ES2326789T3

ES2326789T3 - Plantas transgenicas con el gen de la enzima para la segmentacion de neoxantina.

Info

Publication number: ES2326789T3
Application number: ES01300218T
Authority: ES
Inventors: Satoshi Iuchi; Masatomo Kobayashi; Kazuo Shinozaki
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2000-01-13
Filing date: 2001-01-11
Publication date: 2009-10-20
Anticipated expiration: 2021-01-11
Also published as: ATE434048T1; EP1116794A2; US20060212969A1; CN1307137A; US7482509B2; AU785477B2; JP4621361B2; DE60138972D1; JP2001258579A; US20020104120A1; EP1116794A3; US7049487B2; CN1294267C; EP1116794B1; AU1368801A

Abstract

Un ADN que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina, en el que la proteína que tiene una actividad de segmentación de la proteína se selecciona entre el grupo constituido por: (a) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº 6; (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno de los 100 aminoácidos en la SEC DE ID Nº 6 está sustituido, borrado, añadido y/o insertado; y (c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 80% a la SEC DE ID Nº 6.

Description

Plantas transgénicas con el gen de la enzima para la segmentación de la neoxantina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un ADN que se puede usar para mejorar o reducir la tolerancia al estrés en una planta, y a una planta transgénica del ADN.

Antecedentes de la invención

Las plantas se deben adaptar por sí mismas a diversas situaciones de estrés, por ejemplo, sequía, sal en el suelo, y baja temperatura ya que no pueden moverse libremente. Entre estas situaciones de estrés, se piensa que la sequía afecta al crecimiento de la planta más gravemente. Con el fin de sobrevivir en condiciones de sequía, algunas plantas han adquirido un rasgo fisiológica y/o morfológicamente específico en el proceso evolutivo mientras que muchas otras plantas confieren también un mecanismo de respuesta al estrés debido a la sequía y se defienden por sí mismas. Estas respuestas a una falta de agua y la adaptación al entorno seco se producen en las plantas mediante diversos cambios fisiológicos entre los que se incluyen la alternancia de la expresión génica durante la sequía (Shinozaki, K y Yamaguchi-Shinozaki, K., Plant Physiol., 115: 327-334, 1997; Shinozaki, K. y Yamaguchi-Shinozaki, K., "Molecular responses to drought stress". En Shinozaki y Yamaguchi-Shinozaki (eds), "Molecular responses to cold, drought, heat and salt stress in higher plants", R. G. LANDES company, Austin, Texas, USA, pp. 11-28, 1999). Por ejemplo, se sabe que en Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), una señal de la sequía se transmite a través de una ruta dependiente del ácido abscísico (ABA) y la ruta independiente del ABA controla la expresión génica implicada en la tolerancia a la sequía. Se piensa que estos productos génicos tienen una función en el control, por ejemplo, en la acumulación de osmoprotectores tales como sacarosa y prolina, la semivida de las proteínas, la ruta de transducción de la señal de estrés, y la transcripción (Bray, E. A., Trends in Plant Science, 2: 48-54, 1997; Bohnert, H. J. y col., Plant Cell, 7: 1099-1111, 1995; Ingram, J. y Bartels, D., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 47: 377-403, 1996; Shinozaki, K. y Yamaguchi-Shinozaki, K., Plant Physiol., 115: 327-334, 1997; Shinozaki, K. y Yamaguchi-Shinozaki, K., "Molecular responses to drought stress". En Shinozaki y Yamaguchi-Shinozaki (eds), "Molecular responses to cold, drought, heat and salt stress in higher plants", R. G. LANDES company, Austin, Texas, USA, pp. 11-28, 1999).

Se ha propuesto la ruta C40 como una ruta biosintética del ABA en las plantas superiores. La ruta C40, denominada también ruta de los carotenoides, es una ruta sintética a través de la epoxidación de la zeaxantina, con síntesis de violaxantina, neoxantina, xantoxina, aldehído del ABA, y a continuación ABA (Zeevaart, J. A. D. y Creelman R. A., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 39: 439-473, 1988). Se ha propuesto esta ruta biosintética a partir de estudios fisiológicos y el análisis de las variantes biosintéticas del ABA. Por ejemplo, la variante aba2 aislada del tabaco (Nicotiana tabacum) tiene una mutación en un gen (aba2) de la enzima zeaxantina epoxidasa que cataliza la epoxidación de la zeaxantina (Marin E. y col., EMBO J., 15: 2331-2342, 1996). La variante vp14 aislada del maíz tiene una mutación en un gen (VP14) de la enzima para la segmentación de la neoxantina que cataliza la conversión de neoxantina en xantoxina (Tan, B. C. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 94: 12235-12240, 1997). De las plantas Arabidopsis, la variante aba3 tiene una mutación en una enzima que cataliza la reacción de xantoxina a aldehído del ABA, y se ha aislado la variante aba4 implicada en la reacción de oxidación del aldehído del ABA para producir ABA (Schwartz, S. H. y col., Plant Physiol., 114: 161-166, 1997; Leon-Kloosterziel, K. M. y col., Plant J., 10: 655-661, 1996).

Se sabe que un maíz que tiene una mutación en el gen de la enzima para la segmentación de la neoxantina (VP14) muestra rasgos de fácil pérdida de agua y fácil marchitamiento. No se sabe aún, sin embargo, si se puede mejorar o no la tolerancia al estrés en las plantas usando el gen de la enzima para la segmentación de la neoxantina.

Resumen de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un ADN que codifica una enzima para la segmentación de la neoxantina usado para mejorar la tolerancia al estrés en una planta, un procedimiento para aumentar la tolerancia al estrés en una planta introduciendo el ADN en la planta, y una planta transgénica en la que se introduce un gen de la enzima para la segmentación de la neoxantina. La presente descripción se refiere también al suministro de un ADN usado para reducir la tolerancia al estrés en una planta, un procedimiento para disminuir la tolerancia al estrés en una planta introduciendo el ADN en la planta, y una planta transgénica en la que se introduce el ADN. La mejora de la tolerancia al estrés en plantas es útil, por ejemplo, en la mejora genética de plantas.

Los presentes inventores han aislado un clon de ADNc (CPRD65) que corresponde a un gen implicado en una respuesta frente al tratamiento a la sequía, mediante el rastreo diferencial de una biblioteca de ADN preparada a partir de una planta de frijol (Vigna unguiculata) que mostró gran tolerancia a la sequía tras un tratamiento de deshidratación durante 10 horas. Se esperaba que el ADNc de CPRD65 codificara una enzima para la segmentación de la neoxantina propuesta para implicarse en la biosíntesis del ácido abscísico (ABA). El estrés debido a la sequía proporcionó una planta de frijol de 8 días de edad que indujo fuertemente la acumulación de ABA y la expresión de CPRD65, indicando el potencial de la profunda implicación del gen CPRD65, especialmente en respuesta al estrés debido a la sequía. La determinación de una actividad enzimática usando la proteína de fusión GST-CPRD65 confirmó que CPRD65 comprende una actividad de segmentación de la 9-cis-naoxantina para producir xantoxina. Estos resultados indican que el gen CPRD65 codifica una enzima para la segmentación de la neoxantina y su producto juega un papel clave en la biosíntesis del ABA endógeno bajo condiciones de estrés debido a la sequía.

Además, los presentes inventores han aislado un gen novedoso (AtCED3) rastreando un gen de la enzima para la segmentación de la neoxantina a partir de una biblioteca de ADNc derivada de plantas de Arabidopsis usando como sonda un ADNc del gen CPRD65 aislado de plantas de frijol. Además, se identificaron cuatro tipos de secuencias (AtNCED1, 2, 4, y 5) derivadas de una planta de Arabidopsis que comprenden una elevada homología con estos genes. La expresión de estos genes en Escherichia coli (E. coli) y el ensayo de la actividad de segmentación de la neoxantina reveló que AtNCED1, 3, y 5 comprenden una actividad del enzima para la segmentación de la neoxantina igual a la de CPRD65.

Los presentes inventores produjeron en primer lugar una planta transgénica de Arabidopsis usando AtNCED3, un gen de la enzima para la segmentación de la neoxantina. Se ligó el gen AtNCED3 a la dirección 3' del promotor 35S en un vector para introducir un gen en las células de la planta (pBE2113N) en las direcciones de sentido directo (un tipo de sobreexpresión) o de sentido contrario (un tipo de inhibición de la expresión) y se introdujo el vector en Arabidopsis mediante el procedimiento de infiltración a vacío. La evaluación de la tolerancia a la sequía de las plantas transgénicas preparadas reveló que la tolerancia al estrés en las plantas sobreexpresadas estuvo significativamente aumentada en comparación con la de sus líneas parentales. Por el contrario, en las líneas con expresión inhibida en las que se introdujo el sentido contrario, se redujo la tolerancia al estrés (Figs. 15 y 16). De tal manera, los presentes inventores encontraron que, realmente, la planta transgénica en la que se introdujo el gen de la enzima para la segmentación de la neoxantina aumentó significativamente la tolerancia al estrés y la tolerancia al estrés se pudo reducir significativamente disminuyendo la expresión del gen para completar la presente invención.

Específicamente, esta invención se refiere a un ADN que codifica una enzima para la segmentación de la neoxantina usado para mejorar la tolerancia al estrés en una planta, un procedimiento para aumentar la tolerancia al estrés en una planta introduciendo el ADN en la planta, y una planta transgénica en la que se introduce el gen de la enzima par la segmentación de la neoxantina. Esta descripción se refiere también específicamente a un ADN usado para reducir la tolerancia al estrés en una planta, un procedimiento para disminuir la tolerancia al estrés en una planta introduciendo el ADN en la planta, y una planta transgénica en la que se introduce ADN. Más específicamente, la presente invención proporciona:

(1): un ADN aislado que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina en el que la proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina se selecciona entre el grupo constituido por:

(a): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID N: 6 (AtNCED3),

(b): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno a 100 aminoácidos en la SEC DE ID Nº: 6 (AtNCED3) están sustituido, borrados, añadidos, y/o insertados, y

(c): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos al menos idéntica en un 80% a la SEC DE ID N: 6,

(2): el ADN de (1), en el que el ADN es capaz de mejorar la tolerancia al estrés debido a la sequía en una planta,

(3): el ADN de (1) ó (2), en el que la proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina se deriva de plantas de Arabidopsis,

(4): una célula de planta transformante en la que se ha introducido el ADN de uno cualquiera de (1) a (3),

(5): una planta transgénica que comprende la célula de la planta transformante de (4),

(6): una planta transgénica que comprende la célula de la planta transformante de (4) que es progenie o un clon de la planta transgénica de (5),

(7): la planta transgénica de (5) ó (6), en la que la expresión de un gen que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina está aumentada en comparación con la de su tipo natural,

(8): la planta transgénica de uno cualquiera de (5) a (7) en la que la cantidad de ácido abscísico está aumentada en comparación con la de su tipo natural,

(9): la planta transgénica de uno cualquiera de (5) a (8), en la que la tolerancia al estrés debido a la sequía está aumentada en comparación con la de su tipo natural,

(10): un material de propagación para la planta transgénica de uno cualquiera de (5) a (9), en el que el material es homocigótico para el ADN de uno cualquiera de (1) a (3),

(11): un vector que comprende el ADN de uno cualquiera de (1) a (3),

(12): un procedimiento para producir la planta transgénica de uno cualquiera de (5) a (9), que comprende las etapas de introducir el ADN de uno cualquiera de (1) a (3) en una célula de planta y regenerar una planta a partir de la célula de la planta,

(13): un procedimiento para aumentar la tolerancia al estrés debido a la sequía en una planta, que comprende expresar el ADN de uno cualquiera de (1) a (3) en una célula de la planta, y

(14): uso del ADN de (1) para mejorar la tolerancia al estrés debido a la sequía en una planta.

En la presente invención, "tolerancia al estrés" significa tolerancia frente a los estreses ambientales, por ejemplo, tolerancia al estrés debido a la sequía, tolerancia al estrés debido a la sal, tolerancia al estrés debido a la baja temperatura, tolerancia a la contaminación del aire, tolerancia al estado de bajo contenido en oxígeno, tolerancia a los patógenos, tolerancia a los fármacos tales como a los agentes fitoquímicos, etc. Se sabe que el tratamiento exógeno con ABA mejora la tolerancia frente a estos estreses en muchas plantas (se hace referencia a Takahashi, N. y Masuda, Y. (eds), "Plant Hormone Handbook (The Last)", Baifukan, Japón, pp. 78-160; y las referencias citadas en el mismo).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra el análisis por transferencia Northern de la expresión de los genes CPRD65 tras la deshidratación o rehidratación. Se preparó el ARN total procedente de plantas de frijol de 8 días de edad que se habían deshidratado durante 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, y 12 horas o rehidratado durante 0, 1, 2, 5, 10, y 24 horas tras la deshidratación durante 10 horas. Se cargó cada banda con 10 \mug del ARN total. Se fraccionó el ARN en un gel de agarosa al 1%, se transfirió sobre una membrana de nylon, y se sondeó con insertos de ADNc de los clones CPRD65 marcados con [^{32}P].

