CN101395270B - 根伸长增强的植物及其产生方法 - Google Patents

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Abstract

本发明主要公开了：通过应用遗传工程技术使根的伸长增强的植物；即使在高渗透压胁迫下其根的伸长能力仍不受抑制的植物；用于增强植物根伸长的方法；等等。通过应用遗传工程技术来制备转基因植物，其表达源自野生型西瓜(Citrullus lanatus)的Ran蛋白。

Description

根伸长增强的植物及其产生方法
技术领域
本发明涉及促进植物根伸长的多肽、阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的多肽以及编码它们的多核苷酸。本发明还涉及根伸长增强的植物、即使在高渗胁迫下根伸长能力仍不被抑制的植物以及产生它们的方法。另外，本发明还涉及用于增强植物根伸长的方法。
背景技术
地球正面临如全球变暖和沙漠化的严重问题。近年来，全球人口的迅速增长、由于异常天气导致的农作物产量降低等已引起人们对重大的世界性食品危机的关注。人们认为通过改善农作物生长和林木生长来提高生产力是解决这些问题的可能有效的策略之一。
已开发并在实践中应用了化肥、农药等用于改善植物生长。然而，考虑到它们对植物本身的影响及其对人体的影响，必须限制化肥和农药的用量。特别是在农作物的栽培中，为了减少对人体的不良影响，已越来越多地应用无农药栽培，甚至不惜降低生产力。
作为不使用化肥或农药而改善植物生长的技术，已报道了应用遗传工程增强植物根伸长的若干方法。例如，非专利文献1报道了在植物中过表达细胞周期蛋白基因会导致根伸长增强以及地上部分生长增强。
已知Ran蛋白是植物中参与重要细胞现象的因子，所述细胞现象如核膜介导的蛋白质转运、有丝分裂过程中的微管形成、细胞周期调控等。近年来有报道称，将小麦来源的Ran基因引入水稻或拟南芥使得根伸长被抑制(参见非专利文献2)。基于此，认为将Ran基因引入植物对植物生长产生不利的影响。
此外，尽管已公知植物根在干燥土壤、高盐土壤等之中经受高渗胁迫，其伸长因此受到抑制，但是尚不知道在此高渗胁迫下使根稳定伸长的方法。
非专利文献1：Doerner et al.，(1996)Nature，380：520-523
非专利文献2：Non-Patent Document2：Xin Wang et al.，(2006)PlantPhysiology，140：91-101
发明内容
本发明待解决的问题
本发明是基于上述背景技术而产生的，其目的之一是提供改善农作物生长、林木生长等的技术。更具体地，本发明的一些主要目的是应用遗传工程技术来提供根伸长增强的植物、即使在高渗胁迫下其根伸长能力仍不受抑制的植物以及增强植物根伸长的方法等。
解决所述问题的方法
本发明人为解决上述问题而进行了深入的研究，发现野生西瓜(Citrullus lanatus；以下称为“野生西瓜”，其生长于博茨瓦纳共和国附近的非洲喀拉哈里沙漠中)的Ran蛋白可以促进根伸长，并发现人工表达来源于野生西瓜的Ran基因的植物根伸长增强。与野生型相比，这些植物表现出在高渗胁迫下根伸长受到的抑制较小，以及在高渗胁迫下具有极好的生长能力。本发明人基于这些发现进行进一步的研究以改进所述技术并完成本发明。
具体地，本发明提供了以下方面的发明：
第1项.包含以下(a)或(b)的DNA的多核苷酸：
(a)由SEQ ID NO:1或2所示碱基序列组成的DNA；或者
(b)在严格条件下与和由SEQ ID NO：1或2碱基序列所组成DNA互补的DNA杂交的DNA，其编码具有以下活性的蛋白质，即增强植物根伸长的活性和阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的活性。
第2项.编码以下(c)、(d)或(e)中任何多肽的多核苷酸：
(c)由SEQ ID NO：3或4所示氨基酸序列组成的多肽；
(d)由SEQ ID NO：3或4所示氨基酸序列组成并且其中一个或若干个氨基酸被替换、缺失或添加的多肽，所述多肽具有增强植物根伸长的活性以及阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的活性；或者
(e)与SEQ ID NO：3或4所示氨基酸序列具有不低于70％的同源性的多肽，并且所述多肽具有增强植物根伸长的活性以及阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的活性。
第3项.以下(c)、(d)或(e)中任何多肽：
(c)由SEQ ID NO：3或4所示氨基酸序列组成的多肽；
(d)由SEQ ID NO：3或4所示氨基酸序列组成的多肽，其中一个或若干个氨基酸被替换、缺失或添加，并且所述多肽具有增强植物根伸长的活性；或者
(e)与SEQ ID NO：3或4所示氨基酸序列具有不低于70％的同源性的多肽，并且所述多肽具有增强植物根伸长的活性。
第4项.包含第1项的多核苷酸的重组载体。
第5项.用第1项的多核苷酸转化的转基因植物。
第6项.用于产生根伸长增强的植物的方法，其包括用第1项的多核苷酸转化植物的步骤。
第7项.用于产生在高渗胁迫下根伸长不受抑制的植物的方法，其包括将第1项的多核苷酸引入植物细胞的步骤。
第8项.用于增强植物根伸长的方法，其包括将第1项的多核苷酸引入植物细胞。
第9项.用于增强植物根伸长的试剂，其包含第1项的多核苷酸。
第10项.根据第9项的用于增强植物根伸长的试剂，所述多核苷酸以第4项的重组载体的形式包含于其中。
第11项.第1项的多核苷酸用于增强植物根伸长的用途。
第12项.根据第11项的用途，其中所述多核苷酸以第4项的重组载体的形式使用。
第13项.第1项的多核苷酸用于产生增强植物根伸长的试剂的用途。
第14项.根据第13项的用途，其中所述多核苷酸以第4项的重组载体的形式使用。
第15项.用于增强植物根伸长的试剂，其包含第3项的多肽。
第16项.第3项的多肽用于增强植物根伸长的用途。
第17项.第3项的多肽用于产生增强植物根伸长的试剂的用途。
第18项.用于阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的方法，其包括将第1项的多核苷酸引入植物。
第19项.用于在高渗胁迫下支持植物根生长的试剂，其包含第1项的多核苷酸。
第20项.根据第19项的用于支持植物根生长的试剂，其包含以第4项的重组载体的形式存在的所述多核苷酸。
第21项.第1项的多核苷酸用于阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的用途。
第22项.根据第20项的用途，其中所述多核苷酸以第4项的重组载体的形式使用。
第23项.第1项的多核苷酸用于产生在高渗胁迫下支持植物根生长的试剂的用途。
