CN108138199B - 含有低拷贝数的ri基因的植物 - Google Patents

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Abstract

描述了通过用含有Ri质粒的发根农杆菌感染来用源自发根农杆菌的Ri质粒的一种或多种基因转化的植物、或这类植物的子代，所述植物或子代在其基因组中包含1至5个拷贝的所述源自Ri质粒的一种或多种基因。此外，公开了这类植物或其子代作为观赏植物的用途，用作大田作物种，用于食物提取物、化妆品、香料或用作药用植物。进一步公开了这类植物的制备方法。所述植物相比于没有发根农杆菌序列的对照植物显示中等高度和/或具有更高含量的代谢物，而没有花数的显著降低或开花时间延迟。

Description

含有低拷贝数的RI基因的植物
技术领域
本发明涉及特别是具有中等高度的、通过用携带Ri质粒的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染来用源自发根农杆菌(A.rhizogenes)的Ri质粒的一种或多种基因转化的植物、或这类植物的子代，以及所述植物的制备方法。
背景技术
观赏植物(ornamental plant)领域越来越需要密实植物结构(compact plantarchitecture)。出于环境、空间和运输的目的，盆栽植物产业偏爱较密实的植物结构。呈现细长(elongated)的生长行为的盆栽植物正在失去育种者、植物生产者、和消费者的兴趣。
目前，产业用生长延缓剂处理植物从而限制植物大小。此外，用发根农杆菌转化的植物具有密实植物结构，其中转化的植物的长度小于未转化的野生型植物的高度的20％。这类转化体呈现多种表型，包括矮态(dwarfism)和密实植物生长。所述密实生长与不期望的表型例如皱叶、花形、减少的花数、延迟开花一致。对于观赏植物，发根农杆菌转染的缺点似乎大于密实生长的设想优势。密实生长通常导致过小从而不具有商业价值的植物。虽然偶尔观察到在植物高度上受影响较小的转化体，但这类转化体还受其他不期望表型的影响。
的确，Christensen等人(植物细胞Rep(2008)27,1485-1495)描述通过用携带Ri质粒的发根农杆菌感染来用发根农杆菌的rol基因转化圣诞伽蓝菜(Kalanchoeblossfeldiana)。得到不同的Ri系，其长度和密实度(compactness)不同。然而，所有植物受皱叶、较小的花尺寸、减少的干重、花数严重减少至少50％和延迟的开花时间的影响。通过DNA印迹分析，一些Ri系描述为具有1(系306和319)或2个拷贝(系331)的Ri质粒，而其他系(312和324)在DNA印迹中显示多条条带。然而，这些数据是不可靠的，并且似乎是错误的。Christensen的估计错误的第一标志在于以下事实：Christensen的Ri系是用发根农杆菌直接转化圣诞伽蓝菜的结果，这导致在伽蓝菜属(Kalanchoe)基因组中掺入多个Ri拷贝。所述数量在7和11之间变化、甚至更多，但绝不会更少。此外，Christensen的Ri系受花序、花数和干重损失的剧烈减少的影响。测定拷贝数的显著较可靠的方法，如本文所用的qPCR，的确显示Christensen的系331拷贝数为7。此外，Christensen观察到的表型似乎与所称的拷贝数不一致；例如叶起皱似乎在系306和331中较不明显，而声称系331中的rol基因的拷贝数相比于系306为两倍，而声称与系306具有相同拷贝数的系319具有比系331和306两者更明显的皱叶。并且，相比于声称包含较少拷贝的rol基因的对应物，延迟开花在系331中较不明显。
天然存在的土壤细菌发根农杆菌农杆碱型菌株(agropine-type strains)的Ri质粒在Ri质粒上携带两种T-DNA区(分别地，TL-DNA和TR-DNA，SEQ ID NO 1和2)，用于转移至植物细胞。在感染植物细胞后，细菌转移整个T-DNA区(TL-DNA和TR-DNA两者)，由此将rol(根基因座(root loci))和aux基因转移至植物基因组，并且引起感染位点的毛状根(hairyroot)生长(Tepfer(1984)Cell,37,pp.959-967)。因为发根农杆菌天然感染植物，rol基因天然地转移至植物，作为植物致癌基因起作用，并且在植物组织中发育毛状根。
TL-DNA含有四种rol基因，rolA、rolB、rolC、和rolD(分别为SEQ ID Nos 3-6)，而TR-DNA含有多种基因，包括两种生长素基因，aux1和aux2(分别为SEQ ID Nos 7和8)。TL-DNA含有其他18个开放阅读框(open reading frame)(Veena和Taylor(2007),In VitroCellular&Developmental Biology-Plant,43,383-403)。
发明内容
定义
本文所用的所有技术术语是生物化学、分子生物学和农业中常规使用的术语，并且可由本领域普通技术人员理解。技术术语可在以下中找到：Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第3版,卷1-3,Sambrook和Russell编辑,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001；Current Protocols in MolecularBiology,Ausubel等人编辑,Greene Publishing Associates and Wiley-lnterscience,New York,1988(定期更新)；Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology,第5版,卷1-2,Ausubel等人编辑,John Wiley&Sons,Inc.,2002；Genome Analysis:A Laboratory Manual,卷1-2,Green等人编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1997。涉及植物生物学技术的方法学在本文中描述，并且在论文例如Methods in Plant MolecularBiology:A Laboratory Course Manual,Maliga等人编辑,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1995中详细描述。使用PCR的各种技术在Innis等人,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,San Diego,1990与Dieffenbach和Dveksler,PCR Primer:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2003中描述。PCR引物对可通过已知技术例如使用旨在该目的的计算机程序、Primer,版本0.5,1991,Whitehead Institute for Biomedical Research,Cambridge,MA从已知序列衍生。用于核酸的化学合成的方法在例如Beaucage和Caruthers,1981,Tetra.Letts.22:1859-1862、与Matteucci和Caruthers,1981J.Am.Chem.Soc.103:3185中描述。限制性酶消化、磷酸化、连接和转化如在Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press所述进行。用于细菌细胞的生长和维持的所有试剂和材料获得自Aldrich Chemicals(Milwaukee,WI)、DIFCO Laboratories(Detroit,MI)、Invitrogen(Gaithersburg,MD)、或Sigma Chemical Company(St.Louis,MO)，除非另有说明。
"转化"在本文中指的是用于将源自发根农杆菌的Ri质粒的一种或多种基因引入宿主植物细胞的任何方法学。特别地，所述一种或多种基因包含一种或多种rol基因。重要地，并且因为发根农杆菌天然地感染植物，转化包括将野生型基因从野生型细菌的Ri质粒天然转移至植物细胞，特别是rol基因。因此，并且如本文所使用的，转化既不表示也不需要将异源基因克隆至载体以用于转移至宿主植物细胞。此外，表达源自发根农杆菌的Ri质粒的一种或多种基因例如一种或多种rol基因的宿主植物细胞可表征为"转化的"。转化可通过任何已知方法包括例如天然感染、浸花(floral dip)、渗透(infiltration)、或粒子轰击(particle bombardment)来发生。细胞的转化可通过任何已知方式检测，包括但不限于RNA印迹、DNA印迹、PCR、RT-PCR(同义q-PCR、qRT-PCR)和/或基因组测序。还可以从根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ri质粒取源自所述Ri质粒的一种或多种基因，并且在根癌农杆菌系统的背景之外使用，从而转化设想的植物。本领域技术人员将意识到这类方法。
术语"组织培养物"指的是在无菌条件下繁殖的植物组织，通常用于产生植物的克隆。植物组织培养依赖于很多植物细胞具有再生整个植物的能力的事实。单个细胞、没有细胞壁的植物细胞(原生质体)、小块的叶、或根可通常用于在提供了需要的营养和植物激素的培养基上生成新植物。
如本文所使用的，"种间杂种(interspecific hybrid)"包括来自相同属的两个不同种的植物和其品种(cultivars)的杂交(cross)的子代，以及源自随后的与亲本(parent)或姊妹株(sibling)或来自相同或相容种的品种之一的回交的子代。这种与亲本之一的回交可进行一次或多次，目标是将密实度性状与期望的特征稳定地结合。"种间杂种"包含在植物的背景中具有种间杂交的任何所述植物。即，种间杂种包括两种植物种之间杂交的第一代和随后的几代，以及产生自用相同或不同种的植物自交种间杂种或杂交种间杂种的子代。
发根农杆菌指的是发根农杆菌和其来自农杆碱型菌株的Ri质粒。T-DNA含有两种片段、即TL和TR，它们由未整合的15Kb序列分隔。TL-DNA含有存在4种根基因座基因的18个开放阅读框(ORF)。TR-DNA含有多种基因，包括aux1和aux2。
"毛状根表型"指的是指示推定的转化植物的植物表型。即，当发根农杆菌感染植物细胞并且转移一种或多种rol基因时，毛状根生长发生在感染位点。以该方式，毛状根表型提供用于识别推定的转化体的无标记方法。
"中等高度"是指植物高度相对于野生型或相同种的对照植物的高度的定量减少，但还指植物高度相对于用发根农杆菌的Ri质粒的一种或多种基因转化的所述种的植物的高度的增加。由于转化的植物通常显示密实生长或矮态，转化的植物的高度通常约小于野生型非转化对照植物的高度的20％、15％或10％。因此，相比于相同种的野生型未转化的植物、优选转化的植物源自的亲本植物的高度，"中等高度"的植物由野生型未转化的植物的高度的25％-75％、优选30-70％、更优选40-60％的高度定义。
"中等密实度"指的是植物密实度相对于野生型或相同种的对照植物的定量增加。密实度与节间之间的距离相关。节间越短，植物越密实。本文中中等密实度由节间之间的距离的25-75％、优选30-70％、更优选40-60％减少来定义。短语"中等密实度"与"中等长度"相关。在Ri转化体、特别是rol转化体中，当长度减少时密实度增加。
术语"对照植物"和"野生型植物"旨在意为与转化体植物相同的植物，即源自相同亲本来源或属于相同种或种类。本领域技术人员将立刻理解如何比较转化的植物与对照或野生型植物，并且取哪些植物作为对照植物，即检查转化事件是否发生。
术语植物的"子代"包含具有所述植物作为祖先的所有后代植物。
A.核酸序列
术语"基因"指的是包含产生RNA或多肽所需要的编码序列的核酸(例如DNA或RNA)序列。多肽可由全长编码序列或其任何部分编码。当对于基因使用时，术语"其部分"指的是该基因的片段，特别是编码至少部分蛋白质的片段。片段的大小范围可为几个核苷酸至整个基因序列减一个核苷酸。因此，"包含至少部分基因的核酸序列"可包含基因的片段或整个基因。
"基因"还包含结构基因的编码区，并且包括位于5'和3'端的编码区附近的距离各端约1kb的序列，从而基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5'、并且存在于mRNA上的序列称为5'非翻译(或未翻译)序列(5'UTR)。位于编码区的3'或下游、并且存在于mRNA上的序列称为3'非翻译(或未翻译)序列(3'UTR)。
本文所使用的"核酸"指的是线性或支化的、单链或双链的RNA或DNA，或其杂交体。术语还包含RNA/DNA杂交体。
"编码(encoding,coding)"指的是基因通过转录和翻译机制向细胞提供信息的过程，由此一系列氨基酸可组装为特定氨基酸序列从而产生活性酶。由于遗传密码的简并性，DNA序列中的某些碱基改变不会改变蛋白质的氨基酸序列。因此理解，考虑编码不实质地影响蛋白质的功能特性的转录因子的DNA序列中的修饰。
术语"表达"，如本文所使用，指的是功能性终产物例如mRNA或蛋白质的生产。
术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换地使用来指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于一种或多种氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物、以及天然存在的氨基酸聚合物。
探针或引物指的是可设计和合成、或作为较大序列的片段产生的短寡核苷酸序列。探针或引物可为任何长度，例如长度为6、7、8、9、10、1 1、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、或60个核苷酸。
示例性rol序列包括但不限于分别在SEQ ID NOs:1-12中列出的序列，以及由有一个或多个碱基删除、取代、插入、或添加的SEQ ID NO:1-12的片段或变体组成的核酸分子，所述变体编码具有rol活性的多肽。例如，并且绝不限制，本公开提供SEQ ID NO:1、以及SEQID NO:1的各种片段，其可包括例如rolA-D和aux1-2。例如，并且对于本领域普通技术人员显而易见的是，rolA基因可代表包含rolA-D和aux1-2的较大序列的700bp部分或片段。
"变体"是偏离特定基因或蛋白质的标准或给定的核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。术语"同工型(isoform)"、"同种型(isotype)"、和"类似物"也指核苷酸或氨基酸序列的"变体"形式。通过一种或多种氨基酸的添加、除去、或取代而改变的氨基酸序列，或核苷酸序列中的变化，可认为是"变体"序列。变体可具有"保守"变化，其中取代的氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如，用异亮氨酸替代亮氨酸。变体可具有"非保守"变化，例如，用色氨酸替代甘氨酸。类似的小改变还可包括氨基酸缺失或插入，或两者。确定哪些氨基酸残基可取代、插入、或缺失的指导可使用本领域内广泛公知的计算机程序例如Vector NTI Suite(InforMax,Md.)软件来发现。"变体"还可指"改组基因"，例如在Maxygen受让的专利中描述的那些。
在"变体"序列的类别中包括的是与参考rol序列杂交的序列。例如，当两种序列在6x SSC、0.5％SDS、5x邓哈特(Denhardt)溶液和100μg的非特异性载体DNA的杂交溶液中形成双链复合物时，所述两种序列杂交。参见Ausubel等人，见上文，节2.9处，补充27(1994)。序列可以以"中度严格性(moderate stringency)"杂交，其定义为60℃的温度、在6倍SSC、0.5％SDS、5倍邓哈特溶液和100μg的非特异性载体DNA的杂交溶液中。对于"高严格性"杂交，温度增加至68℃。遵循中度严格性杂交反应，在室温下、在2倍SSC加0.05％SDS的溶液中洗涤核苷酸5次，随后在60℃下用0.1倍SSC加0.1％SDS洗涤1小时。对于高严格性，洗涤温度增加至68℃。本领域普通技术人员可通过改变杂交反应和洗涤过程中的温度、杂交反应和洗涤过程中的盐浓度等来容易地选择这类条件。为了本目的，可使用1ng具有10,000cpm/ng的特异性放射性的放射性标记的探针检测杂交的核苷酸，其中杂交的核苷酸在-70℃下暴露于X射线胶片不多于72小时后清楚地可见。
本申请意指与在SEQ ID NO:1-18的任一种中描述的核酸序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的这类核酸分子。优选为与在SEQ ID NO:1-18的任一种中示出的核酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸分子。两种核酸序列之间的差异可在参考核苷酸的5'或3'末端位置处发生。
作为实际问题，说明是否任何特定核酸分子与参考核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％相同意味着使用本领域内公知的算法在两种分子之间作比较，并且可使用公众可获得的计算机程序例如BLASTN算法常规地确定。参见Altschul等人,NucleicAcids Res.25:3389-402(1997)。
术语"序列同一性(sequence identity)"和"序列相似性"可通过使用全局或局部比对算法比对两种肽或两种核苷酸序列来确定。然后当序列分别在其整个长度上具有至少70％的序列同一性时，序列可称为"基本上相同的(substantially identical)"或"本质上相似的(essentially similar)"。序列比对和百分比序列同一性的评分可使用计算机程序例如可从Accelrys Inc.,9685Scranton Road,San Diego,Calif.92121-3752USA获得的GCG Wisconsin Package,版本10.3，或EmbossWin版本2.10.0(使用程序"needle")来测定。可选地，百分比相似性或同一性可通过使用算法如FASTA、BLAST等对数据库搜索来测定。