La Figura 2 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de CPRD65, VP14 (enzima para la segmentación de la neoxantina de Zea mays, Schwartz, S. H. y col., Science, 276: 1872-1874, 1997), y la proteína LENCED1 (enzima para la segmentación de la neoxantina de Lycopersicon esculentum, Burbidge, A. y col., J. Exp. Bot., 47: 2111-2112, 1997; Burbidge, A. y col., Plant J., 17: 427-431, 1999). Las rayas indican las separaciones que se introdujeron para optimizar la alineación. Las secuencias encerradas indican aminoácidos idénticos. Las regiones sombreadas indican aminoácidos similares.

La Figura 3 muestra el análisis de transferencia Southern del ADN genómico del cultivar 2246 de frijol. El ADN genómico (10 \mug por banda) se digirió con EcoRI (E), HindIII (H), y XbaI (X), se fraccionó en un gel de agarosa al 1%, y se transfirió a una membrana de nylon. Se dejó hibridar el filtro con un fragmento del ADNc de CPRD65 marcado con [^{32}P]. "A" y "B" representan diferentes condiciones de restricción en la hibridación (se hace referencia a los Ejemplos). El marcador de tamaño de los fragmentos de ADN se indica en pkb.

La Figura 4 (A) muestra el análisis de transferencia Northern de la inducción del gen CPRD65 mediante salinidad elevada (NaCl), temperatura elevada (calor), baja temperatura (frío), y la aplicación de ácido abscísico (ABA). Se aisló el ARN total de la plantas de frijol a las horas indicadas después del tratamiento. Se cargó cada banda con 10 \mug del ARN total. El número por encima de cada banda indica la duración (horas) del tratamiento.

La Figura 4 (B) muestra el análisis de transferencia Northern del gen CPRD65 sin o con 10 horas de tratamiento de deshidratación. Cada banda se cargó con 10 \mug del ARN total aislado de hojas (L), tallos (S), y raíces (R) del cultivar 2246 de frijol. Se fraccionó el ARN en un gel de agarosa al 1%, se transfirió sobre una membrana de nylon, y se sondeó con insertos de ADNc de los CPRD65 marcados con [^{32}P].

La Figura 5 muestra los perfiles de la HPLC de los metabolitos carotenoides de GST (A) o la proteína recombinante GST-CPRD65 (B). La mezcla de reacción contenía cis-neoxantina como sustrato. cN; cis-neoxantina, C25; producto C25.

La Figura 6 muestra la dirección de la diana plástida de la proteína quimérica CPRD65-sGFP en los protoplastos. Los constructos que transportan la 35S-sGFP (A, C, E) o los constructos quiméricos 35S-CPRD65N-sGFP (B, D, F) se transfectaron en los protoplastos de A. thaliana usando polietilenglicol (PEG). Los protoplastos transfectados se observaron mediante microscopio óptico (A, B) o microscopio fluorescente con un filtro de interferencia de tipo verde (E, F) o rojo (C, D). E y F indican la localización de GFP, y C y D el cloroplasto.

La Figura 7 muestra la relación entre la acumulación de ABA y la expresión del gen de CPRD65 durante la deshidratación. La radioactividad retenida en el filtro de nylon de la Fig. 1 se cuantificó y se representó gráficamente tal como se muestra. El procedimiento para la cuantificación del ABA se describe en los Ejemplos. Las barras de error muestran los errores estándar. Se repitió el experimento tres veces.

La Figura 8 muestra la acumulación del ABA endógeno en hojas (L), tallos (S), y raíces (R) de plantas de frijol durante el tratamiento de deshidratación tras la separación de los órganos. El procedimiento para la cuantificación del ABA es el mismo que el descrito en el Ejemplo 7 (Figura 7).

La Figura 9 muestra la comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de AtNCED3 y CPRD65. Las rayas indican las separaciones que se introdujeron para optimizar la alineación. Las secuencias encerradas indican aminoácidos idénticos. Las regiones sombreadas indican aminoácidos similares.

La Figura 10 muestra las alineaciones de las secuencias de aminoácidos de AtNCED1, 2, 3, 4, y 5. Las rayas indican las separaciones que se introdujeron para optimizar la alineación. Las secuencias encerradas indican aminoácidos idénticos. Las regiones sombreadas indican aminoácidos similares.

La Figura 11 muestra el resultado del análisis filogénico de examinar la relación entre las secuencias de aminoácidos de AtNCED1, 2, 3, 4, 5, y CPRD65, y sus secuencias relacionadas en las bases de datos. LeNCED1 (Nº de Acceso Z97215) y VP14 (Nº de Acceso U95953) muestran las proteínas derivadas de tomates y maíz, respectivamente.

La Figura 11 muestra la expresión de los genes AtNCED frente a cada estrés.

La Figura 13 muestra la expresión del gen AtNCED3 en los transformantes ArNCED3. Los paneles superior e inferior muestran la expresión del gen AtNCED3 en plantas antes de la sequía y después del tratamiento de estrés debido a la sequía, respectivamente. Se usaron dos cepas de cada planta que expresaban el gen AtNCED3 de sentido directo (sobreexpresión) (A y B) y las plantas que expresaban el de sentido contrario (inhibición de la expresión) (C y D).

La Figura 14 muestra las cantidades de ABA endógeno en los transformantes AtNCED3. Las cantidades de ABA endógeno aumentaron en las plantas que expresaban el gen AtNCED3 de sentido directo (sobreexpresión) (A y B) pero disminuyeron en aquellas que expresaban el de sentido contrario (inhibición de la expresión) (C y D), en comparación con las plantas de tipo natural.

La Figura 15 muestra el resultado del ensayo de la tolerancia a la sequía en plantas transgénicas con la enzima para la segmentación de la neoxantina, indicando las plantas y el contenido relativo de agua en las hojas 14 días después de la terminación de la irrigación.

La Figura 16 muestra el resultado del ensayo de la tolerancia a la sequía en plantas transgénicas con la enzima para la segmentación de la neoxantina, indicando las plantas 17 días después de la terminación de la irrigación.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un ADN aislado que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina usada para mejorar la tolerancia al estrés debido a la sequía. Se sabe que una enzima para la segmentación de la neoxantina es una enzima implicada en la biosíntesis del ABA, sin embargo, no se ha confirmado si la introducción del ADN que codifica esta enzima en una planta conduce realmente a la acumulación de ABA y a la mejora de la tolerancia frente a los estreses debidos a la sequía sin un grave efecto para el crecimiento de la planta.

El tratamiento exógeno con ABA produce, por ejemplo, la inhibición del crecimiento en muchas plantas. En una semilla, se sabe que ABA produce también la inhibición del crecimiento (inhibición de la germinación) (Takahashi, N. y Masuda, Y. (eds), "Plant Hormone Handbook (The Last)", Baifukan, Japón, pp. 78-160; y las referencias citadas en el mismo). El aumento en el nivel de ABA provoca diversos daños a las plantas. No se ha informado si la producción excesiva de ABA por un gen exógeno conduce a la adquisición de la tolerancia al estrés, o no. Los procedimientos experimentales convencionales para el tratamiento exógeno con ABA requieren el tratamiento a una concentración elevada, que inhibe fuertemente el crecimiento y ha evitado una evaluación fiable de la tolerancia. Además, los experimentos de tratamientos exógenos no han identificado que un nivel apropiado de ABA asegure el crecimiento normal y la adquisición de la tolerancia. Obteniendo el gen de la biosíntesis de ABA y creando una planta transgénica que usa este gen, los presentes inventores han confirmado por vez primera que se puede mejorar la tolerancia al estrés debido a la sequía en una planta.

Un "ADN aislado" es un ADN cuya estructura no es idéntica a la de cualquier ADN que se produce de manera natural o la de cualquier fragmento de un ADN genómico que se produce de manera natural que se extiende más de tres genes separados. El término incluye, por tanto, por ejemplo, (a) un ADN que tiene la secuencia de parte de una molécula de ADN genómico que se produce de manera natural en el genoma del organismo en el que se produce naturalmente; (b) un ADN incorporado en un vector o en el ADN genómico de un procariota o eucariota de una manera tal que la molécula resultante no es idéntica a cualquier vector o ADN genómico que se produce naturalmente; (c) una molécula diferente tal como un ADNc, un fragmento genómico, un fragmento producido mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o un fragmento de restricción; y (d) una secuencia de nucleótidos recombinante que es parte de un gen híbrido, es decir, un gen que codifica una proteína de fusión. Específicamente excluidas de esta definición están las moléculas de ADN presentes en las mezclas de (i) moléculas de ADN, (ii) células transfectadas, o (iii) clones celulares; por ejemplo, tal como estos se encuentran en una biblioteca de ADN tal como ADNc o una biblioteca de ADN genómico.

Como ADN aislado usado para aumentar la tolerancia al estrés, se puede usar cualquier gen siempre que codifique una proteína que tenga actividad de segmentación de la neoxantina. Por ejemplo, VP14 de maíz (Zea mays) (Schwartz, S. H. y col., Science, 276: 1872-1874, 1997; Tan, B. V. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 94: 12235-12240, 1997) (ADNc: SEC DE ID Nº: 13, proteína: SEC DE ID Nº: 14), LeNCED1 de tomate (Lycopersicon esculentum) (Burbidge, A. y col., J. Exp. Bot., 47: 2111-2112, 1997; Burbidge, A. y col., Plant J., 17: 427-431, 1999) (ADNc: SEC DE ID Nº: 15, proteína: SEC DE ID Nº: 16), y se han aislado dichos genes de la enzima para la segmentación de la neoxantina. Estos genes son útiles para mejorar la tolerancia al estrés. Además, se pueden usar convenientemente los ADN que codifican AtNCED1 (SEC DE ID Nº: 2), AtNCED3 (SEC DE ID Nº: 6), AtNCED5 (SEC DE ID Nº: 10), y CPRD65 (SEC DE ID Nº: 12) (SEC DE ID N^{os}: 1, 5, 9, y 11, respectivamente). Además, se puede usar también un ADN que codifica una enzima para la segmentación de la neoxantina de la SEC DE ID Nº: 18 (ADNc: SEC DE ID Nº: 17, proteína: SEC DE ID Nº: 18) (Neill, S. J. y col., J. Exp. Bot., 49: 1893-1894, 1998, Nº de acceso AJ005813) para mejorar la tolerancia al estrés. Se puede usar también un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de segmentación de la neoxantina como reactivo para aumentar la tolerancia al estrés (agente que aumenta la tolerancia al estrés). La presente invención proporciona también los usos de un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de segmentación de la neoxantina para aumentar la tolerancia al estrés debido a la sequía.

Un ADN que codifica una proteína que tiene actividad de segmentación de la neoxantina en la presente invención incluye un ADN genómico, un ADNc, y un ADN quimiosintético. Se pueden preparar un ADN genómico y un ADNc mediante procedimientos comunes para una persona experta en la técnica. Se puede preparar un ADN genómico, por ejemplo, extrayendo un ADN genómico de una planta de acuerdo con procedimientos convencionales, en los que se prepara una biblioteca genómica (en la que como vector, por ejemplo, se puede usar un plásmido, un fago, un cósmido, y un BAC), y se lleva a cabo la hibridación de la colonia, o la hibridación de la placa usando una sonda basada en el ADN de la presente invención (por ejemplo, SEC DE ID Nº: 5, etc.). Alternativamente, se puede preparar también un ADN genómico llevando a cabo la PCR con cebadores específicos del ADN de la presente invención (por ejemplo, SEC DE ID Nº: 5, etc). Se puede preparar un ADNc sintetizando un ADNc basado en un ARNm extraído de una planta, insertando el ADNc en un vector, tal como el fago \lambda para preparar y desarrollar una biblioteca de ADNc, y llevar a cabo la hibridación de la colonia o la hibridación de la placa de la misma manera que anteriormente, o llevando a cabo la PCR. Un ADN de la presente invención incluye no sólo las secuencias de ADN de la SEC DE ID Nº: 5, sino un ADN que comprende las secuencias de nucleótidos basadas en la degeneración opcional de los codones que codifican los aminoácidos de cada proteína.

Un ADN de la presente invención incluye también, por ejemplo, un ADN que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que de uno a 100 aminoácidos están sustituidos, borrados, añadidos, y/o insertados en la SEC DE ID Nº: 6, y tiene actividad de segmentación de la neoxantina. De esta manera, el ADN de la invención incluye un mutante, un derivado, un alelo, una variante, y un homólogo de la SEC DE ID Nº: 5, un gen derivado de una planta natural.

