JP5444560B2 - 根の伸長が促進されている植物、及びその作製方法 - Google Patents
根の伸長が促進されている植物、及びその作製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5444560B2 JP5444560B2 JP2008502870A JP2008502870A JP5444560B2 JP 5444560 B2 JP5444560 B2 JP 5444560B2 JP 2008502870 A JP2008502870 A JP 2008502870A JP 2008502870 A JP2008502870 A JP 2008502870A JP 5444560 B2 JP5444560 B2 JP 5444560B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plant
- dna
- elongation
- seq
- root
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 36
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 160
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 37
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 37
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 35
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 claims description 33
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 32
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 30
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 29
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims description 17
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000035882 stress Effects 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 45
- 101150084062 RAN gene Proteins 0.000 description 41
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 244000270200 Citrullus vulgaris Species 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 13
- 235000012840 Citrullus vulgaris Nutrition 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 11
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 10
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 9
- 102000005912 ran GTP Binding Protein Human genes 0.000 description 9
- 108010005597 ran GTP Binding Protein Proteins 0.000 description 9
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010021033 Hypomenorrhoea Diseases 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 5
- 230000002786 root growth Effects 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 4
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 4
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 4
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 235000009831 Citrullus lanatus Nutrition 0.000 description 3
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 3
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- -1 Aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000006481 Colocasia esculenta Nutrition 0.000 description 2
- 244000205754 Colocasia esculenta Species 0.000 description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 2
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 2
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 2
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 240000003829 Sorghum propinquum Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 2
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 2
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000009715 pressure infiltration Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 2
