CN103703131B - 诱导根的伸长或增加生物质的量的新基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
通过在植物中增加编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因等的表达，能够促进植物的根的伸长，增加生物质的量。
Description
技术领域
本发明涉及诱导根的伸长、或增加生物质的量的新基因及其应用。
背景技术
已知适应沙漠等干燥地质的植物的根的伸长能力好，能够通过到达地下的深水系而避免干燥胁迫。如将承担该能力的基因导入一般作物，则可以促进植物的根的土壤水分、营养源的有效吸收，期待干燥胁迫抗性能力的提高以及产量的增加。此外，根也参与植物体的支持，因而根的发达对于强化植物制造性而言也是一个重要因素。
因而，传统上开展了对于调控植物的根的伸长的基因的研究。例如，专利文献1中采用T-DNA标记法，获得了与野生株相比根的伸长显著受到抑制的突变体，并记载了参与该表型的基因等的应用技术。此外，非专利文献1中作为通过基因导入法促进根的伸长的例子，记载了周期蛋白基因过表达的一个例子。非专利文献2中报告称，拟南芥的AtCOL3基因的敲除植物体具有侧根的伸长抑制这样的表型。
现有技术文献
专利文献
专利文献1日本国公开专利公报特开2004-187564号公报(平成16年7月8日公开)
非专利文献
非专利文献1Doerner et al.，1996Nature，380：520-523
非专利文献2Datta et al.，2006Plant Cell，18：70-84
发明内容
发明所要解决的问题
然而，参与根的发达的基因的探索目前还不能说是充分。因而，强烈需要发现诱导根的伸长的基因，以及该基因的应用技术、例如开发耐干性的植物体等技术的开发。
有鉴于上述问题点，本发明的目的在于，鉴定诱导根的伸长的新基因，并提供该基因的应用技术。
解决问题的方法
本发明等为实现上述目的进行了深入研究，对在沙漠等干燥地带生长的植物的基因信息以及分子机制进行了解析，结果发现了通过增强诱导表达根的伸长的基因。而且，在进一步进行研究时发现，通过用该基因转化植物，不仅能够增加根的伸长，还能够增加生物质的量，从而完成了本发明。即，本发明包括以下方案。
(1)包含在植物中增加选自以下(a)～(e)中的任意基因的表达的步骤的、诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物的制造方法：
(a)编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
(b)编码由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
(c)编码由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
(d)由SEQ ID NO：2所示的碱基序列构成的基因；
(e)与由与上述(a)～(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
(2)(1)所述的诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物的制造方法，其中，增加上述基因的表达的步骤包括导入选自上述(a)～(e)中的基因、制作转化植物细胞的步骤。
(3)(2)所述的诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物的制造方法，其还包括从上述植物细胞再生植物体的步骤。
(4)用选自以下的(a)～(e)中的任意基因转化了的、诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物：
(a)编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
(b)编码由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
(c)编码由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
(d)由SEQ ID NO：2所示的碱基序列构成的基因；
(e)与由与上述(a)～(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
(5)选自以下的(a)～(e)中的任意基因的表达增加的、诱导了根的伸长、和/或增加了生物质的量的植物：
(a)编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
(b)编码由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
(c)编码由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
(d)由SEQ ID NO：2所示的碱基序列构成的基因；
(e)与由与上述(a)～(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
(6)一种植物，其为上述(4)或(5)所述的植物的后代、子孙、或克隆。
(7)上述(4)～(6)中任一项所述的植物的繁殖材料。
(8)包括增加选自以下的(a)～(e)中的任意基因的表达的步骤的、诱导植物的根的伸长的方法：
(a)编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
(b)编码由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有诱导植物的根的伸长的活性的蛋白质的基因；
(c)编码由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有诱导植物的根的伸长的活性的蛋白质的基因；
(d)由SEQ ID NO：2所示的碱基序列构成的基因；
(e)与由与上述(a)～(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有诱导植物的根的伸长的活性的蛋白质的基因。
(9)包括增加选自以下的(a)～(e)中的任意基因的表达的步骤的、增加植物的生物质的量的方法：
(a)编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
(b)编码由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
(c)编码由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
(d)由SEQ ID NO：2所示的碱基序列构成的基因；
(e)与由与上述(a)～(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
(10)一种植物体的制造方法，其包括
准备增加了选自以下的(a)～(e)中的任意基因的表达的转化植物的步骤，和
在上述转化植物的后代植物中，测定(i)根的伸长、和/或、(ii)生物质的量，选择该(i)根的伸长、和/或、(ii)生物质的量显著提高的系统的步骤：
(a)编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
(b)编码由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
(c)编码由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
(d)由SEQ ID NO：2所示的碱基序列构成的基因；
(e)与由与上述(a)～(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
(11)选自以下的(a)～(e)中的基因：
(a)编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
(b)编码由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
(c)编码由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
(d)由SEQ ID NO：2所示的碱基序列构成的基因；
(e)与由与上述(a)～(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
(12)选自以下的(f)～(i)中的蛋白质：
(f)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质；
(g)由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质；
(h)由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质；
(i)上述(11)所述的基因所编码的蛋白质。
(13)包含上述(11)所述的基因的重组表达载体。
(14)导入了上述(11)所述的基因或(13)所述的重组表达载体的转化体。
(15)(14)所述的转化体，其为植物。
(16)一种增加植物的根的伸长诱导或生物质的量的试剂，其含有上述(11)所述的基因或(13)所述的重组表达载体作为有效成分。
(17)选自以下的(j)～(l)中的多核苷酸：
(j)由SEQ ID NO：3所述的碱基序列构成的多核苷酸；
(k)由在SEQ ID NO：3所述的碱基序列中缺失、取代或者添加一个或数个碱基而得到的碱基序列构成、且具有作为响应于植物的干燥胁迫进行表达调控的启动子的功能的多核苷酸；
(l)与由与上述(j)或(k)所述的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件杂交、且具有作为响应于植物的干燥胁迫进行表达调控的启动子的功能的多核苷酸。
(18)具有上述(17)所述的多核苷酸作为启动子的重组表达载体。
(19)导入了上述(17)所述的多核苷酸或(18)所述的重组表达载体的转化体。