Una proteína modificada codificada por el ADN de la invención comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 80% (por ejemplo, 90%, 95%, o 99%) a la SEC DE ID Nº: 6. Tal como se usa en el presente documento, el "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos se determina usando el algoritmo de Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 2264-2268, 1990) modificado como en Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5873-5877, 1993). Dicho algoritmo está incorporado en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul y col. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990). Se llevan a cabo investigaciones de nucleótidos BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12. Se llevan a cabo investigaciones de las proteínas BLAST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3. Cuando existen espacios entre dos secuencias, se utiliza BLAST Espaciado tal como se describe en Altsuchl y col. (Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997). Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST Espaciado, se usan los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

La proteína modificada en la que están sustituidos uno o más aminoácidos en la SEC DE ID Nº: 6 se obtiene preferiblemente mediante al menos una sustitución conservativa de aminoácidos. Una "sustitución conservativa de aminoácidos" es una sustitución de un resto de aminoácido que comienza con uno de los siguientes grupos que tienen una cadena lateral químicamente similar por otro aminoácido del mismo grupo. Se han definido en la técnica los grupos de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estos grupos incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Un ejemplo de un procedimiento para preparar dicho ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos modificada, bien conocido por una persona experta en la técnica, es la mutagénesis in vitro utilizando la PCR (Izawa, T., "in vitro mutagenesis by PCR" in Shimamoto, K. y Sasaki, T. (supervisores), Cell Technology, Supplement, Plant Cell Technology Serie VII, Protocols for PCR Experiments in Plants, New Edition, pp. 151-158, Shujunsha, Japón). La modificación de aminoácidos en una proteína, está comprendida preferiblemente entre 100 aminoácidos, más preferiblemente entre 50 aminoácidos, y además más preferiblemente entre 10 aminoácidos en el caso de modificación artificial. Se puede producir en la naturaleza la modificación de una secuencia de aminoácidos de una proteína debido a la modificación de la secuencia de nucleótidos codificante. Está incluso incluido en el ADN de la presente invención un ADN que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos en la que de uno a 100 aminoácidos están sustituidos, borrados, añadidos, y/o insertados en una secuencia de aminoácidos que codifica una enzima para la segmentación de la neoxantina de tipo natural siempre que codifique una proteína que tenga actividad de segmentación de la neoxantina. El ADN de la presente invención incluye también una variante degenerada en la que una mutación en una secuencia de nucleótidos no da como resultado una mutación de aminoácidos en una
proteína.

Que un ADN dado codifique una enzima para la segmentación de la neoxantina, o no, se puede determinar expresando el ADN en E. coli para preparar una proteína recombinante y detectar la segmentación usando una cis-neoxantina como sustrato, de acuerdo con el Ejemplo 5 siguiente.

Basándose en un ADN que codifica una enzima conocida para la segmentación de la neoxantina, se puede aislar un gen novedoso de la enzima para la segmentación de la neoxantina. Los ejemplos de procedimientos bien conocidos por una persona experta en la técnica a este fin son procedimientos que usan la técnica de hibridación (Maniatis, T y col., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y las técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Nakayama, H., Cell Technology, Supplement, Biological Experiment Illustrated, Vol. 3, Nueva Edición, Shujunsha, 1998). Específicamente, una persona experta en la técnica puede aislar de manera rutinaria un ADN que codifica el gen de la enzima para la segmentación de la neoxantina procedente de cualquier planta usando una secuencia de nucleótidos de un gen de la enzima para la segmentación de la neoxantina de una SEC DE ID conocida (por ejemplo, SEC DE ID Nº: 5, etc.) o su secuencia parcial como sonda, así como un oligonucleótido hibridado de manera específica con estas secuencias como cebador. Un ADN que codifica una enzima para la segmentación de la neoxantina, capaz de aislarse mediante dicha técnica de hibridación o la técnica de la PCR está también incluido en un ADN usado para mejorar la tolerancia al estrés.

Se puede llevar a cabo la hibridación bajo condiciones restrictivas siguiendo, por ejemplo, el procedimiento descrito en la referencia (Sambrook, J., y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2ª ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) usando un ADN marcado con [^{32}P] preparado usando un procedimiento de cebado aleatorio como sonda. Un ADN se transfiere a una membrana de nylon y se hibrida con un fragmento marcado con [^{32}P], por ejemplo, en una solución de hibridación que contiene un 30%, preferiblemente un 50% de formamida, SSC 6X, solución de Denhardt 5X, y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, a 37ºC, preferiblemente a 42ºC. Bajo condiciones de restricción, se lava, por ejemplo, en SSC 1X, SDS al 1% (temperatura ambiente), durante 15 min dos veces, preferiblemente (más restricción) en SSC 0,5X, SDS al 0,5% (37ºC), durante 15 min dos veces, y más preferiblemente (más restricción) SSC al 0,1X, SDS al 0,1% (60ºC) durante 15 min dos veces, y sometido a autorradiografía. Por "hibridar bajo condiciones de restricción" se entiende la unión en equilibrio específico y no covalente mediante el emparejamiento de bases en un ácido nucleico de referencia inmovilizado bajo las condiciones anteriores.

Con el fin de preparar una planta transgénica con tolerancia al estrés mejorada usando estos ADN, se inserta el ADN en un vector apropiado, y se introduce en una célula de la planta, y se regenera una planta transgénica a partir de la célula de la planta transformante.

Como vector usado para la transformación de una célula de la planta, se puede usar cualquier vector capaz de expresar un gen insertado en la célula. Por ejemplo un vector que comprende un promotor para expresar de manera constante un gen en una célula de la planta (por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor) y se puede usar un vector con un promotor activado de manera inducible mediante un estímulo exógeno. Alternativamente, usando un promotor específico de un tejido de la planta para inducir la expresión de un gen objetivo, se puede proporcionar específicamente tolerancia al estrés en un tejido muy sensible al estrés. Por ejemplo, se puede expresar específicamente un gen objetivo en un tejido usando un promotor de un gen que se expresa específicamente en las semillas, tal como el gen de la \beta-faseolina de los frijoles (Bustos et al., EMBO J., 10: 1469-1479, 1991) y del gen de la glicinina de las semillas de soja (Lelievre y col., Plant Physiol., 98: 387-391, 1992), un promotor de un gen que se expresa específicamente en las hojas, tal como el del gen RbcS de guisante (Lam y Chua, Science, 248: 471-474, 1990) y el del gen Cab1 de trigo (Gotorn y col., Plant J., 3: 509-518, 1993), y un promotor de un gen que se expresa específicamente en las raíces, tal como el del gen TobRB7 de tabaco (Yamamoto y col., Plant Cell, 3: 371-382, 1991), etc. Alternativamente, se puede usar un vector que comprende un promotor activado de manera inducible mediante un estímulo exógeno. Un ejemplo de un promotor que responde a los estreses ambientales, tales como la sequía, la sal, o la baja temperatura, es un promotor del gen rd29A (Yamaguchi-Shinozaki, K. y Shinozaki, K., Plant Cell, 6: 251-264, 1994). En la presente invención, se usa también preferiblemente un promotor que se va a activar mediante los estreses ambientales tales como la sequía y la concentración elevada de sal. Los ejemplos de dichos promotores son los del gen AtNCED3 de Arabidopsis, el gen CPRD65 de frijol, y así sucesivamente. Además, usando un sistema de expresión inducible mediante un fármaco, se puede expresar un gen objetivo en un momento opcional y en un tejido opcional. Un ejemplo de un sistema de expresión inducido por un hormona esteroide (glucocorticoide) es un sistema de inducción que usa el gen GVG (GAL4, VP16, receptor glucocorticoide) (Aoyama T. y Chua, N. H., Plant J, 11: 605-12, 1997).

Se puede insertar un vector en cualquier célula de planta, por ejemplo, Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), arroz (Oriza sativa), tabaco (Nicotiana tabacum), tomate (Lycopersicon esculentum), patata (Solanum tuberosum), maíz (Zea mays), trébol de alimento para pájaros (Lotus japonicus), y así sucesivamente. Son también útiles otros cultivos o árboles. Una planta puede ser una conífera, un árbol de hoja caduca, una dicotiledónea, una monocotiledónea, etc. La(s)
"célula(s) de planta(s)" usada(s) en el presente documento incluye(n) diversas formas de células de planta(s), por ejemplo, una célula cultivada en suspensión, un protoplasto, un corte de hojas, un callo, etc.

Para la introducción de un vector en una célula de la planta, se pueden aplicar diversos procedimientos conocidos por una persona experta en la técnica, por ejemplo, el procedimiento del polietilenglicol, el procedimiento de la electroporación, el procedimiento de la agrobacteria, el procedimiento de infiltración a vacío, el procedimiento del cañón de partículas y similares. Se puede regenerar una planta a partir de una célula de planta transformante mediante procedimientos bien conocidos por una persona experta en la técnica, dependiendo del tipo de célula de la planta. Por ejemplo, un transformante de arroz, Arabidopsis, o similares que se pueda preparar de acuerdo con el procedimiento descrito en "Simamoto, K., Okada K. (supervisores), Cell Technology, Supplement, Plant cell Technology Serie 4, Experimental Protocol for Model Plants, Shujunsha, Japón".

Una vez se obtiene una planta transformante en cuyo genoma se introduce el ADN de la presente invención, se puede obtener la progenie mediante la propagación sexual o asexual de la planta. Alternativamente, se obtiene de la planta un material de propagación, por ejemplo, una semilla, un fruto, un vástago, un tubérculo, una raíz tuberosa, una reserva, un callo, un protoplasto, etc.), su progenie, o clones, y la planta se puede producir en masa a partir de los anteriores. La presente invención incluye una célula de planta en la que se introduce el ADN de la presente invención, una planta que contiene la célula, la progenie o un clon de la planta que contiene la célula, así como los materiales de propagación de la planta, que es homocigótica para el ADN de la presente invención, su progenie, y el
clon.

Una planta transformante producida de tal manera tiene un contenido de ABA aumentado, en comparación con su planta de tipo natural. Alternativamente, una planta transformante tiene una tolerancia al estrés mejorada, en comparación con su planta de tipo natural. Se puede comparar la tolerancia al estrés mediante un procedimiento conocido. Por ejemplo, tal como se describe en los Ejemplos a continuación, se hace crecer una planta en condiciones de estrés, tales como sequía, sal elevada, baja temperatura, o condiciones de calor, y se compara el crecimiento de los individuos. Por ejemplo, se puede hacer la comparación midiendo una apariencia, un tamaño de una planta o de un tejido tal como unas hojas, un tallo, y una raíz, un peso (peso en húmedo o peso en seco), el color, una velocidad de crecimiento relativa, una actividad fotosintética, etc., como índice. La tolerancia al estrés puede aumentar en al menos un tejido de una planta. Se puede determinar un nivel de ABA en una planta mediante, por ejemplo, inmunoensayo, cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía de gases (GC) y HPLC (se refiere a Takahashi, N. y Masuda, Y. (eds), "Plant Hormone Handbook (The Last)", Baifukan, Japón, pp. 1-21; y las referencias citadas en el mismo). Por ejemplo, tal como se describe en el Ejemplo 7, es posible la cuantificación fiable cuantificando finalmente la fracción purificada bruta mediante HPLC con GC/MS, usando ABA marcado como patrón
interno.

Mediante la presente invención, se puede hacer crecer un cultivo útil en un área expuesta a estrés ambiental, por ejemplo, una zona de sequía. Además, se puede aplicar la presente invención a otras plantas diferentes de las de los cultivos para entornos de plantación de árboles.

La presente descripción se refiere también a un ADN que puede disminuir la expresión de un gen que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina que se va a usar para disminuir la tolerancia al estrés. Se puede usar también el ADN como reactivo para disminuir la tolerancia al estrés (agente de disminución de la tolerancia al estrés). La presente descripción se refiere también a los usos de un ADN que puede disminuir la expresión de un gen que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina para disminuir la tolerancia al estrés.

Una planta con tolerancia al estrés reducida es útil para eliminar malas hierbas y similares del medio ambiente, aplicándose a las malas hierbas y similares. Por ejemplo, se puede preparar una planta capaz de inducir la disminución en la tolerancia al estrés para aplicar a la mejora del campo y similar. A una planta con una alta capacidad de regeneración, tal como una mala hierba, se le introduce un constructo que inhiba la expresión de un gen de la enzima para la segmentación de la neoxantina (por ejemplo en la dirección de sentido contrario) en la dirección 3' de un promotor inducible con un agente químico (por ejemplo, un glucocorticoide y así sucesivamente). Esta planta transformante puede crecer normalmente sin la aplicación del agente químico. Se puede mejorar un campo árido haciendo crecer la mala hierba transformante durante algunos años, pulverizando el glucocorticoide para eliminar la mala hierba de una vez mediante la disminución de manera específica de la tolerancia al estrés en la mala hierba, y plantar una planta de cultivo. Como planta de cultivo, se introduce un cultivo transformante que sobreexpresa una enzima de segmentación de la neoxantina (una planta en la que se introduce el ADN en la dirección de sentido directo) y se puede plantar la mencionada.

