ES2376003T3 - Uso de trehalosa-6-fosfato sintasa para modular el crecimiento vegetal. - Google Patents

Abstract

El uso de la inactivación de una trehalosa-6-fosfato sintasa de clase II vegetal para promover el crecimiento vegetal.

Description

Uso de trehalosa-6-fosfato sintasa para modular el crecimiento vegetal

La presente invención se refiere al uso de la inactivación de una trehalosa-6-fosfato sintasa vegetal de clase II para promover el crecimiento vegetal. Más específicamente, se refiere al uso de la inactivación de la trehalosa-6-fosfato sintasa de clase II, que comprende tanto una parte similar a sintasa como una parte similar a fosfatasa, para promover el crecimiento vegetal. Preferiblemente, la actividad de la trehalosa-6-fosfato sintasa de clase II se disminuye para obtener una mayor producción de biomasa vegetal. La trehalosa es un disacárido muy extendido, que aparece en bacterias, hongos, insectos y plantas. En microbios, la acumulación de trehalosa está asociada generalmente con resistencia a estrés, no al menos con resistencia a estrés osmótico y de desecación. En plantas, sin embargo, excepto para algunas plantas de la resurrección tales como Selaginella lepidophylla, el papel de la trehalosa es menos claro.

En la mayoría de los casos, la síntesis de trehalosa es un proceso de dos etapas en el que la trehalosa-6-fosfato sintasa (TPS) sintetiza trehalosa-6-fosfato (T6P), seguido de una desfosforilación hasta trehalosa mediante T6P fosfatasa (TPP). Aunque en la mayoría de las plantas la trehalosa es muy poco detectable, están presentes múltiples homólogos tanto del gen de TPS como de TPP, por ejemplo en Arabidopsis (Vogel et al., 2001; Leyman et al., 2001; Eastmond et al., 2003). La acumulación de trehalosa obtenida en plantas transgénicas, transformadas con genes heterólogos de la biosíntesis de trehalosa, conduce a una tolerancia mejorada a estrés abiótico (Garg et al., 2002; Jang et al., 2003). Sin embargo, la ausencia de acumulación significativa de trehalosa en la mayoría de las plantas, a pesar de la presencia de múltiples genes de la biosíntesis de trehalosa, prueba el papel regulador de los productos génicos en lugar del papel de la trehalosa como protector contra el estrés. De hecho, varios autores sugieren un papel regulador para TPS (Avonce et al 2004) y su producto génico T6P en el metabolismo del azúcar (Eastmond et al., 2003) y la síntesis del almidón (Kolbe et al., 2005). T6P es indispensable para la utilización de hidratos de carbono y el crecimiento (Schluepmann et al., 2003), pero la acumulación de T6P parece provocar una inhibición del crecimiento en plántulas (Schluepmann et al., 2004). Los actuales datos son algunas veces contradictorios, y el papel de los genes de la biosíntesis de trehalosa todavía está lejos de estar claro. Ninguna de estas publicaciones relaciona un posible papel de TPS de las plantas, en particular TPS vegetal de clase II, con el crecimiento y producción vegetales.

El documento EP0901527 describe la regulación del metabolismo vegetal modificando el nivel de T6P. Más específicamente, se reivindica un incremento en la producción de plantas incrementando la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato. Sin embargo, bastante contradictoriamente, también se reivindica la estimulación del crecimiento de una célula o tejido vegetal disminuyendo la disponibilidad intracelular de trehalosa-6-fosfato. Nuevamente, como se muestra en la bibliografía reciente, esto indica que el balance de T6P es muy delicado, y está lejos de ser sencillo. Se llevó a cabo la modulación del contenido de T6P expresando genes heterólogos de TPS y TPP en la planta. Aunque la patente menciona que se pueden obtener resultados similares mediante un aumento o disminución de los genes endógenos, se podría esperar que, debido al gran número de genes vegetales, la supresión o sobreexpresión de uno de esos genes tiene sólo un efecto limitado sobre la concentración de T6P, si es que la tiene en absoluto. Esto es especialmente cierto para los genes de TPS de clase II, en los que están presentes tanto un dominio semejante a sintasa como un dominio semejante a fosfatasa. Si ambos dominios están activos, el producto final sería trehalosa en lugar de T6P. Además, para al menos dos genes de TPS de clase II de Arabidopsis, AtTPS7 y AtTPS8, no se pudo detectar ninguna actividad de sintasa ni de fosfatasa (Vogel et al., 2001; Eastmond et al., 2003), dando a entender que una manipulación de estos genes no afectaría en absoluto al contenido de T6P de la planta.