发明的效果
本发明的基因是具有能够增加诱导植物的根的伸长的活性、或生物质的量的活性的新基因。根据本发明的基因及其应用技术，能够得到诱导了根的伸长的植物、或增加了生物质的量的植物等。该植物不仅具有例如耐干性以及稳定性提高的优点，还具有生物质增产等优点。
附图说明
【图1】(a)为显示土壤中的含水量的推移的图；(b)为显示干燥条件下与湿润条件下生长0～4日的野生种西瓜的根的状态的图。
【图2】显示干燥条件下生长的野生种西瓜与栽培种西瓜中的根的干燥重量的时间变化的图。
【图3】显示对于干燥胁迫下的野生种西瓜的根中的CLCOL1基因的时间表达、采用定量RT-PCR进行解析的结果的图。
【图4】显示采用了诱导载体的CLCOL1基因的野生种西瓜毛状根中的诱导表达的结果的图。
【图5】显示CLCOL1基因的表达水平的上升对毛状根的生长的效果的图。
【图6】显示对于强表达了CLCOL1基因的拟南芥转化体、对发芽后的根系发达进行解析的结果的图。
【图7】显示对用CLCOL1基因转化的植物以及对照植物的生长状况进行观察的结果的图。
【图8】显示对于用CLCOL1基因转化的植物以及对照植物、从钵中拔出植株、对根的伸长状况进行观察的结果的图。
发明的具体实施方式
以下，针对本发明的实施方式进行具体说明。而且，本说明书中记载的全部学术文献以及专利文献在本说明书中援引作为参考。在本说明书中，如无特殊提及，表示数值范围的“A～B”是指“A以上(包含A且大于A)B以下(包含B且小于B)”。
此外，在本说明书中使用时，碱基和氨基酸的符号适宜地采用IUPAC和IUB规定的单字母符号或三字母符号。在本说明书中使用时，术语“蛋白质”与“肽”或“多肽”可以互换使用。此外，术语“基因”与“多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”可以互换使用，是指核苷酸的聚合体。这里，基因可以以DNA的形态(例如cDNA或基因组DNA)、或RNA(例如mRNA)的形态存在。DNA或RNA可以是双链，也可以是单链。单链DNA或RNA可以是编码链(有义链)，也可以是非编码链(反义链)。此外，基因可以化学合成，也可以变更密码子利用性(Codon usage)使得编码的蛋白质的表达提高。当然，编码相同氨基酸的密码子之间也可以发生取代。此外，基因只要是编码蛋白质即可，包括具有基于遗传密码的简并的任意碱基序列的DNA。
<1.基因、蛋白质>
本发明中的基因是选自以下的(a)～(e)中的基因。
(a)编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
(b)编码由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因；
(c)编码由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有诱导植物的根的伸长的活性的蛋白质的基因；
(d)由SEQ ID NO：2所示的碱基序列构成的基因；
(e)与由与上述(a)～(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
此外，本发明的蛋白质是选自以下的(f)～(i)中的蛋白质。
(f)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质；
(g)由在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或数个氨基酸残基而得到的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质；
(h)由与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80%以上的同源性的氨基酸序列构成、且具有(i)诱导植物的根的伸长的活性或(ii)增加植物的生物质的量的活性的蛋白质；
(i)上述(a)～(e)中任一项所述的基因所编码的蛋白质。
上述(a)～(e)的基因编码具有诱导植物的根的伸长的活性、或增加植物的生物质的量的活性的蛋白质，即上述(f)～(i)所述的蛋白质。因而，例如，通过在植物中增加这些基因的表达，能够促进植物的根的伸长、或增加植物的生物质的量。
首先，针对上述(a)的基因以及上述(f)的蛋白质进行具体说明。SEQ IDNO：1显示野生种西瓜(Citrullus lanatus sp.No101117-1)来源的CLCOL1蛋白质的氨基酸序列。CLCOL1蛋白质是由337个氨基酸组成的蛋白质，推测作为CONSTANS样转录因子发挥功能。目前尚未充分了解CLCOL1蛋白质的功能，本发明人此次发现了其具有诱导(促进)根的伸长、或增加植物的生物质的量的功能。
上述野生种西瓜是在沙漠等干燥地带生长的，已知其即使在严酷的干燥条件下也具有根伸长的能力，对于干燥胁迫具有高抗性能力。如后述的实施例所示，此次本发明人发现：在该植物的根、特别是根尖端部(RootChip)，CLCOL1基因在干燥胁迫初期被诱导表达。此外，序列信息解析的结果，鉴定了CLCOL1基因编码CONSTANS样转录因子。
在CLCOL1基因在野生种西瓜毛状根中被诱导表达时，与非诱导的对照植物相比，促进了根的伸长。此外，相反地，当在野生种西瓜毛状根中制作了功能抑制系统时，根的伸展受到了抑制。而且，当在拟南芥中制作了稳定地过表达CLCOL1基因的系统时，主根的伸展得到了促进。由这些结果可知，CLCOL1基因作为野生种西瓜的应答干燥条件的根的伸长促进调控的关键因子发挥功能。此外，在用上述基因转化植物时，可知植物的生物质的量能够增加。
通过利用本基因，通过土壤水分、营养源的有效吸收，能够实现干燥胁迫抗性能的提高、作物产量的增加，并且通过用于植物的根的培养细胞系，能够进行有用物质的高效率制造。
上述(b)的基因意指该基因编码下述蛋白质，其并不限于具体序列，所述蛋白质是相对于具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质，功能上等同的突变体、衍生物、变体、等位基因、同源物、直系同源、部分肽、或与其他蛋白质、肽的融合蛋白质，且该蛋白质具有诱导根的伸长的活性(即上述(g)的蛋白质)。
在本说明书中“具有诱导植物的根的伸长的活性的蛋白质”是指：具有通过在植物(包括培养细胞)中表达，诱导(促进)植物的根的伸长和/或发达、特别是主根的伸长和/或发达的功能的蛋白质。而且，表达该蛋白质的组织可以是根，但不限于此。即也可以说，在植物内表达目的基因编码的蛋白质的情况下，该蛋白质具有诱导植物的根(或根来源的细胞)的伸长、促进植物的根(根来源的细胞)的伸长速度(增殖速度)的活性。此外，在阻碍了植物中的目的基因的表达、功能的情况下，该活性可以作为抑制该植物的根的伸长的活性来进行评价。植物中的目的基因的表达抑制、功能阻碍，例如可以按照常规方法，通过公知的基因破坏株的制作、反义技术的利用来进行。
此外，“根”是指将植物体固定、支持于根基(例如大地)，此外从其吸收成分的器官。例如，不仅包含单子叶植物的须根、双子叶植物的主根，还包含不定根、气根、支柱根、板根、附着根、寄生根、块根、吸水根、呼吸根、牵引根、收缩根。
在本说明书中“生物质的量”是指与植物个体的整体、部分、个别器官、或者其组合相关的量。作为植物个体的整体、部分、或者个别器官，可以列举出例如，全体、地上部、根、茎、叶、果实、种子、胚、胚珠、子房、苗端、花药、花粉、穗等。此外，作为量，可以列举出例如，大小、长度、宽度、重量、面积、或体积等。因而，作为生物质的量的例子，可以列举出全体重、地上部重、产量、茎径、茎数、杆长、叶面积、叶数、穗数、一穗粒数、穗长、最大穗长、或全穗重等。此外，“增加”是指任何这些生物质的量单独、或多个组合地增加。作为增加的指标，可以通过例如，与对照植物(亲本植物、非转化体等)相比较，考察植物体的生物质的量来进行评价。
这里，作为可缺失、取代、或者添加的氨基酸的数目，只要不丧失上述功能，对其个数没有限制。是指采用定点诱变法等公知的突变导入法能够缺失、取代、或者添加的程度的数目。通常是30个氨基酸以内，优选20个氨基酸以内，更优选10个氨基酸以内，最优选5个氨基酸以内(例如5，4，3，2，1个氨基酸)。导入了突变的蛋白质是否赋予植物希望的形状，可以通过使编码该蛋白质的基因表达，并考察该植物的根的伸长是否得到促进、或者植物的生物质的量是否增加来进行判断。此外，这里所称的“突变”主要是指通过定点诱变法等人工导入的突变，但也可以是天然存在的同样的突变。
在突变的氨基酸残基中，优选突变成氨基酸侧链的性质保守的其他氨基酸。例如，作为氨基酸侧链的性质，可以列举出疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P，W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q，G、H、K、S、T)、具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L，I、P)、具有含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸及酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱侧链的氨基酸(R、K、H)、具有含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。而且，例如，利用突变矩阵(mutational matrix)将氨基酸进行分类也是公知的(Taylor1986，J，Theor.Biol.119，205-218；Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning3rd ed.A7.6-A7.9，Cold SpringHarbor Lab.Press，2001)。如将该分类简要总结如下，则可以列举出脂肪族氨基酸(L、I、V)、芳香族氨基酸(H、W、Y、F)、带电氨基酸(D、E、R、K、H)、带正电氨基酸(R、K、H)、带负电氨基酸(D、E)、疏水性氨基酸(H、W、Y、F、M、L，I、V、C、A，G、T、K)、极性氨基酸(T、S、N、D、E、Q、R、K、H、W、Y)、小型氨基酸(P、V、C、A、G、T、S、N、D)、微小氨基酸(A、G、S)以及大型(非小型)氨基酸(Q、E、R、K、H、W、Y、F、M、L、I)。而且，上述括号内均为氨基酸的单字母符号。