第24项.根据第23项的用途，其中所述多核苷酸以第4项的重组载体的形式使用。
第25项.用于在高渗胁迫下支持植物根生长的试剂，其包含第3项的多肽。
第26项.第3项的多肽用于阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的用途。
第27项.第3项的多肽用于产生支持植物根生长的试剂的用途。
第28项.用于产生根伸长增强的植物或者在高渗胁迫下根伸长不受抑制的植物的试剂盒，所述试剂盒包含第4项的重组载体。
本发明的效果
本发明的转基因植物的根伸长增强，并因此与所述野生型相比能够在低水位条件下生长得更好。
而且，本发明的转基因植物在高渗胁迫条件下根伸长不受抑制，并且即使在干燥土壤或高盐土壤中，根也可以有力地生长。因此，本发明的转基因植物即使在高渗条件下也可以生长。
附图说明
图1显示参考例1的数据，在干旱胁迫3天后，野生西瓜的根中表达的蛋白质的双向电泳图。在该图中，所圈出的区域表示干旱胁迫后强度增加的蛋白质点。
图2显示实验例1的实验结果，生长中的实施例3所得重组拟南芥的根的状况示意图。
图3显示实验例1的实验结果，生长中的实施例3所得重组拟南芥的所测定初生根长度图。
图4显示实验例2的实验结果，在高渗胁迫下生长中的实施例3所得重组拟南芥初生根长度图。在图4中，PEG栏中标注的“+”表明添加了5％(重量)的聚乙二醇6000，而该栏中的“-”表明未添加聚乙二醇。
实施本发明的最佳方式
源自野生西瓜的Ran基因
本发明提供了编码源自野生西瓜的Ran蛋白的多核苷酸(在下文中，有时称为“本发明的Ran基因”)。不同于源自小麦及其它植物的Ran蛋白，所述源自野生西瓜的Ran蛋白在植物中增强根的伸长。所述源自野生西瓜的Ran蛋白还具有特别的特征：阻止在高渗胁迫下的植物根伸长抑制。
特别地，本发明的Ran基因是包含以下(a)或(b)所述DNA的多核苷酸：
(a)由SEQ ID NO：1或2所示碱基序列组成的DNA；或者
(b)在严格条件下与和由SEQ ID NO：1或2所表示碱基序列组成的DNA互补的DNA杂交的DNA，其编码具有增强植物根伸长活性以及阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制活性的蛋白质。
在本文中，关于上述(b)中的DNA，严格条件意味着：例如在65℃在5×SSC溶液(1×SSC溶液的组成：150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)中杂交，随后在65℃在含有0.1％SDS的0.5×SSC溶液中洗涤。可以利用已知方法进行严格条件下的每个杂交过程，所述方法如《分子克隆(第三版)》(J.Sambrook & D.W.Russell，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中描述的，等等。通常，温度越高以及盐浓度越低，严格性则越高。
在严格条件下杂交的DNA与用作探针的DNA的碱基序列通常具有高于某种程度的同源性，其中所述同源性为例如不低于60％，优选地不低于80％，更优选地不低于90％以及特别优选地不低于95％。例如，SEQ ID NO：1所示碱基序列与SEQ ID NO：2所示碱基序列之间的同源性为79％(通过GENETYX-MAC Ver.13；Genetyx Corporation计算)。可以利用商品化的分析工具或者利用可由电信线路(国际互联网)获得的工具来计算核酸序列同源性。特别地，可以使用BLAST分析软件(J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)来计算同源性。可以使用DNA序列相关数据库如日本DNA数据库(DDBJ)(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)、Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genebank/Index.htlm)、欧洲分子生物学实验室核酸序列数据库(EMBL)(http://www.ebi.ac.uk/ebi docs/embldb.html)等来检索核酸序列同源性。
关于上述(b)中的DNA，该DNA所编码蛋白质的“增强植物根伸长的活性”可以如下进行验证。使用包含靶DNA的重组表达载体制备转基因拟南芥。通过自交，获得转化拟南芥的T3种子。将所述T3种子在23℃、100μmol/m2/s光照度(光照期16小时，黑暗期8小时)下培养在含2％(重量)蔗糖的Murashige & Skoog培养基中。两周后，测量该植株的初生根长度。在同样的条件下培养未经转化的拟南芥。两周后，测量该植株的初生根长度。与在同样条件下培养的未经转化拟南芥的初生根长度相比，当转基因拟南芥的初生根长度是其1.1倍或更多、优选地1.2倍或更多、更优选地1.3倍或更多、更优选地1.4倍或更多、特别优选地1.5倍或更多时，认为由DNA编码的蛋白质具有“增强植物根伸长的活性”。
关于上述(b)中的DNA，由该DNA编码的蛋白质的“阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的活性”可以如下进行验证。具体地，使用包含靶DNA的重组表达载体制备转基因拟南芥。通过自交，获得经转化拟南芥的T3种子。将所述T3种子在23℃100μmol/m2/s光照度(光照期24小时)下，在1/2强度Murashige & Skoog培养基中培养3天，然后移至含有5％(重量)聚乙二醇6000的1/2强度Murashige & Skoog培养基。在23℃、24小时光照期下培养4天后，测量该植株的初生根长度。同时，在同样的条件下，使用同样的T3种子在不含聚乙二醇的1/2强度Murashige &Skoog培养基中进行另一培养，并测量植株的初生根长度。与在不含聚乙二醇的培养基中培养的拟南芥初生根长度相比，当培养在含聚乙二醇的培养基中的拟南芥的初生根长度是其0.85倍或更多、优选地0.9倍或更多、更优选地0.95倍或更多时，认为由DNA编码的蛋白质具有“阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的活性”。
在另一实施方案中，本发明的Ran基因是编码以下(c)、(d)或(e)中任何多肽的多核苷酸：
(c)由SEQ ID NO：3或4所示氨基酸序列组成的多肽；
(d)由SEQ ID NO：3或4所示氨基酸序列组成的多肽，其中一个或若干个氨基酸被替换、缺失或添加，并且所述多肽具有增强植物根伸长的活性以及阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的活性；
