TW202302853A

TW202302853A - 自紅萵苣高量生產多酚之方法及其用途

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Publication number: TW202302853A
Application number: TW111107155A
Authority: TW
Inventors: 浩陳; 鐵漢趙; 曉暉姚; 載輝張; 俊嚴
Original assignee: 加拿大商新格諾康植物技術公司
Priority date: 2021-02-26
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2023-01-16
Also published as: JP2024508844A; WO2022183014A1; AU2022226265A1; US20240147927A1; CN117597021A; EP4297565A1; CA3209030A1

Abstract

本文提供用於提高紅萵苣中多酚(諸如綠原酸、菊苣酸、花青素及水溶性槲皮素衍生物)產量之系統及方法。本文亦提供用於生產多酚之轉殖基因萵苣。亦提供此類轉殖基因萵苣之部分，諸如種子、葉子及提取物。本發明亦提供使用新型萵苣及其部分來預防病毒/細菌感染(亦即，藉由抑制COVID-19病毒/酶之活性)、糖尿病、心血管疾病、記憶及視力喪失、發炎及癌症之方法。

Description

自紅萵苣高量生產多酚之方法及其用途

多酚，諸如水溶性槲皮素衍生物、菊苣酸、綠原酸及花青素，為具有抗氧化特性的有益植物化合物，可有助於人們保持健康及預防各種疾病。消費者對於提高身體機能、降低疾病風險及延長壽命的營養食物之需求日益增加。研究人員及食品製造商對增加食物中有益於健康的多酚有興趣，此係由於此等化合物具有抗氧化特性及其在預防各種疾病，諸如許多類型的癌症、心血管及神經退化性疾病方面具有作用。由於此等健康促進作用取決於相對較高之多酚含量，因此非常需要增加其在人類飲食中之量。儘管藍莓為最豐富的多酚來源之一且強烈建議人類攝取，但其人均攝取量仍比其他類型之新鮮水果及蔬菜低。此外，藍莓含有大量糖，此對於許多個體來說可能並不合乎需要。因此，需要開發其他多酚含量增加且糖較少之有益健康的植物，其可在公眾中廣受歡迎，且可成為日常食物攝入之一部分。

萵苣(Lettuce/ Lactuca sativaL.)廣泛用於沙拉及三明治中，且為人類飲食及營養中之重要組成部分。最近，萵苣為美國第二大消費的新鮮蔬菜。因此，可生產高含量多酚之新穎紅萵苣可能在商業上可行且對健康有益。

本發明提供具有顯著增加量之有益健康的多酚之紅萵苣，該等多酚為諸如槲皮素衍生物、菊苣酸、綠原酸及花青素。本文亦提供產生此類紅萵苣之方法，例如藉由(1)使用植物良性應激子/激發子刺激所需次級代謝物之產生以及(2)調節苯丙烷路徑之基因以增強下游次級代謝物。本發明亦提供此類萵苣之提取物、製備此類提取物之方法及使用此類提取物之方法，例如以抑制病毒複製、減少發炎、改善視力、調節免疫反應、減少肥胖症及糖尿病、降低血糖含量或其組合。

在一些實施例中，本文揭示一種用於在萵苣中生物合成多酚之系統，其包含增加萵苣中之多酚產量的至少一種激發子或其同系物、異構體或衍生物。

在一些實施例中，本文揭示一種用於在萵苣中生物合成多酚之系統，其包含表現卡匣，該表現卡匣包含可操作地連接於至少一個聚核苷酸的異源表現控制序列，該至少一個聚核苷酸編碼一或多種增加萵苣中之多酚產量之蛋白質。

在一些實施例中，本文揭示一種用於在萵苣中增加多酚產量之系統，其包含至少一種本發明之激發子或其同系物、異構體或衍生物及本發明之表現卡匣。

在參考以下實施方式及隨附圖式時，本發明之此等及其他態樣將變得顯而易見。本文所揭示之所有參考文獻均以全文引用的方式併入本文中，如同各參考文獻個別地併入一般。

諸如綠原酸、菊苣酸、槲皮素衍生物及花青素之多酚具有廣泛範圍的生物及藥理活性。然而，此類多酚不易且經濟地獲得。因此，為了以經濟上有效益的之方式生產多酚，需要用於生產多酚，諸如綠原酸、菊苣酸、槲皮素衍生物及花青素之較佳工具。

本文中展現用於提高紅萵苣中之多酚產量的系統及方法。本文中展現之系統及方法允許高量生產多酚以大量、低成本、可調式生產多酚。特定言之，該等系統及方法允許產生多酚，諸如綠原酸、菊苣酸、槲皮素衍生物及花青素；以及在有意義的規模下探索其益處。另外，該等系統及方法提供在商業相關數量下之綠原酸、菊苣酸及槲皮素衍生物之有成本效益的生產。本文中展現之系統及方法藉由利用萵苣中之多酚生物合成路徑之天然充足中間物(內源性基因及酶)以及代謝工程改造技術之力量，利用易於獲得之萵苣底盤。

本發明提供具有顯著增加量之有益健康的多酚之紅萵苣，該等多酚為諸如槲皮素衍生物、菊苣酸、綠原酸及花青素。本文亦提供生產此類紅萵苣之方法，例如藉由使用良性應激子/激發子刺激所需次級代謝物之產生以及調節苯丙烷路徑之基因以增強下游次級代謝物。本發明亦提供此類萵苣之提取物、製備此類提取物之方法及使用此類提取物之方法，例如以抑制病毒複製、減少發炎、改善視力、調節免疫反應、減少肥胖症及糖尿病、降低血糖含量或其組合。

本發明包括多種態樣，其可以不同方式組合。提供以下描述，列出要素並描述本發明之一些實施例。此等要素用起始實施例列出，然而，應理解此等實施例可以任何方式及任何數字組合以形成額外實施例。不同描述之實例及較佳實施例不應視為將本發明僅限於明確描述之系統、技術及應用。另外，本說明書應理解為支持及涵蓋所有各種實施例、系統、技術、方法、裝置及應用之描述及申請專利範圍，其具有任何數目之所揭示要素，具有單獨各要素，且亦具有此或任何後續申請案中之所有要素的任何及所有各種排列及組合。

多酚為具有抗氧化特性之有益植物化合物，可有助於人們保持健康及預防各種疾病。已鑑別出超過8,000種多酚類型(Tsao, R. Nutrients2010, 2(12), 1231-1246; 及Zhou等人, Nutrients2016, 8, 515)。多酚可進一步歸類為至少四個主族，其包括類黃酮、酚酸、多酚醯胺及其他多酚。類黃酮佔所有多酚之約60%。實例包括槲皮素、番鬱金黃素、兒茶酚胺及花青素，其見於如蘋果、洋蔥、黑巧克力及紅甘藍菜之食物中。酚酸佔所有多酚之約30%。實例包括芪及木脂素，其大部分見於水果、蔬菜、全穀物及種子中。多酚醯胺包括紅辣椒中之辣椒素及燕麥中之鄰氨基苯甲酸醯胺。其他多酚包括紅酒中之白藜蘆醇、草莓中之土耳其鞣酸、薑黃中之薑黃素及諸如亞麻種子、芝麻種子及全穀物中發現之木脂素。

植物酚類物質，包括單一酚類、酚酸、類黃酮、香豆素、芪、可水解及縮合之鞣酸、木脂素及木質素，為最豐富的次級代謝物，主要經由莽草酸路徑自L-苯丙胺酸及L-酪胺酸產生，且含有一或多個直接連接至芳環之羥基(Chirinos等人, Food Chem.113 (2009) 1243-1251; 及Kumar等人, Biotechnol. Rep.4 (2014) 86-93)。次級代謝物來源於初級代謝物(碳水化合物、胺基酸及脂質)，主要用於保護免受UV輻射、競爭性對抗病毒、細菌、昆蟲及其他植物，以及負責植物產品之氣味、顏色及風味(Winkel-Shirley, B. Plant Physiology.2001, 126 (2): 485-93)。植物酚類物質在許多方面類似於具有脂族結構之醇，但芳環之存在，酚羥基之氫原子使其成為弱酸。已知植物酚類物質呈現出多種功能，包括植物生長、發育及防護，且亦對人類具有有益作用。已確認植物酚類物質為強效天然抗氧化劑，在廣泛範圍之生物及藥理特性，諸如消炎、抗癌、抗微生物、抗過敏、抗病毒、抗血栓、保肝、食品添加劑、信號傳導分子及更多的方面具有關鍵作用(Kumara等人, Biotechnol. Rep.24 (2019) 1-10)。

類黃酮類黃酮(或生物類黃酮)(來自拉丁文 flavus，意謂黃色，其本質上之顏色)為一類植物及真菌次級代謝物(Formica等人, Food and Chemical Toxicology.1995, 33 (12): 1061-80)。類黃酮廣泛分佈於具有多種功能之植物中。類黃酮為花色中最重要植物色素，在花瓣中產生黃色或紅色/藍色色素沉著，吸引授粉昆蟲。類黃酮在高等植物中具有廣泛範圍之功能，諸如UV過濾、共生氮固定及花色素沉著。另外，類黃酮可充當化學信使、生理調節劑及細胞週期抑制劑。此外，一些類黃酮具有針對引起植物疾病之生物體的抑制活性。

已闡明天然存在之槲皮素及其衍生物之生物合成路徑(Winkel-Shirley, B. Plant Physiology.2001, 126 (2): 485-93)。在植物中進行生物合成，在稱為通用苯丙烷路徑的一系列步驟中，使用苯丙胺酸氨分解酶(PAL)、肉桂酸4-羥化酶(C4H)及4-香豆醯基CoA-連接酶(4CL)，將苯丙胺酸轉化成4-香豆醯基-CoA。將4-香豆醯基-CoA之一個分子添加至丙二醯基-CoA之三個分子中，使用7,2'-二羥基-4'-甲氧基異黃酮醇合成酶，形成四羥基查耳酮。接著使用查耳酮異構酶(CHI)將四羥基查耳酮轉化成柚配質。使用類黃酮3'-羥化酶，將柚配質轉化成聖草酚。隨後用黃烷酮3-羥化酶(F3H)將聖草酚轉化成二氫槲皮素，其隨後使用黃酮醇合成酶(FLS)轉化成槲皮素。以下酶促糖基化及酯化過程將分別產生槲皮素-3- O-葡糖苷(Q3G)及槲皮素-3- O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)。

槲皮素及槲皮素衍生物槲皮素為最豐富的飲食類黃酮之一。槲皮素可見於許多植物及食物中，諸如紅酒、洋蔥、綠茶、蘋果、漿果、銀杏(Ginkgo biloba)、聖約翰草(St. John's wort)、美洲接骨木(American elder)及其他植物(Flavonoids, Micronutrient Information Center, Linus Pauling Institute, Oregon State University, 2015)。槲皮素與運動表現改善及發炎減輕、血壓及血糖含量降低有關。其亦可具有大腦保護性、抗過敏及抗癌、抗細菌及抗病毒特性。然而，槲皮素一般非充分生物可用且大部分轉化為不同代謝物。儘管關於其生物活性知之甚少，但此等代謝物與槲皮素飲食攝入相關之健康益處有關(Lesjak, M.等人 2018 Journal of Functional Foods, 40, 68-75)。咸信在植物提取物中發現之槲皮素及其衍生物之活性充當強效抗氧化劑及消炎劑，且可能成為富含槲皮素之飲食之總體生物活性(Carullo, G.等人 2017 Future medicinal chemistry, 9(1), 79-93)。槲皮素衍生物包含槲皮素-3- O-葡糖苷酸(Q3G)(亦稱為異槲皮素)、檉柳黃素、異鼠李素、異鼠李素-3- O-葡糖苷、槲皮素-3, 4'-二- O-葡糖苷、槲皮素-3,5,7,3',4'-五甲醚。天然存在之槲皮素及其衍生物之一些實例包括槲皮素-3- O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)及槲皮素-3- O-葡糖苷(Q3G)。

花青素花青素為屬於酚基之彩色水溶性色素(Khoo等人， Food Nutr Res.61(1), 2017)。色素呈糖基化形式。引起顏色紅、紫及藍之花青素在水果及蔬菜中。漿果、醋栗、葡萄及一些熱帶水果具有較高花青素含量。紅色至略呈紫色的藍色葉菜、穀物、根及塊莖為含有高含量花青素之可食用蔬菜。在花青素色素中，矢車菊素-3-葡糖苷為見於大部分植物中之主要花青素。花青素具有抗糖尿病、抗癌、消炎、抗微生物及抗肥胖作用，以及預防心血管疾病(He等人, J Ethnopharmacol.137(3) (2011):1135-1142。

酚酸術語「酚酸」一般描述具有一個羧酸基之酚類化合物。酚酸或酚羧酸(一種類型的植物化學成分，稱為多酚)為植物酚類化合物的主要類別之一。酚酸可見於各種基於植物之食物，諸如含有最高濃度酚酸之種子、水果皮及蔬菜葉中。通常，酚酸以諸如醯胺、酯或糖苷之結合形式存在且很少呈游離形式(Pereira等人, Molecules14 (6) (2009) 2202-2211)。酚酸通常劃分成兩個子群：羥基苯甲酸及羥基肉桂酸(Clifford等人, J. Sci. Food Agric.79 (1999) 362-372)。酚酸具有比熟知抗氧化維生素高得多的活體外抗氧化活性(Tsao等人, J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.812 (2004) 85-99)。

羥肉桂酸(HCA)，其衍生自肉桂酸，常常以簡單酯形式與奎尼酸或葡糖一起存在於食物中。存在的最豐富的可溶性結合羥基肉桂酸係綠原酸(咖啡酸及奎尼酸之組合形式)。四種最常見的羥基肉桂酸為阿魏酸、咖啡酸、對香豆酸及芥子酸。

羥基苯甲酸具有C6-C1之常見結構且衍生自苯甲酸。羥基苯甲酸以可溶性形式存在(與糖或有機酸結合)且與細胞壁部分，諸如木質素結合(Strack等人, Plant Biochemistry, Academic, London, 1997, 第387頁; 及Khoddami等人, Molecules18 (2013) 2328-2375)。相比於羥基肉桂酸，羥基苯甲酸通常以低濃度存在於紅色水果、洋蔥、黑蘿蔔等中(Shahidi等人, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, 1995)。四種通常存在之羥基苯甲酸為對羥基苯甲酸、原兒茶酸、香草酸及丁香酸。

綠原酸一種類型的生物活性酚酸，綠原酸(CGA)為咖啡酸及(-)-奎尼酸之酯，其在木質素生物合成中充當中間物。術語「綠原酸」係指相關多酚酯家族，包括羥基肉桂酸(咖啡酸、阿魏酸及對香豆酸)與奎尼酸。綠原酸之實例包括5- O-咖啡醯奎尼酸(綠原酸或5-CQA)、4- O-咖啡醯奎尼酸(隱綠原酸或4-CQA)及3- O-咖啡醯奎尼酸(新綠原酸或3-CQA)。

5- O- 咖啡醯奎尼酸進行生物合成，CQA生物合成中之初始步驟係經由苯丙烷路徑及催化轉化之酶。苯丙胺酸向對香豆醯基-CoA之轉化(其中肉桂酸及對香豆酸充當中間物)依序藉由苯丙胺酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羥化酶(C4H)及4-桂皮醯基-CoA連接酶(4CL)催化。

菊苣酸菊苣酸(Chicoric acid；亦稱為cichoric acid)為羥基肉桂酸，苯丙烷類有機化合物且在多種植物物種中存在其為咖啡酸及酒石酸之衍生物(Shi等人，Functional Foods: Biochemical and Processing Aspects. CRC Press. 2(27) (2002) 第241頁)。已展示菊苣酸在活體外及活體內研究兩者中刺激吞噬作用，抑制玻尿酸酶(在人體中分解玻尿酸之酶)之功能，保護膠原蛋白免於由自由基引起之破壞，且抑制HIV-1整合酶之功能。

定義「類黃酮」係指衍生自苯丙胺酸及丙二醯基-輔酶A(CoA；經由脂肪酸路徑)之芳族分子之不同家族。此等化合物包括見於大部分高等植物中之六個主要子組：查耳酮、黃酮、黃酮醇、黃酮二醇、花青素及縮合鞣酸(或原花青素)；第七組，橙酮，分佈廣泛但並非普遍存在。Ferreyra, M.等人, Frontiers in Plant Science, 2012, 3, 222及Winkel-Shirley, B. Plant Physiol. 2001,126, 485-493中提供致力於自遺傳視角闡明類黃酮產生之生物合成路徑之實例。進行生物合成，類黃酮經由苯丙烷路徑合成，將苯丙胺酸轉化成4-香豆醯基-CoA，其最終進入類黃酮生物合成路徑。不希望受理論所束縛，認為特定針對類黃酮路徑之第一酶，查耳酮合成酶(CHS)產生查耳酮骨架，所有類黃酮自該等骨架衍生。

化學上，類黃酮具有15-碳構架之通用結構，由兩個苯環(A及B)及雜環(C)組成。此碳結構可縮寫為C6-C3-C6。類黃酮之通用結構提供為式(I)。

如本文所用，「多酚」係指包括超過一個酚結構單元之有機化學物質。萵苣中常見之多酚包括花青素、菊苣酸、綠原酸、二咖啡醯奎尼酸及槲皮素衍生物。

如本文所用，「良性應激子」及「激發子」可互換使用，且係指觸發信號傳導路徑而產生植物產物之較高生物活性化合物含量及品質屬性的各種生物、物理或化學應激因子。可將良性應激子/激發子分類為生物及非生物物質，其實例在表1中提供。植物激素/植物生長調節劑(例如柳酸(SA)、茉莉酸酯等)亦視為良性應激子/激發子。生物、化學或物理來源之良性應激子/激發子可歸因於反應活化而增加植物農藝/營養性狀，該等反應活化可包括其中之防護反應，使得例如水果及蔬菜之功能品質提高。植物生長調節劑(PGR)可用作良性應激子/激發子以刺激植物次級代謝物之產生。植物生長調節劑可包括天然存在之激素物質(植物激素)以及其合成類似物。表 1 基於源 / 來源之良性應激子 / 激發子分類之實例