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 241001133760 Acoelorraphe Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 1
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 240000001548 Camellia japonica Species 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 244000068485 Convallaria majalis Species 0.000 description 1
- 235000009046 Convallaria majalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195955 Equisetum hyemale Species 0.000 description 1
- 240000000731 Fagus sylvatica Species 0.000 description 1
- 235000010099 Fagus sylvatica Nutrition 0.000 description 1
- 241000702463 Geminiviridae Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical class CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000710078 Potyvirus Species 0.000 description 1
- 240000005893 Pteridium aquilinum Species 0.000 description 1
- 235000009936 Pteridium aquilinum Nutrition 0.000 description 1
- 241000208422 Rhododendron Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000124033 Salix Species 0.000 description 1
- 241001125046 Sardina pilchardus Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 244000040738 Sesamum orientale Species 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 244000273928 Zingiber officinale Species 0.000 description 1
- 235000006886 Zingiber officinale Nutrition 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 235000018597 common camellia Nutrition 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000008397 ginger Nutrition 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N indole-3-butyric acid Chemical compound C1=CC=C2C(CCCC(=O)O)=CNC2=C1 JTEDVYBZBROSJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000019512 sardine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Doerner et al., (1996) Nature, 380: 520-523 Xin Wang et al., (2006) Plant Physiology, 140: 91-101
項1. 以下の(a)又は(b)のDNAからなるポリヌクレオチド:
(a)配列番号1又は2で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1又は2で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ植物の根に対して、伸長を促進する活性又は高浸透圧ストレス下での伸長抑制を阻害する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
項2. 以下の(c)、(d)又は(e)のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド:
(c)配列番号3又は4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(d)配列番号3又は4で表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ植物の根に対して、伸長を促進する活性又は高浸透圧ストレス下での伸長抑制を阻害する活性を有するポリペプチド
(e)配列番号3又は4で表されるアミノ酸配列と70%以上の相同性を有し、且つ植物の根に対して、伸長を促進する活性又は高浸透圧ストレス下での伸長抑制を阻害する活性を有するポリペプチド。
項3. 以下の(c)、(d)又は(e)のいずれかのポリペプチド:
(c)配列番号3又は4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(d)配列番号3又は4で表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ植物の根に対して伸長促進活性を有するポリペプチド
(e)配列番号3又は4で表されるアミノ酸配列と70%以上の相同性を有し、且つ植物の根に対する伸長促進活性を有するポリペプチド。
項4. 項1に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
項5. 項1に記載のポリヌクレオチドで形質転換されたトランスジェニック植物。
項6. 項1に記載のポリヌクレオチドで植物を形質転換する工程を含む、根の伸長が促進された植物の作製方法。