Los presentes inventores crearon satisfactoriamente por primera vez una planta transformante en la que la expresión de una enzima para la segmentación de la neoxantina está artificialmente inhibida usando un constructo génico que expresa un ARN de sentido contrario de un gen de la enzima para la segmentación de la neoxantina. Esta planta se marchita fácilmente en condiciones no irrigadas en comparación con su tipo natural que muestra tolerancia al estrés reducida (Figs. 15 y 16). De tal manera, los presentes inventores establecieron un procedimiento para inhibir artificialmente la expresión de un gen que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina y redujeron por tanto satisfactoriamente la tolerancia al estrés en una planta.

Con el fin de reducir la tolerancia al estrés en una planta, se puede disminuir la expresión de un gen que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina. El término "expresión" del gen usado en el presente documento incluye la transcripción del gen y la traducción del transcripto. La inhibición de la expresión incluye la terminación completa de la expresión. Para inhibir la transcripción y la traducción del gen que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina, se puede inhibir la expresión del gen dirigiendo el ADN que codifica el gen, su región de control transcripcional, o el transcripto del gen.

Se puede usar cualquier planta para el procedimiento anterior, y se pueden usar varias plantas. Por ejemplo, se pueden usar Arabidopsis y similares. Los ejemplos de un gen que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina, que se puede dirigir para inhibir la expresión, son, VP14 para el maíz (Zea mays) (Schwartz, S. H. y col., Science, 276: 1872-1874, 1997; Tan, B. V. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 94: 12235-12240, 1997) (ADNc: SEC DE ID Nº: 13, proteína: SEC DE ID Nº: 14), LeNCED1 para tomate (Lycopersicon esculentum) (Burbidge, A. y col., J. Exp. Bot., 47: 2111-2112, 1997; Burbidge, A. y col., Plant J., 17: 427-431, 1999) (ADNc: SEC DE ID Nº: 15, proteína: SEC DE ID Nº: 16), AtNCED1 (ADNc: SEC DE ID Nº: 1, proteína: SEC DE ID Nº: 2), AtNCED3 (ADNc: SEC DE ID Nº: 5, proteína: SEC DE ID Nº: 6), y/o AtNCED5 (ADNc: SEC DE ID Nº: 9, proteína: SEC DE ID Nº: 10) para Arabidopsis, CPRD65 (ADNc: SEC DE ID Nº: 11, proteína: SEC DE ID Nº: 12) para frijol, etc. Los genes homólogos derivados de otras plantas pueden ser también una diana. Se pueden identificar y/o aislar los genes homólogos de otras plantas mediante, por ejemplo, el procedimiento de hibridación descrito y mencionado anteriormente. Para reducir la tolerancia al estrés en una planta dada de la presente descripción, usando un gen o la información de la secuencia génica de otras especies de plantas (por ejemplo, los genes anteriores), se puede inhibir la expresión de un gen diana en la planta deseada mediante procedimientos conocidos, tales como el silenciamiento del gen y los procedimientos de sentido contrario. Por tanto, un gen diana en una planta objetivo ni se aísla ni se identifica necesariamente.

Se puede inhibir la expresión de un gen que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina de la presente invención insertando un ADN para inhibir la expresión del gen en un vector apropiado, introduciendo el vector en una célula de la planta, y regenerando una planta transgénica a partir de la célula transformante resultante. Se puede usar cualquier promotor, por ejemplo los promotores que se describen anteriormente para el caso de mejorar la tolerancia al estrés. Por ejemplo, el uso de un promotor de la expresión de tipo inducible puede reducir la tolerancia al estrés sólo bajo una condición específica.

Como procedimiento para inhibir la expresión de un gen endógeno específico en una planta, una persona experta en la técnica usa con más frecuencia un procedimiento que usa la técnica de sentido contrario.

El procedimiento de sentido contrario es un procedimiento de inhibición artificial de la expresión génica en el que se forma una doble cadena de un ARNm diana con una molécula de ADN (un ácido nucleico de sentido contrario) complementario al ARN transcrito a partir de un gen dado, para inhibir la expresión. El procedimiento de sentido contrario de inhibición de la expresión génica se desarrolló entre 1960 y 1970, y en 1978, Zamecnik y col. inhibieron satisfactoriamente la replicación y la actividad de la transcriptasa inversa del virus de sarcoma de Rous en pollos usando un oligómero de sentido contrario (Zamecnik, P. C. y Stephenson, M. L., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 75: 280-284, 1978).

Entre los procedimientos para introducir un ADN de sentido contrario, se administra directamente un oligómero de sentido contrario a una célula, o se lleva a cabo la transformación uniendo un ADN de sentido contrario de un gen diana con un vector de expresión. Los ejemplos dados a continuación demuestran el último procedimiento. Específicamente, un ADNc de un gen que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina se une en la dirección 3' del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor en la dirección en sentido contrario para introducir el vector en una célula de la planta. El efecto de sentido contrario en una célula de planta se demostró en primer lugar por Ecker y col., demostrando el efecto de sentido contrario del ARN de sentido contrario introducido mediante electroporación usando un procedimiento de expresión génica transitoria en una planta (Ecker, J. R. y Davis, R. W., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 83: 5372, 1986). Tras lo anterior, se ha informado de la inhibición de una expresión génica diana mediante la expresión de un ARN de sentido contrario en plantas de tabaco y petunia (van der Krol, A. R. y col., Nature, 333: 866, 1988). En la actualidad, el procedimiento de sentido contrario está bien establecido como medio para inhibir la expresión génica en una planta. Los modos de inhibición de una expresión génica diana mediante un ácido nucleico de sentido contrario incluyen la inhibición del inicio de la transcripción mediante la formación de una triple cadena, la inhibición de la transcripción mediante la formación de un híbrido con un emplazamiento en el que se crea localmente una estructura de lazo abierto mediante una ARN polimerasa, la inhibición de cortado y pegado mediante la formación de un híbrido con un ARN en el que se produce una síntesis, la inhibición de cortado y pegado mediante la formación de un híbrido con un emplazamiento de formación del ayustosoma, la inhibición de la transferencia de un núcleo en un citoplasma mediante la formación de un híbrido con un ARNm, la inhibición del cortado y pegado mediante la formación de un híbrido con un emplazamiento tapado o un emplazamiento de Poli (A) adición, la inhibición del inicio de la traducción mediante la formación de un híbrido con un emplazamiento de unión al factor de inicio de la traducción, la inhibición de la traducción mediante la formación de un híbrido con un emplazamiento de unión al ribosoma que flanquea un codón de inicio, la inhibición de la extensión de una cadena péptida mediante la formación de un híbrido con una región de codificación del ARNm o un emplazamiento de unión al polisoma, la inhibición de la expresión génica mediante la formación de un híbrido con un emplazamiento de interacción entre un ácido nucleico y una proteína, y así sucesivamente. Estos procesos de inhibición de la transcripción, el cortado y pegado, o la traducción inhiben la expresión de un gen diana (Hirajima e Inoue, "New Biochemistry Experiment Lecture 2, Nucleic Acid IV, Replication and expression of a gene", Japanese Association of Biochemistry (eds), Tokyo-Kagakudojin, pp. 319-347, 1993).

Una secuencia de un ADN de sentido contrario es preferiblemente una secuencia complementaria de un transcripto de un gen endógeno que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina o su parte en una planta que se va a transformar, sin embargo, no es necesariamente completamente complementaria siempre que inhiba efectivamente la expresión génica. Un ARN transcrito comprende preferiblemente un 90% o más de complementariedad, y lo más preferible, un 95% o más de complementariedad a la del transcripto de un gen diana. Para inhibir efectivamente la expresión de un gen diana usando una secuencia de sentido contrario, la longitud de un ADN de sentido contrario es al menos de 15 o más nucleótidos, preferiblemente de 100 o más nucleótidos, y más preferiblemente de 500 o más nucleótidos. Generalmente, un ADN de sentido contrario que se va a usar es más corto de 5 kb y preferiblemente más corto de 2,5 kb.

Se puede inhibir también la expresión de un gen endógeno usando un ADN que codifica una ribozima. Recientemente, se ha estudiado la inhibición de la expresión génica usando un ADN que codifica una ribozima. Una ribozima es un ARN que comprende una actividad de catálisis de una reacción in vivo. Las ribozimas tienen diversas actividades. Los estudios de una ribozima como una enzima que rompe un ARN permiten diseñar una ribozima con el objetivo de romper un ARN en un emplazamiento específico. Las ribozimas incluyen un grupo I de tipo intrón, uno enorme de 400 o más nucleótidos tales como el ARNM1 incluido en la RNasaP, y aquellos denominados de tipo cabeza de martillo y de tipo alfiler para el cabello, que comprenden una región activa tan larga como 40 nucleótidos (Koizumi, M., y Otsuka, E., Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 35: 2191, 1990).

Por ejemplo, una región de autoescisión de una ribozima de tipo cabeza de martillo digiere el emplazamiento 3' de C15 en medio de G13U14C15. Se cree que la formación de un par de bases entre U14 y A en la 9ª es importante para esta actividad, y se puede digerir el nucleótido en la 15ª si este es A o U así como C (Koizumi, M. y col., FEBS Lett., 228: 225, 1988). Si un emplazamiento de unión al sustrato de una ribozima se diseña para que sea complementario de una secuencia de ARN que flanquea un emplazamiento diana, se puede crear una ribozima de tipo enzima de restricción que reconozca las secuencias UC, UU, o UA en un ARN diana (Koizumi, M. y col., FEBS Lett., 239: 285, 1988; Koizumi, M., Otuska, E., Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 35: 2191, 1990; Koizumi, M. y col., Nucleic Acids Res., 17: 7059, 1989). Por ejemplo, existen cientos de dichos emplazamientos en una región de codificación del gen AtNCED3 de Arabidopsis. Una ribozima de tipo alfiler para el cabello se encuentra en, por ejemplo, una cepa menos de un ARN satélite en el virus de la mancha anular del tabaco (Buzayan, J. M., Nature, 323: 349, 1986). Esta ribozima ha demostrado también ser capaz de diseñarse para romper específicamente un ARN diana (Kikuchi, Y. y Sasaki, N., Nucleic Acids Res., 19: 6751, 1992; Kikuchi, H., Chemistry and Biology, 30: 112,
1992).

Una ribozima diseñada para romper una diana está unida con un promotor, por ejemplo, el promotor 35S de los virus del mosaico de la coliflor y una secuencia de terminación de la transcripción, que se va a transcribir en una célula de la planta. Cuando se añade una secuencia extra al extremo 5' o al extremo 3' de un ARN transcrito, se puede eliminar la actividad de una ribozima. En este caso, para escindir con fiabilidad una porción de ribozima sola a partir de un ARN transcrito que contiene una ribozima, se puede colocar otra ribozima de recorte, que trabaja en cis para recortar el extremo 5' y el extremo 3' de una porción de la ribozima (Taira, K. y col., Protein Eng., 3: 733, 1990; Dzianott, A. M. y Bujarski, J. J., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.., 86: 4823, 1989; Grosshans, C. A. y Cech, R. T., Nucleic Acids Res., 19: 3875, 1991; Taira, K. y col., Nucleic Acids Res., 19: 5125, 1991). Además, dicha unidad constitutiva está dispuesta en tándem para escindir múltiples emplazamientos en el interior de un gen diana, mejorando el efecto (Yuyama, N. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 186: 1271, 1992). Usando dicha ribozima, se puede escindir un transcripto de un gen diana de la presente invención. Preferiblemente, una ribozima escinde específicamente un transcripto de un gen diana. Usando dicha ribozima, un transcripto de un gen diana de esta invención se escinde específicamente para inhibir su expresión.

Se puede conseguir también la inhibición de la expresión de un gen endógeno mediante supresión simultánea debida a la introducción de un ADN que comprende una secuencia idéntica o una similar a una secuencia del gen diana. "Supresión simultánea" significa un fenómeno en el que una introducción de un gen que comprende una secuencia idéntica o similar a un gen endógeno diana en una planta inhibe mediante transformación la expresión de ambos, tanto un gen exógeno introducido como un gen endógeno diana. Los detalles del mecanismo de supresión simultánea no están claros, sin embargo, se observan a menudo en plantas (Curr. Biol., 7: R793, 1997; Curr. Biol., 6: 810, 1996). Por ejemplo, se puede obtener una planta en la que se ha suprimido simultáneamente la expresión de un gen que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina, preparando un vector de ADN que comprende un gen que codifica un proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina o una secuencia similar, transformando una planta objetivo con el vector, y seleccionando entre las plantas obtenidas con un rasgo en el que se ha reducido la expresión de un gen que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la
neoxantina.

Un gen que se va a usar para la supresión simultánea no necesita ser completamente idéntico a un gen diana, sin embargo, generalmente tienen una identidad de al menos el 70% o más, preferiblemente 80% o más, más preferiblemente 90% o más. Se puede usar Genetyx (Software Development), un programa informático que procesa información genética, para determinar una identidad o complementariedad. Este programa adopta el procedimiento de Lipman-Pearson (Lipman, D. J. y Pearson, W. R., Science, 227: 1435-1441, 1985). Este procedimiento compara en primer lugar los datos de la secuencia, y calcula la identidad entre las secuencias con homología elevada en consideración con una delección de una secuencia (GAP).