Sorprendentemente, se encontró que la inactivación de una TPS de clase II vegetal se puede usar para promover el crecimiento vegetal y la producción de biomasa. De hecho, contrariamente a lo que se podría esperar en base a la bibliografía, la inactivación de la actividad de TPS vegetal conduce a un incremento del crecimiento del tallo y de las raíces, y a un aumento de la biomasa vegetal.

Un primer aspecto de la invención es el uso de la inactivación de una TPS de clase II vegetal para la promoción del crecimiento vegetal. El término “vegetal”, como se usa aquí, engloba plantas completas, ancestros y progenie de las plantas, y partes vegetales, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores, y tejidos y órganos, en el que cada uno de los mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término “vegetal” también engloba células vegetales, cultivos en suspensión, tejido de callo, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, en el que, nuevamente, cada uno de los mencionados anteriormente comprende el gen/ácido nucleico de interés. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. Como ejemplo no limitante, puede ser una cosecha usada para alimento o forraje, por lo que el incremento de raíces, hojas, tallo o biomasa de semillas aumenta el rendimiento de la cosecha. Como alternativa, la cosecha se puede usar con fines ornamentales o industriales, tal como la producción de almidón, o se puede usar como materia prima para la producción de biocombustible. Las cosechas conocidas para biocombustible son conocidas por la persona experta en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a,

cosechas alimentarias tales como maíz, haba de soja, linaza, colza, caña de azúcar, cosechas industriales, tales como cáñamo y panizo de pradera, pero también biomasa maderera tal como álamo y sauce.

TPS, como se usa aquí, se refiere a la homología estructural del gen y proteína con otros miembros de la familia de trehalosa-6-fosfato, pero no implica que la proteína tiene una actividad sintetizadora de trehalosa-6-fosfato efectiva. Preferiblemente, dicha TPS tiene un dominio homólogo a la glucosil transferasa 20 (pfam00982.12). El término “dominio” se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo de un alineamiento de secuencias de proteínas evolutivamente relacionadas. Mientras que los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos que están muy conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que son probablemente esenciales en la estructura, estabilidad o actividad de una proteína. Identificados mediante su grado elevado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos proteicos, se pueden usar como identificadores para determinar si cualquier polipéptido en cuestión pertenece a una familia polipeptídica previamente identificada. Como ejemplo no limitante, debido a su estructura, TPS, como se usa aquí, puede tener una actividad de T6P fosfatasa, o una combinación de actividad de sintasa y fosfatasa. El uso de la inactivación de TPS, como se menciona aquí, cubre el uso de la inactivación del gen, el uso de la inactivación de la proteína, así como el uso de compuestos que disminuyen la actividad de la proteína. Como ejemplo no limitante, un compuesto que disminuye la actividad de la TPS puede ser un anticuerpo inactivador anti-TPS.

Preferiblemente dicha TPS es una TPS de clase II, según la clasificación en Arabidopsis thaliana. Una TPS de clase II comprende tanto un dominio semejante a trehalosa-6-fosfato sintasa, así como un dominio semejante a trehalosa6-fosfato fosfatasa (Leyman et al, 2001, Vogel et al., 2001); preferiblemente, dicha TPS de clase II comprende un dominio semejante a trehalosa-6-fosfato sintasa, así como un dominio semejante a trehalosa-6-fosfato fosfatasa que comprende una caja de fosfatasa con la secuencia LDYD (G/D) T y/o una caja de fosfatasa con la secuencia GDD(R/Q)SD; más preferiblemente, dicha TPS de clase II comprende tanto un dominio semejante a trehalosa-6fosfato sintasa como un dominio semejante a trehalosa-6-fosfato fosfatasa que comprende al menos una, preferiblemente dos cajas de fosfatasa como se describe por Leyman et al. (2001). Incluso más preferiblemente, dicha TPS se selecciona de un grupo que consiste en SEC ID Nº 1-15 (AtTPS5-11, ortólogo del arroz, ortólogos del álamo), o sus homólogos, ortólogos o parálogos. “Homólogos” de una proteína engloba péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos con relación a la proteína sin modificar en cuestión, y que tienen actividad biológica y funcional similar a la proteína sin modificar de la que derivan. Una supresión se refiere a la eliminación de uno o más aminoácidos de una proteína. Una inserción se refiere a la introducción de uno o más restos de aminoácidos en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones N-terminales y/o C-terminales, así como inserciones intrasecuencias de aminoácidos individuales o múltiples aminoácidos. Una sustitución se refiere a una sustitución de aminoácidos de la proteína por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (tal como similar hidrofobia, hidrofilia, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras helicoidales ! o estructuras de láminas ∀). Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de restos individuales, pero se pueden agrupar dependiendo de las restricciones funcionales sobre el polipéptido; las inserciones serán habitualmente del orden de alrededor de 1 a 10 restos de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos son preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas. Las tablas de sustituciones conservativas son bien conocidas en la técnica.