項7. 項1に記載のポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程を含む、高浸透圧ストレス下において根の伸長能が抑制されていない植物の作製方法。
項8. 項1に記載のポリヌクレオチドを植物細胞に導入することを特徴とする、植物の根の伸長を促進させる方法。
項9. 項1に記載のポリヌクレオチドを含む、植物の根伸長促進剤。
項10. 前記ポリヌクレオチドが、項4に記載の組換えベクターの形態で含まれている、項9に記載の植物の根伸長促進剤。
項11. 項1に記載のポリヌクレオチドの、植物の根の伸長を促進させるための使用。
項12. 前記ポリヌクレオチドが、項4に記載の組換えベクターの形態で用いられる、項11に記載の使用。
項13. 項1に記載のポリヌクレオチドの、植物の根伸長促進剤の製造のための使用。
項14. 前記ポリヌクレオチドが、項4に記載の組換えベクターの形態で用いられる、項13に記載の使用。
項15. 項3に記載のポリペプチドを含む、植物の根伸長促進剤。
項16. 項3に記載のポリペプチドの、植物の根の伸長を促進させるための使用。
項17. 項3に記載のポリペプチドの、植物の根伸長促進剤の製造のための使用。
項18. 項1に記載のポリヌクレオチドを植物に導入することを特徴とする、高浸透圧ストレス条件下での植物根伸長抑制を阻害する方法。
項19. 項1に記載のポリヌクレオチドを含む、高浸透圧ストレス条件下における植物根の生育助剤。
項20. 前記ポリヌクレオチドが、項4に記載の組換えベクターの形態で含まれている、項19に記載の生育助剤。
項21. 項1に記載のポリヌクレオチドの、高浸透圧ストレス条件下での植物根伸長抑制を阻害させるための使用。
項22. 前記ポリヌクレオチドが、項4に記載の組換えベクターの形態で用いられる、項20に記載の使用。
項23. 項1に記載のポリヌクレオチドの、高浸透圧ストレス条件下における植物根の生育助剤の製造のための使用。
項24. 前記ポリヌクレオチドが、項4に記載の組換えベクターの形態で用いられる、項23に記載の使用。
項25. 項3に記載のポリペプチドを含む、高浸透圧ストレス条件下における植物根の生育助剤。
項26. 項3に記載のポリペプチドの、高浸透圧ストレス条件下での植物根伸長抑制を阻害させるための使用。
項27. 項3に記載のポリペプチドの、高浸透圧ストレス条件下における植物根の生育助剤の製造のための使用。
項28. 根の伸長が促進された植物、又は高浸透圧ストレス下においても根の伸長能が抑制されない植物を作製するためのキットであって、項4に記載の組換えベクターを含有することを特徴とする、キット。
本発明は、野生種スイカ由来のRan蛋白質をコードするポリヌクレオチド(以下、単に、「本発明Ran遺伝子」ということもある)を提供する。野生種スイカ由来のRanタンパク質は、植物体内で根の伸長を促進する作用があり、麦等の他の植物由来のRanタンパク質とは異なる特徴を有するものである。また、野生種スイカ由来のRanタンパク質は、植物体内で、高浸透圧ストレス下での根の伸長抑制を阻害する作用がある点も、特有の特徴であるといえる。
(a)配列番号1又は2で表される塩基配列を含むDNA
(b)配列番号1又は2で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ植物の根に対して、伸長を促進する活性又は高浸透圧ストレス下での伸長抑制を阻害する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(c)配列番号3又は4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(d)配列番号3又は4で表されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ植物の根に対して、伸長を促進する活性又は高浸透圧ストレス下での伸長抑制を阻害する活性を有するポリペプチド
(e)配列番号3又は4で表されるアミノ酸配列と70%以上の相同性を有し、且つ植物の根に対して、伸長を促進する活性又は高浸透圧ストレス下での伸長抑制を阻害する活性を有するポリペプチド。
芳香族アミノ酸:Phe、Trp、Tyr
脂肪族アミノ酸:Ala、Leu、Ile、Va
極性アミノ酸:Gln、Asn
塩基性アミノ酸:Lys、Arg、His
酸性アミノ酸:Glu、Asp
水酸基を有するアミノ酸:Ser、Thr
側鎖の小さいアミノ酸:Gly、Ala、Ser、Thr、Met
本発明のポリペプチドは、本発明Ran遺伝子によりコードされているRanタンパク質に相当し、具体的には、上記(c)〜(e)のポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、植物体内で根の伸長を促進する作用を発揮するので、根伸長促進剤として有用である。また、本発明のポリペプチドは、植物体内で、高浸透圧ストレス条件下で生じる根の伸長抑制を阻害する作用を発揮するので、高浸透圧ストレス条件下における根の生育助剤としても有用である。本発明のポリペプチドを植物体内で発現させるには、本発明Ran遺伝子を用いて調製した組換えベクターを使用して、植物を形質転換する方法が好適である。
本発明の組換えベクターは、植物細胞形質転換用ベクターに本発明Ran遺伝子を挿入することにより得ることができる。植物細胞形質転換用ベクターとしては、植物細胞に遺伝子を導入しうる限り特に限定されないが、例えば、Tiプラスミド由来のpBI101, pBI121, pBI122(クロンテク社製)PBE2113-GUS(独立行政法人農業生物資源研究所製)等や、直接導入用ベクターとしては、pUC19等が用いられる。また、植物ウイルス由来のベクター、例えば、ジェミニウイルス由来のウイルスベクター(WDV等)、RNAウイルス由来のウイルスベクター(タバコモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、ポティウイルス由来のウイルスベクター等)を用いてもよい。更に、ベクターから切り出した機能しうるDNA断片を植物細胞中に直接導入したり、プロモーター、ポリAのいずれかまたは両方を持たないDNA断片を直接植物ゲノムに組み込み、内在性のプロモーターやポリAシグナルにより転写制御することも可能である。
本発明の組換えベクターを目的の宿主植物に導入することによって、根の伸長が促進されたトランスジェニック植物を作製することができる。