Se puede preparar una planta transformante con tolerancia al estrés reducida usando un ADN tal como se describe anteriormente que inhiba la expresión de un gen. Específicamente, el ADN se inserta en un vector apropiado, el vector se introduce en una célula de la planta, y se regenera una planta transgénica a partir de la célula de la planta transformante. Como vector que se va a usar, se puede usar cualquier vector de la misma manera que en el caso anterior de aumentar la tolerancia al estrés siempre que se puede expresar un gen insertado en una célula de la planta. Se puede usar cualquier célula de la planta para insertar un vector. La planta puede ser una conífera, un árbol de hoja caduca, una dicotiledónea, una monocotiledónea, etc. La(s) "célula(s) de la planta" a las que se hace referencia en el presente documento incluye(n) diversas formas de células de la planta, por ejemplo, una célula cultivada en suspensión, un protoplasto, una parte de las hojas, un callo, y así sucesivamente.

Se puede llevar a cabo la introducción de un vector en una célula de la planta, y la regeneración de una planta a partir de una célula transformante mediante un procedimiento conocido por una persona experta en la técnica dependiendo del tipo de células de planta de la misma manera como en el caso de la tolerancia al estrés mejorada. Una vez que se puede obtener una planta transformante en la que se introduce un ADN de la presente invención en el genoma, se puede obtener la progenie de la planta mediante propagación sexual o asexual. Alternativamente, se puede obtener un material de propagación (por ejemplo, una semilla, un fruto, un vástago, un tubérculo, una raíz tuberosa, una reserva, un callo, un protoplasto, etc.) de la planta, su progenie, o los clones, y se puede producir en masa la planta a partir de los mismos. La presente invención incluye una célula de planta en la que se introduce un ADN de la presente invención, una planta que contiene la célula, la progenie o un clon de la planta que contiene la célula, así como un material de propagación de la planta que es homocigótico para el ADN de la presente invención, su progenie, y el clon.

La planta transformante creada de tal manera tiene un contenido de ABA reducido, en comparación con la planta de tipo natural. Alternativamente, la planta transformante tiene una tolerancia al estrés disminuida en comparación con la planta de tipo natural. La presente descripción se puede aplicar a, por ejemplo, una mala hierba para eliminarla efectivamente. Además, usando un promotor inducible tal como se describe anteriormente, se puede usar una planta transformante de la presente invención para la mejora del campo y similares.

La presente descripción permite crear una planta en la que se ha aumentado o disminuido la tolerancia al estrés, Una planta con la tolerancia al estrés mejorada puede crecer en un campo árido en el que las plantas ya no pueden crecer. La reducción de la tolerancia al estrés se puede aplicar a las malas hierbas y eliminarlas de este modo. El procedimiento de la presente invención se puede aplicar a la agricultura para expandir la zona cultivada y aumentar los rendimientos de los cultivos.

Cualquier patente, solicitud de patente, y las publicaciones citadas en el presente documento se incorporan por referencia.

La presente invención se ilustra en detalle a continuación con referencia a los ejemplos, pero no se debe tomar como limitante de los mismos. Las condiciones experimentales usadas en los presentes Ejemplos son como
sigue.

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Crecimiento del frijol

Se sembraron semillas de frijol (Vigna unguiculata IT84S-2246-4) en macetas y se hicieron crecer durante 8 días en un invernadero con un fotoperíodo de 16 horas (además de la luz natural, se suplementaron con iluminación artificial cuando la iluminación era insuficiente), temperatura de 25ºC, y un riego apropiado.

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Tratamiento de deshidratación

Para el tratamiento de deshidratación se extrajeron cuidadosamente las plantas de las macetas para evitar lesiones, se pesaron, y se deshidrataron en un papel de filtro 3MM de Whatman a temperatura ambiente y aproximadamente una humedad del 60% con luz tenue (300 lux). Para el control se extrajeron las plantas de las macetas y se trasplantaron inmediatamente en suelo bien regado que se mantuvo bajo las mismas condiciones que el grupo de tratamiento de la deshidratación.

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Análisis de la secuencia de ADN

Se prepararon plantillas de ADN plásmido usando el Sistema Automático de Aislamiento de Plásmidos Modelo PI-100 (KURABO) y se secuenciaron usando el Secuenciador de ADN Modelo 373A (ABI). Se analizaron las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos usando un Sistema Informático GeneWorks (IntelliGenetics, Inc.), Sequencher 3.0 (Hitachi Software) y el programa del Grupo de Genética asistido por ordenador (GCG) de la Universidad de Wisconsin,

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Ejemplo 1

Aislamiento de clones de ADNc que corresponden a los genes inducidos por la deshidratación

Se construyó una biblioteca de ADNc con ARN poli(A)^{+} que se había aislado de plantas de frijol de 8 días después del estrés debido a la deshidratación durante 10 horas como sigue.

Se cosecharon las plantas completas, se lavaron suavemente para eliminar el suelo de las raíces y se deshidrataron en un papel de filtro 3MM de Whatman a temperatura ambiente y aproximadamente una humedad del 60% con luz tenue durante 10 horas. Se preparó el ARN total de las plantas tras el tratamiento de deshidratación mediante el procedimiento anteriormente mencionado (Nagy, F. y col., "Analysis of gene expression in transgenic plants". En Gelvin y Schilperoort (eds), "Plant Molecular Biology Manual. B4", Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 1-29, 1988). Siguiendo la referencia (Sambrook, J. y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), se pasó el ARN total a través de un columna de celulosa Oligo-dt dos veces para preparar el ARN poli(A)^{+}. Se recogió aproximadamente un 2% del ARN aplicado a la columna como fracción de ARN Poli (A)^{+}. Se sintetizó el ADNc de doble cadena a partir del ARN Poli (A)^{+} usando el Sistema de Síntesis de ADNc Plus (Amersham Pharmacia Biotech). Se construyó una biblioteca de ADNc a partir del ADNc usando el Sistema de Clonación del ADNc (Amersham Pharmacia Biotech).

Se rastreó diferencialmente la biblioteca de ADNc con el ADNc preparado a partir del ARN poli(A)^{+} que se había aislado de plantas de frijol tras el estrés debido a la deshidratación durante 10 horas. Siguiendo la referencia (Sambrook, J. y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), se llevó a cabo la hibridación de las placas para rastrear 1 x 10^{4} placas de la biblioteca de ADNc.

Como resultado, se obtuvieron placas que daban una señal de hibridación más fuerte con ADNc marcado con [^{32}P] de plantas de frijol deshidratadas durante 10 horas. Las regiones plásmidas de los clones de los fagos se escindieron in vivo y se usaron para transformar células de Escherichia coli. Los fragmentos de ADNc de los plásmidos resultantes se analizaron usando el mapa de restricción y las secuencias límite de los fragmentos de ADNc. A partir de estos análisis, se agrupó el ADNc, y se podría identificar un clon de ADNc, denominado CPRD (CowPea Responsive to Dehydration) 65.

Se analizó la deshidratación inducida por la expresión del gen correspondiente al clon CPRD65 mediante hibridación de transferencia Northern. Se extrajeron la plantas de 8 días del suelo y se deshidrataron durante varios períodos de hasta 12 horas. Como controles, se extrajeron del suelo plantas de frijol similares y se trasplantaron en suelo bien regado. A continuación se aisló el ARN total de las plantas deshidratadas o control mediante la hibridación por transferencia Northern.

Se aisló el ARN total de acuerdo con el procedimiento de Nagy y col. (Nagy, F. y col., "Analysis of gene expression in transgenic plants". En Gelvin y Schilperoort (eds), "Plant Molecular Biology Manual, B4.", Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp, 1-29, 1988), fraccionado en un gel de agarosa al 1% que contenía formaldehido, y se transfirió a un filtro de nylon (Sambrook, J. y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).Se hibridó el filtro de nylon con fragmentos de ADNc de CPRD65 marcados con [^{32}P] en formamida al 50%, SSC 5X, tampón de fosfato de sodio 25 mM (pH 6,5), solución de Denhardt 10 X, y 250 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 42ºC. Se lavó el filtro dos veces con SSC 0,1 X, SDS al 0,1% a 60ºC durante 15 min, y se sometió a autorradiografía.

La Figura 1 muestra el curso de tiempo de la inducción de la expresión que corresponde al gen CPRD65 frente al tratamiento de deshidratación, La expresión de CPRD65 aumentó significativamente por el estrés debido a la deshidratación. Se observó que se acumulaba el ARNm correspondiente al CPRD65 en las dos horas después del inicio del tratamiento de deshidratación.

Las plantas de frijol deshidratadas durante 10 horas aparecieron marchitas. Estas plantas marchitas mostraron recuperación de la marchitez en las 4 horas después de la transferencia a un suelo bien regado (tratamiento de rehidratación). Tras la rehidratación, disminuyó el nivel de ARNm de CPRD65 (Fig. 1). El gen CPRD65 presentó respuestas típicas y significativas al estrés debido a la sequía, concretamente, la inducción de las transcripciones por la deshidratación y la reducción del nivel tras la rehidratación. Estos hechos sugirieron que el gen CPRD65 está implicado en la tolerancia a la sequía.

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Ejemplo 2

Análisis de la secuencia del ADNc de CPRD65

Debido a que el fragmento del ADNc de CPRD65 aislado en el Ejemplo 1 no tenía posiblemente la longitud completa, se rastreó la misma biblioteca de ADNc de nuevo con un ADNc parcial de CPRD65 como sonda para aislar un ADNc de longitud completa (SEC DE ID Nº: 11). Se muestra en la Fig. 2 una secuencia de aminoácidos codificada por el clon del ADNc de longitud completa (SEC DE ID Nº: 12). El ADNc de CPRD65 de longitud completa está constituido por 2432 pb, incluyendo una región que flanquea 5' de 125 pb y una región que flanquea 3' de 486 pb. Se encontró una secuencia consenso de poliadenilación (AATAAA) en la región que flanquea 3'. Esta secuencia tiene un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de 612 aminoácidos con un peso molecular calculado para la presunta proteína de 67,6 kDa. La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína CPRD65 con la base de datos de las proteínas reveló una extensa homología con VP14 de maíz (Zea mays) (61%) (Schwartz, S. H., Science, 276: 1872-1874, 1997) y un enzima para la segmentación de la neoxantina de tomate (Lycopersicon esculentum) (69%), (Burbidge, A. y col., J. Exp. Bot., 47: 2111-2112, 1997; Burbidge, A. y col., Plant J., 17: 427-431, 1999) tal como se muestra en la Fig. 2. La presunta proteína CPRD65 parece contener un polipéptido transitorio en su región N-terminal similar a la proteína VP14. Las secuencias N terminales del CPRD65, VP14 y la enzima para la segmentación de la neoxantina de tomate tienen baja similitud de la secuencia, pero similitud
estructural.

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Ejemplo 3

Análisis genómico de transferencia Southern del CPRD65

Con el fin de analizar los genes relacionados con el CPRD65 de planta de frijol, se llevó a cabo la hibridación mediante transferencia Southern en las condiciones de dos restricciones (Fig. 3).

Se llevó a cabo el análisis genómico de transferencia Southern de acuerdo con el procedimiento de referencia (Sambrook, J. y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Se digirió el ADN genómico de 10 \mug con enzimas de restricción, separados en un gel de agarosa al 1%, y se transfirió a un filtro de nylon. Se hibridó el filtro con fragmentos marcados con [^{32}P] en formamida al 30%, SSC 6 X, solución Denhardt 5 X y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 42ºC. se lavó el filtro dos veces con SSC 0,1 X, SDS al 0,1% a 60ºC durante 15 min (B), o se lavó dos veces con SSC 0,5 X, SDS al 0,5% a 37ºC durante 15 min (A), y se sometió a autorradiografía.

El ADNc de CPRD65 no tenía emplazamiento de restricción interna par EcoRI y XbaI y tenía dos emplazamientos de restricción interna de flanqueo para HindIII, confirmados por su secuencia de nucleótidos. Se detectaron una banda hibridada en la digestión con EcoRI y XbaI y dos bandas hibridadas en la digestión con HindIII usando el ADNc de CPRD65 como sonda. Se detectaron algunas bandas hibridadas débiles bajo la condición de restricción anterior (A). Estos resultados sugieren que el gen CPRD65 constituye una pequeña familia de genes con genes relacionados.

