KR101437409B1 - 현사시 유래의 ＰａｔｇＳＡＰ1 유전자, 상기 ＰａｔｇＳＡＰ1 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터의 제조방법, 상기 재조합 벡터를 이용한 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체 및 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체의 생산방법 - Google Patents

현사시 유래의 ＰａｔｇＳＡＰ1 유전자, 상기 ＰａｔｇＳＡＰ1 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터의 제조방법, 상기 재조합 벡터를 이용한 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체 및 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 나타내는 현사시 유래의 PatgSAP1 유전자, 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터의 제조방법, 상기 재조합 벡터를 이용한 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체 및 상기 재조합 벡터를 이용한 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체의 제조방법을 제공하고자 한다.

Description

현사시 유래의 ＰａｔｇＳＡＰ1 유전자, 상기 ＰａｔｇＳＡＰ1 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터의 제조방법, 상기 재조합 벡터를 이용한 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체 및 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체의 생산방법{A gene encoding PatgSAP1 protein from poplar(Populus alba × P. tremula var. glandulosa), a recombinant vector containing the PatgSAP1 gene, the methods for producing the recombinant vector containing the PatgSAP1 gene and the plants showing enhanced salt tolerance using the recombinant vector}
본 발명은 현사시(Populus alba × P. tremula var. glandulosa) 유래의 PatgSAP1 유전자, 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법, 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 염 스트레스(salt stress)에 대한 내성이 향상된 식물체 및 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체의 생산방법에 관한 것이다.
SAP(stress associated protein)는 A20 zinc finger domain과 AN1 zinc finger domain을 포함하는 단백질로, 모든 진핵생물에 존재하고 주로 동물의 면역반응과 관련된 기능이 잘 밝혀져 있다.
식물에서는 SAP 유전자군이 다양한 비생물적 스트레스에 반응하여 발현되는 것이 보고되었다(Vij and Tyagi, 2008, Functional & Integrative Genomics, 8, 301-307). SAP 단백질은 검은미루나무에서 19개, 토마토에서 14개, 벼에서 18개, 애기장대에서 14개가 보고 되었다(Jin et al, 2007, Genomics, 90, 265-275).
대부분의 SAP 단백질에는 아미노 말단에 A20 zinc finger domain과 카르복시 말단에 AN1 zinc finger domain이 존재한다. A20 zinc finger domain은 인간세포의 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF) 유도단백질(inducible protein)에서 처음 발견 되었고, 항세포자멸(anti-apoptosis)과 염증반응에 관여하는 nuclear factor kappa B (NFkB)의 활성을 억제시킴으로서 면역반응을 조절하는 역할을 한다(Verstrepen et al, 2010, Biochemical Pharmacology, 80, 2009- 2020).
AN1 zinc finger domain은 유비퀴틴(ubiquitin)을 인식하고 ubiquitination pathway에 관여한다고 알려져 있다 (Gilles et al, 2011, Plant Physiology and Biochemistry, 49, 303-310).
식물의 SAP는 AN1 zinc finger domain의 아미노산 서열을 바탕으로 2개의 type으로 나뉜다. Type I은 AN1 domain이 CX(2)CX(9,12)CX(1,2)CX(4)CX(2)HX(5)HXC의 구조를 갖는다. Type I은 다시 1개의 A20 domain과 1개의 AN1 domain을 갖는 형태와 A20 domain이 2개 존재하거나 없는 형태로 구분된다. Type Ⅱ는 AN1 domain이 CX(4)CX(9,12)CX(1,2)CX(4)CX(2)HX(5)HXC의 구조로, type I의 AN1 domain보다 더 확장된 구조를 갖는다. Type Ⅱ는 2개의 AN1 domain을 갖는다(Jin et al, 2007, Genomics, 90, 265-275).
식물의 SAP 유전자는 비생물적 스트레스에 반응하여 다양한 발현을 나타낸다. 애기장대의 SAP6과 벼의 SAP1, SAP11은 염과 건조, 저온 스트레스에 반응하여 발현이 2배 이상 증가하였고, 애기장대의 SAP12는 염과 저온 처리에 의해 발현이 증가하는 반면, 건조 처리에 의해서는 발현변화가 나타나지 않았다. 벼의 SAP16은 염 처리에 의해서만 발현이 2배 이상 증가하고 건조와 저온 처리에 의해서는 발현변화가 나타나지 않았다(Jin et al, 2007, Genomics, 90, 265-275).
식물의 SAP 유전자 형질전환 연구 사례를 살펴보면, 벼의 SAP1이 과발현된 담배는 염과 건조, 저온 스트레스에 대한 저항성이 증가하였다(Mukho padhyay et al, 2004, Plant Biology, 16, 6309-6314). 벼의 SAP11이 과발현된 애기장대는 염과 건조 스트레스에 대한 저항성이 증가하였다(Giri et al, 2011, New Phytologist, 191, 721-732). 옥수수의 SAP 유전자인 AN13이 과발현된 애기장대는 저온 저항성이 증가했지만 염과 건조 스트레스에 대해서는 오히려 민감해지는 결과를 보였다(Xuan et al, 2011, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 107, 101-112).
본 발명의 목적은 현사시(Populus alba × P. tremula var. glandulosa) 유래의 PatgSAP1 유전자, 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법, 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 염 스트레스(salt stress)에 대한 내성이 향상된 식물체 및 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체의 생산방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 지니는 현사시 유래의 PatgSAP1 유전자, 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법, 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 염 스트레스(salt stress)에 대한 내성이 향상된 식물체 및 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체의 생산방법을 제공할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 지니는 현사시 유래의 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 염 스트레스(salt stress)에 대한 내성이 향상된 식물체 및 상기 염 스트레스(salt stress)에 대한 내성이 향상된 식물체의 생산방법을 제공할 수 있다.