“Ortólogos” y “parálogos” engloban conceptos evolutivos usados para describir las relaciones ancestrales de genes. Los parálogos son genes dentro de la misma especie que se han originado a través de la duplicación de un gen ancestral, y los ortólogos son genes procedentes de diferentes organismos que se han originado a través de evolución de las especies. Los ortólogos y parálogos se pueden encontrar fácilmente llevando a cabo una denominada búsqueda BLAST recíproca. Típicamente, esto implica utilizar un primer programa BLAST que implica comparar mediante alineamiento SEC ID Nº 1 o SEC ID Nº 4 como secuencia problema (query), usando BLASTP o TBLASTN (usando valores estándar por defecto). Los resultados de BLAST se pueden filtrar opcionalmente. Las secuencias de longitud completa de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados se vuelven entonces a someter a un programa BLAST (segundo BLAST) frente a secuencias del organismo del que deriva la secuencia problema (cuando la secuencia problema corresponde a AtTPS8 o AtTPS5, el segundo BLAST sería por lo tanto frente a secuencias de Arabidopsis thaliana). Entonces se comparan los resultados del primer y segundo BLASTs. Un parálogo se identifica si un acierto de clasificación elevada del primer BLAST es de la misma especie de la que deriva la secuencia problema, y un nuevo BLAST daría entonces idealmente como resultado la secuencia problema entre el acierto más elevado; un ortólogo se identifica si un acierto de clasificación elevada en el primer BLAST no es de la misma especie de la que deriva la secuencia problema, y preferiblemente los resultados con el nuevo BLAST en la secuencia problema están entre los aciertos más elevados. Los aciertos de clasificación elevada son aquellos que tienen un bajo valor E. Cuanto menor es el valor E, más significativa es la puntuación (o, en otras palabras, menor es la probabilidad de que se encuentre el acierto por casualidad). La computación del valor E es bien conocida en la técnica. Además de los valores E, las comparaciones también se pueden puntuar mediante porcentaje de identidad. Porcentaje de identidad se refiere al número de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias polipeptídicas comparadas, a lo largo de una longitud particular. En el caso de grandes familias, se puede usar ClustalW, seguido de un árbol de unión de vecinos, para ayudar a visualizar el agrupamiento de genes relacionados e identificar ortólogos y parálogos. Como alternativa, los homólogos, ortólogos y parálogos se pueden

identificar mediante búsquedas de dominios de un dominio de trehalosa sintasa, y de uno de los dominios de fosfatasa. La secuencia proteica de longitud completa se compara entonces con SEC ID Nº 4, usando bl2seq (Tatusova y Madden, 1999). Usando este alineamiento, un ortólogo o parálogo tiene al menos identidades del 50%, preferiblemente identidades del 55%, más preferiblemente identidades del 60%. Como ejemplos no limitantes, los ortólogos de AtTPS8 están presentes en Oryza sativa (números de acceso de Genpept ABF94728, BAF06162 y BAF11342), Brassica oleracea (número de acceso de Genpept ABD65165), Medicago trunculata (número de acceso de Genpept ABE86430), Cypripedium parviflorum (número de acceso de Genpept AAN86570) y Ginlo biloba (número de acceso de Genbank AAX16015.

En una realización preferida, dicha TPS es AtTPS8 (SEC ID Nº 4). En otra realización preferida, dicha TPS es AtTPS5 (SEC ID Nº 1).