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Ejemplo 4

Análisis de transferencia Northern del gen CPRD65

Se analizaron los efectos de diversos estreses ambientales sobre la expresión del gen CPRD65. Para la salinidad alta, el ABA y los tratamientos con agua, se extrajeron las plantas del suelo de la misma manera que en el tratamiento de hidratación, y se hicieron crecer mediante hidrocultivo en soluciones que contenían NaCl 250 mM, ABA 100 \muM, y agua desionizada, respectivamente. Para el calor y los tratamientos de frío, se transfirieron las plantas en maceta a las incubadoras a 40ºC y 4ºC, respectivamente. Se llevó a cabo cada tratamiento a las plantas para el estrés durante 0, 1, 2, 5, 10, y 24 horas. Después de los tratamientos, las plantas tratadas se congelaron inmediatamente con nitrógeno líquido, y se aislaron los ARN para el análisis de transferencia Northern.

Como resultado, se encontró que la expresión de este gen estaba fuertemente inducida bajo condiciones de elevada salinidad, pero no por el estrés del frío o el calor (Fig. 4A). No se detectó la inducción del gen CPRD65 mediante el tratamiento con ABA o tratamiento con agua.

Para determinar la especificidad de la expresión del gen CPRD65 sobre el tejido bajo condiciones de estrés debido a la sequía, se llevó a cabo la hibridación mediante transferencia Northern del ARN total preparado de hojas, tallos, o raíces bajo una condición normal o de sequía (Fig. 4B). El transcripto de CPRD65 estaba fuertemente inducido en tallos y hojas por el tratamiento a la sequía, pero no en las raíces.

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Ejemplo 5

Actividad enzimática de la proteína CPRD65 expresada en bacterias

La secuencia de aminoácidos deducida del gen CPRD65 tiene elevada homología con una secuencia de aminoácidos de una enzima para la segmentación de la neoxantina codificada por el gen VP14 de maíz (Fig. 2). Para examinar si el gen CPRD65 codifica una enzima para la segmentación de la neoxantina, se analizaron las propiedades bioquímicas de la proteína CPRD65 recombinante expresada en E. coli. Se amplificó un fragmento de ADN de la región de codificación de CPRD65 mediante la PCR y se fusionó con el gen GST en marco usando el pGEX4T-1 (Pharmacia) para construir un plásmido pGST-CPRD65 quimérico como sigue.

Se amplificó el ADN que codificaba la proteína CPRD65 mediante la PCR usando los cebadores: 5'-ATTGAATT
CATGCCTTCAGCTTCAAAC-3' (SEC DE ID Nº: 19) y 5'-ATTGGATCCCAAAAGCTACACGCTGGTCCCC-3' (SEC DE ID Nº: 20). Se insertó el fragmento de la PCR en el emplazamiento EcoRV del vector pBluescript II SK^{+}. Se confirmaron las secuencias de los fragmentos de la PCR insertados para determinar si se generó una mutación en una secuencia de nucleótidos mediante la PCR. Se aisló el fragmento de la PCR en el que no se identificó ninguna mutación en la secuencia de nucleótidos del vector pBluescript II SK^{+} en forma de un fragmento de ADN usando los enzimas de restricción (EcoRI y XhoI) y se insertó en el emplazamiento EcoRI y XhoI de pGEX4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech) del constructo pGST-CPRD65. Se transformaron las células de la cepa JM109 de Escherichia coli con pGST-CPRD65 o pGEX4T-1 y se cultivaron en caldo L a 37ºC. Cuando la DO_{600} alcanzó aproximadamente 0,5, se añadió \beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG), y se continuó la incubación durante 12 horas a 17ºC. Las células se cosecharon, se lavaron, y se suspendieron en tampón de extracción [Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), MgCl_{2} 5 mM, glicerol al 5%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM, y ditiotreitol (DTT) 0,1 mM. Se llevaron a cabo los procedimientos para la purificación de la proteína fusionada y la digestión con trombina de acuerdo con el manual de instrucciones para el sistema de fusión del gen GST (Amersham Pharmacia Biotech). Se determinó la concentración de proteína con un kit de ensayo de proteínas (Bio-Rad).

Se sobreexpresó la proteína de fusión GST-CPRD65 en E. coli de la manera descrita anteriormente, y se purificó a partir del extracto celular bruto usando glutatión-Sefarosa 4B. Se examinó si esta proteína recombinante GST-CPRD65 purificada digería la cis-neoxantina, la trans-violaxantina, y la cis-violaxantina para producir xantoxina.

Se han descrito los procedimientos de ensayo para la actividad de la enzima para la segmentación de la neoxantina (Schwartz, S. H. y col., Science, 276: 1872-1874, 1997). Se prepararon cis-neoxantina y trans-violaxantina a partir de hojas de espinaca. Se preparó cis-violaxantina a partir de cáscara de naranja. La mezcla de reacción (100 \mul) contenía Bis-Tris 100 mM (pH 6,7) Triton X-100 al 0,05%, ácido ascórbico 10 mM, FeSO_{4} 5 mM, y una muestra de proteína. Se dejó proceder la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la adición de 1 ml de agua, se extrajeron las mezclas de reacción con n-hexano (1 ml x 2) y a continuación acetato de etilo (1 ml x 2). Se concentró la fracción de n-hexano y se sometió a análisis mediante HPLC sobre una columna C_{18} Nucleosil 5 (150 mm de longitud, 8 mm de diámetro interno (d. i.). Se eluyó la columna con un gradiente lineal entre el disolvente A (etanol al 85%) y el disolvente B (cloroformo y metanol, 1.1) a un caudal de 1,5 ml/min. se aumentó la concentración del disolvente B desde 10% a 50% en 25 min, y se mantuvo a un 50% durante 5 min. Se siguió la absorbancia del eluato con un detector UV a 440 nm. Se purificó la fracción de acetato de etilo con HPLC sobre una columna C_{18} Nucleosil 5 (150 mm de longitud, 8 mm de d. i.). Se eluyó la columna con disolución acuosa de metanol al 50% a un caudal de 1,5 ml/min, y se siguió la absorbancia del eluato con un detector UV a 260 nm. Se recogió la fracción de xantoxina predicha y se sometió a análisis GC-MS. En cada etapa, se protegieron las muestras de la luz tanto como fue posible.

Se llevó a cabo el análisis por GC-MS como sigue. Se usó para el análisis un espectrómetro de masas AUTOMASS (Nippon Denshi) equipado con un cromatógrafo de gases 5890 (Hewlett Packard). Las condiciones analíticas fueron como sigue: ionización, IE 70 eV; columna, DB-5 (15 m de longitud; d. i. 0,25 mm; espesor de la película 0,25 \mum; J&W Scientific), gas vehículo, He (1 ml min^{-1}); temperatura de inyección, 250ºC, temperatura de la línea de transferencia, 250ºC, y temperatura inicial de calentamiento, 80ºC, Comenzando 1 min después de la inyección, se aumentó la temperatura de calentamiento a 200ºC a una velocidad de 30ºC min^{-1} seguido por un incremento adicional a 230ºC a una velocidad de 5ºC min^{-1}.

Tal como se muestra en la Fig. 5, se detectaron el producto C25 predicho y la xantoxina en la mezcla de reacción con la proteína GST-CPRD65 y la cis-neoxantina mediante análisis HPLC. Se confirmó la aparición de la xantoxina mediante el análisis GC-MS en el que se observaron los iones característicos de la xantoxina. Los iones y sus intensidades relativas fueron: m/z 250 (4), 168 (32), 149 (77), 107 (61), y 95 (100). No se formaron xantoxina y producto C25 a partir de la trans-violaxantina (no se muestran los datos). Estos resultados no se vieron afectados por el tratamiento con trombina que separa la proteína recombinante GST-CPRD65 en porciones GST y CPRD65.

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Ejemplo 6

Análisis de la región N terminal de la proteína CPRD65 como péptido en tránsito en protoplastos preparados a partir de Arabidopsis

La región N terminal de la proteína de la proteína CPRD65 tiene características estructurales típicas de los péptidos transitorios que están implicados en la dirección del cloroplasto, esta característica estructural de la proteína CPRD65 sugiere que la proteína CPRD65 madura se localiza en los plástidos que incluyen los cloroplastos. Para analizar el papel de su región N terminal como un péptido en tránsito, se construyó un gen 35S::CPRD65N-sGFP quimérico que codifica la región N terminal de la proteína CPRD65 (1-148) entre el promotor 35S de CaMV y el gen de la proteína fluorescente verde sintética (sGFP) de la medusa Aequorea victoria (Chiu, W., y col., Curr. Biol., 6: 325-330, 1996).

Se amplificó el ADN correspondiente al péptido N terminal (1 a 148 aminoácidos) de la proteína CPRD65 mediante la PCR usando los cebadores: 5'-ATATATCTAGAATGCCTTCATCAGCTTCAAACACTTGG-3' (SEC DE ID Nº: 21) y 5'-ATATAGGATCCCTCCGGCACCGGCGCGAAGTTCCCG-3 (SEC DE ID Nº: 22). Se insertó el fragmento de la PCR en el vector pBluescript II SK^{+} y se verificó que no tenía mutación de la secuencia producida por la PCR. Se insertó el fragmento de ADN en el emplazamiento entre el promotor 35S y el gen sGFP en un vector de expresión transitoria (Chiu, W. y col., Curr. Biol., 6: 325-330, 1996). Se llevaron a cabo la preparación, la transfección de ADN, y la incubación de los protoplastos de Arabidopsis tal como se ha descrito anteriormente (Abel, S. y Theologis, A., Plant J., 5: 421-427, 1994).

Se introdujeron el constructo de fusión 35S::CPRD65N-sGFP y su constructo de control (35S::sGFP) en los protoplastos preparados de Arabidopsis mediante un procedimiento de transfección con ADN (Abel, S. y Theologis, A., Plant J., 5: 421-427, 1994). Se observaron los protoplastos mediante microscopio fluorescente 2 a 4 días después de la transformación. Tal como se muestra en la Fig. 6, cuando 35S::CPRD65N-sGFP se expresó transitoriamente en los protoplastos, se localizó la fluorescencia en los plástidos. Por otra parte, cuando se introdujo el constructo 35S::sGFP, se detectó la fluorescencia no en los plástidos, sino principalmente en el citoplasma. Estos resultados sugieren que la región N terminal de la proteína CPRD65 funciona como un péptido en tránsito para la diana de la proteína CPRD65 en los plástidos. Se esperaba que la proteína CPRD65 se localizara en los plástidos, y funcionara para producir ABA en los plástidos.

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Ejemplo 7

Acumulación de AB por estrés debido a la deshidratación en plantas de frijol de 8 días

Se midió la acumulación del nivel de ABA endógeno en una planta de frijol de 8 días en condiciones de deshidratación.

Se homogeneizaron las muestras en nitrógeno líquido y se extrajeron con disolución acuosa de metanol (20 a 80%) dos veces. Tras la adición de [^{2}H_{3}]ABA, se concentraron los extractos, y se sometieron a un procedimiento de fraccionamiento estándar del disolvente para dar una fracción soluble en acetato de etilo ácido. Se purificó ésta usando un cartucho Bond Elut (C_{18} y DEA, Varian) mediante el procedimiento informado anteriormente (Wijayanti, L., y col., Biosci. Biotech. Biochem., 59: 1533-1535, 1995). A continuación se sometieron la muestras purificadas de plantas no desecadas a análisis HPLC con una columna ODS-2101-N de Senshu Pak (100 mm de longitud, 6 mm de d. i., Senshu Scientific Co). Las condiciones analíticas fueron las mismas que se habían informado anteriormente (Wijayanti, L., y col., Biosci. Biotech. Biochem., 59: 1533-1535, 1995). Las muestras purificadas de esta manera se metilaron con diazometazona etérea y se sometieron a análisis GC-SIM.

Tal como se muestra en la Fig. 7, comienza a acumularse ABA en las 2 horas siguientes a la deshidratación. El nivel de ABA en las plantas deshidratadas durante 10 horas fue 140 veces mayor que en las plantas control no estresadas. El tiempo de acumulación del ARNm de CPRD65 fue anterior al de la acumulación del ARNm del ABA (Fig. 7).

La expresión del gen CPRD65 estuvo fuertemente inducida por el estrés debido a la sequía en hojas y tallos, pero ligeramente en las raíces (Fig. 4B). Se examinó la relación entre la expresión del gen CPRD65 y la acumulación del ABA endógeno bajo estrés debido a la sequía. Se separaron las plantas de frijol de 8 días en hojas, tallos, y raíces y a continuación se deshidrataron. Se midieron los niveles de ABA endógeno en estos órganos antes o después del tratamiento de deshidratación. Tal como se muestra en la Fig. 8, se acumuló espectacularmente ABA endógeno por el estrés debido a la sequía en hojas y tallos, pero ligeramente en la raíces. El modelo específico del tejido de acumulación de ABA en condiciones de estrés debido a la sequía fue consistente con el de la expresión del gen CPRD65 tal como se muestra en las Figs. 4B y 8.

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Ejemplo 8

Análisis de las xantofilas en hojas de frijol

Se analizaron las xantofilas en hojas de frijol para encontrar posibles sustancias para la proteína CPRD65.