도 1a는 현사시(Populus alba × P. tremula var. glandulosa)에서 분리한 PatgSAP1 단백질, 검은미루나무의 SAP 단백질(PtAN118, PtAN119), 애기장대의 SAP 단백질(AtSAP2, AtSAP5), 벼의 SAP 단백질(OsSAP8, OsSAP4)들과의 다중 서열 정렬을 나타낸 것으로, 이때 다중 서열 비교는 ClustalW 프로그램을 사용하였다. 아미노 말단의 A20 zinc finger domain과 AN1 zinc finger domain은 박스로 표시하였다. PatgSAP1은 검은미루나무의 PtAN118과 98％의 아미노산 서열 상동성을 보이고 벼의 OsSAP8과는 71％, 애기장대의 AtSAP2와는 59％의 상동성을 보인다. 아미노산 서열 분석 결과, PatgSAP1은 SAP 패밀리 단백질에 속하며, 상기 그룹 멤버의 전형적인 특징 즉, 아미노 말단의 A20 zinc finger domain과 카르복시 말단의 AN1 zinc finger domain을 가지는 것으로 나타났다.
도 1b는 현사시(Populus alba × P. tremula var. glandulosa)에서 분리한 PatgSAP1 단백질과 검은미루나무의 SAP 유전자인 AN1 단백질 패밀리와의 유연관계를 비교한 PatgSAP1 단백질의 계통분석 결과이다. Phylogenetic tree는 Mega 4.1을 이용하여 작성하였다. 분기점(branches)의 숫자는 백분율로 표기된 부스트랩 값 (bootstrap value)이다. 부트스트랩 분석은 1,000반복으로 수행하였으며 값은 백분율로 나타내었다. 단백질 계통분석 결과, PatgSAP1은 type I에 속하고 검은미루나무의 PtAN118과 가장 높은 유연관계를 나타내었다.
도 2는 현사시의 염색체 DNA를 사용한 서던 블랏(Southern blot) 분석 결과를 나타낸 것으로서, 도 2에서 B는 BamHⅠ, E는 EcoRⅠ, H는 HindⅢ, X는 XbaⅠ을 의미한다.
도 3은 PatgSAP1 유전자의 조직 특이적 발현을 확인하기 위한 노던 블랏(northern blot) 분석 결과이다. 현사시의 잎, 줄기, 뿌리 및 꽃과 계대 후 배양 12일째의 세포로부터 total RNA를 분리하여 분석하였다. PatgSAP1은 배양세포에서 가장 높게 발현 되었고, 다음으로 잎과 꽃에서 높게 발현되는 반면 뿌리에서 가장 낮게 발현 되었다. 도 3에서 L는 잎(Leaf), S는 줄기(Shoot), R은 뿌리(Root), F는 꽃(Flower), SC는 Suspension cell을 의미한다.
도 4a 내지 도 4d는 현사시 현탁배양세포에서 다양한 조건에 따른 PatgSAP1 유전자의 발현 분석 결과로서, 도 4a는 현사시 현탁배양세포의 배양일(0일∼26일)에 따른 생장곡선을 나타낸 것이고, 도 4b는 현사시 현탁배양세포 생장곡선의 생장 단계별(4일∼24일) 현사시 PatgSAP1 유전자의 발현을 나타낸 것이고, 도 4c는 현사시 현탁배양세포에 아무런 처리를 하지 않은 것(Con), 현사시 현탁배양세포에 건조(250mM 만니톨, Man), 염(150mM 염화나트륨, NaCl), 저온(2℃, Cold), 앱시스산(25μM, ABA)을 각각 처리한 다음 2시간 및 10시간 진탕배양 후 PatgSAP1 유전자의 발현을 나타낸 것이고, 도 4d는 현사시 현탁배양세포를 앱시스산(20μM, ABA), 지베렐린(20μM, GA3), 자스몬산(10μM, JA), 살리실산(20μM, SA) 처리한 배지에서 배양한 다음 0.5시간 및 5시간에 각각 회수 후 현사시 배양세포에서의 PatgSAP1 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5c는 현사시 유래의 PatgSAP1 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 유전자를 포함하는 과발현 벡터 제작과 형질전환 현사시의 선발에 관한 것으로서, 도 5a는 PatgSAP1 유전자를 pBI121 벡터에 삽입하여 제작한 발현벡터의 유전자 지도이고, 도 5b는 형질전환하지 않은 현사시인 대조구(WT)의 genomic DNA PCR 결과 및 PatgSAP1 유전자를 도입한 형질전환 현사시의 genomic DNA PCR 결과이고, 도 5c는 형질전환하지 않은 현사시인 대조구(WT) 및 형질전환 현사시(PatgSAP1-OX)에 대한 PatgSAP1 유전자의 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
도 6a 내지 도 6c는 PatgSAP1 유전자의 발현억제를 위한 RNAi 벡터 제작과 형질전환 현사시의 선발에 관한 것으로서, 도 6a는 PatgSAP1-RNAi 벡터의 유전자 지도이고, 도 6b는 형질전환하지 않은 현사시인 대조구(WT)의 genomic DNA PCR 결과 및 PatgSAP1-RNAi 벡터를 도입한 형질전환 현사시의 genomic DNA PCR 결과이고, 도 6c는 형질전환하지 않은 현사시인 대조구(WT) 및 형질전환 현사시(PatgSAP1-RNAi)에 대한 PatgSAP1 유전자의 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
도 7a 내지 도 7b는 PatgSAP1의 발현이 억제된 형질전환 현사시의 염(salt) 스트레스 내성을 나타낸 것으로서 도 7a는 염 스트레스 처리 후의 PatgSAP1 유전자의 과발현 현사시(PatgSAP1-OX17), PatgSAP1 유전자의 발현억제 현사시(PatgSAP1-RNAi4), 그리고 형질전환하지 않은 대조구(WT) 현사시를 나타낸 것이고, 도 7b는 염 스트레스 처리에 따른 PatgSAP1 유전자의 과발현 현사시(PatgSAP1-OX17), PatgSAP1 유전자의 발현억제 현사시(PatgSAP1-RNAi4), 그리고 형질전환하지 않은 대조구(WT) 현사시의 엽록소 형광량(Fv/Fm)의 변화를 나타낸 것이다.