Preferiblemente, dicho uso es una inactivación de la actividad de TPS, y dicha promoción es un incremento en la biomasa vegetal y/o rendimiento vegetal. Los métodos para inactivar la actividad de TPS son conocidos por la persona experta en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, la desactivación génica, el uso de ARNi, silenciamiento génico, desactivación del promotor de TPS, mutaciones inactivadoras en el promotor de TPS o en la región codificante, o la síntesis por la planta de anticuerpos inactivadores frente a TPS. Preferiblemente, se obtiene un aumento de la biomasa vegetal y/o del rendimiento vegetal mediante el aumento del crecimiento de las raíces, el aumento del grosor del tallo, el aumento del número de hojas y/o el aumento del tamaño de las semillas. Una realización preferida es el uso de la inactivación de TPS para promover el crecimiento vegetal, mediante lo cual dicha modulación se obtiene en ausencia de luz. El término “rendimiento” significa en general un producto medible de valor económico, típicamente relacionado con una cosecha específica, con un área, o con un período de tiempo. Las partes individuales de las plantas contribuyen directamente al rendimiento basándose en su número, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por acre para una cosecha y año, que se determina dividiendo la producción total (incluye la producción tanto cosechada como tasada) por acres plantadas. Los términos “incrementar”, “mejorar” o “potenciar” son intercambiables, y significarán, en el sentido de la aplicación, al menos un 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10%,preferiblemente al menos 15% o 20%, más preferiblemente 25%, 30%, 35% o 40% más rendimiento y/o crecimiento en comparación con plantas de control como se define aquí. Un aumento del rendimiento de las semillas se puede manifestar por sí mismo como uno o más de los siguientes: a) un incremento en la biomasa de las semillas (peso total de semillas), que puede ser en una base de semilla individual y/o por planta y/o por hectárea o acre; b) un aumento del número de flores por planta; c) un aumento del número de semillas (llenas); d) un aumento de la tasa de llenado de semillas (que se expresa como la relación entre el número de semillas llenas dividido entre el número total de semillas); e) un aumento del índice de cosechas, que se expresa como la relación del rendimiento de partes cosechables, tales como semillas, dividido entre la biomasa total; y f) un aumento del peso de mil granos (TKW), que se extrapola a partir del número de semillas llenas contadas y su peso total. Un incremento de TKW puede resultar de un incremento del tamaño de las semillas y/o peso de las semillas, y también puede resultar de un incremento en el tamaño de embriones y/o endosperma.

Otro aspecto de la invención es el uso de la inactivación de una TPS de clase II vegetal, como se define anteriormente, para la promoción de la síntesis de almidón. Preferiblemente, dicha promoción es un incremento en la síntesis de almidón. Preferiblemente, dicha TPS es una TPS de clase II, según la clasificación en Arabidopsis thaliana. Una TPS de clase II comprende tanto un dominio semejante a trehalosa-6-fosfato sintasa como un dominio semejante a trehalosa-6-fosfato fosfatasa (Leyman et al, 2001, Vogel et al., 2001). Incluso más preferiblemente, dicha TPS se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº 1-15 (TPS5-11, ortólogo del arroz, ortólogo del álamo). En una realización preferida, dicha TPS es AtTPS8 (SEC ID Nº 4). En otra realización preferida, dicha TPS es AtTPS5 (SEC ID Nº 1).

Todavía otro aspecto de la invención es un método para mejorar diversos rasgos relacionados con el rendimiento en plantas con relación a plantas de control, que comprende modular la expresión y/o traducción en una planta de un ácido nucleico de TPS de clase II y/o un polipéptido de TPS de clase II, en el que dicha expresión modulada consiste en una reducción o eliminación sustancial de la expresión y/o producción de un gen endógeno de TPS de clase II en una planta. Como ejemplo no limitante, dicha reducción o eliminación sustancial se puede obtener mediante silenciamiento de la expresión génica mediado por ARN, mediante coexpresión, mediante el uso de secuencias de ácido nucleico antisentido de TPS de clase II, o mediante el uso de

Todavía otro aspecto de la invención es el método para la producción de una planta transgénica que tiene un rendimiento aumentado con relación a plantas de control, método el cual comprende:

(i)

introducir y expresar en una planta un constructo genético que comprende una o más secuencias de control para reducir la expresión y/o traducción en una planta de un gen endógeno de TPS de clase II; y

(ii)

cultivar la planta, parte vegetal o célula vegetal en condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo vegetal.

Las secuencias de control, como se usa aquí, son secuencias que incluyen en la expresión y/o traducción el gen de TPS de clase II, conocidas por la persona experta en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, secuencias que provocan la coexpresión, secuencias que codifican ARN antisentido, y ARNi.

También se describe una planta, obtenible según el método de la invención, por lo que dicha planta tiene una expresión reducida de un gen endógeno de TPS de clase II debido a la introducción, en una planta, de una secuencia de ácido nucleico de control de TPS de clase II. La expresión reducida, como se usa aquí, es una expresión que está sustancialmente disminuida cuando la expresión se compara con una planta de control no transformada que se hizo crecer en las mismas condiciones. Los métodos para medir la expresión son conocidos por la persona experta en la técnica; una reducción sustancial es una reducción con preferiblemente 10%, más preferiblemente 20%, e incluso más preferiblemente 30%.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Longitud de la raíz de AtTPS8 KO en medio MS, con y sin sacarosa, en luz y en la oscuridad. GT2, GT4 y GT6 son diferentes líneas KO de AtTPS8

Figura 2: Niveles de expresión de AtCYCD3 y ApL3 en el contexto de AtTPS8 KO

Figura 3: Caracterización fenotípica de las plantas adultas con AtTPS8 KO en comparación con plantas WT

Figura 4: Datos de la expresión de AtTPS5 de SALK_144791

Figura 5: Medidas de la longitud de las raíces de la línea SALK_144791.