Se extrajeron las muestras con acetona dos veces, y se concentraron los extractos, se disolvieron en metanol al 80% (1 ml) y se cargaron sobre una columna C_{18} Bond Elut. Se lavó la columna con 4 ml adicionales de metanol al 80%, y se eluyeron las xantofilas con 5 ml de metanol-agua-cloroformo (71:9:20). Se concentró el eluato y se aplicó a los análisis de HPLC con columna C1 Nucleosil 5 y Senshu Pak Silica-2251-S (250 mm de longitud, 6 mm de d. i.). Las condiciones para la ODS-HPLC fueron las mismas que las descritas anteriormente. Para la Silica-HPLC, se usaron un caudal de 1,5 ml/min y un gradiente lineal de disolvente B a una concentración desde 10% a 100% en 30 min en el que el disolvente A fue acetato de etilo-n-hexano (1:1) y el disolvente B es acetato de etilo. Se identificaron las xantofilas a partir de sus datos espectroscópicos visible y en el ultravioleta.

Se detectaron como xantofilas mayores trans-neoxantina, trans-violaxantina, y cis-neoxantina y se detectó cis-violaxantina como componente menor en hojas de frijol mediante análisis espectroscópico óptico de luces visible y ultravioleta (no se muestran los datos). Las cantidades endógenas de trans-neoxantina, trans-violaxantina, y cis-neoxantina no fueron significativamente diferentes entre condiciones de crecimiento normal y condiciones de sequía.

Tal como se muestra anteriormente, el gen CPRD65 de frijol inducible mediante sequía codifica la enzima para la segmentación de la neoxantina, y su producto se localiza en los plástidos. El gen CPRD65 estuvo fuertemente inducido principalmente en hojas y tallos bajo condiciones de sequía y elevada salinidad. Se observó una fuerte acumulación de ABA en hojas y tallos en condiciones de sequía, que mostraron un modelo similar de expresión del gen CPRD65. Estos resultados sugieren fuertemente que la proteína CPRD65 es una enzima implicada principalmente en la biosíntesis de ABA bajo estrés debido a la sequía en plantas de frijol.

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Ejemplo 9

Aislamiento del clon de ADNc de Arabidopsis que codifica un homólogo del gen de la enzima para la segmentación de la neoxantina

Usando el CPRD65 como sonda, se rastreó una biblioteca de ADNc de Arabidopsis (Abe H. y col, Plant Cell, 9: 1859-1868, 1997). Como resultado, se obtuvieron muchas placas que indicaban fuertes señales de hibridación. A partir de estas placas, se aislaron clones de fago, y se escindió una región d ADNc con enzimas de restricción para insertar en un vector pBluescript SK+ y transfectar E. coli. Mediante el análisis de una secuencia de ADN, se clasificaron estos clones en un grupo. Se designó éste AtNCED3. El AtNCED3 mostró una homología significativa con el CPRD65 que codifica una enzima para la segmentación de la neoxantina (Fig. 9). Se muestran una secuencia de nucleótidos del ADNc de AtNCED3 y una secuencia de aminoácidos de la proteína AtNCED3 en las SEC DE ID N^{os}: 5 y 6, respectivamente.

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Ejemplo 10

Aislamiento de los AtNCED1, 2, 4, y 5, y análisis del árbol filogénico

La investigación de las bases de datos del ADN usando las secuencias de nucleótidos de CPRD65 y del AtNCED3 identificó cuatro secuencias con una elevada homología (Nº de acceso AL021713, AL021687, AJ005813, AB028621).

Con el fin de aislar un gen con una elevada homología existente en la secuencia AL021713, se amplificó un fragmento del gen diana mediante el procedimiento de la PCR usando un ADNg como plantilla, y 5'-CCCGGGATCCCT
CAAGCCTCTCTATACCG-3' (SEC DE ID Nº: 23) y 5'-CCCGGGATCCTTTATACGGATTCTGAGGGAG-3' (SEC DE ID Nº: 24) como cebadores. Usando el fragmento como sonda, se aisló un clon que contenía el gen diana de la biblioteca de ADNg (Clontech). Se amplificó el gen de nuevo mediante el procedimiento de la PCR usando 5'-CCCGGGATCCCTCAAGCCTCTCTATACCG-3' (SEC DE ID Nº: 23) y 5'-CCCGGGATCCTTTATACGGATTCT
GAGGGAG-3' (SEC DE ID Nº: 24) como cebadores, y se clonó en el emplazamiento EcoRV de pBluescript II SK^{+} (Stratagene) para determinar una secuencia de nucleótidos. Se designó este gen como AtNCED1. Se muestran una secuencia de nucleótidos del ADNc de AtNCED1 y una secuencia de aminoácidos de la proteína AtNCED1 en las SEC DE ID N^{os}: 1 y 2, respectivamente.

Con el fin de aislar un gen con una elevada homología existente en la secuencia AL021687, se amplificó un fragmento del gen diana mediante el procedimiento de la PCR usando un ADNg como platilla, y 5'-ATTGAATTCATG
GACTCTGTTTCTTCTTCTTCC-3' (SEC DE ID Nº: 25) y 5'-ATTGAATTCTTAAAGCTTATTAAGGTCACTTTCC-3' (SEC DE ID Nº: 26) como cebadores. Usando el fragmento como sonda, se aisló un clon que contenía el gen diana a partir de la biblioteca de ADNg (Clontech). Se amplificó el gen de nuevo mediante el procedimiento de la PCR usando 5'-ATTGAATTCATGGACTCTGTTTCTTCTTCTTCC-3' (SEC DE ID Nº: 25) y 5'-ATTGAATTCTTAAAGCTTAT
TAAGGTCACTTTCC-3' (SEC DE ID Nº: 26) como cebadores, y se clonó en un emplazamiento EcoRV de pBluescript II SK+ (Stratagene) para determinar una secuencia de nucleótidos. Se designó este gen AtNCED2. Se muestran una secuencia de nucleótidos del ADNc de AtNCED2 y una secuencia de aminoácidos de la proteína AtNCED2 en las SEC DE ID N^{os}: 3 y 4, respectivamente.

Con el fin de aislar un gen con una elevada homología existente en la secuencia AJ005813, se amplificó un fragmento del gen diana mediante el procedimiento de la PCR usando un ADNg como platilla, y 5'-AAGAATTCATGGCG
GAGAAACTCAGTGATGGCAGC-3' (SEC DE ID Nº: 27) y 5'-AAAAGAATTCGGCTTATATAAGAGTTTGTTCC
TGG-3' (SEC DE ID Nº: 28) como cebadores. Usando el fragmento como sonda, se aisló un clon que contenía el gen diana a partir de la biblioteca de ADNg (Clontech). Se amplificó el gen de nuevo mediante el procedimiento de la PCR usando 5'-AAGAATTCATGGCGGAGAAACTCAGTGATGGCAGC-3' (SEC DE ID Nº: 27) y 5'-AAAA
GAATTCGGCTTATATAAGAGTTTGTTCCTGG-3' (SEC DE ID Nº: 28) como cebadores, y se clonó en un emplazamiento EcoRV de pBluescript II SK+ (Stratagene) para determinar una secuencia de nucleótidos. Se designó este gen como AtNCED4. Se muestran una secuencia de nucleótidos del ADNc de AtNCED4 y una secuencia de aminoácidos de la proteína AtNCED4 en las SEC DE ID N^{os}: 7 y 8, respectivamente.

Con el fin de aislar un gen con una elevada homología existente en la secuencia AB028621, se aisló el ADN del MUJ8 del clon P1. Se amplificó un fragmento del gen diana mediante el procedimiento de la PCR usando 5'-CGGGATCCATGCAACACTCTCTTCGTTCTGATCTTCTTC-3' (SEC DE ID Nº: 29) y 5'-CGGGATCCTCA
GAAAACTTGTTCCTTCAACTGATTCTCGC-3' (SEC DE ID Nº: 30) como cebadores y se clonó en el emplazamiento EcoRV de pBluescript II SK+ (Stratagene) para determinar una secuencia de nucleótidos. Se designó este gen como AtNCED5. Se muestran una secuencia de nucleótidos del ADNc de AtNCED5 y una secuencia de aminoácidos de la proteína AtNCED5 en las SEC DE ID N^{os}: 9 y 10, respectivamente.

La Figura 10 muestra las alineaciones de las secuencias de aminoácidos de los AtNCED1 a 5. Para examinar la relación entre las secuencias de aminoácidos deducidas de cada secuencia y las secuencias de las bases de datos, se llevó a cabo el análisis del árbol filogénico (Fig. 11). Se construyó un árbol filogénico usando GeneWorks (Intelligenetics, Inc), un programa informático para analizar genes. Se usó el algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean: Molecular Evolutionary genetics, escrito por Nei, M., traducido por Gojo, H. and Saito N., Baifukan, pp. 252-256, Japón).

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Ejemplo 11

Análisis de transferencia Northern de los genes AtNCED

Se analizaron los efectos de diversos estreses ambientales sobre la expresión de cada gen AtNCED identificado mediante el análisis de transferencia Northern.

Se usaron plantas creciendo sobre una placa de agar durante tres semanas para cada tratamiento de estrés. Para el estrés debido a la deshidratación, se extrajeron las plantas del medio de agar, y se secaron al aire sobre papel de filtro (humedad relativa del 50%), Para el estrés debido a la salinidad, el tratamiento con ABA, y el tratamiento con agua como control, se extrajeron las plantas y se colocaron en placas petri que contenían solución de NaCl 250 mM, solución de ABA 100 \muM, y agua destilada, respectivamente, de tal manera que sólo se sumergieron las raíces, durante un cierto período de tiempo a temperatura ambiente con una tapa cerrada. Para los estreses debidos al frío y al calor, se colocaron las placas de agar en una incubadora a temperatura constante a 4ºC y 40ºC, respectivamente, durante un cierto período de tiempo.

Las plantas tratadas con cada estrés ambiental anterior se trituraron en nitrógeno líquido, se extrajo el ARN total (Nagy F, Kay SA y Chua N-H (1988) Analysis of gene expression in transgenic plants. En Gelvin y Schilperoort (eds), Plant Molecular Biology Manual, B4. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 1-29), y se introdujeron 20 \mug de cada muestra en cada hilera de un gel de agarosa al 1% y se sometieron a electroforesis. Se transfirió el ARN desde el gel a una membrana de nylon después de la electroforesis, y se sometieron a la hibridación Northern usando una sonda de ADNc marcado con [^{32}P] (Sambrook, J., Fritsch EF y Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.).

Como resultado, se encontró que la expresión del gen AtNCED3 estaba fuertemente inducida por las condiciones de sequía, concentración elevada de sal, y el frío. La condición de calor no induce la expresión. Además, para el tratamiento con ABA o el tratamiento con agua, no se detectó la inducción de la expresión del gen AtNCED3 (Fig. 12).

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Ejemplo 12

Propiedades enzimáticas de la proteína AtNCED expresada en bacterias

La secuencia de aminoácidos deducida del gen AtNCED3 tiene una elevada homología con la del gen CPRD65 de frijol que codifica una enzima para la segmentación de la neoxantina (Fig. 9). Para examinar si el gen AtNCED3 codifica un enzima para la segmentación de la neoxantina, se analizaron las propiedades bioquímicas de la proteína AtNCED3 recombinante expresadas en E. coli.

Se amplificó el ADN que codificaba la proteína AtNCED3 mediante la PCR usando el ADNc de AtNCED3 clonado como plantilla, y 5'-ATTGAATTCATGGCTTCTTTCACGGCAACGGC-3' (SEC DE ID Nº: 31 y 5'-GTTTTCC
CAGTCACGAC-3' (SEC DE ID Nº: 32) como cebadores. Se clonó el fragmento de la PCR en el emplazamiento EcoRV de pBluescript II SK^{+} (Stratagene). Se confirmaron las secuencias de los fragmentos de la PCR insertados para determinar si se generó una mutación en una secuencia de nucleótidos por la PCR. El fragmento de ADN en el que no se identificó ninguna mutación se clonó en marco en el emplazamiento EcoRI de pGEX4T-1 que contenía el gen de la glutatión S-transferasa (GST) (Amersham Pharmacia Biotech) para construir el plásmidos pGST-AtNCED3 quimérico. Se transformaron las células de la cepa JM109 de Escherichia coli con pGST-AtNCED3 o pGEX4T-1 y se cultivaron en caldo L a 37ºC. Cuando la DC_{600} alcanzó aproximadamente 0,5, se añadió \beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) y se continuó durante 12 horas a 17ºC. Se cosecharon las células de E. coli, se lavaron, y se suspendieron en tampón de extracción [Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), MgCl_{2} 5 mM, glicerol al 5%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,1 mM, y ditiotreitol (DTT) 0,1 mM. Se llevaron a cabo los procedimientos par la purificación de la proteína fusionada y la digestión con trombina usando glutatión-Sefarosa 4B el sistema de fusión génica GST (Amersham Pharmacia Biotech)] de acuerdo con su manual de instrucciones. Se determinó la concentración de proteína con un kit de ensayo de proteínas (Bio-Rad, CA, EE.UU.).