본 발명은 현사시 유래의 PatgSAP1 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터의 제조방법, 상기 재조합 벡터를 이용하여 염 내성이 향상된 식물체 및 염 내성이 향상된 식물체의 생산방법을 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 지니는 PatgSAP1 유전자를 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 지니는 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 나타낸다.
상기에서 재조합 벡터는 서열번호 1의 염기서열을 지니는 PatgSAP1 유전자를 포함하는 pH7GWICWG-PatgSAP1 RNAi 벡터이다.
상기에서 재조합 벡터는 PatgSAP1 유전자의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 지니는 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법을 나타낸다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 지니는 PatgSAP1 유전자를 서열번호 5의 1차 포워드 프라이머 및 서열번호 6의 1차 리버스 프라이머를 이용하여 1차 PCR 증폭하는 단계; 상기 1차 PCR 증폭 후 서열번호 7의 2차 포워드 프라이머 및 서열번호 8의 2차 리버스 프라이머를 이용하여 2차 PCR 증폭하는 단계; 상기 2차 증폭된 PCR 산물을 35S 프로머터와 하이그로마이신 표지를 포함하는 pH7GWICWG 벡터에 삽입하는 단계를 포함하는 서열번호 1의 염기서열을 지니는 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법을 나타낸다.
상기에서 1차 PCR 증폭은 Ex-Taq DNA 폴리머라아제(Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 사용하였으며 어닐링은 69℃에서 30초간, 연장은 72℃에서 30초간 수행하여 40 사이클의 증폭을 실시하였다.
상기에서 2차 PCR 증폭은 Ex-Taq DNA 폴리머라아제(Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 사용하였으며 어닐링은 69℃에서 30초간, 연장은 72℃에서 30초간 수행하여 40 사이클의 증폭을 실시하였다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 지니는 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 형질 전환시킨 식물체를 나타낸다.
상기에서 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 pH7GWICWG-PatgSAP1 RNAi 벡터이다.
상기에서 형질전환된 식물체는 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체를 나타낸다.
상기에서 형질전환된 식물체는 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 현사시일 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 지니는 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 형질전환시킨 식물체의 생산방법을 나타낸다.
상기에서 형질전환된 식물체의 생산방법에서의 식물체는 PatgSAP1 유전자의 발현을 억제시킨 pH7GWICWG-PatgSAP1 RNAi 재조합 벡터를 이용하여 염 스트레스(salt stress)에 대한 내성이 향상되도록 형질 전환시킨 식물체를 나타낸다.
상기에서 염 스트레스(salt stress)에 대한 내성이 향상되도록 형질 전환시킨 식물체는 현사시일 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 발명은 현사시 유래의 서열번호 1의 염기서열을 지니는 PatgSAP1 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합벡터, 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합벡터를 이용한 형질 전환시킨 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체 및 염 스트레스에 대한 내성 이 향상된 식물체의 생산방법을 나타낸다.
본 발명에 따른 PatgSAP1 단백질의 범위는 현사시에서 분리한 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.
상기의"기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％ 이상, 더 더욱 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 건조 스트레스 내성을 증진시키는 활성을 의미한다.
본 발명은 상기 현사시 유래의 PatgSAP1 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 PatgSAP1 단백질을 코딩하는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인위적인 합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA는 코딩(coding) 가닥 또는 넌코딩(non-coding) 가닥일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 현사시 유래의 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서, PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터는 바람직하게는 식물 발현 벡터이며, 더욱 바람직하게는 도5a 내지는 도6a에 기재된 재조합 벡터이나, 이에 제한되지 않는다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화 할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절요소(translation control element)를 가지는 것이다.
상기에서"재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
상기에서 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
본 발명의 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다.
본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CamV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
본 발명의 현사시 유래의 PatgSAP1 유전자, 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용하여 염 스트레스 내성이 향상된 식물체 및 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체의 생산방법에 대해 다양한 조건으로 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 상기에서 언급한 조건에 의해 현사시 유래의 PatgSAP1 유전자, 상기 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 이용하여 염 스트레스 내성이 향상된 식물체 및 염 스트레스에 대한 내성이 향상된 식물체의 생산방법을 제공하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명의 내용을 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실험예>
[1]실험 재료 및 방법
(1)식물 재료, 배양 조건 및 스트레스 처리
식물재료로 현사시 (Populus alba × P. tremula var. glandulosa)를 사용하였다 (Choi et al, 2001, Plant Biotechnology Journal, 3, 83-88). 250ml 삼각플라스크에 100ml의 액체배지를 분주한 다음 0.4g의 현탁배양세포를 넣고 130rpm, 22±1℃, 20μmol m2s-1의 광조건으로 현탁배양 하였다(Lee et al, 2005, Plant Science, 169, 1118-1124).
배지는 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Plant Physiology, 15, 473-497)에 2,4-D 1.0mg/L, NAA 0.1mg/L, 6-BAP 0.01mg/L 및 sucrose 3％가 첨가한 후 상기 배지를 1M NaOH 처리에 의해 배지의 pH를 5.8가 되도록 적정하고 121℃에서 15분간 고압증기멸균한 후 사용하였다.
현탁배양세포의 세포생장곡선 조사를 위해 계대 후 26일 동안 2일 간격으로 배양세포를 수거하여 생중량을 측정하였다(Lee et al, 2007, Plant Physiology, 131, 599-613). 조직특이성 분석을 위하여 잎, 줄기와 뿌리는 1년생 삽목묘로부터, 꽃은 25년생 나무로부터 채취하였다. 현탁배양세포는 계대 후 12일령을 사용하였다.