Figura 6: Fenotipo de la línea SALK_144791 AtTPS5 KO, en comparación con WT (Columbia), en medio 1 x MS, 1% de sacarosa.

Figura 7: Fenotipo de la línea SALK_144791 AtTPS5 KO, en comparación con WT (Columbia), en medio 1 x MS, 1% de sacarosa: ensayo sobre el efecto agravitrófico.

Figura 8: Datos de expresión de AtTPS5 de GT12622

Figura 9: Fenotipo de la línea de Gene Trap GT12622 AtTPS5 KO, en comparación con WT (Landsberg erecta), en medio 1 x MS, 1% de sacarosa.

Figura 10: Fenotipo de la línea de Gene Trap GT12622 AtTPS5 KO, en comparación con WT (Landsberg erecta), en medio 1 x MS, 1% de sacarosa: ensayo sobre el efecto agravitrófico.

Ejemplos

Materiales y métodos para los ejemplos

Material vegetal para AtTPS8

Se transformaron plantas de Arabidopsis de tipo salvaje (Columbia) con constructos de silenciamiento y de sobreexpresión (véase posteriormente). Además, se obtuvo una línea de Gene Trap (GT13138, Landsberg erecta) a través del laboratorio de Martienssen en Cold Spring Harbor Laboratory. Para estudiar el fenotipo de estas plantas, se obtuvieron líneas homocigotas. Se esterilizó la superficie de las semillas, y se hicieron germinar en cápsulas de Petri orientadas verticalmente en medio 1x de Murashige y Skoog (Duchefa) solidificado con agar puro (Duchefa), con 1% de sacarosa o sin sacarosa (como se indica en las figuras), en un ciclo diario de 12 h a 22ºC y 12 h de oscuridad a 18ºC. Diez días después de la germinación, se midió la longitud de las raíces de las plantas. Las plantas que se hicieron crecer en condiciones de oscuridad se mantuvieron en la oscuridad durante todo el período de tiempo.

Constructos

Para el silenciamiento de AtTPS8 (At1g70290) en Arabidopsis, se usaron los vectores de Gateway, pDONR207 y pK7GWIWG2 (Karimi et al, 2002). Se amplificaron 149 pb de una secuencia específica de AtTPS8 con dos cebadores que contienen los sitios de recombinación AttB1 y AttB2. Cebador directo, GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGC-TCCGAAGTAACTTCTACCTCC; cebador inverso, GGGGACCACTTTGTACAAG-AAAGCTGGGTCCCATCTCTAAGTTGTAACTG. El constructo se transformó en células de Agrobacterium competentes (cepa C58C1), y se transformó en plantas de Arabidopsis WT usando el método inmersión de tejidos florales (Clough, 2005). Se seleccionaron semillas T0 en canamicina, y se transfirieron al suelo para fijar las semillas. Estas semillas T1 se seleccionaron nuevamente en canamicina, y se cribaron en busca de líneas T2 homocigotas.

El constructo de sobreexpresión de AtTPS8 se obtuvo usando el vector vegetal PCB302. AtTPS8 de longitud completa se amplificó a partir de ADNc de protoplasto con los siguientes cebadores: cebador directo, CGGGATCCATGGTGTCAAGATCTTGTGCTAA; cebador inverso, AAGGCC-TAACGATGCTTTCAAATGCAACTT. El constructo se transformó en Agrobacterium y plantas como se describe anteriormente.

Línea de Gene Trap

La línea de Gene Trap (GT13138, Landsberg erecta) se obtuvo del laboratorio de Martienssen en Cold Spring Harbor Laboratory. Un vector pWS32, que contiene un elemento transposable Ds con el gen ∀-glucuronidasa (GUS) como informador y el gen de neomicin fosfotransferasa (NPTII) como marcador seleccionable, se transformó en Arabidopsis, en la que se insertó aleatoriamente en el genoma. Los ensayos de glucuronidasa revelaron inserciones en exones de diferentes genes. Los sitios de inserción se amplificaron entonces mediante TAIL PCR (Liu et al, 1995), y se secuenciaron. Estas secuencias se validaron y anotaron según la secuencia del genoma de Arabidopsis.