また本発明は、本発明Ran遺伝子を植物に導入、発現させることを特徴とする植物根の伸長促進方法を提供する。本発明では、本発明Ran遺伝子を上記の如く植物に導入することにより、当該植物の根、特に主根の伸長を促進することができる。このように、植物の根の伸長を促進することは、土壌からの栄養及び水分の補給能を向上させることになり、農作物の乾燥耐性向上、その増産や、植林木の生長促進に有効である。また、根の発達は、樹木の林立強度を増大させ、防風林、環境保全林の育成及び維持に有効である。
更に、本発明は、本発明Ran遺伝子を植物に導入、発現させることを特徴とする高浸透圧ストレス下での植物根の伸長抑制を阻害する方法を提供する。本発明では、本発明Ran遺伝子を上記の如く植物に導入することにより、高浸透圧ストレス条件下で生じる根の伸長抑制を阻害することができる。当該方法は、乾燥土壌や高塩土壌等でも根が旺盛に伸長できるので、高浸透圧ストレス環境に晒される植物に対して好適に適用される。
本発明のキットは、根の伸長が促進された植物、又は高浸透圧ストレス下においても根の伸長能が抑制されない植物を生産するために使用されるものである。当該キットは、本発明の組換えベクターを含むことを特徴とするものであり、必要に応じて、当該組換えベクターを植物細胞に導入するための試薬及び手順書等を含んでいてもよい。
参考例1 乾燥ストレスにより、野生種スイカの根由来タンパク質の発現に与える影響の解析
野生種スイカに乾燥ストレスを負荷し、乾燥ストレス負荷前後で野生種スイカの根において発現するンパク質の種類及び量を解析することにより、乾燥ストレス下での生育に関連するタンパク質の検出、同定を行った。具体的には、以下の方法に従って試験を実施した。
ボツワナ共和国カラハリ砂漠原産の野生種スイカ(Citrullus lanatus sp. No. 101117-1:鳥取県園芸試験場保存)の種を、蒸留水に浸潤し、37℃で約20時間インキュベートした。人工用土イソライト(粒径:2 mm, イソライト工業株式会社)をペーパーポット(750ml)に入れ、浸潤処理した種を播種した。これを人工気象機(明期:気温35℃、湿度50%、光強度700μmol photons m-2 s-1、16時間、暗期:気温25℃、湿度60%、8時間)(強光条件)中で、第4葉が完全展開するまで(約20日間)毎日潅水(約125ml/ポット)し栽培した。潅水用の水は2,000倍希釈した液体肥料(HYPONex;N:P:K=6:10:5;株式会社ハイポネックスジャパン製)を用いた。第4葉完全展開後に潅水を停止することで乾燥ストレスを付与し、0、1、3日後の根を回収した。
−80℃に保存した乾燥ストレス付与0日目、1日目、3日目の野生種スイカの根(各3〜4個体、約2.5g前後)を液体窒素の入った乳鉢で粉末状になるまですり潰した。約50mlの破砕用緩衝液(61.5mM K2HPO4、38.5mM KH2PO4、pH7.0、2mM MgCl2、10mM NaCl、1mM EDTA、10mM β-ME、1mM PMSF)を加えて更に擦り潰し、4重のガーゼ(スズラン株式会社)で濾過した。得られた抽出液を50ml容遠心管に分注し、遠心分離(2,000×g、4℃、10秒)を行い、夾雑物や未破砕細胞等を除いた。上清を新たな50ml容遠心管に移し、超遠心分離(100,000×g、4℃、1時間)を行った。その後、上清(可溶性画分)は別の50ml容チューブへ移し、等量のTCAを加えて氷上で30分間静置した。この溶液を遠心分離(15,000×g、4℃、15分間)して上清を除いた後、沈殿を100%アセトンに懸濁し、遠心分離(15,000×g、4℃、15分間)後、上清を除いて、アセトン沈殿を得た。
上記で得られたアセトン沈殿を2-DE用緩衝液(7M urea,、2M thiourea、4重量% CHAPS、0.5%(v/v) Triton X-100、0.5%(v/v) Immobiline pH Gradient buffer: pH4−7 (Amersham Pharmacia Science社)、100 mM DTT)で溶解した。室温で30分間撹拌後、遠心分離(15,000×g、4℃、1時間、室温)し、上清を二次元電気泳動のサンプルとした。得られたサンプルは分注後、−80℃で保存した。2-DE用緩衝液に溶解したタンパク質は、2-D Quant Kit(Amersham Pharmacia Science社)を用いて定量した。
24 cm Dry Strip gel用の膨潤トレイ( Amersham Pharmacia Science社)を水平に置き、1レーンにつきタンパク質サンプルを含む450 μlの膨潤用溶液(2-DE用緩衝液と同組成)を塗り込んだ。また、11cm用の膨潤トレイの場合は、1レーンにつき240 μlの膨潤用溶液を同様に塗り込んだ。Immobiline Dry Strip: 24cm、pH 4−7 (Amersham Pharmacia Science社)のフィルムを剥がしてゲル面を下にして空気が入らないようにトレイに置き、水分蒸発と尿素析出を防止する為に1レーンにつき1.5〜3mlのシリコンオイル:KF-96-1.5CS(信越化学工業株式会社)で覆った。その後、14〜20時間静置(4℃)してゲルを膨潤させた。
一次元目の泳動はAmersham Pharmacia Science社のMultiphorTMIIを使用した。膨潤済みのstrip gelを泳動層にセットし、ゲルの乾燥を防ぐためにシリコンオイルを泳動トレイに充填した。泳動条件は、step 1: 500V gradient, 2mA, 5 W, 1 min, 15℃;step 2: 500V, 2mA, 5W, 4 hr, 15℃;step 3: 3500V gradient, 2mA, 5W, 8 hr, 15℃;step 4: 3500V, 2mA, 5W, 40hr以上とした。
等電点電気泳動終了後、strip gel一本につき10 mlの一次平衡化緩衝液[ 50mM Tris-HCl (pH8.8), 6M urea, 30%(w/v) glycerol, 2%(v/v) SDS, 65mM DTT]中で室温15分振とうした。一次平衡化緩衝液を除去し、10mlの二次平衡化緩衝液[50mM Tris-HCl(pH8.8), 6M urea, 30%(w/v) glycerol, 2%(v/v) SDS, 135mM idoasetamide]を入れて、アルミホイルで遮光して室温15分振とうした。平衡化後、strip gelにelectrode buffer (25mM Tris-HCl (pH8.8), 190mM glycine, 3.5mM SDS)を加え、平衡化バッファーを洗い流した。