비생물적 스트레스에 대한 반응을 조사하기 위해 계대 5일령의 현탁배양세포에 만니톨(250 mM)과 염화나트륨(150 mM)을 첨가한 다음 2시간과 10시간 동안 진탕배양 하였다. 비생물적 스트레스와 관련된 식물호르몬인 앱시스산은 최종농도가 25μM이 되도록 처리하였다. 저온 처리는 현탁배양세포가 들어있는 삼각플라스크를 얼음이 들어있는 ice box에 꽂아 130rpm으로 진탕배양 하였으며, 이때 배지의 온도는 2℃이었다. 대조구는 스트레스 처리에 사용된 동일한 현탁배양세포를 아무런 처리 없이 2시간과 10시간 후에 각각 회수하였다.
식물생장조절물질 처리에 대한 반응을 조사하기 위해 살리실산(20μM), 앱시스산(20μM), 자스몬산(10μM) 및 지베렐린(20μM)을 각각 배양 배지에 첨가하고 0.5시간 및 5시간 후에 세포를 회수하였다. 대조구는 스트레스 처리에 사용된 동일한 현탁배양세포를 아무런 처리 없이 0.5시간과 5시간 후에 각각 회수하였다. 모든 현탁배양세포는 진공펌프를 이용하여 배지를 제거하고 액체질소에 얼린 다음 ??70℃에 보관하였다.
형질전환 현사시의 염 스트레스 내성을 조사하기 위해 식물체를 24±1℃, 50％ 상대 습도 및 16시간 광/8시간 암의 광주기에서 8주간 생장시켰다. 염 처리는 150 mM 염화나트륨 용액을 24시간 동안 처리하였다. 염 스트레스에 대한 형질전환 현사시의 내성은 엽록소 형광량을 측정하여 확인하였다. 엽록소 형광량은 Poket PEA Chlorophyll Fluorimeter (Hansatech, England)로 측정하였다.
(2)유전자의 분리 및 염기서열 분석
현사시의 현탁배양세포 유래의 EST(expressed sequence tag) 분석(Lee et al, 2005, Plant Science, 169, 1118-1124)을 통하여 식물에서 보고된 SAP 유전자와 상동성을 보이는 cDNA 클론을 선발하였다.
선발된 cDNA 클론의 염기서열을 결정한 다음 Vector NTI advance 10.0 (Invitrogen, USA)을 이용하여 예상 아미노산 서열과 분자량 등을 조사하였다.
단백질의 상동성 분석은 Uniprot program (http://www.uniprot.org/align/)으로 ClustalW algorithm을 사용하여 실시하였다. Phylogenetic tree는 MEGA4.1 (beta)을 사용하여 NJ method로 작성하였다.
(3)Genomic DNA 및 total RNA의 분리
완전히 전개된 현사시의 잎으로부터 MagaExtractor plant genome (Toyobo Co, Japan)을 이용하여 사용자 매뉴얼에 따라 genomic DNA를 분리하였다. Total RNA는 현탁배양세포 또는 잎에 액체질소를 붓고 유발로 간 후 TRI Reagent (Molecular Research Center, USA)를 이용하여 사용자 매뉴얼에 따라 분리하였다.
(4)Southern blot 및 northern blot 분석
10㎍의 현사시 genomic DNA를 제한효소 BamHI, EcoRI, HindIII 및 XbaI으로 완전히 절단한 다음 에탄올 침전 방법으로 회수하였다. 제한효소로 절단된 genomic DNA를 1％ agarose gel에서 전기영동하고 capillary transfer 방법으로 Hybond-XL nylon membrane (Amersham-Pharmacia Biotech Inc, UK)에 전이시켰다.
Total RNA 10㎍을 1.2％ formaldehyde agarose gel로 전기영동한 다음 capillary transfer 방법을 이용하여 Hybond-XL nylon membrane에 전이시켰다.
Probe로 사용할 cDNA의 방사능 표식을 위하여 Multiprime labelling kit (Amersham Co, USA)를 이용하여 사용자 매뉴얼에 따라 반응시켰다. Membrane을 10 ml의 1× PerfectHYB plus hybridization buffer (Sigma, USA)에 넣고 68℃에서 1시간 동안 전처리 하였다. α-32P로 표식된 현사시의 SAP1 (PatgSAP1) cDNA를 5분간 끓여 변성시킨 후 얼음에 냉각시켰다. 변성된 probe를 hybridization 반응액에 첨가하고 68℃에서 12시간 동안 hybridization을 실시하였다. 반응이 끝난 membrane은 0.2× SSC-0.1％ SDS 용액으로 65℃에서 15분간 3회 세정하였다. Membrane을 X-ray 필름에 부착한 다음 -70℃에서 3일간 노출시킨 후 현상하였다.
(5)형질전환 벡터 제작과 현사시의 형질전환
PatgSAP1 유전자의 과발현 벡터 제작을 위해 정방향 프라이머 (5'- GAATCTAGAGGATCCACTTTTGAGAAGATG-3'; 서열번호 3)와 역방향 프라이머 (5'-ATAAACAATGAGCTCAGTCCATGGC-3'; 서열번호 4)를 사용하여 PCR 증폭하였다.
PCR 증폭은 Ex-Taq DNA 폴리머라아제(Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 사용하였으며 어닐링은 60℃에서 30초간, 연장은 72℃에서 1분간 수행하여 40 사이클의 증폭을 실시하였다. PCR 산물은 1.0％ 아가로스 젤에서 분리하였다.