Material vegetal para AtTPS5

La línea SALK “SALK 144791” (Arabidopsis thaliana, ecotipo Columbia) estaba disponible a partir de la colección de Alonso/Crosby/Ecker de plantas transformadas con T-DNA de Agrobacterium, y se ordenó en NASC/ABRC. La secuencia de ADN de flanqueo de T-DNA se recuperó y se secuenció por el Salk Institute Genomic analysis Laboratory (SIGnAL), USA, y se predijo que estaba en el primer exón del gen de AtTPS5 (At4g17770). Las líneas indexadas de secuencias ordenadas segregaron líneas T3. Con el marcador NTPII (resistencia a canamicina) y PCR, se seleccionaron plantas homocigotas, en lo sucesivo denominadas como línea 070(2) (cebador directo: 5’TCCTGCTTATATCCCACCTGAGC3’; y cebador inverso: 5’GCGCCGCTTAAAGAAGGAGAA3’). Las secuencias se obtuvieron con el cebador de T-DNA del borde izquierdo (Lba1: 5’TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG3’), y el T-DNA se encontró en la posición 923 con relación al codón de INICIO en el ADNc de AtTPS5.

La línea de Gene Trap GT12622 (Arabidopsis thaliana, ecotipo Landsberg erecta) se ordenó de la colección de líneas de inserción de transposones producidas en la laboratorio de Martienssen de Cold Spring Harbor Laboratory, USA (Sundaresan et al., 1995; Martienssen, 1998). La línea se generó usando los transposones Disociación (Ds) del maíz, manipulados mediante ingeniería para que portasen un gen informador uidA (∀-glucuronidasa (GUS)) y un gen de resistencia a canamicina NPTII (neomicin fosfotransferasa). Los genes informadores de Gene Trap no tienen promotor, de forma que la expresión de GUS sólo se puede producir cuando el informador se inserta en un gen cromosómico transcrito, creando una fusión transcripcional. Estos elementos monitorizan simultáneamente la expresión génica y destruyen la función del gen endógeno. El constructo de Gene Trap tiene un aceptor con múltiples empalmes fusionado al gen de GUS. Basándose en las secuencias de flanqueo del sitio de inserción obtenidas mediante TAIL-PCR, CSHL predijo que la línea GT12622 posee una única inserción de un elemento DS transposable de Gene Trap en alguna parte en el extremo del primer exón del gen de AtTPS5 (At4g17770). Las líneas indexadas de secuencias suministradas fueron semillas F3. Con el marcador de canamicina y la PCR, se obtuvieron líneas desactivadas de AtTPS5 homocigotas (F5), en lo sucesivo denominadas como línea GT4.1 y GT6.2. Se diseñaron cebadores específicos de los genes (cebador directo: 5’TTGGGCGCGTAGCTTTATAC3’, y cebador inverso: 5’CAAGAAGATATGAAAACAGCCTCA3’), junto con cebadores en los bordes del constructo de Gene Trap, para amplificar secuencias de flanqueo específicas del sitio de inserción. El lugar exacto de inserción es en la posición 1930 (en el primer exón) en la secuencia de ADNc de AtTPS5.

Ejemplo 1: Las líneas de desactivación de TPS8 muestran un crecimiento mejorado en diferentes condiciones de crecimiento

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, la trehalosa es sintetizada en dos reacciones a partir de UDP-glucosa y glucosa-6-fosfato mediante trehalosa-6-fosfato sintasa (codificada por TPS1) y trehalosa-6-fosfato fosfatasa (codificada por TPS2). En el genoma de Arabidopsis thaliana, se han detectado 11 genes semejantes a TPS. Esos genes se pueden agrupar en dos subfamilias, que presentan la mayor similitud con TPS1 de levadura (que codifica TPS en levadura; clase I) o TPS2 (que codifica TPP en levadura; clase II) (Leyman et al. 2001). No se sabe casi nada sobre los genes de TPP de tipo clase II en Arabidopsis. Para estudiar el efecto de estos genes, se construyeron líneas de desactivación (KO), líneas de ARNi y líneas de sobreexpresión, y se estudiaron como se describe en Materiales y Métodos.

Las líneas se estudiaron en medio 1x de Murashige y Skoog (Duchefa) solidificado con agar puro (Duchefa) (MS), con o sin adición de sacarosa. Las líneas de desactivación representativas se analizaron después de 10 días de germinación. Los resultados para la AtTPS8 KO se resumen en la Figura 1. Independientemente de las condiciones de crecimiento, la línea KO mostró siempre un incremento significativo en la longitud de las raíces, aunque el efecto fue ligeramente más pronunciado cuando estaba presente la sacarosa en el medio.

Ejemplo 2: La inactivación de TPS8 promueve la expresión de CYCD3 y ApL3

Para analizar el mecanismo subyacente del incremento en el crecimiento, se estudió mediante PCR en tiempo real el efecto de la AtTPS8 KO sobre la expresión del gen de ciclo celular AtCYCD3, y sobre el gen de la biosíntesis del 6 5

almidón ApL3. Comparados con el tipo salvaje (wt), la expresión tanto de ApL3 como de AtCYCD3, fue significativamente mayor. Los resultados se muestran en la Figura 2. Especialmente, el resultado de ApL3 es inesperado, ya que Kolbe et al. (2005) han demostrado recientemente que T6P es inductor de la síntesis del almidón, mientras que se podría esperar que la concentración de T6P es menor en la AtTPS8 KO.