生物激發子
脂多醣
多醣：果膠及纖維素(細胞壁)；聚葡萄胺糖、甲殼素及葡聚糖(微生物)、海藻酸鹽、阿拉伯膠、瓜爾膠、LBG、酵母提取物。
寡醣：半乳糖醛酸苷、古洛糖酸(guluronate)、甘露聚糖、甘露糖酸。
蛋白質：纖維素酶、隱地蛋白、糖蛋白、寡雄蛋白、果膠酶、魚蛋白、水解產物、乳鐵蛋白。
複合體組成：真菌孢子、菌絲細胞壁、微生物細胞壁。
病原體毒素：冠菌素(Coronatine)。
牛至草提取物
非生物激發子
化學	物理
乙酸	經改變之氣體組成
苯并噻二唑	冷凍
矽	CO ₂
生物調節劑調環酸	乾旱
乙醇	極端溫度衝擊
乙烯	高壓
無機鹽：氯化汞(HgCl ₂)、硫酸銅(CuSO ₄)、氯化鈣(CaCl2)及硫酸氧釩。	高或低容積滲透濃度、UV輻射
鹽水脅迫金屬離子：Co ²⁺、Fe ²⁺、Al ³⁺、Ag ²⁺、Ag ⁺、Mn ²⁺、Zn ²⁺、Cu ²⁺、Pb ²⁺及Cd ²⁺	受傷，臭氧
植物生長調節劑
植物生長調節劑包括天然存在之激素物質(植物激素)以及其合成類似物

「植物」包括整株植物或任何部分，諸如植物器官(例如經收集或未收集之葉等)、植物細胞、植物原生質體、整株植物可自其再生的植物細胞或組織培養物、植物癒合組織、植物細胞凝集塊、植物移植株、幼苗、植物中完整的植物細胞、植物純系或微體繁殖物；或植物之部分(例如,經收集之組織或器官)，諸如植物插條,無性繁殖物、胚胎、花粉、胚珠、花、葉、頭部、種子、無性繁殖植物、根、莖、稈、根尖、移植物；任何此等及其類似物或其衍生物，較佳具有與獲得其之植物相同的基因體成(或非常相似的基因體成)的任何此等及其類似物或其衍生物的部分。另外，包括任何發育階段，諸如發根之前或之後的幼苗、插條及/或不成熟植物或成熟及/或不成熟葉子。

「萵苣(Lettuce)」在本文中係指萵苣( Lactuca sativa L)屬植物。萵苣( Lactuca sativa)係在菊科(菊科植物)家族之菊苣族中。萵苣與菊苣、向日葵、翠菊、蒲公英、朝鮮薊及菊花相關。萵苣( L. sativa)為萵苣( Lactuca)屬中約300種物種之一。作為高度多態物種，萵苣因其可食用頭部及葉子而被種植。作為作物，商業上，萵苣在環境條件准許生產經濟上可行產量的任何地方種植。新鮮萵苣幾乎僅以新鮮原料形式且偶爾以烹製蔬菜形式被攝取。萵苣為愈來愈流行的作物。萵苣消費量在全世界持續增加。由於其較高需求，尋求多酚產量提高了的新式轉殖基因萵苣具有益處。特定言之，穩定、高產及農藝可持續的健康多酚產量提高了的經改良轉殖基因萵苣對於人類攝取將尤其在商業上可行。

「萵苣植株」係指不成熟或成熟萵苣植株，包括整株萵苣植株及已自其中移除種子、根或葉之萵苣植株。產生植物之種子或胚胎亦視為萵苣植株。可藉由在土地(例如土壤，諸如田地土壤)中直接播種或藉由在受控環境條件(例如溫室)中使種子發芽且接著將幼苗移植至田地來生產萵苣植株。參見例如Gonai等人, J. of Exp. Bot., 55(394), 111-118, 2004; Louise Jackson等人, Acquaah, Principles of Plant Genetics and Breeding, 2007, Blackwell Publishing, 及Jackson, Louise等人, University of California, Publication 7216 ，其以引用的方式全部併入本文中。

「萵苣細胞」或「萵苣植株細胞」係指已分離之萵苣細胞，於組織培養物中生長，及/或併入萵苣植株或萵苣植株部分中。

如本文所用，「萵苣植株部分」包括萵苣頭部、萵苣葉、萵苣葉之部分、花粉、胚珠、花及其類似物。在另一實施例中，本發明進一步關於自萵苣植株分離之萵苣頭部、萵苣葉、萵苣葉之部分、花、花粉及胚珠。

術語「品種」或「栽培品種」意謂在最低已知等級之單一植物分類內的植物分組，不管是否充分滿足育種者種植權條件，該分組可由給定基因型或基因型之組合產生之特徵的表現界定，該等特徵的表現區別於任何其他植物分組的至少一個該等特徵的表現，且視為關於其針對未改變之繁殖的適合性的單元。

如本文所用，聚核苷酸或多肽在其經人工或經工程改造時為「重組的」，或來源於人工或經工程改造之蛋白質或核酸。舉例而言，聚核苷酸插入載體或任何其他異源位置，例如重組生物體之基因體中，使得其與如在自然界中所見一般側接聚核苷酸的核苷酸序列不連接，該聚核苷酸為重組聚核苷酸。自重組聚核苷酸活體外或活體內表現之多肽為重組多肽之實例。同樣地，自然界中不存在之聚核苷酸序列，例如天然存在之基因之變異體為重組的。

如本文所用，「異源」關於源自外來物種之序列，或若來自相同物種，則係藉由故意人類干預實質上由組成物及/或基因體基因座中之其天然形式修飾。舉例而言，可操作地連接至異源聚核苷酸之啟動子來自與聚核苷酸所來源之物種不同的物種，或若來自相同/類似物種，則一或兩者自其初始形式及/或基因體基因座實質上經修飾，或啟動子不為可操作地連接之聚核苷酸之天然啟動子。

如本文所用，「轉殖基因」係指例如藉由基因工程改造方法，諸如藉由轉型，轉移至萵苣植株之基因體中的基因或遺傳物質。例示性轉殖基因包括cDNA(互補DNA)區段，其為mRNA之複本(信使RNA)，以及自身駐存於基因體DNA之其原始區域中的基因。在一個實例中，描述含有引入萵苣植株或萵苣植株細胞之基因體中之基因序列的DNA之區段。DNA之此非原生片段可保留轉殖基因萵苣植株中產生RNA或蛋白質之能力，或其可改變轉殖基因萵苣植株基因密碼之正常功能。一般而言，將經轉移核酸併入至植物生殖細胞系中。轉殖基因亦可描述任何DNA序列，不管其是否含有已引入至先前未發現之萵苣植株或載體構築體中的基因編碼序列或其已經人工構築。

「可操作地連接」意欲意謂兩個或更多個元件之間的功能性鍵聯。舉例而言，相關聚核苷酸與調節序列(亦即，啟動子)之間的可操作連接為允許表現相關聚核苷酸之功能性鍵聯。可操作地連接之元件可為相鄰或非相鄰的。當用於指代藉由可操作地連接使得兩個蛋白質編碼區接合時，意欲指編碼區在同一閱讀框架中。卡匣可另外含有至少一個有待共同轉型至生物體中之額外編碼序列/基因。替代地，額外編碼序列/基因可提供於多個表現卡匣上。此類表現卡匣具有複數個限制位點及/或重組位點，以用於在調節區(例如啟動子)之轉錄調節下將相關編碼聚核苷酸或其活性變異體或片段插入。表現卡匣可另外含有可選標記基因。

「表現卡匣」係指編碼可操作地連接於至少一個編碼表現控制序列之聚核苷酸的相關多肽的聚核苷酸。表現卡匣可包括在轉錄之5'-3'方向上的轉錄及轉譯起始區(亦即啟動子)、編碼相關多肽或其活性變異體或片段之聚核苷酸及植物中之轉錄及轉譯終止區(亦即終止區)功能。調節區(亦即，啟動子、轉錄調節區及轉譯終止區)及/或聚核苷酸或活性變異體或其片段可為天然的/類似於宿主細胞或彼此的。或者，調節區及/或其活性變異體或片段之聚核苷酸可與宿主細胞或彼此異源。

表現卡匣可另外含有5'前導序列。此類前導序列可用以增強轉譯。轉譯前導序列為本領域中已知且包括：小核糖核酸病毒前導序列，例如EMCV前導子(腦心肌炎5'非編碼區)(Elroy-Stein等人(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130)；馬鈴薯Y病毒前導序列，例如TEV前導子(菸草蝕刻病毒) (Gallie等人(1995) Gene 165(2):233-238)、MDMV前導子(玉米矮嵌紋病毒)(Virology 154:9-20)及人類免疫球蛋白重鏈結合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991) Nature 353:90-94)；來自苜蓿嵌紋病毒之鞘蛋白之非轉譯前導子(AMV RNA 4) (Jobling等人(1987) Nature 325:622-625)；菸草嵌紋病毒前導子(TMV) (Gallie等人(1989)於Molecular Biology of RNA中編 Cech (Liss, New York), 第237-256頁)；及玉米枯黃斑點病毒(maize chlorotic mottle virus)前導子(MCMV) (Lommel等人(1991) Virology 81:382-385。亦參見Della-Cioppa等人(1987) Plant Physiol. 84:965-968。

「表現控制序列」係指能夠增加或減少由表現卡匣編碼之多肽表現的核酸分子區段。表現控制區之實例包括啟動子、轉錄調節區及轉譯終止區。終止區對於轉錄起始區可為天然的，對於可操作地連接之聚核苷酸或其活性變異體或片段可為天然的，對於植物宿主可為天然的，或可衍生自另一啟動子、聚核苷酸或其活性片段或變異體、植物宿主或其任何組合之來源(亦即外來或異源)。合宜終止區可獲自根癌農桿菌之Ti-質體，諸如章魚鹼合成酶及胭脂鹼合成酶終止區。亦參見Guerineau等人(1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon等人(1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen等人(1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe等人(1990) Gene 91: 151-158; Ballas等人(1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; 及Joshi等人(1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639。

「變異」蛋白質意欲意謂藉由在天然蛋白質中之一或多個內部位點處缺失(亦即在5'及/或3'端處截短)及/或缺失或添加一或多個胺基酸及/或在天然蛋白質中之一或多個位點處取代一或多個胺基酸而衍生自蛋白質的蛋白質。涵蓋之變異蛋白具有生物活性，亦即其繼續具有天然蛋白之所需生物活性。

如本文所用，「植物生物刺激劑」係指含有的物質及/或微生物當施加於植物或根圍時，刺激自然過程以增強及/或提高養分吸收、養分效率、對非生物性逆境之耐受性及與其養分含量無關之作物品質的材料。在一些實施例中，生物刺激劑為生物良性應激子/激發子。

「對照」或「對照萵苣」或「對照萵苣細胞」提供用於量測個體萵苣植株或萵苣植株細胞之表現型變化之參考點，且可為任何適合萵苣植株或萵苣細胞。對照萵苣或萵苣細胞可包含例如：(a)野生或天然萵苣或萵苣細胞，亦即與用於基因改變產生個體萵苣或萵苣細胞之起始物質具有相同基因型的萵苣或萵苣細胞；(b)與已用空構築體(亦即用對相關性狀無已知影響的構築體，諸如包含標記基因之構築體)轉型的起始物質具有相同基因型的萵苣或萵苣細胞；(c)在個體萵苣或萵苣細胞之子代當中作為未轉型分離子之萵苣或萵苣細胞；(d)與不暴露於與個體萵苣或萵苣細胞相同處理(例如良性應激子/激發子處理，除草劑處理)下的萵苣或萵苣細胞基因一致的萵苣或萵苣細胞；或(e)在相關基因不被表現的條件下的個體萵苣或萵苣細胞本身。

「有效量」或「治療有效量」可指提供所需生理變化(諸如抗病毒、消炎、抗氧化及/或抗癌作用)之治療劑(例如本文所述之萵苣提取物、萵苣植株或萵苣植株部分)的量。所需生理變化可為例如疾病症狀減少，或疾病嚴重程度降低，或疾病進展減緩。關於病毒感染，所需生理變化可包括例如個體中之可偵測病毒減少、症狀減少、病毒複製減少及/或與宿主細胞之病毒結合減少。關於癌症，所需生理改變可包括例如腫瘤消退、腫瘤進展速率降低、癌症生物標記含量降低、與癌症相關之症狀減少、癌轉移預防或延遲或臨床緩解。

在本說明書中，除非另外規定，否則術語「約」意謂指示範圍、值或結構之±20%。術語「基本上由……組成」將技術方案之範疇限定於所指定物質或步驟及不會顯著影響所主張實施例之基本及新穎特徵之彼等物質或步驟。應理解，如本文所用的術語「一(a/an)」係指所列舉組分中之「一或多個」。使用替代物(例如「或」)應理解為意謂替代物之一者、兩者或其任何組合。如本文所用，術語「包括」及「具有」同義地使用，該等術語及其變化形式意欲被理解為非限制性的。術語「包含」如申請專利範圍中所提及之所述特徵、整數、步驟或組分之存在，但其不排除存在或添加一或多個其他特徵、整數、步驟、組分或其群組。

本發明中所用之重組DNA、分子選殖及基因表現技術為此項技術中已知的且描述於參考文獻，諸如Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2001, 及Ausubel等人, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD, 1999中。

所有文獻(例如，專利公開案)均以全文引用之方式併入本文中。

在不脫離本發明之範疇及精神的情況下，熟習此項技術者將顯而易見本發明之所描述產物及方法的各種修改及變化。儘管已結合特定實施例描述本發明，但應理解，如所主張之本發明不應過度地受限於此等特定實施例。

植物系統中提高 / 增加的多酚產量如上文所論述，多酚，諸如類黃酮、花青素、菊苣酸及綠原酸，共用常見生物合成苯丙烷路徑。因此，本文提供調節其在植物系統中生產的策略。

用靶向多酚之特定基因偶合調節一般基因可以有效且經濟的方式用於生產特定多酚。獲得高度生物可用的槲皮素衍生物(更具水溶性)對於生產生物有效產品為有利的。由於內源性生物合成路徑至槲皮素及衍生物已存在於紅萵苣系統中，因此本發明之一個目標為構築目標導向的及更高效之生物工程改造系統。本發明之主要策略藉由使用植物中天然豐富的類黃酮中間物、內源性基因及酶以及合成生物學技術之力量，利用易於獲得之植物底盤。此外，萵苣為生物量高、生長快及極受歡迎的蔬菜。

植物之植物化學成分組成隨遺傳(家族、物種、栽培品種等)、生理(器官、成熟及年齡)及農藝因素(光週期、化學應激源等)變化(Nieves B.等人 , Molecules2014, 19, 13541-13563.; Bellostas, N. 等人 , Sci. Hortic.2007, 114, 234-242; Cartea, M.E. 等人, Phytochem. Rev.2008, 7, 213-229; Charron, C.S. 等人 , J. Sci. Food Agric.2005, 85, 671-681; Domínguez-Perles, R. 等人 , J. Food Sci.2010, 75, C383-C392; Francisco, M., 等人 , J. Chromatogr. A2009, 1216, 6611-6619; Pérez- Balibrea, S. J. Clin. Biochem. Nutr.2008, 43, 1-5; 及Pérez-Balibrea, S., 等人 , J. Sci. Food Agric.2008, 88, 904-910)。此等因素歸類為生物(遺傳學、生理決定因素、害蟲及疾病)及非生物(環境及農藝條件)，且可用於在全年生產中增加食物及成分中之有價值的代謝物。包括良性應激子/激發子應用之特定處理可用於增加植物中之代謝物產生且提高其新鮮農產品、強化營養食品之定性值或作為飼料/食品及醫藥產品之原始成分。

本發明包括在萵苣中生物合成多酚之系統。「在萵苣中生物合成多酚之系統」係指當引入紅萵苣中時使得可在將系統施加於萵苣時提高多酚之產量的系統。在一些實施例中，該等系統包括增加萵苣中之多酚之產量的至少一種良性應激子/激發子或其同系物、異構體或衍生物。在一些實施例中，系統包括表現卡匣，其包含與編碼一或多種蛋白質之至少一個聚核苷酸可操作地連接之異源表現控制序列，該一或多種蛋白質增加萵苣中之多酚之產量。在一些實施例中，系統包括本發明之至少一種良性應激子/激發子或其同系物、異構體或衍生物；及本發明之表現卡匣。在一些實施例中，該系統用於在萵苣中生物合成多酚之方法中，該方法包含向萵苣投與至少一種良性應激子/激發子或其同系物、異構體或衍生物，由此增加萵苣中之多酚產量。

在一些實施例中，用於在萵苣中生物合成多酚之系統包含增加萵苣中之多酚之產量的至少一種良性應激子/激發子或其同系物、異構體或衍生物。在一些實施例中，本文提供一種用於在萵苣中生物合成多酚之方法，其包含向萵苣投與至少一種良性應激子/激發子或其同系物、異構體或衍生物，由此增加萵苣中之多酚之產量。在一些實施例中，良性應激子/激發子之組合(亦即一或多種良性應激子/激發子)已用於在所施加之紅萵苣中高量生產所需有益健康的多酚。不希望受特定理論束縛，植物化學成分之增加與引起多酚生物合成之路徑中所涉及的基因之基因轉錄物的增加有關，此使得植物化學成分生物合成增強。在一些實施例中，紅萵苣中有益健康的多酚含量之顯著提高已藉由組合，亦即一或多種良性應激子/激發子來實現。

在一些實施例中，至少一種良性應激子/激發子為植物生長調節劑。在一些實施例中，植物生長調節劑係選自：生長素、細胞分裂激素(CK)、赤黴素(GA)、乙烯、菜籽類固醇、茉莉酸酯(JA)、獨角金內酯(strigolactone，SL)、柳酸(SA)及其任何同系物或異構體或衍生物、合成類似物或任何組合或混合物。在一些實施例中，植物生長調節子為植物激素。

在一些實施例中，至少一種良性應激子/激發子係選自：二十碳四烯酸(AA)、吲哚-3-乙酸(IAA)、5-胺基乙醯丙酸(5-ALA)、哈平蛋白(harpin protein；HP)或其任何組合或混合物。

在一些實施例中，至少一種良性應激子/激發子係選自：吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-乙腈(IAN)、吲哚-3-乙醛(IAc)、乙基吲哚乙酸鹽(ethylindoeacetate)、吲哚-3-丙酮酸(IPyA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、吲哚-3-丙酸(IPA)、吲唑-3-乙酸、氯苯氧基丙酸、萘乙酸(NAA)、苯氧基乙酸(PAA)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、2,4,5-三氯苯氧基乙酸(2,4,5-T)、萘乙醯胺(NAAM)、2-萘氧基乙酸(NOA)、2,3,5-三碘苯甲酸(TIBA)、苯并噻吩-3-丙酸(IPA)、核糖苷玉米素、玉米素、異戊烯基腺嘌呤(isopentinyladenine)、二氫玉米素、6-苯甲基胺基嘌呤、6-苯基胺基嘌呤、裂殖素、N-苯甲基-9-(2-四氫哌喃基)腺嘌呤(BPA)、均二苯脲、噻苯隆、苯并咪唑、腺嘌呤、6-(2-噻吩甲基胺基)嘌呤、GA、GA4、GA7、GA3、乙烯、乙烯豐、乙烯利(ethrel)、扁豆甾醇內酯(dolicholide)、28-高扁豆甾醇內酯、栗甾酮(castasterone)、扁豆甾酮、28-高扁豆甾酮、香蒲甾醇(typhasterol)、茉莉酸、二氫茉莉酸甲酯、二氫茉莉酸、茉莉酸甲酯(MJ)、獨腳金醇(strigol)、列當醇(orobanchol)、GR24、二十碳四烯酸(AA)、柳酸(SA)、哈平蛋白(HP)或其任何組合或混合物。