분리한 PCR 산물은 UltraClean 15 DNA purification Kit(MoBio, Korea)를 이용하여 사용자 매뉴얼에 따라 정제하고, pGEM-T easy 벡터(Promega, USA)에 서브클로닝 하였다. PatgSAP1의 삽입이 검증된 plasmid DNA를 제한효소 XbaI과 SacI으로 완전히 절단한 후 1.0％ 아가로스 젤에서 전기영동하고 분리하였다. 분리한 단편을 UltraClean 15 DNA purification Kit(MoBio, Korea)를 사용하여 정제한 다음 pBI121 벡터의 XbaI/SacI 위치에 삽입하여 PatgSAP1 과발현 벡터인 pBI121-PatgSAP1을 제작하였다.
PatgSAP1 유전자의 RNAi 발현억제 벡터 제작을 위해 Gateway system (Invitrogen, CA)을 이용하였다 (Shahinul Islam et al, 2005, Plant Biotechnology, 22, 443-446; Higuchi et al, Journal of Plant Research, 2009, 122, 477-482). SAP1_attB1 프라이머(5'-AAAAAGCAGGCTTATCGGACTGCTGCTCG-3'; 서열번호 5)와 SAP1_attB2 프라이머(5'-AGAAAGCTGGGTCACACTTAAACCAGGACGC-3'; 서열번호 6)를 사용하여 1차 PCR 증폭을 수행하였다. 1차 PCR 증폭은 Ex-Taq DNA 폴리머라아제(Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 사용하였으며 어닐링은 69℃에서 30초간, 연장은 72℃에서 30초간 수행하여 40 사이클의 증폭을 실시하였다. attB1 adaptor 프라이머(5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'; 서열번호 7)와 attB2 adaptor 프라이머(5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'; 서열번호 8)를 사용하여 2차 PCR 증폭을 수행하였다. 2차 PCR 증폭은 Ex-Taq DNA 폴리머라아제(Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 사용하였으며 어닐링은 69℃에서 30초간, 연장은 72℃에서 30초간 수행하여 40 사이클의 증폭을 실시하였다. 증폭된 PCR 산물을 35S 프로모터와 하이그로마이신 표지를 포함하고 있는 pH7GWICWG 벡터에 삽입하여 pH7GWICWG-PatgSAP1 RNAi 벡터를 제작 하였다.
PatgSAP1의 과발현 벡터와 RNAi 발현억제 벡터를 각각 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 도입한 다음 현사시의 형질전환을 위한 표준실험방법(Noh et al, 1994, Res Rep For Gen Res Inst Kor, 30, 114-120; Kim et al, 2011, Plant Biotecchnology Journal, 9, 334-347)에 따라 형질전환시켰다.
형질전환된 현사시의 절간조직으로부터 캘러스를 유도하고 PatgSAP1 과발현 현사시는 카나마이신에서, RNAi 발현억제 현사시는 하이그로마이신에서 선발된 캘러스를 줄기 유도배지로 옮겨 재분화를 유도한 다음 뿌리 유도배지로 옮겨 뿌리를 유도하였다. 캘러스 유도배지는 MS 배지 4.4g, 2,4-D 1㎎/L, NAA 0.1㎎/L, BA 0.01mg/L, sucrose 3％를 첨가하고 pH 5.8로 적정하였다. 줄기 유도배지는 WPM 2.46g, Zeatin 1/L, BAP 0.1㎎/L, NAA 0.01㎎/L, sucrose 3％를 첨가하고 pH 5.5로 적정하였다. 뿌리 유도배지는 MS 배지 4.4g, IBA 0.2㎎/L, sucorse 3％를 첨가하고 pH 5.8로 적정하였다.
형질전환 여부는 genomic DNA PCR 분석을 통하여 확인하였다.
과발현 현사시의 검증에는 정방향 프라이머(5'-TGCTTCACAAACCAAGGCAAGTAAT-3'; 서열번호 9) 와 역방향 프라이머(5'-TCACGAGCAGCAGTCCGATAA-3'; 서열번호 10)를 사용하였다. PCR 반응은 Ex-Taq DNA 폴리머라아제(Takara, Otsu, Shiga, Japan)에 35S 프로모터의 일부서열을 지니는 서열번호 9의 포워드 프라이머와 PatgSAP1 유전자의 일부서열을 지니는 서열번호 10의 리버스 프라이머를 각각 10μM 첨가하고, PatgSAP1 유전자가 도입된 현사시의 genomic DNA 또는 형질전환하지 않은 현사시(WT)의 genomic DNA 100 pg을 포함하는 총 부피 50㎕로 수행하였다. PCR 증폭은 98℃에서 5분 후 98℃에서 30초, 60℃에서 30초 72℃에서 1분간의 35 사이클 동안 자동 써머 사이클러(Biometra, Germany)에서 수행하였다. PCR 산물은 1.0％ 아가로스 젤에 전기영동하고 UV 광에서 시각화하였다.
RNAi 발현억제 현사시의 검증에는 정방향 프라이머(5'-AGGTCACTGGATTTTGGTTTTAGG-3'; 서열번호 11)와 역방향 프라이머(5'-CCCACTAAGCGTGACCAGATAAAC-3'; 서열번호 12)를 사용하였다. PCR 반응은 Ex-Taq DNA 폴리머라아제(Takara, Otsu, Shiga, Japan)에 35S 프로모터의 일부서열을 지니는 서열번호 11의 포워드 프라이머와 PatgSAP1 유전자의 일부서열을 지니는 서열번호 12의 리버스 프라이머를 각각 10μM 첨가하고, pH7GWICWG-PatgSAP1 RNAi 벡터가 도입된 현사시의 genomic DNA 또는 형질전환하지 않은 현사시(WT)의 genomic DNA 100 pg을 포함하는 총 부피 50㎕로 수행하였다. PCR 증폭은 98℃에서 5분 후 98℃에서 30초, 60℃에서 30초 72℃에서 1분간의 35 사이클 동안 자동 써머 사이클러(Biometra, Germany)에서 수행하였다. PCR 산물은 1.0％ 아가로스 젤에 전기영동하고 UV 광에서 시각화하였다.