Ejemplo 3: La inactivación de TPS8 da como resultado mayor biomasa y plantas más grandes

Las plántulas del tipo salvaje y de AtTPS8 KO se pusieron en el suelo, y se hicieron crecer durante 30 días, para comparar los fenotipos de las plantas adultas. Las plántulas adultas de AtTPS8 KO crecen más rápidamente en el suelo, tienen más hojas en forma de roseta pero más pequeñas, y el tallo de inflorescencia es el doble de grueso que en el tipo salvaje. La línea KO tiene aproximadamente dos veces tantas silicuas como wt. Las hojas caulinares de la línea KO son mucho más grandes y parecen más hojas en forma de roseta (Figura 3). Esto conduce a un mayor rendimiento de semillas y a un mayor rendimiento de biomasa global de la planta.

Ejemplo 4: La inactivación de TPS5 promueve el crecimiento de las raíces

Para evaluar la expresión de AtTPS5 en la línea SALK_144791, se aisló ARN de 50 plántulas de la línea 070(2). Los experimentos de RT-PCR (cebador directo: 5’GCACTCCTCAACGCTGATTT3’, y cebador inverso: 5’AAGCCCTATGGTTCCACGTT3’) en ADNc demostraron una drástica disminución de la expresión de AtTPS5 (figura 4). Para la caracterización fenotípica, se esterilizaron semillas de la línea 070(2) mediante humectación (100 ml de lejía + 3 ml de HCl al 37%) durante 4-6 horas, y se impregnaron/estratificaron durante dos días en luz constante a 4ºC. Después de dos días, las semillas se pusieron en placas estériles con medio para plantas (medio 1x MS pH 5,7 (KOH), 1% de sacarosa) y se incubaron verticalmente en una cámara de crecimiento con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h-12 h, 70 microE, 22ºC día, 18ºC noche. Después de 7 días de germinación, se midieron las longitudes de las raíces de 18 plántulas. Las líneas SALK mostraron un incremento significativo en la longitud de las raíces (figura 5). Este resultado se confirmó en un segundo experimento, y se tomaron fotos de las plántulas después de 13 días de germinación (véase la figura 6). Las plántulas parecieron tener raíces en cierto modo más largas. Sin embargo, es necesario confirmar esto. Algunas placas se giraron 90º para comprobar los posibles efectos gravitróficos. Después de 4 días, no se detectó ningún efecto agravitrófico (figura 7).

Ejemplo 4: La inactivación de TPS5 de Gene Trap promueve el crecimiento de las raíces y de los hipocotilos

Para evaluar la expresión de AtTPS5 en las líneas homocigotas de TPS5 de Gene Trap, se aisló ARN de 50 plántulas de dos líneas de GT sometidas a desactivación. La RT-PCR (cebador directo: 5’GCACTCCTCAACGCTGATTT3’, y cebador inverso: 5’AAGCCCTATGGTTCCACGTT3’) demostró una disminución drástica de la expresión de AtTPS5 (figura 8). Las semillas se esterilizaron mediante humectación (100 ml de lejía + 3 ml de HCl al 37%) durante 4-6 horas, y se impregnaron/estratificaron durante dos días en luz constante a 4ºC. Después de dos días, las semillas se pusieron en placas estériles con medio para plantas (medio 1x MS pH 5,7 (KOH), 1% de sacarosa) y se incubaron verticalmente en una cámara de crecimiento con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h-12 h, 70 microE, 22ºC día, 18ºC noche. Diez días después de la germinación, se tomaron fotos de las plántulas (figura 9). Las plántulas parecieron tener raíces significativamente más largas, e hipocotilos más largos. Varios días después de girar las placas 90º, y contrariamente a lo que se observó en Columbia, las plantas mostraron efectos agravitróficos (figura 10).