本公开可考虑编码功能性蛋白的核酸分子。如在本领域所公知的，理解这类蛋白质包含不改变任何蛋白质的功能的氨基酸取代、添加、和删除。因为很多蛋白质由基因家族编码，期望其他基因可编码具有与本多肽相似功能的蛋白质。可通过序列比较识别和功能地注释这些基因。本领域技术人员可在常规方法例如用合适的杂交探针筛选cDNA文库或基因组文库的帮助下识别功能上相关的蛋白质序列。本领域技术人员已知旁系同源序列(paralogous sequences)还可在(简并的)寡核苷酸和基于PCR的方法的帮助下分离。
B.核酸构建体
如上所述，将源自发根农杆菌的Ri质粒的一种或多种基因序列转移至宿主植物细胞。这类转移可通过天然方式例如使用携带包含天然rol基因的Ri质粒的发根农杆菌天然感染植物细胞来发生。这类天然或原生(native)转移避免对构建体和选择标记(selectionmarker)的需要。
然而，另一方面，可将包括rol序列的、源自发根农杆菌的Ri质粒的一种或多种基因掺入适用于引入植物细胞的核酸构建体。因此，例如在不利用原生系统的情况下，核酸构建体可用于在植物细胞中表达rol。
示例性的核酸构建体可包括生成mRNA并因此生成多肽的最小长度的碱基序列。不存在碱基序列长度的理论上限。以下更详细地描述这类构建体的制备。
作为用于转录的核酸序列的来源，可使用合适的cDNA或基因组DNA或合成多核苷酸。描述了合适的rol序列的分离方法，见上文。因此可得到编码整个、或基本上整个序列的序列。合适长度的该DNA序列可通过限制酶的方式切下用以使用。当使用基因组DNA作为用于转录的部分碱基序列的来源时，可以使用内含子或外显子区域、或两者的组合。
可使用标准技术制备重组核酸构建体。例如，用于转录的核酸序列可通过用限制酶处理含有所述序列的载体从而切下合适的区段来得到。用于转录的核酸序列还可通过退火和连接合成的寡核苷酸或通过在聚合酶链式反应(PCR)中使用合成寡核苷酸来生成，从而在各端给出合适的限制性位点。然后将核酸序列克隆至含有合适的调节元件例如上游启动子和下游终止子序列的载体。
另一方面涉及核酸构建体，其中源自发根农杆菌的Ri质粒的一种或多种基因的基因序列、例如rol序列可操作地连接至一种或多种调节序列，所述调节序列驱动rol序列在某些细胞类型、器官、或组织中的表达，而不过度地影响正常发育或植物生理。
当然，并且在天然转化或天然感染系统的背景中，使用原生或内源调节序列，而不是异源序列。
"启动子"意指从转录起始上游的DNA区域，其涉及RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合从而起始转录。"组成型启动子"在整个植物生命和多数环境条件下为活性的。组织特异性、组织优选的(tissue-preferred)、细胞类型特异性、和诱导型启动子组成"非组成型启动子"的类别。"可操作地连接"指的是启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始和介导对应于第二序列的DNA序列的转录。通常，"可操作地连接"意为连接的核酸序列是连续的。
有用于引入细胞的核酸序列的表达的启动子可包括用于天然转化系统的原生或内源启动子，或组成型启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，或组织特异性、组织优选的、细胞类型特异性、和诱导型启动子。例如，通过使用维管系统特异性、木质部特异性、或木质部优选的启动子，可特异性地在很多组织例如维管组织、特别是木质部中修饰rol表达。通常，组成型启动子的使用影响在植物的所有部分中酶的水平和功能，而组织优选的启动子的使用允许将修饰的基因表达靶向特定植物部分，导致更可控的表型。
载体还可包含位于rol序列下游的终止序列，从而使mRNA的转录终止，并且添加polyA序列。这类终止子的实例为原生或内源终止子序列、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子、或胭脂碱合酶基因(nopaline synthase gene,Tnos)终止子。表达载体还可包含增强子、起始密码子、剪接信号序列、和靶向序列。
表达载体还可包含选择标记，通过所述选择标记可在培养物中识别转化的细胞。标记可与异源核酸分子、即与启动子可操作地连接的基因相关联。如本文中所用的，术语"标记"指的是编码允许选择、或筛选含有标记的植物或细胞的性状或表型的基因。在植物中，例如，标记基因将编码抗生素或除草剂抗性。这允许从未转化或转染的细胞中选择转化的细胞。
合适的可选择标记的实例包括腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、草甘膦和草铵膦(glufosinate)抗性、和氨基糖苷3'-O-磷酸转移酶(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。这些标记可包括对G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素、和艮他霉素的抗性。构建体还可包括赋予对除草剂膦丝菌素类似物如草丁膦铵盐(ammonium gluphosinate)抗性的可选择标记基因Bar。Thompson等人,EMBOJ.9:2519-23(1987)。其他合适的选择标记也是已知的。
可使用可见标记例如绿色荧光蛋白(GFP)。还已描述了基于控制细胞分裂来识别或选择转化的植物的方法。参见WO 2000/052168和WO 2001/059086。同样地，区别表型例如肿瘤或毛状根生长的存在也可用于识别和选择。
在天然转化或天然感染系统中，不采用选择标记。因为感染提供其自身的区别和天然表型，转化的细胞可基于感染后表型例如毛状根表型来选择。
还可包括细菌或病毒来源的复制序列，从而允许载体在细菌或噬菌体宿主中克隆。优选地，使用宽宿主范围原核复制起点。可包括用于细菌的可选择标记(selectablemarker)，从而允许携带期望的构建体的细菌细胞的选择。合适的原核可选择标记还包括对抗生素例如卡那霉素或四环素的抗性。
如本领域内公知的，编码附加功能的其他核酸序列也可存在于载体中。例如，当农杆菌属(Agrobacterium)是宿主时，可包括T-DNA序列，从而促进随后转移和掺入至植物染色体。
C.转化方法学：基因的转移
如上所述，"转化"指的是任何用于将源自发根农杆菌的一种或多种基因引入宿主植物或植物细胞的方法学。重要地，并且因为发根农杆菌天然地感染植物，转化包含将野生型基因从野生型细菌的Ri质粒转移至植物细胞，特别是一种或多种rol基因和/或aux基因。因此，并且如本文所使用的，转化不要求将异源基因克隆至用于转移至宿主植物细胞的载体，转化也不要求遗传地改造细菌。
"转化的植物"指的是包含还本身存在于另一生物体或种的、或相对于来自另一生物体或种的宿主密码子使用来优化的核酸序列的植物。单子叶和双子叶被子或裸子植物细胞都可以本领域内公知的各种方式转化。例如，参见Klein等人,Biotechnology 4:583-590(1993)；Bechtold等人,C.R.Acad.Sci.Paris 316:1 194-1 199(1993)；Bent等人,Mol.Gen.Genet.204:383-396(1986)；Paszowski等人,EMBO J.3:2717-2722(1984)；Sagi等人,植物细胞Rep.13:262-266(1994)。可使用农杆菌属物种例如根癌农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌，例如，根据Nagel等人，Microbiol Lett 67:325(1990)。此外，植物可通过根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)或中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)转化来转化。Broothaerts等人,Nature 433:629-633(2005)。
例如，农杆菌属可使用植物表达载体通过例如电穿孔转化，然后将农杆菌属通过广泛公知的叶盘法(leaf-disk method)引入植物细胞。用于实现上述的其他方法包括但不限于，电穿孔、粒子枪轰击(particle gun bombardment)、磷酸钙沉淀、和聚乙二醇融合、转移至萌发的花粉粒、直接转化，Lorz等人,Mol.Genet.199:179-182(1985)，以及本领域公知的其他方法。如果采用选择标记例如卡那霉素抗性，这使确定哪些细胞已成功地转化更容易。标记基因可包括于由特定重组酶例如cre或flp识别的重组位点对之内，从而促进选择后标记的移除。参见美国公开申请号2004/0143874。
没有标记基因的转基因植物可使用第二质粒产生，所述第二质粒包含编码标记的核酸，与包含源自发根农杆菌Ri质粒的基因序列、特别是rol序列的第一质粒不同。将第一和第二质粒或其部分引入相同的植物细胞，从而瞬时表达可选择标记基因，识别转化的植物细胞，获得转化的植物，在所述转化的植物中设想的基因序列例如rol序列稳定地整合至基因组，并且可选择标记基因未稳定地整合。参见美国公开申请号2003/0221213。
上述农杆菌属转化方法已知用于转化双子叶植物(dicot)。此外，de la Pena等人,Nature 325:274-276(1987)、Rhodes等人,Science 240:204-207(1988)、和Shimamato等人,Nature 328:274-276(1989)已使用农杆菌属转化谷物单子叶植物(monocot)。还参见Bechtold等人,C.R.Acad.Sci.Paris 316(1994)，说明用于农杆菌属介导的转化的真空渗入。
植物细胞可用核酸或核酸构建体转化，而不使用可选择或可见标记，并且可通过检测引入的序列或构建体的存在来识别转基因生物体。可测量在特定细胞中的蛋白质、多肽、或核酸分子的存在，从而测定例如是否细胞已成功地转化或转染。例如，并且作为本领域内的常规，引入的构建体的存在可通过PCR或用于检测特定核酸或多肽序列的其他合适方法来检测。此外，可通过辨别与在相同条件下培养的非转化细胞的生长速率或形态特征相比，转化的细胞的生长速率或形态特征的不同来识别转化的细胞。参见WO2004/076625。
从转化的细胞或培养物再生植物的方法根据植物的种而变化，但基于已知的方法学。例如，在本领域内广泛公知的用于再生伽蓝菜属植物的方法可在Christensen,等人(2008).Plant Cell Rep.27,1485-1495中找到。
D.用发根农杆菌转化的植物的筛选和分析
选择本转化的植物，其相对于对照、即相同种的非转化的植物含有和表达源自发根农杆菌的Ri质粒的一种或多种基因，所述基因优选包含一种或多种rol基因。此外，相对于非转化的对照植物，本植物可具有变化的表型。这类表型可包括中等高度或中等密实度，其中转化的植物相比于对照植物具有减少的高度和/或密实度。
在本发明的第一方面中，本发明人现已意外地发现通过用携带Ri质粒的发根农杆菌感染而用源自发根农杆菌的Ri质粒的一种或多种基因转化的植物不具有上述缺点或程度显著较低，但反而显示设想的中等生长，同时不或至少不显著地在花数和其他不期望的表型例如皱叶方面受影响。在此，短语"源自发根农杆菌"特别地旨在意为"源自发根农杆菌的Ri质粒"，特别是分别来自如SEQ ID NOs 1和2中所示的Ri质粒的TL-和TR-DNA。为了该目的，本发明通过用携带Ri质粒的发根农杆菌感染来提供具有源自发根农杆菌的Ri质粒的一种或多种基因的转化的植物、或这类植物的子代，所述植物或子代在其基因组中包含1至5个拷贝的所述源自Ri质粒的一种或多种基因。本发明的植物通过用发根农杆菌感染来获得，从而源自Ri质粒的基因通过在植物的细胞中引入Ri质粒来引入其中。这意为所述基因在植物细胞的天然环境中引入所述植物细胞，没有任何DNA，不源自Ri质粒。因此，术语"源自Ri质粒的基因"意为宿主用Ri质粒转化，导致Ri质粒的基因变为掺入植物基因组中。
通过用携带Ri质粒的发根农杆菌感染植物，将Ri质粒引入植物细胞。如上所述，该事件通常导致多个拷贝的Ri质粒、即包括其上存在的所有基因掺入植物基因组。然而，已发现特定选择技术，特别是关于作为感染的结果而发展的毛状根特征，或通过将转化的植物与未转染的植物杂交从而稀释植物基因组中源自Ri质粒的基因的数量，导致具有有限数量的源自Ri质粒的基因的植物。还可以获得通过发根农杆菌感染用Ri质粒转化的植物后代，其中删去(crossed out)源自Ri质粒的基因的一种或多种，产生包含存在于Ri质粒上的一种或多种基因、但不是全部基因的后代植物。
发现较高拷贝数的这类基因导致矮态和其他不期望的性质例如上述的皱叶和花序数的减少。通过仅有限拷贝数的源自Ri质粒的基因的存在，至少部分地克服这类缺点。
优选地，植物或其子代在其基因组中包含1至5个拷贝的rolA、rolB、rolC和rolD基因的至少一种或多种。然而，还可包括aux1、aux2和任何如在Ri质粒上识别的开放阅读框。基于实验数据，认为特别是rol基因在上述特征中起重要作用。因此，本公开的植物或其子代优选在其基因组中包含1至5个拷贝的rolA、rolB、rolC和rolD基因。
在具体实施方案中，本公开的植物或其子代在其基因组中包含存在于Ri质粒上的1至5个拷贝的基因，即包括上述的rol和aux基因。优选植物或其子代包含1至5个拷贝的Ri质粒。然而，如上所述，可以在所述植物的后代中删去源自Ri质粒的一种或多种基因。
拷贝数优选为3以下、2以下或甚至1。已发现使用这类低数量的基因拷贝获得没有伴随的不良作用例如皱叶的设想的中等高度。
优选地，通过用携带Ri质粒的发根农杆菌感染来获得植物。然而，可以通过已知的基因工程技术将发根农杆菌的Ri质粒引入植物，导致源自Ri质粒的一种或多种基因或其两种以上的组合、或全部四种rol基因、或Ri质粒的全部基因掺入植物的基因组。然而，植物或植物细胞的用发根农杆菌的感染已证明是非常有效和方便的。本领域技术人员知晓如如何用发根农杆菌转染设想的植物的合适技术。
发根农杆菌优选为野生型，例如发根农杆菌菌株A4，以保藏号ATCC43057保藏于ATCC，这是由于使用野生型发根农杆菌产生认为不是GMO(遗传修饰的生物体)的转化体。
虽然任何方法学可用于产生用发根农杆菌、特别是用一种或多种rol基因转化的植物，本公开提供用于产生属于上述的任意属的转化的植物的"天然"和"非天然"方法学两者。例如，并且如上所述，本申请人利用野生型发根农杆菌来将其原生基因、包括其rol基因转移至植物细胞。虽然这是发根农杆菌将其原生基因转移至植物细胞的"天然"系统，但这不可能在自然中成功地发生，这是因为用发根农杆菌转化的密实植物面临障碍例如由于密实叶形成较紧密的结构而引起的真菌感染的风险增加、以及来自邻近植物的竞争性。
本公开的植物或其子代优选显示未转化的对照植物的25-75％、优选30-70％、更优选40-60％的中等高度。
在优选实施方案中，相比于未转化的对照植物，转化的植物或其子代具有不少于80％的花数和/或不具有多于4天的延迟开花时间(delayed flowering time)。本发明人现已发现，相比于未转化的对照植物，用发根农杆菌转化的植物、特别是rol转化的植物意外地不具有显著的花数损失，即具有至少80％、但优选至少90％或100％或甚至更多的(即增加的花数)的花数。同样适用于开花延迟，相比于未转化的植物，所述开花延迟优选不晚于4天，更优选不晚于2天。在一些转化体中，相比于未转化的对照植物，开花甚至更早发生。
鉴于上述，本公开的植物或其子代优选属于以下属或种的任一种：
伽蓝菜属(Kalanchoe)，特别是圣诞伽蓝菜(K.blossfeldiana)、裂叶伽蓝菜(K.laciniata)、羽叶长寿(K.pinnata)、江户紫(K.marmorata)、掌上珠(K.gastonis-bonnieri)、狄氏伽蓝菜(K.dixoniana)、虎纹伽蓝菜(K.humilis)、安汶伽蓝菜(K.ambolensis)、馥芳伽蓝菜(K.aromatic)、长寿山樱花(K.campanulata)、黄伽蓝菜(K.citrina)、红伽蓝菜(K.coccinea)、库仑伽蓝菜(K.crundallii)、大叶落地生根(K.daigremontiana)、伏生长寿(K.decumbens)、浮世迪伽蓝菜(K.faustii)、紫晶扇贝(K.fedtschenkoi)、费氏伽蓝菜(K.figueredoi)、红川莲(K.flammea)、矮生伽蓝菜(K.glaucescens)、细柄长寿(K.gracilipes)、天之羽袖(K.grandiflora)、花栎长寿(K.guignardii)、金线长寿(K.jongmansii)、裂叶伽蓝菜(K.laciniata)、宽萼长寿(K.latisepela)、疏花长寿(K.laxiflora)、野长寿(K.lobata)、长花长寿(K.longiflora)、小宫灯长寿(K.manginii)、尼卡伽蓝菜(K.nyikae)、扁柏长寿(K.obtuse)、圆锥伽蓝菜(K.paniculata)、大宫灯长寿(K.porphyrocalyx)、皮维茨长寿(K.prittwitzii)、毛竹长寿(K.pubescens)、白粉叶伽蓝菜(K.pumila)、劳氏长寿(K.rauhii)、圆叶长寿(K.rotundifolia)、小叶长寿(K.scapigera)、舒玛切利长寿(K.schumacherii)、匙叶伽蓝菜(K.spathulata)、链坦沙长寿(K.streptantha)、蝶莲杯长寿(K.synsepala)、毛白杨长寿(K.tomentosa)、唐印(K.thyrsiflora)、吊灯长寿(K.tubiflora)、长寿草(K.uniflora)；
菊属(Chrysantemum)，特别是杭菊(Chrysantemum morifolium)、杭菊杂种(Chrysantemum x morifolium)(异名，杂交杭菊(C.x grandiflorum))例如菊属(Dendranthema)杂种、或杭菊和其他菊属物种例如野菊(Chrysanthemum indicum)之间的杂种；
紫菀属(Aster)，特别是荷兰菊(Aster novi-belgii)、翠菀(Aster dumosus)；
蔷薇属(Rosa)，特别是现代月季(Rosa hybrid)、狗蔷薇(Rosa canina)、密刺蔷薇(Rosa spinosissima)、突厥蔷薇(Rosa damascena)"三十花瓣(trigintipetala)"、百叶蔷薇(Rosa centifolia)；