(e)与SEQ ID NO：3或4所示氨基酸序列具有不低于70％的同源性的多肽，并且所述多肽具有增强植物根伸长的活性以及阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的活性。
SEQ ID NO：3所示氨基酸序列对应于SEQ ID NO：1所示碱基序列的可读框(ORF)所编码的氨基酸序列；SEQ ID NO：4所示氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2所示碱基序列的ORF所编码的氨基酸序列。
在所述肽(d)中，“一个或若干个氨基酸”的范围无特别地限制，具体的，例如1～40个氨基酸，优选地1～20个氨基酸，更优选地1～12个氨基酸，更优选地1～9个氨基酸以及特别优选地1～5个氨基酸。
关于所述肽(d)中的氨基酸替换，更优选地使用相似的氨基酸，因为预计这样的替换不导致表型改变；更特别地，这样的替换为保守性氨基酸替换。可以将相似氨基酸的实例进行如下分类。保守性氨基酸替换在本技术领域是公知的(参见Science，247：1306-1310(1990))。
芳族氨基酸：Phe、Trp、Tyr
脂肪族氨基酸：Ala、Leu、Ile、Val???
极性氨基酸：Gln、Asn
碱性氨基酸：Lys、Arg、His
酸性氨基酸：Glu、Asp
包含羟基的氨基酸：Ser、Thr
包含小侧链的氨基酸：Gly、Ala、Ser、Thr、Met
用于在特定氨基酸序列中替换、缺失或添加一个或若干个氨基酸的技术是公知的，编码所述多肽(d)的多核苷酸也根据已知的方法使用市售的试剂盒等产生。
多肽(e)优选地与SEQ ID NO：3或4的氨基酸序列具有不低于70％、更优选地不低于90％、特别优选地不低于95％的同源性。例如，SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：4的氨基酸序列之间的同源性为95％(通过GENETYX-MAC Ver.13，Genetyx Corporation计算)。在本文中，表示氨基酸序列同源性的“％”是指两个氨基酸序列的一致程度的比率(％)；更具体地，表示氨基酸序列一致性的比率(％)。
为了确保使多肽(e)确定地具有上述期望的活性，所述多肽优选地与SEQ ID NO：3的氨基酸序列中第181位至第221位氨基酸的区域具有不低于80％、优选地不低于85％的同源性。SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：4在该区域内的氨基酸序列同源性为88％。
可以利用市售的分析工具或通过电信线路(国际互联网)来计算氨基酸序列的同源性。特别地，可以利用BLAST分析软件(J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)来计算同源性。关于氨基酸序列同源性的信息可以在蛋白质氨基酸序列相关的数据库或者在基于DNA序列预测的氨基酸序列的相关数据库中找到，如SWISS-PROT(http://www.ebi.ac.uk/swissprot/)或PIR(http://pir.ge orgetown.edu/)。
利用与所述DNA(b)同样的方法来验证所述多肽(d)和(e)所需的“增强植物根伸长的活性”以及“阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的活性”。
可使用RT-PCR方法得到本发明的Ran基因。可以使用根据已知方法从来自野生西瓜的组织中制备的总mRNA作为模板。设计用于扩增全长本发明Ran基因的引物。还可以使用来自野生西瓜的cDNA文库作为模板，使用设计用于扩增全长本发明Ran基因的引物，通过PCR方法获得本发明的Ran基因。
在反应混合物中通过重复高温低温的循环来进行本发明Ran基因的PCR扩增，所述反应混合物包含模板多核苷酸、PCR缓冲液、引物组合(正向引物和反向引物)、dNTP混合物(脱氧核苷三磷酸的混合物)和DNA聚合酶。所述正向引物和反向引物例如基于本发明Ran基因的5’端或邻近以及3’端或邻近的约10～50bp核苷酸序列进行设计，并根据已知方法进行合成。当待扩增的序列不包含起始密码子时，将所述正向引物设计成在框内包含起始密码子，或者将起始密码子在框内引入下述表达载体中。根据待使用的DNA聚合酶，从例如市售产品中选择PCR缓冲液。所述dNTP混合物和DNA聚合酶也可以选自市售产品。可以根据已知方法或DNA聚合酶的说明书来进行PCR反应。反应温度、反应时间、反应循环、反应组成等可以依需要进行调整。
可以将本发明的Ran基因引入植物，并表达该基因以发挥增强根伸长的活性。由于该特征，本发明的Ran基因可用作增强根伸长的试剂。同样，可以将本发明的Ran基因引入植物，并表达该基因以发挥阻止由高渗胁迫所致的根伸长抑制的活性，因此该基因可用作在高渗胁迫条件下支持植物根生长的试剂。
源自野生西瓜的Ran蛋白
本发明的多肽对应于由本发明的Ran基因编码的Ran蛋白，即上述(c)至(e)的肽。本发明的多肽在植物中发挥增强植物根伸长的作用，因此可用作增强根伸长的试剂。本发明的多肽在植物中还发挥阻止由高渗胁迫所致的根伸长抑制的作用，因此可用作在高渗胁迫下支持植物根生长的试剂。本发明的多肽在植物中的表达优选地通过使用重组载体转化植物的方法来实现，所述重组载体通过使用本发明的Ran基因来制备。
重组载体
可通过将本发明的Ran基因插入植物细胞转化载体中来制备本发明的重组载体。所述植物细胞转化载体无特别地限制，只要它可以将基因引入植物细胞即可。例如，可以使用源自Ti质粒的pBI101、pBI121、pBI122(Clontech Laboratories，Inc.)、PBE2113-GUS(National Institute ofAgrobiological Sciences)等。也可以使用pUC1???9等作为直接转化的载体。还可以使用源自植物病毒的载体，如源自双联体病毒的病毒载体(WDV等)以及源自RNA病毒的病毒载体(源自烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒的病毒载体等)。另外，可以将从载体中切出的功能性DNA片段直接引入植物细胞中，或者将不含有启动子和多聚A其一或二者均不含的DNA片段直接引入植物基因组中，使用内源的启动子或多聚A信号进行转录控制。
通过例如将经PCR扩增的Ran基因之5’端与在植物中有功能的启动子之3’端下游部分直接地或者通过适当序列(例如，限制酶识别位点等)进行连接，可以将本发明的Ran基因插入植物细胞转化载体中。
另外，除了启动子和本发明的Ran基因以外，本发明的载体还可以包含终止子、增强子、选择标记基因等。
可用于植物细胞的选择标记基因的优选实例包括但不具体限于：提供抗生素抗性的卡那霉素磷酸转移酶基因和潮霉素磷酸转移酶基因；提供除草剂抗性的乙酰丁酸合成酶基因；以及提供氨甲蝶呤(MTX)抗性的二氢叶酸还原酶基因。
使用本发明的Ran基因转化植物
可以将本发明的重组载体引入靶标宿主植物从而产生根伸长增强的转基因植物。
可用的宿主植物形态和引入部位包括下列任意项：培养的植物细胞；愈伤组织；原生质体；整株的栽培植物；植物器官如叶、花瓣、茎、根、根状茎、种子等；以及植物组织如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束等。
所述宿主植物的实例包括：单子叶植物如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、椰子、天南星科、凤梨科、百合、兰花或姜；以及双子叶植物如番茄、豆类、马铃薯、红薯、向日葵、烟草、黄瓜、卷心菜、莴苣、木薯、柳树、胡桃、山毛榉、玫瑰、山茶属、杜鹃花科、茄子、芝麻、葫芦科或菊花。也可以使用蕨类植物如木贼属、卷柏科、蕨属、紫萁科等。其中，优选稻、小麦、大麦、玉米、高粱、天南星科、番茄、豆、马铃薯、红薯、向日葵、茄子和葫芦科。
可以通过使用农杆菌、电穿孔、基因枪、显微注射等方法将本发明的Ran基因引入宿主植物，其中使用农杆菌的方法是优选的。
使用农杆菌的方法是公知的，其通过例如使用已引入本发明重组载体的农杆菌类感染植物细胞或切片来进行(例如参见Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，94，2117-2121)。
在将本发明的Ran基因引入宿主植物后，选择已引入本发明Ran基因的植物细胞形成愈伤组织样组织。当所述愈伤组织样组织出芽时，将该植物移至生根培养基以获得转基因植物。
优选地在以下培养条件下选择引入了本发明Ran基因的植物细胞并形成出芽的愈伤组织样组织。在约4～50℃、优选地约15～37℃、更优选地约22～30℃的温度下，在适合于所引入选择标记基因类型的选择试剂存在时，将所述引入Ran基因的植物细胞或切片培养在含有适当用量蔗糖等的琼脂培养基(如Murashige & Skoog培养基)中约3～180天，优选地约7～90天，更优选地约14～60天。可以通过对每株植物进行实验性培养来找到最佳培养温度。某些植物可能需要比上述时间更长的培养时间。
将所得的芽移至已知的生根培养基上，如含有4μM吲哚丁酸的Murashige & Skoog培养基等，并培养例如约3～180天，优选地约7～90天，更优选地约14～60天从而长成植株。然后，根据培养的需要，可以将植株移至蛭石或土壤中。还可以使用本发明Ran基因的DNA片段作为探针，通过Northern印迹测定来检测本发明的转基因植物，以找到强烈表达本发明Ran基因的转基因植物。
通过利用PCR、Southern印迹分析等检测细胞或组织基因组DNA中的本发明Ran基因，可以检测已引入所述Ran基因的转基因植物来证实本发明的Ran基因被掺入到转基因植物的当前代和下一代中。
如上制备的本发明转基因植物的根伸长增强，特别是初生根伸长。这种植物根伸长的增强提供了具有生长改善、针对干燥环境的抗性、从土壤吸收营养物能力提高等有用效果的植物。因此，将本发明的转基因植物应用至农作物或林木是非常有益的。另外，在本发明的转基因植物中，所述根伸长即使在高渗胁迫下也不受抑制，因而即使在高渗胁迫下也可以保证生长良好。此优点使得本发明的转基因植物非常适用于作为例如干燥土壤、高盐土壤等环境中的农作物或林木。
本发明的转基因植物包括但不限于整株植物(整个树木)：包括各个细胞、其愈伤组织、种子、植物组织、叶、茎、根、花、果实和纤维。另外，本发明的转基因植物还包括它们的后代以及种内或种间杂交的后代植物。
用于增强植物根伸长的方法
本发明提供了用于增强植物根伸长的方法，该方法包括将本发明的Ran基因引入植物并表达该基因。根据本发明，这样引入本发明的Ran基因可以使靶标植物中的根伸长(特别是初生根伸长)增强。这种根伸长的增强使植物从土壤吸收养分和水的能力提高，从而改善了农作物的抗旱性，提高了农作物产量并提高了林木的生长。另外，根的发育增强了树木的稳定性，对于防风林的养护维持和环境保护是有用的。
用于阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的方法
本发明提供了用于阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的方法，该方法包括将本发明的Ran基因引入植物并表达该基因。本发明可通过如上所述地将本发明的Ran基因引入植物来阻止由高渗胁迫所致的根伸长抑制。该方法使得在干燥土壤、高盐土壤等中根旺盛地伸长，从而优选地可应用至经受高渗胁迫的植物。
用于产生根伸长增强的植物或者即使在高渗胁迫下根伸长能力也不受 抑制的植物的试剂盒
本发明的试剂盒用于产生根伸长增强的植物或者即使在高渗胁迫下根伸长也不受抑制的植物。包含本发明的重组载体的试剂盒可以根据需要包含用于将所述重组载体引入植物细胞的试剂、说明书等。
实施例
参考以下实施例对本发明进行更具体地解释，但本发明不限于这些实施例。
参考例1：分析干旱胁迫对源自野生西瓜根的蛋白质表达的影响
野生西瓜暴露于干旱胁迫，分析干旱胁迫前后根中表达的蛋白质类型和数量从而检测并鉴定干旱胁迫下与生长相关的蛋白。具体地，如下进行实验：
1.培育野生西瓜
将野生西瓜种子(西瓜No.101117-1：保藏于Tottori PrefecturalHorticultural Exp.Stn.，原产于博茨瓦纳共和国的喀拉哈里沙漠)浸泡于蒸馏水中并在37℃孵育约20小时。将人工土壤Isolite(粒径：2mm，IsoliteInsulating Products Co.Ltd.)置于纸盆(750ml)中，播种经浸泡的种子并在人工气候室中(光照期：温度35℃，湿度50％，光照度700μmol光子m-2s-1，16小时；黑暗期：温度25℃，湿度60％，8小时)(强光条件)中培育直至它们的第4片叶完全伸展(约20天)，其间每天浇水(约125ml/盆)。使用2,000倍稀释的液体肥料(HYPONeX；N:P:K＝6:10:5；HYPONeX Japan Corp.，Ltd.的产品)进行浇灌。在第4片叶完全伸展之后，停止浇水以施加干旱胁迫，并在第0、1和3天后收集所述根。
2.从野生西瓜根中提取可溶蛋白质
将保存在-80℃的经受干旱胁迫第0天、第1天和第3天的野生西瓜根(各3或4个，约2.5g)在含液氮的研钵中研磨成粉末。在加入约50ml裂解缓冲液(61.5mM K2HPO4、38.5mM KH2PO4、pH7.0、2mM MgCl2、10mM NaCl、1mM EDTA、10mMβ-ME、1mM PMSF)之后，将经研磨的根进一步研磨，并通过4层纱布(Suzuran Sanitary Goods Co.，Ltd.)进行过滤。将得到的提取物分装至50ml离心管中并离心(2,000×g，4℃，10秒)以去除污染物、未裂解细胞等。将上清液移至新的50ml离心管并进行超速离心(100,000×g，4℃，1小时)。随后，将上清液(可溶级分)移至新的50ml管，加入等量的TCA，将所得溶液置于冰上30分钟。将所述溶液离心(15,000×g，4℃，15分钟)并除去上清液后，用100％丙酮悬浮沉淀物并离心(15,000×g，4℃，15分钟)，然后除去上清液得到丙酮沉淀物。
3.通过双向电泳对可溶蛋白质进行分级分离
3-1.样品制备
将以上获得的丙酮沉淀物溶于2-DE缓冲液(7M尿素、2M硫脲、4％(重量)CHAPS、0.5％(v/v)Triton X-100、0.5％(v/v)Immobiline pH梯度缓冲液：pH4-7(Amersham Pharmacia Science)、100mM DTT)中。在室温搅拌30分钟后，将溶液离心(15,000×g，4℃，1小时，室温)从而获得上清液作为双向电泳样品。对样品进行分装并储存在-80℃。使用2-D Quant试剂盒(Amersham Pharmacia Science)来定量测定溶于2-DE缓冲液中的蛋白质。
3-2.凝胶再水化
将用于24cm DryStrip胶条的再水化槽(Amersham PharmaciaScience)水平放置，将含有所述蛋白质样品的450μl再水化溶液(与2-DE缓冲液组成相同)加样于每条泳道。当使用用于11cm DryStrip的再水化槽时，将240μl再水化溶液以同样的方式加样于每条泳道。在除去Immobiline DryStrips(24cm，pH4-7，Amersham PharmaciaScience)的膜后，将胶条置于槽中，使胶面朝下并避免空气进入，并在每条泳道覆盖1.5～3ml的硅酮油(KF-96-1.5CS(Shin-Etsu ChemicalCo.，Ltd.))以防止水蒸发以及尿素沉淀。随后，将胶条静置14～20小时(在4℃)使凝胶再水化。
3-3.固定化pH梯度等电聚焦电泳(IEF)
使用MultiphorTMII(Amersham Pharmacia Science)进行第一向电泳。将经过再水化的凝胶胶条置于电泳层，将电泳槽充满硅酮油以防止凝胶干燥。电泳条件如下。步骤1：500V梯度，2mA，5W，1分钟，15℃；步骤2：500V，2mA，5W，4小时，15℃；步骤3：3,500V梯度，2mA，5W，8小时，15℃；以及步骤4：3,500V，2mA，5W，40小时或以上。
3-4.平衡
在完成等电聚焦电泳后，在室温将凝胶胶条按照每个凝胶胶条10ml第一平衡缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.8)，6M尿素，30％(w/v)甘油，2％(v/v)SDS，65mM DTT)在其中摇动15分钟。在除去第一平衡缓冲液之后，加入10ml第二平衡缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.8)，6M尿素，30％(w/v)甘油，2％(v/v)SDS，135mM碘乙酰胺)，在铝箔遮光的条件下室温摇动15分钟。平衡后，将电极缓冲液(25mM Tris-HCl(pH8.8)，190mM甘氨酸，3.5mM SDS)加至凝胶胶条以洗去平衡缓冲液。
3-5.SDS-PAGE
使用Ettan DALTsix电泳系统(Amersham Pharmacia Science)进行第二向电泳。将丙烯酰胺凝胶溶液(终浓度：30％丙烯酰胺，0.8％N，N，-甲叉双丙烯酰胺，1.5M Tris-HCl(pH8.8)，10％SDS，10％APS，10％TEMED)倒入置于Ettan DALTsix凝胶架中的盒中，将适量的水饱和丁醇加至凝胶上使凝胶表面平整。在4℃，将凝胶静置至少20小时使之完全聚合。
将经过平衡的凝胶胶条置于所制备的凝胶上。在100℃将封入用琼脂糖凝胶(含有0.5％琼脂糖和适量溴酚蓝的电极缓冲液)融化并冷却至约70℃，倒入从而固定凝胶胶条。随后，将Ettan DALTsix的下槽缓冲液室充满1×电极缓冲液(约4L)，使用恒温循环器将该室的内部预冷却至10℃。在将凝胶胶条置于下槽后，将上槽液室插至下槽液室上，并用2×电极缓冲液充满(约800ml)至下槽缓冲液的水平。使用MultiphorTMII(Amersham Pharmacia Science)在如下条件下进行电泳：步骤1：600V，400mA，2.5W/凝胶，30分钟；步骤2：600V，400mA，100W，3.5～5小时。
3-6.凝胶染色
使用Colloidal Blue染色试剂盒(Invitrogen Corporation)对凝胶进行染色。每片凝胶使用100ml量的染色液。凝胶在室温下染色和脱色不少于40个小时，然后在超纯水中摇动不少于24小时。
3-7.使用HT分析仪来定量测定蛋白质点
使用ProPic(Genomic Solutions)为整个凝胶图像进行拍照，使用HT分析仪(Genomic Solutions)检测和定量分析蛋白质点。为了避免点的错误识别，使用HT分析仪将干旱胁迫第0天、第1天和第3天的双向电泳图样用肉眼进行比较和修正，从而检测干旱胁迫后强度随时间增加的蛋白质点。图1表示在干旱胁迫第3天的野生西瓜根中表达的蛋白质的双向电泳图样。为了定量测定点的强度，使用选定的约10个强度未改变的点来校正凝胶之间蛋白质的量或染色强度的变化。使用HTAnalyzer对每个点周围的背景进行自动校正。
3-8.通过凝胶内消化对蛋白质进行肽片段化
将施加干旱胁迫后强度增加的多个蛋白质点之每一个切下，并移至TPX离心管中。在通过加入100μl乙腈并摇动管15分钟使凝胶再水化后，使用离心蒸发器使凝胶完全干燥(30分钟)。加入40μl量的10mMDTT/100mM NH4HCO3，在56℃孵育45分钟，使每种蛋白质的二硫键还原为SH基团。为了避免SH基团再氧化，在除去溶液之后，加入40μl的55mM碘乙酰胺(ICH2CONH2)/100mM NH4HCO3，在室温于暗处孵育30分钟进行烷基化。用乙腈将凝胶脱水后，使用离心蒸发器使凝胶干燥，加入40μl的12.5ng/μl胰酶(MS级，Promega Corporation)/50mM NH4HCO3，然后在4℃孵育45分钟。随后，除去溶液，用100μl的50mM NH4HCO3洗涤凝胶块，再次加入20μl的50mMNH4HCO3，将该混合物在37℃反应16小时进行胰酶消化。胰酶消化后，将该溶液移至新的TPX离心管。将10μl量的25mM NH4HCO3加至凝胶块，摇动10分钟。加入20μl量的乙腈并再摇动10分钟。将所得混合物移至TPX离心管。将10μl量的5％甲酸(Wako)加至凝胶块，并摇动10分钟。加入25μl量的乙腈，再摇动10分钟，然后移至TPX离心管。重复该过程两次。由于完全干燥使重悬变得困难，使用离心蒸发器将收集离心管中的溶液蒸发至约20μl，最后加入5μl的甲酸。