二次元目の電気泳動はEttan Daltsix Electrophoresis System(Amersham Pharmacia Science社)を用いて行った。アクリルアミドゲル溶液(以下は終濃度[30% acrylamide, 0.8% N,N,-methylenebisacrylamide], 1.5M Tris-HCl (pH 8.8), 10% SDS, 10% APS, 10% TEMED)をEttan Daltsix Gel Casterにセットしたカセットに流し込み、ゲル上部に水飽和ブタノールを適量添加してゲル界面が平らになるように調整した。ゲルは最低20時間4℃で静置し、完全に重合させた。
ゲルの染色にはColloidal Blue Staining Kit(Invitrogen社)を使用した。ゲル1枚につき100 mlの染色液を使用した。染色および脱色は室温でそれぞれ40時間以上、及び超純水で24時間以上振とうした。
ゲルの全体像はProPic(Genomic Solutions社)を用いて撮影し、HT Analyzer(Genomic Solutions社)によりタンパク質スポットの検出及び定量を行った。スポットの誤認識を防ぐために、目視により乾燥ストレス負荷後0、1、3日目の二次元電気泳動像を比較し補正することで、乾燥ストレス付与後経時的にタンパク質スポットの強度が増加しているスポットをHT Analyzerで検出した。乾燥ストレス負荷3日後の野生種スイカの根に発現しているタンパク質についての二次元電気泳動像を図1に示す。なお、スポット強度の定量には、ゲル間のタンパク質量や染色度合いの補正のために、ゲル間で強度変化のないスポットを10個程度選抜したものを用いた。さらに各スポット周辺のバックグラウンドは、HT Analyzerにより自動補正した。
乾燥ストレス負荷により、強度の増加が認められた複数のタンパク質スポットを切り取りTPX遠心管に移した。アセトニトリル100μlを加え15分間振とうによりゲルを脱水後、遠心エバポレーター(30分間)でゲルを完全に乾燥させた。40μlの10mM DTT/100mM NH4HCO3を加えて45分間56℃でインキュベートし、タンパク質のジスルフィド結合をSH基に還元した。SH基の再酸化を防ぐために、溶液を除去後、40μlの55 mM ヨードアセトアミド(ICH2CONH2)/100mM NH4HCO3を加え、室温・暗所で30分間インキュベートし、アルキル化した。アセトニトリルでゲルを脱水した後、遠心エバポレーターでゲルを乾燥させ、40μlの12.5ng/μlトリプシン(MSグレード、プロメガ社)/50mM NH4HCO3を加え4℃で45分間インキュベートした。次いで、溶液を除き、100μlの50mM NH4HCO3でゲル片を洗浄し、再度20μlの50mM NH4HCO3を加え、37℃で16時間反応させトリプシン消化を行った。トリプシン消化後の溶液は新たなTPX遠心管に移した。ゲル片に10μlの25mM NH4HCO3を加えて10分間振とうし、20μlのアセトニトリルを加え更に10分間振とう後、上清をTPX遠心管に移した。ゲル片に5%ギ酸(Wako)を10μl加えて10分間振とうし、25μlアセトニトリルを加え、更に10分間振とう後、TPX遠心管に移した。この操作を2回繰り返した。完全に乾燥させると再懸濁が困難なため回収用遠心管の溶液が約20μlになるまで遠心エバポレーターで蒸発させ、最後に5μlのギ酸を加えた。
上記で、トリプシン消化したペプチド断片は、イオントラップ型のliquid chromatography-tandem mass spectrometory(LC-MS/MS: LCQ-AdvantaseThermo Electron社)による質量分析により解析した。得られた質量分析データはMSCOT(Matrix Science社)によって植物を対象にNCBInr(National Center of Biotechnological Information)データベースの相同性検索を行った。
ボツワナ共和国カラハリ砂漠原産の野生種スイカ(Citrullus lanatus sp. No. 101117-1:鳥取県園芸試験場保存)の根から、TRizol(Invitorogen社)を用いて総RNAを抽出した。得られた総RNA 5μgからOligo(dT)プライマーを用いて1st strand cDNAを作製し、CLRAN1FL-F:5’- gataccttcctctcgcttt -3’(配列番号5)及びCLRAN1FL-R:5’- gcaaagagcatcatcaccac -3’(配列番号6)プライマーを用いて、RT-PCR法により目的cDNAを増幅させた。RT-PCRにはReverTra-Plus-TMKit(TOYOBO社)を用い、キットに付属のプロトコルに従って行なった。具体的には総RNA1μgにOligo(dT)プライマー5μlを加え、総量が12μlになるように調整した反応液を65℃で5分間処理後、氷中で急冷した。そこに5×RT buffer 4μl、10mM dNTPs 2μl、RNAse Inhibitor 1μl、ReverTra Ace 1μlを加え、総量が20μlになるように調整し、42℃で60分、85℃ 5分の処理を行なった。この反応産物 2μlに10×PCRバッファー 5μl、KOD-Plus- 1μl、25mM MgSO4 3μl、10mM dNTPs 1μlと、CLRAN1FL-FおよびCLRAN1FL-Rを各々15pmolずつ加え、総量が50μlになるように調整し、94℃ 2分処理後、98℃ 10秒、55℃ 30秒、68℃ 1分のサイクルを30回繰り返す反応を行ない、cDNAを得た。得られたcDNA増幅断片は1%アガロースで泳動後、QIAquickGel Extraction Kit(QIAGEN社)を用いて精製し、pT7Blue-2 T-Vecter (Novagen社)にDNA Ligation Kit (TaKaRa社)を用いてクローニングした。DNA配列はBigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems社)を用いて、ABI PRISMTM310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems社)により確認した。その結果、野生種スイカ由来のRan遺伝子CLRAN1(DRIP-49)(全長666bp、配列番号1に示すポリヌクレオチド)がクローニングできたことが確認された。
上記実施例1で得られたCLRAN1(DRIP-49)全長cDNAから、CLRAN1-F: 5’-aaaaagcaggctccttttccaatggctt-3’(配列番号7)及びCLRAN1-R :5’-agaaagctgggttttttactcgaacgcg-3’(配列番号8)プライマーを用いて、666bpのORF全長をPCRにより増幅し、植物細胞形質転換用ベクターpGWB2のカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターとノパリンシンターゼターミネーター間に、GATEWAYシステム(Invitrogen社)を用いた組み換え反応により導入し、CLRAN1(DRIP-49)導入プラスミドを構築した。