已知具有相对于某氨基酸序列通过缺失、添加1个或多个氨基酸残基、和/或用其他氨基酸取代进行修饰而得到的氨基酸序列的多肽，能够保持其生物学活性。而且，目标氨基酸残基更优选突变成具有尽量多的共通性质的氨基酸残基。
在本说明书中“功能上等同”是指：作为对象的蛋白质具有与CLCOL1蛋白质等同(同一和/或类似)的生物学功能、生化学功能。在本说明书中，作为CLCOL1蛋白质的生物学功能、生化学功能，可以列举出例如诱导根的伸长的功能、增加植物的生物质的量的功能。生物学性质还可以包括表达的部位的特异性、表达量等。
上述(c)的基因也是指编码下述蛋白质的基因，对其具体序列没有限定，所述蛋白质是相对于具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白质，功能上等同的突变体、衍生物、变体、等位基因、同源物、直系同源、部分肽、或与其他蛋白质、肽的融合蛋白质等，且具有诱导植物的根的伸长的活性的、和/或增加植物的生物质的量的活性(即上述(h)的蛋白质)。
氨基酸序列的同源性是指在整个氨基酸序列(或者功能表达所必要的区域)中，具有至少80%以上、优选85%以上、更优选90%以上、更优选、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%以上的序列的同一性。序列的同源性可以利用BLASTN(核酸水平)、BLASTX(氨基酸水平)的程序(Altschul et al.J.Mol.Biol.，215：403-410，1990)来确定。该程序基于Karlin以及Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2264-2268，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877，1993)。在利用BLASTN对碱基序列进行解析的情况下，参数是例如score=100、wordlength=12。此外，在利用BLASTX对氨基酸序列进行解析的情况下，参数是例如score=50、wordlength=3。此外，在利用Gapped BLAST程序对氨基酸序列进行解析的情况下，可以按照Altschul等(Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)的描述来进行。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情况下，使用各程序的缺省参数。这些解析方法的具体方法是公知的。为了使比较对象的碱基序列或氨基酸序列排列成最适状态，可以容许添加或缺失(例如间隙等)。
此外，在本说明书中“同源性”是指性质类似的氨基酸残基数的比例(homology、positive等)，更优选为一致的氨基酸残基数的比例(identity)。而且，关于氨基酸的性质如上述。
关于上述(d)的基因，SEQ ID NO：2示出了编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的CLCOL1蛋白质的基因的碱基序列(ORF)。由全长1014个碱基组成，末尾的TAA为终止密码子。
上述(e)基因是指与由与上述(a)～(d)的任意多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有诱导植物的根的伸长的活性、和/或增加植物的生物质的量的活性的蛋白质的基因。
可以认为CLCOL1基因是参与根的伸长的关键因子，因而在整个维管束植物中广泛存在。即，本发明的基因也包括存在于各种植物中的、CLCOL1基因的同源基因。这里，作为用于分离同源基因的本领域技术人员熟知的方法，可以列举出杂交技术(Southern，E.M.，Journal of Molecular Biology，Vol.98，503，1975)、聚合酶链反应(PCR)技术(Saiki，R.K.，et al.Science，vol.230，1350-1354，1985，Saiki，R.K.et al.Science，vol.239，487-491，1988)。即，对于本领域技术人员而言，以CLCOL1基因的碱基序列(例如，SEQ ID NO：2所述的DNA)或其一部分作为探针、或者以与CLCOL1基因特异性杂交的寡核苷酸作为引物，从各种植物中分离CLCOL1基因的同源基因是通常能够进行的。
这里，严格条件是指：对于所称的碱基序列形成特异性双链的多核苷酸，而不形成非特异性双链得多核苷酸的条件。换言之，在同源性高的核酸之间、例如完全匹配的杂交物的熔点(Tm值)至低15℃、优选10℃、更优选5℃低的温度的范围的温度进行杂交的条件。例如可以列举出，在一般的杂交用缓冲液中以68℃、20小时的条件进行杂交的条件。作为一例，可以列举出：在由0.25M Na2HPO4，pH7.2，7%SDS，1mM EDTA，1×Denhardt’s溶液组成的缓冲液中、温度60～68℃、优选65℃、更优选68℃的条件下进行16～24小时杂交，再于由20mMNa2HPO4，pH7.2，1%SDS，1mM EDTA组成的缓冲液中、温度60～68℃、优选65℃、更优选68℃的条件下进行15分钟的洗涤2次的条件。作为其他例子，可以列举出：在含25%甲酰胺、更严格的条件中50%甲酰胺、4×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)、50mM Hepes pH7.0、10×Denhardt’s溶液、20μg/ml变性鲑鱼DNA的杂交溶液中，42℃预杂交过夜后，添加标记的探针，42℃保温过夜，由此来进行杂交。此后的洗涤中的洗涤液和温度条件可以在“1×SSC、0.1%SDS、37℃”左右、更严格的条件“0.5×SSC、0.1%SDS、42℃”左右、再严格的条件“0.2×SSC、0.1%SDS、65℃”左右实施。这样，杂交的洗涤条件越严格，就越能够期待分离出与探针序列具有高同源性的DNA。只是，上述SSC、SDS和温度的条件的组合为示例，本领域技术人员能够通过适宜组合决定杂交的严格度的上述或者其他要素(例如探针浓度、探针长度、杂交反应时间等)，实现与上述同样的严格度。例如，本领域技术人员通过参照Molecular Cloning(Sambrook，J.et al.，Molecular Cloning：a Laboratory Manual2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，10Skyline Drive Plainview，NY(1989))等，能够容易地获得这样的基因。
此外，上述(e)基因在与上述(d)基因(SEQ ID NO：2所述的碱基序列)的同源性方面，优选具有至少80%以上、优选85%以上、更优选90%以上、更优选、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列的同一性。而且，与SEQID NO：2所述的碱基序列的同源性可以通过FASTA检索、BLAST检索来确定。多核苷酸的碱基序列可以采用Science，214：1205(1981)中记载的双脱氧法来确定。
基因组DNA以及cDNA的制备可以由本领域技术人员利用常规手段来进行。基因组DNA可以例如这样制备：从植物抽提基因组DNA，制作基因组文库(作为载体可以利用质粒、噬菌体、粘粒、BAC、PAC等)，将其展开，使用基于上述基因(例如SEQ ID NO：2所述的基因)制备的探针，通过进行菌落杂交或者噬菌斑杂交，得到该克隆。此外，通过制作上述基因的特异性引物，并利用其进行PCR，也可以进行制备。此外，cDNA可以例如这样制备：基于从植物抽提的mRNA合成cDNA，将其插入λZAP等载体来制作cDNA文库，将其展开，像上述一样进行菌落杂交或者噬菌斑杂交、或进行PCR来制备。
作为由上述SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的直系同源，可以示例出例如以下。
SEQ ID NO：4示出了栽培种西瓜中的CLCOL1蛋白质的同源蛋白质的氨基酸序列。本蛋白质具有与上述CLCOL1蛋白质完全同一的氨基酸序列。因而，可以说该蛋白质也具有诱导根的伸长的功能。而且，如后述的实施例所示，栽培种西瓜与野生种西瓜相比不耐干燥，此外，无法确认干燥应答性的根系发达和基因的表达上升。这种差异可以推断是因为栽培种西瓜与野生种西瓜的启动子序列的差异。SEQ ID NO：5示出了编码本蛋白质的ORF的碱基序列。
SEQ ID NO：6示出了黄瓜中的CLCOL1蛋白质的直系同源的氨基酸序列。本蛋白质是由337个氨基酸组成的蛋白质，同样是CONSTANS样转录因子。在利用BLASTN进行同源性解析时，显示出与CLCOL1蛋白质非常高的同源性(Length=1014、Score=639bits(1649)，Expect=0.0，Method：Compositional matrix adjust.Identities=326/337(96%)，Positives=329/337(97%))。由此可以说该SEQ ID NO：6所示的蛋白质也具有参与根的伸长的功能。此外，SEQ ID NO：7示出了编码本蛋白质的ORF的碱基序列。
而且，虽然全长的氨基酸序列不明，但在甜瓜中也存在CLCOL1蛋白质的直系同源。在公开的甜瓜unigene(cDNA)的DB(http：//www.icugi.org/cgi-bin/ICuGI/tool/blast.cgi)中，使用BLASTN(expect<1e-2)针对CLCOL1蛋白质的氨基酸序列进行同源性检索。其结果，发现了与CLCOL1蛋白质显示非常高的同源性的序列(DB登录号：MU46046(Length=719Score=380bits(977)，Expect(3)=e-112，Method：Compositionalmatrix adjust.Identities=183/187(97%)，Positives=183/187(97%))。可以说该甜瓜的推定直系同源也具有参与根的伸长的功能，其在本发明的范围内。
此外，在NCBI的nrDB中进行同源性检索时，发现了与上述CLCOL1基因的同源性高的多个基因。以下示出同一性(identities)60%以上、同源性(positives)70%以上的那些。
【表1】
如上述表1所示可知，双子叶植物、针叶树(Picealikiangensis、Pinus radiata等)、小立碗藓植物(Physcomitrella patens)等广泛种类的植物中，存在与本发明的基因同源性高的。而且，上述表中虽未记载单子叶类植物，但例如，在稻中报告了具有与本发明的CLCOL1基因类似的序列的基因(Mol.Cells，Vol.17，No.1，pp.10-16)。
此外，作为获得本发明的基因的方法，可以采用通常进行的多核苷酸修饰方法。即，通过取代、缺失、插入和/或添加具有蛋白质遗传信息的多核苷酸的特定的碱基，可以制作具有希望的重组蛋白质的遗传信息的多核苷酸。作为变换多核苷酸的碱基的具体方法，可以按照Kunkel法或Gappedduplex法等公知方法或基于这些的方法来进行。例如可以列举出利用了定点诱变法的突变导入用市售试剂盒(Mutant-K、Mutant-G(均为商品名、TAKARABio公司制造)、KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit；东洋纺绩制，Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit；Clontech制，QuickChange SiteDirected Mutagenesis Kit；Stratagene制等)的应用。或者，作为利用了聚合酶链反应法(PCR)的方法，可以列举出例如，LA PCR in vitro Mutagenesis系列试剂盒(商品名、TAKARA Bio公司制造)。此外，作为突变导入方法，可以是使用以EMS(甲磺酸乙酯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝胍、其他的致癌性化合物为代表的那样的化学突变剂的方法，也可以是基于以X射线、阿尔法射线、贝塔射线、伽马射线、离子束为代表的这样的放射线处理、紫外线处理的方法。这些方法是本领域技术人员公知的。
此外，本发明中利用的基因可以仅由编码上述蛋白质的多核苷酸组成，也可以添加其他碱基序列。对于添加的碱基序列，没有特殊限制，可以列举出编码标记(例如组氨酸标签、Myc标签或FLAG标签等)、融合蛋白质(例如链霉亲和素、细胞色素、GST、GFP或MBP等)、启动子序列、以及信号序列(例如，内质网移行信号序列、以及分泌序列等)的碱基序列等。对这些碱基序列添加的部位没有特殊限制，可以是例如，翻译的蛋白质的N末端或C末端。
<2.重组表达载体>
本发明提供包含上述基因的重组表达载体。作为本发明的重组表达载体，除了为了制作转化体而用于在宿主细胞内表达本发明的基因的载体之外，还包括用于重组蛋白质的制造的那些。对作为转化对象的生物没有特殊限制，可以示例出细菌、昆虫、动物以及植物。特别优选植物。
在本发明中，作为重组表达载体的母体载体，可以使用传统上公知的各种载体。例如，可以使用质粒、噬菌体、或粘粒等，可以根据所导入的植物细胞、导入方法来适宜地选择。具体地，可以使用例如，pBluescript系的载体、pBI系的载体、pUC系的载体等。作为pBluescript系的载体，可以列举出例如，pBluescript SK(+)、pBluescript SK(-)、pBluescript II KS(+)、pBluescriptII KS(-)、pBluescript II SK(+)、pBluescript II SK(-)等。作为pBI系的载体，可以列举出例如，pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3、pBI221等。pBluescript系的载体、pBI系的载体等的二元载体从能够介由土壤杆菌向植物导入目的DNA这一点来看是优选的。此外，作为pUC系的载体，可以列举出pUC19、pUC119等。pUC系载体在可向植物直接导入DNA这一点上是优选的。
此外，作为上述载体，优选包含可在植物细胞中转录的启动子序列以及包含转录产物的稳定化所必要的多腺苷化部位的转录终止子序列。本领域技术人员可以适宜选择这样的启动子、转录终止子序列。例如，也可以使用用于进行植物细胞内的恒定基因表达的启动子、用于通过外部刺激诱导表达的启动子。
作为用于恒定地进行基因表达的启动子，可以列举出例如，花椰菜花叶病毒的35S(CaMV35S)启动子(Odell et al.1985Nature313：810)、稻的肌动蛋白启动子(Zhang et al.1991Plant Cell3：1155)、玉米的泛素启动子(Cornejoet al.1993Plant Mol.Biol.23：567)、胭脂碱合成酶基因的启动子、番茄的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶、氧化酶小亚基基因启动子、NAPIN基因启动子、油体蛋白基因启动子等。这其中，更优选可以使用CaMV35S启动子。
此外，作为用于诱导表达的启动子，除了后述的实施例中使用的那些以外，还可以列举出例如已知能够因丝状真菌·细菌·病毒的感染或侵入、低温、高温、干燥、紫外线照射、特定化合物的散布等外因而表达的启动子等。作为这样的启动子，可以列举出例如，因丝状真菌、细菌、病毒的感染、侵入而表达的稻几丁质酶基因的启动子(Xu et al.1996Plant Mol.Biol.30：387)、烟草的PR蛋白质基因的启动子(Ohshima et al.1990Plant Cell2：95)、低温诱导的稻的“lip19”基因的启动子(Aguan et al.1993Mol.Gen.Genet.240：1)、高温诱导的稻的“hsp80”基因和“hsp72”基因的启动子(Van Breusegem et al.1994Planta193：57)、干燥诱导的拟南芥的“rab16”基因的启动子(Nundy et al.1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1406)、紫外线照射诱导的欧芹的查尔酮合成酶基因的启动子(Schulze-Lefert et al.1989EMBO J.8：651)、厌氧条件下诱导的玉米的醇脱氢酶基因的启动子(Walker et al.1987Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：6624)、盐胁迫诱导的启动子(Shinozaki，K.andYamaguchi-Shinozaki，K.，Curr.Opin.Plant Biol.3，217-223(2000))等。此外，稻几丁质酶基因的启动子与烟草的PR蛋白质基因的启动子还能够被水杨酸等特定化合物所诱导，而“rab16”还能够被作为植物激素的脱落酸的散布而诱导。
此外，在本发明中，在意图促进根的伸长的情况下，并非限定，但优选可以使用在根组织中表达的启动子。作为这样的启动子的例子，也可以适宜使用在<6>中后述的、本发明的干燥胁迫特异性启动子。
因此，本发明还提供在本发明的基因上可操作连接合适的启动子而成的构建体。本领域技术人员可以基于本说明书的记载以及技术常识，适宜选择合适的启动子。
即，本发明还包括将上述<1>所述的基因与后述<6>所述的启动子连接而成的表达盒(视需要还可以连接后述的转录终止子等)。该表达盒组作为增加上述基因表达的构建体，是可以利用的。在表达盒的构建，例如，通过将各DNA片段的切断部位互相作为互补的突出末端，用连接酶进行反应，可以决定该DNA片段的顺序。而且，在表达盒包含终止子的情况下，从上游起可以是启动子、上述基因、终止子的顺序。
此外，如果将该表达盒导入适宜选择的作为母体的载体，可以获得本发明的重组载体。对于用于构建表达载体的试剂类、即限制酶、连接酶等的种类没有特殊限制，可以适宜选择市售的那些。
转录终止子序列具有作为转录终止部位的功能即可，对其没有特殊限制，可以使用公知的那些。优选可以使用例如，胭脂碱合成酶基因的转录终止区域(Nos终止子)、花椰菜花叶病毒35S的转录终止区域(CaMV35S终止子)等。在上述重组表达载体中，通过将转录终止子序列配置在适当的位置，可以防止在导入植物细胞后发生合成不必要地长的转录物、强力启动子减少质粒的拷贝数这样的现象。
此外，上述重组表达载体中还可以进一步包含其他DNA片段。对该其他DNA片段没有特殊限制，可以列举出转化体筛选标记、增强子、用于提高翻译效率的碱基序列等。此外，上述重组表达载体还可以具有T-DNA区域。T-DNA区域特别是在使用土壤杆菌将上述重组表达载体导入植物体时，能够提高基因导入的效率。
作为转化体筛选标记，可以使用例如药剂抗性基因。作为该药剂抗性基因的具体一例，可以列举出例如，对潮霉素、博来霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等的药剂抗性基因(对抗生素卡那霉素或庆大霉素有抗性的新霉素磷酸转移酶基因、对潮霉素有抗性的潮霉素磷酸转移酶基因)。此外，还可以利用对除草剂草胺膦有抗性的乙酰基转移酶基因等。由此，通过对在含上述抗生素、除草剂的培养基中生长的植物体进行选择，能够容易地筛选被转化的植物体。
作为用于提高翻译效率的碱基序列，可以列举出例如烟草花叶病毒来源的omega序列。通过将该omega序列配置于启动子的非翻译区域(5’UTR)，能够提高上述融合基因的翻译效率。
此外，作为增强子，可以列举出包含CaMV35S启动子内的上游侧的序列的增强子区域。这样，上述重组表达载体中根据目的可以包含各种各样的DNA片段。
对于重组表达载体的构建方法没有特殊限制，在适宜选择的作为母体的载体中导入上述启动子、上述基因、和终止子序列、以及视需要的上述其他DNA片段并使之为指定顺序即可。为了将上述基因插入作为母体的载体，可以采用按照常规方法、将纯化后的基因的DNA用适当的限制酶切断、并插入适当的载体DNA的限制酶部位或多克隆位点的方法等(例如，MolecularCloning，5.61-5.63)。