PatgSAP1 과발현 현사시와 RNAi 발현억제 현사시에서의 PatgSAP1 유전자의 발현을 확인하기 위하여 quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)을 실시하였다. qRT-PCR 분석에는 PatgSAP1 유전자에 특이적인 정방향 프라이머(5'-TCTCCACAGAACCATCCACTGC-3'; 서열번호 13)와 역방향 프라이머(5'-TCACGAGCAGCAGTCCGATAA-3'; 서열번호 14)를 사용하였다. qRT-PCR을 위해서 형질전환 현사시 및 형질전환하지 않는 현사시(WT)의 total RNA 1㎍을 주형으로 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara, Japan)를 사용하여 사용자 매뉴얼에 따라 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. qRT-PCR 반응은 첫 번째 가닥 cDNA 반응 생성물 전체 10㎕ 중 2㎕, 유전자 특이적 프라이머 10μM 및 SYBR Premix EX Taq II(Takara, Japan) 10㎕을 포함하는 총 부피 20㎕를 이용하여 수행하였다. qRT-PCR 증폭은 95℃에서 3분 후 95℃에서 10초, 60℃에서 10초 72℃에서 30초간의 40 사이클 동안 Multi-color Real-time PCR System CFX96(Bio-Rad, USA)에서 수행하였다. PCR 산물은 1.0％ 아가로스 젤에 전기영동하고 UV 광에서 시각화하였다. 인터널컨트롤 유전자로서 액틴의 정방향 프라이머(5'-CATCCAGGCTGTCCTTTCCC-3'; 서열번호 15)와 역방향 프라이머(5'-AACGAAGGATGGCGTGTGG-3'; 서열번호 16)를 사용하였다.
[2]결과
상기 [1]실험재료 및 방법에서의 결과를 도 1a 내지 도 7b에 나타내었다.
도 1a는 현사시(Populus alba × P. tremula var. glandulosa)에서 분리한 PatgSAP1 단백질, 검은미루나무의 SAP 단백질(PtAN118, PtAN119), 애기장대의 SAP 단백질(AtSAP2, AtSAP5), 벼의 SAP 단백질(OsSAP8, OsSAP4)들과의 다중 서열 정렬을 나타낸 것으로, 이때 다중 서열 비교는 ClustalW 프로그램을 사용하였다. 아미노 말단의 A20 zinc finger domain과 AN1 zinc finger domain은 박스로 표시하였다. PatgSAP1은 검은미루나무의 PtAN118과 98％의 아미노산 서열 상동성을 보이고 벼의 OsSAP8과는 71％, 애기장대의 AtSAP2와는 59％의 상동성을 보인다. 아미노산 서열 분석 결과, PatgSAP1은 SAP 패밀리 단백질에 속하며, 상기 그룹 멤버의 전형적인 특징 즉, 아미노 말단의 A20 zinc finger domain과 카르복시 말단의 AN1 zinc finger domain을 가지는 것으로 나타났다.
도 1b는 현사시(Populus alba × P. tremula var. glandulosa)에서 분리한 PatgSAP1 단백질과 검은미루나무의 SAP 유전자인 AN1 단백질 패밀리와 유연관계를 비교한 PatgSAP1 단백질의 계통분석 결과이다. Phylogenetic tree는 Mega 4.1을 이용하여 작성하였다. 분기점(branches)의 숫자는 백분율로 표기된 부스트랩 값 (bootstrap value)이다. 부트스트랩 분석은 1,000반복으로 수행하였으며 값은 백분율로 나타내었다. 단백질 계통분석 결과, PatgSAP1은 type I에 속하고 검은미루나무의 PtAN118과 가장 높은 유연관계를 나타내었다.
도 2는 현사시의 염색체 DNA를 사용한 서던 블랏(Southern blot) 분석 결과를 나타낸 것으로서, 현사시의 염색체 DNA를 사용한 Southern blot 분석 결과 PatgSAP1 유전자가 현사시의 염색체에 1∼2 copy로 존재하였다. 한편 도 2에서 B는 BamHⅠ, E는 EcoRⅠ, H는 HindⅢ, X는 XbaⅠ을 의미한다.
도 3은 PatgSAP1 유전자의 조직 특이적 발현을 확인하기 위한 노던 블랏(northern blot) 분석 결과이다. 현사시의 잎, 줄기, 뿌리 및 꽃과 계대 후 배양 12일째의 세포로부터 total RNA를 분리하여 분석하였다. PatgSAP1은 배양세포에서 가장 높게 발현 되었고, 다음으로 잎과 꽃에서 높게 발현되는 반면 뿌리에서 가장 낮게 발현 되었다. 도 3에서 L는 Leaf, S는 Shoot, R은 Root, F는 Flower, SC는 Suspension cell을 의미한다.