Como resultados de los ensayos para la actividad de la enzima para la segmentación de la neoxantina, se detectaron el producto C25 y la xantoxina esperados en la mezcla de reacción que contenía la proteína GST-AtNCED3 y la cis-neoxantina, confirmando esto que la proteína AtNCED3 comprende la actividad de segmentación de la neoxantina. El experimento similar detectó la actividad de segmentación de la neoxantina en AtNCED1 y AtNCED5.

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Ejemplo 13

Preparación de plantas transgénicas

Se usó como muestra Arabidopsis (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ecotipo Columbia). Las plantas de Arabidopsis de tipo natural se sembraron en macetas de plástico de 9 cm de diámetro con suelo de cultivo, crecieron durante 6 semanas a 22ºC con un fotoperíodo de 16 horas, y a continuación se usaron para la transformación.

Se construyó un vector sin un gen indicador GUS (pBE2113NOT) a partir del vector pBE2113 con un marcador resistente a la kanamicina y un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (Mitsuhara, I. y col., Plant Cell Physiol., 37: 49-59, 1996), y se unió el ADNc de la AtNCED3 aislada de Arabidopsis al vector en el emplazamiento BaMHI en la dirección derecha (una dirección de sentido directo) o la opuesta (una dirección de sentido contrario). Los vectores obtenidos se introdujeron en una bacteria de suelo (Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101 (pMP90)) mezclando los vectores con la bacteria. Se seleccionó el Agrobacterium tumefaciens con el gen diana para la resistencia a la kanamicina (Km), y se infectó con plantas de Arabidopsis de tipo natural usando el procedimiento de infiltración a vacío (Bechtold, N. y col., C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sci., 316: 1194-1199, 1993). A partir de las plantas infectadas, se cosecharon las semillas secas, se sembraron en una placa de agar suplementado con Km, y se hicieron crecer para recoger las semillas para la tercera generación (T3) de plantas que mostraban resistencia a la Km. Además, se sembraron las semillas de la tercera generación sobre una placa suplementada con Km de la manera similar, y se usaron aquellas de todas las semillas que mostraron resistencia al fármaco para los siguientes experimentos como una línea homóloga T3. Finalmente, se aislaron dos líneas para cada transformante de sentido directo y sentido contrario del gen AtNCED3.

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Ejemplo 14

Evaluación de la expresión del gen AtNCED3 en transformantes

Se evaluó la expresión del gen AtNCED3 en Arabidopsis de tipo natural y plantas transformante para el gen AtNCED3 mediante el procedimiento de hibridación Northern.

Se usaron plantas cultivadas durante un mes para el análisis de la expresión del gen AtNCED3. Se extrajeron las plantas y se secaron al aire sobre papeles de filtro tal como en el estrés debido a la sequía (humedad relativa del 50%). Las plantas que soportaron el tratamiento de estrés ambiental anterior se rompieron en nitrógeno líquido para extraer el ARN total (Nagy, F., Kay, S. A. y Chua, N. -H. (1988) Analysis of gene expression in transgenic plants. En Gelvin y Schilperoort, eds, Plant Molecular Biology Manual, B4. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 1-29). Se sometió el ARN a electroforesis (20 \mug por hilera) en gel de agarosa al 1%, se transfirió desde el gel sometido a electroforesis sobre una membrana de nylon, y se sometió a hibridación Northern usando una sonda de ARN marcada con [^{32}P] (Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.).

Como resultado, el gen AtNCED3 no se expresó en el tipo natural antes del estrés debido a la sequía sino que se expresó ya en las plantas de sentido directo. Por otra parte, tras el tratamiento debido a la sequía, se indujo el gen AtNCED3 para expresar por la sequía en las plantas de tipo natural pero no expresarse en las plantas de sentido contrario incluso después del tratamiento de estrés debido a la sequía (Fig. 13).

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Ejemplo 15

Evaluación de la cantidad de ABA endógeno en transformantes

Se midieron las cantidades de ABA endógeno en Arabidopsis de tipo natural y plantas transformante para el gen AtNCED3.

Se usaron plantas cultivadas durante un mes para la evaluación de las cantidades de ABA endógeno en Arabidopsis de tipo natural y los transformantes. Se homogeneizaron las muestras en nitrógeno líquido y se llevó a cabo la extracción con disolución acuosa de metanol (20 a 80%) dos veces. Tras añadir [^{2}H_{3}] ABA, se concentraron los extractos, y se obtuvieron fracciones solubles en ácido-acetato de etilo mediante un fraccionamiento estándar del disolvente. Se purificaron estas fracciones usando el cartucho Bond Elut (C_{18} y DEA, Varian) siguiendo el procedimiento descrito en Wijayanti, L. y col., Biosci. Biotech. Biochem., 59: 1533-1535, 1995. Se analizaron las muestras purificadas a partir de plantas no deshidratadas usando la columna ODS-2101-N de Senshu Pak (100 mm de longitud, 6 mm de d. i.) (Senshu Scientific Co) mediante HPLC. Las condiciones analíticas fueron las mismas que las descritas en Wijayanti, L. y col., Biosci. Biotech. Biochem., 59: 1533-1535, 1995. Se metilaron las muestras purificadas mediante diazometazona etérea y se analizaron mediante GC-SIM.

Como resultado, la cantidad de ABA aumentó en la planta de sentido directo en comparación con su tipo natural y disminuyó en la planta de sentido contrario (Fig. 14).

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Ejemplo 16

Resultados de la evaluación de la tolerancia a la sequía

Se sembraron las semillas de las plantas transformantes obtenidas sobre una placa de agar suplementado con sales nutritivas (Valvekens, D. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 85: 5536-5540, 1988), y se hicieron crecer bajo las anteriores condiciones de crecimiento durante dos semanas para someterlas al siguiente experimento.

Se trasplantaron cuatro individuos de las plantas anteriores a macetas de plástico con un diámetro de 9 cm rellenas con el suelo (vermiculita:perlita = 1,1) y se hicieron crecer bajo la condición con temperatura de 22ºC y un fotoperíodo de 16 horas. Tres semanas después de sembrar las semillas (dos semanas después del trasplante), las macetas con las plantas se deshidrataron deteniendo el regado para producir naturalmente el estrés debido a la sequía. Catorce días y 17 días después del inicio de la no irrigación, se tomaron fotografía de las plantas. Las plantas en la que se introdujo el gen AtNCED3 en la dirección de sentido contrario se marchitaron 14 días después del inicio de la no irrigación (Fig. 15). Por el contrario, las plantas transformantes en las que se introdujo el gen en la dirección de sentido directo no se marchitaron casi nunca. Las líneas naturales se marchitaron también 17 días después del inicio de la no irrigación, mientras que las plantas transformantes en las que se introdujo el gen en la dirección de sentido directo mostraron tolerancia significativa a la sequía (Fig. 16).

<110> RIKEN

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<120> Plantas transgénicas con el gen de la enzima para la segmentación de la neoxantina

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<130> R3-102DP1

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<140>

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<141>

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<150> JP 2000-010056

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<151> 13-01-2000

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 32

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1752

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1752)

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<400> 1

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\hskip0,8cm

1

\hskip0,8cm

2

\hskip0,8cm

3

\hskip0,8cm

4

\hskip0,8cm

5

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<210> 2

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<211> 583

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<212> PRT

<213 Arabidopsis thaliana

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<400> 2

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\hskip0,8cm

6

\hskip0,8cm

7

\hskip0,8cm

8

\hskip0,8cm

9

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<210> 3

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<211> 1788

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1788)

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<400> 3

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

10

\hskip0,8cm

11

\hskip0,8cm

12

\hskip0,8cm

13

\hskip0,8cm

14

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<210> 4

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<211> 595

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 4

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\hskip0,8cm

15

\hskip0,8cm

16

\hskip0,8cm

17

\hskip0,8cm

18

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<210> 5

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<211> 1800

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1800)

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<400> 5

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\hskip0,8cm

19

\hskip0,8cm

20

\hskip0,8cm

21

\hskip0,8cm

22

\hskip0,8cm

23

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<210> 6

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<211> 599

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 6

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\hskip0,8cm

24

\hskip0,8cm

25

\hskip0,8cm

26

\hskip0,8cm

27

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<210> 7

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<211> 1617

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

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<221> CDS

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<220> (1)..(1617)

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<400> 7

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\hskip0,8cm

28

\hskip0,8cm

29

\hskip0,8cm

30

\hskip0,8cm

31

\hskip0,8cm

32

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<210> 8

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<211> 538

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 8

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\hskip0,8cm

33

\hskip0,8cm

34

\hskip0,8cm

35

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<210> 9

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<211> 1734

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<212> ADN

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<213> Arabidopsis thaliana

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1734)

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<400> 9

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\hskip0,8cm

36

\hskip0,8cm

37

\hskip0,8cm

38

\hskip0,8cm

39

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<210> 10

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<211> 577

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<212> PRT

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<213> Arabidopsis thaliana

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<400> 10

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\hskip0,8cm

40

\hskip0,8cm

41

\hskip0,8cm

42

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<210> 11

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<211> 1839

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<212> ADN

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<213> Vigna unguiculata

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1839)

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<400> 11

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\hskip0,8cm

43

\hskip0,8cm

44

\hskip0,8cm

45

\hskip0,8cm

46

\newpage

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<210> 12

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<211> 612

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<212> PRT

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<213> Vigna unguiculata

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<400> 12

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\hskip0,8cm

47

\hskip0,8cm

48

\hskip0,8cm

49

\hskip0,8cm

50

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<210> 13

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<211> 1815>

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<212> ADN

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<213> Zea mays

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1815)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

51

\hskip0,8cm

52

\hskip0,8cm

53

\hskip0,8cm

54

\hskip0,8cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 604

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Zea mays

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

56

\hskip0,8cm

57

\hskip0,8cm

58

\hskip0,8cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1818

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon esculentum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1818)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

60

\hskip0,8cm

61

\hskip0,8cm

62

\hskip0,8cm

63

\hskip0,8cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 605

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Lycopersicon esculentum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

65

\hskip0,8cm

66

\hskip0,8cm

67

\hskip0,8cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1617

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1617)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

69

\hskip0,8cm

70

\hskip0,8cm

71

\hskip0,8cm

72

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 538

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Arabidopsis thaliana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

73

\hskip0,8cm

74

\hskip0,8cm

75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attgaattca tgccttcagc ttcaaac

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADB

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attggatccc aaaagctaca cgctggtccc c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatatctag aatgccttca tcagcttcaa acacttgg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atataggatc cctccggcac cggcgcgaag ttcccg

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgggatcc ctcaagcctc tctataccg

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgggatcc tttatacgga ttctgaggga g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attgaattca tggactctgt ttcttcttct tcc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attgaattct taaagcttat taaggtcact ttcc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagaattcat ggcggagaaa ctcagtgatg gcagc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaagaattc ggcttatata agagtttgtt cctgg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatccat gcaacactct cttcgttctg atcttcttc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatcctc agaaaacttg ttccttcaac tgattctcgc

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attgaattca tggcttcttt cacggcaacg gc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttttcccag tcacgac

\hfill

17

Claims

1. Un ADN que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina,

en el que la proteína que tiene una actividad de segmentación de la proteína se selecciona entre el grupo constituido por:

(a): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC DE ID Nº 6;

(b): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno de los 100 aminoácidos en la SEC DE ID Nº 6 está sustituido, borrado, añadido y/o insertado; y

(c): una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos un 80% a la SEC DE ID Nº 6.

2. Un ADN tal como se reivindica en la reivindicación 1, en la que el ADN es capaz de mejorar la tolerancia al estrés por sequía en una planta.

3. El ADN de la reivindicación 1 ó 2, en el que la proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina está derivado de plantas Arabidopsis.

4. Una célula de la planta transformante en la que se ha introducido el ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Una planta transgénica que comprende la célula de la planta transformante de la reivindicación 4.

6. Una planta transgénica que comprende la célula transformante de planta de la reivindicación 4 que es una progenie o un clon de la planta transformante de la reivindicación 5.

7. La planta transgénica de la reivindicación 5 ó 6, en la que la expresión de un gen que codifica una proteína que tiene una actividad de segmentación de la neoxantina está potenciada en comparación con su tipo natural.

8. La planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que la cantidad de ácido abscísico está aumentada en comparación con la de su tipo natural.

9. La planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que la tolerancia al estrés por sequía está potenciada en comparación a la de su tipo natural.

10. Un material de propagación de la planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en la que el material es homocigótico para el ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Un vector que comprende el ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. Un procedimiento para producir la planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, que comprende las etapas de introducir un ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en una célula de la planta y regenerar una planta a partir de una célula de la planta.

13. Un procedimiento para aumentar la tolerancia al estrés por sequía en una planta, que comprende expresar el ADN de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en una célula de la planta.

14. Uso del ADN de la reivindicación 1 para mejorar la tolerancia al estrés por sequía en una planta.