Referencias

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LISTADO DE SECUENCIAS 15 <110> VIB vzw

K.U. Leuven Research and Development

<120> Uso de trehalosa-6-fosfato sintasa para modular el crecimiento vegetal

<130> JTH/TPS/V229

<150> EP06100950.2 20 <151>

<150> EP06112770.0

<151>

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3 25 <210> 1

<211> 865

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

<210> 2

<211> 847

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

<210> 3

<211> 851

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 3

<210> 4

<211> 826

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

<210> 5

<211> 867

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 5

<210> 6

<211> 861

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

<210> 7

<211> 862

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 7

<210> 8

<211> 862

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 8

<210> 9

<211> 862

<212> PRT

<213> Populus balsamifera subsp. trichocarpa

<400> 9

<210> 10

<211> 854

<212> PRT

<213> Populus balsamifera subsp. trichocarpa

<400> 10

<210> 11

<211> 853

<212> PRT

<213> Populus balsamifera subsp. trichocarpa

<400> 11

<210> 12

<211> 857

<212> PRT

<213> Populus balsamifera subsp. trichocarpa

<400> 12

<210> 13

<211> 865

<212> PRT

<213> Populus balsamifera subsp. trichocarpa

<400> 13

<210> 14

<211> 854

<212> PRT

<213> Populus balsamifera subsp. trichocarpa

<400> 14

<210> 15

<211> 846

<212> PRT

<213> Populus balsamifera subsp. trichocarpa

<400> 15

<210> 16

<211> 6

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Secuencia de consenso

<220>

<221> CARACTER�?STICA DIVERSA 10 <222> (5) .. (5)

<223> Xaa puede ser G o D

<400> 16

<210> 17 15 <211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia de consenso 20 <220>

<221> CARACTER�?STICA DIVERSA

<222> (4) .. (4)

<223> Xaa puede ser R o Q

<400> 17

<210> 18

<211> 49

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador directo

<400> 18 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc cgaagtaact tctacctcc 49

<210> 19

<211> 50

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador inverso

<400> 19 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ccatctctaa gttgtaactg 50

<210> 20

<211> 31

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador directo

<400> 20 cgggatccat ggtgtcaaga tcttgtgcta a 31

<210> 21

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador inverso

<400> 21

aaggcctaac gatgctttca aatgcaactt 30

<210> 22

<211> 23

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador directo AtTPS5

<400> 22 tcctgcttat atcccacctg agc 23

<210> 23

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador inverso AtTPS5

<400> 23 gcgccgctta aagaaggaga a 21

<210> 24

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador de T-DNA del borde izquierdo

<400> 24 tggttcacgt agtgggccat cg 22

<210> 25

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador directo Genetrap

<400> 25 ttgggcgcgt agctttatac 20

<210> 26

<211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador inverso Genetrap

5 <400> 26 caagaagata tgaaaacagc ctca 24

<210> 27

<211> 20

<212> ADN 10 <213> Artificial

<220>

<223> Cebador DS5

<400> 27

tacgataacg gtcggtacgg 20 15 <210> 28

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 20 <223> Cebador directo línea 6

<400> 28 ttgggcgcgt agctttatac 20

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. El uso de la inactivación de una trehalosa-6-fosfato sintasa de clase II vegetal para promover el crecimiento vegetal.
2. 2. El uso según la reivindicación 1, por lo cual dicha promoción del crecimiento vegetal es aumento del crecimiento 5 de las raíces, aumento del grosor del tallo, aumento del número de hojas y/o aumento del tamaño de las semillas.

3. 3.

   El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, por lo cual dicha promoción del crecimiento vegetal se obtiene en ausencia de luz.

4. 4.

   El uso de la inactivación de una trehalosa-6-fosfato sintasa vegetal de clase II para incrementar la síntesis del almidón.

   10 5. El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, por lo cual dicha trehalosa-6-fosfato sintasa se selecciona del grupo que consiste en SEC ID Nº 1-15.

5. 6.

   El uso según la reivindicación 5, por lo que dicha trehalosa-6-fosfato sintasa consiste en SEC ID Nº 4.

6. 7.

   El uso según la reivindicación 6, por lo que dicha trehalosa-6-fosfato sintasa consiste en SEC ID Nº 1.

   Figura 1: Longitud de las raíces de AtTPS8 KO en diferentes condiciones. GT2, GT4 y GT6 son diferentes líneas KO de AtTPS8

   Líneas AtTPS8 KO en medio MS+sac Líneas AtPS8 KO en medio MS-sac AtTPS8 KO en medio + sac en la oscuridad Líneas AtTPS8 KO en medio -sac en la oscuridad

   Figura 2: Niveles de expresión de AtCYD3 y ApL3 en el contexto de AtTPS8 KO Expresión de ApL3

   Expresión de AtCYCD3 Figura 3: Caracterización fenotípica de las plantas adultas con AtTPS8 KO en comparación con plantas WT

   Hoja caulinares Figura 4

   Figura 5 Figura 6

   Figura 7 Figura 8: Expresión de TPS5 en la línea GT12622 con relación a la expresión de (Landsberg erecta) de WT

   Figura 9 Figura 10