도 4a 내지 도 4d는 현사시 현탁배양세포에서 다양한 조건에 따른 PatgSAP1 유전자의 발현 분석 결과로서, 도 4a는 현사시 현탁배양세포의 배양일(0일∼26일)에 따른 생장곡선을 나타낸 것이고, 도 4b는 현사시 현탁배양세포 생장곡선의 생장 단계별(4일∼24일) 현사시 PatgSAP1 유전자의 발현을 나타낸 것이고, 도 4c는 현사시 현탁배양세포에 아무런 처리를 하지 않은 것(Con), 현사시 현탁배양세포에 건조(250mM 만니톨, Man), 염(150mM 염화나트륨, NaCl), 저온(2℃, Cold), 앱시스산(25μM, ABA)을 각각 처리한 다음 2시간 및 10시간 진탕배양 후 PatgSAP1 유전자의 발현을 나타낸 것이고, 도 4d는 현사시 현탁배양세포를 앱시스산(20μM, ABS), 지베렐린(20μM, GA3), 자스몬산(10μM, JA), 살리실산(20μM, SA) 처리한 배지에서 배양한 다음 0.5시간 및 5시간에 각각 회수 후 현사시 배양세포에서의 PatgSAP1 유전자의 발현을 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5c는 PatgSAP1 유전자의 과발현 벡터 제작과 형질전환 현사시의 선발에 관한 것으로서, 도 5a는 PatgSAP1 유전자를 pBI121 벡터에 삽입하여 제작한 발현벡터의 유전자 지도이고, 도 5b는 PatgSAP1 유전자를 도입한 형질전환 현사시의 genomic DNA PCR 결과 및 형질전환하지 않은 현사시인 대조구(WT)의 genomic DNA PCR 결과이고, 도 5c는 형질전환하지 않은 현사시인 대조구(WT) 및 형질전환 현사시(PatgSAP1-OX)에 대한 PatgSAP1 유전자의 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
PatgSAP1 유전자의 과발현 벡터를 제작한 다음 현사시에 형질전환 하였다. PatgSAP1 유전자의 도입 여부는 genomic DNA PCR을 통해 확인하였다. 그 결과 PatgSAP1 유전자 증폭산물이 형질전환하지 않은 대조구(WT)에서는 관찰되지 않은 반면 형질전환된 현사시 (PatgSAP1-OX)에서는 증폭산물이 나타나 형질전환이 정상적으로 이루어졌음을 확인하였다. 형질전환 현사시에서 PatgSAP1 유전자의 발현수준을 qRT-PCR로 확인한 결과, 대조구에 비하여 형질전환 현사시에서 PatgSAP1 유전자의 발현이 30∼150배 이상 증가하였다.
도 6a 내지 도 6c는 PatgSAP1 유전자의 발현억제를 위한 RNAi 벡터 제작과 형질전환 현사시의 선발에 관한 것으로서, 도 6a는 PatgSAP1-RNAi 벡터의 유전자 지도이고, 도 6b는 형질전환하지 않은 현사시인 대조구(WT)의 genomic DNA PCR 결과 및 PatgSAP1-RNAi 벡터를 도입한 형질전환 현사시의 genomic DNA PCR 결과이고, 도 6c는 형질전환하지 않은 현사시인 대조구(WT) 유전자의 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과 및 형질전환 현사시에서 PatgSAP1 유전자의 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과이다.
PatgSAP1-RNAi 벡터를 제작한 다음 현사시에 형질전환 하였다. 벡터의 도입 여부는 genomic DNA PCR을 통해 확인하였다. 그 결과 증폭산물이 형질전환하지 않은 대조구 (WT) 에서는 관찰되지 않은 반면 형질전환된 현사시 (PatgSAP1-RNAi)에서는 증폭산물이 나타나 형질전환이 정상적으로 이루어졌음을 확인하였다. 형질전환 현사시에서 PatgSAP1 유전자의 발현수준을 qRT-PCR로 확인한 결과, 대조구에 비하여 PatgSAP1-RNAi 4번에서의 PatgSAP1 유전자 발현이 약 80％ 감소하였다.
도 7a 내지 도 7b는 PatgSAP1의 발현이 억제된 형질전환 현사시의 염(salt) 스트레스 내성을 나타낸 것으로서 도 7a는 염 스트레스 처리 후의 PatgSAP1 유전자 과발현 현사시(PatgSAP1-OX17), PatgSAP1 유전자 발현억제 현사시(PatgSAP1-RNAi4), 그리고 형질전환하지 않은 대조구(WT) 현사시를 나타낸 것이고, 도 7b는 염 스트레스 처리에 따른 PatgSAP1 유전자 과발현 현사시(PatgSAP1-OX17), PatgSAP1 유전자 발현억제 현사시(PatgSAP1-RNAi4), 그리고 형질전환하지 않은 대조구(WT) 현사시의 엽록소 형광량(Fv/Fm)의 변화를 나타낸 것이다.
염 스트레스 내성 확인 결과, 과발현 형질전환 현사시와 대조구는 고사하였으나 PatgSAP1의 발현이 억제된 현사시는 정상적으로 생장을 유지하여 염 스트레스에 강한 내성을 나타내었다. 엽록소 형광량을 조사한 결과에서도 과발현 현사시와 대조구는 식물체의 고사로 인해 처리 2∼3일 이후 엽록소 형광량이 0을 나타내었으나 PatgSAP1의 발현이 억제된 현사시는 정상수준인 0.7∼0.8의 엽록소 형광량을 유지하였다. 따라서 PatgSAP1 발현억제 현사시가 염 스트레스에 내성을 보이는 것을 확인하였다.
상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실험예를 참조하여 설명하였지만 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 지니는 현사시 유래의 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 염 스트레스(salt stress)에 대한 내성이 향상된 식물체를 제공할 수 있는 효과가 있어 식물 관련 산업의 발전에 기여할 수 있어 산업상 이용가능성이 있다.