本领域技术人员可以通过常规的基因工程技术适宜地制作具有希望的基因的载体。通常，通过利用市售的各种载体能够容易地制作。
<3.转化体>
本发明包括导入了上述基因或重组表达载体的转化体。上述基因通常搭载(插入)在适当的载体、并导入作为转化对象的宿主细胞。即，本发明提供保持上述基因或重组表达载体的宿主细胞(转化体)。
对于上述宿主细胞没有特殊限制，可以根据目的使用各种宿主细胞。作为用于表达上述基因的细胞，可以示例出例如，细菌细胞(例如，链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌、枯草杆菌等)、昆虫细胞(例如，果蝇S2、灰夜蛾SF9)、动物细胞(例如，CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑素瘤细胞)以及植物细胞。本发明的基因是植物来源的，因此作为宿主，特别优选植物细胞，植物细胞中包括各种形态的植物细胞、例如，悬浮培养细胞、原生质体、植物体中的细胞。此外，作为本发明的转化体，不仅包括植物细胞，还包括植物体整体、植物器官(例如，根、茎、叶、花瓣、种子、果实等)、植物组织(例如，表皮、筛部、柔性组织、木部、维管束等)、它们的切片、愈伤组织、苗条原基、多芽体、毛状根以及培养根等。
作为在宿主细胞内表达上述基因的方法，可以列举出将上述基因导入适当的载体，采用例如聚乙二醇法、土壤杆菌法、脂质体法、阳离子脂质体法、磷酸钙沉淀法、电脉冲穿孔法(电穿孔)(Current protocols in Molecular Biologyedit.Ausubel et al.(1987)Publish.John Wiley&Sons.Section9.1-9.9)、脂转染法(GIBCO-BRL公司制造)、微注射法、粒子枪法等本领域技术人员公知的方法导入生物体内的方法。
此外，对植物体内的施用可以是ex vivo法，也可以是in vivo法。此外，在向植物体内导入本发明的基因的情况下，基因可以采用微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法等直接导入植物细胞，也可以组合至针对植物的基因导入用质粒，以此为载体，通过具有植物感染能力的病毒或者细菌，间接地导入植物细胞。作为该病毒，例如作为代表性病毒，可以列举出花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、Gemini病毒等；作为细菌，可以列举出土壤杆菌等。在采用土壤杆菌法对植物进行基因导入的情况下，可以使用市售的质粒。作为使用这样的载体、向植物体内导入本发明的基因时的方法，优选可以列举出通过土壤杆菌导入基因的叶盘法(Jorgensen，R.A.et al.，(1996).Chalconesynthase cosuppression phenotypes in petunia flowers：comparison of sense vs.antisense constructs and single-copy vs.complex T-DNA sequences.Plant Mol.Biol.31，957-973.)。
在本发明中，作为转化对象的“植物”只要是具有根的维管束植物即可，没有特殊限制，优选是被子植物，可以是单子叶植物或双子叶植物。此外，不仅包括草本类，也包含木本类。
“单子叶植物”作为，可以列举出例如：兰科(Orchidaceae、例如春兰(中国春兰)，香草等)、稻科(Poaceae、例如稻、小麦，大麦，黑麦，玉米，小米，谷子，甘蔗等)、莎草科(Cyperaceae、例如葵、泽泻等)、天南星科(Araceae、例如芋(taro)、芋头、大野芋等)、泽泻科(Alismataceae、例如茨菰等)、百合科(Liliaceae、例如韭菜、青葱、洋葱、薤、葱、冬葱、大蒜、丝葱、韭、芦笋、天香百合、卷丹、大花卷丹(3种百合根)等)、薯蓣科(Dioscoreaceae、例如大薯、薯蓣(家山芋、佛掌薯蓣)、野山药等)、姜科(Zingiberaceae、例如生姜等)，作为其他木本类，可以列举出竹(苦竹、淡竹、孟宗竹等)、椰子等。
此外，作为“双子叶植物”，可以列举出：离瓣花类、合瓣花类中的任何一种，例如，菊科(Asteraceae、例如向日葵，莴苣，牛蒡，茼蒿，食用菊，苣荬菜，菊苣，菊牛蒡(商陆)、朝鲜蓟(洋蓟)、橐吾、水前寺菜、菊芋、莴苣、长叶莴苣、款冬、菊牛蒡、食用蒲公英、婆罗门参(蒜叶婆罗门参)等)、豆科(Fabaceae、例如大豆，豌豆，蚕豆，花生，刀豆，扁豆，红凤，红花豆，芸豆，黎豆，歪头菜，绿豆，豇豆等)、茜草科(Rubiaceae、例如咖啡等)、唇形科(Lamiaceae、例如日本罗勒，鼠尾草，中国朝鲜蓟，百里香，紫苏，薄荷等)、大戟科(Euphorbiaceae、例如蓖麻，木薯等)、牡丹科(Melastomataceae)、桃金娘科(Myrtaceae、例如蒲桃等)、夹竹桃科(Apocynaceae)、锦葵科(Malvaceae、例如秋葵等)、杜鹃花科(Ericaceae)、苦苣苔科(Gesneriaceae)、伞形科(Apiaceae、例如胡萝卜、欧芹、芹菜、明日叶、香芹、芫荽、鸭儿芹、茴香、珊瑚菜、水芹、欧洲萝卜等)、十字花科(Brassicaceae、例如油菜子、萝卜、山葵、青菜(小白菜)、京菜、乌塌菜、油菜、大白菜、芜菁、榨菜、芥菜、高菜、芥菜(Brassica juncea)、羽衣甘蓝、芥蓝、花椰菜、圆白菜、小卷心菜、大头菜、花茎甘蓝、芜菁甘蓝、白兰、辣根、小萝卜、水田芥等)、爵床科(Acanthaceae)、蔷薇科(Rosaceae、例如苹果，樱桃，草莓等)、紫草科(Boraginaceae)、荨麻科(Urticaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、茄科(Solanaceae、土豆，番茄，辣椒，烟草，青椒，茄子等)、蓼科(Polygonaceae、例如水柳蓼(本蓼)、蓝蓼、大黄(食用大黄)等)、藜科(Chenopodiaceae、例如恭菜(根甜菜)、红菜头(火焰菜)、地肤、钠沙蓬、菠菜、碱蓬等)、苋科(Amaranthaceae、例如苋菜等)、粟米草科(Molluginaceae、例如番杏(蔓菜)等)、马齿苋科(Portulacaceae、例如马齿苋(蜀本草)等)、落葵科(Basellaceae、例如落葵等)、睡莲科(Nymphaeaceae、例如莼菜、莲(藕)等)、芸香科(Rutaceae、例如山椒等)、柳叶菜科(Onagraceae、例如菱等)、五加科(Araliaceae、例如土当归、辽东楤木等)、旋花科(Convolvulaceae、例如空心菜、甘薯等)、葫芦科(Cucurbitaceae、例如冬瓜、西瓜、越瓜、香瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜(日本南瓜、西洋南瓜、西葫芦这3种)、葫芦、丝瓜、苦瓜(凉瓜)、佛手瓜等)，作为其他木本类，可以列举出樟、椎、樱、杜鹃、忍冬等。
而且，上述的转化方法优选根据作为宿主的植物等的种类(例如单子叶植物、双子叶植物)进行适宜选择。
此外，本发明不仅包括直接导入了上述基因或载体的宿主细胞，在该宿主细胞为高等植物的情况下，还包括植物细胞生长得到的植物体、作为该植物的后代、子孙或克隆的植物、以及繁殖材料(例如种子、果实、切穗、块茎、块根、植株、愈伤组织、原生质体等)。本领域技术人员可以视植物细胞的种类采用公知方法从转化植物细胞再生植物体。例如，在制作转化植物体的方法方面，可以列举出利用聚乙二醇向原生质体进行基因导入、再生植物体的方法，利用电脉冲向原生质体进行基因导入、再生植物体的方法，采用粒子枪法向细胞直接导入基因、再生植物体的方法、以及利用土壤杆菌进行基因导入、再生植物体的方法等，没有特殊限制。上述技术是已经建立的，在本发明的技术领域广泛应用，本发明中优选可以使用上述方法。
作为使转化的植物细胞再分化、再生植物体的方法，因植物细胞的种类而异，例如，对于稻可以使用Fujimura等(Plant Tissue Culture Lett.2：74(1995))的方法，对于玉米可以使用Shillito等(Bio/Technology7：581(1989))的方法或Gorden-Kamm等(Plant Cell2：603(1990))的方法。采用上述方法再生、且栽培出得转化植物体中被导入的外源基因的存在，可以通过采用公知的PCR法、Southern杂交法、或对植物体中的DNA的碱基序列进行解析来确认。这种情况下，从转化植物体抽提DNA可以按照公知的J.Sambrook等的方法(Molecular Cloning、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)来实施。
例如，在采用PCR法解析再生的植物体中存在的本发明的基因的情况下，以如上述地从再生植物体抽提的DNA作为模板来进行扩增反应。此外，也可以使用具有根据本发明的基因、或者修饰基因的碱基序列适当选择的碱基序列的合成寡核苷酸作为引物，在将它们混合而成的反应液中进行扩增反应。在扩增反应中，若将DNA的变性、退火、延伸反应重复进行数十次，则能够得到包含本发明的基因的碱基序列的DNA片段的扩增产物。若将含扩增产物的反应液用于例如琼脂糖电泳，则扩增出得各种DNA片段能够分级，能够确认该DNA片段对应于本发明的基因。
如果得到了基因组内导入了本发明的基因的转化植物体，则能够从该植物体体通过有性生殖或无性生殖获得子孙。此外，从该植物体、其子孙或者克隆得到繁殖材料，基于此可以量产该植物体。本发明包括：导入了本发明的基因或重组表达载体的植物细胞、含该细胞的植物体、该植物体的子孙以及克隆、还有该植物体、其子孙、以及克隆的繁殖材料。即，本发明包括：作为实施了转化处理而得到的再分化当代的“T0代”、作为T0代的植物的自殖种子的“T1代”等后代植物、以及以它们作为一个亲本进行交配而得到的杂种植物或其后代植物。
这样地制作的植物体与通常的植物相比，根系的发达得到促进、和/或其生物质的量增加，因而有用性高。