茄属(Solanum)，特别是番茄(Solanum lycopersicum)、阳芋(Solanumtuberosum)、烟草茄(Solanum nicotiana)；
大戟属(Euphorbia)，特别是一品红(Euphorbia pulcherrima)、刺梅(Euphorbiamilii)；
蝴蝶兰属(Phaelanopsis)，特别是蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)、安汶蝴蝶兰(Phalaenopsis amboinensis)、白蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)、齿脊蝴蝶兰(Phalaenopsis appendiculata)；
罗勒属(Ocimum)，特别是罗勒(Ocimum basilicum)；
辣椒属(Capsicum)，特别是辣椒(Capsicum annuum)、风铃辣椒(Capsicumbaccatum)、黄灯笼辣椒(Capsicum chinense)、小米辣(Capsicum frutescens)、绒毛辣椒(Capsicum pubescens)；
薄荷属(Mentha)，特别是野薄荷(Mentha arvensis)、科西嘉薄荷(Mentharequienii)、留兰香(Mentha spicata)、欧薄荷(Mentha longifolia)、唇萼薄荷(Menthapulegium)、圆叶薄荷(Mentha suaveolens)、水薄荷(Mentha aquatic)、野薄荷杂留兰香(Mentha arvensis x spicata)、水薄荷杂野薄荷(Mentha aquatica x arvensis)、辣薄荷(Mentha x piperita)；
木槿属(Hibiscus)，特别是朱槿(Hibiscus rosa-sinensis)、吊灯扶桑(Hibiscusschizopetalus)、玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa)、木槿(Hibiscus syriacus)、野西瓜苗(Hibiscus trionum)、大麻槿(Hibiscus cannabinus)；
红蝉花属/飘香藤属(Mandevilla/Dipladenia)，特别是红皱藤(Mandevilla xamabilis)、飘香藤(Mandevilla sanderi)、艳花飘香藤(Mandevilla splendens)；
洋桔梗属(Eustoma)，特别是土耳其桔梗(Eustoma russellianum)、洋桔梗(Eustoma exaltatum)；
薰衣草属(Lavendula)，特别是薰衣草(Lavandula angustifolia)、宽叶薰衣草(Lavandula latifolia)、绵毛大薰衣草(Lavandula lanata)、齿叶薰衣草(Lavanduladentate)、法国薰衣草(Lavandula stoechas)、蝴蝶薰衣草(Lavandula pedunculata)、绿薰衣草(Lavandula viridis)；
百合属(Lillium)，特别是博兰德百合(Lilium bolanderi)、伯班克百合(Liliumx burbankii)、加拿大百合(Lilium canadense)、哥伦比亚百合(Lilium columbianum)、格雷百合(Lilium grayi)、洪堡百合(Lilium humboldtii)、凯莉百合(Lilium kelleyanum)、凯洛格老虎百合(Lilium kelloggii)、滨百合(Lilium maritimum)、卡罗来纳百合(Liliummichauxii)、密西根百合(Lilium michiganense)、希望百合(Lilium occidentale)、帕达博迪百合(Lilium x pardaboldtii)、豹纹百合(Lilium pardalinum)、帕里百合(Liliumparryi)、小豹纹百合(Lilium parvum)、费城百合(Lilium philadelphicum)、匹金宁百合(Lilium pitkinense)、华丽百合(Lilium superbum)、欧美里百合(Lilium ollmeri)、华盛顿百合(Lilium washingtonianum)、维金斯百合(Lilium wigginsii)；
铁线莲属(Clematis)，特别是本土铁线莲(Clematis addisonii)、原生铃铛铁线莲(Clematis albicoma)、高山铁线莲(Clematis alpine)、澳洲铁线莲(Clematisaristata)、小木通(Clematis armandii)、伯德维尼铁线莲(Clematis baldwinii)、大叶铁线莲(Clematis bigelovii)、布拉切特铁线莲(Clematis brachiate)、钟形铁线莲(Clematis campaniflora)、卡特斯布雅娜铁线莲(Clematis catesbyana)、威灵仙(Clematis chinensis)、金毛铁线莲(Clematis chrysocoma)、卷须铁线莲(Clematiscirrhosa)、克蒂列斯铁线莲(Clematis coactilis)、哥伦比亚纳铁线莲(ClematisColumbiana)、卷花铁线莲(Clematis crispa)、单独铁线莲(Clematis dioica)、长齿铁线莲(Clematis drummondii)、杜兰单叶铁线莲(Clematis durandii)、伊斯帕尼卡铁线莲(Clematis ispahanica)、法维提铁线莲(Clematis fawcettii)、火焰铁线莲(Clematisflammula)、弗罗里达铁线莲(Clematis florida)、弗雷蒙蒂铁线莲(Clematisfremontii)、格洛克菲拉铁线莲(Clematis glaucophylla)、格来希诺德铁线莲(Clematisglycinoides)、单叶铁线莲(Clematis henryi)、粗毛铁线莲(Clematis hirsutissima)、全缘铁线莲(Clematis integrifolia)、铁线莲杰克曼尼(Clematis x jackmanii)、毛叶铁线莲(Clematis lanuginose)、棉团铁线莲(Clematis lasiantha)、雷拓费拉铁线莲(Clematis leptophylla)、林圭斯弗利亚铁线莲(Clematis ligusticifolia)、长瓣铁线莲(Clematis macropetala)、马莫拉利亚铁线莲(Clematis marmoraria)、小叶铁线莲(Clematis microphylla)、绣球藤(Clematis montana)、莫尔费蒂铁线莲(Clematismorefieldii)、合苞铁线莲(Clematis napaulensis)、欧西顿沓雷斯铁线莲(Clematisoccidentalis)、欧克鲁卡铁线莲(Clematis ochroleuca)、东方铁线莲(Clematisorientalis)、帕梅丽铁线莲(Clematis palmeri)、天台铁线莲(Clematis patens)、泡西弗罗拉铁线莲(Clematis pauciflora)、匹克林吉铁线莲(Clematis pickeringii)、匹车尔铁线莲(Clematis pitcher)、雷克他铁线莲(Clematis recta)、里替克雷铁线莲(Clematisreticulate)、罗度卡帕铁线莲(Clematis rhodocarpa)、菝葜叶铁线莲(Clematissmilacifolia)、索士里斯铁线莲(Clematis socialis)、钓钟草(Clematis stans)、甘青铁线莲(Clematis tangutica)、圆锥铁线莲(Clematis terniflora)、三叶铁线莲(Clematisternifolia)、德克萨斯铁线莲(Clematis texensis)、凡斯卡勒铁线莲(Clematisversicolor)、革花铁线莲(Clematis viorna)、弗吉尼亚铁线莲(Clematis virginiana)、葡萄叶铁线莲(Clematis vitalba)、维提考里斯铁线莲(Clematis viticaulis)、意大利铁线莲(Clematis viticella)；
烟草属(Nicotiana)，特别是红花烟草(Nicotiana tabacum)、林烟草(Nicotianasylvestris)、花烟草(Nicotiana x sanderrae)；
寒丁子属(Bouvardia)，特别是寒丁子花(Bouvardia longiflora)；
香荚兰属(Vanilla)，特别是香荚兰(Vanilla planifolia)；
番薯属(Ipomoea)，特别是番薯(Ipomoea batatas)；
松果菊属(Echinacea)，特别是松果菊(Echinacea purpurea)、狭叶松果菊(Echinacea angustifolia)、苍白松果菊(Echinacea pallida)；
五味子属(Schisandra)，特别是五味子(Schisandra chinensis)、无毛五味子(Schisandra glabra)、红花五味子(Schisandra rubriflora)；
红景天属(Rhodiola)，特别是红景天(Rhodiola rosea)；
滨菊属(Leucanthemum)，特别是大滨菊(Leucanthemum maximum)、白晶菊(Leucanthemum paludosum)、大花滨菊(Leucanthemum x superbum)、法兰西滨菊(Leucanthemum vulgare)、阿杜斯他姆滨菊(Leucanthemum adustum)、格兰米妮弗里姆滨菊(Leucanthemum graminifolium)、因特格里姆弗里姆滨菊(Leucanthemumintegrifolium)、比利牛斯山菊花(Leucanthemum lacustre)、曼斯培里恩斯滨菊(Leucanthemum monspeliense)、帕伦斯滨菊(Leucanthemum pallens)、普拉克斯滨菊(Leucanthemum praecox)、萨博格劳卡姆滨菊(Leucanthemum subglaucum)、塞吕提卡姆滨菊(Leucanthemum sylvaticum)、华德斯泰尼滨菊(Leucanthemum waldsteinii)；
鹤望兰属(Strelitzia)，特别是鹤望兰(Strelitzia reginae)，包括属内的种间杂种，并且还包括上述属和种的任一种的属间嫁接(intergeneric graft)。
在具体实施方案中，属于以下任意属的本公开的植物特别适用于观赏用途：伽蓝菜属、紫菀属、菊属(Chrysanthemum)、铁线莲属、大戟属、木槿属、滨菊属、红蝉花属、烟草属、罗勒属、天竺葵属(Pelagonium)、蝴蝶兰属、蔷薇属和茄属。
另一方面，本发明涉及上述植物或其子代的以下用途：作为观赏植物，或用于提供或制备食物，或作为用于制备人类或动物必需品例如药物、刺激剂或化妆品的活性成分的来源。术语"人类或动物必需品"意味着在此意为源自所述植物的包含任何植物部分、化合物、化合物或提取物的混合物的任何产品，供人类或动物使用，特别是通过用这类产品治疗所述人类或动物，特别是所述人类或动物的身体的治疗，例如医学、化妆品或刺激性治疗，或由所述动物或人类消耗产品。因此还认为这样的食物是人类或动物必需品。
在本领域中，仅进行用包括大田作物种菊苣(Cichorum intybus)(比利时莴苣(Belgian endive))和作为刺激剂(香烟)的活性成分的来源的红花烟草(烟草)的发根农杆菌而转化的的植物的目视评价。然而本发明人已意外地发现包含1至5种Ri质粒的发根农杆菌基因、特别是源自发根农杆菌的rol基因的这类植物，例如用发根农杆菌或其一种或多种rol基因转化的植物，或所述植物的子代，不仅具有当这类植物生长得非常高、有损收获时是特别期望的中等高度，作为较小细胞体积的结果而具有较浓缩的内容物。不受任何理论限制，认为这类转化体的较小尺寸至少部分地由于较不伸长的植物细胞和因此较小的细胞。这是明显的，因为例如rol转化果实的果实例如来自辣椒属物种的胡椒、或来自香荚兰的香草(vanilla)、或草本植物(herbs)例如罗勒(basil,Ocimum basilicum)相比于非转化的对应物具有增强的味道。同样适用于番茄，马铃薯和单子叶植物例如小麦、大麦等。同样适用于用作用于药物或刺激剂制备的活性成分的来源的植物。这类植物例如药用植物在它们的细胞中以较浓缩的方式具有活性成分，因此促进分离和提取。在含有刺激剂烟碱的烟草的情况下，具有较高的烟碱含量，导致较浓缩的产品。用作人类必需品的植物、植物部分、化合物、和化合物或提取物的混合物的使用的更多细节在实施例中给出。
用于提供或制备食物的植物优选属于任意的属香荚兰属、罗勒属、辣椒属、番薯属、茄属，尽管任何这类植物由本发明包含。植物本身可用作食物，例如胡萝卜，或其果实，例如苹果、梨、浆果等，此外，可制备提取物，例如茶。
用作用于药物或刺激剂的制备的活性成分的来源的植物优选属于以下任意属：伽蓝菜属、茄属、烟草属、红景天属、松果菊属、五味子属、蔷薇属、木槿属和菊属。rol转化的伽蓝菜属含有增加水平的环落地生根素例如环落地生根素A具有强抗肿瘤促进活性，并且有趣地，类黄酮莰非醇和异鼠李素的水平在如本文所述的植物中显著增加，特别是在伽蓝菜属中，使这类植物的提取物在癌症治疗中呈现特别兴趣，rol转化的五味子属含有增加水平的五味子素(schisandrin)、脱氧五味子素(desoxyschisandrin)、戈米辛(gomisin)和前戈米辛(pregomisin)。rol转化的松果菊属具有增加水平的例如类苯基丙烷和松果菊苷。
因此，本发明还涉及如本文所述的植物或其子代的提取物用作药物，特别是伽蓝菜属提取物用作用于治疗癌症、或可通过抗氧化剂特别是类黄酮的作用来减轻的任何其他疾病或病症例如氧自由基诱导的疾病的药物。
此外，rol转化的杭菊或玫瑰茄的叶的提取物可用于茶的制备，蔷薇属(Rosa spp)可用于香料(perfume)的制备等。
另一方面，本发明涉及上述植物的制备方法，其包括：
(a)用发根农杆菌的Ri质粒转化野生型植物的组织，
(b)允许转化的组织发育具有毛状(hairy)表型的根，
(c)在步骤(b)的具有毛状表型的根中选择毛状表型显示步骤(b)中得到的根中观察到的最大根毛长度的至多一半的最大根毛长度的根；
(d)在再生培养基上生长选择的根，并且允许从所述选择的根产生转化生根的小植物(plantlet)；
(e)所述转化生根的小植物生长为具有相应野生型植物的25-75％高度的成熟的转化的母本植物。
意外地发现用源自发根农杆菌的Ri质粒的一种至五种基因转化的植物可以以该方式获得，而不具有上述缺点或程度显著较低。在此，短语"源自发根农杆菌的基因"、或"Ri基因"如上述所定义，并且特别旨在意为"源自发根农杆菌的Ri质粒的基因"，特别是来自分别在SEQ ID NOs 1和2中示出的Ri质粒的TL-和TR-DNA。
在步骤(a)中，组织例如野生型植物的叶盘(leaf disc)用发根农杆菌的Ri质粒转化，导致源自Ri质粒的基因的一种或多种掺入转染的植物细胞的基因组。如上所述，本领域技术人员意识到如何以导致在转化的植物细胞中表达源自Ri质粒的基因的一种或多种的方式将Ri质粒引入植物。植物可例如通过将发根农杆菌的培养物与植物或其部分的新鲜伤口接触来例如通过用发根农杆菌感染来获得。然而，还可以通过已知的基因工程技术将Ri质粒引入植物细胞，导致源自Ri质粒或其两种以上的组合的基因，例如一种或多种rol基因、其两种以上的组合、或全部四种rol基因由植物细胞表达。然而，用发根农杆菌感染植物或植物细胞已证明是非常有效和方便的。本领域技术人员意识到如何用发根农杆菌转染设想的植物、如何生产转化的植物的合适技术。
在随后的步骤中，允许由此转化的组织发育根，然后是选择具有毛状根表型、即用于发根农杆菌转化的植物组织的广泛公知的表型选择标记的一种或多种根的特定方式。然而，与对在根上具有最多和最长毛的多数毛状转化体进行选择的本领域相对的，本发明人意外地发现通过选择如步骤(c)中定义的少毛状根(less hairy root)，优选地得到具有中等高度的植物，而不是显示矮态生长的植物。意外地发现如根据本发明的该实施方式筛选的少毛状根由具有较少拷贝的源自Ri质粒的基因的植物产生。在正常转化事件中，转化体含有多于10个拷贝的源自Ri质粒的基因。通过选择具有毛长度为具有最大长度的那些的至多一半的毛状根的植物组织，发现了设想的转化体。具有最大毛长度的那些包含超过大于10个拷贝的Ri基因。
在选择后，选择的少毛状根在再生培养基上生长，从而转化生根的小植物可从其中产生，然后所述转化生根的小植物可生长至成熟。这类成熟的转化的母本植物包含1至5个拷贝的源自Ri质粒的基因，并且如上所述，将具有相应野生型植物例如相同种的对照植物的25-75％的设想的中等高度，所述中等高度可通过进行上述方法的相同步骤、并且从相同的组织材料、然而不进行转化步骤来产生。然而，还可使用相同种的另一野生型植物作为正常野生型植物高度的指示。
在有吸引力的实施方案中，选择步骤(c)还可包括以下：在步骤(b)的具有毛状表型的根中选择毛状表型显示每长度的分枝数量为在步骤(b)中得到的根中观察到的每这种长度的最大分枝数量的至多一半的根。除了根毛长度以外，分枝也是仅含有1至5个拷贝的Ri基因的转化体的选择标准，所述选择标准可与上述毛长度标准一起使用，或代替所述毛长度标准。优选考虑两种标准。如果每长度的毛状根的分枝数量为具有多数分枝的根的那些转化体的一半，这类转化体含有设想的较低拷贝数的Ri基因。
在选择时，在从未转化的组织部分生长的对照植物上检查根发育是有利的。
基于所述知识，本发明人通过上述方法得到，可开发没有特定选择步骤、但通过经由得到的转化的母本植物的杂交和回交来从转化体的基因组中"稀释"Ri基因的另一方法。在那种情况下，转化的母本植物在转化后确实具有多于10个拷贝的Ri基因，并且经常显示如上所述的矮态生长和其他缺点。通过选择转化的母本植物的后代直至得到设想的中等高度，植物在它们的基因组中具有1至5个拷贝的Ri基因。为了该目的，提供用于制备如上所述的植物的第二方法，其包括以下步骤：
(a)用发根农杆菌的Ri质粒转化野生型植物的组织，
(b)允许转化的组织发育具有毛状(hairy)表型的根，
(c)选择具有毛状根表型的推定转化的根；
(d)在再生培养基上生长选择的根，并且允许从所述选择的根产生转化生根的小植物；
(e)所述转化生根的小植物生长为成熟的转化的母本植物；
(f)通过杂交、回交和自交产生步骤(e)的成熟的转化的母本植物的子代，同时选择具有相比于步骤(e)的成熟的转化的母本植物的增加的高度、和相比于步骤(a)的野生型的减少的高度的子代，
(g)重复步骤(f)直至子代产生具有步骤(a)的相应野生型植物的25-75％高度的成熟植物。
在该实施方案中，步骤(c)仅选择毛状根的存在，而不需要更详细地研究毛长度或分枝数量。相反，加入附加步骤(f)，其中将推定显示矮态生长习性(即具有小于相应野生型植物的20％的长度)的步骤(e)的成熟的转化的母本植物进行一次或多次杂交或回交或自交步骤，所述一次或多次杂交或回交或自交步骤导致设想的中等高度的后代。通过这类进一步杂交，可引入其他功能，或目前的功能可进一步提高或在较晚的代中从植物移除。子代的杂种可进一步杂交和选择，并且这可重复几轮从而达到预期结果。
优选地，在上述方法中，步骤(e)、或者如果存在的步骤(f)和/或(g)包括选择相应野生型植物的30-70％、优选40-60％的植物高度。如果在第二方法中，设想高度的植物已经在步骤(e)中获得，选择那些植物可甚至使步骤(f)和(g)较不重要或多余。当在步骤(f)中获得设想高度的植物时同样适用。在此情况下，步骤(g)是多余的。
优选地，步骤(e)、或者如果存在的步骤(f)和/或(g)进一步包括选择如下的植物或子代，其相比于未转化的对照植物，具有不少于80％、优选不少于90％的花数和/或不具有多于4天、优选多于2天的延迟的开花时间。已发现当含有1至5个拷贝的源自Ri质粒的基因的一种或多种时产生这类植物，并且可被选择。
在有吸引力的实施方案中，步骤(a)包括将携带Ri质粒的发根农杆菌与植物或植物部分例如叶或叶部分共培养，允许发根农杆菌将Ri质粒递送至所述植物或植物部分中。如上所述，可通过任何已知的转化技术将Ri质粒引入植物细胞，优选将发根农杆菌与植物或植物部分共培养，例如包括使植物或植物部分损伤。
在所述方法中，通过将发根农杆菌与植物或植物部分共培养，将源自发根农杆菌的Ri质粒的一种或多种基因掺入植物细胞的基因组中，并且如上所述，优选包含一种或多种rol基因，特别是选自rolA、rolB、rolC和rolD。特别地，例如作为Ri质粒完全整合至植物基因组中的结果，还包括aux1、aux2和任何如Ri质粒上识别的开放阅读框。
在优选实施方案中，步骤(a)包括用发根农杆菌感染，这是转化的天然方式，而不需要应用基因操作技术。虽然任何方法学可用于用发根农杆菌的Ri质粒转化植物，但本公开提供用于产生特别是属于如上所述的任意的属的转化的植物的"天然"和"非天然"方法学两者。例如，并且如上所述，本申请人利用野生型发根农杆菌将其原生基因包括其rol基因转移至植物细胞。虽然这是发根农杆菌在没有外源DNA(即不属于发根农杆菌或宿主细胞的DNA)的存在下将其原生基因转移至植物细胞的"天然"系统，这不太可能成功地在自然中发生，这是因为用发根农杆菌转化的密实植物面临障碍，例如由于密实叶形成较紧密的结构而引起的真菌感染的风险增加，以及来自邻近植物的竞争性。除此之外，由于转化的植物将本质上含有很多拷贝的Ri质粒，这不仅导致矮态生长，还导致延迟开花，使与野生型植物异花传粉不可能。
发根农杆菌优选为野生型，例如菌株A4(ATCC43057)，即不含有通过基因工程的方式引入的遗传物质。有利地，使用野生型发根农杆菌产生认为不是GMO(遗传修饰的生物体)的转化体。
优选地，上述方法包括分析源自发根农杆菌的Ri质粒的一种或多种基因的拷贝数，使得可以选择具有减少的拷贝数的Ri质粒或其一种或多种基因的植物。优选地，在这种分析后，对具有1至5个拷贝的Ri质粒或其一种或多种基因的植物进行选择。在下述实施例中说明可能的分析，但分子生物学领域的技术人员将知道任何合适的和可应用的分析。
在非常有吸引力的方面，本发明涉及包含源自如本文所述的植物或其子代的植物部分、提取物、化合物、或其两种以上的混合物的产品。所述产品可例如选自由以下组成的组：果实、块茎、根、叶、食物提取物、化妆品、药物、香料。但这类产品不限于此。例如，果实例如胡椒或番茄、或块茎例如马铃薯比未用发根农杆菌转化的植物例如非rol转化的植物具有更强烈的味道。所述产品可通过编码rol基因的遗传物质或其部分的存在来识别。所述存在可例如通过PCR技术例如如本文所述来方便地识别。
附图说明
以下附图和实施例为说明性的，并且不限制本申请。当然，理解在保持在所意欲的精神和范围内的同时可进行很多变化和修改。
图1描述示例性的来自农杆碱型菌株的发根农杆菌Ri质粒。T-DNA含有两个区段，即由未整合的15Kb序列分隔的TL和TR。TL-DNA含有其中存在4个根基因座基因的18个开放阅读框(ORF)。TR-DNA含有多个基因，包括aux1和aux2。
图2、3和4分别示出已暴露于发根农杆菌的阳芋、飘香藤属(Dipladenia)和伽蓝菜属种间杂种2006-0199(裂叶伽蓝菜杂圣诞伽蓝菜杂种)的叶盘的根。A：非转化对照，B：转化、毛状，C：转化、少毛状。
图5A示出伽蓝菜属种间杂种2006-0199野生型(左)，和从用发根农杆菌转化的(图4C)的少毛状根再生的伽蓝菜属种间杂种4006-0199S2，它们在长日照条件(long daycondition)(光照从02:00至17:00)下在营养繁殖开始后15周。扦插插条(sticking thecuttings)后3周，将植物移至短日照条件用来花诱导(光照从07:00至17:00)。图5B示出伽蓝菜属种间杂种2006-0199野生型(左)和从图4B的根再生的毛状类型的用发根农杆菌转化的伽蓝菜属种间杂种4006-0199K20.1(右边3株植物)，它们在长日照条件(光照从02:00至17:00)。扦插插条后3周，将植物移至短日照条件用来花诱导(光照从07:00至17:00)。
图6示出rol转化的羽叶长寿(Kalanchoe pinnata)AAE(左)，和对照野生型植物(右)。中等高度的植物(中间，羽叶长寿rol-2 Pemba)通过左边的rol转化的植物的杂交和回交来得到。
图7示出rol转化的蔷薇属(左和中)和对照野生型植物(右)。具有中等高度的植物(中)源自对少毛状根的选择。
图8示出rol转化的紫菀属(左和中)和对照野生型植物(右)。具有中等高度的植物(中)源自对少毛状根选择。
具体实施方式
实施例
植物材料
将羽叶长寿、伽蓝菜属种间杂种2006-0199(Knud Jepsen A/S，Hinnerup，Denmarkand AgroTech a/s，
Figure GDA0001626741880000291
丹麦)的活体植物(in vivo plant)在日间和夜间20℃的温度、16小时日长和260μmol光子m-2s-1的光强度下在温室中培养。将离体植物在日间25℃和夜间22℃的温度、13小时日长和75μmol光子m-2s-1的光强度下在生长箱中培养。其他种的植物从不同供应商处购得。
各个种/杂种的叶外植体用于对照实验。将源自活体材料的叶在70％EtOH中1min，然后在1％NaOCl(VWR，Copenhagen，丹麦)和0.03％(v/v)Tween20(Merck,La Jolla,USA)中20min灭菌，并且在无菌水中清洗3次，保存直至切除。
细菌菌株
发根农杆菌菌株ATCC43057(A4)(由瑞典的瑞典农业科学大学的Dr.MargaretaWelander(Swedish University of Agricultural Sciences,Sweden)友情提供)用于毛状根的诱导。将菌株在液体MYA培养基中培养(Tepfer and Cassedelbart(1987)MicrobiolSci.4,pp.24-28)。将1mL的细菌甘油贮存液(在-80℃下保存)在50mL Falcon管中在10mLMYA中稀释，在27℃下温育8h，并且在260rpm下振荡。将溶液在250mL烧瓶中用100mL MYA进一步稀释，并且在黑暗中、27℃下、以260rpm振荡24h。在Nanodrop 1000(ThermoScientific，Wilmington，DE，美国)上测量OD600＝0.4-0.6。
转化
将灭菌的叶或离体植物切为最小1cm×1cm的块，并且在无菌水中保存直至所有外植体准备好。将水从外植体弃去，并且加入发根农杆菌悬浮液从而覆盖所有外植体30min。30min后，弃去发根农杆菌悬浮液，并且在表面上有发根农杆菌悬浮液的薄层的情况下转移切片至共培养板在黑暗中无选择下24h。将外植体在实验室中、在22℃的温度下、在黑暗中培养。在共培养后，通过用撕碎的无菌滤纸片干燥外植体，将外植体转移至0培养基(选择培养基)。叶表面在切下的叶的两侧尽可能地干燥。外植体保持在黑暗中直至根足够发育以转移至再生培养基。将材料在3个阶段中转化。转化用阳芋(参见图2)、飘香藤属(参见图3)、伽蓝菜属种间杂种2006-0199(裂叶伽蓝菜杂圣诞伽蓝菜杂种)(参见图4-5)、羽叶长寿(参见图6)、现代月季(参见图7)和荷兰菊(参见图8)进行。对于各个种，对照和推定转化体在同一天进行。
基础培养基
使用的用作所有培养基的背景的基础培养基为2.2g L-1的浓度的1/2×MS(SigmaM0404)(由Murashige与Skoog大量元素和微量元素组成)(Murashige和Skoog,1962)、30gL-1蔗糖(食糖)、7g L-1细菌琼脂(bacto agar)和0.50g L-1 2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)(Duchefa)。由1M KOH将pH调节为6.3，并且将培养基在121℃和103.5kPa下高压灭菌。
共培养培养基
用于外植体和发根农杆菌之间的共培养的共培养培养基由含有30μg mL-1乙酰丁香酮(Sigma-Aldrich，Steinheim，德国)的基础培养基组成。
选择培养基
选择培养基是用于推定转化的外植体和对照的根形成的无激素培养基。高压灭菌后向选择培养基加入过滤除菌(filter-sterilised)的抗生素。选择培养基由含有100mgL-1浓度的特美汀(timentin,TIM)的基础培养基1/2×MS培养基组成。优选地，选择培养基含有精氨酸，优选0.5mM精氨酸。
再生培养基
含有激素N-(2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲(CPPU)的再生培养基用于推定转化的根簇上的结节的再生。高压灭菌后向再生培养基加入过滤除菌的激素和抗生素。CPPU培养基包含含有1.5μg L-1CPPU以及100mg L-1浓度的TIM的基础1/2×MS培养基。
共培养
在所有处理中，将外植体共培养24小时。共培养后，将外植体印迹至无菌滤纸上，并且用撕碎的无菌滤纸片完全干燥。将对照和推定转化的外植体转移至选择培养基。
植物选择
24小时的共培养后，将外植体转移至0-培养基(选择培养基)，各培养皿上8个外植体。几周后，在处理中对特定培养皿监测根的增加数量和外植体的减少数量(由于玻璃化-叶部分变为玻璃样，或者由于感染)。
植物再生
当推定转化的外植体的根已发育为1.5-2cm的长度时，将它们成簇与部分外植体转移至CPPU培养基。在11h日光和20/18℃的日间/夜间温度和45-70μmol光子m-2s-1的强度(Philips，Amsterdam，荷兰)下，将转移的根簇置于气候室(Celltherm，英国)中的架上。仅转移用发根农杆菌处理的外植体的根簇。在此监测根簇的数量以及从根发育的结节的数量。对于4个种的任一种，当30天后未观察到阳性发育时，停止结节发育的计数。
对照植物
如转化体一样处理对照植物，但在没有细菌下、和每品种低数量的外植体-即25下在MYA培养基中温育。对照实验植物与转化体平行进行。
植物生长条件
本文所述的植物根据如以下表1和2中所述的日长和温度在温室中生长。植物在具有10.5cm或13cm的直径的盆中产生。根据品种、种、属和盆尺寸，从营养(vegetative,veg.)植物取插条，并且在种植后前3-8周生长和保持是营养的。种植后4-9周，将表1中描述的植物转移至花诱导条件。种植后13-19周之间，根据品种、种属、盆尺寸、和一年中的时间，植物进入它们的生殖(generative,gen.)阶段-是成熟的、具有开放或即将开放的花。
当自然光小于100μmol/m2/s时，在补充有70μmol光子m-2s-1SON-T光的自然光条件下生长植物。除了蝴蝶兰属和香荚兰属以外，所有植物在泥炭基土混合物(peat basedsoil mix)中生长，并且用含有200百万分率(ppm)氮、200ppm钾、40ppm磷、200ppm钙、40ppm镁、60ppm硫酸盐、1ppm铁、0.6ppm锰、0.1ppm铜、0.1ppm锌、0.3ppm硼、0.03ppm钼的溶液浇水。对于除了蝴蝶兰属和香荚兰属以外的所有植物，当光强度高于450μmol光子m-2s-1并且湿度保持在60-80％相对湿度之间的范围内时，激活用帘遮光。
蝴蝶兰属和香荚兰属在树皮基土混合物(bark based soil mix)中生长，并且用含有50百万分率(ppm)氮、50ppm钾、10ppm磷、50ppm钙、10ppm镁、15ppm硫酸盐、0.2ppm铁、0.1ppm锰、0.01ppm铜、0.01ppm锌、0.05ppm硼、0.005ppm钼的溶液浇水。
香荚兰属和蝴蝶兰属植物在自然光条件下生长。当光强度高于250μmol光子m-2s-1并且湿度保持在80-90％相对湿度之间的范围内时，激活用帘遮光。
表1：生长条件
Figure GDA0001626741880000331
表2：香荚兰属和蝴蝶兰属植物的生长条件
光照时段 黑暗时段 光照温度 黑暗温度
开花前的营养生长 06:00-18:00 18:00-06:00 24℃ 24℃
冷却用于花诱导 06:00-18:00 18:00-06:00 14-17℃ 14-17℃
花诱导后的生殖生长 06:00-18:00 18:00-06:00 24℃ 24℃
分子分析
在将Nucleomag 96植物试剂盒(http://www.mn-net.com/)的裂解缓冲液MC1用1％PVP补充的修改下，已经根据供应商建议在KingFisher Flex(thermo scientific)上用Nucleomag 96植物试剂盒进行每个样品6次独立的DNA分离。
qPCR扩增在DNA热循环仪(CFX96Touch Real-Time PCR Detection System,Bio-Rad)中根据以下程序进行：92℃2min，然后45个循环的92℃20s、59℃20s、和72℃20s。rolC和Ref1的反应、即表3通过根据供应商的指导使用SALSA聚合酶用LCgreen+单独地标记(BioFire Defense，http://biofiredefense.com/；MRC-Holland，www.mlpa.com)。
表3：使用的引物
引物# 靶 序列
2142 rolC F CAATAGAGGGCTCAGGCAAG SEQ ID NO 9
2143 rolC R CCTCACCAACTCACCAGGTT SEQ ID NO 10
1654 Ref1 AATGAGGGCTTGTTGGATGA SEQ ID NO 11
1655 Ref1 TTTGAGTGATGGCTCCTTCC SEQ ID NO 12
使用ΔCt假设两个反应具有相似的效率，并且由于它们在分开的孔中进行，它们以独立方式进行。相对量化已通过ΔCt＝Ct(rolC)-Ct(Ref1)进行，比通过2-ΔCt计算，并且拷贝数基于分析的植物为四倍体植物的原代转化体来计算，因此将所述比乘以4来得到拷贝数。
为了测定原代四倍体转化体的拷贝数，在Ref1作为内部伽蓝菜属参比下，已对未转化对照植物2006-0199(具有裂叶伽蓝菜和圣诞伽蓝菜作为亲本系的种间杂种)、所述对照植物的3种独立原代转化体(即在没有进一步杂交下基于如本文所述的根形态通过转化体的选择得到)、4006-0199K20.1、4006-0119S11和4006-0199S2、以及如Christensen,2008(同上所述)的Ri系331进行发根农杆菌的rolC的qPCR。所述转化体的生长习惯不同，见表1。对于2006-0199，如期望地不可检测到rolC，因此可确定比或拷贝数，在3种发根农杆菌转化体的情况下相比于参比基因Ref1，拷贝数存在明显差异。具有中等高度的半密实转化体4006-0199S11和4006-0199S2相比于Ref1具有一个拷贝的rolC，而显示矮态生长的密实转化体4006-0199K20.1具有11个拷贝的rolC，而Ri系331示出中等高度，参见表4。还观察到转化体4006-0199S11和4006-0199S2显示与对照相似的花数、和无叶起皱，而4006-0199K20.1和Ri系331两者显示皱叶和相比于对照减少约50％的花数。羽叶长寿AAE是非转化的野生型对照，羽叶长寿AAE rol是rol转化的羽叶长寿AAE，所述羽叶长寿AAE rol显示矮态、皱叶、延迟开花和相比于野生型的约50％的花数、具有10个拷贝的rolC。羽叶长寿AAE-rol与野生型AAE回交，产生多个系，例如羽叶长寿Rol-2 Pemba，所述羽叶长寿Rol-2 Pemba具有中等高度，但不起皱，并且花和花序的数量与未转化的羽叶长寿AAE大致相同。羽叶长寿Rol-2Pemba中的rolC拷贝数测定为2。在另一实验中，羽叶长寿AAE用rol转化，并且在原代转化体中，如本文所述对根形态进行选择，即选择的转化体的根毛长度为在转化体中观察到的最大根毛长度的至多一半。以该方式获得具有与羽叶长寿Rol-2 Pemba相似的表型、并且分别具有2个和3个rolC拷贝的羽叶长寿K2 AAE和羽叶长寿Pin5 A15 AAE。
对于试验的其他植物属获得相似的结果，其中选择也如上述基于根形态进行，参见表4。
表4：rolC比较对照(rolC compared control)的生长习惯和它们的拷贝数
Figure GDA0001626741880000361
c对照野生型
*rol转化的
**rol转化的并且对根形态选择
***rol转化的并且与野生型(wt)回交
统计分析
羽叶长寿功能为转化的参比。相似地，对照外植体具有5个重复，但每种/杂种5个外植体具有总共每种/杂种25个。因为外植体可由于感染而从实验取出，外植体的数量随时间改变。因此监测外植体的总数从而得到较好的外植体数量与根的形成之间的比。随数量增加，监测根的数量。计算每培养皿的存活外植体的平均值和每培养皿的根的平均值。两种平均值用于计算每个培养皿的比，从而描述每外植体的根的数量。