<110> THE REPUBLIC OF KOREA (FORESTRY ADMINISTRATION FORESTRY RESEARCH INSTITUTE) <120> A gene encoding PatgSAP1 protein from poplar(Populus alba x P. tremula var. glandulosa), a recombinant vector containing the PatgSAP1 gene, the methods for producing the recombinant vector containing the PatgSAP1 gene and the plants showing enhanced salt tolerance using the recombinant vector <130> 9002 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1056 <212> DNA <213> Populus alba x P. tremular var. glandulosa <220> <221> gene <222> (174)..(683) <223> Open reading frame <220> <221> gene <222> (162)..(698) <223> Fragment for overexpressed construct <220> <221> gene <222> (612)..(759) <223> Fragment for RNAi construct <400> 1 accaccgaaa ataacccaat ctctctccgt ctcccttcct ctttctctgg tctcgatttc 60 ttcgatataa cccacgattg attctatctc tttgattaag cttgatagaa actacctggt 120 tcgattttgt tagtcaagat cggccagaat tattaaagag gacttttgag aagatggagt 180 ctcatgatga gactggatgc caagctccag agggccccat cctctgcatt aacaactgtg 240 gcttctttgg aagtgctgct acaatgaaca tgtgttccaa gtgccacaag gacatcatcc 300 tgaaccagca acaagcccaa ctggcagcat catccattga aagcattgtg aatggaaact 360 ctagcgggaa tggaaaagaa cctgtggttg ctggtgccgt tgatgtacaa gctgcacctg 420 tagaggtgaa aatcatctcc acagaaccat ccactgcttc aagcaagcct tctgagatga 480 aggcaaatga gggacccagt aggtgtaccg cttgccgaaa gcgtgttggt ttaacagggt 540 tcggttgtag atgtggagac ctgttctgtg caattcatcg ttactctgac aagcatgact 600 gcccctttga ttatcggact gctgctcgtg atgctattgc taaagccaac ccagttgtca 660 aggcagagaa gcttgataag atctaagtgc catggactga agtgattgtt tatgtaatca 720 agtatgattc ttctccttct gtccatgcgt cctggtttaa gtgtggcagc tttgtcctgt 780 ctagtgtcct tcattgataa aaatggttca gggcatgata ggacattgtc acagtccaag 840 gaactttata tttctagttg attggcgagg attccattgt tagctccagt gtgcaagtct 900 ttatttgtgt tggtttgtgg acatcgttat gggttacttt gtcatgttat ttgctggttg 960 gtacgcgttt ctttctggta ttgcatggaa aattgatctg ccccaatgca tatatgtgta 1020 catttttcag ttgttcataa aaaaaaaaaa aaaaaa 1056 <210> 2 <211> 170 <212> PRT <213> Populus alba x P. tremular var. glandulosa <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(170) <223> amino acid sequence of PatgSAP1 <400> 2 Met Glu Ser His Asp Glu Thr Gly Cys Gln Ala Pro Glu Gly Pro Ile 1 5 10 15 Leu Cys Ile Asn Asn Cys Gly Phe Phe Gly Ser Ala Ala Thr Met Asn 20 25 30 Met Cys Ser Lys Cys His Lys Asp Ile Ile Leu Asn Gln Gln Gln Ala 35 40 45 Gln Leu Ala Ala Ser Ser Ile Glu Ser Ile Val Asn Gly Asn Ser Ser 50 55 60 Gly Asn Gly Lys Glu Pro Val Val Ala Gly Ala Val Asp Val Gln Ala 65 70 75 80 Ala Pro Val Glu Val Lys Ile Ile Ser Thr Glu Pro Ser Thr Ala Ser 85 90 95 Ser Lys Pro Ser Glu Met Lys Ala Asn Glu Gly Pro Ser Arg Cys Thr 100 105 110 Ala Cys Arg Lys Arg Val Gly Leu Thr Gly Phe Gly Cys Arg Cys Gly 115 120 125 Asp Leu Phe Cys Ala Ile His Arg Tyr Ser Asp Lys His Asp Cys Pro 130 135 140 Phe Asp Tyr Arg Thr Ala Ala Arg Asp Ala Ile Ala Lys Ala Asn Pro 145 150 155 160 Val Val Lys Ala Glu Lys Leu Asp Lys Ile 165 170 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence for PatgSAP1-OX <400> 3 gaatctagag gatccacttt tgagaagatg 30 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence for PatgSAP1-OX <400> 4 ataaacaatg agctcagtcc atggc 25 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence for PatgSAP1-RNAi <400> 5 aaaaagcagg cttatcggac tgctgctcg 29 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence for PatgSAP1-RNAi <400> 6 agaaagctgg gtcacactta aaccaggacg c 31 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence for PatgSAP1-RNAi <400> 7 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence for PatgSAP1-RNAi <400> 8 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence of PatgSAP1-OX for genomic PCR <400> 9 tgcttcacaa accaaggcaa gtaat 25 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence of PatgSAP1-OX for genomic PCR <400> 10 tcacgagcag cagtccgata a 21 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence of PatgSAP1-RNAi for genomic PCR <400> 11 aggtcactgg attttggttt tagg 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence of PatgSAP1-RNAi for genomic PCR <400> 12 cccactaagc gtgaccagat aaac 24 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence for qRT-PCR <400> 13 tctccacaga accatccact gc 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence for qRT-PCR <400> 14 tcacgagcag cagtccgata a 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Actin-qRT-F <400> 15 catccaggct gtcctttccc 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Actin-qRT-R <400> 16 aacgaaggat ggcgtgtgg 19

Claims (11)

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  6. 서열번호 1의 염기서열을 지니는 PatgSAP1 유전자를 서열번호 5의 1차 포워드 프라이머 및 서열번호 6의 1차 리버스 프라이머를 이용하여 1차 PCR 증폭하는 단계;
    상기 1차 PCR 증폭 후 서열번호 7의 2차 포워드 프라이머 및 서열번호 8의 2차 리버스 프라이머를 이용하여 2차 PCR 증폭하는 단계;
    상기 2차 증폭된 PCR 산물을 35S 프로머터와 하이그로마이신 표지를 포함하는 pH7GWICWG 벡터에 삽입하는 단계를 포함하는 서열번호 1의 염기서열을 지니는 PatgSAP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    1차 PCR 증폭과 2차 PCR 증폭은 Ex-Taq DNA 폴리머라아제(Takara, Otsu, Shiga, Japan)를 사용하여 어닐링은 69℃에서 30초간, 연장은 72℃에서 30초간 수행하여 40 사이클로 증폭하고 증폭된 PCR 산물을 35S 프로머터와 하이그로마이신 표지를 포함하는 pH7GWICWG 벡터에 삽입 시키는 방법을 이용한 재조합 벡터의 제조방법.
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