此外，本发明可以包含植物体的制造方法，其包括：准备上述<1>所述的基因的表达增加了的植物的步骤，在上述植物的后代植物中测定(i)根的伸长、和/或、(ii)生物质的量、选择该(i)根的伸长、和/或、(ii)生物质的量显著提高的系统的步骤。作为该“上述<1>所述的基因的表达增加了的植物”，优选转化植物，但不限于此。可以从该植物采用常规方法获得后代植物。通过将保持了上述基因过表达这样的性状的后代植物，以其(i)根的伸长、和/或、(ii)生物质的量为基准进行选择，可以制作通过具有上述性状而生物质的量增产的稳定的植物系统。从该植物或其子孙得到植物细胞、种子、果实、植株、愈伤组织、块茎、切穗、块等繁殖材料，以此为基础，可以量产(i)根的伸长、和/或、(ii)生物质的量提高的稳定的植物系统。
<4.根的伸长得到诱导的植物、或生物质的量增加的植物、以及它们的制造方法>
本发明中除了上述转化体之外，还包含该转化体的制造方法。特别是包括，包含在植物中增加本发明的基因的表达的步骤的、根的伸长得到促进的植物、或生物质的量增加的植物的制造方法(制作方法)。作为该制造方法的其他方式，包含在植物中增加本发明的基因的表达的步骤即可，对于其他的步骤、条件、材料等没有特殊限制。对于作为本制造方法的对象的植物等，适当参见上述<3>的说明。
而且，本发明不仅包括转化植物，还包括上述基因的表达增加的、诱导了根的伸长、和/或增加了生物质的量的植物。作为增加的比较对象，例如，可以列举出野生型植物。该基因的表达增加的植物不论是转化、突变、传统育种等制造方法，具有该性状即可。
“增加基因的表达”是指：在作为对象的植物内，上述基因所编码的蛋白质的表达量(产生量)增加，除去从外部导入基因的情况，还包括内源性基因的表达量增加的情况。对于其增加的程度没有特殊限制，作为结果，在接受上述基因的表达增加的植物中，与对照植物(例如，非基因导入体、野生型植物等)相比，显示根的伸长得到促进的表型、或生物质的量增加的表型即可。根的伸长是否得到促进、或生物质的量是否增加，可以如后述的实施例所示那样，通过考察根的干燥重量或其他生物质的量(植物的杆长、最大穗长、全穗重等)来简便地进行评价。
例如，作为增加内源性基因的表达量的方法，可以利用突变导入法。例如，EMS(甲磺酸乙酯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝胍、其他的致癌性化合物为代表的那样的化学突变剂的方法，也可以采用以X射线、阿尔法射线、贝塔射线、伽马射线、离子束为代表的这样的放射线处理、紫外线处理，在作为对象的植物的基因中导入突变，并筛选作为结果在该植物中上述基因的表达得到增加的株。这些方法是本领域技术人员公知的。
在从外部导入基因的情况下，可以利用传统上公知的基因工程的方法。具体地，可以使用上述重组表达载体，或者利用上述<3>中说明的各种方法。即，在本制造方法中，优选包含导入上述基因或重组表达载体、制作转化植物细胞的步骤。而且，在本发明中，作为转化的对象的植物材料可以列举出例如，根、茎、叶、种子、成熟胚、未熟胚、胚珠、子房、苗端、花药、花粉等植物组织，或其切片、细胞、愈伤组织、将其用酶处理除去细胞壁而得到的原生质体等植物细胞。
而且，优选包含从上述植物细胞再生植物体的步骤。如上述那样转化的植物细胞可以通过本领域技术人员公知的组织培养法再生成器官或植物个体。可以列举出例如，将愈伤组织状的转化细胞转移至激素的种类、浓度改变的培养基并进行培养、形成不定胚、得到完全植物体的方法等。具体示例如下：首先，在作为转化的对象的植物材料使用植物组织或原生质体的情况下，将其在加入了无机要素、维生素、碳源、作为能量源的糖类、植物生长调节物质(植物生长素、细胞分裂素等植物激素)等并灭菌的愈伤组织形成用培养基中进行培养、形成增殖成不定形的脱分化的愈伤组织(以下称“愈伤组织诱导”)。将这样形成的愈伤组织在转移至含植物生长素等植物生长调节物质的新培养基中，进一步进行增殖(传代培养)。愈伤组织诱导在琼脂等固型培养基中进行、而传代培养在例如液体培养中，这样可以有效率且大量地实施各培养。然后，通过将通过上述的传代培养增殖得到的愈伤组织在适当的条件下进行培养，诱导器官的再分化(以下称为“再分化诱导”)、最终再生出完全的植物体。再分化诱导可以通过适宜设定培养基中的植物生长素、细胞分裂素等植物生长调节物质、碳源等各种成分的种类及量、光、温度等来进行。通过该再分化诱导，可以形成不定胚、不定根、不定芽、不定茎叶等，并进一步将其培育成完全植物体。或者，可以以成为完全植物体之前的状态(例如胶囊化的人工种子、干燥胚、冻干干燥细胞以及组织等)进行保存。
此外，在作为转化的对象的植物材料使用植物组织、例如叶盘的情况下，可以在土壤杆菌感染后，将其在添加了无机盐类、维生素类、碳源(作为能量源的糖类等)、植物生长调节物质(植物生长素、细胞分裂素等植物激素)、卡那霉素等选择药剂等并灭菌的再分化固型培养基上，以适当的光以及温度条件进行培养，从而形成茎叶。然后，通过在从上述固型培养基中除去植物生长调节物质而得到的培养基(发根培养基)上培养茎叶，诱导不定根，使之再生为完全植物体。作为使用的培养基，可以列举出例如，LS培养基、MS培养基等一般的那些。
此外，本发明的根的伸长得到诱导的植物体、或生物质的量增加的植物体还可以通过育种法来制作。作为上述育种法，可以列举出例如，以与具有本发明的基因的品种进行杂交为特征的一般的育种法(杂交育种法等)。通过该方法，可以制作根的伸长得到促进的植物体、或生物质的量增加的植物体。在通过育种法制作本发明的植物体时，可以参照公知的各种文献来适宜实施(細胞工学別冊·植物細胞工学シリーズ15「モデル植物の実験プロトコール」秀潤社、2001年)。
作为上述育种方法的优选实施方式，可以列举出下述方法，该方法包括：制作由根的伸长得到诱导的植物、或生物质的量增加的植物与具有任意功能的植物交配而得到的品种的步骤、检验在上述步骤制作的植物中根的伸长是否得到促进、或生物质的量是否增加的步骤。此外，作为其他实施方式，可以列举出包括与具有本发明的基因植物杂交的步骤、选择具有该基因的植物修饰体的步骤的方法。
而且，作为其他实施方式，可以列举出包括(1)使植物A与具有本发明的基因的其他植物B进行杂交、制作F1的步骤、(2)使上述F1与上述植物A杂交的步骤、(3)选择具有上述基因的植物的步骤、(4)使步骤(3)中选择出的植物与上述植物A杂交的步骤的方法。
在上述方法中，使具有本发明的基因的植物B与希望诱导根的伸长的植物(这些植物表述为“植物A”)进行杂交，选择继承了植物B所具有本发明的基因、且接近植物A的个体，再对其反复进行基于植物A的杂交即“回交”，有意识地导入植物B所具有的本发明的基因的性状。此时，通过按照常规方法、利用一般在基因组育种中利用的DNA标记来选择具有本发明的基因的植物，能够有效地进行基于上述”回交”的置换。其结果，能够缩短育种期间，还能够准确地去除多余的基因组区域的混入。通常，在“回交”中存在下述问题：无论怎样也无法排除依赖于与本发明的基因非常强地连锁的其他基因的性状的现象。这种情况下，通过利用本发明的基因的附近存在的DNA标记，能够准确地选择希望的植物。在获取生物质的量增加的植物的情况中也是一样的。
此外，在上述方法中，视需要可以反复进行至本发明的基因以外的基因组全域在目的遗传性状方面纯合(homo)固定。即，可以对于上述步骤(4)中杂交出的个体，利用一般的DNA标记，选择具有本发明的基因、且基因组结构接近植物A的植物个体。而且，该选择出得植物个体可以视需要进行“回交”(与植物A杂交)。
特别是在利用了DNA标记的基因组育种方法中，能够将替换率高的个体选择出来并用于下一轮杂交，因而杂交世代越多，选择效率越好。此外，在本方法中，采用少的个体数即可完成，因而能够实现省空间的育种。而且，利用温室、人工气象室，可以在1年中进行多轮杂交。
此外，在上述步骤(3)中，使用DNA标记进行选择是指：基于关于以该DNA标记为特征的碱基序列(例如多型等)的碱基种类信息，来进行选择。例如，在本发明的基因的附近存在多型突变的情况下，是指选择具有与该多型突变同一的多型突变的个体。因而优选可以说，上述育种方法是利用了DNA标记的“基因组育种”方法。该“基因组育种”也可以说是“标记育种”。在上述育种方法中可利用的DNA标记没有特殊限制，优选可以使用一般知晓的各种DNA标记。可以列举出例如，RFLP(限制酶片段长多型)标记、SSR(单纯重复序列)标记、SNP(单碱基多型)标记等。
而且，通过增加本发明的基因的表达来诱导根的伸长、或增加生物质的量，不仅适用于西瓜以及拟南芥这样的双子叶植物，也可以广泛适用于全体维管束植物、特别是单子叶植物。与在本发明中确认了效果的西瓜来源的基因类似的基因(序列同源性高的基因)不仅存在于葫芦科植物、拟南芥以外的双子叶植物中，也广泛存在于单子叶植物中。特别值得注意的是，在与西瓜、拟南芥在分类学上亲缘关系远的植物——稻中也存在(Mol.Cells，Vol.17，No.1，pp.10-16)。即，上述的本发明的基因的同源基因不仅存在于双子叶植物中，而是广泛存在于包含单子叶植物在内的全体维管束植物中。这样，基因从双子叶植物到单子叶植物普遍保守，因而本发明的基因引起的根的伸长机制、或生物质的量的增加机制在双子叶植物和单子叶植物之间共通的可能性极其高。
在考虑到以上的点的基础上，如果阅读了本说明书，本领域技术人员对于双子叶植物以外的植物，也能够将上述本发明的基因导入各种植物、增加表达，从而在该植物中促进根的伸长、或增加生物质的量。例如，在单子叶植物中利用本发明的情况下，仅通过将后述的实施例中使用的植物材料(双子叶植物)替换成单子叶植物，即可实施本发明。而且，此时，考虑到申请时的技术水平、技术常识，适宜变更实验顺序、材料等是本领域技术人员公知的。
此外，本发明还包括包含增加上述的基因的表达的步骤的、诱导植物的根的伸长的方法。而且，还包括包含增加下述的任意基因的表达的步骤的、增加植物的生物质的量的方法。关于增加基因的表达的步骤，可以适宜利用上述的各种方法。
<5.植物的根的伸长诱导、或增加生物质的量的剂>
本发明还包括：含有上述基因或重组表达载体作为有效成分的、植物的根的伸长诱导剂、或增加生物质的量的剂(以下统称为“伸长诱导剂等”)。该伸长诱导剂等适用于植物，可以以含有植物成长调节剂等公知的适用于植物的药剂所容许的载体成分的组合物的形式提供。此外，伸长诱导剂等可以以包含上述基因、重组表达载体、以及用于转化植物的各种试剂等的试剂盒的方式提供。此外，本发明还包含使用了该伸长诱导剂等的诱导植物的根的伸长的方法或增加生物质的量的方法。该方法可以通过伸长诱导剂等的散布、对植物的注入、或转化技术等来进行。
<6.具有干燥胁迫特异性启动子活性的多核苷酸及其应用>
而且，本发明人对上述的野生种西瓜中的CLCOL1基因的启动子区域进行了解析，结果发现：该启动子区域响应于植物的环境变化调控特异性基因表达、尤其是诱导调控在植物受到干燥胁迫时特异性表达的启动子。此外，还可知该启动子区域，具有在植物的根中使基因特异性表达的功能。即，本发明包括选自以下的(j)～(l)中的多核苷酸。
(j)由SEQ ID NO：3所述的碱基序列构成的多核苷酸；
(k)由在SEQ ID NO：3所述的碱基序列中缺失、取代或者添加一个或数个碱基而得到的碱基序列构成、且具有作为响应于植物的干燥胁迫进行表达调控的启动子的功能的多核苷酸；
(l)与由与上述(j)或(k)所述的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件杂交、且具有作为响应于植物的干燥胁迫进行表达调控的启动子的功能的多核苷酸。
上述多核苷酸通过插入至编码目的蛋白质的基因(以下称为“目的基因”)的翻译起始位点的5’侧，能够对于该目的基因，诱导对应于植物的干燥胁迫的表达，和/或能够使该目的基因在根中高水平表达。
上述多核苷酸包括由在SEQ ID NO：3所示的碱基序列中取代、缺失、添加或插入1个以上的碱基而得到的碱基序列构成、且具有作为响应于植物的干燥胁迫进行表达调控的启动子的功能(以下也称为“干燥特异性启动子活性”)的多核苷酸。这里，对于可以取代、缺失、添加或插入的碱基的个数没有特殊限制，优选1个～数个。例如，SEQ ID NO：3所示的碱基序列的1～10个、优选1～5个碱基可以缺失，SEQ ID NO：3所示的碱基序列中可添加1～10个、优选1～5个碱基，或者，SEQ ID NO：3所示的碱基序列的1～10个、优选1～5个碱基可以取代成其他碱基。
此外，本发明包括由SEQ ID NO：3所示的碱基序列的部分碱基序列构成、且具有干燥特异性启动子活性的多核苷酸。由SEQ ID NO：3所示的碱基序列构成的多核苷酸中的启动子活性所必需的部分可以如下确定：该多核苷酸的各种缺失体、例如，将从5’上游侧起缺损各种长度而得到的DNA片段与β-葡糖醛酸酶(GUS)基因等的报告基因融合而成的质粒导入宿主中，并测定启动子活性。而且，用于这样的活性部分的确定的方法是本领域技术人员公知的。
这样的突变体多核苷酸具有干燥特异性启动子活性即可，对其活性的大小没有特殊限制，优选基本上保持由SEQ ID NO：3所示的碱基序列构成的多核苷酸的干燥特异性启动子活性。“基本上保持由SEQ ID NO：3所示的碱基序列构成的多核苷酸的干燥特异性启动子活性”是指保持了下述程度的启动子活性：在利用该启动子活性的实际使用方式中，与由SEQ ID NO：3所示的碱基序列构成的多核苷酸在同一条件下基本可以同样地利用。
在本发明中“干燥特异性启动子活性”是指：植物在遭受干燥胁迫的情况下，与将同植物置于非干燥状态的情况相比，该植物体的组织或器官的至少一部分位置(优选根)中，目的基因优先且高度表达的活性。该“干燥特异性启动子活性”可以采用后述的实施例中进行的干燥胁迫赋予实验来进行评价。
用于取得诸如上述的突变体多核苷酸的基因突变导入可以通过上述的<1>所示的Kunkel法或Gapped duplex法等公知方法或基于它们的方法来进行。
而且，本领域技术人员可以容易地使用由SEQ ID NO：3所示的碱基序列的全部或一部分构成的多核苷酸、从各种生物中新获得由具有与由SEQID NO：3所示的碱基序列构成的多核苷酸同样的功能、即干燥特异性启动子活性的其他碱基序列构成的多核苷酸、并加以利用。这样的由其他碱基序列构成的多核苷酸的取得例如可以这样进行：与由与SEQ ID NO：3所示的碱基序列的全部或一部分构成的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交，或者使用该该碱基序列的一部分作为引物进行PCR等。杂交、PCR方法参见上述说明。作为示例可以列举出同源性高的多核苷酸，即由与SEQ ID NO：3所示的碱基序列具有至少80%以上、优选85%以上、更优选90%以上、更优选95%以上的同源性的碱基序列构成的多核苷酸。
而且，通过将所得启动子区域导入能够对表达量进行定量的基因的上游、并对该基因的表达量进行定量，能够测定启动子活性。即，通过构建导入了所得启动子区域以及指定基因的重组载体，并使用该重组载体对转化细胞中的该基因的表达量进行定量，可以测定所得启动子区域的一部分中的启动子活性。此时的干燥胁迫条件可以在参考后述实施例的基础上，由本领域技术人员适宜设定。
此外，本发明还包括具有上述多核苷酸作为启动子区域的重组表达载体。该重组表达载体可以通过将在上述的多核苷酸的下游域连接目的基因而成的盒导入适当的载体来构建。关于重组表达载体的说明，参见上述<2>的记载。
作为目的基因，可以是作为对象的植物中的内源性基因或外源基因。作为该基因，可以列举出例如，有用物质(医药、色素、芳香成分等)生产基因、植物生长调控(促进/抑制)基因、糖代谢关联基因、耐病虫害性〔昆虫食害抗性、霉菌(菌类)以及细菌病抗性、病毒(病)抗性等〕基因、环境胁迫(低温、高温、干燥、光障害、紫外线)抗性关联基因等，但不限于此。
而且，本发明还包括将具有上述多核苷酸或该多核苷酸的重组表达载体导入而成的转化体。该转化体可以例如，通过使用上述重组表达载体转化对象生物来制备转化体。而且，对对象生物没有特殊限制，优选植物。
关于转化体以及制备转化体的方法，可以适宜利用已经报告、确立的各种方法、具体说明适当参见上述<3>，<4>的记载。
如以上，本发明的基因具有诱导根的伸长的活性。因而，通过将本发明的基因在植物细胞内高表达，可以促进根的伸长速度，而不对根以外的其他组织产生影响。所以，本发明除了用于干燥胁迫等恶劣环境胁迫下的植物的抗性提高以外，还可以通过营养素的有效获取而用于植物生产性的提高，或者通过应用于植物组织培养，而用于医药品、生药等的生产效率的提高。
具体地，根据本发明的基因及其利用技术，能够实现以下的良好作用效果。
(I)对植物赋予耐干性：表达本发明的基因、根的发育增加的植物显示出良好的水分吸收能力。所以，即使在干燥条件下，也能够生长。
(II)植物的生长旺盛化：表达本发明的基因、根的发育增加的植物的营养成分和/或水分的吸收能力增加。因而，可以期待该植物显示出旺盛的生长。
(III)稳定性的提高：表达本发明的基因、根的发育增加的植物能够将植物体强力稳定地支持在根基(地中)中。因而，栽培管理变得容易，农业上是非常有用的。
(IV)有用物质的制造：已知有用根制造/蓄积生物碱等有用物质的植物。通过在该植物中表达本发明的基因、增加根的发育，能够有效率地制造医药品、功能性分子等有用物质。此外，不仅是对植物个体，通过在培养根中表达本发明的基因，也能够更简便且有效率地制造上述有用物质。
本发明不限于以上解说的各方案，在说明书中记载的范围中可实施各种变更，在不同的实施方式中分别公开的技术手段适宜组合而得到的实施方式也包含在本发明的技术范围内。此外，本说明书中记载的全部文献在此援引作为参考。以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不仅限于该实施例。
实施例
(1)野生种西瓜中的干燥胁迫应答性的根系发达：
对于发芽后第二星期的野生种西瓜(Citrullus lanatus sp.No101117-1)，通过停止灌水使之在干燥条件下生长。此外作为对照组，使同样发芽后第二星期的野生种西瓜在湿润条件下生长。生长条件如下：光强度250μmol photonsm-2s-1、16L/8D、温度35/25℃、湿度50/60%、土壤ISOLITE。
结果如图1(a)，图1(b)所示。图1(a)示出了土壤中的含水量的推移，图1(b)示出了干燥条件下与湿润条件下进行0～4日生长后的野生种西瓜的根的状态。如该图所示，干燥条件下的野生种西瓜与湿润条件下的对照组相比较，可见根系的显著发达。
(2)干燥胁迫时的西瓜根的干燥重量的变化：
接下来，考察了干燥条件下生长的野生种西瓜与栽培种西瓜中的根的干燥重量的时间变化。而且，已知栽培种西瓜与野生种西瓜相比，不具备对干燥的抗性。结果如图2所示。图2中，左侧曲线显示野生种西瓜的根的干燥重量，右侧曲线显示栽培种西瓜的根的干燥重量。如该图所示，野生种西瓜的根的干燥重量在灌水停止后的干燥条件下显著地增加，3日后成为湿润条件的约5倍。由这些结果可以推测，野生种西瓜具有特征性的干燥应答性的根系发达机制。
(3)干燥胁迫下的野生种西瓜的根中的CLCOL1基因的时间表达解析：
对于干燥胁迫下的野生种西瓜和栽培种西瓜的根中的CLCOL1基因的时间表达，通过定量的RT-PCR进行了解析。具体实验方法如以下。
对于野生种西瓜(sp.no.101117-1)和栽培种西瓜(cv.Sanki/三喜)，使用500mlISOLITE CG1号(ISOLITE工业)，在明期16小时/暗期8小时、35/25℃、湿度50/60%、照度250μmol photonsm-2s-1的人工气象器内环境下，培育至播种后的第2星期。这期间，每日在明期后的第1小时给予含1000倍稀释浓度的Hyponex的水分，直至土壤含水率为62%。然后，通过停止灌水将其置于干燥条件下。其结果，土壤中的含水率以约9%/日的比例降低。以停止灌水时为第0天，此后直至第4天，按时间在明期后第4小时从土壤中回收3个体的植物体的根。另一方面，作为湿润条件下的对照，准备相同数量的播种后第2星期的植物。对其继续给与水分，并在与停止灌水的情况一样的时间点上收获根。从这些根使用Plant RNA Isolation kit(Agilent)抽提总RNA，再使用逆转录酶ReverTra Ace-α-(Toyobo)合成cDNA。将其用于定量RT-PCR。定量RT-PCR使用SYBR Premix Ex Taq II(Takara)和LightCycler480(Roche)按以下条件进行。
变性：5m95℃，变温速度4.4℃/s.PCR：45循环，10s95℃，10s60℃，10s72℃，变温速度4.4，2.2，4.4℃/s(对每一步).熔解：5s95℃，15s65℃，变温至98℃，变温速度4.4，2.2，0.11℃/s(对每一步).冷却：10s50℃，变温速度1.5℃/s.