3-9.利用离子阱液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)鉴定蛋白质
通过离子阱液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS：LCQ-AdvantageThermo Electron Corporation)分析上述经胰酶消化的肽片段。在NCBI(美国国立生物技术信息中心)数据库的非冗余数据库中使用MSCOT(Matrix Science Ltd.)，对所获得的质谱数据针对植物进行同源性检索。
结果，作为在施加干旱胁迫后在根中表达显著增加的蛋白质，检测并鉴定出Ran蛋白(CLRAN1：SEQ ID NO：1；CLRAN2：SEQ ID NO：2)。基于该结果，进行了以下实验以集中研究源自野生西瓜的Ran基因。
实施例1：源自野生西瓜的Ran基因CLRAN1(DRIP-49)的cDNA克隆
使用TRIzol(Invitrogen Corporation)从野生西瓜的根(西瓜No.101117-1：保藏于Tottori Prefectural Horticultual Exp.Stn.，原产于博茨瓦纳共和国的喀拉哈里沙漠)提取总RNA。从5μg所得的总RNA，使用寡脱氧胸苷(Oligo(dT))引物来制备第一链cDNA，使用以下引物通过RT-PCR扩增靶cDNA：CLRANlFL-F:5′-gataccttcctctcgcttt-3′(SEQ ID NO：5)；和CLRANl???FL-R:5′-gcaaagagcatcatcaccac-3′(SEQ IDNO：6)。根据试剂盒所附的方案，使用ReverTra-Plus-TM试剂盒(ToyoboCo.，Ltd.)进行RT-PCR。具体地，将5μl的Oligo(dT)引物加至1μg的总RNA，将反应混合物调整为总量12μl，在65℃处理5分钟，然后在冰中骤冷。向其加入4μl的5×RT缓冲液、2μl的10mM dNTP、1μl的RNA酶抑制剂、1μl的ReverTra Ace并调整总量至20μl，然后在42℃处理60分钟，然后在85℃处理5分钟。向2μl的该反应产物加入5μl的10×PCR缓冲液、1μl的KOD-Plus-、3μl的25mM MgSO4、1μl的10mM dNTP以及15pmol的每种CLRAN1FL-F和CLRAN1FL-R，调整至总共50μl。在94℃处理该混合物2分钟，然后进行30个循环的98℃10秒、55℃30秒和68℃1分钟，从而获得cDNA。所得到的扩增cDNA片段进行1％琼脂糖电泳，然后使用QIAquickGel提取试剂盒(Qiagen，Inc.)进行纯化，并使用DNA连接试剂盒(TaKaRa Inc.)克隆至pT7Blue-2T-载体(Novagen，Inc.)。使用BigDye末端循环测序试剂盒(BigDye Terminator Cycle SequencingKit，Applied Biosystems，Inc.)，利用ABI PRISMTM310遗传分析仪(Applied Biosystems，Inc.)来测定DNA序列。结果证实成功克隆到源自野生西瓜的Ran基因CLRAN1(DRIP-49)(总长度666bp，SEQ ID NO：1所示多核苷酸)。
实施例2：构建待引入的质粒
基于实施例1中得到的CLRAN1(DRIP-49)的全长cDNA，使用以下引物通过PCR扩增666bp的全长ORF：CLRAN1-F：5’-aaaaagcaggctccttttccaatggctt-3’(SEQ ID NO：7)；和CLRAN1-R：5’-agaaagctgggttttttactcgaacgcg-3’(SEQ ID NO：8)。使用GATEWAY系统(Invitrogen Corporation)，通过重组反应，将该ORF引入植物细胞转化载体pGWB2中花椰菜花叶病毒35S启动子和胭脂碱合酶终止子之间，以构建引入了CLRAN1(DRIP-49)的质粒。
实施例3：制备引入了Ran基因CLRAN1(DRIP-49)的重组拟南芥
通过电穿孔用引入了CLRAN1(DRIP-49)的质粒转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105株。根据已知方法利用真空渗入使用农杆菌来转化拟南芥(细胞工程别册，植物细胞工程21卷，第3次修订，模式植物的实验操作步骤：水稻、拟南芥和百脉根，第4章，第4节，“使用减压浸润法和花序浸入法转化拟南芥”，第3版第1次印刷，秀润社(2005年4月5日))。
然后，将经农杆菌感染的拟南芥(T0代)培养在含有潮霉素(100mg/l)、卡那霉素(50mg/l)和蔗糖(20g/l)的Murashige & Skoog培养基中，在23℃、50μmol/m2/s光照度和24小时光照期下进行选择。将所选植物移至土壤(Metro-
Figure G2007800073123D00191
350；Sun Gro Horticulture Inc.的产品)，继续在同样的条件下培育，然后收集T1种子。在通过Northern印迹证实转基因来源的CLRAN1(DRIP-49)mRNA的表达后，T1植株继续自交从而得到T3种子。
实验例1：评估重组拟南芥的根伸长
将实施例3中得到的6个品系的T3种子(RAN1-2、RAN-3、RAN1-4、RAN1-6、RAN1-7和RAN1-9)培养在23℃、100μmol/m2/s光照度(16小时光照期和8小时黑暗期)下、含有2％(重量)蔗糖的Murashige & Skoog培养基琼脂培养基中2周。之后，测量植株的初生根长度。将用无插入片段的pGWB2载体转化的拟南芥的T3种子以同样的方式进行培养并测量所得到植株的初生根的长度，以作为对照。
图2和3显示了结果。这些结果证实了表达源自野生西瓜的Ran基因的重组拟南芥表现出初生根伸长增强。
实验例2：评估重组拟南芥在高渗胁迫下的根伸长
将实施例3中得到的两个品系的T3种子(RAN1-6和RAN1-11)在23℃、无蔗糖的1/2强度Murashige & Skoog培养基中、100μmol/m2/s光照度以及24小时光照期下培养3天。之后，将幼苗移至含有5％(重量)聚乙二醇6000的1/2强度Murashige & Skoog培养基，在23℃培养4天之后测量初生根的长度。将用无插入片段的pGWB2载体转化的拟南芥的T3种子用作对照。
图4显示了结果。对照株表现出由渗透胁迫导致的对初生根伸长的显著抑制，所述渗透胁迫由加入5％(重量)聚乙二醇6000引起。相反地，在实施例3中得到的重组拟南芥的两个品系中未观察到渗透胁迫的影响。
序列表
<110>国立大学法人奈良先端科学技术大学院大学
<120>根伸长增强的植物及其产生方法
<130>P07-18
<150>JP2006-058746
<151>2006-03-03
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>666
<212>DNA
<213>西瓜(Citrullus lanatus)
<400>1
atggctttgc cggaccagaa gactgttgat tatccgagtt tcaagcttgt tattgttggt   60
gatggtggca ctggaaaaac aacatttgtg aaaagacatc tcacagggga gttcgaaaag  120
aaatacgaac caaccattgg tgtggaggtg cacccattgg acttcttcac taactgtgga  180
aaaattagat tttactgttg ggacactgct gggcaggaga aatttggtgg tttacgtgat  240
ggctactaca tccatgggca atgtgcaatc atcatgtttg atgttactgc cagattgaca  300
tataaaaatg ttccgacgtg gcaccgtgat ctttgcagag tgtgtgagaa tattccaata  360
gttctttgtg gaaacaaggt cgatgtgaaa aacaggcagg ttaaggccaa gcaagtcaca  420
ttccacagga agaagaacct acagtactat gaaatatctg caaagagtaa ctacaacttc  480
gaaaaaccat tcctgtactt ggccagaaag ttggctgggg atccaaacat tcatttcgtg  540
gagtctccag ctctggctcc tcctgaagta cacattgatt tggctgccca gcaacagcat  600
gaagctgaat tagcggcagc agcaagtcaa cctcttcccg acgatgacga cgacgcgttc  660
gagtaa                                                             666
<210>2
<211>666
<212>DNA
<213>西瓜
<400>2
atggcgctac caaatcaggc caccgtagat taccctagct tcaagcttgt aattgtcgga   60
gatggtggaa cagggaagac aacctttgtt aaacgtcatc ttactggaga gttcgagaag  120
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gtattgtgtg gaaacaaggt cgacgtgaaa aacagacagg ttaaagcaaa gcaggtcacc  420
ttccacagga agaaaaatct tcagtattac gaaatctctg caaagagtaa ttacaacttt  480
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gagtaa                                                             666
<210>3
<211>221
<212>PRT
<213>西瓜
<400>3
Met Ala Leu Pro Asp Gln Lys Thr Val Asp Tyr Pro Ser Phe Lys Leu
1               5                   10                  15
Val Ile Val Gly Asp Gly Gly Thr Gly Lys Thr Thr Phe Val Lys Arg
            20                  25                  30
His Leu Thr Gly Glu Phe Glu Lys Lys Tyr Glu Pro Thr Ile Gly Val
        35                  40                  45
Glu Val His Pro Leu Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gly Lys Ile Arg Phe
    50                  55                  60
Tyr Cys Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Lys Phe Gly Gly Leu Arg Asp
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Tyr Ile His Gly Gln Cys Ala Ile Ile Met Phe Asp Val Thr
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Thr Tyr Lys Asn Val Pro Thr Trp His Arg Asp Leu Cys
            100                 105                 110
Arg Val Cys Glu Asn Ile Pro Ile Val Leu Cys Gly Asn Lys Val Asp
        115                 120                 125
Val Lys Asn Arg Gln Val Lys Ala Lys Gln Val Thr Phe His Arg Lys
    130                 135                 140
Lys Asn Leu Gln Tyr Tyr Glu Ile Ser Ala Lys Ser Asn Tyr Asn Phe
145                 150                 155                 160
Glu Lys Pro Phe Leu Tyr Leu Ala Arg Lys Leu Ala Gly Asp Pro Asn
                165                 170                 175
Ile His Phe Val Glu Ser Pro Ala Leu Ala Pro Pro Glu Val His Ile
            180                 185                 190
Asp Leu Ala Ala Gln Gln Gln His Glu Ala Glu Leu Ala Ala Ala Ala
        195                 200                 205
Ser Gln Pro Leu Pro Asp Asp Asp Asp Asp Ala Phe Glu
    210                 215                 220
<210>4
<211>221
<212>PRT
<213>西瓜
<400>4
Met Ala Leu Pro Asn Gln Ala Thr Val Asp Tyr Pro Ser Phe Lys Leu
1               5                   10                  15
Val Ile Val Gly Asp Gly Gly Thr Gly Lys Thr Thr Phe Val Lys Arg
            20                  25                  30
His Leu Thr Gly Glu Phe Glu Lys Lys Tyr Glu Pro Thr Ile Gly Val
        35                  40                  45
Glu Val His Pro Leu Asp Phe Phe Thr Asn Tyr Gly Lys Ile Arg Phe
    50                  55                  60
Tyr Cys Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Lys Phe Gly Gly Leu Arg Asp
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Tyr Ile His Gly Gln Cys Ala Ile Ile Met Phe Asp Val Thr
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Thr Tyr Lys Asn Val Pro Thr Trp His Arg Asp Leu Cys
            100                 105                 110
Arg Val Cys Glu Asn Ile Pro Ile Val Leu Cys Gly Asn Lys Val Asp
        115                 120                 125
Val Lys Asn Arg Gln Val Lys Ala Lys Gln Val Thr Phe His Arg Lys
    130                 135                 140
Lys Asn Leu Gln Tyr Tyr Glu Ile Ser Ala Lys Ser Asn Tyr Asn Phe
145                 150                 155                 160
Glu Lys Pro Phe Leu Tyr Leu Ala Arg Lys Leu Ala Gly Asn Pro Glu
                165                 170                 175
Leu His Phe Val Glu Ser Pro Ala Leu Ala Pro Pro Glu Val Gln Ile
            180                 185                 190
Asp Leu Ala Ala Gln Ala Gln His Glu Ala Glu Leu Ala Gln Ala Ala
        195                 200                 205
Ala Gln Pro Leu Pro Asp Glu Asp Asp Asp Ala Phe Glu
    210                 215                 220
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>西瓜
<400>5
gataccttcc tctcgcttt                                   19
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aaaaagcagg ctccttttcc aatggctt                         28
<210>8
<211>28
<212>DNA
<213>西瓜
<400>8
agaaagctgg gttttttact cgaacgcg                         28

Claims (13)

1.由以下(a)的DNA组成的多核苷酸：
(a)由SEQ ID NO：1或2所示碱基序列组成的DNA。
2.编码以下(c)多肽的多核苷酸：
(c)由SEQ ID NO：3或4所表示氨基酸序列组成的多肽。
3.以下(c)的多肽：
(c)由SEQ ID NO：3或4所示氨基酸序列组成的多肽。
4.包含权利要求1或2的多核苷酸的重组载体。
5.用于产生根伸长增强的植物的方法，其包括使用权利要求1或2的多核苷酸转化植物的步骤。
6.用于产生在高渗胁迫下根伸长不受抑制的植物的方法，其包括将权利要求1或2的多核苷酸引入植物细胞的步骤。
7.用于增强植物根伸长的方法，其包括将权利要求1或2的多核苷酸引入植物细胞。
8.用于增强植物根伸长的试剂，其包含权利要求1或2的多核苷酸。
9.权利要求1或2的多核苷酸用于增强植物根伸长的用途。
10.用于增强植物根伸长的试剂，其包含权利要求3的多肽。
11.权利要求3的多肽用于增强植物根伸长的用途。
12.用于阻止在高渗胁迫下植物根伸长抑制的方法，其包括将权利要求1或2的多核苷酸引入植物。
13.用于产生根伸长增强的植物或者在高渗胁迫下根伸长不受抑制的植物的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求4的重组载体。
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