在一些實施例中，至少一種良性應激子/激發子係選自：吲哚-3-乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、草酸、苯并噻二唑(BTH)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、二十碳四烯酸(AA)、柳酸(SA)、茉莉酸甲酯(MJ)、哈平蛋白(HP)或其任何組合或混合物。

在一些實施例中，至少一種良性應激子/激發子係選自：脂多醣、果膠及纖維素(細胞壁)；聚葡萄胺糖、甲殼素及葡聚糖(微生物)、海藻酸鹽、阿拉伯膠、瓜爾膠、LBG、酵母提取物、半乳糖醛酸苷、古洛糖酸、甘露聚糖、甘露糖醛、纖維素酶、隱地蛋白、糖蛋白、寡雄蛋白、果膠酶、魚蛋白、水解產物、乳鐵蛋白、真菌孢子、菌絲細胞壁、微生物細胞壁、冠菌素、牛至提取物、大虎杖提取物；或其任何組合或混合物。

在一些實施例中，至少一種良性應激子/激發子係選自以下植物生物刺激劑類別：腐植酸及富里酸；蛋白水解產物及其他含N化合物；海藻提取物及植物性藥材；聚葡萄胺糖及其他生物聚合物；無機化合物；有益真菌；有益細菌；或其任何組合或混合物。

在一些實施例中，系統包含濃度為約30 mg/L至1000 mg/L之良性應激子/激發子。在一些實施例中，系統包含濃度為約30 mg/L至500 mg/L、30 mg/L至400 mg/L、30 mg/L至300 mg/L、30 mg/L至200 mg/L、30 mg/L至150 mg/L、30 mg/L至100 mg/L的良性應激子/激發子。在一些實施例中，系統包含濃度為約30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L或200 mg/L之良性應激子/激發子。

在一些實施例中，系統包含濃度為約1 µM至1000 µM之良性應激子/激發子。在一些實施例中，系統包含濃度為以下之良性應激子/激發子：約1 µM至900 µM、1 µM至800 µM、1 µM至700 µM、1 µM至600 µM、1 µM至500 µM、1 µM至400 µM、1 µM至300 µM、1 µM至200 µM、1 µM至100 µM、5 µM至100 µM或5 µM至90 µM。在一些實施例中，系統包含濃度為約5 µM、10 µM、15 µM、45 µM或90 μM的良性應激子/激發子。

在一些實施例中，系統包含選自以下之良性應激子/激發子：吲哚-3-乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、二十碳四烯酸(AA)、柳酸(SA)及/或茉莉酸甲酯(MJ)，其中各良性應激子/激發子之濃度獨立地為約1 µM至100 µM。在一些實施例中，各良性應激子/激發子之濃度獨立地為約5 µM、10 µM、15 µM、45 µM或90 μM。

在一些實施例中，系統包含濃度在約30-200 mg/L範圍內之良性應激子/激發子哈平蛋白(HP)、聚葡萄胺糖、海藻酸鹽、阿拉伯膠、瓜爾膠及/或酵母提取物。在一些實施例中，系統包含良性應激子/激發子，該等良性應激子/激發子包含濃度在約100至 5000 mg/L範圍內之基於植物之提取物中之至少一者。在一些實施例中，系統包含濃度為約30 mg/L、60 mg/L、120 mg/L或200 mg/L之良性應激子/激發子哈平蛋白(HP)、聚葡萄胺糖、海藻酸鹽、阿拉伯膠、瓜爾膠、酵母提取物。

在一些實施例中，本發明之多酚為綠原酸或其衍生物、菊苣酸及/或水溶性槲皮素衍生物。在一些實施例中，綠原酸為3- O-咖啡醯奎尼酸(3-CQA)、4- O-咖啡醯奎尼酸(4-CQA)及/或5- O-咖啡醯奎尼酸(5-CQA)；菊苣酸為(2R,3R)- O-二咖啡醯奎尼酸；及/或其中水溶性槲皮素衍生物為槲皮素-3- O-葡糖苷(Q3G)及/或槲皮素-3- O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)。在一些實施例中，多酚增加之產量藉由LCMS定量。在一些實施例中，多酚增加之產量藉由HPLC定量。

在一些實施例中，多酚增加之產量相比於對照系統的產量增加3至9倍。在一些實施例中，良性應激子/激發子之組合引起累加或協同作用，引起多酚之產量增加。在一些實施例中，對照系統為無該至少一種良性應激子/激發子或其同系物、異構體或衍生物之系統。

在某些實施例中，本發明係關於自植物或酶系統(包括整株萵苣植株、萵苣植株部分及/或萵苣植株細胞懸浮液培養物系統或酶促生物轉化系統)活體內/活體外生產、修飾及分離類黃酮、綠原酸、菊苣酸花青素化合物的新穎系統、方法及組合物。在某些實施例中，本發明提供一種基因修飾萵苣植株或植物細胞懸浮液培養物以生產、修飾及/或積聚紅萵苣中之有益健康的多酚之新穎系統。

在一些實施例中，萵苣中之多酚生物合成系統包含表現卡匣，該表現卡匣包含可操作地連接於至少一個編碼一或多種增加萵苣中之多酚產生之蛋白質的聚核苷酸的異源表現控制序列。

在一些實施例中，一或多種蛋白質包含丙二酸-CoA連接酶。在此類實施例中，該系統包括一或多個編碼丙二酸-CoA連接酶之聚核苷酸。丙二酸-CoA連接酶催化丙二醯基-CoA直接由丙二酸酯及CoA形成，該丙二醯基-CoA為類黃酮生物合成之前驅體。丙二酸-CoA連接酶可為AAE13。在一些實施例中，丙二酸-CoA為AAE13。用於工程改造丙二醯基-CoA之生物合成及強化有益健康的多酚合成之構築嵌段的轉殖基因之一些實例為AAE13(丙二酸-CoA連接酶)及AtMYB12轉錄因子。

在一些實施例中，系統包括一或多個編碼苯丙烷路徑之酶的聚核苷酸。在特定實施例中，苯丙烷路徑之酶係選自：苯丙胺酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羥化酶(C4H)及4-香豆酸：CoA連接酶(4CL)或其任何組合。

在一些實施例中，系統包括一或多個編碼綠原酸路徑之酶的聚核苷酸。在特定實施例中，綠原酸路徑之酶係選自：羥基桂皮醯基CoA：奎尼酸羥基桂皮醯基轉移酶(HQT)、對香豆醯基-3-羥化酶(C3H)及咖啡醯基-CoA-3- O-甲基轉移酶(CCoAMT)或其任何組合。

在一些實施例中，該系統包括一或多個編碼類黃酮路徑之酶的聚核苷酸。在特定實施例中，類黃酮路徑之酶係選自：查耳酮合成酶(CHS)、查耳酮異構酶(CHI)、黃烷酮3-羥化酶(F3H)及黃酮醇合成酶(FLS)、類黃酮3'-羥化酶(F3'H)、對香豆酸3-羥化酶(C3H)、肉桂酸4-羥化酶(C4H)、4-羥基桂皮醯基-CoA連接酶(4CL)、羥基桂皮醯基-CoA莽草酸/奎尼酸羥基桂皮醯基轉移酶(HCT)、羥基桂皮醯基-CoA奎尼酸羥基桂皮醯基轉移酶(HQT)或其任何組合。

在某些實施例中，該系統包括一或多個編碼細胞色素P450 3A4、CYP氧化還原酶及UDP-葡糖醛酸基轉移酶或其任何組合的聚核苷酸。P450 3A4、CYP氧化還原酶及UDP-葡糖醛酸基轉移酶為可用於產生類黃酮葡糖醛酸化物的酶。葡糖苷酸，亦稱為葡萄糖苷酸，係任何由葡糖醛酸經由糖苷鍵連接至另一物質而產生之物質。葡糖醛酸化物修飾適用於例如提高類黃酮之水溶性。

在一些實施例中，系統包括一或多個編碼轉錄因子之聚核苷酸。轉錄因子可增強一或多種類黃酮前驅體或中間物之產生。在某些實施例中，本發明產生過度表現一或多種轉錄因子(諸如MYB轉錄因子)之經基因修飾或轉殖基因植物，該等轉錄因子經由類黃酮及綠原酸及花青素生物合成路徑增強代謝物通量。在一些實施例中，聚核苷酸編碼MYB轉錄因子。在某些實施例中，此等轉錄因子可包括各種類似物。在某些實施例中，一或多種轉殖基因可連接至一或多種由轉錄因子調控之啟動子。

在一些實施例中，MYB轉錄因子係選自：ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5)、AtCPC、AtMYBL2、AtMYB11、AtMYB12、AtMYB60、AtMYB75/PAP1、AtMYB90/PAP2、AtMYB111、AtMYB113、AtMYB114、AtMYB123/TT2、HvMYB10、BoMYB2、PURPLE (PR)、MrMYB1 SmMYB39、GMYB10、VlMYBA1-1、VlMYBA1-2、VlMYBA1-3、VlMYBA2、VvMYBA1、VvMYBA2、VvMYBC2-L1、VvMYBF1、VvMYBPA1、VvMYBPA2、VvMYB5a、VvMYB5b、EsMYBA1、GtMYBP3、GtMYBP4、InMYB1、BoPAP1、MYB110a、DkMYB2、DkMYB4、LEGUME ANTHOCYANIN PRODUCTION1 (LAP1)、MtPAR、LhMYB6、LhMYB12、LhMYB12-Lat、LjMYB14、LjTT2a、LjTT2b、LjTT2c、ZmC1、ZmPL、ZmPL-BLOTCHED1 (PL-BH)、ZmP1、ZmMYB-IF35、GmMYB10、PpMYB10、PpMYBPA1、CsRUBY、OgMYB1、PcMYB10、PyMYB10、Petunia AN2、Petunia DPL、Petunia PHZ、PhMYBx、PhMYB27、PtMYB134、PtoMYB216、StAN1、StAN2、StMTF1、TaMYB14、AmROSEA1、AmROSEA2、VENOSA、SorghumY1、GmMYB176、GmMYB-G20-1、GmMYB12B2、FaMYB1、FaMYB9、FaMYB10、FaMYB11、PvMYB4a、NtAN2、LeANT1、SlMYB12、SlMYB72 AmDEL、FaMYB10、FavbHLH及大麻MYB12樣及其類似物。在一些實施例中，MYB轉錄因子為AtMYB12。

在一些實施例中，本發明之系統產生作為綠原酸或水溶性槲皮素衍生物之多酚。在某些實施例中，綠原酸為3- O-咖啡醯奎尼酸(3-CQA)、4- O-咖啡醯奎尼酸(4-CQA)及/或5- O-咖啡醯奎尼酸(5-CQA)。在某些實施例中，水溶性槲皮素衍生物為槲皮素-3- O-葡糖苷(Q3G)及/或槲皮素-3- O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)。在一些實施例中，多酚增加之產量藉由LCMS定量。在一些實施例中，多酚增加之產量藉由HPLC定量。在一些實施例中，相較於對照系統，多酚增加之產量增加2倍至5倍的產量。在一些實施例中，對照系統為無表現卡匣之系統。

對於該系統之任一聚核苷酸，聚核苷酸可經密碼子最佳化以在萵苣細胞中表現。在特定實施例中，聚核苷酸可經密碼子最佳化以於紅萵苣細胞中表現。

在一些實施例中，異源表現控制序列包含在植物細胞中起作用之啟動子。在一些實施例中，啟動子為組成型活性植物啟動子。在一些實施例中，啟動子為組織特異性啟動子。在特定實施例中，組織特定啟動子為葉特異性啟動子。在一些實施例中，該啟動子為誘導型啟動子。在一些實施例中，聚核苷酸進一步包含選自以下之調節序列：位於啟動子序列與編碼序列之間的充當轉譯前導序列之5' UTR、3'非轉譯序列、3'轉錄終止區及聚腺苷酸化區。許多啟動子可用於任何相關基因之植物基因表現，包括但不限於可選標記、用於害蟲耐受性之基因、疾病抗性、營養增強及農藝相關之其他基因。

適用於萵苣植株基因表現之組成型啟動子之一些實例包括但不限於Rsyn7啟動子及其他揭示於WO 99/43838及美國專利第6,072,050號中之組成型啟動子；核心CaMV 35S啟動子(Odell等人(1985) Nature 313:810-812)；水稻肌動蛋白(McElroy等人 (1990) Plant Cell 2: 163-171)；泛素(Christensen 等人 (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 及Christensen等人 (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689)；pEMU (Last等人 (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588)；MAS (Velten等人 (1984) EMBO J. 3:2723-2730)；ALS啟動子(美國專利第5,659,026號)及其類似者。其他組成型啟動子包括例如美國專利第5,608,149號；第5,608,144號；第5,604,121號；第5,569,597號；第5,466,785號；第5,399,680號；第5,268,463號；第5,608,142號；及第6,177,611號。

可採用巨噬細胞特異性啟動子靶向特定植物組織內之增強的表現。組織較佳啟動子包括描述於以下中之啟動子：Yamamoto等人(1997) Plant J. 12(2):255-265; Kawamata等人(1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen等人(1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell等人(1997) Transgenic Res. 6(2): 157- 168; Rinehart等人(1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341; Van Camp等人(1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini等人(1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto等人(1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozco等人(1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka等人(1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; 及Guevara-Garcia等人(1993) Plant J. 4(3):495-505。必要時，此類啟動子可經修飾以用於弱表現。

葉特異性啟動子為此項技術中已知的。參見例如Yamamoto等人(1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon等人(1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto等人(1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor等人(1993) Plant J. 3:509-18; Orozco等人(1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129-1138; 及Matsuoka等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590。

合成啟動子亦為此項技術中已知的。合成組成型啟動子揭示於例如美國專利第6,072,050號及第6,555,673號中。

在一些實施例中，用於在萵苣中增加多酚產量的系統包含：本發明之至少一種良性應激子/激發子或其同系物、異構體或衍生物；及本發明之表現卡匣。

對於該系統之聚核苷酸中之任一者，聚核苷酸可包括於植物轉型載體中。「轉型」係指將新遺傳物質(例如外源性轉殖基因或呈表現卡匣形式)引入萵苣植株細胞萵苣植株中。將DNA轉移至萵苣植株細胞中之例示性機制包括但不限於電穿孔、微彈轟擊、農桿菌介導之轉型及藉由原生質體之直接DNA吸收。植物原生質體之轉型亦可使用基於磷酸鈣沈澱、聚乙二醇處理、電穿孔及此等處理之組合的方法實現(參見例如Potrykus等人, 1985; Omirulleh等人, 1993; Fromm等人, 1986; Uchimiya等人, 1986; Marcotte等人, 1988)。植物之轉型及外來基因元件之表現例示於Choi等人(1994)及Ellul等人(2003)中。

如本文所用，「植物轉型載體」係指用作遞送外來遺傳物質至植物細胞中之媒介的DNA分子。表現卡匣可為載體(例如植物轉型載體)之組分，且多個表現卡匣可共同存在於單一載體中。舉例而言，載體可編碼多種相關蛋白質(例如兩種不同類黃酮生物合成酶或單一類黃酮生物合成酶及可選擇標記或可篩選標記)。

用於萵苣細胞轉型之載體不受限制，只要載體可在細胞中表現所插入之DNA即可。舉例而言，可使用包含用於萵苣細胞中組成型基因表現之啟動子(例如花椰菜嵌紋病毒35S啟動子)及由外源性刺激誘導之啟動子的載體。適合載體之一些實例包括具有GUS報導基因之二元農桿菌載體用於植物轉型。待引入有載體之萵苣細胞包括各種形式之萵苣細胞，諸如經培養細胞懸浮液、原生質體、葉切片及愈傷組織。可藉由已知方法將載體引入萵苣細胞中，該等已知方法諸如聚乙二醇法、聚陽離子法、電穿孔、農桿菌介導之轉移、粒子轟擊及藉由原生質體之直接DNA吸收。

在一些實施例中，植物轉型載體包括可選標記。在特定實施例中，可選標記物係選自殺生物劑抗性標記物、抗生素抗性標記物或除草劑抗性標記。

在一些實施例中，本發明之系統進一步包含可篩選標記。在特定實施例中，可篩選標記物係選自β-葡糖醛酸苷酶或uidA基因(GUS)、R-基因座基因、β-內醯胺酶基因、螢光素酶基因、xylE基因、澱粉酶基因、酪胺酸酶基因及α-半乳糖苷酶基因。

在一些實施例中，植物轉型載體來源於根癌農桿菌之質體。在某些實施例中，載體來源於根癌農桿菌之Ti質體。在某些實施例中，載體來源於發根農桿菌之Ri質體。農桿菌介導之轉移為用於將基因座引入至植物細胞中之廣泛適用的系統。現代農桿菌轉型載體能夠在大腸桿菌以及農桿菌中複製，允許方便的操縱(Klee等人, 1985)。此外，當前用於農桿菌介導之基因轉移之載體的技術發展已改良載體中之基因及限制性位點之排列，以有助於構築能夠表現各種多肽編碼基因之載體。所描述之載體具有側接有啟動子之方便的多連接子區及用於直接表現所插入多肽編碼序列之聚腺苷酸化位點。另外，含有武裝及解除武裝Ti基因之農桿菌可用於轉型。

已確定經由農桿菌介導之植物整合載體轉型以將DNA引入萵苣植株細胞中之方案及方法(Fraley等人, 1985; 美國專利第5,563,055號)。舉例而言，美國專利第5,349,124號描述一種使用農桿菌介導之轉型來轉型萵苣植株細胞之方法。藉由插入具有編碼全長蘇力菌(Bt)毒素蛋白(其表現針對鱗翅目幼蟲，例如毛蟲有毒之蛋白質)之DNA編碼序列的嵌合基因，此方法產生對此類昆蟲具有抗性之萵苣。