CLRAN1(DRIP-49)導入プラスミドはエレクトロポレーション法によりアグロバクテリ
ウム(Agrobacterium tumefaciens)EHA105株へ形質転換した。シロイヌナズナへの形質転換は、常法に従いアグロバクテリウムを用いた減圧浸潤法(細胞工学別冊 植物細胞工学シリーズ21 改許3版 モデル植物の実験プロトコール イネ・シロイヌナズナ・ミヤコグサ編、第4章4節「減圧浸潤法および花序浸し法によるシロイヌナズナの形質転換」、秀潤社、2005年4月5日、第3版第1刷発行)により行った。
上記実施例3で得られた6ラインのT3種子(RAN1-2、RAN1-3、RAN1-4、RAN1-6、RAN1-7、及びRAN1-9)を、2重量%のシュクロースを含むムラシゲ-スクーグ寒天培地を用いて、光照度100 μmol/m2/s、明期16時間、暗期8時間、23℃の条件下で2週間栽培した。2週間後に、植物体の主根長を測定した。また、コントロールとして、インサートを含まないベクターpGWB2で形質転換したシロイヌナズナのT3種子も同様に栽培し、植物体の主根長を測定した。
上記実施例3で得られた2ラインのT3種子(RAN1-6及びRAN1-11)を、シュクロースを含まない1/2強度のムラシゲ-スクーグ培地を用いて光照度100 μmol/m2/s、明期24時間、23℃で3日間栽培した。その後、5重量%ポリエチレングリコール6000を含む1/2強度のムラシゲ-スクーグ培地に移植し、23℃で4日間栽培後の主根長を測定した。なお、コントロールとしてはインサートを含まないベクターpGWB2で形質転換したシロイヌナズナのT3種子を用いた。
Claims (12)
- 以下の(a)又は(b)のDNAからなるポリヌクレオチドで植物を形質転換する工程を含む、根の伸長が促進された植物の作製方法:
(a)配列番号1又は2で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1又は2で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ植物の根に対して、伸長を促進する活性又は高浸透圧ストレス下での伸長抑制を阻害する活性を有するタンパク質をコード
するDNA。 - 以下の(a)又は(b)のDNAからなるポリヌクレオチドを植物細胞に導入する工程を含む、高浸透圧ストレス下において根の伸長能が抑制されていない植物の作製方法:
(a)配列番号1又は2で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1又は2で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ植物の根に対して、伸長を促進する活性又は高浸透圧ストレス下での伸長抑制を阻害する活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 以下の(a)又は(b)のDNAからなるポリヌクレオチドを植物細胞に導入することを特徴とする、植物の根の伸長を促進させる方法:
(a)配列番号1又は2で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1又は2で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ植物の根に対して、伸長を促進する活性又は高浸透圧ストレス下での伸長抑制を阻害する活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 以下の(a)又は(b)のDNAからなるポリヌクレオチドの植物の根の伸長を促進させるための使用:
(a)配列番号1又は2で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1又は2で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ植物の根に対して、伸長を促進する活性又は高浸透圧ストレス下での伸長抑制を阻害する活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 以下の(a)又は(b)のDNAからなるポリヌクレオチドを植物に導入することを特徴とする、高浸透圧ストレス条件下での植物根伸長抑制を阻害する方法:
(a)配列番号1又は2で表される塩基配列からなるDNA
(b)配列番号1又は2で表される塩基配列からなるDNAと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ植物の根に対して、伸長を促進する活性又は高浸透圧ストレス下での伸長抑制を阻害する活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 配列番号1又は2で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
- 配列番号3又は4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号3又は4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 請求項6又は7に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
- 請求項6又は7に記載のポリヌクレオチドで形質転換されたトランスジェニック植物。
- 請求項6又は7に記載のポリヌクレオチドを含む、植物の根伸長促進剤。
- 根の伸長が促進された植物、又は高浸透圧ストレス下においても根の伸長能が抑制されない植物を作製するためのキットであって、請求項9に記載の組換えベクターを含有することを特徴とする、キット。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008502870A JP5444560B2 (ja) | 2006-03-03 | 2007-03-02 | 根の伸長が促進されている植物、及びその作製方法 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2006058746 | 2006-03-03 | ||
JP2006058746 | 2006-03-03 | ||