用线性回归并且使用斜率建模Vmax(根发育/天)。在Excel计算各观察的标准偏差(SD)和学生t检验(students t-test)(t检验)从而验证单个种/杂种内的变异。ANOVA检验用R(R是用于统计计算的免费的软件环境)进行。
结果
实验涉及用发根农杆菌的天然转化，从而研究不同种和杂种以及来自活体和离体的普通材料的转化效率。属于以下种的植物用优化Christensen等人(2008，同上)的圣诞伽蓝菜"Molly"的、或对各个种稍微改变来优化的条件转化：鹤望兰、荷兰菊、翠菀、杭菊、杭菊杂种(异名，杂交杭菊)例如菊属杂种、或杭菊和其他菊属物种例如野菊之间的杂种、一品红、刺梅、寒丁子花、朱槿、吊灯扶桑、玫瑰茄、木槿、野西瓜苗、大麻槿、红皱藤、飘香藤、艳花飘香藤、红花烟草、林烟草、花烟草、蝴蝶兰、安汶蝴蝶兰、白蝴蝶兰、齿脊蝴蝶兰、香荚兰、罗勒、辣椒、风铃辣椒、黄灯笼辣椒、小米辣、绒毛辣椒、番薯、番茄、阳芋、烟草茄、松果菊、狭叶松果菊、苍白松果菊、现代月季、狗蔷薇、密刺蔷薇、突厥蔷薇"三十花瓣"、百叶蔷薇、五味子、无毛五味子、红花五味子、红景天、羽叶长寿、江户紫、掌上珠、狄氏伽蓝菜、虎纹伽蓝菜、裂叶伽蓝菜。圣诞伽蓝菜"Molly"用作转化体内的对照，这是因为该品种形成转化系统的背景。
监测根诱导和生长作为各处理中的每培养皿的根总数。因为由于感染移除一些外植体，还监测了外植体随时间的总数。如此进行以在计算各植物系中每外植体的根数量时得到更无偏见的评估。
0培养基上的根发育
发现根形成在以下种中发生：鹤望兰、荷兰菊、翠菀、杭菊、杭菊杂种(异名，杂交杭菊)例如菊属杂种、或杭菊和其他菊属物种例如野菊之间的杂种、一品红、刺梅、寒丁子花、朱槿、吊灯扶桑、玫瑰茄、木槿、野西瓜苗、大麻槿、红皱藤、飘香藤、艳花飘香藤、红花烟草、林烟草、花烟草、蝴蝶兰、安汶蝴蝶兰、白蝴蝶兰、齿脊蝴蝶兰、香荚兰、罗勒、辣椒、风铃辣椒、黄灯笼辣椒、小米辣、绒毛辣椒、番薯、番茄、阳芋、烟草茄、松果菊、狭叶松果菊、苍白松果菊、现代月季、狗蔷薇、密刺蔷薇、突厥蔷薇"三十花瓣"、百叶蔷薇、五味子、无毛五味子、红花五味子、红景天、羽叶长寿、江户紫、掌上珠、狄氏伽蓝菜、虎纹伽蓝菜、裂叶伽蓝菜，并且在不晚于转移至0培养基后100天转移至再生培养基。在第一次转移至再生培养基时，来自以下的推定转化体与对照显著不同：鹤望兰、荷兰菊、翠菀、杭菊、杭菊杂种(异名，杂交杭菊)例如菊属杂种、或杭菊和其他菊属物种例如野菊之间的杂种、一品红、刺梅、寒丁子花、朱槿、吊灯扶桑、玫瑰茄、木槿、野西瓜苗、大麻槿、红皱藤、飘香藤、艳花飘香藤、红花烟草、林烟草、花烟草蝴蝶兰、安汶蝴蝶兰、白蝴蝶兰、齿脊蝴蝶兰、香荚兰、罗勒、辣椒、风铃辣椒、黄灯笼辣椒、小米辣、绒毛辣椒、番薯、番茄、阳芋、烟草茄、松果菊、狭叶松果菊、苍白松果菊、现代月季、狗蔷薇、密刺蔷薇、突厥蔷薇"三十花瓣"、百叶蔷薇、五味子、无毛五味子、红花五味子、红景天、羽叶长寿、江户紫、掌上珠、狄氏伽蓝菜、虎纹伽蓝菜、裂叶伽蓝菜。
根据本发明的转化的植物的可能用途
伽蓝菜属
实例：
·羽叶长寿
·江户紫
·掌上珠种间杂种'热带芭菲(Tropical Parfait)'
·狄氏伽蓝菜
·虎纹伽蓝菜
·裂叶伽蓝菜种间杂种'神奇粉(Amazing Pink)'
目前主要用作观赏植物。相比于非转化的植物，观察到降低的植物高度和增加的分枝。另外显示强抗肿瘤促进活性的次级代谢物例如环落地生根素A的含量使该属/种作为药用植物而引人关注。伽蓝菜属特别是羽叶长寿还含有香豆酸，阿魏酸，丁香酸，咖啡酸，柠檬酸，异柠檬酸，苹果酸，对羟基苯甲酸，类黄酮类(flavonoids)如槲皮素(quercetin)、莰非醇、槲皮素-3-二阿糖胞苷(quercetin-3-diarabinoside)、呋喃糖苷、槲皮素-3-L-鼠李糖苷-L-阿拉伯糖呋喃糖苷(quercetin-3-L-rhamnosido-L-arabino furanoside)、η-三十一烷、η-三十三烷、谷甾醇。研究显示这些化合物中的多种在rol转化的植物中显示较高的浓度。
这些化合物的任一种可从伽蓝菜属分离，并且用作或用于人类或动物必需品例如药物。用含有rol基因的发根农杆菌的Ri质粒转化的植物相比于对照显示更高的含量。
蔷薇属
实例：
·现代月季
·狗蔷薇
·密刺蔷薇
·突厥蔷薇'三十花瓣'
·百叶蔷薇
目前主要用作观赏植物。相比于非转化的对照，观察到降低的植物高度和增加的分枝，使得可以从每盆更少的插条而具有足够的分枝。蔷薇属还在香料行业中具有显著的用途。在欧洲，特别地使用突厥蔷薇'三十花瓣'，并且在世界的其他地区为百叶蔷薇。主要成分是芳香醇类的香叶醇和l-香茅醇和玫瑰樟脑(rose camphor)。β-大马酮也是香味(scent)的显著贡献者。用含有rol基因的发根农杆菌的Ri质粒转化的植物相比于对照显示更高的浓度。
鹤望兰属
实例：
·鹤望兰
由于其尺寸，主要用作切花(cut flower)。在用含有Ri质粒的发根农杆菌转化的植物中观察到植物高度以及生产时间(开花时间)的显著降低。
紫菀属
实例：
·荷兰菊
·翠菀
主要用作盆栽植物和切花。相比于非转化的对照，观察到降低的植物高度和增加的分枝，使得可以从每盆更少的插条而具有足够的分枝。
菊属
实例：
·杭菊
·野菊
·杭菊杂种(菊属杂种)
主要用作盆栽植物和切花，但还用作菊属茶(野菊)中的成分。在转化体中观察到降低的植物高度和增加的分枝，使得可以在使用植物作为盆栽植物时从每盆更少的插条而具有足够的分枝。从Ri转化的野菊和杭菊制得的茶提取物的风味显示为比未转化的对应物更强烈。
大戟属
实例：
·刺梅
·一品红(圣诞红(Poinsettia))
主要用作观赏植物。相比于非转化的对照，观察到降低的植物高度和增加的分枝，使得可以在不摘心下并且从每盆更少的插条而具有足够的分枝。
木槿属
实例
·朱槿
·吊灯扶桑
·玫瑰茄
·木槿
·野西瓜苗
·大麻槿
主要用作盆栽植物或温带地区(木槿)和热带/亚热带(所有种)的观赏园林植物。在转化体中观察到降低的植物高度和增加的分枝，使得可以在不摘心下、并且从每盆更少的插条而具有足够的分枝。木槿属花含有花色素苷，并且用含有rol基因的发根农杆菌的Ri质粒转化的植物相比于对照显示更高的浓度。
飘香藤属/红蝉花属
实例：
·红皱藤
·飘香藤
·艳花飘香藤
主要用作盆栽植物或热带/亚热带的观赏园林植物(园林植物)。在转化体中观察到降低的植物高度和增加的分枝，使得可以在不摘心下并且从每盆更少的插条而具有足够的分枝。在rol转化体中将不需要将植物连接至物理夹具(fixture)的高成本工作。
烟草属
实例：
·红花烟草
主要用作用于生产烟草的作物植物。烟草叶通常含有2至8％烟碱，并且用含有rol基因的发根农杆菌的Ri质粒转化的植物相比于对照显示更高的浓度。
·林烟草
·花烟草
主要用作装饰/花坛植物(bedding plant)。观察到降低的植物高度和增加的分枝，使得可以在不摘心下、并且从每盆更少的插条而具有足够的分枝。
寒丁子属
实例：
·寒丁子花
主要用作盆栽植物和切花。在转化的植物中，观察到降低的植物高度和增加的分枝，使得可以在需要更少化学生长调节下从每盆更少的插条而具有足够的分枝。
蝴蝶兰属
实例：
·蝴蝶兰
·安汶蝴蝶兰
·白蝴蝶兰
·齿脊蝴蝶兰
用作盆栽植物和切花，是欧洲的最大盆栽植物产品(生产的数量和营业额)。在转化的植物中观察到降低的植物高度和增加的分枝，使得可以使用更少的化学生长调节而具有每株植物更多的穗，具有在市场上期望的更高价格。
香荚兰
香荚兰属是香草风味的主要来源之一，由于其高香草醛含量(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)，用含有rol基因的发根农杆菌的Ri质粒转化的植物相比于对照显示更高的浓度。
罗勒
实例：
·罗勒
主要用作食用植物。叶可尝起来有些像茴香，由于其中含有甲基胡椒酚(metylchavicol)、桉叶素(kineol)和里哪醇而具有强烈的、辛辣的、通常是甜的气味。用含有rol基因的发根农杆菌的Ri质粒转化的植物相比于对照显示更高的浓度。
辣椒属
实例：
·辣椒，
·风铃辣椒，
·黄灯笼辣椒，
·小米辣，
·绒毛辣椒。
主要用作调味品(spice)和食物蔬菜，但含有辣椒素(甲基香草基壬烯酰胺)的辣椒属还已在刺激血液循环或缓解疼痛的药物中发现用途。用含有rol基因的发根农杆菌的Ri质粒转化的植物相比于对照显示更高的浓度。
番薯属
实例：
·番薯
称为甜马铃薯。其大、淀粉质、甜味、块状的根是根菜类蔬菜(root vegetable)。除淀粉以外，甜马铃薯富含复合碳水化合物、膳食纤维和β-胡萝卜素(维生素A原类胡萝卜素)，同时具有适中含量的其他微量营养元素(micronutrient)，包括维生素B5、维生素B6、锰和钾。用含有rol基因的发根农杆菌的Ri质粒转化的植物相比于对照显示更高的浓度。
番茄
实例：
·番茄
番茄是可食用的，通常是红色、橙色、黄色、绿色的水果/浆果。所述水果含有番茄红素、即强抗氧化剂，已与结肠直肠癌、胃癌、肺癌、前列腺癌、和胰腺癌的降低的风险相关联。我们观察到降低的植物高度和增加的分枝，使得还可以将该植物用作具有可食用果实的室内植物(houseplant)或用于可用空间有限的花园中。另外我们注意到番茄红素的含量在用含有rol基因的发根农杆菌的Ri质粒转化的植物的果实中增加。
马铃薯
实例
·阳芋
马铃薯是可食用植物，其含有维生素和矿物质、以及各种植物化学成分(phytochemical)例如类胡萝卜素和天然酚类。
观察到降低的植物高度和增加的分枝，使得还可以将该植物在可用空间有限的花园中用作具有可食用块茎的园林植物。此外注意到在rol转化的马铃薯植物的块茎中维生素的含量和矿物质含量增加。另外，注意到较强烈的味道。
烟草茄(Solanum nicotianum)
烟草茄为红花烟草(Nicotiana tabacum L.)和澳洲茄(Solanum laciniatum)的属间嫁接嵌合体(Kaddoura,R.L.和Mantell,S.H.,(1991)Ann Bot 68(6):547-556)，并且用作观赏植物。相比于非转化的对照，观察到降低的植物高度和增加的分枝，使得可以从每盆的更少插条而具有足够的分枝。
松果菊属
实例：
·松果菊
·狭叶松果菊,
·苍白松果菊
松果菊属主要用于草药-其含有类苯基丙烷(phenyl propanoid)、松果菊苷。松果菊属的成分基础是复杂的，由广泛种类的各种效果和效力的化学品组成。活性物质的范围对免疫系统的不同部分具有抗菌、刺激或调解作用。所有种都含有酚类，类苯基丙烷成分例如菊苣酸(cichoric acid)、和咖啡酰酒石酸(caftaric acid)存在于松果菊中，其他酚类包括松果菊苷。在松果菊属健康作用中可以是重要的其他化学成分包括烷基酰胺和多糖。松果菊属制剂的免疫调节作用可以由脂溶性烷基酰胺(alkylamides,alkamides)引起，烷基酰胺与THC对CB2受体具有相似效力，THC强约1.5倍(～40nm对比～60nm亲和性)。然而，对精神活性CB1受体的效力显著小于THC(～40nm对比～>1500nm亲和性)。现观察到一系列化学成分的浓度在用含有rol基因的发根农杆菌的Ri质粒转化的植物部分中增加。此外观察到植物高度和增加的分枝，使得还可以使用植物作为具有观赏价值的室内/园林植物。
五味子属
实例：
·五味子
·无毛五味子
·红花五味子(观赏用途)
五味子属的浆果用于传统中药。化学成分包括在果实的种子中发现的木酚素五味子素(lignans schisandrin)、脱氧五味子素、戈米辛、和前戈米辛。观察到一系列化学成分的浓度在用含有rol基因的发根农杆菌的Ri质粒转化的植物的植物部分中增加。此外观察到植物高度和增加的分枝，使得还可以使用植物作为具有观赏价值的室内/园林植物。
红景天属
实例：
·红景天
红景天属已用于中国、俄罗斯和斯堪的纳维亚的草药，从而较好地应对寒冷的西伯利亚气候。地上部分(aerial portion)在世界的一些地区作为食物消费，有时加入至沙拉。根和其他植物部分含有洛塞维(rosavin)、洛赛琳(rosarin)、松香和红景天苷(有时为对羟苯基乙醇(p-tyrosol))、洛定塞(rhodioniside)、洛定林(rhodiolin)和洛塞定(rosiridin)。观察到一系列的化学成分的浓度在rol转化的植物的植物部分中增加。植物较缓慢生长，并且植物的观赏价值有限。
伽蓝菜属中上升的类黄酮水平
取如表4所述的野生型羽叶长寿和具有5个Ri基因拷贝的转化的对应物(即通过将原代Ri转化的羽叶长寿与野生型未转化的羽叶长寿回交来获得)，并且通过冷冻干燥50g叶直至水损失为85w/w％来制备提取物，然后在黑暗中、5℃下、甲醇中过夜温育(每重量份干燥的叶5重量份甲醇)。收集上清液并且在压力下蒸发至完全干燥。用100mg/ml浓度的甲醇制备提取物样品并且过滤(Sartorius，0.20μm)。HPLC-MS/MS分析(高效液相色谱(HPLC)与质谱(MS)的组合，MS/MS为两个质量分析仪在一个质谱仪器中的组合)用于根据去质子的分子离子的特征质量识别类黄酮的不同衍生物。[M-H]-用于基于质量比电荷之比(m/z；槲皮素＝301；异鼠李亭＝315；莰非醇＝285)的识别。根据Tsimogiannis等人(Molecules(2007)12,593-606进行HPLC-MS/MS。
发现在野生型羽叶长寿中，莰非醇和异鼠李亭的水平分别为每g植物材料2.12和4.74μg，而在测定为具有5个拷贝的Ri基因的羽叶长寿中，所述水平分别为每g植物材料2.41和6.03μg。
序列表
<110> 克鲁德简普森花卉公司
<120> 含有低拷贝数的RI基因的植物
<130> 64190PC
<150> NL2015306
<151> 2015-08-14
<150> NL2015312
<151> 2015-08-17
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19471
<212> DNA
<213> Agrobacterium rhizogenes
<400> 1
tggcaggata tattgtgatg taaacagatt agatatggac atgcgaagtc gttttaacgc 60
atgctttatc gaatataaaa tgtagatggg ctaatgtggt tttacgtcat gtgaataaaa 120
gttcagcatt cgtttaataa tatttcaata tcggtgtcta gagacccgtg gatttgtata 180
gtcagcacca tgatatgaat ctataaaata ttgtatctcc aattgcaatt caatcgatat 240
aagaaattaa tacaagccgt tcatatagta aggttgccaa tggcattcaa taacgaccgt 300
acagttgccg ctatattaat ctacgtgcca tttcttaaat aaagataggc gaatgactat 360
cgaaaataaa acaattatta atgagtgaaa acgtattgca caaataaaga ttcattatgg 420
ttggctcaaa ttttggctct ggtgctcgat gacgtcgaga tgaggacagt agtgatcaac 480
ttggcggtcg ataccttggt tacgccactc ccagagtgcc atgtcgtcct ccgagcggtc 540
tgagataacc cagtcggcaa ttgctgctgc attgccgggc gttccccaac cacgacgaat 600
atgctttcgt tcatctaact cgcgtcgcac tgccctccca gtcatgaagt caaagccaaa 660
ttctaccctc tctccatttc ccagctcagt cgagaaatcg taacacctcg tggcagctga 720
cagtttcaga aaggggcgta tccctcgaac tccagggtcc tctttcacat agttagcaag 780
gcgtactgct gcataatctg cgttgaaggc tctgatgact acaggatcct cggacaagcc 840
caattgatca gggcgaaccc tcgcgctcat aatatgaatt gcgacgaccc ttgcttcctg 900
tcggagcatc gaatcaatcc aagccttccc tgcggcatag aggtcatcga ctgcgatgtc 960
atcaagatcg agtagctttg ccaacctagg aagttcttga ggaaaaatca ccggcatgac 1020
agcaaccgtc tctcgccagt cagttgccgg actggcttcc ctaacgccat ccacgaatgc 1080
ctcaccgctt gcgtatttga atgtgtaaaa gagaaggacc actctttggc ggtacttcgg 1140
acgccggctt agccacgcgg caataatgtg ggcctcaaac tcacgaccat ccaaaaatat 1200
agtcgcgcct ggattgacct cgctggcctt gtcgagaaga ggttccaaaa agggaacggt 1260
gtctttcgta atagtactta aatctgtgag ttcgccatgc gaaacctctc gaacgattat 1320
cggcgtatcc ctgacatcag ctgaatgaaa ttctcggacg agtttgtcgg gcaaagtgga 1380
gacccgccac gtgttgaagt cgtgggaaac gatgggcaca tcgtcgccgg tgagtgcggc 1440
atcgagctca gagaggttcc gcctgccaac ctcaccgaga gcagctaaca acgaagtttc 1500
ggtgcattcc tgtatccctt tacccagatt atacatgccc cggtgttcga taacttgaag 1560
aggcagtggc tcctcaagat gttcaaggag gtggggtaca gagtgccggg cgaggacctc 1620
atccaccgtg acaccaaccg ggagatccca ttcgagtttc cactggggcc agcatgtgcc 1680
cgcgacggcg aaaggtttgc gctggcaaag aacccggctg ctgcaggtgg acctatcctt 1740
acccatggca atggggtttt gctaaaaagt caggcacttt actgggcaat tgatagggtg 1800
ggattgcgtt attaactgtt ctccagcggg aatctttatc tttattgaaa tgctaaagca 1860
cttagataaa atacagctgt accgcaatat aaaatagtag gataatgtaa tatgtgtatc 1920
gagaatacga caagctaata taatctagcg tcaaattgca ataatttaaa tcaaaactac 1980
tgatgaaata ataaaagatg gtcaattttt attggtagga gttgtcgaaa gattcgacgg 2040
acggccatta caatacatag gtgcaagaag taaaacagga agggaaacgg aaaacagtgc 2100
tataaaaaag cgacagatcg cggcgatcac tgactgcgat cgggaagaag ctcgccaagt 2160
tcaccgagaa tagcagagag cgcatcctca tcgggtacta cgaacacatt cgtcccagag 2220
ggctttgttt cagctgcgcc aacccagaaa gcaaggccat tttccaagtt gccgatggcg 2280
gtcagcatgt tttgattgtt gctgccgttt ccacaagcga tgtgaaggcc gatcccgtga 2340
gagaggccct tgacgaaggt gaaatagcct ttggattttc caactgtttc aacgggcact 2400
agatattgac cctctggcgc ggcaaccacc ttgaatttgc gagatgactg gttgccgatg 2460
agcgaagaaa gcatttctcc ggcttctttg taagatttgt gagattccca catttgacag 2520
ccgtagaaat gccccatcgg aatgttgcgg attcccggga tgccaccaaa tttgttctcc 2580
atagccgcgt gaacggcttg ccagttgggc agggagaaag aatcgaagcg atcatctttg 2640
tagatcgtga ccattccatc atttccctgg aatccgatat tttcaatggc gctgaaaact 2700
gaccttgcga tttcttcgca ttcccgtgcg gatgtgagca attgataatg gcccttgcag 2760
gcgatcctgg tcaaattggc gatgatgttg atggcaggat taatatccca acactggtga 2820
tttcgatctt gcttaaaggt ggtaccatcg ccgtcgaagg cgagcagggc ccggagagat 2880
gaatcggcaa gactgcgtcg gacccgctcc gcggcgtcgg gaatgaggct gataagagac 2940
atatccaaag gtgtttgtgg gtaacgggct gctcaatgaa gccttaaatg caacgcaaca 3000
tatgtaagga tgagttgact tattggagag agaaatagga atgagctggc cagccattat 3060
caacgtgggg ccatgctgac aatgtttacg tgaaaggctc aactacctcg aagcagacct 3120
ctatattcgt tgactttatt actgaacaag aagttgcttg ccactcattt tcttaaatct 3180
tgccctttct gcgcctcgct atcatgcccg ccaacgacgc gacatgcgct gccgcgattg 3240
ccttccccga gggcaactgg aaggaagaac ttgatgcgct ccgcaccttg tgtgaccccg 3300
tcgaggtggt taaggtcgca gtcggcagag gtcttagcgg catatgtaat gttgttgcag 3360
caatgaatcc cacaaaggtg aggggcctcg gcgatgtcat cgggcagatg ccggctctta 3420
atcaccgtat tgctgccgcc gccggcgaaa ctccggtgcg agaccttgga ataggttacc 3480
agtgcgcaat ctgccacccc gacatagcca gtgcgatgtt agccacttct gaggggatca 3540
gccacgttct ccgtgaaagg attgagaaag aagttgaccg ggacattgga gaaggcgcca 3600
ccgtctgcat tttcgttcag ccgagaatga gctccaaggg ctctccagtt tctgtccatt 3660
tcaccctcca gtttgcgaga tctggaactc ttgtcgatgc cagaatgatg gagagttaca 3720
atttcatgaa aggcaatggc acagtgaccg caccggattt gaaaagtcat tggaagaagc 3780
acggtattga caggccaggc ccacgtccgc ccacgtccaa gtttgaactc ctcttcgccg 3840
ctgtccccga caacagtaaa cttgccgcca ccgattttac ccatctcggc cctgtcgagc 3900
gtgataagga actactcggc agcacggtat tcgggattgc cgctaagaaa cctggtacga 3960
tcgtttatcc gtgcgaaaag gttctctgtt tggaggtcga cgtacacgcg catcgcgccc 4020
tagaagtact tcaccgcctt ggggaacagg cttatagcaa tggccgtggc actagcttcg 4080
gtcttcacac cggtccgtcc tcttgcctta atctttccgc cgccgcgctc gctacatttt 4140
tcaaacgctc ggatctctgt tcccttccat tgagtgatgc ttttgtcctt ttctgcgacc 4200
cgccaccgcc tacagcgcca agaaagatgg ccttccgatc actgccttct cccccacgag 4260
caccaatcag ttcgaactcg tagagcctca ggtcgtcaag gcatatgttc tcggactttt 4320
cgacgcgccg acgatggtta cgccccgcga caaaacgcga gccagcttct gcagccaata 4380
tgtacgtttc cgtgaaccgc atccctgtga agagttcaat gaaattggag ttttgatcct 4440
cgatgctgct gctaaaatgc tcgaacgtta tgcaaaattt ctagaagatg gtggaagaga 4500
tgatgatgaa atggcgaaca taatagatgt atttgggttt tgtcttaact agtggattga 4560
ttgaaacaaa ggagtccgag ttgggattcc ctttcggtct tcgtcgtgca acgatatcgt 4620
atgcgtacag gtatcacatt taacgttgct gcggcggacc gagcccgctt ggaagcgatt 4680
gttgcagctc caacttctgc tcagaagcac gtgtggcgag cgaagatcat cttgatgagc 4740
agtgatggct cgggaacggt cgcgatcatg gaggcaaccg gtaaatccaa aacctgtgtc 4800
tggcgctggc aggagcgctt catgactgag ggcgtcgatg gccttttgca cgacaagagc 4860
agaccgcccg gcattgcgcc gcttgatggc gaactcgttg agcgtgtcgt cgcactgacg 4920
cttgagacgc ctcaacagga agcaacgcac tggactgttc gtgcgatggc caaggccgtt 4980
gggattgcag cctcttcggt tgtgaagatc tggcacgagc atggtcttgc gccgcatcgc 5040
tggcgctctt tcaaactgtc gaacgacaag gcctttgccg agaagcttca cgacgtcgtt 5100
ggcctctacg tctcgccacc ggcccatgcc attgtcctgt ccgtcgatga gaagagccag 5160
atccaggcac tcgatcggac gcaaccggga ctccccttga agaaagggcg cgccggcaca 5220
atgacccacg attacaagcg ccacggcacc accaccctat ttgccgccct caacatcctc 5280
gacggctcgg tgatcggccg aaacatgcag cgtcaccggc atcaggagtt catccgtttt 5340
ctcaacgcca tcgaggcgga actgccaaag gacaaggccg tccacgtcat tctcgacaat 5400
tacgcgaccc ataagcagcc gaaggtccgc gcctggctgg caaggcatcc gcgctggacc 5460
ttccacttcg tcccaacatc atgttcatgg ctgaacgccg tcgagggatt cttcgctaaa 5520
ttgacacgtc gacgtctgaa gcacggtgtc tttcattccg tcgttgacct ccaggccacc 5580
atcaaccgct tcgtcagaga gcataatcag gaaccaaagc cgttcatctg gagagcagat 5640
ccagacgaga tcattgcagc cgtcaaacgt gggcaccaag cgttggaatc aatccactag 5700
cgtatgaaca gtaataagaa aatcccgatt gtgaatagtc ccaatttcaa atgtgtccgt 5760
gtgtaatttg cgtgtcttca gttgaatttc ctttaataat atcaaatatt caattgtgaa 5820
aagttgtatt ggttcaggtt caagctttcc gaatttgttg aattttattc cctgttttca 5880
atttgttgac ttgtttggga gacacctttt ttgtgtttcg tgaacatgtc accccttcgg 5940
tatacattag cctacaaagt aaataacgtt gataaatgtc actcatgttg taataaaatt 6000
gagcttatta tgtataacca gaccctgtgt taatctaatt acaaagaaat tcatcattct 6060
cccaagcaat cctgagtagc tgcgtgatgg atcttccata tcagcgccca cgtttcaccc 6120
cgtttgccgt cacccatcca cgtagtggag tcaacctgaa ccgtgcaatt tctcaggcct 6180
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gggtgttcga ccacggattt gcagaagcca ttgaagacgt ggcgctggtg ttccaggttg 6300
caccttgcct tcatggcccc cgaataggcg cgctcgaagt gttgatacct cgtcgcaccc 6360
aggtcttcat ttatatgtcg aacaaccaat tgcagcgctt tgttgcacac cagtgcattg 6420
ctcaacttgg cgacgccgtg cttgcttgca tgatcccgcc ctacgcgagt gacctctcgc 6480
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attcgcgtgt ttttgaccag gtcatcattg gcggcagtgc tgaggccgct acagttgata 7740
acagactggc cggggatgag acttccttca gctacaatat cgaacccgcc gtcggaaact 7800
cgtctgccgc tgtcaattca gcactcttca tggtcacgaa gcaaaagttt tgggttaact 7860
ccggcatccc agcagtgata tggaccgatg ggcttgtccg tgagctgtgt tgcattgaca 7920
tcgaatcgcc agctggagag ggccttgtcg tttttcacta tgctttggat gactatctat 7980
cccggccgat cgagcatcat gacaagaagg gacggtgctt ggaattggtc agggagcttg 8040
ctgctgcctt tcctgaactg gcttgtcacc tggtcccagt caacgaagac tacgaacgat 8100
atgtcttcga cgaccaccta acggatggtt ttaagggagc tttgtggagg gaaaattctc 8160
tggaaaaagg tcagtatatc caggatctgc ctgggaataa ttttcctatt ggggatcacg 8220
ggggagccta tctgattgac cgtgacgact gcgtcaccgg agcctcgttc gaggagcagg 8280
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cactccaacc ggtggactgg aataaaaaat agaaatttcc tgattaagtt atagtcaatg 8400
tactattgcg tgttaatccc gtaggtatgc aagctgcacc ggcagcatca taatttgatg 8460
ttccatcaat aaattaaggt gcccgttcat tgtgtattac attatgtatg tttatcaaaa 8520
atataatcga agtccatttt aagtctgata ttaattggaa ttccaaacga ttccttgatg 8580
cctatcttcg ctatgattgt atggtaataa agtctccaca tctcccgaaa aatgctttcg 8640
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ccattaattg gcacctacat atattagtgg agaagataaa gtgtcactat cgtttcctgt 8880
tcaattttga attttgcaag gatttcatgt tgtcaactac acagcttgaa aggaaatccg 8940
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tgcatattga ccgctccttt cggcgctggg cctgctttta ctgttgccta gcgttcggac 9060
agccaccaga gaatgggcta tatagatcct ttcatcaaac caaaacatta ctaagatcat 9120
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atcgtgggtg aaaggtacct acatatcttc acagacaata actactgttg ctgtttgctg 19440
attgactgac aggatatatg ttcctgtcat g 19471
<210> 2
<211> 5995
<212> DNA
<213> Agrobacterium rhizogenes
<400> 2
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atgttatata tttttgtgca aaaagacgac tgcacttggt aatatgaagg ggttccgcat 300
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ccagttgagg gttgtctacg cttagatgag aaggaaagtt gtccaagacg aatcccagtg 1200
tcctattacc aatagccggc gctagtttga tttcagaata aagagaaatt cgtcacacca 1260
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cgccgcccag catcaatcgg ccggccaccg cggcggccac acccccactt gatccccctg 2400
ggatgagact agggttccac gggtttcgta cggcgcctgt ggcgaagttg ttgctcgtga 2460
tcccaaaaga caattcgtgc atgtttcccg aagcgccagg cagtgcccca gccgcgagaa 2520
gttgtcgtgc aactccggca ggcgtcttgg gtttgtggtt ctgtaagcct ggcgtaccag 2580
cggtcgcggc gaacctgcct gtcgcaatat tcgctttaaa gcatagggga acgccagcta 2640
ggccaacacc ggcacctccg tgttgatcga ttttgctggc agtccaccgt aggtgcgccc 2700
agtcggtttc cagaaaggcg tttaaggatc ttgctgcttc acagcgggct attatcgttt 2760
cgattaactc aaagcacgag tattttcttt ccctgagaca tttaagcgtc tcggtgatcg 2820
aggagagggt caccattttc gttgtgctga gggaactgag atagatctcg ccagagaaac 2880
gttcaatgat ttttgcttgg agtgaaaaag gcaaataatt atagaggaag gaagtcagaa 2940
atgctgcgca gtagggccac ttgtataagt gccggtcgaa cactgctggt ggaaagtcaa 3000
aagcgtgaag tattagttga actctgttac taaattgaga taaatgggat attttattcg 3060
aaagtactgt ttgagatcta gcgacaataa taatgtcatc ttatgagatt gcatggcaat 3120
atggatctaa tatttggcat aaatagatgg tggttttgtc tccactttta aaccttcaca 3180
gcgttaccct aacacctctt aattgcgtac actcctttca accgcatcaa tggctggatc 3240
ctccttcaca ttgccatcaa ctggctcagc gccccttgat atgatgctta tcgatgattc 3300
agatctgctg caattgggtc tccagcaggt attctcgaag cggtacacag agacaccgca 3360
gtcacgctac aaactgacca ggagggcttc tccagacgtc tcatctggcg aaggcaatgt 3420
gcatgccctt gcgttcatat atgtcaacgc tgagacgttg cagatgatca aaaacgctcg 3480
atcgctaacc gaagcgaacg gcgtcaaaga tcttgtcgcc atcgacgttc cgccatttcg 3540
aaacgacttc tcaagagcgc tactccttca agtgatcaac ttgttgggaa acaaccgaaa 3600
tgccgatgac gatcttagtc acttcatagc agttgctctc ccaaacagcg cccgctctaa 3660
gatcctaacc acggcaccgt tcgaaggaag cttgtcagaa aacttcaggg ggttcccgat 3720
cactcgtgaa ggaaatgtgg catgtgaagt gctagcctat gggaataact tgatgcccaa 3780
ggcctgctcc gattcctttc caaccgtgga tcttctttat gactatggca agttcttcga 3840
gagttgcgcg gccgatggac gtatcggtta ttttcctgaa ggcgttacga aacctaaagt 3900
ggctataatt ggcgcaggct tttccgggct cgttgcagcg agcgaactac ttcatgcagg 3960
ggtagacgat gttacggtgt atgaggcgag tgatcggctt ggaggaaagc tatggtcaca 4020
cggatttaag agtgctccaa atgtgatagc cgagatgggg gccatgcgtt ttccgcgaag 4080
tgaatcatgc ttgttcttct atctcaaaaa gcacggactg gactccgttg gtctgttccc 4140
gaatccggga agtgtcgata ccgcattgtt ctacaggggc cgtcaatata tctggaaagc 4200
gggagaggag ccaccggagc tgtttcgtcg tgtgcaccat ggatggcgcg catttttgca 4260
agatggctat ctccatgatg gagtcatgtt ggcgtcaccg ttagcaattg ttgacgcctt 4320
gaatttaggg catctacagc aggcgcatgg cttctggcaa tcttggctca catattttga 4380
gcgagagtct ttctcttctg gcatcgaaaa aatgttcttg ggcaatcatc ctccgggggg 4440
tgaacaatgg aattccctag atgacttgga tcttttcaaa gcgctgggta ttggatccgg 4500
cggattcggc cctgtatttg aaagtgggtt tatcgagatc cttcgcttag tcgtcaacgg 4560
gtatgaggat aacgtgcggc tgagttacga aggaatttct gagctgcctc ataggatcgc 4620
ctcacaggta attaacggca gatctattcg cgagcgtaca attcacgttc aagtcgagca 4680
gattgataga gaggaggata aaataaatat caagatcaaa ggaggaaagg ttgaggtcta 4740
tgatcgagta ctggttacat ccgggtttgc gaacatcgaa atgcgccatc tcctgacatc 4800
aagcaacgca ttcttccatg cagatgtaag ccatgcaata gggaacagtc atatgactgg 4860
tgcgtcaaaa ctgttcttgc tgactaacga aaaattctgg ctacaacatc atttgccatc 4920
gtgcatactc accaccggcg ttgcaaaggc agtttattgc ttagactatg atccgcgaga 4980
tccaagcggc aaaggactgg tgttgataag ctatacttgg gaggatgact cacataagct 5040
cctagccgtc cccgacaaaa gagaaaggtt cgcatcgctg cagcgcgata ttgggagggc 5100
attcccagat tttgccaagc acctaactcc tgcagacggg aactatgatg ataatatcgt 5160
tcaacatgat tggctgactg atccccacgc tggcggagcg tttaaactga accgcagagg 5220
caacgacgta tattcagaaa ggcttttctt tcagcccttt gacgtaatgc atcccgcgga 5280
cgataaggga ctttacttgg ccggttgtag ctgttccttc accggagggt gggttcatgg 5340
tgccattcag accgcatgca acgctacgtg tgcgatcatt tatggttccg gacacctgca 5400
agagctaatc cactggcgac acctcaaaga aggtaatcca ctggcgcacg cttggaagcg 5460
gtataggtat caagcgtgat aatgcaacag ttagaataat tagtttgccc tagccggtat 5520
tccttggtgt tccaataggg ttccgaagcc aataggcgaa aaagctgact tttcagtccc 5580
ttttattatt caattcgctt cggtccaagc ataattgtaa cgctacgtga tagaaaaatg 5640
gaaattgaca gattacttac ttaaattaat ataatctatt aatatcgtca agctaaaaac 5700
atgtaatacg taaatatatg gaaactttat gtctgaaaag accacattat tattgatcgt 5760
aatacactga actggtcata acagggaagg ctaactgcaa catatcctat aaatactcag 5820
tgaaaatggc cgctccccaa tgttaagcca tttttgcggt cgggctaagc gctcgtccgt 5880
gtctcccctg gcccgagtgt cggctctcca tcagcggcct catcatctgt cgctgacacc 5940
ggtggcccca atttcaaatc gaggaaagac gatgccctcg ccggcaaacg tcgac 5995
<210> 3
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 3
atggaattag ccggactaaa cgtcgccggc atggcccaga ccttcggagt attatcgctc 60
gtctgttcta agcttgttag gcgtgcaaag gccaagagga aggccaaacg ggtatccccg 120
ggcgaacgcg accatcttgc tgagccagcc aatctgagca ccactccttt ggccatgact 180
tcccaagccc gaccgggacg ttcaacgacc cgcgagttgc tgcgaaggga ccctttgtcg 240
ccggacgtga aaattcagac ctacgggatt aatacgcatt tcgaaacaaa cctacgggat 300
taa 303
<210> 4
<211> 780
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 4
atggatccca aattgctatt ccttccacga tttcaaccag tagatctcac tccagcatgg 60
agccagataa acctattcga ggggatccga tttgcttttg caatctatag ccgtgactat 120
agcaaacccc tcctgcattt ccagaaacga tgggctcttg cagtgctaga tttgaaggaa 180
aactctccac cgatatatat acttaaacaa ctagctgagc tcttgaagaa caaagtctgc 240
tatcatcctc ctatgtttgt tagtcagccg gatctggctc gagaaaacga ccaacatgta 300
tttgtctatc tttctcgcga gaagatgcag aaagtgctga aggaacaatc cattacattt 360
ggaatggagg ccgtgctggc gacaacgatt caaccatatc ggagcgagct cgccctccag 420
gagatgctcc gtgttcacaa ccttgcttgg ccgcacagcc gcacggagga acctgattta 480
gaatgcttca tcgccatttt cgcaagttcc ttgttcattc acttgctgga gttaaaagtg 540
accaacgttt acgggagaga ggtagcttgc accttctttc tgcggcgagg gactgaaaac 600
cgcccctatg atgttgtagc ttgcggcacc acacaattca ccaaaaatgc cctcgggata 660
tcacgtccgg ccgcctcctc accggagcca gacctaaccc tgcgactctc ggggcctgat 720
caggaaggcg aggagggcgt catgaagcct gctgcagtaa acctgaagaa agaagcctaa 780
<210> 5
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 5
atggctgaag acgacctgtg ttctctcttt ttcaagctca aagtggagga tgtgacaagc 60
agcgatgagc tagctagaca catgaagaac gcctcaaatg agcgtaaacc cttgatcgag 120
ccgggtgaga atcaatcgat ggatattgac gaagaaggag ggtcggtggg ccacgggctg 180
ctgtacctct acgtcgactg cccgacgatg atgctctgct tctatggagg gtccttgcct 240
tacaattgga tgcaaggcgc actcctcacc aaccttcccc cgtaccagca tgatgtgact 300
ctcgatgagg tcaatagagg gctcaggcaa gcatcaggtt ttttcggtta cgcggatcct 360
atgcggagcg cctacttcgc tgcattttct ttccctgggc gtgtcatcaa gctgaatgag 420
cagatggagc taacttcgac aaagggaaag tgtctgacat tcgacctcta tgccagcacc 480
cagcttaggt tcgaacctgg tgagttggtg aggcatggcg agtgcaagtt tgcaatcggc 540
taa 543
<210> 6
<211> 603
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 6
atggctcgtt attgcagtgg tggctctcaa cggcttcatg tcgatgattt tcgttggatc 60
aaggagccca ctcgactgaa ggctcagctt attaatgtgg tggagaccta caaggctgca 120
caaacagaga cgttaaagta ctatatatca tctgcaactg agcgtgtggc tcatgtggag 180
gcagccgagg tcaacaatgc ggaaatggag ctgcatcctg ctgggttgaa gtaccctctg 240
tccttcgtct ttacctccct ggccgtggct acagcctgca aggagaacaa gcatctcttg 300
tgcgaggagc atttggaggg ggacttgata tcgtgcgtcg ttcctcccta tcagacaaat 360
gtctcactcg ctgctttaag ggagctccac aattccattt cgggaggagg gtaccaggaa 420
caagcagaca tggattattt tgtggcgatc atcccaaatg ataatttcga ctatcagagc 480
tgcgaaatcg acacacgaag ttgcggtaaa ggactttgca agatttatag tagggaactg 540
ggagggcagc ctctagctta tgacgccata ctggcaatcg gcaaggtgct gctgctggaa 600
tag 603
<210> 7
<211> 2250
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 7
atggctggat cctccttcac attgccatca actggctcag cgccccttga tatgatgctt 60
atcgatgatt cagatctgct gcaattgggt ctccagcagg tattctcgaa gcggtacaca 120
gagacaccgc agtcacgcta caaactgacc aggagggctt ctccagacgt ctcatctggc 180
gaaggcaatg tgcatgccct tgcgttcata tatgtcaacg ctgagacgtt gcagatgatc 240
aaaaacgctc gatcgctaac cgaagcgaac ggcgtcaaag atcttgtcgc catcgacgtt 300
ccgccatttc gaaacgactt ctcaagagcg ctactccttc aagtgatcaa cttgttggga 360
aacaaccgaa atgccgatga cgatcttagt cacttcatag cagttgctct cccaaacagc 420
gcccgctcta agatcctaac cacggcaccg ttcgaaggaa gcttgtcaga aaacttcagg 480
gggttcccga tcactcgtga aggaaatgtg gcatgtgaag tgctagccta tgggaataac 540
ttgatgccca aggcctgctc cgattccttt ccaaccgtgg atcttcttta tgactatggc 600
aagttcttcg agagttgcgc ggccgatgga cgtatcggtt attttcctga aggcgttacg 660
aaacctaaag tggctataat tggcgcaggc ttttccgggc tcgttgcagc gagcgaacta 720
cttcatgcag gggtagacga tgttacggtg tatgaggcga gtgatcggct tggaggaaag 780
ctatggtcac acggatttaa gagtgctcca aatgtgatag ccgagatggg ggccatgcgt 840
tttccgcgaa gtgaatcatg cttgttcttc tatctcaaaa agcacggact ggactccgtt 900
ggtctgttcc cgaatccggg aagtgtcgat accgcattgt tctacagggg ccgtcaatat 960
atctggaaag cgggagagga gccaccggag ctgtttcgtc gtgtgcacca tggatggcgc 1020
gcatttttgc aagatggcta tctccatgat ggagtcatgt tggcgtcacc gttagcaatt 1080
gttgacgcct tgaatttagg gcatctacag caggcgcatg gcttctggca atcttggctc 1140
acatattttg agcgagagtc tttctcttct ggcatcgaaa aaatgttctt gggcaatcat 1200
cctccggggg gtgaacaatg gaattcccta gatgacttgg atcttttcaa agcgctgggt 1260
attggatccg gcggattcgg ccctgtattt gaaagtgggt ttatcgagat ccttcgctta 1320
gtcgtcaacg ggtatgagga taacgtgcgg ctgagttacg aaggaatttc tgagctgcct 1380
cataggatcg cctcacaggt aattaacggc agatctattc gcgagcgtac aattcacgtt 1440
caagtcgagc agattgatag agaggaggat aaaataaata tcaagatcaa aggaggaaag 1500
gttgaggtct atgatcgagt actggttaca tccgggtttg cgaacatcga aatgcgccat 1560
ctcctgacat caagcaacgc attcttccat gcagatgtaa gccatgcaat agggaacagt 1620
catatgactg gtgcgtcaaa actgttcttg ctgactaacg aaaaattctg gctacaacat 1680
catttgccat cgtgcatact caccaccggc gttgcaaagg cagtttattg cttagactat 1740
gatccgcgag atccaagcgg caaaggactg gtgttgataa gctatacttg ggaggatgac 1800
tcacataagc tcctagccgt ccccgacaaa agagaaaggt tcgcatcgct gcagcgcgat 1860
attgggaggg cattcccaga ttttgccaag cacctaactc ctgcagacgg gaactatgat 1920
gataatatcg ttcaacatga ttggctgact gatccccacg ctggcggagc gtttaaactg 1980
aaccgcagag gcaacgacgt atattcagaa aggcttttct ttcagccctt tgacgtaatg 2040
catcccgcgg acgataaggg actttacttg gccggttgta gctgttcctt caccggaggg 2100
tgggttcatg gtgccattca gaccgcatgc aacgctacgt gtgcgatcat ttatggttcc 2160
ggacacctgc aagagctaat ccactggcga cacctcaaag aaggtaatcc actggcgcac 2220
gcttggaagc ggtataggta tcaagcgtga 2250
<210> 8
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<223> 人工序列的描述：合成的多核苷酸
<400> 8
atggtgaccc tctcctcgat caccgagacg cttaaatgtc tcagggaaag aaaatactcg 60
tgctttgagt taatcgaaac gataatagcc cgctgtgaag cagcaagatc cttaaacgcc 120
tttctggaaa ccgactgggc gcacctacgg tggactgcca gcaaaatcga tcaacacgga 180
ggtgccggtg ttggcctagc tggcgttccc ctatgcttta aagcgaatat tgcgacaggc 240
aggttcgccg cgaccgctgg tacgccaggc ttacagaacc acaaacccaa gacgcctgcc 300
ggagttgcac gacaacttct cgcggctggg gcactgcctg gcgcttcggg aaacatgcac 360
gaattgtctt ttgggatcac gagcaacaac ttcgccacag gcgccgtacg aaacccgtgg 420
aaccctagtc tcatcccagg gggatcaagt gggggtgtgg ccgccgcggt ggccggccga 480
ttgatgctgg gcggcgtcgg aactgacacg ggagcgtcgg tccgtttacc ggccgccttg 540
tgcggcgtgg tggggtttcg tcctaccgtg gggcgatatc caacggacgg aatagttccg 600
gtaagcccca cccgggacac ccctggcgtt atcgcacaga atgttccgga cgtgattctt 660
cttgacggta tcatttgcgg gagaccgccg gttaatcaaa cggtccgcct gaaggggctg 720
cgtataggct tgccaaccgc ttacttttac aacgacctgg agcccgatgt cgccttagca 780
gccgagacga ttatcagagt tctggcacgc aaagatgtta cttttgttga agcagatatt 840
cctgatttag cgcatcacaa tgaaggggtc agctttccga ctgccatcta cgaatttccg 900
ttgtcccttg aacattatat tcagaacttc gtagagggtg tttccttttc tgaggttgtc 960
agagcgattc gcagtccgga tgttgcaagt attctcaatg cacaactctc ggataatctt 1020
atttccaaaa gcgagtattg tctggcgcga cgttttttca gaccgagact ccaagcggcc 1080
taccacagtt acttcaaggc gcatcagcta gatgcaattc ttttcccaac agctccgttg 1140
acagccaagc caattggcca tgatctatcg gtgattcaca atggctcaat gaccgatacc 1200
tttaaaatct tcgtgcggaa tgtagatccc agcagtaatg cgggcctgcc gggcctaagt 1260
cttcccgttt ctcttagttc caacggtctg cctattggca tggaaatcga tggctctgca 1320
agctcggatg aacgtctgtt agcaattgga ctagcgatag aagaagcaat agactttagg 1380
catcgtccga ctctgtcgta a 1401
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 9
caatagaggg ctcaggcaag 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 10
cctcaccaac tcaccaggtt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 11
aatgagggct tgttggatga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> primer_bind
<223> 人工序列的描述：合成的引物
<400> 12
tttgagtgat ggctccttcc 20

Claims (41)

1.植物或其子代在作为用于提供或制备食物的观赏植物，或者作为用于制备人类或动物必需品的活性成分的来源中的用途，其中所述植物通过用携带Ri质粒的发根农杆菌感染来用源自发根农杆菌的Ri质粒的多个基因转化，所述植物或其子代在其基因组中包含1至5个拷贝的源自Ri质粒的rolA、rolB、rolC和rolD基因，并且所述植物或其子代显示未转化的对照植物的25-75％的高度。
2.根据权利要求1所述的用途，所述植物或其子代在其基因组中包含1至5个拷贝的存在于Ri质粒上的基因。
3.根据权利要求2所述的用途，所述植物或其子代在其基因组中包含1至5个拷贝的Ri质粒。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其中拷贝数为3以下。
5.根据权利要求3所述的用途，其中拷贝数为2以下。
6.根据权利要求4所述的用途，其中拷贝数为1。
7.根据权利要求1-3和权利要求5-6任一项所述的用途，其中所述植物通过用野生型发根农杆菌感染来获得。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述植物或子代显示未转化的对照植物的30-70％的高度。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述植物或子代显示未转化的对照植物的40-60％的高度。
10.根据权利要求1-3、权利要求5-6和权利要求8-9任一项所述的用途，所述植物或子代相比于未转化的对照植物具有不少于80％的花数和/或不具有多于4天的延迟开花时间。
11.根据权利要求10所述的用途，所述植物或子代相比于未转化的对照植物具有不少于90％的花数和/或不具有多于2天的延迟开花时间。
12.根据权利要求1-3、权利要求5-6、权利要求8-9和权利要求11任一项所述的用途，其中用发根农杆菌转化的植物属于以下任意属：
-伽蓝菜属；
-菊属；
-紫菀属；
-蔷薇属；
-茄属；
-大戟属；
-蝴蝶兰属；
-罗勒属；
-辣椒属；
-薄荷属；
-木槿属；
-红蝉花属/飘香藤属(Mandevilla/Dipladenia)；
-洋桔梗属；
-薰衣草属；
-百合属；
-铁线莲属；
-烟草属；
-寒丁子属；
-香荚兰属；
-番薯属；
-松果菊属；
-五味子属；
-红景天属；
-滨菊属；
-鹤望兰属，
并且包括属内的种间杂种。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述植物属于以下任意属：伽蓝菜属、紫菀属、菊属、铁线莲属、大戟属、木槿属、滨菊属、红蝉花属、烟草属、罗勒属、蝴蝶兰属、蔷薇属和茄属。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述人类必需品为药物、刺激剂或化妆品。
15.根据权利要求1或权利要求14所述的用途，其中用于提供或制备食物的所述植物为大田作物种。
16.根据权利要求1或权利要求14所述的用途，其中用于提供或制备食物的所述植物属于以下任意属：香荚兰属、罗勒属、辣椒属、番薯属、茄属。
17.根据权利要求14所述的用途，其中用作用于制备药物或刺激剂的活性成分的来源的所述植物属于以下任意属：伽蓝菜属、茄属、烟草属、红景天属、松果菊属、五味子属、蔷薇属、木槿属和菊属。
18.一种植物或其子代的制备方法，其中所述植物通过用携带Ri质粒的发根农杆菌感染来用源自发根农杆菌的Ri质粒的多个基因转化，所述植物或其子代在其基因组中包含1至5个拷贝的源自Ri质粒的rolA、rolB、rolC和rolD基因，所述方法包括以下步骤：
(a)用发根农杆菌的Ri质粒转化野生型植物的组织，
(b)允许转化的组织发育具有毛状表型的根，
(c)在步骤(b)的具有毛状表型的根中选择所述毛状表型显示在步骤(b)中得到的根中观察到的最大根毛长度的至多一半的最大根毛长度的根；
(d)在再生培养基上生长选择的根，并且允许从所述选择的根产生转化生根的小植物；
(e)所述转化生根的小植物生长为具有相应野生型植物的25-75％的高度的成熟的转化的母本植物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中步骤(c)进一步包括从步骤(b)的所述具有毛状表型的根中，选择所述毛状表型显示每长度的分枝数量为在步骤(b)中得到的根中观察到的每这种长度的最大分枝数量的至多一半的根。
20.一种植物或其子代的制备方法，其中所述植物通过用携带Ri质粒的发根农杆菌感染来用源自发根农杆菌的Ri质粒的多个基因转化，所述植物或其子代在其基因组中包含1至5个拷贝的源自Ri质粒的rolA、rolB、rolC和rolD基因，所述方法包括以下步骤：
(a)用发根农杆菌的Ri质粒转化野生型植物的组织，
(b)允许转化的组织发育具有毛状表型的根，
(c)选择具有毛状根表型的推定转化的根；
(d)在再生培养基生长选择的根，允许从所述选择的根产生转化生根的小植物；
(e)所述转化生根的小植物生长为成熟的转化的母本植物；
(f)通过杂交、回交和自交产生步骤(e)的所述成熟的转化的母本植物的子代，同时选择具有相比于步骤(e)的所述成熟的转化的母本植物的增加的高度、和相比于步骤(a)的所述野生型植物的减小的高度的子代，
(g)重复步骤(f)直至所述子代产生具有步骤(a)的相应野生型植物的25-75％的高度的成熟植物。
21.根据权利要求20所述的方法，所述植物或其子代在其基因组中包含1至5个拷贝的存在于Ri质粒上的基因。
22.根据权利要求21所述的方法，所述植物或其子代在其基因组中包含1至5个拷贝的Ri质粒。
23.根据权利要求18-22任一项所述的方法，其中拷贝数为3以下。
24.根据权利要求22所述的方法，其中拷贝数为2以下。
25.根据权利要求23所述的方法，其中拷贝数为1。
26.根据权利要求18-22和权利要求24-25任一项所述的方法，其中所述植物通过用野生型发根农杆菌感染来获得。
27.根据权利要求18-22和权利要求24-25任一项所述的方法，其中所述植物或子代显示未转化的对照植物的25-75％的高度。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述植物或子代显示未转化的对照植物的30-70％的高度。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述植物或子代显示未转化的对照植物的40-60％的高度。
30.根据权利要求18-22、权利要求24-25和权利要求28-29任一项所述的方法，所述植物或子代相比于未转化的对照植物具有不少于80％的花数和/或不具有多于4天的延迟开花时间。
31.根据权利要求30所述的方法，所述植物或子代相比于未转化的对照植物具有不少于90％的花数和/或不具有多于2天的延迟开花时间。
32.根据权利要求18-22、权利要求24-25、权利要求28-29和权利要求31任一项所述的方法，其中用发根农杆菌转化的植物属于以下任意属：
-伽蓝菜属；
-菊属；
-紫菀属；
-蔷薇属；
-茄属；
-大戟属；
-蝴蝶兰属；
-罗勒属；
-辣椒属；
-薄荷属；
-木槿属；
-红蝉花属/飘香藤属(Mandevilla/Dipladenia)；
-洋桔梗属；
-薰衣草属；
-百合属；
-铁线莲属；
-烟草属；
-寒丁子属；
-香荚兰属；
-番薯属；
-松果菊属；
-五味子属；
-红景天属；
-滨菊属；
-鹤望兰属，
并且包括属内的种间杂种。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述植物属于以下任意属：伽蓝菜属、紫菀属、菊属、铁线莲属、大戟属、木槿属、滨菊属、红蝉花属、烟草属、罗勒属、蝴蝶兰属、蔷薇属和茄属。
34.根据权利要求18-20任一项所述的方法，其中步骤(e)、或如果存在的步骤(f)和/或(g)包括选择所述相应野生型植物的30-70％的植物高度。
35.根据权利要求34所述的方法，其中步骤(e)、或如果存在的步骤(f)和/或(g)包括选择所述相应野生型植物的40-60％的植物高度。
36.根据权利要求18-20和权利要求35任一项所述的方法，其中步骤(e)、或如果存在的步骤(f)和/或(g)进一步包括选择相比于未转化的对照植物具有不少于80％的花数和/或不具有多于4天的延迟开花时间的植物或子代。
37.根据权利要求18-20和权利要求35任一项所述的方法，其中步骤(e)、或如果存在的步骤(f)和/或(g)进一步包括选择相比于未转化的对照植物具有不少于90％的花数和/或不具有多于2天的延迟开花时间的植物或子代。
38.根据权利要求18-20和权利要求35任一项所述的方法，其中步骤(a)包括将携带所述Ri质粒的发根农杆菌与植物或植物部分进行共培养，允许发根农杆菌将所述Ri质粒递送至所述植物或植物部分中。
39.根据权利要求18-20和权利要求35任一项所述的方法，其中步骤(a)包括用发根农杆菌感染。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述发根农杆菌为野生型发根农杆菌。
41.根据权利要求18-20、权利要求35和权利要求40任一项所述的方法，所述选择进一步包括分析源自发根农杆菌的所述Ri质粒的多个基因的拷贝数。
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