微彈轟擊技術為廣泛適用的，且可用於轉型幾乎任何植物物種。涉及用萵苣之微彈轟擊轉型之實例可見於例如Elliott等人 2004; Phys. Rev. Lett. 92, 095501中。

轉殖基因萵苣細胞及轉殖基因萵苣植株在一些實施例中，本文揭示用本文中所描述之聚核苷酸及/或表現卡匣中之一或多者轉型的轉殖基因萵苣。如本文所述，轉殖基因萵苣細胞可為萵苣植株之一部分。在一些實施例中，本文揭示一種用本文所述之一或多個聚核苷酸及/或表現卡匣轉型的轉殖基因萵苣細胞。在一些實施例中，轉殖基因萵苣包含轉殖基因萵苣細胞。在一些實施例中，轉殖基因萵苣或萵苣細胞為萵苣種子。在某些實施例中，本發明提供包含如本文所述之系統的萵苣種子。

在一些實施例中，本發明之轉殖基因萵苣細胞、轉殖基因萵苣或轉殖基因萵苣種子顯示一或多種多酚或其衍生物之提高的產量。在一些實施例中，提高的產量包含相對於對照萵苣細胞或對照萵苣一或多種多酚或其衍生物之增加的產量。在一些實施例中，相對於對照萵苣細胞或對照萵苣，一或多種多酚或其衍生物之提高的產量改進。在一些實施例中，一或多種多酚或其衍生物係選自綠原酸或其衍生物，諸如3- O-咖啡醯奎尼酸(3-CQA)、4- O-咖啡醯奎尼酸(4-CQA)、5- O-咖啡醯奎尼酸(5-CQA)、3,4-二咖啡醯奎尼酸(3,4-diCQA)、菊苣酸；槲皮素及水溶性槲皮素衍生物諸如槲皮素-3- O-葡糖苷(Q3G)及槲皮素-3- O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)；其他，芹菜素及衍生物、木犀草素及衍生物、金聖草素及衍生物、楊梅黃酮及衍生物；及花青素，諸如矢車菊素3-丙二醯基-葡糖苷、矢車菊素-3- O-葡糖苷及類似物。在一些實施例中，一或多種多酚或其衍生物包括槲皮素-3-O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)。在一些實施例中，一或多種多酚或其衍生物包含5-O-咖啡醯奎尼酸(5-CQA)。

在某些實施例中，多酚或其衍生物係選自綠原酸及槲皮素。在一些特定實施例中，一或多種多酚或其衍生物包含5- O-咖啡醯奎尼酸(5-CQA)、4- O-咖啡醯奎尼酸(4-CQA)、3- O-咖啡醯奎尼酸(3-CQA)、3, 4-二咖啡醯奎尼酸(3,4-diCQA)、菊苣酸、槲皮素、槲皮素-3- O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)及槲皮素-3- O-葡糖苷(Q3G)。

在一些實施例中，本文所述之萵苣為具有來自一般萵苣類型之紅葉萵苣栽培品種。在一些實施例中，本發明之萵苣，其中一般萵苣類型係選自散葉萵苣、橡葉萵苣、長葉萵苣、奶油萵苣、卷心萵苣及夏季脆萵苣。在一些實施例中，萵苣為紅葉萵苣栽培品種。在一些實施例中，紅葉萵苣栽培品種係選自皺葉萵苣(Lollo Rossa)、新品紅火萵苣(New Red Fire Lettuce)、紅帆萵苣(Red Sails Lettuce)、熱迪納萵苣(Redina Lettuce)、銀河萵苣(Galactic Lettuce)、巴塔維亞萵苣(Batavian lettuce)及貝尼托萵苣(Benito Lettuce)。在一些實施例中，萵苣為安納波利斯萵苣(Annapolis Lettuce)、Hongjil萵苣、紅火萵苣、晉拉克萵苣(Jinluck Lettuce)、戴茲樂萵苣(Dazzler Lettuce)、首爾紅萵苣、革命萵苣(Revolution Lettuce)、切諾基萵苣(Cherokee Lettuce)、纈草萵苣(Valerial Lettuce)、OOC 1441萵苣、伊姆普路斯萵苣(Impuls Lettuce)、紅霧萵苣(Red Mist Lettuce)、紅沙拉碗萵苣(Red Salad Bowl Lettuce)、紅潮萵苣(Red Tide Lettuce)、貝爾維尤萵苣(Bellevue Lettuce)、非凡萵苣(Outredgeous Lettuce)、石榴鬆脆性萵苣(Pomegranate Crunch Lettuce)、伏爾甘萵苣(Vulcan Lettuce)、坎塔里克斯萵苣(Cantarix Lettuce)、布林萵苣(Breen Lettuce)、胭脂D'Hiver萵苣(Rouge D'Hiver Lettuce)、奧斯卡萵苣(Oscarde Lettuce)、葉片萵苣(Blade Lettuce)、斯波克萵苣(Spock Lettuce)、愛多士萵苣(Edox Lettuce)、堡壘萵苣(Fortress Lettuce)、斯坦佛萵苣(Stanford Lettuce)、斯卡拉曼加萵苣(Scaramanga Lettuce)或羅格斯深紅萵苣(Rutgers Scarlet Lettuce)。

在一些實施例中，轉殖基因萵苣細胞包含懸浮培養植物細胞。在特定實施例中，懸浮液培養植物細胞為紅葉萵苣之細胞。

生產轉殖基因植物細胞或轉殖基因植物之方法在一些態樣中，本文提供生產能夠合成一或多種多酚之轉殖基因萵苣的方法。在一些實施例中，方法包括：將本發明之系統、轉殖基因或表現卡匣引入萵苣細胞中以產生經轉型萵苣細胞；在足以允許包含複數個經轉型萵苣細胞之萵苣細胞培養物發育的條件下培養經轉型萵苣細胞；篩選經轉型萵苣細胞以表現由該系統、轉殖基因或表現卡匣編碼之多肽；以及自該萵苣細胞培養物選擇表現該多肽之經轉型萵苣細胞。在一些實施例中，轉型係用原生質體、電穿孔、用碳化矽纖維攪拌、農桿菌介導轉型或藉由加速經DNA包覆之粒子進行。在一些實施例中，萵苣細胞使用農桿菌介導之轉型轉型來轉型且植物轉型載體包含農桿菌載體。在一些實施例中，經轉型細胞之選擇係基於可篩選標記物之表現的偵測。在一些實施例中，轉型可為穩定轉型或短暫轉型。

可使用各種方法將相關序列引入至植物或植物部分中。「引入(Introduce)」或「引入(introducing)」意欲意謂以使得序列可接近植物細胞之內部的方式向植物、植物細胞或植物部分呈遞聚核苷酸或多肽。本發明之方法不取決於將序列引入至植物或植物部分中之特定方法，僅該聚核苷酸或多肽可接近植物之至少一個細胞之內部。用於將聚核苷酸或多肽引入至植物中之方法為此項技術中已知的，包括但不限於穩定轉型方法、短暫轉型方法及病毒介導之方法。

「穩定轉型」意欲意謂聚核苷酸整合至植物之基因體中或聚核苷酸整合至色素體(亦即葉綠體、澱粉體、色素體、耳石、白色體、造油體及蛋白質體)之基因體中，且聚核苷酸能夠由植物之子代遺傳。「短暫轉型」意欲意謂聚核苷酸引入至植物中且不整合至植物的基因體中。轉型方案以及用於將多肽或聚核苷酸序列引入植物中之方案可視靶向轉型之植物或植物細胞之類型，亦即單子葉或雙子葉而變化。將多肽及聚核苷酸引入至植物細胞中之適合方法包括顯微注射(Crossway等人(1986) Biotechniques 4:320-334)、電穿孔(Riggs等人(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606、農桿菌介導之轉型(美國專利第5,563,055號及第5,981,840號)、直接基因轉移(Paszkowski等人(1984) EMBO J. 3:2717-2722)及衝擊粒子加速(參見例如美國專利第4,945,050號；第5,879,918號；第5,886,244號及第5,932,782號；Tomes等人(1995)於Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods,中編 Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin)；McCabe等人(1988) Biotechnology 6:923-926)；及Lecl transformation (WO 00/28058)。亦參見 Weissinger等人(1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford等人(1987) Particulate Science and Technology 5 27-37 (洋蔥); Christou等人(1988) Plant Physiol. 87:671-674 (大豆); McCabe等人(1988) Bio/Technology 6:923-926 (大豆); Finer及McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (大豆); Singh等人(1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (大豆); Datta等人(1990) Biotechnology 8:736-740 (水稻); Klein等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (玉米); Klein等人(1988) Biotechnology 6:559-563 (玉米); 美國專利第5,240,855號；第5,322,783號；及第5,324,646號; Klein等人(1988) Plant Physiol. 91:440-444 (玉米); Fromm等人(1990) Biotechnology 8:833-839 (玉米); Hooykaas-Van Slogteren等人(1984) Nature (London) 311 :763-764; 美國專利第5,736,369號 (cereals); Bytebier等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (百合); De Wet等人(1985)於The Experimental Manipulation of Ovule Tissues中編 Chapman等人(Longman, New York), 第197-209頁(花粉); Kaeppler等人(1990) Plant Cell Reports 9:415-418 及Kaeppler等人(1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (須介導之轉型); D'Halluin等人(1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (電穿孔); Li等人(1993) Plant Cell Reports 12:250-255及Christou及Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (水稻); Osjoda等人(1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (經由根癌農桿菌之玉米)；，該等所有文獻均以引用的方式併入本文中。

在某些實施例中，轉型係藉由農桿菌介導之轉型且植物轉型載體包含農桿菌載體。在特定實施例中，農桿菌載體包含Ti質體或Ri質體。農桿菌介導之轉移為此項技術中關於將基因座引入至植物細胞中之現有方法。DNA可引入整個植物組織中，由此無需自原生質體再生完整植物。農桿菌轉型載體能夠在大腸桿菌以及農桿菌中複製，允許方便的操縱(Klee等人, 1985. Bio. Tech. 3(7):637-342)。此外，用於農桿菌介導之基因轉移的載體在載體中具有改良的基因排列及限制位點以促進能夠表現各種多肽編碼基因之載體的構築。此類載體具有側接有啟動子之方便的多連接子區及用於直接表現所插入多肽編碼序列之聚腺苷酸化位點。另外，含有武裝及解除武裝之基因之農桿菌可用於轉型。

在某些實施例中，萵苣細胞或萵苣植株使用根癌農桿菌Ti質體介導之轉型，用植物表現載體pSCP-ME(SignalChem)來轉型。pSCP-ME為用於高含量表現攜帶組成型SCP啟動子及嵌合終止子之雙子葉植株中之外來基因的二元載體。所有轉殖基因可選殖至pSCP-ME中用於短暫或穩定轉型。

生產萵苣多酚之方法在一些態樣中，本文提供生產一或多種多酚或其衍生物之方法。在一些實施例中，生產一或多種多酚或其衍生物之方法包含向萵苣植株或細胞投與本文所揭示之至少一種良性應激子/激發子或其同系物、異構體或衍生物，由此增加萵苣植株或細胞中之多酚之產量。在某些實施例中，至少一種良性應激子/激發子係選自：吲哚-3-乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、草酸、苯并噻二唑(BTH)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、二十碳四烯酸(AA)、柳酸(SA)、茉莉酸甲酯(MJ)、哈平蛋白(HP)或其任何組合或混合物。

在一些實施例中，生產一或多種多酚或其衍生物之方法包含在足以生產一或多種多酚或其衍生物之條件下培養轉殖基因萵苣細胞或培養本發明之轉殖基因萵苣或萵苣種子。在一些實施例中，轉殖基因萵苣細胞、轉殖基因萵苣或萵苣種子包含表現卡匣，該表現卡匣包含可操作地連接於編碼一或多種蛋白質之至少一個聚核苷酸的異源表現控制序列，該一或多種蛋白質增加萵苣中之多酚之產量。在某些實施例中，表現卡匣包含編碼丙二酸-CoA連接酶之聚核苷酸。在一些實施例中，丙二酸-CoA為AAE13。在一些實施例中，表現卡匣包含編碼MYB轉錄因子之聚核苷酸。在一些實施例中，MYB轉錄因子為AtMYB12轉錄因子。在一些實施例中，表現卡匣包含編碼苯丙烷路徑之酶的聚核苷酸。在特定實施例中，苯丙烷路徑之酶係選自：苯丙胺酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羥化酶(C4H)及4-香豆酸：CoA連接酶(4CL)或其任何組合。在某些實施例中，表現卡匣包含編碼綠原酸路徑之酶的聚核苷酸。在特定實施例中，綠原酸路徑之酶係選自：羥基桂皮醯基CoA：奎尼酸羥基桂皮醯基轉移酶(HQT)、對香豆醯基-3-羥化酶(C3H)及咖啡醯基-CoA-3- O-甲基轉移酶(CCoAMT)或其任何組合。在某些實施例中，表現卡匣包含編碼類黃酮路徑之酶的聚核苷酸。在特定實施例中，類黃酮路徑之酶係選自：查耳酮合成酶(CHS)、查耳酮異構酶(CHI)、黃烷酮3-羥化酶(F3H)及黃酮醇合成酶(FLS)、類黃酮3'-羥化酶(F3'H)、對香豆酸3-羥化酶(C3H)、肉桂酸4-羥化酶(C4H)、4-羥基桂皮醯基-CoA連接酶(4CL)、羥基桂皮醯基-CoA莽草酸/奎尼酸羥基桂皮醯基轉移酶(HCT)、羥基桂皮醯基-CoA奎尼酸羥基桂皮醯基轉移酶(HQT)或其任何組合。在某些實施例中，表現卡匣包含編碼細胞色素P450 3A4、CYP氧化還原酶及UDP-葡糖醛酸基轉移酶或其任何組合之聚核苷酸。

在一些實施例中，一或多種多酚或其衍生物係選自：綠原酸或其衍生物、菊苣酸及/或水溶性槲皮素衍生物。在一些實施例中，綠原酸為3- O-咖啡醯奎尼酸(3-CQA)、4- O-咖啡醯奎尼酸(4-CQA)及/或5- O-咖啡醯奎尼酸(5-CQA)；菊苣酸為(2 R,3 R)- O-二咖啡醯奎尼酸；及/或其中水溶性槲皮素衍生物為槲皮素-3- O-葡糖苷(Q3G)及/或槲皮素-3- O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)。在一些實施例中，多酚增加之產量藉由LCMS定量。在一些實施例中，多酚增加之產量藉由HPLC定量。

提取物及食品在某些實施例中，本發明提供本發明之萵苣細胞、轉殖基因萵苣或萵苣種子之提取物，其包含與對照相比量增加之一或多種多酚或其衍生物。在一些實施例中，本發明之提取物為紅萵苣提取物SLC1021。在一些實施例中，提取物包含水及乙醇及可溶於其中之萵苣組分。在一些實施例中，提取物包含約2%綠原酸、2%菊苣酸及2%花青素及約3.5%槲皮素(w/w)。

在一些實施例中，本發明提供一種製備萵苣提取物之方法，其包含將萵苣樣品與溶劑混合及將液相與固相分離。在一些實施例中，溶劑為食品級溶劑。在某些實施例中，溶劑為乙醇。萵苣樣品可為新鮮、冷凍或脫水的。在一些實施例中，萵苣與溶劑之比率(g/mL)為1:10、1:5、2:5、3:5、4:5或1:1。在某些實施例中，萵苣與溶劑之比率(g/mL)為2:5。在一些實施例中，製成萵苣提取物之方法包含將萵苣樣品冷凍、研磨冷凍萵苣樣品、將萵苣樣品與乙醇以2:5比率(g/mL)混合及將液相與固相分離。

在一些實施例中，萵苣提取物預防或減少病毒感染或細菌感染、糖尿病、心血管疾病、神經退化性疾病(包括記憶及視力損失)、發炎及癌症之症狀。在一些實施例中，萵苣提取物為提供消炎、抗癌、抗微生物、抗過敏、抗病毒、抗血栓及/或保肝作用之抗氧化劑。在一些實施例中，萵苣提取物抑制或減少病毒複製、減少發炎、改善視力、調節免疫反應、減少肥胖症及糖尿病、降低血糖含量或其任何組合。

在一些實施例中，本文揭示一種含有本發明中所述之萵苣或萵苣部分之食品。如本文所用，「食品」包括本文所述之萵苣植株部分及/或來自本文所述之萵苣植株部分之提取物。食品可為新鮮的或經處理，例如罐裝、蒸、煮、炸、焯或及/或冷凍。此外，本揭露內容的食品不受特定限制。舉例而言，本發明適用於製備食用萵苣之食品，諸如：沙拉、三明治、於湯中、作為果汁、作為萵苣包皮、油爆或快炒、燒烤、燜燉、分成春捲及包皮，摻入米飯及/或面碗以及作為調味醬。在一些實施例中，食品用於哺乳動物。在一些實施例中，食品用於人類。

在一些實施例中，食品預防或減少病毒感染或細菌感染、糖尿病、心血管疾病、神經退化性疾病(包括記憶及視力損失)、發炎及癌症之症狀。在一些實施例中，食品為提供消炎、抗癌、抗微生物、抗過敏、抗病毒、抗血栓及/或保肝作用之抗氧化劑。在一些實施例中，食品抑制或減少病毒複製、減少發炎、改善視力、調節免疫反應、減少肥胖症及糖尿病、降低血糖含量或其任何組合。

治療病毒感染之方法在一些實施例中，本文揭示一種用於治療病毒感染之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明之提取物或食品。在一些實施例中，病毒為冠狀病毒(例如COVID-19、SARS、MERS)、A型流感(流感A)、呼吸道融合病毒(RSV)、茲卡病毒、登革熱病毒(DENV2)。在某些實施例中，提取物或食品中所存在之酚類化合物抑制及/或干擾病毒蛋白質之活性。如本文所用，術語「抑制」係指減少或預防目標蛋白質之至少一種活性。活性可抑制及/或降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或100%，如藉由本文所揭示或此項技術中已知之方法所量測。在一些實施例中，治療病毒感染之方法包含為紅萵苣提取物SLC1021之提取物。在一些實施例中，提取物之濃度為約10 µg/mL - 200 µg/mL、10 µg/mL - 150 µg/mL、10 µg/mL - 100 µg/mL、10 µg/mL - 90 µg/mL、10 µg/mL - 80 µg/mL、10 µg/mL - 70 µg/mL、10 µg/mL - 60 µg/mL。在一些實施例中，SLC1021之濃度大於約1 µg/mL、2 µg/mL、3 µg/mL、4 µg/mL、5 µg/mL、6 µg/mL、7 µg/mL、8 µg/mL、9 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL、30 µg/mL、40 µg/mL、50 µg/mL、60 µg/mL、70 µg/mL、80 µg/mL、90 µg/mL、100 µg/mL、120 µg/mL、140 µg/mL、160 µg/mL、180 µg/mL、200 µg/mL、250 µg/mL、300 µg/mL、350 µg/mL、400 µg/mL、450 µg/mL或500 µg/mL。在本文所揭示之任何實施例中，患者可為人類。