PCT/JP2007/054041 WO2007100094A1 (ja) | 2006-03-03 | 2007-03-02 | 根の伸長が促進されている植物、及びその作製方法 |
JP2008502870A JP5444560B2 (ja) | 2006-03-03 | 2007-03-02 | 根の伸長が促進されている植物、及びその作製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2007100094A1 JPWO2007100094A1 (ja) | 2009-07-23 |
JP5444560B2 true JP5444560B2 (ja) | 2014-03-19 |
Family
ID=38459189
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008502870A Expired - Fee Related JP5444560B2 (ja) | 2006-03-03 | 2007-03-02 | 根の伸長が促進されている植物、及びその作製方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7956241B2 (ja) |
JP (1) | JP5444560B2 (ja) |
CN (1) | CN101395270B (ja) |
AU (1) | AU2007221680B2 (ja) |
CA (1) | CA2638809A1 (ja) |
WO (1) | WO2007100094A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20130174299A1 (en) * | 2010-09-22 | 2013-07-04 | Akiho Yokota | Method for production of stolon-forming plant having improved tuber production ability or stolon production ability compared with wild type, and stolon-forming plant produced by the method |
KR101296619B1 (ko) | 2011-01-11 | 2013-08-14 | 경상대학교산학협력단 | 벼 유래 OsIDD10 유전자의 발현을 조절함으로써 식물의 뿌리 형태를 조절하는 방법 |
WO2013015287A1 (ja) * | 2011-07-25 | 2013-01-31 | 国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学 | 根の伸長誘導又はバイオマス量を増大させる新規遺伝子及びその利用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040034888A1 (en) * | 1999-05-06 | 2004-02-19 | Jingdong Liu | Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1126817C (zh) * | 2000-12-15 | 2003-11-05 | 南京农业大学 | 一种编码植物生长调节剂的基因、表达产物及其用法 |
US6759576B2 (en) * | 2002-03-05 | 2004-07-06 | Syngenta Participations Ag | Enhanced pollenizer and method for increasing seedless watermelon yield |
CN100355896C (zh) * | 2004-07-30 | 2007-12-19 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 双转基因耐盐植物的培育方法 |
-
2007
- 2007-03-02 US US12/224,439 patent/US7956241B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-03-02 CA CA002638809A patent/CA2638809A1/en not_active Abandoned
- 2007-03-02 WO PCT/JP2007/054041 patent/WO2007100094A1/ja active Search and Examination
- 2007-03-02 AU AU2007221680A patent/AU2007221680B2/en not_active Ceased
- 2007-03-02 JP JP2008502870A patent/JP5444560B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-03-02 CN CN2007800073123A patent/CN101395270B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040034888A1 (en) * | 1999-05-06 | 2004-02-19 | Jingdong Liu | Nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
JPN6012032967; Plant J. Vol.6, No.4, 1994, p.555-565 * |
JPN6012032968; Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.91, 1994, p.5863-5867 * |
JPN6012032969; Plant J. Vol.11, No.1, 1997, p.93-103 * |
JPN6012032970; GenBank , 20020415, accession No. AF495716 * |
JPN6013008824; 日本農芸化学会大会講演要旨集 , 2005, p.144, 29H026beta * |
JPN6013008827; 第46回日本植物生理学会年会要旨集 , 2005, p.150, 2aE09(199) * |
JPN6013008830; 第28回日本分子生物学会年会講演要旨集 , 2005, p.589, 3P-0146 * |
JPN6013008833; J.Biol.Chem. Vol.273, No.36, 1998, p.22857-22860 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2007221680A1 (en) | 2007-09-07 |