使用内源性肌动蛋白基因进行校正。CLCOL1和肌动蛋白基因的检测使用以下引物。
CLCOL1：
正向：TTGAGGTTGGAGTTGTGCCG(SEQ ID NO：8)
反向：TACCTCAACACTCTCGCCTC(SEQ ID NO：9)
肌动蛋白：
正向：CATTCTCCGTTTGGACCTTGCT(SEQ ID NO：10)
反向：TCGTAGTTTTCTCAATGGAGGAACTG(SEQ ID NO：11)
结果如图3所示。图中，“Wild”表示野生种西瓜，“Sanki”表示栽培种西瓜。如该图所示，CLCOL1基因的表达在野生种西瓜的根中，在干燥胁迫开始后迅速上升，先于根系发达的峰值(第3天)，在第2天表达到达最大。而且可以认为，基因的表达要经过翻译成蛋白质才表现出根系发达这个表型，因而比根系发达的峰值快1天。
(4)使用诱导载体进行CLCOL1基因在野生种西瓜毛状根中的诱导表达：
使用基于β-雌二醇(β-estradiol)的诱导表达载体(XVE诱导系统)，在野生种西瓜毛状根中进行CLCOL1基因的诱导表达。具体实验方法如下。
作为诱导表达载体，使用了pER8载体(Zuo et al.，Plant J.24，265-273，2000)。在pER8载体内的诱导性启动子(OLexA-46)下游的XhoI/SpeI限制酶位点采用PCR法扩增、克隆CLCOL1基因ORF，制作了pXVE-CLCOL1。克隆中使用的引物如下。引物序列中的XhoI和SpeI位点在正向中是5’末端起4～9碱基的部分，在反向中是5’末端起5～10碱基的部分。
正向：CCGCTCGAGGAATGGCTTCCAAGCTTTG(SEQ ID NO：12)
反向：GCCGACTAGTTTAGAAGGACGGAACGACG(SEQ ID NO：13)
用其转化土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes ATCC15834)，用于使用了野生种西瓜胚轴的毛状根诱导。野生种西瓜毛状根的诱导按照已经发表的方法(Kajikawa et al.，Plant Cell Rep.29，771-778，2010)进行。作为选择药剂，使用了终浓度2.5mg/L潮霉素。
诱导表达系列制作了3个系统(wXVE-5、wXVE-7、wXVE-11)。
对于这3个系统、以及作为对照组仅导入了pER8载体的对照系统，分别添加终浓度2μMβ-雌二醇，进行CLCOL1基因的诱导表达。结果如图4所示。图的上部示出了在XVE诱导系载体中导入CLCOL1基因而成的载体(pXVE-CLCOL1)的模式图，下部示出了基因的相对表达量。在添加2μM雌二醇的培养基中移植约5cm的毛状根，培养2天后用于基因表达量解析。作为对照，将各系统在不含雌二醇的培养基中也进行培养，同样地用于基因表达解析。CLCOL1基因的表达量像上述(3)项那样通过定量RT-PCR进行解析。如该图所示可以确认，上述3个系统的任何一个中，CLCOL1基因都受到了β-雌二醇的添加的诱导表达。
接下来，考察了CLCOL1基因的表达水平的上升对毛状根的生长的效果。具体实验方法如下。在添加2μM雌二醇的培养基中移植约5cm的毛状根，以此时的毛状根尖端部作为基点，在4天测定毛状伸长的长度。
结果如图5所示。如该图所示，在导入了pXVE-CLCOL1载体的任何系统中，因β-雌二醇的添加导致CLCOL1基因的表达水平的上升，从而显著促进毛状根的伸长。由此强烈提示，CLCOL1基因参与干燥条件下的野生种西瓜的根系发达的分子调控。
(5)拟南芥中的CLCOL1基因的表达对根的生长的影响：
对于强表达CLCOL1基因的拟南芥转化体，制作了2个系统(CLCOL1ox-3，CLCOL1ox-17)。具体实验方法如下。
利用Gateway克隆(Invitrogen)使用pGWB2载体(Nakagawa et al.，J.Biosci.Bioeng.104，34-41，2007)制作了CLCOL1基因表达载体。将CLOCL1基因通过BP反应克隆至pDONR221(Invitrogen)。所用引物如下。
正向：AAAAAGCAGGCTCCGGAATGGCTTCCAAGCTTTG(SEQ IDNO：14)
反向：AGAAAGCTGGGTTAGAAGGACGGAACGACG(SEQ ID NO：15)
在将其通过LR反应克隆至pGWB2，制作了CLCOL基因表达载体pGWB2-CLCOL1。用其转化土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens MP90)，采用floral dip法感染拟南芥。将所得T1转化体用终浓度25mg/L的潮霉素进行选择，得到自殖后代的T2种子。将其用于潮霉素选择，选出抗性/非抗性的选择比为3：1、即插入1个拷贝的表达盒的2个系统(CLCOL1ox-3，CLCOL1ox-17)，得到了它们的纯合(homo)型T3种子。将CLCOL1ox-3，CLCOL1ox-17的纯合型T3种子与野生型种子一起播种于非选择培养基，以发芽后的第1天为基点，在7天测定主根伸长的长度。
对于这2个系统的拟南芥转化体，对发芽后的根系发达进行了解析。结果如图6所示。如该图所示，在强表达CLCOL1基因的拟南芥转化体中，发芽后的主根的伸长与野生种(WT)相比得到了显著促进。由该结果可知，CLCOL1基因在其他种的植物体中也具有促进根系发达的功能。
(6)稻中的CLCOL1基因的表达对生长的影响：
制作了CLCOL1基因强表达稻(品种：雪光)。
将CLCOL1基因组合入GATEWAY入门载体(pDONR221：卡那霉素抗性载体)，并用其转化DH5α感受态细胞，抽提质粒，测序，得到了具有与序列信息相同的插入物的质粒。使该具有“attL1-CLCOL1(1014bp)-attL2”的pDONR221入门载体与具有“attR1-CmRccdB-attR2”的pDEST1目的载体进行LR反应，制作了表达载体。
对于反应液20μl，将含CLCOL1/pDONR221约600ng、pDEST1Red约2μg的溶液用TE制备成16μl，最后加入Gateway(注册商标)LR Clonase IIEnzyme Mix(Invitrogen)4μl，25℃、反应过夜。加入ProteinaseK2μl，37℃、温育10分钟停止LR反应，加入MilliQ30μl，乙醇沉淀。采用电穿孔法用其转化GeneHogs感受态细胞，涂布于含50μg/ml卡那霉素和35μg/ml潮霉素的LB琼脂培养基，37℃培养过夜。
将生长出的菌落用含50μg/ml卡那霉素和35μg/ml潮霉素的TB培养基2ml，37℃培养过夜。从培养液采用miniprep法抽提质粒，进行Afl II和PacI消化模式检查。此外，使用pDEST1-FW引物、pDEST1-RV引物，用荧光测序仪(ABI PRISM3100Genetic Analyzer，Applied Biosystems社)从两端起测序。所用引物如下。
正向：TTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTT(SEQ ID NO：16)
反向：TAAATAACGTCATGCATTACATGTT(SEQ ID NO：17)
将进行了序列确认的质粒1μl采用电穿孔法转化土壤杆菌(LBA4404)感受态细胞。悬浮于SOC培养基1ml，28℃培养1～2小时后，涂布于含50μg/ml卡那霉素和35μg/ml潮霉素的LB琼脂培养基，28℃培养1～2晚。
将生长出的CLCOL1/pDEST1/LBA4404的菌落用含50μg/ml卡那霉素和35μg/ml潮霉素的TB培养基2ml在28℃培养二晚。从培养液抽提质粒，测序。将带有经序列确认的质粒的土壤杆菌的菌落划线接种于含有50μg/ml卡那霉素和35μg/ml潮霉素的AB琼脂培养基。转化采用用土壤杆菌感染未熟胚的方法来进行。
将从未熟胚来源的愈伤组织再分化而来的个体用50mg/l的潮霉素进行选择，选择出转化体。将所得T0个体在温室中栽培，采集种子。
将采集到了T1、4系统以及作为对照使用的稻品种雪光的种子各播种56粒，10日后将切叶用100mg/l潮霉素进行检验。对于T1系统，选择潮霉素抗性的个体，将各系统的24个体定植于装入了稻用培养土的直径10.5cm、高8cm的乙烯树脂钵中，每一个个体一个乙烯树脂钵(对照的雪光均确认了潮霉素敏感性)。然后，栽培136天，对生长状况进行了观察(图7)。并且，对杆长、最大穗长、全穗重进行了测定(表2)。栽培结束后，从钵中拔出植株，对根的伸长状况进行了观察(图8)。
【表2】
表2：各系统的测定性状平均值
*通过t-检验检出显著差异的值
如图7所示，导入了CLCOL1基因的稻与对照的非转化的稻相比，地上部的生长明显良好。此外，如图8所示确认，根的生长也比对照的非转化稻明显良好。
如表2所示，所测定的杆长、最大穗长、全穗重这些性状，分别在导入了CLCOL1的4个系统中的3个系统、3个系统、2个系统中显示高于对照的雪光的值。
此外，作为生长特性，可以确认导入了CLCOL1的个体存在延迟出穗1～4星期左右的倾向。
工业实用性
本发明可以利用在粮食生产、沙漠绿化、植物育种、利用了生物质的燃料的开发、使用植物培养细胞制造医药品、功能性分子等有用物质等各种产业中。
Claims (15)
1.一种诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物的制造方法，其包括在植物中增加选自以下(a)或(b)中的任意基因的表达的步骤：
(a)编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
(b)由SEQ ID NO：2所示的碱基序列构成的基因。
2.权利要求1所述的诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物的制造方法，其中，上述增加基因的表达的步骤包括导入选自上述(a)或(b)中的基因，制作转化植物细胞的步骤。
3.权利要求2所述的诱导了根的伸长或增加了生物质的量的植物的制造方法，其还包括从上述植物细胞再生植物体的步骤。
4.一种诱导植物的根的伸长的方法，其包括增加选自以下的(a)或(b)中的任意基因的表达的步骤：
(a)编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
(b)由SEQ ID NO：2所示的碱基序列构成的基因。
5.一种增加植物的生物质的量的方法，其包括增加选自以下的(a)或(b)中的任意基因的表达的步骤：
(a)编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
(b)由SEQ ID NO：2所示的碱基序列构成的基因。
6.一种植物体的制造方法，其包括
准备增加了选自以下的(a)或(b)中的任意基因的表达的转化植物的步骤，和
在上述转化植物的后代植物中，测定(i)根的伸长、和/或(ii)生物质的量，选择该(i)根的伸长、和/或(ii)生物质的量显著提高的系统的步骤：
(a)编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
(b)由SEQ ID NO：2所示的碱基序列构成的基因。
7.选自以下的(a)或(b)中的基因：
(a)编码由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因；
(b)由SEQ ID NO：2所示的碱基序列构成的基因。
8.选自以下的(f)或(i)中的蛋白质：
(f)由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列构成的蛋白质；
(i)由权利要求7所述的基因编码的蛋白质。
9.包含权利要求7所述的基因的重组表达载体。
10.导入了权利要求7所述的基因或权利要求9所述的重组表达载体的细菌细胞、昆虫细胞或动物细胞。
11.导入了权利要求7所述的基因或权利要求9所述的重组表达载体的转化植物在诱导根的伸长或增加生物质的量方面的用途。
12.一种增加植物的根的伸长诱导或生物质的量的试剂，其含有权利要求7所述的基因或权利要求9所述的重组表达载体作为有效成分。
13.选自以下的(j)中的多核苷酸：
(j)由SEQ ID NO：3所述的碱基序列构成的多核苷酸。
14.具有权利要求13所述的多核苷酸作为启动子的重组表达载体。
15.导入了权利要求13所述的多核苷酸或权利要求14所述的重组表达载体的转化体。
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