在一些實施例中，為一種用於治療冠狀病毒(例如COVID-19、SARS、MERS)之病毒感染的方法。在一些實施例中，冠狀病毒為嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2(SARS-CoV-2)。在一些實施例中，SARS-CoV-2引起冠狀病毒病2019(COVID-19)。在一些實施例中，用於治療冠狀病毒感染之方法包含向感染冠狀病毒之患者投與有效量之本發明之提取物或食品產物，其中抑制3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3CL ^pro)之活性。3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3CL ^pro)為半胱胺酸蛋白酶，其在病毒聚合蛋白之蛋白水解加工中起重要作用，被認為為病毒複製及功能所必需之蛋白質。

在一些實施例中，用於治療冠狀病毒感染之方法包含向感染冠狀病毒之患者投與有效量之本發明之提取物或食品產物，其中抑制及/或減少RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)之活性。RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)，亦稱為nsp12，藉由催化RNA自RNA模板複製來介導病毒複製。RdRp為病毒非結構蛋白(nsp)之複製/轉錄催化複合體的核心組件。由於其對於RNA病毒之生命週期的重要作用，RdRp已被建議作為一類抗病毒藥物之目標，該等抗病毒藥物為核苷酸類似物，包括瑞德西韋(remdesivir)。

在一些實施例中，用於治療冠狀病毒感染的方法包含向感染冠狀病毒的患者投與有效量的本發明之提取物或食品產物，其中RNA解旋酶及三磷酸酶(nsp13)的活性受到抑制。SARS-CoV-2之RNA解旋酶(nsp13)為與SARS-CoV-1 nsp13共有99.8%序列一致性及驚人地保守性整體架構的超家族1解旋酶。如同其他冠狀病毒，SARS-CoV-2 nsp13展現多種酶活性。認為Nsp13為病毒複製中之必需酶，且常常與宿主免疫系統相互作用。

在一些實施例中，用於治療冠狀病毒感染的方法包含向感染冠狀病毒的患者投與有效量的本發明之提取物或食品，其中刺突蛋白與ACE2的結合受到抑制。在某些實施例中，刺突蛋白為2019-nCoV刺突蛋白。在一些實施例中，刺突蛋白受體結合域(RBD)與ACE2之相互作用經抑制。

在一些實施例中，為一種用於治療A型流感(流感A)之病毒感染之方法，其包含向有需要之患者投與有效量的本發明之提取物或食品。在一些實施例中，用於治療A型流感感染之方法包含作為紅萵苣提取物SLC1021之提取物。在一些實施例中，提取物之濃度為約1-100 µg/mL。在一些實施例中，提取物之濃度為約10.3 µg/mL、30.9 µg/mL或92.6 µg/mL。

在一些實施例中，為一種用於治療呼吸道融合病毒(RSV)之病毒感染之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明之提取物或食品。在一些實施例中，提取物之濃度為約1-400 µg/mL。在一些實施例中，提取物之濃度為約4.1 µg/mL、12.43 µg/mL、37 µg/mL、111 µg/mL或333 µg/mL。

在一些實施例中，為一種治療茲卡病毒病毒感染的方法，包含向有需要之患者投與有效量的本發明之提取物或食品。在一些實施例中，提取物之濃度為約1-1000 µg/mL。

在一些實施例中，為一種治療登革熱病毒(DENV2)之病毒感染之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明之提取物或食品。在一些實施例中，提取物之濃度為約1-1000 µg/mL。

治療癌症之方法在一些實施例中，本文揭示一種用於治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明之提取物或食品。在一些實施例中，癌症為白血病、淋巴瘤、乳癌或前列腺癌。在某些實施例中，提取物或食品中所存在之酚類化合物對癌細胞具有細胞毒性作用。在一些實施例中，治療引起以下中之至少一者：腫瘤消退、腫瘤進展速率降低、癌症生物標記含量降低、與癌症相關之症狀減少、癌轉移預防或延遲或臨床緩解。在一些實施例中，治療癌症之方法包含為紅萵苣提取物SLC1021之提取物。在一些實施例中，提取物之濃度為約0.1 mg/mL - 5 mg/mL、0.2 mg/mL - 4 mg/mL、0.2 mg/mL - 3 mg/mL、0.3 mg/mL - 3 mg/mL、0.4 mg/mL - 3 mg/mL、0.5 mg/mL - 3 mg/mL、0.4 mg/mL - 2.5 mg/mL、0.4 mg/mL - 2.0 mg/mL或0.4 mg/mL - 1.6 mg/mL。在一些實施例中，提取物之濃度為大於約0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL、1.3 mg/mL、1.4 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.7 mg/mL、1.8 mg/mL、1.9 mg/mL或2.0 mg/mL。在某些實施例中，提取物之濃度為約0.02 mg/mL、0.06 mg/mL、0.19 mg/mL、0.56 mg/mL、1.67 mg/mL或5 mg/mL。

治療發炎性病狀或疾病之方法在一些實施例中，本文揭示一種用於治療發炎性病狀或疾病之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明之提取物或食品。在某些實施例中，存在於提取物或食品產物中之酚類化合物抑制免疫細胞產生發炎性細胞介素。免疫細胞之實例包括單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞、T細胞、B細胞及自然殺手細胞。發炎性細胞介素之實例包括IL-6及TNFα。在一些實施例中，治療發炎性病狀或疾病之方法包含為紅萵苣提取物SLC1021之提取物。在一些實施例中，提取物之濃度為約0.1 mg/mL - 5 mg/mL、0.2 mg/mL - 4 mg/mL、0.2 mg/mL - 3 mg/mL、0.3 mg/mL - 3 mg/mL、0.4 mg/mL - 3 mg/mL、0.5 mg/mL - 3 mg/mL、0.4 mg/mL - 2.5 mg/mL、0.4 mg/mL - 2.0 mg/mL或0.4 mg/mL - 1.6 mg/mL。在一些實施例中，提取物之濃度為大於約0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL、1.3 mg/mL、1.4 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.7 mg/mL、1.8 mg/mL、1.9 mg/mL或2.0 mg/mL。在某些實施例中，提取物之濃度為約0.02 mg/mL、0.06 mg/mL、0.19 mg/mL、0.56 mg/mL、1.67 mg/mL或5 mg/mL。

抑制活性含氧物 (ROS) 產生之方法在一些實施例中，本文揭示一種用於抑制活性含氧物(ROS)產生之方法，該方法包含向有需要之患者投與有效量之本發明之提取物或食品。在某些實施例中，存在於提取物或食品中之酚類化合物抑制細胞中ROS之產生。ROS之實例包括一氧化氮。在一些實施例中，用於抑制ROS產生之方法包含為紅萵苣提取物SLC1021之提取物。在一些實施例中，提取物之濃度為約0.1 mg/mL - 5 mg/mL、0.2 mg/mL - 4 mg/mL、0.2 mg/mL - 3 mg/mL、0.3 mg/mL - 3 mg/mL、0.4 mg/mL - 3 mg/mL、0.5 mg/mL - 3 mg/mL、0.4 mg/mL - 2.5 mg/mL、0.4 mg/mL - 2.0 mg/mL或0.4 mg/mL - 1.6 mg/mL。在一些實施例中，提取物之濃度為大於約0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL、1.3 mg/mL、1.4 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.7 mg/mL、1.8 mg/mL、1.9 mg/mL或2.0 mg/mL。在某些實施例中，提取物之濃度為約0.02 mg/mL、0.06 mg/mL、0.19 mg/mL、0.56 mg/mL、1.67 mg/mL或5 mg/mL。

實例以下實例係為了說明，而非為了限制而提供。

實例1 使用良性應激子/激發子提高紅萵苣中之多酚產量此實例證實當以生物/非生物良性應激子/激發子處理時，紅葉萵苣中之多酚產量增加。

植物材料、生長條件及良性應激子 / 激發子處理在實驗室溫室中，在12小時/天之平均光週期下，在25-28℃、40-60%相對濕度下，種植紅色品種之萵苣植株( Lactuca sativa)。所用非生物良性應激子/激發子為5、10、15、45及90 μM的吲哚-3-乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、草酸、苯并噻二唑(BTH)；2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、二十碳四烯酸(AA)、柳酸(SA)及茉莉酸甲酯(MJ)。所用生物良性應激子/激發子為30、60、120及1000 mg/L之哈平蛋白(HP)、聚葡萄胺糖、牛蒡果寡醣(BFO)、大虎杖提取物及海藻提取物。所有良性應激子溶解於去離子水中(非水溶性良性應激子事先溶解於1 mL乙醇中)。添加一組樣品及僅具有1 mL乙醇之水。添加未處理之對照樣品。在收穫前第14天對紅萵苣施加良性應激子/激發子處理。各實驗單元由隨機選擇且分配至一個處理之五個萵苣組成。各樣品藉由根吸收或葉面噴灑處理，各激發子噴霧3次(大致1.70 mL)。在50天收穫萵苣樣品。

提取及定量在用50%乙醇提取樣品之後，對經處理及未經處理(對照)紅萵苣中主要有益健康的多酚進行表徵及定量。一般而言，用液氮冷凍兩克樣品，研磨且與5 mL乙醇混合。樣品/乙醇混合物在室溫下震盪4小時且在5000×g下離心10分鐘(4℃)。收集上清液，過濾，且進行LC-MS分析。

結果使用LC/MS/UV確認多酚之產量提高。

如圖1中所示，藉由基於基因體學之技術增強的生物活性組分之層析圖確認用生物或非生物良性應激子處理之紅萵苣中之特定代謝物的產量。與未經處理之萵苣對照相比，多酚綠原酸(3-CQA)；菊苣酸；3,4-二咖啡醯奎尼酸(3,4-diCQA)；槲皮素-3- O-葡糖苷(Q3G)，槲皮素-3- O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)在經處理之萵苣中顯示出提高的產量。

如圖2A-2B中所示，綠原酸(圖2A)及水溶性槲皮素衍生物(圖6B)之產量在經良性應激子/激發子處理之紅萵苣中增加3至9倍。與未經處理之萵苣對照相比，綠原酸及衍生物(3-CQA、菊苣酸及3,4-diCQA)及槲皮素衍生物(Q3G及Q3MG)在經處理之萵苣中顯示出提高的產量。

此等結果表明，用非生物及/或生物良性應激子處理增加紅萵苣活體內多酚產量。良性應激子/激發子處理之組合可展示累加或協同反應。

實例2 藉由調節主要苯丙烷路徑之基因提高紅萵苣中之多酚產量此實例展示藉由調節主要苯丙烷路徑之基因增加多酚。更特定言之，此實例藉由過度表現AAE13及ATMYB12提高紅萵苣中之多酚含量，其作為在可食用蔬菜活體內生產生物活性分子之代表性實例，其藉由使用本發明專有基於基因體學之技術(例如系統)上調主要苯丙烷生物合成路徑以提高下游代謝物產量。

使用由SignalChem開發之植物懸浮細胞技術之短暫表現及穩定轉型的高效平台。特定言之，Ti質體介導之根癌農桿菌用植物表現載體pSCP-ME (SignalChem)轉型，該pSCP-ME為用於高含量表現攜帶組成型SCP啟動子及嵌合終止子之雙子葉植株中之外來基因的二元載體。為工程改造丙二醯基-CoA之生物合成且增加用於有益健康的多酚合成之構築嵌段，將轉殖基因AAE13(丙二酸-CoA連接酶)及AtMYB12轉錄因子選殖入pSCP-ME中以供短暫及穩定轉型。

將含有轉殖基因之農桿菌株AGL1之隔夜培養物轉移至具有補充有100 mg/L卡那黴素(kanamycin)、50 mg/L卡本西林(carbenicillin)及50 mg/L立複黴素(rifampicin)之250 mL YEP培養基的1000 mL燒瓶中，且生長4-8小時直至600 nm處之光密度(OD600)達到大致0.5與1之間。細胞在室溫下在離心機中粒化且再懸浮於45 mL含有5 g/L D-葡糖、10 mM MES、10 mM MgCl ₂及200 μM乙醯丁香酮之浸潤培養基中。使用藉由真空滲入進行之農桿菌滲入法在紅萵苣葉中短暫表現及穩定轉型。

結果使用LC/MS確認多酚之提高的產量。

在農桿菌滲入之後5-7天，使用LC/MS確認多酚之積聚。圖3展示層析圖，其展現藉由紅萵苣葉細胞生產多酚。本發明證實，如本文所述實現了用攜帶以上基因之農桿菌滲入萵苣葉。在農桿菌滲入之後5-7天，使用LC/MS確認多酚之積聚。

如圖3中所示，藉由基於基因體學之技術增強生物活性組分之層析圖(HPLC-UV)確認在經由調節主要苯丙烷路徑之基因處理之紅萵苣中之特定代謝物的產量。多酚3-CQA、菊苣酸、3,4-二咖啡醯奎尼酸(3,4-diCQA)、槲皮素-3- O-葡糖苷(Q3G)、槲皮素-3- O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)展示與未經處理之萵苣對照相比經處理之萵苣之提高的產量。

如圖4A-4B中所示，綠原酸(圖4)及水溶性槲皮素衍生物(圖4B)之產量在藉由調節主要苯丙烷路徑之基因處理後在紅萵苣中顯著增加。綠原酸及其衍生物(3-CQA、菊苣酸及3,4-diCQA)及槲皮素衍生物(Q3G及Q3MG)展示與未經處理之萵苣對照相比經處理之萵苣中之提高的產量。

此等結果展現諸如藉由過度表現AAE13及ATMYB12調節主要苯丙烷路徑之基因，增加紅萵苣活體內多酚產量。

實例3 本發明之紅萵苣提取物展示對COVID-19之抑制以下實例證實具有本發明之高含量多酚之紅萵苣提取物含有各種生物活性。

為了測試對SARS-CoV-2之抑制，表現且純化包括3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3CL ^pro)、RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)及SARS-CoV-2 RNA解旋酶(nsp13)之COVID-19病毒蛋白。進行酶抑制分析以確認各純化蛋白質之活性。所有酶分析係基於分光光度法。

使用如實例1及2中所述之方法製備經處理之紅萵苣提取物(SLC1021)。主要多酚經表徵且用LCMS分析定量。在酶抑制分析中測試提取物(SLC1021)。

結果如圖5中所示，經處理之紅萵苣提取物(SLC1021)展示對SARS-CoV-2 3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3CL ^pro)之抑制。當與未經處理之植物提取物(3CL ^pro+對照)或純槲皮素-3- O-葡糖苷(3CL ^pro+Q3G)相比時，展現SLC1021(紅萵苣提取物)(3CL ^pro+SLC1021)之更強抑制效果。*：等效於該植物提取物中之100 mM槲皮素衍生物。

如圖6中所示，經處理之紅萵苣提取物(SLC1021)展示對SARS-CoV-2 RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)之抑制。當與未經處理之植物提取物(RdRp+對照)相比時，觀測到SLC1021(RdRp+SLC1021)之較強抑制效果。*：等效於該植物提取物中之100 mM槲皮素衍生物。

如圖7中所示，經處理之紅萵苣提取物(SLC1021)展示對SARS-CoV-2 RNA解旋酶及三磷酸酶(nsp13)之抑制。當與未經處理之植物提取物(nsp13+對照)相比時，觀測到SLC1021(nsp13+SLC1021)之較強抑制效果。*：等效於該植物提取物中之100 mM槲皮素衍生物。

實例4 本發明之紅萵苣提取物展示對Vero E6細胞中之SARS-COV-2病毒之抑制進行實驗以測試經處理之紅萵苣提取物(SLC1021)對Vero E6細胞中之SARS-CoV-2病毒誘導之細胞病變效應(CPE)之抑制。亦進行實驗以評定在Vero E6細胞中之SARS-CoV2病毒(SARS-CoV2 _USA/WA1/2020)複製之後，經處理之紅萵苣提取物(SLC1021)對細胞活力的影響。使用如實例1及2中所述之方法製備經處理之紅萵苣提取物(SLC1021)。主要多酚經表徵且用LCMS分析定量。

方法：藉由中性紅色染料量測在Vero E6細胞中之SARS CoV2病毒(SARS-CoV2 _USA/WA1/2020)複製之後的病毒誘導之細胞病變效應(CPE)及細胞活力。將細胞接種於96孔平底組織培養盤中且使其在37℃及5% CO2下黏附隔夜以實現80-100%匯合。在培育之後，將經稀釋之測試化合物及病毒添加至盤中，稀釋至預定效價以在感染後3天產生超過80%細胞病變效應。在37℃、5% CO ₂下培育3天之後，培養盤用中性紅色染料染色大致2小時。移除上清液染料，且用PBS沖洗孔，且將併入之染料在50:50 Sorensen檸檬酸鹽緩衝液/乙醇中提取＞30分鐘且以分光光度法在540 nm下讀取光密度。使用四個參數曲線擬合分析來計算感染病毒之孔的CPE降低百分比及未感染藥物對照孔之細胞活力百分比以測定EC50及TC50值。EC50表示測試化合物抑制CPE達50%的濃度；TC50為在不存在病毒的情況下引起50%細胞死亡的濃度。

結果：SLC1021展示Vero E6細胞中免於SARS-CoV2誘導之細胞病變效應(CPE)的細胞保護潛力。儘管EC50未達到50%，當SLC1021濃度達到＞92.6 µg/ml時，證實細胞保護傾向(圖8)。

實例5 用SLC1021阻斷SARS-COV刺突蛋白與ACE2-CHO細胞之結合冠狀病毒在病毒包膜上使用同源三聚刺突醣蛋白結合於其細胞受體，例如ACE2。刺突醣蛋白包含各刺突單體中之S1次單元及S2次單元。結合於細胞受體之冠狀病毒引起一系列事件，該等事件使得細胞與病毒膜之間融合以便進入細胞。因此，認為與ACE2受體之結合為SARS-CoV進入目標細胞中之重要初始步驟。受體結合域(RBD)係S1次單元內之重要功能組分，其負責SARS-CoV-2與ACE2之結合(Lan, J., Ge, J., Yu, J. 等人 Nature2020, 581, 215-220)。

為了證實2019-nCoV刺突蛋白RBD與ACE2相互作用之SLC1021阻斷，人類ACE2穩定細胞株CHO(SignalChem, A51C2-71C)用於此分析。使用如實例1及2中所述之方法製備經處理之紅萵苣提取物(SLC1021)。主要多酚經表徵且用LCMS分析定量。

方法：為了證實2019-nCoV刺突蛋白RBD與ACE2相互作用之SLC1021阻斷，人類ACE2穩定細胞株CHO(SignalChem, A51C2-71C)用於此分析。2019-nCoV刺突蛋白RBD、His標籤(SignalChem, C19SD-G241H)、抗2019-nCoV刺突蛋白hIgG抗體(SignalChem, C19S1-61H)及小鼠抗人類IgG BB700 (BD, 742235)係根據製造商說明書使用。藉由對抗刺突蛋白hIgG及抗人類IgG染色，經由流式細胞量測術分析來確認RBD與ACE2之成功結合。根據製造商方案培養ACE2-CHO細胞(目標細胞)。10 µg/mL刺突蛋白RBD與100 µg/mL或10 µg/mL SLC1021一起預培育30分鐘且隨後添加至目標細胞中。目標細胞在冰上培育1小時且接著用PBS洗滌兩次。對照細胞與無SLC1021之10 µg/mL 刺突蛋白RBD一起培育。添加5 µg/mL之抗刺突蛋白hIgG且在冰上培育1小時。用PBS洗滌細胞兩次且添加小鼠抗人類IgG BB700。將細胞再次在冰上培育1小時。細胞接著用PBS洗滌兩次且使用CytoFLEX(Beckman)藉由流式細胞量測術分析。使用FlowJo (BD Biosciences)分析流式細胞量測術資料。

結果：結果證實，相比於對照，SLC1021減少刺突蛋白RBD與ACE2-CHO細胞之結合(圖9)。

實例6 RPMI2650細胞中人類流感A及RSV誘導之細胞病變效應(CPE)之SLC1021細胞保護評估SLC1021對感染人類流感病毒(流感A)、茲卡病毒、登革熱病毒(DENV2)或呼吸道融合病毒(RSV)之RPMI2650細胞的細胞保護作用。使用如實例1及2中所述之方法製備經處理之紅萵苣提取物(SLC1021)。主要多酚經表徵且用LCMS分析定量。

方法：藉由化學發光評估指標(CellTiterGlo)，量測在人類流感病毒(Flu _APR834)及A型呼吸道融合病毒(RSV _A2)在RPMI2650細胞中複製、茲卡病毒及DENV2病毒在Hub 7細胞中複製之後，對病毒誘導之細胞病變效應(CPE)及細胞活力之抑制。將細胞(5×10^5個細胞/孔)接種與96孔平底組織培養盤中且使其在37℃及5% CO2下黏附隔夜。在培育之後，將經稀釋之測試化合物及病毒添加至盤中，稀釋至預定效價以在感染後4天(FluA)產生至少50%細胞殺滅或在5天(RSV)時產生80%細胞殺滅。在37℃，5% CO ₂下培育4-5天之後，使用CellTiterGlo量測細胞活力。使用四個參數曲線擬合分析來計算感染病毒之孔的降低百分比及未感染藥物對照孔之細胞活力百分比以測定EC50及TC50值。EC50為抑制CPE達50%之測試化合物之濃度；TC50為在不存在病毒之情況下引起50%細胞死亡之濃度。

結果：SLC1021證實對經FluA或RSV感染之RPMI2650細胞之細胞病變效應的抑制。對流感A之治療指數(TI) ＞12且對RSV為約9.6(圖10A及10B，表2)。表2：SLC1021細胞保護分析

病毒株 / 細胞	EC50 (µg/mL)	TC50 (µg/mL)	TI
SAR-CoV2 _USA/WA1/2020/ VeroE6細胞	＞470	470	…
Flu _APR834/RPMI2650細胞	＜10	120	＞12
RSV _A2/PRMI2650細胞	70	670	9.57
Zika _PRVABC59/Huh7細胞	130	400	3.08
DENV2 _{New Guinea}/Huh7細胞	＞300	300	…

TI：治療指數實例7 腫瘤細胞上之SLC1021細胞毒性作用研究SLC1021對癌細胞的細胞毒性。Jurkat、HL60、THP1、MCF7及LNCaP細胞株用於細胞毒性分析。此外，評估SLC1021暴露後Jurkat細胞及初級人類T細胞之氧化還原狀態。使用如實例1及2中所述之方法製備經處理之紅萵苣提取物(SLC1021)。主要多酚經表徵且用LCMS分析定量。

方法：根據ATCC說明培養Jurkat、HL60、THP1、MCF7及LNCaP細胞株。藉由MTS (Promega，G111A)及PMS (Sigma，P9625)分析評定細胞活力。在分析前一天，MCF7及LNCaP (黏附細胞)用胰蛋白酶處理且用培養基洗滌。將細胞再懸浮於10%胎牛血清(FBS)培養基中且接種(2×10 ⁴個細胞/孔)於九十六孔培養盤(Sarstedt)中隔夜。在SLC1021處理當天，小心地移除培養基且用1% FBS培養基替換。洗滌剩餘懸浮細胞株，再懸浮於1% FBS培養基中，且接種(2×10 ⁴個細胞/孔)於九十六孔培養盤中。所有細胞隨後在37℃下在含有5% CO ₂之細胞培養箱中用SLC1021處理48小時(每孔總體積為100 µl)。此後，將25µl MTS溶液添加至各孔中且在37℃下培育2小時。最後，使用微量盤讀取器(SpectraMax i3X，Molecular Devices)在490 nm下記錄分光光度吸光度。藉由GraphPad Prism (GraphPad Software)測定引起50%細胞死亡之毒性濃度(TC ₅₀；µg/mL)。

使用氧化敏感螢光探針DCF-DA(OZBiosciences, ROS0300)監測細胞內活性含氧物(ROS)產生。使用CD3陽性細胞分離套組(Stemcell, 17951)自人類周邊血液單核細胞(Stemcell, 70025.1)分離初級人類T細胞。接著用抗CD3抗體(R&D systems, MAB100)以3 µg/mL活化初級T細胞72小時。活化T細胞接著在培養中在50 ng/mL下在人類IL-2(Sigma, SRP3085)下擴增7天，隨後應用於分析。在96孔培養盤(1×10 ⁵個細胞/孔)中接種Jurkat細胞及初級T細胞且用6.9至556.7 µg/mL之SLC1021在含有1% FBS之培養基中處理24小時。收集細胞並根據製造商方案用2 µM DCF-DA進行染色30分鐘。藉由流式細胞量測術檢測ROS產量。

結果：MTS分析顯示SLC1021提取物以濃度依賴性方式對所測試之細胞株具有細胞毒性作用。計算各細胞株之以下TC ₅₀值：Jurkat，799.8 µg/mL；HL60，1004.6 µg/mL；THP1，1039.9 µg/mL及LNCaP，2766.9 µg/mL (圖11)。

相較於未處理對照Jurkat細胞，用6.9 µg/mL持續24小時處理之Jurkat細胞顯示提高的ROS含量(圖12)。SLC1021之濃度增加引起Jurkat細胞中ROS含量顯著增加。用556.7 µg/mL SLC1021處理24小時的Jurkat細胞具有最高ROS含量且自細胞毒性分析觀測到之細胞毒性暗示Jurkat細胞死亡與由增加的ROS含量及降低的抗氧化能力引起之細胞內氧化還原平衡之破壞相關。在初級T細胞下未觀測到細胞內氧化還原反應之中斷。此等資料指示SLC1021在對人類初級T細胞不具有任何顯著影響情況下之潛在抗癌機制。

實例8 SLC1021、SLC1021-B及SLC1021之主要多酚組分對腫瘤細胞之細胞毒性作用為了評估SLC1021 (經處理萵苣之提取物)及SLC1021-B (未經處理之萵苣之提取物，基線多酚含量)的生物作用，進行SLC1021及SLC-1021-B對腫瘤細胞之細胞毒性作用。為了比較SLC1021與SLC1021之主要個別多酚組分的生物活性，進行SLC1021及一系列主要個別多酚組分對腫瘤細胞之細胞毒性作用。使用如實例1及2中所述之方法製備具有顯著提高之有益健康的多酚之經處理之紅萵苣提取物(SLC1021)及具有基線多酚含量之未經處理之萵苣提取物(SLC1021-B)。主要多酚用LCMS分析進行表徵及定量。

方法：Jurkat、THP1及MCF7細胞株根據ATCC說明書培養。藉由MTS及PMS分析評定細胞活力。在分析前一天，MCF7細胞用胰蛋白酶處理且用培養基洗滌。將細胞再懸浮於10% FBS培養基中且在MTS分析之前接種(2×10 ⁴個細胞/孔)於九十六孔培養盤中隔夜。在細胞處理當天，小心地移除培養基且用1% FBS培養基替換。洗滌懸浮細胞株，再懸浮於1% FBS培養基中，且接種(2×10 ⁴個細胞/孔)於九十六孔培養盤中。隨後在37℃下，在含有5% CO ₂之細胞培養箱中，用SLC1021、SLC1021-B、菊苣酸、4-CQA、新綠原酸或矢車菊素3-半乳糖苷處理所有細胞48小時(每孔總體積為100 µl)。此後，將25 µl MTS溶液添加至各孔中且在37℃下培育2小時。使用微量盤讀取器在490 nm下記錄吸光度。TC ₅₀(µg/mL)藉由GraphPad Prism (GraphPad Software)測定。

結果：將SLC1021與SLC1021-B及個別組分(菊苣酸、4-CQA、新綠原酸及矢車菊素3-半乳糖苷)對癌細胞之細胞毒性作用進行比較。細胞以等效濃度(w/w)培育48小時。MTS分析顯示SLC1021以濃度依賴性方式對所測試之細胞株具有一致的細胞毒性作用(圖13A)。SLC1021對所測試之細胞株之細胞毒性比SLC1021-B更大(圖13A及圖13B)。菊苣酸、4-CQA、新綠原酸及矢車菊素3-半乳糖苷顯示出對Jurkat細胞之細胞毒性活性(圖13C、圖13D、圖13E及圖13F)，但低於SLC1021。菊苣酸、4-CQA、新綠原酸及矢車菊素3半乳糖苷似乎對THP1及MCF7細胞株沒有單獨的細胞毒性。表3展示SLC1021、SLC1021-B、菊苣酸、4-CQA、新綠原酸及矢車菊素3-半乳糖苷對3個細胞株之細胞毒性作用。總體而言，SLC1021 TC ₅₀低於SLC1021-B，且相較於SLC1021-B、菊苣酸、4-CQA、新綠原酸及矢車菊素3-半乳糖苷，SLC1021顯示出針對多種癌細胞之優越的細胞毒性作用。表 3.SLC1021、SLC1021-B、4-CQA、新綠原酸、菊苣酸及矢車菊素3-半乳糖苷之TC ₅₀

處理	Jurkat, TC ₅₀(µg/mL)	MCF7, TC ₅₀(µg/mL)	THP1, TC ₅₀(µg/mL)
SLC1021	355.6	2729	1086
SLC1021-B	459.2	4864	2399
4-CQA	49.9	---	---
新綠原酸	42.4	---	---
菊苣酸	48.9	---	---
矢車菊素3-半乳糖苷	53.5	---	---

TC ₅₀：引起50%細胞死亡之毒性濃度

實例9 SLC1021、SLC1021-B及SLC1021之個別多酚組分的消炎作用為了研究SLC1021、SLC1021-B及SLC1021中發現的相關個別酚類生物活性組分(亦即，4-CQA、新綠原酸、菊苣酸及矢車菊素3-半乳糖苷)的消炎作用，LPS用於刺激PMA分化之THP1巨噬細胞中IL-6及TNF-α之釋放以模擬發炎環境。

方法：使用PMA分化之THP1巨噬細胞評估SLC1021及SLC1021-B之消炎作用。使用佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA，Sigma，P1585)將THP1單核球分化成巨噬細胞。將THP1細胞再懸浮於10%胎牛血清(FBS)培養基中且在25 nM PMA存在下接種(1×10 ⁵個細胞/孔，100 µl體積)於九十六孔培養盤中2天。在分析當天，移除培養基且用含有500 ng/mL IFN-γ (Sino, GMP-11725-HNAS)之1% FBS培養基(每孔100µl)替換。將細胞用不同濃度之SLC1021或SLC1021-B(0.02、0.06、0.19、0.56、1.67及5 mg/mL)處理2小時，且隨後用LPS (Sigma，L2630)處理額外48小時(每孔總體積為200 µl)。暴露於LPS但未用SLC1021或SCL1021-B處理之巨噬細胞用作對照(未處理細胞)。自各孔收集培養物上清液且用100µl之新鮮1% FBS培養基替換。為了量測細胞對照百分比(%)，將25µl MTS溶液添加至各孔中且在37℃下培育2小時。使用微量培養盤讀取器(SpectraMax i3X，Molecular Devices)在490 nm下記錄吸光度。使用50µl經培養上清液來量測TNF-α及IL6濃度。根據製造商說明書，使用人類TNF-α DuoSet ELISA套組(R&D systems, DY210-05)量測TNF-α且使用人類IL6 DuoSetELISA套組(R&D systems, DY206-05)測定IL6。TC _50/EC ₅₀(µg/ml)藉由GraphPad Prism (GraphPad Software)測定。

如先前所描述，將THP1單核球分化成巨噬細胞。在分析當天，移除培養基且用含有500 ng/ml IFN-γ之1% FBS培養基(每孔100µl)替換。細胞在1.23、3.7、11.11、33.33及100µg/mL下用4-CQA、新綠原酸、菊苣酸及矢車菊素3-半乳糖苷預處理2小時。未處理之細胞用作對照。在培育之後，細胞培養物隨後用LPS刺激額外48小時(每孔總體積為200 µL)。自各孔收集培養物上清液且用100 µL之新鮮1% FBS培養基替換。為了量測細胞對照%，將25µl MTS溶液添加至各孔中且在37℃下培育2小時。使用微量盤讀取器在490 nm下記錄吸光度。使用50µl經培養上清液來量測TNF-α及IL6濃度。根據製造商說明書，使用人類TNF-α DuoSet ELISA套組量測TNF-α且使用人類IL6 DuoSet ELISA套組測定IL6。

結果：研究SLC1021之消炎作用。LPS用於刺激PMA分化之THP1巨噬細胞中IL-6及TNF-α之釋放以模擬發炎環境(圖14)。在48小時內，LPS增強IL-6及TNF-α之產生(資料未示出)，且在LPS攻擊之前用不同濃度(0.02、0.06、0.19、0.56、1.67及5 mg/mL)之SLC1021預處理降低促炎性細胞介素之分泌。對巨噬細胞之消炎作用為濃度依賴性的，且該作用與濃度低於1.67 mg/ml下之細胞毒性無關。總體而言，實驗證實SLC1021對人類巨噬細胞之消炎作用。

亦進行SLC1021B之消炎作用的比較(圖15)。條件及處理與SLC1021相同。對巨噬細胞之消炎作用為濃度依賴性的且該作用與濃度低於1.67 mg/mL之細胞毒性無關。在1.67 mg/ml下，TNF-α減少%顯著低於SLC1021。表4展示SLC1021及SLC1021-B之消炎作用。SL1021之總體治療指數(TI)高於SLC1021-B。換言之，SLC1021-B對人類巨噬細胞之消炎作用低於SLC1021。表 4 ： SLC1021 及 SLC1021-B 對 PMA 分化之 THP1 巨噬細胞消炎分析的作用

處理	IL6, EC ₅₀(µg/mL)	TNF- α , EC ₅₀(µg/mL)	TC ₅₀(µg/mL)	IL6, TI	TNF- α , TI
SLC1021	383	887	3967	10.3	4.47
SLC1021-B	567	1371	4092	7.2	2.98

TI：治療指數 TC ₅₀：引起50%細胞死亡之毒性濃度

如本文中所描述，已偵測到在SLC1021萵苣提取物中發現之主要生物活性化合物中之綠原酸、菊苣酸、槲皮素衍生物及花青素。綠原酸、菊苣酸及花青素各構成SLC1021之約2%(w/w)且槲皮素約3.5%(w/w)。使用經LPS刺激之PMA分化之THP1巨噬細胞研究4-CQA、新綠原酸、菊苣酸及矢車菊素3-半乳糖苷之消炎作用。不包括槲皮素資料，歸因於其對藉由MTS染色之細胞毒性評估的顏色干擾。LPS刺激IL-6及TNF-α之產生，持續48小時。巨噬細胞用1.23、3.7、11.11、33.33及100µg/mL之4-CQA、新綠原酸、菊苣酸及矢車菊素3-半乳糖苷預處理，且隨後用LPS處理。個別地，4-CQA、新綠原酸、菊苣酸及矢車菊素3-半乳糖苷展示對促炎性細胞介素IL-6及TNF-α分泌之最小作用(圖16A-D)。該等組分對PMA分化之THP1巨噬細胞無細胞毒性。總體而言，實驗證實SLC1021內之各種組分對人類巨噬細胞的潛在協同消炎作用。

實例10 SLC1021、SLC1021-B及SLC1021之個別多酚組分的抗氧化作用為了研究SLC1021、SLC1021 B及SLC1021之個別多酚生物活性組分的抗氧化作用，LPS用於刺激PMA分化之THP1巨噬細胞中之一氧化氮(NO)釋放以模擬發炎環境。

方法：如上文所描述地建立使用PMA分化之THP1巨噬細胞進行的測試一氧化氮(NO)產生之分析，且使用42.5 µL經培養上清液量測一氧化氮(亞硝酸鹽)。總亞硝酸鹽係根據製造商說明書使用一氧化氮比色檢定套組(BioVision, K262-200)量測。TC _50/EC ₅₀(µg/mL)藉由GraphPad Prism (GraphPad Software)測定。

為了評估SLC1021中之主要個別組分，如先前所述將THP1單核球分化成巨噬細胞。在分析當天，移除培養基且用含有500 ng/mL IFN-γ之1% FBS培養基(每孔100µl)替換。細胞在1.23、3.7、11.11、33.33及100µg/mL下用4-CQA、新綠原酸、菊苣酸及矢車菊素3-半乳糖苷預處理2小時。未處理之細胞用作對照。在培育之後，細胞培養物隨後用LPS刺激額外48小時(每孔總體積為200 µL)。自各孔收集培養物上清液且用100µl之新鮮1% FBS培養基替換。為了量測細胞對照%，將25µl MTS溶液添加至各孔中且在37℃下培育2小時。使用微量盤讀取器在490 nm下記錄吸光度。42.5 µL經培養上清液係用於量測亞硝酸鹽濃度。總亞硝酸鹽係根據製造商說明書使用一氧化氮比色檢定套組量測。EC ₅₀(µg/mL)藉由GraphPad Prism (GraphPad Software)測定。

結果：SLC1021之抗氧化作用為濃度依賴性的且該作用與濃度低於1.67 mg/mL之細胞毒性無關(圖17)。相比於SLC1021，SLC1021-B之抗氧化作用顯著較低(圖18)。

圖19A-19D展示4-CQA、新綠原酸、菊苣酸及矢車菊素3-半乳糖苷對一氧化氮產生之作用。表5概述SLC1021、SLC1021-B、4-CQA、新綠原酸、菊苣酸及矢車菊素3-半乳糖苷之抗氧化作用。SL1021之總體治療指數(TI)高於SLC1021-B。換言之，SLC1021-B對人類巨噬細胞之抗氧化作用低於SLC1021。總體而言，實驗證實SLC1021內各種組分對人類巨噬細胞的潛在協同治療作用，其不依賴抗氧化作用。表5. SLC1021、SLC1021B及4-CQA、新綠原酸、菊苣酸及矢車菊素3-半乳糖苷對THP1巨噬細胞抗氧化作用分析

處理	NO, EC50 (µg /mL)	TC ₅₀(µg/mL)	NO, TI
SLC1021	345.1	3967	11.50
SLC1021-B	2032.4	4092	2.01
4-CQA	71.9	---	---
新綠原酸	80.5	---	---
菊苣酸	25.3	---	---
矢車菊素3-半乳糖苷	98.4	---	---

TI：治療指數 TC ₅₀：引起50%細胞死亡之毒性濃度

可組合上述各種實施例以提供其他實施例。本說明書中所涉及及/或申請案資料表(Application Data Sheet)中所列舉之所有美國專利、美國專利申請案公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案及非專利公開案，包括2021年2月26日申請之美國臨時專利申請案第63/154,529號，均係以全文引用之方式併入本文中。必要時，可修改實施例之態樣以採用各種專利、申請案及公開案之概念，從而提供又其他實施例。

可鑒於以上實施方式對實施例進行此等及其他改變。一般而言，在以下申請專利範圍中，所用術語不應解釋為將申請專利範圍限制於本說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例，而應解釋為包括所有可能之實施例以及該申請專利範圍有權要求的等效物之全部範疇。因此，申請專利範圍不受本發明限制。

圖1A-1B展示生物活性組分增強之HPLC-UV層析圖，其藉由基於基因體學之技術確認來自用良性應激子/激發子處理之紅萵苣的特定代謝物產量。圖1A展示未經處理之萵苣。圖1B展示經處理之萵苣： A ：綠原酸(3-CQA)； B ：菊苣酸(CRA)； C ：槲皮素-3-O-葡糖苷(Q3G)； D ：槲皮素-3-O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)； E ：3,4-二咖啡醯奎尼酸(3,4-diCQA) 圖2A-2B展示綠原酸及菊苣酸及水溶性槲皮素衍生物之產量在用植物生長調節劑處理之紅萵苣中增加3至9倍。圖2A描繪綠原酸、3,4-二咖啡醯奎尼酸(3,4-diCQA)及菊苣酸(3-CQA、CRA及3,4-diCQA)之產量。圖2B描繪槲皮素衍生物(Q3G及Q3MG)之產量。圖3A-3B展示生物活性組分增強之HPLC-UV層析圖，其藉由基於基因體學之技術確認來自藉由調節苯丙烷路徑之基因處理之紅萵苣的特定代謝物產量。圖1A展示未經處理之萵苣。圖1B展示經處理之萵苣： A ：綠原酸(3-CQA)； B ：菊苣酸(CRA)； C ：槲皮素-3-O-葡糖苷(Q3G)； D ：槲皮素-3-O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)； E ：3,4-二咖啡醯奎尼酸(3,4-diCQA) 圖4A-4B展示經處理之萵苣及未處理對照組中苯丙烷路徑產物之含量。圖4A展示綠原酸之產量。圖4B展示水溶性槲皮素衍生物之產量。圖5展示對SARS-CoV-2 3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3CL ^pro)之抑制。當與未經處理之植物提取物(3CL ^pro+對照)或純槲皮素-3- O-葡糖苷(3CL ^pro+Q3G)相比時，展現SLC1021(紅萵苣提取物)(3CL ^pro+SLC1021)之更強抑制效果。*：等效於該植物提取物中之100 mM槲皮素衍生物。圖6展示對SARS-CoV-2 RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)之抑制。當與未經處理之植物提取物(RdRp+對照)相比時，觀測到SLC1021(RdRp+SLC1021)之較強抑制效果。*：等效於該植物提取物中之100 mM槲皮素衍生物。圖7展示對SARS-CoV-2 RNA解旋酶及三磷酸酶(nsp13)之抑制。當與未經處理之植物提取物(nsp13+對照)相比時，觀測到SLC1021(nsp13+SLC1021)之較強抑制效果。*：等效於植物提取物中之100 mM槲皮素衍生物。圖8展示紅萵苣提取物SLC1021對活體外SARS-CoV2感染誘導Vero E6細胞中之細胞病變效應(CPE)的結果。圖9展示用紅萵苣提取物SLC1021以10µg/mL及100µg/mL阻斷ACE2-CHO細胞之2019-nCoV刺突蛋白受體結合域(RBD)結合。10µg/mL刺突蛋白用作陰性對照。藉由抗刺突蛋白抗體染色及螢光流式細胞量測術測定該結合。圖10A-10B展示紅萵苣提取物SLC1021活體外抑制A型流感病毒(流感A)及呼吸道融合病毒(RSV)之細胞病變效應。圖10A展示由流感A引起之細胞病變效應的SLC1021抑制。圖10B展示由RSV引起之細胞病變效應之SLC1021抑制。對未經SLC1021處理之細胞測定病毒CPE減少百分比及細胞對照百分比。圖11展示對用增加之濃度之SLC1021處理的Jurkat、HL60、THP1、MCF7及LNCaP細胞相較於未經處理之對照細胞進行的MTS分析的結果。資料展現為平均值±SE。對未經處理之細胞測定細胞對照%。圖12展示SLC1021對Jurkat細胞及人類初級T細胞中之活性含氧物(ROS)的作用，如藉由使用流式細胞量測術偵測DCF-DA螢光評定。資料展現為比較經SLC1021處理之細胞與未處理對照組之平均螢光強度(MFU)的比率。圖13A-13F展示評定SLC1021、SLC1021-B、4-CQA、新綠原酸、菊苣酸及矢車菊素3-半乳糖苷對Jurkat、THP1及MCF7癌細胞之細胞毒性作用的比較研究之結果，如藉由MTS分析所測定。圖13A展示用SLC1021處理的結果。圖13B展示用SLC1021-B處理的結果。圖13C展示用4-CQA處理之結果。圖13D展示用新綠原酸處理之結果。圖13E展示用菊苣酸處理之結果。圖13F展示用矢車菊素3-半乳糖苷處理之結果。資料展現為平均值±SE。對未經處理之對照細胞測定細胞對照百分比(%)。圖14展示SLC1021對經LPS處理之巨噬細胞中的IL-6及TNFα產生之消炎作用。藉由ELISA量測細胞介素之產量。資料展現為平均值±SE。對無SLC1021之經LPS處理之巨噬細胞測定對照百分比(%)。圖15展示SLC1021-B對經LPS處理之巨噬細胞中之IL-6及TNFα產生的消炎作用。藉由ELISA量測細胞介素之產量。資料展現為平均值±SE。對無SLC1021-B的經LPS處理之巨噬細胞測定對照百分比(%)。圖16A-16D展示4-CQA、新綠原酸、菊苣酸及矢車菊素3-半乳糖苷對LPS誘導之巨噬細胞的IL-6及TNF-α產生的作用。圖16A展示經4-CQA處理之細胞中之細胞介素產率。圖16B展示經新綠原酸處理之細胞中之細胞介素產生。圖16C展示經菊苣酸處理之細胞中之細胞介素產生。圖16D展示經矢車菊素3-半乳糖苷處理之細胞中之細胞介素產生。藉由ELISA量測細胞介素之產量。資料展現為平均值±SE。對未經測試劑處理之LPS處理細胞測定對照百分比(%)。圖17展示SLC1021對經LPS處理之巨噬細胞中之一氧化氮產生的抗氧化作用。藉由ELISA量測一氧化氮之產量。資料展現為平均值±SE。對無SLC1021之經LPS處理之巨噬細胞測定對照百分比(%)。圖18展示SLC1021-B對經LPS處理之巨噬細胞中的一氧化氮產生的抗氧化作用。藉由ELISA量測一氧化氮之產量。資料展現為平均值±SE。對無SLC1021-B的經LPS處理之巨噬細胞測定對照百分比(%)。圖19A-19D展示4-CQA、新綠原酸、菊苣酸及矢車菊素3-半乳糖苷對LPS誘導之巨噬細胞的一氧化氮(NO)產生的作用。圖19A展示經4-CQA處理之細胞中之NO產生。圖19B展示經新綠原酸處理之細胞中之NO產生。圖19C展示經菊苣酸處理之細胞中之NO產生。圖19D展示經矢車菊素3-半乳糖苷處理之細胞中之NO產生。藉由ELISA量測NO之產量。資料展現為平均值±SE。對未經測試劑處理之LPS處理細胞測定對照%。

Claims

一種用於在萵苣中生物合成多酚之系統，其包含至少一種增加萵苣中多酚產量的良性應激子(eustressor)/激發子或其同系物、異構體或衍生物。
如請求項1之系統，其用於在萵苣中生物合成多酚之方法中，該方法包含向該萵苣投與至少一種良性應激子/激發子或其同系物、異構體或衍生物，由此增加萵苣中之多酚產量。
如請求項1或2之系統，其中該至少一種良性應激子/激發子為非生物良性應激子/激發子。
如請求項3之系統，其中該非生物良性應激子/激發子係選自：生長素、細胞分裂激素(cytokinin；CK)、赤黴素(gibberellin；GA)、乙烯、菜籽類固醇、茉莉酸酯(jasmonate；JA)、獨角金內酯(strigolactone，SL)、柳酸(salicylic acid；SA)、二十碳四烯酸(arachidonic acid；AA)、5-胺基乙醯丙酸(5-aminolevumic acid；5-ALA)、草酸及其任何同系物或異構體或衍生物、合成類似物或任何組合或混合物。
如請求項3之系統，其中該至少一種非生物良性應激子/激發子係選自：二十碳四烯酸(AA)、5-胺基乙醯丙酸(5-ALA)、乙烯或其任何組合或混合物。
如請求項3之系統，其中該至少一種非生物良性應激子/激發子係選自：吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid；IAA)、吲哚-3-乙腈(indole-3-acetonitril；IAN)、吲哚-3-乙醛(indole-3-acetaldehyde；IAc)、乙基吲哚乙酸鹽(ethylindoeacetate)、吲哚-3-丙酮酸(indole-3-pyruvic acid；IPyA)、吲哚-3-丁酸(indole-3-butyric acid；IBA)、吲哚-3-丙酸(indole-3-propionic acid；IPA)、吲唑-3-乙酸、氯苯氧基丙酸、萘乙酸(naphthalene acetic acid；NAA)、苯氧基乙酸(phenoxy acetic acid；PAA)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-dichlorophenoxy acetic acid；2,4-D)、2,4,5-三氯苯氧基乙酸(2,4,5-trichlorophenoxy acetic acid；2,4,5-T)、萘乙醯胺(naphthalene acetamide；NAAM)、2-萘氧基乙酸(2-napthoxyacetic acid；NOA)、2,3,5-三碘苯甲酸(2,3,5-triodobenzoic acid；TIBA)、苯并噻吩-3-丙酸(thianaphthen-3-propionic acid；IPA)、核糖苷玉米素、玉米素、異戊烯基腺嘌呤(isopentinyladenine)、二氫玉米素、6-苯甲基胺基嘌呤、6-苯基胺基嘌呤、裂殖素、N-苯甲基-9-(2-四氫哌喃基)腺嘌呤(N-benzyl-9-(2-tetrahydropyranyl) adenine；BPA)、均二苯脲、噻苯隆、苯并咪唑、腺嘌呤、6-(2-噻吩甲基胺基)嘌呤、GA、GA4、GA7、GA3、乙烯、乙烯豐(ethephon)、乙烯利(ethrel)、扁豆甾醇內酯(dolicholide)、28-高扁豆甾醇內酯、栗甾酮(castasterone)、扁豆甾酮、28-高扁豆甾酮、香蒲甾醇(typhasterol)、茉莉酸、二氫茉莉酸甲酯、二氫茉莉酸、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate；MJ)、獨腳金醇(strigol)、列當醇(orobanchol)、GR24、二十碳四烯酸(AA)、柳酸(SA)或其任何組合或混合物。
如請求項3之系統，其中該至少一種非生物良性應激子/激發子係選自：吲哚-3-乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、草酸、苯并噻二唑(BTH)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、二十碳四烯酸(AA)、柳酸(SA)、茉莉酸甲酯(MJ)或其任何組合或混合物。
如請求項4至7中任一項之系統，其中該系統包含濃度為1 µM至1000 µM之該良性應激子/激發子。
如請求項7之系統，其中該系統包含選自以下之該良性應激子/激發子：吲哚-3-乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、草酸、苯并噻二唑(BTH)、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、二十碳四烯酸(AA)、柳酸(SA)及/或茉莉酸甲酯(MJ)，其中各激發子之濃度獨立地為5 μM、10 μM、15 μM、45 μM或90 μM。
如請求項1或2之系統，其中該至少一種良性應激子/激發子為生物良性應激子/激發子(生物刺激劑)。
如請求項10之系統，其中該至少一種生物良性應激子/激發子(生物刺激劑)係選自：脂多醣、果膠及纖維素(細胞壁)、聚葡萄胺糖、甲殼素及葡聚糖、海藻酸鹽、阿拉伯膠、酵母提取物、海藻提取物、腐植酸及富里酸；一或多種來自以下之植物提取物：大虎杖(Reynoutria Sachalinensis)、虎杖(Reynoutria japonica)提取物、辣木葉、茉沃刺(cregano)、甜菜、亞麻籽、聖約翰草(St. John's wort) (貫葉連翹；草本植物)、高大一枝黃花(巨大一枝黃花(Solidago gigantean Ait.)；葉)、藥用蒲公英(西洋蒲公英(Taraxacum officinale (L.) Weber ex F.H. Wigg)；花、葉)、紅三葉草(紅車軸草(Trifolium pretense L.)；花)、蕁麻(異株蕁麻(Urtica dioica L.)；葉)、纈草(valerian/Valeriana officinalis L.；根)、大蒜、韭菜、甘草根、紅葡萄皮、藍莓果實、山楂葉、艾草(Common Mugwort)、橄欖葉、石榴葉、番石榴葉、琉璃苣葉及花、栽培菸葉、硬皮橘葉、無花果樹葉、散沫花樹(hina tree)葉、黃荊樹(Chinese chaste tree)葉、野芹葉、法國橡木、玉米粒、迷迭香、棕櫚花粉粒、苜蓿植株及其他；半乳糖醛酸苷、古洛糖酸(gluronate)、甘露聚糖、甘露糖醛、纖維素酶、隱地蛋白、糖蛋白、哈平蛋白(harpin protein；HP)、糖蛋白、寡雄蛋白、果膠酶、魚蛋白、水解產物、乳鐵蛋白、真菌孢子、菌絲細胞壁、微生物壁、冠菌素(coronatine)、牛至提取物(oregano extract)。
如請求項10或11之系統，其中該系統包含濃度為10 mg/L至5000 mg/L之該良性應激子/激發子。
如請求項8之系統，其中該系統包含濃度為30 mg/L、60 mg/L或120 mg/L之該生物良性應激子/激發子哈平蛋白(HP)、牛蒡果寡醣(Burdock fructooligosaccharide；BFO)及/或聚葡萄胺糖。
如請求項1至13中任一項之系統，其中該多酚為綠原酸/衍生物、水溶性槲皮素衍生物及花青素。
如請求項14之系統，其中該綠原酸為3- O-咖啡醯奎尼酸(3-CQA)、4- O-咖啡醯奎尼酸(4-CQA)及/或5- O-咖啡醯奎尼酸(5-CQA)、菊苣酸、3,4-二咖啡醯奎尼酸(3,4-diCQA)。
如請求項14之系統，其中該水溶性槲皮素衍生物為槲皮素-3- O-葡糖苷(Q3G)及/或槲皮素-3- O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)。
如請求項13之系統，其中該花青素為矢車菊素3-丙二醯基-葡糖苷及/或矢車菊素-3- O-葡糖苷。
如請求項1至17中任一項之系統，其中該增加之多酚產量係藉由LC-MS定量。
如請求項1至18中任一項之系統，其中相較於對照系統，該增加之多酚產量為增加3至9倍產量。
如請求項19之系統，其中該對照系統為不具有該至少一種非生物/生物激發子或其同系物、異構體或衍生物之系統。
一種用於在萵苣中生物合成多酚之系統，其包含表現卡匣，該表現卡匣包含可操作地連接於至少一個聚核苷酸的異源表現控制序列，該至少一個聚核苷酸編碼一或多種增加萵苣中之多酚產量之蛋白質。
如請求項21之系統，其用於在萵苣中生物合成多酚之方法中，該方法包含投與表現卡匣，該表現卡匣包含可操作地連接於至少一個聚核苷酸的異源表現控制序列，該至少一個聚核苷酸編碼一或多種增加萵苣中之多酚產量之蛋白質。
如請求項21或22之系統，其中該一或多種蛋白質包含丙二酸-CoA連接酶。
如請求項23之系統，其中該丙二酸-CoA連接酶包含AAE13。
如請求項21至24中任一項之系統，其中該一或多種蛋白質包含轉錄因子。
如請求項21至25中任一項之系統，其中該一或多種蛋白質包含MYB轉錄因子。
如請求項26之系統，其中該MYB轉錄因子係選自：ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5)、AtCPC、AtMYBL2、AtMYB11、AtMYB12、AtMYB60、AtMYB75/PAP1、AtMYB90/PAP2、AtMYB111、AtMYB113、AtMYB114、AtMYB123/TT2、HvMYB10、BoMYB2、PURPLE (PR)、MrMYB1 SmMYB39、GMYB10、VlMYBA1-1、VlMYBA1-2、VlMYBA1-3、VlMYBA2、VvMYBA1、VvMYBA2、VvMYBC2-L1、VvMYBF1、VvMYBPA1、VvMYBPA2、VvMYB5a、VvMYB5b、EsMYBA1、GtMYBP3、GtMYBP4、InMYB1、BoPAP1、MYB110a、DkMYB2、DkMYB4、LEGUME ANTHOCYANIN PRODUCTION1 (LAP1)、MtPAR、LhMYB6、LhMYB12、LhMYB12-Lat、LjMYB14、LjTT2a、LjTT2b、LjTT2c、ZmC1、ZmPL、ZmPL-BLOTCHED1 (PL-BH)、ZmP1、ZmMYB-IF35、GmMYB10、PpMYB10、PpMYBPA1、CsRUBY、OgMYB1、PcMYB10、PyMYB10、Petunia AN2、Petunia DPL、Petunia PHZ、PhMYBx、PhMYB27、PtMYB134、PtoMYB216、StAN1、StAN2、StMTF1、TaMYB14、AmROSEA1、AmROSEA2、VENOSA、SorghumY1、GmMYB176、GmMYB-G20-1、GmMYB12B2、FaMYB1、FaMYB9、FaMYB10、FaMYB11、PvMYB4a、NtAN2、LeANT1、SlMYB12、SlMYB72 AmDEL、FaMYB10、FavbHLH及大麻MYB12樣及其類似物。
如請求項26至27中任一項之系統，其中該MYB轉錄因子為AtMYB12。
如請求項21至28中任一項之系統，其中該系統進一步包含一或多個編碼苯丙烷路徑之酶的聚核苷酸。
如請求項29之系統，其中該等苯丙烷路徑之酶係選自：苯丙胺酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase；PAL)、肉桂酸4-羥化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase；C4H)及4-香豆酸:CoA連接酶(4-coumaric acid: CoA ligase；4CL)或其任何組合。
如請求項21至30中任一項之系統，其中該系統進一步包含一或多個編碼綠原酸路徑之酶的聚核苷酸。
如請求項31之系統，其中該等綠原酸路徑之酶係選自：羥基桂皮醯基CoA:奎尼酸羥基桂皮醯基轉移酶(hydroxycinnamoyl CoA: quinate hydroxycinnamoyl transferase；HQT)、對香豆醯基-3-羥化酶(p-coumaroyl-3-hydroxylase；C3H)及咖啡醯基-CoA-3- O-甲基轉移酶(caffeoyl-CoA-3-O-methyltransferase；CCoAMT)或其任何組合。
如請求項21至32中任一項之系統，其中該系統進一步包含一或多個編碼類黃酮路徑之酶的聚核苷酸。
如請求項33之系統，其中該等類黃酮路徑之酶係選自：查耳酮合成酶(chalcone synthase；CHS)、查耳酮異構酶(chalcone isomerase；CHI)、黃烷酮3-羥化酶(flavanone 3-hydroxylase；F3H)及黃酮醇合成酶(flavonol synthase；FLS)、類黃酮3'-羥化酶(flavonoid 3’-hydroxylase；F3'H)、對香豆酸3-羥化酶(p-coumarate 3-hydroxylase；C3H)、肉桂酸4-羥化酶(cinnamate 4-hydroxilase；C4H)、4-羥基桂皮醯基-CoA連接酶(4-hydroxycinnamoyl-CoA ligase；4CL)、羥基桂皮醯基-CoA莽草酸/奎尼酸羥基桂皮醯基轉移酶(hydroxycinnamoyl-CoA shikimate/quinate hydroxycinnamoyl transferase；HCT)、羥基桂皮醯基-CoA奎尼酸羥基桂皮醯基轉移酶(hydroxycinnamoyl-CoA quinate hydroxycinnamoyl transferase；HQT)或其任何組合。
如請求項21至34中任一項之系統，其進一步包含一或多個編碼細胞色素P450 3A4、CYP氧化還原酶及UDP-葡糖醛酸基轉移酶或其任何組合之聚核苷酸。
如請求項21至35中任一項之系統，其中該多酚為綠原酸、菊苣酸、花青素或水溶性槲皮素衍生物。
如請求項36之系統，其中該綠原酸為3- O-咖啡醯奎尼酸(3-CQA)、4- O-咖啡醯奎尼酸(4-CQA)及/或5- O-咖啡醯奎尼酸(5-CQA)、菊苣酸、3,4-二咖啡醯奎尼酸(3,4-diCQA)，及/或其中該水溶性槲皮素衍生物為槲皮素-3- O-葡糖苷(Q3G)及/或槲皮素-3- O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)及花青素。
如請求項21至37中任一項之系統，其中該增加之多酚產量係藉由LC-MS定量。
如請求項21至38中任一項之系統，其中相較於對照系統，該增加之多酚產量為增加2至5倍產量。
如請求項39之系統，其中該對照系統為不具有該表現卡匣之系統。
如請求項21至40中任一項之系統，其中該聚核苷酸經密碼子最佳化以在萵苣細胞中表現。
如請求項21至41中任一項之系統，其中該異源表現控制序列包含在植物細胞中起作用之啟動子。
如請求項42之系統，其中該啟動子為組成型活性植物啟動子。
如請求項42之系統，其中該啟動子為誘導型啟動子。
如請求項42至44中任一項之系統，其中該啟動子為組織特異性啟動子。
如請求項45之系統，其中該組織特異性啟動子為葉特異性啟動子。
如請求項21至46中任一項之系統，其中該聚核苷酸進一步包含選自以下之調節序列：位於啟動子序列與編碼序列之間的充當轉譯前導序列之5' UTR、3'非轉譯序列、3'轉錄終止區及聚腺苷酸化區。
一種用於在萵苣中增加多酚產量之系統，其包含： i. 如請求項1至20中任一項之至少一種激發子或其同系物、異構體或衍生物；及 ii. 如請求項21至47中任一項之表現卡匣。
如請求項21至48中任一項之系統，其中該表現卡匣包括於植物轉型載體中。
如請求項49之系統，其中該植物轉型載體包含可選標記。
如請求項50之系統，其中該可選標記係選自殺生物劑抗性標記、抗生素抗性標記或除草劑抗性標記。
如請求項21至51中任一項之系統，其進一步包含可篩選標記。
如請求項52之系統，其中該可篩選標記係選自β-葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)、R-基因座基因、β-內醯胺酶基因、螢光素酶基因、xylE基因、澱粉酶基因、酪胺酸酶基因及α-半乳糖苷酶基因。
如請求項49至53中任一項之系統，其中該載體係衍生自根癌農桿菌( Agrobacterium tumefaciens)之Ti質體。
如請求項49至53中任一項之系統，其中該載體係衍生自發根農桿菌( Agrobacterium rhizogenes)之Ri質體。
一種產生轉殖基因萵苣之方法，其包含：將如請求項21至55中任一項之系統引入萵苣細胞中以產生經轉型萵苣細胞；在足以允許包含複數個經轉型萵苣細胞之萵苣細胞培養物發育的條件下培養該經轉型萵苣細胞；篩選該等經轉型萵苣細胞以表現由該系統編碼之多肽；及自該萵苣細胞培養物選擇表現該多肽之經轉型萵苣細胞。
如請求項56之方法，其中該轉型係藉由使用原生質體、電穿孔、用碳化矽纖維攪拌、農桿菌介導之轉型或藉由加速經DNA包覆之粒子進行。
如請求項57之方法，其中該轉型係藉由農桿菌介導之轉型進行且該植物轉型載體包含農桿菌載體。
如請求項56至58中任一項之方法，其中該篩選係基於可篩選標記之表現。
一種轉殖基因萵苣細胞，其經如請求項21至55中任一項之系統轉型。
一種轉殖基因萵苣，其包含如請求項56之轉殖基因萵苣細胞。
一種轉殖基因萵苣，其經如請求項21至55中任一項之系統轉型。
如請求項60至62中任一項之轉殖基因萵苣細胞或轉殖基因萵苣，其中該轉殖基因萵苣細胞或轉殖基因萵苣顯示一或多種多酚或其衍生物之改變的生產，該改變的生產包含相對於對照萵苣細胞或對照萵苣而言，該一或多種多酚或其衍生物之增加的生產或修飾。
如請求項63之轉殖基因萵苣細胞或轉殖基因萵苣，其中該一或多種多酚或其衍生物係選自綠原酸，諸如3- O-咖啡醯奎尼酸(3-CQA)、菊苣酸、3,4-diCQA；槲皮素；及水溶性槲皮素衍生物，諸如槲皮素-3- O-葡糖苷(Q3G)及槲皮素-3- O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)；其他類黃酮，諸如芹菜素及衍生物、木犀草素及衍生物、金聖草素及衍生物、楊梅黃酮及衍生物；及花青素，諸如矢車菊素3-丙二醯基-葡糖苷、矢車菊素-3- O-葡糖苷及類似物。
如請求項64之轉殖基因萵苣細胞或轉殖基因萵苣，其中該一或多種多酚或其衍生物包含槲皮素-3- O-丙二醯基葡糖苷(Q3MG)。
如請求項64之轉殖基因萵苣細胞或轉殖基因萵苣，其中該一或多種多酚或其衍生物包含3- O-咖啡醯奎尼酸(3-CQA)。
如請求項63至66中任一項之轉殖基因萵苣細胞或轉殖基因萵苣，其中該改變的生產包含相對於對照萵苣細胞或對照萵苣而言，該一或多種多酚或其衍生物之增加的生產。
如請求項63至66中任一項之轉殖基因萵苣細胞或轉殖基因萵苣，其中該改變的生產包含相對於對照萵苣細胞或對照萵苣而言，該一或多種多酚或其衍生物之修飾。
如請求項1至68中任一項之萵苣，其為來自一般萵苣類型之具有紅葉之萵苣栽培品種。
如請求項1至69中任一項之萵苣，其中該一般萵苣類型係選自散葉萵苣、橡葉萵苣、長葉萵苣、奶油萵苣、卷心萵苣及夏季脆萵苣。
如請求項1至70中任一項之萵苣，其中該紅葉萵苣栽培品種係選自皺葉萵苣(Lollo Rosso)、新品紅火萵苣(New Red Fire Lettuce)、紅帆萵苣(Red Sails Lettuce)、熱迪納萵苣(Redina Lettuce)、銀河萵苣(Galactic Lettuce)、巴塔維亞萵苣(Batavian lettuce)、安納波利斯萵苣(Annapolis Lettuce)、Hongjil萵苣、紅火萵苣、晉拉克萵苣(Jinluck Lettuce)、戴茲樂萵苣(Dazzler Lettuce)、首爾紅萵苣、革命萵苣(Revolution Lettuce)、切諾基萵苣(Cherokee Lettuce)、纈草萵苣(Valerial Lettuce)、OOC 1441萵苣、伊姆普路斯萵苣(Impuls Lettuce)、紅霧萵苣(Red Mist Lettuce)、紅沙拉碗萵苣(Red Salad Bowl Lettuce)、紅潮萵苣(Red Tide Lettuce)、貝爾維尤萵苣(Bellevue Lettuce)、非凡萵苣(Outredgeous Lettuce)、石榴鬆脆性萵苣(Pomegranate Crunch Lettuce)、伏爾甘萵苣(Vulcan Lettuce)、坎塔里克斯萵苣(Cantarix Lettuce)、布林萵苣(Breen Lettuce)、胭脂D'Hiver萵苣(Rouge D'Hiver Lettuce)、奧斯卡萵苣(Oscarde Lettuce)、葉片萵苣(Blade Lettuce)、斯波克萵苣(Spock Lettuce)、愛多士萵苣(Edox Lettuce)、堡壘萵苣(Fortress Lettuce)、斯坦佛萵苣(Stanford Lettuce)、斯卡拉曼加萵苣(Scaramanga Lettuce)、羅格斯深紅萵苣(Rutgers Scarlet Lettuce)及貝尼托萵苣(Benito Lettuce)。
一種萵苣種子，其包含如請求項21至55中任一項之系統。
一種生產一或多種多酚或其衍生物之方法，該方法包含在足以產生該一或多種多酚或其衍生物之條件下培養或栽培如請求項1至72中任一項之萵苣細胞或萵苣植株或萵苣種子。
一種如請求項1至73中任一項之萵苣的提取物，其包含相對於對照提取物而言增加的多酚或其衍生物之產量。
如請求項74之提取物，其中該提取物為紅萵苣提取物SLC1021。
如請求項74或75之提取物，其中該提取物包含水及乙醇及可溶於其中之萵苣組分。
一種製備如請求項74至76中任一項之萵苣提取物的方法，其包含將萵苣樣品與溶劑混合且將液相與固相分離。
如請求項77之方法，其中該溶劑為乙醇。
如請求項77至78中任一項之方法，其中萵苣樣品為新鮮、冷凍或脫水的。
如請求項77至79中任一項之方法，其中萵苣與溶劑之比率(g/mL)為1:10、1:5、2:5、3:5、4:5或1:1。
一種食品，其含有如請求項1至73中任一項之萵苣或其部分。
如請求項81之食品，其中該食品包含沙拉、三明治或任何包含萵苣之食品。
如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至82中任一項之食品，其中該提取物或該食品防止或預防病毒或細菌感染；糖尿病；心血管疾病；神經退化性疾病，包括記憶及視力喪失；發炎；及癌症。
如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至83中任一項之食品，其中該提取物或該食品提供抗氧化特性，可在各種由以下組成之生物及藥理特性方面具有關鍵作用：消炎、抗癌、抗微生物、抗過敏、抗病毒、抗血栓或保肝。
如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至83中任一項之食品，其中該提取物或該食品抑制病毒複製、減少發炎、改善視力、調節免疫反應、減少肥胖症及糖尿病、降低血糖含量或其組合。
一種用於治療冠狀病毒呼吸道感染之方法，其包含向感染冠狀病毒之患者投與有效量的如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至83中任一項之食品，且其中該冠狀病毒係藉由抑制3-胰凝乳蛋白酶樣蛋白酶(3CL ^pro)活性來抑制。
一種用於治療冠狀病毒呼吸道感染之方法，其包含向感染冠狀病毒之患者投與有效量的如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至83中任一項之食品，且其中該冠狀病毒係藉由抑制RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)活性來抑制。
一種用於治療冠狀病毒呼吸道感染之方法，其包含向感染冠狀病毒之患者投與有效量的如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至83中任一項之食品，且其中該冠狀病毒係藉由抑制RNA解旋酶及三磷酸酶(nsp13)活性來抑制。
一種治療冠狀病毒呼吸道感染之方法，其包含向感染冠狀病毒之患者投與有效量的如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至83中任一項之食品，且其中刺突蛋白與ACE2之結合被抑制。
如請求項86至89中任一項之方法，其中該冠狀病毒為嚴重急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)。
如請求項90之方法，其中該SARS-CoV-2引起冠狀病毒病2019 (COVID-19)。
如請求項86至91中任一項之方法，其中該提取物之濃度為約50-1000 µg/mL、50-150 µg/mL或50-100 µg/mL；或約92.6 µg/mL。
一種用於治療A型流感(流感A)感染之方法，其包含向感染流感A之患者投與有效量的如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至83中任一項之食品。
如請求項93之方法，其中該提取物之濃度為約1至100 µg/mL；或約10.3 µg/mL、30.9 µg/mL或92.6 µg/mL。
一種用於治療呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus；RSV)感染之方法，其包含向感染RSV之患者投與有效量的如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至83中任一項之食品。
如請求項95之方法，其中該提取物之濃度為約1至400 µg/mL；或約4.1 µg/mL、12.43 µg/mL、37 µg/mL、111 µg/mL或333 µg/mL。
一種治療茲卡病毒(Zika virus)感染之方法，其包含向感染茲卡病毒之患者投與有效量的如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至83中任一項之食品。
一種用於治療登革熱(DENV2)病毒感染之方法，其包含向感染DENV2之患者投與有效量的如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至83中任一項之食品。
如請求項86至98中任一項之方法，其中該提取物之濃度為約10 µg/mL - 200 µg/mL、10 µg/mL - 150 µg/mL、10 µg/mL - 100 µg/mL、10 µg/mL - 90 µg/mL、10 µg/mL - 80 µg/mL、10 µg/mL - 70 µg/mL或10 µg/mL - 60 µg/mL，或大於約1 µg/mL、2 µg/mL、3 µg/mL、4 µg/mL、5 µg/mL、6 µg/mL、7 µg/mL、8 µg/mL、9 µg/mL、10 µg/mL、20 µg/mL、30 µg/mL、40 µg/mL、50 µg/mL、60 µg/mL、70 µg/mL、80 µg/mL、90 µg/mL、100 µg/mL、120 µg/mL、140 µg/mL、160 µg/mL、180 µg/mL、200 µg/mL、250 µg/mL、300 µg/mL、350 µg/mL、400 µg/mL、450 µg/mL或500 µg/mL。
一種治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量的如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至83中任一項之食品。
如請求項100之方法，其中該癌症為白血病、淋巴瘤、乳癌或前列腺癌。
一種用於治療發炎性病狀或疾病之方法，其包含向有需要之患者投與有效量的如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至83中任一項之食品。
如請求項102之方法，其中該提取物或食品抑制免疫細胞產生發炎性細胞介素。
一種用於抑制活性含氧物(reactive oxygen species；ROS)產生之方法，其包含向有需要之患者投與有效量的如請求項74至80中任一項之提取物或如請求項81至83中任一項之食品。
如請求項104之方法，其中該提取物或食品抑制一氧化氮之產生。
如請求項100至105中任一項之方法，其中該提取物之濃度為約0.1 mg/mL - 5 mg/mL、0.2 mg/mL - 4 mg/mL、0.2 mg/mL - 3 mg/mL、0.3 mg/mL - 3 mg/mL、0.4 mg/mL - 3 mg/mL、0.5 mg/mL - 3 mg/mL、0.4 mg/mL - 2.5 mg/mL、0.4 mg/mL - 2.0 mg/mL或0.4 mg/mL - 1.6 mg/mL；或該提取物之濃度大於約0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL、0.6 mg/mL、0.7 mg/mL、0.8 mg/mL、0.9 mg/mL、1.0 mg/mL、1.1 mg/mL、1.2 mg/mL、1.3 mg/mL、1.4 mg/mL、1.5 mg/mL、1.6 mg/mL、1.7 mg/mL、1.8 mg/mL、1.9 mg/mL或2.0 mg/mL；或該提取物之濃度為約0.02 mg/mL、0.06 mg/mL、0.19 mg/mL、0.56 mg/mL、1.67 mg/mL或5 mg/mL。
如請求項86至106中任一項之方法，其中該提取物為紅萵苣提取物SLC1021。