US20090055971A1 (en) | 2009-02-26 |
AU2007221680B2 (en) | 2012-07-05 |
CN101395270A (zh) | 2009-03-25 |
CN101395270B (zh) | 2012-02-22 |
CA2638809A1 (en) | 2007-09-07 |
JPWO2007100094A1 (ja) | 2009-07-23 |
AU2007221680A2 (en) | 2008-09-25 |
US7956241B2 (en) | 2011-06-07 |
WO2007100094A1 (ja) | 2007-09-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100359598B1 (ko) | 노화 특성이 변화된 형질전환 식물 | |
ES2307491T3 (es) | Metodos y medios para la modificacion de caracteristicas de la planta usando la vernalizacion gen vrn2. | |
US9809827B2 (en) | Transgenic maize | |
Manjulatha et al. | Overexpression of a pea DNA helicase (PDH45) in peanut (Arachis hypogaea L.) confers improvement of cellular level tolerance and productivity under drought stress | |
CN105753953B (zh) | 小麦抗病蛋白与编码基因及其在调控植物抗病性中的应用 | |
CN109206493A (zh) | Zm-Remorin基因在玉米南方锈病防治中的应用 | |
Zhao et al. | Downregulation of SL-ZH13 transcription factor gene expression decreases drought tolerance of tomato | |
US20150128304A1 (en) | Plant Body Showing Improved Resistance Against Environmental Stress and Method for Producing Same | |
KR101608175B1 (ko) | 고추 RING Finger 단백질 유전자 CaAIR1 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진방법 | |
ES2376003T3 (es) | Uso de trehalosa-6-fosfato sintasa para modular el crecimiento vegetal. | |
JP5444560B2 (ja) | 根の伸長が促進されている植物、及びその作製方法 | |
US5731419A (en) | Freezing tolerance proteins Wcs19 and Wcor410 from gramineae | |
ES2326789T3 (es) | Plantas transgenicas con el gen de la enzima para la segmentacion de neoxantina. | |
WO2018234191A1 (en) | INCREASED STRENGTH IN DROUGHT IN PLANTS | |
AU2015202487B2 (en) | Gene capable of increasing plant biomass production and method for utilizing the same | |
JP4998809B2 (ja) | 植物の鉄欠乏耐性を向上させるポリペプチドおよびその利用 | |
CN107827963B (zh) | 拟南芥idd14基因在提升植物干旱胁迫耐性中的应用 | |
Lechner et al. | A gene trap Dissociation insertion line, associated with a RING-H2 finger gene, shows tissue specific and developmental regulated expression of the gene in Arabidopsis | |
JP5142247B2 (ja) | 植物ウイルス抵抗性植物の製造方法及びその利用 | |
CN107739403B (zh) | 一种与植物开花期相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
JP2003334084A (ja) | ストレスに応答する根特異的遺伝子 | |
KR102674984B1 (ko) | CaSIRF1 유전자 및 이를 이용한 식물체의 건조 스트레스 저항성 증진 방법 | |
JP4776216B2 (ja) | 新規な植物細胞死誘導因子NbCD1 | |
KR101251615B1 (ko) | 식물의 방어반응에 관여하는 고추식물 유래 CaLecRK1 유전자 및 그 용도 | |
CN109777805B (zh) | 矮牵牛锌指蛋白基因PhZFP1及其在提高植物抗寒性中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100216 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120626 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120815 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130226 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130425 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131203 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 5444560 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |