JP4621361B2 - ネオザンチン開裂酵素遺伝子を用いるトランスジェニック植物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物のストレス耐性を上昇または低下させるために用いるＤＮＡ、および該ＤＮＡのトランスジェニック植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物は移動の自由を持たないため、乾燥、土壌中の塩、低温などの様々なストレスに適応しなければならない。これらのストレスの中で、乾燥は最も植物の生長に影響を与えていると考えられる。乾燥状態でも生存できるように、進化の過程で生理的・形態的に特異な形質を獲得した植物が存在する一方、他の多くの植物も乾燥ストレスに応答し、防御する機構を備えている。このような植物の渇水に対する応答と乾燥環境への適応は、渇水時の遺伝子発現の変化を含む様々な生理学的変化によりもたらされる（Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., Plant Physiol. 115: 327-334, 1997; Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., "Molecular responses to drought stress". In Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki (eds), "Molecular responses to cold, drought, heat and salt stress in higher plants", R.G. LANDES company, Austin, Texas, USA, pp.11-28, 1999）。例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）では、乾燥シグナルはアブシジン酸（abscisic acid; ABA）依存的経路とABA非依存的経路により伝達され、乾燥耐性に関わる遺伝子の発現を調節していることが知られている。これらの遺伝子産物は、例えば、ショ糖やプロリンなどの適合溶質（osmoprotectants）の蓄積、蛋白質の半減期、ストレスシグナル伝達経路、転写などを調節する機能を果たしていると考えられている（Bray, E.A., Trends in Plant Science, 2: 48-54, 1997; Bohnert, H.J. et al., Plant Cell, 7: 1099-1111, 1995; Ingram, J. and Bartels, D., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 377-403, 1996; Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., Plant Physiol. 115: 327-334, 1997; Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., "Molecular responses to drought stress". In Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki (eds), "Molecular responses to cold, drought, heat and salt stress in higher plants", R.G. LANDES company, Austin, Texas, USA, pp.11-28, 1999）。
【０００３】
高等植物におけるABAの生合成経路としては、C40経路が考えられている。C40経路は別名カロチノイド経路ともよばれ、ゼアザンチン（zeaxanthin）のエポキシ化を経てビオラザンチン（violaxanthin）、ネオザンチン（neoxanthin）、ザントキシン（xanthoxin）、ABAアルデヒド、ABAへと合成される経路である（Zeevaart, J.A.D. and Creelman, R.A., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39: 439-473, 1988）。この生合成経路は、生理学的な研究やABA生合成変異株の解析から予想されたものである。例えば、タバコ（Nicotiana tabacum）から単離されたaba2変異株は、ゼアザンチンのエポキシ化を行うゼアザンチンエポキシダーゼ酵素遺伝子（aba2）に変異が入っている（Marin, E. et al., EMBO J. 15: 2331-2342, 1996）。トウモロコシから単離されたvp14変異株は、ネオザンチンからザントキシンへの変換を触媒するネオザンチン開裂酵素遺伝子（VP14）に変異が入っている（Tan, B.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12235-12240, 1997）。また、シロイヌナズナからは、ザントキシンからABAアルデヒドへの反応を触媒する酵素に変異が入ったaba3変異株、ABAアルデヒドを酸化しABAを産生する反応に関与するaba4変異株が単離されている（Schwartz, S.H. et al., 1997, Plant Physiol. 114: 161-166; Leon-Kloosterziel, K.M. et al., 1996, Plant J. 10: 655-661）。
【０００４】
ネオザンチン開裂酵素遺伝子（VP14）に変異を有するトウモロコシは、水分を失いやすく萎れやすい形質を示すことは知られているが、ネオザンチン開裂酵素遺伝子を用いて、植物のストレス耐性を向上させることができるかは知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物のストレス耐性を上昇させるために用いられるネオザンチン開裂酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを植物に導入することにより、植物のストレス耐性を上昇させる方法、および、ネオザンチン開裂酵素の遺伝子が導入されたトランスジェニック植物を提供することを課題とする。また本発明は、植物のストレス耐性を低下させるために用いられるＤＮＡ分子、該ＤＮＡを植物に導入することにより、植物のストレス耐性を低下させる方法、および、該ＤＮＡが導入されたトランスジェニック植物を提供することを課題とする。植物のストレス耐性の上昇は、植物の品種改良などの分野において有用である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高い耐旱性を示すカウピー（Vigna unguiculata）を10時間乾燥処理して調製したcDNAライブラリーのディファレンシャルスクリーニングにより、乾燥処理に対する応答に関わる遺伝子に対応するcDNAクローン（CPRD65）を単離した。CPRD65 cDNA はアブシジン酸（ABA）の生合成に関与すると考えられているネオザンチン開裂酵素をコードしていることが予想された。生育８日目のカウピーに乾燥ストレスを与えると、ABAの蓄積とCPRD65の発現が強く誘導されたことから、CPRD65遺伝子は、特に乾燥ストレス応答に深く関与していることが予想された。GST-CPRD65融合蛋白質を用いて酵素活性を調べたところ、CPRD65は9-cis-ネオザンチンを開裂しザントキシンを産生する活性を有することが確認された。これらの結果は、CPRD65遺伝子はネオザンチン開裂酵素をコードしており、その産物は、乾燥ストレス下における内生ABAの生合成において鍵となる役割を果たしていることを示している。
【０００７】
本発明者らは、さらに、カウピーから単離したCPRD65遺伝子のcDNAをプローブにして、シロイヌナズナ由来cDNAライブラリーからネオザンチン開裂酵素遺伝子のスクリーニングを行い、新規遺伝子（AtNCED3）を単離した。さらに、これらの遺伝子と相同性の高い配列を有する４種類のシロイヌナズナ由来の配列（AtNCED1、2、4、5）を見出した。これらの遺伝子を大腸菌で発現させ、ネオザンチン開裂活性のアッセイを行ったところ、AtNCED1、3、および5が、CPRD65と同様にネオザンチン開裂酵素の活性を有することが判明した。
【０００８】
本発明者らは、その中の１つであるAtNCED3遺伝子を例に用いてネオザンチン開裂酵素遺伝子のシロイヌナズナ形質転換植物を初めて作製した。植物細胞の遺伝子導入用ベクター（pBE2113N）の 35S プロモーター下流にセンス（過剰発現型）、またはアンチセンス（発現抑制）方向にAtNCED3遺伝子を接続し、これを減圧浸潤法でシロイヌナズナに導入した。作製したトランスジェニック植物の乾燥耐性を評価した結果、過剰発現体では親株に比べストレス耐性が有意に上昇していることが判明した。逆に、アンチセンスを導入した発現抑制株ではストレス耐性が低下していた（図１５、１６）。このように本発明者らは、ネオザンチン開裂酵素遺伝子のトランスジェニック植物が、実際にストレス耐性を有意に上昇させること、さらに、該遺伝子の発現を低下させることにより、ストレス耐性を有意に低下させることができることを見出し本発明を完成させた。
【０００９】
即ち、本発明は、植物のストレス耐性を上昇させるために用いられるネオザンチン開裂酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを植物に導入することにより、植物のストレス耐性を上昇させる方法、および、ネオザンチン開裂酵素の遺伝子が導入されたトランスジェニック植物、ならびに植物のストレス耐性を低下させるために用いられるＤＮＡ分子、該ＤＮＡを植物に導入することにより、植物のストレス耐性を低下させる方法、および、該ＤＮＡが導入されたトランスジェニック植物に関し、より具体的には、
（１）植物のストレス耐性を上昇させるために用いる、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードするDNA、
（２）植物のストレス耐性を低下させるために用いる、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、
（ｂ）ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写産物を開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
（ｃ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現を抑制させるRNAをコードするDNA、
（３）ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質が、下記（ａ）から（c）のいずれかに記載の蛋白質である、（１）または（２）に記載のDNA、
（ａ）配列番号：２（AtNCED1）、６（AtNCED3）、１０（AtNCED5）、１２（CPRD65）、１４（VP14）、または１６（LeNCED1）に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２（AtNCED1）、６（AtNCED3）、１０（AtNCED5）、１２（CPRD65）、１４（VP14）、または１６（LeNCED1）に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｃ）配列番号：１（AtNCED1）、５（AtNCED3）、９（AtNCED5）、１１（CPRD65）、１３（VP14）、または１５（LeNCED1）に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードする蛋白質、
（４）ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質がアラビドプシス由来である、（１）から（３）のいずれかに記載のDNA、
（５）（１）から（４）のいずれかに記載のDNAが導入された形質転換植物細胞、
（６）（５）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、
（７）（６）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
（８）ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現が野生型に比べ上昇または低下している（６）または（７）に記載の植物体、
（９）アブシジン酸量が野生型に比べ上昇または低下している、（６）から（８）のいずれかに記載の植物体、
（１０）ストレス耐性が野生型に比べ上昇または低下している、（６）から（９）のいずれかに記載の植物体、
（１１）（６）から（１０）のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料、
（１２）（１）から（４）のいずれかに記載のDNAを保持するベクター、
（１３）（６）から（１０）のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、（１）から（４）のいずれかに記載のDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、
（１４）（１）から（４）のいずれかに記載のDNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物のストレス耐性を上昇または低下させる方法、を提供するものである。
【００１０】
なお、本発明において「ストレス耐性」とは、乾燥ストレス耐性、塩ストレス耐性、低温ストレス耐性、大気汚染耐性、低酸素状態に対する耐性、病原菌耐性、および農薬などの薬剤耐性などの環境ストレスに対する耐性を指す。ABAを外部から処理することにより多くの植物で、これらのストレスに対する耐性が上昇することが知られている（高橋信孝・増田芳雄共編、植物ホルモンハンドブック(下)、pp.78-160、培風館; およびそこに引用されている文献を参照のこと）。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、ストレス耐性を上昇させるために用いる、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードするDNAに関する。ネオザンチン開裂酵素の遺伝子は、これまでABAの生合成に関与する酵素としては知られていたが、この酵素をコードするDNAを植物に導入することにより、実際にABAの蓄積がもたらされ、植物体の生育に重大な影響を与えることなくストレスに対する耐性を向上させることができるかどうかは知られていなかった。
【００１２】
例えば、外部からABAを植物に処理すると、多くの植物において生育阻害などが認められる。また、種子においても、ABA処理により生育阻害（発芽阻害）が起きることが知られている（高橋信孝・増田芳雄共編、植物ホルモンハンドブック(下)、pp.78-160、培風館; およびそこに引用されている文献を参照のこと）。このように、ABAレベルの上昇は、植物に対し様々な障害をもたらす。外来遺伝子によるABAの過剰生産が、ストレス耐性の獲得につながるかどうかの情報は全くなかった。これまで行われてきた研究手法においては外部からABAを処理していたが、高い処理濃度が必要なため発育阻害が強く、正確な耐性評価に結びつかなかった。また外部からの処理実験では、正常に発育しつつ耐性を獲得するようなABAレベルがありうるのかどうか不明であった。本発明において、ABA生合成遺伝子の取得とこれを用いた形質転換植物の作成を行うことにより、植物のストレス耐性が上昇することが初めて実証された。
【００１３】
ストレス耐性を上昇させるために用いるDNAとしては、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードしている限り制限はない。現在、ネオザンチン開裂酵素の遺伝子としては、トウモロコシ（Zea mays）のVP14（Schwartz, S. H. et al., Science 276: 1872-1874, 1997; Tan, B. V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12235-12240, 1997）（cDNA：配列番号１３、蛋白質：配列番号：１４）、トマト（Lycopersicon esculentum）のLeNCED1（Burbidge, A. et al., J. Exp. Bot., 47: 2111-2112, 1997；Burbidge, A. et al., Plant J. 17:427-431, 1999）（cDNA：配列番号１５、蛋白質：配列番号：１６）等が単離されている。これらの遺伝子は、ストレス耐性を上昇させるために有用であり、本発明において用いられ得る。また、AtNCED1（配列番号：２）、AtNCED3（配列番号：６）、AtNCED5（配列番号：１０）、およびCPRD65（配列番号：１２）をコードするDNA（それぞれ、配列番号：１、５、９、および１１）も好適に用いられ得る。また、配列番号：１８に記載のネオザンチン開裂酵素をコードするDNA（cDNA,配列番号：１７、蛋白質, 配列番号：１８）（Neill, S.J. et al., J. Exp. Bot., 49: 1893-1894, 1998, Ac. No. AJ005813）も本発明において用いられ得る。ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードするDNAは、ストレス耐性を上昇させるための試薬（ストレス耐性上昇剤）ともなる。また本発明は、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードするDNAのストレス耐性を上昇させるための使用を提供する。
【００１４】
本発明のネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードするDNAには、ゲノムDNA、cDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、植物体から常法に従ってゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明のDNA（例えば、配列番号：１、５、９、１１、１３、または１５など）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明のDNA（例えば、配列番号：１、５、９、１１、１３、または１５など）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行うことによって調製することも可能である。また、cDNAは、植物体から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλファージベクター等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。また、本発明のDNAには、配列番号：１、５、９、１１、１３、または１５に記載のDNA配列のみならず、各蛋白質のアミノ酸をコードするコドンの任意の縮重に基づく塩基配列からなるDNAが含まれる。
【００１５】
また本発明のDNAには、例えば、配列番号：２、６、１０、１２、１４、または１６に記載の蛋白質において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードするDNAが含まれる。このようなDNAには、配列番号：１、５、９、１１、１３、または１５に記載の天然の植物由来の遺伝子の変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００１６】
アミノ酸配列が改変された蛋白質をコードするDNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、PCRによるin vitro変異導入法が挙げられる（伊沢毅、PCRによるin vitro mutagenesis、151-158頁、監修 島本功、佐々木卓治、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ７新版植物のＰＣＲ実験プロトコール、秀潤社）。蛋白質におけるアミノ酸の改変は、人為的に行うのであれば、通常、200アミノ酸以内、好ましくは100アミノ酸以内、さらに好ましくは50アミノ酸以内、さらに好ましくは10アミノ酸以内である。また、塩基配列の変異によりコードする蛋白質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のネオザンチン開裂酵素をコードするアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNAであっても、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする限り、本発明のDNAに含まれる。また、例え、塩基配列が変異した場合でも、それが蛋白質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。
【００１７】
あるDNAがネオザンチン開裂酵素をコードしているか否かは、実施例５に記載されているように、大腸菌でDNAを発現させて組換え蛋白質を調製し、シス-ネオザンチンを基質としてその開裂を検出することにより決定することができる。
【００１８】
また、既知のネオザンチン開裂酵素をコードするDNAを基に、新たにネオザンチン開裂酵素遺伝子を単離することもできる。このための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Maniatis, T. et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（中山広樹著,細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド第３巻新版, 秀潤社, 1998）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、既知のネオザンチン開裂酵素遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号：１、５、９、１１、１３、または１５などの配列）もしくはその一部をプローブとして、またこれらの配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、任意の植物からネオザンチン開裂酵素遺伝子をコードするDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうるネオザンチン開裂酵素をコードするDNAもまた本発明のストレス耐性を上昇させるために用いるDNAに含まれる。
【００１９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件を示せば、例えばプローブには、ランダムプライム法を用いて32ＰラベルしたDNAを用いる。ハイブリダイゼーション解析は、例えば文献記載の方法に従って行うことができる（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Mannual", 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）。DNAをナイロンフィルターに転写し、[32P]ラベルした断片と、例えば30％好ましくは50％ホルムアミド、6×SSC、5×Denhardt溶液、および 100μg/mlの変性サケ精子DNA中で、37℃好ましくは42℃でハイブリダイズさせる。ストリンジェントな条件における洗浄は、例えば 1×SSC、1% SDS（室温）で15分の洗浄を２回、好ましくは（よりストリンジェント） 0.5×SSC、0.5% SDS（37℃）で15分の洗浄を２回、より好ましくは（さらにストリンジェント） 0.1×SSC、0.1% SDS（60℃）15分の洗浄を２回行い、オートラジオグラフィーを行なう。「ストリンジェントな条件でハイブリダイズさせる」ことにより、上記の条件下で対象とする核酸に対して、塩基対の非共有結合的な平衡結合を特異的に生じさせることができる。
【００２０】
本発明のDNAによりコードされる蛋白質は、通常、配列番号：２、６、１０、１２、１４、または１６に記載の蛋白質とアミノ酸配列において少なくとも70％（例えば80％以上、90％以上、95％以上、または99％以上）の同一性を有する。ここで、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性（percent identity）は、KarlinおよびAltschul（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990）により構築され、KarlinおよびAltschul（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993）により改変されたアルゴリズムを用いて決定することができる。このようなアルゴリズムはAltschulら（J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990）のNBLASTおよびXBLAST等のプログラムに取り込まれている。BLASTの塩基配列の検索はNBLASTプログラム等により score = 100, wordlength = 12 で行うことができる。BLASTの蛋白質の検索はXBLASTプログラム等により score = 50, wordlength = 3 で行うことができる。２つの配列間でギャップが存在する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）により記載されたGapped BLAST等を用いることができる。BLASTやGapped BLASTを用いる場合、それぞれのプログラム（すなわちNBLASTおよびXBLAST等）のデフォルトのパラメーターを用いることができる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。
【００２１】
また、配列番号：２、６、１０、１２、１４、または１６に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入などにより改変された蛋白質をコードするDNAには、例えば、少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換により得られる蛋白質をコードするDNAが含まれる。「アミノ酸の保存的置換」とは、あるアミノ酸残基を、このアミノ酸が属する、互いにアミノ酸の側鎖の化学的性質が類似しているグループ内の別のアミノ酸に置換することを言う。類似した側鎖を持つアミノ酸残基のグループは当分野において知られている。これらのグループには、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
【００２２】
上記のようにして本発明のDNAを単離すれば、これを植物のストレス耐性の調節に用いることができる。ここで「単離されたDNA」とは、天然のDNAのいずれの構造とも同一でないか、あるいは少なくとも3つの別々の遺伝子を含む天然のゲノムDNA断片のいずれの構造とも同一でない構造を有するDNAを指す。従って、この用語は、例えば、（ａ）天然の生物のゲノムにおける天然のゲノムDNA分子の部分配列を持つDNA、（ｂ）ベクターあるいは原核生物または真核生物のゲノムDNAに導入されたDNAで、その結果生じた分子が天然のベクターまたはゲノムDNAと同一でないDNA、（ｃ）cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により産生された断片、または制限酵素切断断片などの分離された分子、ならびに（ｄ）ハイブリッド遺伝子すなわち融合蛋白質をコードする遺伝子の部分である組み換え核酸配列、などが含まれる。但し、例えばcDNAまたはゲノムDNAのライブラリーなど、（ｉ）異なるDNA分子の混合物中、（ｉｉ）異なるトランスフェクトされた細胞の混合物中、もしくは（ｉｉｉ）異なる細胞クローンの混合物中、に存在するDNA分子は単離されたDNAに含まれない。
【００２３】
これらのDNAを用いてストレス耐性を上昇させた形質転換植物体を作製する場合には、該DNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。
【００２４】
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや外的刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。また、植物の組織特異的なプロモーターを用いて、組織特異的に目的の遺伝子の発現を誘導すれば、ストレスに感受性が高い組織に特異的にストレス耐性を付与することが可能である。例えば、種子特異的な発現をするインゲンのβ-ファセオリン遺伝子（Bustos et al., EMBO J. 10:1469-1479 1991）やダイズのグリシニン遺伝子（Lelievre et al., Plant Physiol. 98:387-391, 1992）、葉特異的な発現をするエンドウのRbcS遺伝子(Lam and Chua, Science 248:471-474, 1990)やコムギのCab1遺伝子(Gotorn et al., Plant J. 3:509-518, 1993)、根特異的な発現をするタバコのTobRB7遺伝子(Yamamoto et al., Plant Cell, 3:371-382, 1991)などのプロモーターを用いることによって、目的の遺伝子を組織特異的に発現させることが可能である。また、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。例えば、乾燥や塩あるいは低温ストレスなどの環境ストレスに応答するプロモーターとしてrd29A遺伝子(Yamaguchi-Shinozaki, K. and Shinozaki, K. Plant Cell 6:251-264 1994)のプロモーターが挙げられる。また、乾燥、高塩濃度などの環境ストレスによって活性化するプロモーターも本発明において好適に用いられる。このようなプロモーターとしては、シロイヌナズナ AtNCED3 遺伝子およびカウピー CPRD65遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。さらに、薬剤によって誘導される発現システムを用いることによって、目的の遺伝子を任意の時期にかつ任意の組織に発現させることが可能である。例えば、ステロイドホルモン(グルココルチコイド)によって誘導される発現システムとしてとしてＧＶＧ遺伝子（GAL4, VP16, Glucocorticoid receptor）を利用した誘導系(Aoyama, T. and Chua, N. H. Plant J. 11:605-12,1997)が挙げられる。
【００２５】
ベクターを挿入する植物細胞としては、特に制限はないが、例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、イネ（Oriza sativa）、タバコ（Nicotiana tabacum）、トマト（Lycopersicon esculentum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、トウモロコシ（Zea mays）、ミヤコグサ（Lotus japonicus）等が挙げられる。またその他の農作物や樹木等に対しても有用である。植物は針葉樹、広葉樹、双子葉植物、単子葉植物などいずれでもよい。なお、ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００２６】
植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウム法、減圧浸透法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、イネおよびシロイヌナズナ等の形質転換体の作製は、文献「島本功・岡田清孝監修、モデル植物の実験プロトコール、細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ４、秀潤社」に従って行うことができる。
【００２７】
一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００２８】
このようにして作出された形質転換植物体は、野生型植物体と比較して、ABA含量が上昇している。あるいは、これらの形質転換植物体は、野生型植物体と比較して、そのストレス耐性が上昇している。ストレス耐性は、公知の方法により比較することができる。例えば、実施例に記載されているように、乾燥、高塩、低温、または高温などのストレス条件下で植物体を栽培し、その生長を比較すればよい。例えば、見かけの状態、植物体や葉、茎、根などの組織のサイズ、重量（生重量または乾燥重量）、色、相対生長速度、または光合成活性などを指標にして比較することができる。ストレス耐性は、少なくとも植物のいずれかの組織で上昇していればよい。また、植物体のABAレベルの測定は、イムノアッセイ、薄層クロマトグラフィー（TLC）、ガスクロマトグラフィー（GC）、HPLCなどの方法が知られている（高橋信孝・増田芳雄共編、植物ホルモンハンドブック(下)、pp.1-21、培風館; およびそこに引用されている文献を参照のこと）。例えば実施例７に記載されたように、ラベル化したABAを内部標準に用い、HPLCを用いた粗精製画分を最終的にGC・MSで定量することにより、信頼性の高い定量が可能である。
【００２９】
本発明により、乾燥地帯、寒冷地、高塩濃度などの環境ストレスに曝されている地域でも有用作物の栽培が可能となる。また、作物以外の植物に適用して、環境緑化に応用することも可能である。
【００３０】
また、本発明は、ストレス耐性を低下させるために用いる、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現を低下させることができるDNAに関する。該DNAは、ストレス耐性を低下させるための試薬（ストレス耐性低下剤）ともなる。また本発明は、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現を低下させることができるDNAのストレス耐性を低下させるための使用を提供する。
【００３１】
ストレス耐性が低下した植物は、雑草などに適用して環境から排除するために有用である。例えば、ストレス耐性の低下を誘導できるような植物を作製して、土地改良などに応用することができる。雑草のような生殖能力の高い植物品種に、化学物質（例えばグルココルチコイドなど）で誘導されるプロモーター下流にネオザンチン開裂酵素遺伝子の発現を抑制（例えばアンチセンス方向）するようなコンストラクトを導入する。この形質転換植物は化学物質が加えられなければ正常に生育するため、荒れ果てた土地において数年間その雑草を育てることによって土地を改良させることができる。その後、グルココルチコイドを散布することによって特異的に雑草のストレス耐性を低下させ、一網打尽に雑草を排除する。そして、栽培作物を作付けする。栽培作物は、ネオザンチン開裂酵素を過剰に発現する形質転換作物（センス方向に導入した植物）などを作付けすることができる。
【００３２】
本発明者らは、ネオザンチン開裂酵素遺伝子のアンチセンスRNAを発現する遺伝子構築物を用いて、ネオザンチン開裂酵素の発現を人為的に抑制した形質転換植物を初めて作出することに成功した。この植物体は、無潅水条件で野生型に比べ有意に枯れやすく、ストレス耐性が低下していることが判明した（図１５、１６）。このように、本発明者らは、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現を人為的に抑制する方法を確立し、これにより植物体のストレス耐性を低下させることに成功した。
【００３３】
本発明において、植物のストレス耐性を低下させるには、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現を低下させればよい。ここで遺伝子の発現には、遺伝子の転写および転写産物の翻訳が含まれる。また、発現の抑制には発現の完全な停止も含まれる。ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写や翻訳を抑制するには、該遺伝子をコードするDNA、その転写調節領域、または該遺伝子の転写産物を標的として、該遺伝子の発現を抑制すればよい。
【００３４】
本発明を適用する植物としては特に制限はなく、様々な植物を用いることができる。例えばシロイヌナズナなどが用いられる。また、発現を抑制する標的となりうるネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、例えば、トウモロコシ（Zea mays）であればVP14（Schwartz, S.H. et al., Science. 276: 1872-1874, 1997; Tan, B.V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12235-12240, 1997）（cDNA：配列番号１３、蛋白質：配列番号：１４）、トマト（Lycopersicon esculentum）であればLeNCED1（Burbidge, A. et al., J. Exp. Bot., 47: 2111-2112, 1997；Burbidge, A. et al., Plant J., 17:427-431, 1999）（cDNA：配列番号１５、蛋白質：配列番号：１６）、シロイヌナズナであれば、AtNCED1（cDNA：配列番号：１、蛋白質：配列番号：２）、AtNCED3（cDNA：配列番号：５、蛋白質：配列番号：６）、および/またはAtNCED5（cDNA：配列番号：９、蛋白質：配列番号：１０）、カウピーであればCPRD65（cDNA：配列番号１１、蛋白質：配列番号：１２）等が挙げられる。他の植物由来のホモログ遺伝子も標的となりうる。他の植物のホモログ遺伝子は、例えば上記したハイブリダイゼーション等により同定・単離することが可能である。なお、本発明においてある植物のストレス耐性を低下させるために、他種植物の遺伝子または遺伝子配列情報（例えば上記の遺伝子）を利用して、ジーンサイレンシング法やアンチセンス法のような周知の方法を用いて、目的とする植物の標的遺伝子の発現を抑制することも可能である。従って、目的とする植物が有する標的遺伝子は、必ずしも単離または同定されていなくてもよい。
【００３５】
本発明におけるネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現の抑制は、該遺伝子の発現を抑制するためのDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることにより行うことができる。プロモーターとしては特に制限はなく、例えば上記のストレス耐性を上昇させる場合と同様のプロモーターを用いることができる。例えば、発現誘導型のプロモーターを用いれば、特定の条件でのみストレス耐性を低下させることができる。
【００３６】
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。
アンチセンス法とは、ある遺伝子から転写されたRNAに相補的なDNA分子（アンチセンス核酸）を用いて標的mRNAと二重鎖を形成させ、その発現を抑制しようとする人為的遺伝子発現制御法である。アンチセンスによる遺伝子発現制御法は1960年から1970年に見出され、1978年にはZamecnikらがアンチセンスオリゴマーを用いてニワトリ・ラウス肉腫ウイルスの複製および逆転写酵素の活性阻害を行うことに成功している(Zamecnik,P.C. and Stephenson,M.L. 1978, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 75, 280-284)。
【００３７】
アンチセンスDNAを導入する方法には、アンチセンスオリゴマーを直接細胞内に投与する方法や発現ベクターに標的遺伝子のアンチセンスDNAをつないで形質転換を行う方法があり、後述する実施例では後者を用いた例を記載している。具体的には、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターの下流にネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のcDNAをアンチセンス方向につないで植物細胞に導入する。植物細胞におけるアンチセンス効果は、Eckerらが一時的遺伝子発現法を用いて電気穿孔法により導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証された(Ecker,J.R. and Davis,R.W., Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 83:5372, 1986)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を抑制する例が報告されており(van der Krol,A.R. et al., Nature, 333:866, 1988)、現在では植物における遺伝子発現抑制の手段としてアンチセンス法は確立した技術である。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼにより局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進行しつつあるRNAとのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現制御などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実験講座２核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人, pp.319-347, 1993）。
【００３８】
アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする内在性遺伝子の転写産物またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
【００３９】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。近年、リボザイムをコードするDNAを利用して遺伝子の発現抑制を行う研究がなされている。リボザイムとは生体内の反応を触媒する活性を持つRNAである。リボザイムには様々な活性を有するものがあるが、とりわけRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きなものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠・大塚栄子,蛋白質核酸酵素, 35:2191, 1990）。
【００４０】
たとえば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が9位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCのほかにAまたはUでも切断されることが示されている(Koizumi, M. et al., FEBS Lett. 228:225, 1988）。リボザイムの基質結合部位を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的な切断リボザイムを作ることが可能である(Koizumi, M. et al., FEBS Lett., 239:285, 1988；小泉誠・大塚栄子, 蛋白質核酸酵素, 35：2191, 1990；Koizumi, M. et al., Nucleic Acids Res., 17:7059, 1989）。例えば、アラビドプシスのAtNCED3遺伝子のコード領域には、このような部位が数百箇所存在する。また、ヘアピン型リボザイムは、たとえばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(Buzayan, J. M., Nature 323:349, 1986）。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Kikuchi, Y. and Sasaki, N., Nucleic Acids Res. 19:6751, 1992；菊池洋, 化学と生物, 30:112, 1992）。
【００４１】
標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されているとリボザイムの活性が消失する可能性がある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側にトリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である(Taira,K. et al., Protein Eng. 3:733, 1990；Dzianott, A. M. and Bujarski, J. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:4823, 1989；Grosshans, C. A. and Cech, R. T., Nucleic Acids Res., 19:3875, 1991; Taira, K. et al., Nucleic Acids Res. 19:5125, 1991)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(Yuyama, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186:1271, 1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を切断し、当該遺伝子の発現を抑制することが可能である。リボザイムは、標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断することが好ましい。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００４２】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr. Biol. 7: R793, 1997, Curr. Biol. 6:810, 1996)。例えば、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現が共抑制された植物体を得るためには、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体からネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現が低下した形質を有する植物を選択すればよい。
共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、通常、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上の配列の同一性を有する。同一性または相補性を決定するために遺伝子情報処理ソフトウェアであるGenetyx(ソフトウェア開発株式会社)を用いることができる。このプログラムはLipman-Pearson法（Lipman, D.J. and Pearson, W. R. 1985, Science 227:1435-1441）を採用している。この方法は、まず配列データを比較し、相同性の高い配列データーについて、配列の欠落(GAP)を考慮し相同性を算出する。
【００４３】
本発明で利用される、遺伝子の発現を抑制する機能を有する上記のようなDNAを利用してストレス耐性が低下した形質転換植物体を作製する場合には、該DNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。用いられるベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば、上記のストレス耐性を上昇させる場合と同様に特に制限はない。ベクターを挿入する植物細胞としても特に制限はない。植物は針葉樹、広葉樹、双子葉植物、単子葉植物などいずれでもよい。なお、ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００４４】
植物細胞へのベクターの導入、および形質転換植物細胞からの植物体の再生は、上記のストレス耐性を上昇させる場合と同様、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００４５】
このようにして作出された形質転換植物体は、野生型植物体と比較して、ABA含量が低下している。あるいは、これらの形質転換植物体は、野生型植物体と比較して、そのストレス耐性が低下している。このような植物は、例えば雑草などに適用して、効果的な除草を行うことができる。また、上記のように誘導性のプロモーターを利用することで、本発明の形質転換植物体を土地改良などに利用することが可能である。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本実施例において汎用した実験条件を以下に示す。
・カウピーの生育
カウピーの種（Vigna unguiculata IT84S-2246-4）を鉢に播き、温室で８日間、16時間明期（自然光に加え照度不足時は人工灯による補光）、25℃の条件下で、適度に水を撒きながら生育させた。
・乾燥処理
乾燥処理は、植物体を傷つけないように鉢から引き出し、計量後、室温、湿度約60％、弱光（300 lux）の条件下 Whatman 3MM 濾紙上に置くことで行った。コントロールでは、植物を鉢から取り出し、すぐによく水を含んだ土に戻して乾燥処理群と同じ条件下で維持した。
・DNA配列分析
自動プラスミド単離システム Model PI-100（KURABO）を用いてプラスミドDNAの鋳型を調製し、DNAシークエンサー Model 373A（ABI）で配列を決定した。塩基配列およびアミノ酸配列は GeneWorks ソフトウェアシステム（IntelliGenetics, Inc.）、Sequencher 3.0（Hitachi Software）およびウィスコンシン大学 Genetic Computer Group（GCG）プログラムを用いて解析した。
【００４７】
[実施例１] 乾燥処理により誘導される遺伝子のcDNAクローンの単離
８日間生育させたカウピーに10時間乾燥ストレスを与えた後単離したポリA+ RNAを用いてcDNAライブラリーを作製した。
まず、乾燥処理植物からのcDNAライブラリーの調製を以下にようにして行った。植物体全体を回収し、根から土を穏やかに洗い落とした後、室温、湿度約60％、弱光条件下 Whatman 3MM 濾紙上に10時間置くことで乾燥処理を行った。乾燥処理を施した植物から全RNAを以前記載されていた方法で調製した（Nagy, F. et al., "Analysis of gene expression in transgenic plants". In Gelvin and Schilperoort (eds), "Plant Molecular Biology Manual, B4"., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp.1-29, 1988）。文献（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Mannual", 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）に従って、全RNAをオリゴdTセルロースカラムに２回通してポリA+ RNA を調製した。カラムにアプライしたRNAの約2％がポリA+ RNA分画として回収された。ポリA+ RNAからcDNA Synthesis System Plus（Amersham Pharmascia Biotech）を用いて２本鎖cDNAを合成した。cDNA Cloning System（Amersham Pharmascia Biotech）を用いてcDNAからcDNAライブラリーを作製した。
【００４８】
ストレスを与えていないカウピーから単離したポリA+ RNAから調製したcDNAと、10時間乾燥ストレスを与えた植物から単離したポリA+ RNAから調製したcDNAとを用いて、上記のcDNAライブラリーのディファレンシャルスクリーニングを行った。文献（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Mannual", 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）に従って、プラークハイブリダイゼーションを行い、cDNAライブラリーから 1×104 プラークをスクリーニングした。
【００４９】
その結果、10時間乾燥ストレスを与えたカウピー由来の [32P]ラベルしたcDNAでより強いハイブリダイズシグナルが得られるプラークを得た。ファージクローンから in vivo でプラスミドを切り出し、大腸菌に形質転換した。得られたプラスミドは、制限酵素地図と各cDNA断片の境界部の配列により解析した。この解析によるcDNAをグループ分けを通して、CPRD（CowPea Responsive to Dehydration）65と名付けたcDNAクローンを同定することができた。
【００５０】
CPRD65クローンに対応する遺伝子の発現が乾燥処理により誘導されるかを、ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより解析した。８日目の植物体を土から引き出し、最大12時間までの様々な時間乾燥処理した。コントロールとして、同様のカウピーをいったん土から引き出し、すぐによく水を含む土に植え戻した。乾燥処理植物とコントロール植物から全RNAを単離し、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを行った。
【００５１】
全RNAをNagyらの方法（Nagy, F. et al., "Analysis of gene expression in transgenic plants". In Gelvin and Schilperoort (eds), "Plant Molecular Biology Manual, B4"., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp.1-29, 1988）に従って単離し、ホルムアルデヒドを含む 1％アガロースゲルで分離しナイロンフィルターに転写した（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Mannual", 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）。ナイロンフィルターは [32P]ラベルしたCPRD65 cDNA断片と 50% ホルムアミド、5×SSC、25mM リン酸ナトリウムバッファー（pH6.5）、10×Denhardt溶液、および 250μg/mlの変性サケ精子DNA中で42℃でハイブリダイズさせた。0.1×SSC、0.1% SDSで60℃で15分の洗浄を２回行い、オートラジオグラフィーを行った。
【００５２】
図１は、CPRD65遺伝子の乾燥処理に対する発現誘導のタイムコースを表す。CPRD65の発現は、乾燥ストレスにより有意に上昇することが判明した。CPRD65に対応するmRNAは乾燥処理を始めて２時間以内に蓄積が認められた。
【００５３】
10時間乾燥処理したカウピーは萎れたが、これらの萎れた植物をよく水をやった土に戻す（再吸水処理）と４時間以内に萎れから回復した。再吸水処理に伴って、CPRD65 mRNA のレベルは減少した（図１）。CPRD65遺伝子は、乾燥処理により転写が誘導され、再吸水処理により減少するという、乾燥ストレスに対する典型的かつ有意な応答を示した。このことから、CPRD65遺伝子は乾燥耐性に関与していることが示唆された。
【００５４】
[実施例２] CPRD65 cDNA のシークエンス解析
実施例１で単離されたCPRD65 cDNA断片は全長ではない可能性が考えられたため、CPRD65の部分cDNAをプローブにして同じcDNAライブラリーを再度スクリーニングして全長cDNA（配列番号：１１）を単離した。CPRD65の全長cDNAクローンがコードするアミノ酸配列（配列番号：１２）を図２に示す。全長CPRD65 cDNAは2432bpからなり、125bpの5'-flanking region（5'-隣接領域）と486bpの3'-flanking region（3'-隣接領域）を有する。3'-flanking regionには、ポリアデニレーションコンセンサス配列（AATAAA）が１つ見出された。この配列は、612アミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを持っており、予想される蛋白質の分子量は67.6kDaと計算された。CPRD65蛋白質の予想されるアミノ酸配列を蛋白質データベースと比較したところ、図２に示すように、トウモロコシ（Zea mays）のVP14（61％）（Schwartz, S.H. et al., Science. 276: 1872-1874, 1997）およびトマト（Lycopersicon esculentum）のネオザンチン開裂酵素（69％）（Burbidge, A. et al., J. Exp. Bot., 47: 2111-2112, 1997; Burbidge, A. et al., Plant J., 17:427-431, 1999）と高いホモロジーを有することが判明した。VP14蛋白質と同様、予想されるCPRD65蛋白質はＮ末領域にトランジットポリペプチドを有していると思われた。CPRD65、VP14、およびトマトのネオザンチン開裂酵素のＮ末の配列の類似性は低いが、構造的な類似性を有している。
【００５５】
[実施例３] CPRD65遺伝子のゲノムサザンブロット解析
カウピーのCPRD65関連遺伝子を解析するため、ゲノムサザンブロットハイブリダイゼーションを２つのストリンジェンシーの条件で行った（図３）。
【００５６】
ゲノムサザン解析は文献記載の方法に従った（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Mannual", 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）。10μgのゲノムDNAを制限酵素で切断し、1％アガロースゲルで分離後ナイロンフィルターに転写した。フィルターは [32P]ラベルした断片と 30% ホルムアミド、6×SSC、5×Denhardt溶液、および 100μg/mlの変性サケ精子DNA中で42℃でハイブリダイズさせた。0.1×SSC、0.1% SDSで60℃で15分の洗浄を２回（Ｂ）、または 0.5×SSC、0.5% SDSで37℃で15分の洗浄を２回（Ａ）を行い、オートラジオグラフィーを行った。
【００５７】
CPRD65 cDNA は、その塩基配列から、内部にEcoRIとXbaIの制限酵素部位がなく、HindIIIの制限酵素部位が近接した２箇所に確認される。CPRD65 cDNAをプローブに使ったハイブリダイゼーションの結果、EcoRIまたはXbaIの切断に対し１本のバンドが、HindIII切断に対し２本のバンドが検出された。上記（Ａ）のストリンジェンシー条件では、さらに薄いバンドが何本か検出された。これらの結果は、CPRD65遺伝子は、関連遺伝子と共に小さな遺伝子ファミリーを形成していることを示唆している。
【００５８】
[実施例４] CPRD65遺伝子のノーザンブロット解析
様々な環境ストレスがCPRD65の発現に及ぼす影響を調べた。高塩、ABA、および水処理は、乾燥処理と同様に植物を土から引き出し、水耕法により、それぞれ、250mM NaCl、100μM ABA、および脱イオン水を含む溶液で生育させた。高温および低温ストレス処理は、鉢植した植物をそれぞれ、40℃および4℃のインキュベーターに移して行った。それぞれの場合で、植物のストレス処理は 0、1、2、5、10、および24時間行った。処理終了後、速やかに処理した植物を液体窒素中で凍結させた後、RNAを単離しノーザンブロット解析を行った。
その結果、この遺伝子の発現は高塩濃度条件において強く誘導されるが、低温または高温ストレスによっては誘導されないことが判明した（図４A）。CPRD65遺伝子の誘導は、ABA処理や水処理によっては検出されなかった。
【００５９】
乾燥ストレスによるCPRD65遺伝子発現に組織特異性が存在するかを調べるため、標準条件と乾燥条件下で葉、茎、または根から全RNAを調製し、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを行った（図４B）。乾燥処理により、CPRD65遺伝子の転写産物は茎と葉で強く誘導されたが、根での誘導量は顕著ではなかった。
【００６０】
[実施例５] バクテリアで発現させたCPRD65蛋白質の酵素活性
CPRD65遺伝子から予想されるアミノ酸配列は、トウモロコシのVP14遺伝子がコードするネオザンチン開裂酵素のアミノ酸配列と高いホモロジーを有している（図２）。CPRD65遺伝子がネオザンチン開裂酵素をコードしているのかを調べるため、大腸菌で発現させた組換えCPRD65蛋白質の生化学的特性を分析した。CPRD65のコード領域のDNA断片をPCRで増幅し、pGEX4T-1（Pharmacia）のGST遺伝子に in frame で融合させ、キメラプラスミド pGST-CPRD65 を下記のように構築した。
【００６１】
CPRD65蛋白質をコードするDNAを、プライマー 5'-ATTGAATTCATGCCTTCAGCTTCAAAC-3'（配列番号：１９）および 5'-ATTGGATCCCAAAAGCTACACGCTGGTCCCC-3'（配列番号：２０）を用いてPCRにより増幅した。得られたPCR断片をpBluescript II SK+ ベクターのEcoRV部位に挿入した。PCRによりDNA配列に変異が生じていないか挿入したPCR断片の塩基配列を確認した。塩基配列に変異の認められないPCR断片をpBluescript II SK+ ベクターから制限酵素（EcoRI、XhoI）を用いてDNA断片として単離し、このDNA断片を pGEX4T-1（Amersham Pharmacia Biotech）のEcoRI、XhoI部位に挿入し、pGST-CPRD65を構築した。大腸菌 JM109 を pGST-CPRD65 または pGEX4T-1 で形質転換し、L培地で37℃で培養した。OD600 が約0.5になったところでイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG)を加え、さらに17℃で12時間培養を続けた。細胞を回収し、洗浄した後、抽出バッファー [10mM Tris-HCl (pH8.0), 5mM MgCl2, 5% glycerol, 0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), および 0.1mM dithiothreitol (DTT)] に懸濁した。融合蛋白質の精製とトロンビン切断の方法は、GST遺伝子融合システム（Amersham Pharmacia Biotech）の説明書に従った。蛋白質濃度はプロテインアッセイキット（Bio-Rad）を使って決定した。
【００６２】
上記のように大腸菌で GST-CPRD65 融合蛋白質を過剰発現させ、粗細胞抽出物からグルタチオンセファロース4Bを用いて蛋白質を精製した。この精製GST-CPRD65組換え蛋白質が、シス-ネオザンチン（cis-neoxanthin）、トランス-ビオラザンチン（trans-violaxanthin）、およびシス-ビオラザンチン（cis-violaxanthin）を切断し、ザントキシンを生成するかを調べた。
【００６３】
ネオザンチン開裂酵素活性のアッセイ方法は以前記載されている方法に従った（Schwartz, S.H. et al., Science. 276: 1872-1874, 1997）。シス-ネオザンチンとトランス-ビオラザンチンはホウレンソウ葉より調製した。シス-ビオラザンチンはオレンジの皮から調製した。反応液（100μl）は 100mM Bis-Tris (pH6.7), 0.05% Triton X-100, 10mM アスコルビン酸, 5mM FeSO4, および 蛋白質試料を含む。室温で１時間反応させた。反応後、水 1ml を加え、n-ヘキサン（1ml×2）、次に酢酸エチル（1ml×2）で抽出した。n-ヘキサン画分を濃縮し、Nucleosil 5 C18 (150mm長, 内径8mm)カラムによりHPLC分析を行った。カラムは、溶媒A（85% エタノール）と溶媒B（クロロホルム:メタノール=1:1）のリニアグラディエントで、流速 1.5ml/min で溶出させた。溶媒Bの濃度を25分かけて10％から50％に増加させ、5分間50％に維持した。溶出液はUV検出器で440nmの吸収をモニターした。酢酸エチル画分を、Nucleosil 5 C18 (150mm長, 内径8mm)カラムを用いたHPLCにより精製した。カラムは、50％の水メタノールで流速 1.5ml/min で溶出させ、UV検出器で260nmの吸収をモニターした。ザントキシン（xanthoxin）画分を集め、GC-MS分析を行った。各段階ではできる限り試料に光が当たらないようにした。
【００６４】
GC-MS分析は以下のようにして行った。5890ガスクロマトグラフ（Hewlett Packard）を装備したAUTOMASSマススペクトロメーター（日本電子）を分析に用いた。分析条件を以下に示す。イオン化, EI 70eV; カラム, DB-5 (15m長; 内径0.25mm; フィルム厚 0.25μm; J&W Scientific); キャリアガス, He (1ml min-1), 注入温度, 250℃; 伝達経路温度, 250℃; 初期加熱温度, 80℃。注入1分後に開始し、加熱温度を 30℃ min-1 の速度で200℃まで増加させ、さらに 5℃ min-1 の速度で230℃まで増加させた。
【００６５】
図５に示したように、HPLC分析によって、GST-CPRD65蛋白質とシス-ネオザンチンの混合反応により、予想されるC25産物とザントキシンが検出された。ザントキシンの生成は、GC-MS分析でザントキシンに特徴的なイオンを観察することによって確認した。イオンとそれらの相対強度を以下に示す：m/z 250 (4), 168 (32), 149 (77), 107 (61), および 95 (100)。ザントキシンおよびC25産物は、トランス-ビオラザンチンでは生成しなかった（データ省略）。トロンビンによりGST-CPRD65組換え蛋白質をGST部分とCPRD65部分に分離しても、これらの結果は変わらなかった。
【００６６】
[実施例６] CPRD65蛋白質のＮ末領域がシロイヌナズナから調製したプロトプラスト中でトランジットペプチドとして機能するかの解析
CPRD65蛋白質のＮ末領域は、葉緑体へのターゲティングに関与するトランジットペプチドの典型的な構造的特徴を有している。CPRD65蛋白質のこの構造的特徴から、CPRD65蛋白質は葉緑体を含む色素体に局在することが示唆される。このＮ末領域がトランジットペプチドとしての役割を有するかを調べるため、CaMV 35Sプロモーターおよびクラゲ（Aequorea victoria）の合成緑色蛍光蛋白質（sGFP）（Chiu, W. et al., Curr. Biol., 6: 325-330, 1996）遺伝子の間にCPRD65蛋白質のＮ末領域（1-148）がコードされた構造を有する 35S::CPRD65N-sGFP キメラ遺伝子を構築した。
【００６７】
CPRD65蛋白質のＮ末端ペプチド（1-148アミノ酸）に対応するDNAを、プライマー 5'-ATATATCTAGAATGCCTTCATCAGCTTCAAACACTTGG-3'（配列番号：２１）および 5'-ATATAGGATCCCTCCGGCACCGGCGCGAAGTTCCCG-3'（配列番号：２２）を用いたPCRにより増幅した。PCR断片を pBluescript II SK+ ベクターに挿入し、PCRによる配列の変異がないことを確認した。一過的発現ベクター（Chiu, W. et al., Curr. Biol., 6: 325-330, 1996）の35SプロモーターとsGFP遺伝子の間にDNA断片を挿入した。調製方法、DNAトランスフェクション、およびシロイヌナズナプロトプラストのインキュベーションは、以前記載されたように行った（Abel, S. and Theologis, A., Plant J., 5: 421-427, 1994）。
【００６８】
35S::CPRD65N-sGFP 融合構築物およびそのコントロール構築物（35S::sGFP）を、DNAトランスフェクション法によりシロイヌナズナから調製したプロトプラストへ導入した（Abel, S. and Theologis, A., Plant J., 5: 421-427, 1994）。形質転換２〜４日後に蛍光顕微鏡でプロトプラストを観察した。図６に示したように、35S::CPRD65N-sGFPをプロトプラストで一過的に発現させた場合、その蛍光は色素体に局在していた。一方、35S::sGFP構築物を導入した場合は、蛍光は色素体ではなく、主に細胞質に検出された。これらの結果は、CPRD65蛋白質のＮ末端領域はCPRD65蛋白質を色素体にターゲティングするトランジットペプチドとして機能することを示唆している。CPRD65蛋白質は色素体に局在し、色素体中でABAを産生するために機能していると予想される。
【００６９】
[実施例７] 生育８日目のカウピーの乾燥ストレスによるABAの蓄積
生育８日目のカウピーに乾燥ストレスを与え、内生ABAレベルの蓄積を測定した。
試料を液体窒素中でホモジナイズし、水-メタノール（20-80％）で2回抽出した。[2H3]ABA を加えた後、抽出物を濃縮し、標準的な溶媒分画を行い酢酸エチル可溶酸性画分を得た。Bond Elut カートリッジ（C18 およびDEA, Varian）を用いて以前記載された方法に従って精製を行った（Wijayanti, L. et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1533-1535, 1995）。乾燥させていない植物から精製した試料は Senshu Pak ODS-2101-N カラム（100mm長, 内径6mm）（Senshu Scientific Co.）を用いてHPLC分析を行った。分析条件は以前に記載さたものと同様にした（Wijayanti, L. et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1533-1535, 1995）。精製された試料は、エーテル含有ジアゾメタンでメチル化し、GC-SIM分析を行った。
【００７０】
図７に示すように、乾燥処理２時間以内にABAの蓄積が始まった。10時間乾燥処理した植物のABAレベルはストレスを与えないコントロール植物に比べ140倍に高まった。CPRD65 mRNA の蓄積のタイミングはABA mRNA の蓄積のタイミングよりも早かった（図７）。
【００７１】
CPRD65遺伝子の発現は乾燥ストレスにより葉および茎で強く誘導されたが、根での誘導は僅かであった（図４B）。乾燥ストレス下でのCPRD65の発現と内生ABAの蓄積との関係を調べた。生育８日目のカウピーを葉、茎、および根に分け、それぞれを乾燥処理した。これらの器官の内生ABAレベルを、乾燥処理の前後で測定した。図８に示したように、内生ABA量は乾燥ストレスにより、葉および茎で劇的に蓄積が認められたが、根では僅かしか蓄積しなかった。図４Bおよび８に示したように、乾燥ストレスにおけるABAの組織特異的な蓄積パターンは、CPRD65遺伝子の発現パターンと一致していた。
【００７２】
[実施例８] カウピー葉のザントフィル（xanthophyll）分析
CPRD65蛋白質の基質を検索するため、カウピー葉のザントフィルを分析した。
試料をアセトンで２回抽出し、濃縮した後、80％メタノール（1ml）に溶解し、Bond Elut C18 カラムにロードした。80％メタノール4mlを加えてカラムを洗浄し、5mlのメタノール-水-クロロホルム（71:9:20）でザントフィルを溶出した。溶出液を濃縮し、Nucleosil 5 C18 と Senshu Pak Silica-2551-S (250mm長, 内径6mm)のカラムを用いてHPLC分析を行った。ODS-HPLCの条件は上記と同一である。シリカHPLCでは、流速は 1.5ml/min とし、溶媒Aは酢酸エチル-n-ヘキサン（1:1）、溶媒Bは酢酸エチルを用いて、溶媒Bを30分かけて10％から100％までリニアに勾配をつけた。可視光とUVのスペクトル分析によりザントフィルを同定した。
【００７３】
可視光とUVの光学スペクトル分析により、トランス-ネオザンチン、トランス-ビオラザンチン、シス-ネオザンチンがカウピー葉の主要なザントフィルとして、シス-ビオラザンチンが微量成分として検出された（データ省略）。トランス-ネオザンチン、トランス-ビオラザンチンおよびシス-ネオザンチンの内生量は、正常生育条件と乾燥条件下において大きな変化は認められなかった。
【００７４】
以上のように、カウピーの乾燥誘導性遺伝子 CPRD65 はネオザンチン開裂酵素をコードしており、その産物は色素体に局在していることが判明した。CPRD65遺伝子は、乾燥や高塩条件下において、主に葉と茎で強く誘導される。乾燥条件では、葉と茎にABAが高度に蓄積され、それはCPRD65遺伝子の発現と同様のパターンを示す。これらの結果は、CPRD65蛋白質が、カウピーの乾燥ストレスにおけるABA生合成に主に関与する酵素であることを強く示唆している。
【００７５】
[実施例９] ネオザンチン開裂酵素遺伝子のホモログをコードするアラビドプシスcDNAクローンの単離
CPRD65をプローブにして、アラビドプシスのcDNAライブラリー（Abe, H. et al., Plant Cell, 9:1859-1868, 1997）をスクリーニングした。その結果、強いハイブリダイゼーションシグナルを示す多数のプラークが得られた。これらのプラークからファージクローンを単離し、制限酵素でcDNA領域を切り出して pBluscript SK+ 中に挿入し、大腸菌を形質転換した。DNA配列の解析により、これらのクローンは１つのグループに分類された。これをAtNCED3と名付けた。AtNCED3はネオザンチン開裂酵素をコードするCPRD65と有意な相同性を示した（図９）。AtNCED3 cDNAの塩基配列を配列番号：５に、AtNCED3蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。
【００７６】
[実施例１０] AtNCED1, 2, 4, 5 の単離及び系統樹解析
CPRD65 及び AtNCED3 の塩基配列を用いてDNAデータベースを検索した結果、高い相同性が認められた配列を４個見出した（Ac. No. AL021713, AL021687, AJ005813, AB028621）。
AL021713の配列上に存在する相同性の高い遺伝子を単離するために、gDNAを鋳型にPCR法（プライマー5'-CCCGGGATCCCTCAAGCCTCTCTATACCG-3'／配列番号：２３、5'-CCCGGGATCCTTTATACGGATTCTGAGGGAG-3'／配列番号：２４）で目的遺伝子断片を増幅した。その断片をプローブとしてgDNAライブラリー（クローンテック社）から目的遺伝子を含むクローンを単離し再度PCR法（プライマー5'-CCCGGGATCCCTCAAGCCTCTCTATACCG-3'／配列番号：２３、5'-CCCGGGATCCTTTATACGGATTCTGAGGGAG-3'／配列番号：２４）で遺伝子を増幅しpBluescript II SK+（Stratagene）のEcoRVサイトにクローニングしDNA塩基配列を決定した。この遺伝子をAtNCED1とした。AtNCED1 cDNAの塩基配列を配列番号：１に、AtNCED1蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００７７】
AL021687の配列上に存在する相同性の高い遺伝子を単離するためにgDNAを鋳型にPCR法（プライマー5'-ATTGAATTCATGGACTCTGTTTCTTCTTCTTCC-3'／配列番号：２５、5'-ATTGAATTCTTAAAGCTTATTAAGGTCACTTTCC-3'／配列番号：２６）で目的遺伝子断片を増幅した。その断片をプローブとしてgDNAライブラリーから目的遺伝子を含むクローンを単離し再度PCR法（プライマー5'-ATTGAATTCATGGACTCTGTTTCTTCTTCTTCC-3'／配列番号：２５、5'-ATTGAATTCTTAAAGCTTATTAAGGTCACTTTCC-3'／配列番号：２６）で遺伝子を増幅しpBluescript II SK+（Stratagene）のEcoRVサイトにクローニングしDNA塩基配列を決定した。この遺伝子をAtNCED2とした。AtNCED2 cDNAの塩基配列を配列番号：３に、AtNCED2蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
【００７８】
AJ005813の配列上に存在する相同性の高い遺伝子を単離するためにgDNAを鋳型にPCR法（プライマー5'-AAGAATTCATGGCGGAGAAACTCAGTGATGGCAGC-3'／配列番号：２７、5'-AAAAGAATTCGGCTTATATAAGAGTTTGTTCCTGG-3'／配列番号：２８）で目的遺伝子断片を増幅した。その断片をプローブとしてcDNAライブラリーから目的遺伝子を含むクローンを単離し再度PCR法（プライマー5'-AAGAATTCATGGCGGAGAAACTCAGTGATGGCAGC-3'／配列番号：２７、5'-AAAAGAATTCGGCTTATATAAGAGTTTGTTCCTGG-3'／配列番号：２８）で遺伝子を増幅しpBluescript II SK+ （Stratagene）のEcoRVサイトにクローニングしDNA塩基配列を決定した。この遺伝子をAtNCED4とした。AtNCED4 cDNAの塩基配列を配列番号：７に、AtNCED4蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：８に示す。
【００７９】
AB028621の配列上に存在する相同性の高い遺伝子を単離するためにP1クローンMUJ8のDNAを単離しPCR法（5'-CGGGATCCATGCAACACTCTCTTCGTTCTGATCTTCTTC-3'／配列番号：２９、5'-CGGGATCCTCAGAAAACTTGTTCCTTCAACTGATTCTCGC-3'／配列番号：３０）で遺伝子を増幅しpBluescript II SK+（Stratagene）のEcoRVサイトにクローニングしDNA塩基配列を決定した。この遺伝子をAtNCED5とした。AtNCED5 cDNAの塩基配列を配列番号：９に、AtNCED5蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。
【００８０】
AtNCED1〜5のアミノ酸配列のアライメントを図１０に示す。各配列から予想されるアミノ酸配列とデータベース上にある配列の関係を調べるため系統樹解析を行った（図１１）。系統樹は、遺伝子解析ソフトである GeneWorks（Intelligenetics, Inc.）を用いて作製した。アルゴリズムはUPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean；分子進化遺伝学、根井正利著、五條堀孝、斎
藤成也共訳、培風館、p252-256）を使用した。
【００８１】
[実施例１１] AtNCED遺伝子のノーザンブロット解析
同定した各AtNCED遺伝子の発現に関して、様々な環境ストレスが及ぼす影響をノーザンブロット解析により調べた。
【００８２】
各ストレス処理には、寒天プレートにて3週間栽培した植物体を用いた。乾燥ストレスは、寒天培地から植物体を引き抜き濾紙の上で風乾させた（相対湿度50％）。塩ストレス、ABA処理、コントロールとしての水処理は、それぞれ250mM NaCl溶液、100μM ABA溶液、蒸留水を入れたシャーレに根だけが浸かるように引き抜いた植物体をシャーレの中に置きシャーレにフタをして室温にて一定時間放置した。低温ストレス及び高温ストレスは寒天プレートごとそれぞれ4℃、及び４0℃の恒温培養器に一定時間放置した。
【００８３】
上記の環境ストレス処理を行った植物体を液化窒素中で破砕し、全RNAを抽出 (Nagy, F., Kay, S. A. and Chua, N. -H. (1988) Analysis of gene expression in transgenic plants. In Gelvin and Schilperoort, eds, Plant Molecular Biology Manual, B4. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 1-29)し、1％のアガロースゲル中で1レーン当たり20μgずつ電気泳動した。電気泳動後のゲルからRNAをナイロンメンブレンに転写し、32PでラベルしたcDNAプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションをおこなった（Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.）。
【００８４】
その結果、AtNCED3 遺伝子は乾燥、高塩濃度、および低温条件で発現が強く誘導されることが判明した。高温条件では誘導は見られなかった。また、ABA処理または水処理では、AtNCED3遺伝子の発現誘導は検出されなかった（図１２）。
【００８５】
[実施例１２] バクテリアで発現させた AtNCED 蛋白質の酵素特性
AtNCED3遺伝子から予想されるアミノ酸配列は、ネオザンチン開裂酵素をコードするカウピーの CPRD65 遺伝子のものと高いホモロジーを有している（図９）。AtNCED3 遺伝子がネオザンチン開裂酵素をコードしているかを調べるため、大腸菌で発現させた組換え AtNCED3 蛋白質の生化学的な特性を解析した。
【００８６】
プライマー（5'-ATTGAATTCATGGCTTCTTTCACGGCAACGGC-3'／配列番号：３１、および5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'／配列番号：３２）を用いて、クローニングしたAtNCED3 cDNA を鋳型にAtNCED3蛋白質をコードするDNAをPCRで増幅した。得られたPCR断片をpBluescript II SK+ (Stratagene)のEcoRVサイトにクローニングした。PCRによりDNA塩基配列に変異が導入されていないかを決定した。変異の認められないDNA断片を、グルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）遺伝子を含む pGEX4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech) のEcoRIサイトにフレームが合うようにクローニングし、キメラプラスミド pGST-AtNCED3 を構築した。大腸菌JM109株を pGST-AtNCED3 または pGEX4T-1 で形質転換し、L培地中で37℃で培養した。OD600 が約0.5になったところで isopropylβ-D-thiogalactopyranoside (IPTG) を加え、17℃で12時間培養を続けた。大腸菌を回収し、洗浄後、抽出バッファー [10 mM Tris-HCl (pH8.0), 5 mM MgCl2, 5% glycerol, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), および 0.1 mM dithiothreitol (DTT)] に懸濁した。融合蛋白質の精製およびトロンビンによる切断は、glutathione-Sepharose 4B [the GST gene fusion system (Amersham Pharmacia Biotech)]を用いてその説明書に従って行った。蛋白質の濃度は protein assay kit (Bio-Rad, CA, USA) を用いて決定した。
【００８７】
ネオザンチン開裂酵素活性のアッセイを行った結果、GST-AtNCED3蛋白質とシス-ネオザンチンを含む反応液中に、予想される C25産物とザントキシンが検出されたことから、AtNCED3蛋白質はネオザンチン開裂活性を有することが確認された。同様の実験により、AtNCED1およびAtNCED5にもネオザンチン開裂活性が検出された。
【００８８】
[実施例１３] トランスジェニック体の作製
供試体としてシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ecotype Columbia）をもちいた。培養土を入れた直径9cmのプラスティック製ポットに野生型シロイヌナズナを播種し、22℃、16時間日長の条件下で6週間栽培したのち形質転換に用いた。
【００８９】
カナマイシン耐性マーカーとカリフラワーモザイクウィルスの35SプロモーターをもつpBE2113ベクター（Mitsuhara, I. et al. Plant Cell Physiol. 37：49-59 (1996)）からGUSレポーター遺伝子を無くしたベクター(pBE2113NOT）を作製し、シロイヌナズナから単離したAtNCED3のcDNAをそのBamHIサイトに正方向（センス方向）または逆方向（アンチセンス方向）につないだ。得られたベクターを三者混合法により土壌細菌（Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (pMP90)）に導入した。目的の遺伝子を導入した土壌細菌をカナマイシン（Km）耐性により選択し、減圧浸潤法（Bechtold, N. et al. C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sci. 316, 1194-1199 (1993) ）をもちいて野生型シロイヌナズナに感染させた。感染後の植物体から乾燥種子を採取し、カナマイシンを添加した寒天プレートに播種して栽培し形質転換第1世代個体（T1）を選抜した。形質転換体第1世代から得られた形質転換体第2世代（T2）の種子をカナマイシン添加プレートに播種し、カナマイシン耐性を示すものから第3世代（T3）の種子を採取した。さらに、第3世代種子を同様にカナマイシン添加プレートに播種し、すべての種子が薬剤耐性を示すものをT3ホモのラインとして以後の実験にもちいた。最終的にAtNCED3遺伝子のセンス、アンチセンス形質転換体を２系統ずつ単離した。
【００９０】
[実施例１４] 形質転換体におけるAtNCED3遺伝子の発現の評価
シロイヌナズナ野生株及びAtNCED3遺伝子のシロイヌナズナ形質転換株におけるAtNCED3遺伝子の発現をノーザンハイブリダイゼーション法で評価した。
【００９１】
形質転換体におけるAtNCED3遺伝子の発現解析には、1ヶ月栽培した植物体を用いた。乾燥ストレスは、植物体を引き抜き濾紙の上で風乾させた（相対湿度50％）。上記の環境ストレス処理を行った植物体を液化窒素中で破砕し、全RNAを抽出 (Nagy, F., Kay, S. A. and Chua, N. -H. (1988) Analysis of gene expression in transgenic plants. In Gelvin and Schilperoort, eds, Plant Molecular Biology Manual, B4. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 1-29)し、1％のアガロースゲル中で1レーン当たり20μgずつ電気泳動した。電気泳動後のゲルからRNAをナイロンメンブレンに転写し、32PでラベルしたＲＮＡプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションをおこなった（Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.）。
【００９２】
その結果、乾燥ストレスより前において、野生株では AtNCED3遺伝子の発現が認められないが、センス植物体ではすでにAtNCED3遺伝子の発現が認められた。一方、乾燥処理を行うと、野生株ではAtNCED3遺伝子の発現の乾燥誘導が認められたが、アンチセンス植物では乾燥ストレス処理を行ってもAtNCED3遺伝子の発現は認められなかった（図１３）。
【００９３】
[実施例１５] 形質転換体における内生ABA量の評価
シロイヌナズナ野生株及びAtNCED3遺伝子のシロイヌナズナ形質転換株における内生ABA量の測定をした。
【００９４】
シロイヌナズナ野生株及び形質転換体における内生ABA量は、1ヶ月栽培した植物体を用いた。試料を液体窒素中でホモジナイズし、水-メタノール（20-80％）で2回抽出した。[2H3]ABA を加えた後、抽出物を濃縮し、標準的な溶媒分画を行い酢酸エチル可溶酸性画分を得た。Bond Elut カートリッジ（C18 およびDEA, Varian）を用いて以前記載された方法に従って精製を行った（Wijayanti, L. et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1533-1535, 1995）。乾燥させていない植物から精製した試料は Senshu Pak ODS-2101-N カラム（100mm長, 内径6mm）（Senshu Scientific Co.）を用いてHPLC分析を行った。分析条件は以前に記載されたものと同様にした（Wijayanti, L. et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1533-1535, 1995）。精製された試料は、エーテル含有ジアゾメタンでメチル化し、GC-SIM分析を行った。
【００９５】
その結果、野生株に対してセンス植物体ではABA量の上昇が、アンチセンス植物体ではABA量の減少が認められた（図１４）。
【００９６】
[実施例１６] 乾燥耐性の評価結果
得られた形質転換植物の種子を、栄養塩類を含む寒天プレート（Valvekens, D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5536-5540 (1988)）に播種し上記の栽培条件下で2週間栽培して下記の実験に供した。
上記植物体を土（バーミキュウライト：パーライト＝１：１）を入れた直径9cmのプラスティック製ポットに４個体ずつ移植し、22℃、16時間日長の条件下で栽培した。播種3週間後（移植の２週間後）に植物体の入ったポットを水やりを止めることによって無潅水状態にし、自然に植物体に乾燥ストレスを与えた。無潅水処理開始14日後、17日後に写真撮影した。無潅水処理開始後14日にはAtNCED3遺伝子をアンチセンス方向に導入した植物体は枯れた（図１５）。これに対し、センス方向に導入した形質転換植物体では、萎れはほとんど見られなかった。
無潅水処理開始17日後には野性株も枯れたが、センス方向に導入した形質転換植物体は乾燥に対する有意な耐性を示した（図１６）。
【００９７】
【発明の効果】
本発明により、ストレス耐性が上昇または低下した植物を作出することが可能となった。ストレス耐性が上昇した植物は、これまで生育が不可能であった厳しい環境の土地でも生育することができる。また、ストレス耐性が低下した植物は、雑草などに応用することができる。本発明の方法を農作物に適用すれば栽培面積の拡大と収量の増大が期待できる。
【００９８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】乾燥または再吸水処理によるCPRD65遺伝子の発現のノーザンブロット解析を示す図である。生育８日目のカウピーを 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, および 12時間の乾燥処理、または、10時間乾燥処理を行った後、0, 1, 2, 5, 10, および 24時間再吸水処理し、全RNAを調製した。各レーンには、10μgの全RNAをロードした。RNAは 1％アガロースゲルで分画し、ナイロン膜にブロットした後、[32P]ラベルした CPRD65クローンのcDNAインサートをプローブにしてハイブリダイズさせた。
【図２】 CPRD65、VP14（Zea mays のネオザンチン開裂酵素, Schwartz, S.H. et al., Science. 276: 1872-1874, 1997）、および LeNCED1 蛋白質（Lycopersicon esculentum のネオザンチン開裂酵素, Burbidge, A. et al., J. Exp. Bot., 47: 2111-2112, 1997; Burbidge, A. et al., Plant J., 17:427-431, 1999）の予想アミノ酸配列の比較を示す図である。ハイフンは、アライメントを最適化するために挿入したギャップを表す。囲みは同一のアミノ酸を表す。影を付けた部分は、類似したアミノ酸を表す。
【図３】カウピー品種 2246のゲノムDNAのサザンブロット解析を示す図である。ゲノムDNA（各レーン10μg）をEcoRI(E)、HindIII(H)、およびXbaI(X)で切断し、1％アガロースゲルで分画した後、ナイロン膜に転写した。フィルターは、[32P]ラベルした CPRD65 cDNA断片とハイブリダイズさせた。「Ａ」と「Ｂ」は、それぞれストリンジェンシーの異なるハイブリダイゼーションの条件を表す（実施例参照）。DNA断片のサイズマーカーはkbpで示されている。
【図４】 (A) 高塩（NaCl）、高温、低温、およびアブシジン酸処理（ABA）によるCPRD65遺伝子の誘導のノーザンブロット解析を示す図である。処理後、図示した時間にカウピーから全RNAを単離した。各レーンには、全RNAを10μgずつロードした。各レーンの上に処理時間（時間）を示した。 (B) 10時間の乾燥処理の有無によるCPRD65遺伝子のノーザンブロット解析を示す図である。各レーンには、カウピー品種 2246の葉、茎、および根から単離した全RNAを10μgずつロードした。RNAは、1％アガロースゲルで分画し、ナイロン膜にブロットした後、[32P]ラベルした CPRD65 cDNAインサートをプローブにしてハイブリダイズさせた。
【図５】 GST（A）または GST-CPRD65 組換え蛋白質（B）のカロテノイド代謝のHPLC特性を示す図である。シス-ネオザンチンを基質として含む反応混合液を用いた。cN; シス-ネオザンチン、C25; C25産物。
【図６】 CPRD65N-sGFPキメラ蛋白質のプロトプラストにおける色素体ターゲティングを示す図である。35S-sGFP構築物（A, C, E）または 35S-CPRD65N-sGFPキメラ構築物（B, D, F）を A. thaliana から調製したプロトプラストにポリエチレングリコール（PEG）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトしたプロトプラストを光学顕微鏡（A, B）、または緑（E, F）または赤（C, D）の干渉フィルターを付けた蛍光顕微鏡で観察した。E および F は GFP、C および D は葉緑体の局在を示す。
【図７】乾燥におけるABAの蓄積とCPRD65遺伝子発現との関係を示す図である。図１のナイロンフィルター上の放射活性を定量し、図示したようにプロットした。ABAの定量方法は、実施例を参照のこと。エラーバーは標準誤差を示す。実験は３回行った。
【図８】器官毎に分離したカウピーを乾燥処理した時の内生アブシジン酸（ABA）の蓄積を示す図である。ABAの定量方法は図７（実施例７）と同様に行った。
【図９】 AtNCED3とCPRD65のアミノ酸配列を比較を示す図である。ハイフンは、アライメントを最適化するために挿入したギャップを表す。囲みは同一のアミノ酸を表す。影を付けた部分は、類似したアミノ酸を表す。
【図１０】 AtNCED1、2、3、4、および 5 のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。ハイフンは、アライメントを最適化するために挿入したギャップを表す。囲みは同一のアミノ酸を表す。影を付けた部分は、類似したアミノ酸を表す。
【図１１】 AtNCED1、2、3、4、5、および CPRD65 のアミノ酸配列とデータベース上にある関連する配列との関係を調べるため系統樹解析を行った結果を示す図である。LeNCED1はトマト由来（Ac.No. Z97215）、VP14はトウモロコシ由来（Ac.No. U95953）の蛋白質を示す。
【図１２】各種ストレスに対するAtNCED遺伝子の発現を示す図である。
【図１３】 AtNCED3の形質転換体におけるAtNCED3遺伝子の発現を示す図である。上段は乾燥処理前、下段は乾燥ストレス処理後の植物のAtNCED3遺伝子の発現を示す。AtNCED3遺伝子のセンス鎖を発現する植物体（過剰発現）（AおよびB）ならびにアンチセンス鎖を発現する植物体（発現抑制）（CおよびD）は、それぞれ２系統用いて試験を行った。
【図１４】 AtNCED3の形質転換体における内生ABA量を示す図である。野生型に比べ、AtNCED3遺伝子のセンス鎖を発現する植物体（過剰発現）（AおよびB）では内生ABA量の上昇が、アンチセンス鎖を発現する植物体（発現抑制）（CおよびD）では内生ABA量の減少が認められた。
【図１５】ネオザンチン開裂酵素トランスジェニック植物の乾燥耐性試験の結果を示す図である。潅水停止から14日後の植物とその植物の葉の相対水分量を示す。
【図１６】ネオザンチン開裂酵素トランスジェニック植物の乾燥耐性試験の結果を示す図である。潅水停止から17日後の植物を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物のストレス耐性を上昇または低下させるために用いるＤＮＡ、および該ＤＮＡのトランスジェニック植物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
植物は移動の自由を持たないため、乾燥、土壌中の塩、低温などの様々なストレスに適応しなければならない。これらのストレスの中で、乾燥は最も植物の生長に影響を与えていると考えられる。乾燥状態でも生存できるように、進化の過程で生理的・形態的に特異な形質を獲得した植物が存在する一方、他の多くの植物も乾燥ストレスに応答し、防御する機構を備えている。このような植物の渇水に対する応答と乾燥環境への適応は、渇水時の遺伝子発現の変化を含む様々な生理学的変化によりもたらされる（Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., Plant Physiol. 115: 327-334, 1997; Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., "Molecular responses to drought stress". In Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki (eds), "Molecular responses to cold, drought, heat and salt stress in higher plants", R.G. LANDES company, Austin, Texas, USA, pp.11-28, 1999）。例えばシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）では、乾燥シグナルはアブシジン酸（abscisic acid; ABA）依存的経路とABA非依存的経路により伝達され、乾燥耐性に関わる遺伝子の発現を調節していることが知られている。これらの遺伝子産物は、例えば、ショ糖やプロリンなどの適合溶質（osmoprotectants）の蓄積、蛋白質の半減期、ストレスシグナル伝達経路、転写などを調節する機能を果たしていると考えられている（Bray, E.A., Trends in Plant Science, 2: 48-54, 1997; Bohnert, H.J. et al., Plant Cell, 7: 1099-1111, 1995; Ingram, J. and Bartels, D., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 377-403, 1996; Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., Plant Physiol. 115: 327-334, 1997; Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., "Molecular responses to drought stress". In Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki (eds), "Molecular responses to cold, drought, heat and salt stress in higher plants", R.G. LANDES company, Austin, Texas, USA, pp.11-28, 1999）。
【０００３】
高等植物におけるABAの生合成経路としては、C40経路が考えられている。C40経路は別名カロチノイド経路ともよばれ、ゼアザンチン（zeaxanthin）のエポキシ化を経てビオラザンチン（violaxanthin）、ネオザンチン（neoxanthin）、ザントキシン（xanthoxin）、ABAアルデヒド、ABAへと合成される経路である（Zeevaart, J.A.D. and Creelman, R.A., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39: 439-473, 1988）。この生合成経路は、生理学的な研究やABA生合成変異株の解析から予想されたものである。例えば、タバコ（Nicotiana tabacum）から単離されたaba2変異株は、ゼアザンチンのエポキシ化を行うゼアザンチンエポキシダーゼ酵素遺伝子（aba2）に変異が入っている（Marin, E. et al., EMBO J. 15: 2331-2342, 1996）。トウモロコシから単離されたvp14変異株は、ネオザンチンからザントキシンへの変換を触媒するネオザンチン開裂酵素遺伝子（VP14）に変異が入っている（Tan, B.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12235-12240, 1997）。また、シロイヌナズナからは、ザントキシンからABAアルデヒドへの反応を触媒する酵素に変異が入ったaba3変異株、ABAアルデヒドを酸化しABAを産生する反応に関与するaba4変異株が単離されている（Schwartz, S.H. et al., 1997, Plant Physiol. 114: 161-166; Leon-Kloosterziel, K.M. et al., 1996, Plant J. 10: 655-661）。
【０００４】
ネオザンチン開裂酵素遺伝子（VP14）に変異を有するトウモロコシは、水分を失いやすく萎れやすい形質を示すことは知られているが、ネオザンチン開裂酵素遺伝子を用いて、植物のストレス耐性を向上させることができるかは知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物のストレス耐性を上昇させるために用いられるネオザンチン開裂酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを植物に導入することにより、植物のストレス耐性を上昇させる方法、および、ネオザンチン開裂酵素の遺伝子が導入されたトランスジェニック植物を提供することを課題とする。また本発明は、植物のストレス耐性を低下させるために用いられるＤＮＡ分子、該ＤＮＡを植物に導入することにより、植物のストレス耐性を低下させる方法、および、該ＤＮＡが導入されたトランスジェニック植物を提供することを課題とする。植物のストレス耐性の上昇は、植物の品種改良などの分野において有用である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、高い耐旱性を示すカウピー（Vigna unguiculata）を10時間乾燥処理して調製したcDNAライブラリーのディファレンシャルスクリーニングにより、乾燥処理に対する応答に関わる遺伝子に対応するcDNAクローン（CPRD65）を単離した。CPRD65 cDNA はアブシジン酸（ABA）の生合成に関与すると考えられているネオザンチン開裂酵素をコードしていることが予想された。生育８日目のカウピーに乾燥ストレスを与えると、ABAの蓄積とCPRD65の発現が強く誘導されたことから、CPRD65遺伝子は、特に乾燥ストレス応答に深く関与していることが予想された。GST-CPRD65融合蛋白質を用いて酵素活性を調べたところ、CPRD65は9-cis-ネオザンチンを開裂しザントキシンを産生する活性を有することが確認された。これらの結果は、CPRD65遺伝子はネオザンチン開裂酵素をコードしており、その産物は、乾燥ストレス下における内生ABAの生合成において鍵となる役割を果たしていることを示している。
【０００７】
本発明者らは、さらに、カウピーから単離したCPRD65遺伝子のcDNAをプローブにして、シロイヌナズナ由来cDNAライブラリーからネオザンチン開裂酵素遺伝子のスクリーニングを行い、新規遺伝子（AtNCED3）を単離した。さらに、これらの遺伝子と相同性の高い配列を有する４種類のシロイヌナズナ由来の配列（AtNCED1、2、4、5）を見出した。これらの遺伝子を大腸菌で発現させ、ネオザンチン開裂活性のアッセイを行ったところ、AtNCED1、3、および5が、CPRD65と同様にネオザンチン開裂酵素の活性を有することが判明した。
【０００８】
本発明者らは、その中の１つであるAtNCED3遺伝子を例に用いてネオザンチン開裂酵素遺伝子のシロイヌナズナ形質転換植物を初めて作製した。植物細胞の遺伝子導入用ベクター（pBE2113N）の 35S プロモーター下流にセンス（過剰発現型）、またはアンチセンス（発現抑制）方向にAtNCED3遺伝子を接続し、これを減圧浸潤法でシロイヌナズナに導入した。作製したトランスジェニック植物の乾燥耐性を評価した結果、過剰発現体では親株に比べストレス耐性が有意に上昇していることが判明した。逆に、アンチセンスを導入した発現抑制株ではストレス耐性が低下していた（図１５、１６）。このように本発明者らは、ネオザンチン開裂酵素遺伝子のトランスジェニック植物が、実際にストレス耐性を有意に上昇させること、さらに、該遺伝子の発現を低下させることにより、ストレス耐性を有意に低下させることができることを見出し本発明を完成させた。
【０００９】
即ち、本発明は、植物のストレス耐性を上昇させるために用いられるネオザンチン開裂酵素をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを植物に導入することにより、植物のストレス耐性を上昇させる方法、および、ネオザンチン開裂酵素の遺伝子が導入されたトランスジェニック植物、ならびに植物のストレス耐性を低下させるために用いられるＤＮＡ分子、該ＤＮＡを植物に導入することにより、植物のストレス耐性を低下させる方法、および、該ＤＮＡが導入されたトランスジェニック植物に関し、より具体的には、
（１）植物のストレス耐性を上昇させるために用いる、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードするDNA、
（２）植物のストレス耐性を低下させるために用いる、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、
（ｂ）ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写産物を開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
（ｃ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現を抑制させるRNAをコードするDNA、
（３）ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質が、下記（ａ）から（c）のいずれかに記載の蛋白質である、（１）または（２）に記載のDNA、
（ａ）配列番号：２（AtNCED1）、６（AtNCED3）、１０（AtNCED5）、１２（CPRD65）、１４（VP14）、または１６（LeNCED1）に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：２（AtNCED1）、６（AtNCED3）、１０（AtNCED5）、１２（CPRD65）、１４（VP14）、または１６（LeNCED1）に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｃ）配列番号：１（AtNCED1）、５（AtNCED3）、９（AtNCED5）、１１（CPRD65）、１３（VP14）、または１５（LeNCED1）に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードする蛋白質、
（４）ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質がアラビドプシス由来である、（１）から（３）のいずれかに記載のDNA、
（５）（１）から（４）のいずれかに記載のDNAが導入された形質転換植物細胞、
（６）（５）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体、
（７）（６）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
（８）ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現が野生型に比べ上昇または低下している（６）または（７）に記載の植物体、
（９）アブシジン酸量が野生型に比べ上昇または低下している、（６）から（８）のいずれかに記載の植物体、
（１０）ストレス耐性が野生型に比べ上昇または低下している、（６）から（９）のいずれかに記載の植物体、
（１１）（６）から（１０）のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料、
（１２）（１）から（４）のいずれかに記載のDNAを保持するベクター、
（１３）（６）から（１０）のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、（１）から（４）のいずれかに記載のDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、
（１４）（１）から（４）のいずれかに記載のDNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物のストレス耐性を上昇または低下させる方法、を提供するものである。
【００１０】
なお、本発明において「ストレス耐性」とは、乾燥ストレス耐性、塩ストレス耐性、低温ストレス耐性、大気汚染耐性、低酸素状態に対する耐性、病原菌耐性、および農薬などの薬剤耐性などの環境ストレスに対する耐性を指す。ABAを外部から処理することにより多くの植物で、これらのストレスに対する耐性が上昇することが知られている（高橋信孝・増田芳雄共編、植物ホルモンハンドブック(下)、pp.78-160、培風館; およびそこに引用されている文献を参照のこと）。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、ストレス耐性を上昇させるために用いる、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードするDNAに関する。ネオザンチン開裂酵素の遺伝子は、これまでABAの生合成に関与する酵素としては知られていたが、この酵素をコードするDNAを植物に導入することにより、実際にABAの蓄積がもたらされ、植物体の生育に重大な影響を与えることなくストレスに対する耐性を向上させることができるかどうかは知られていなかった。
【００１２】
例えば、外部からABAを植物に処理すると、多くの植物において生育阻害などが認められる。また、種子においても、ABA処理により生育阻害（発芽阻害）が起きることが知られている（高橋信孝・増田芳雄共編、植物ホルモンハンドブック(下)、pp.78-160、培風館; およびそこに引用されている文献を参照のこと）。このように、ABAレベルの上昇は、植物に対し様々な障害をもたらす。外来遺伝子によるABAの過剰生産が、ストレス耐性の獲得につながるかどうかの情報は全くなかった。これまで行われてきた研究手法においては外部からABAを処理していたが、高い処理濃度が必要なため発育阻害が強く、正確な耐性評価に結びつかなかった。また外部からの処理実験では、正常に発育しつつ耐性を獲得するようなABAレベルがありうるのかどうか不明であった。本発明において、ABA生合成遺伝子の取得とこれを用いた形質転換植物の作成を行うことにより、植物のストレス耐性が上昇することが初めて実証された。
【００１３】
ストレス耐性を上昇させるために用いるDNAとしては、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードしている限り制限はない。現在、ネオザンチン開裂酵素の遺伝子としては、トウモロコシ（Zea mays）のVP14（Schwartz, S. H. et al., Science 276: 1872-1874, 1997; Tan, B. V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12235-12240, 1997）（cDNA：配列番号１３、蛋白質：配列番号：１４）、トマト（Lycopersicon esculentum）のLeNCED1（Burbidge, A. et al., J. Exp. Bot., 47: 2111-2112, 1997；Burbidge, A. et al., Plant J. 17:427-431, 1999）（cDNA：配列番号１５、蛋白質：配列番号：１６）等が単離されている。これらの遺伝子は、ストレス耐性を上昇させるために有用であり、本発明において用いられ得る。また、AtNCED1（配列番号：２）、AtNCED3（配列番号：６）、AtNCED5（配列番号：１０）、およびCPRD65（配列番号：１２）をコードするDNA（それぞれ、配列番号：１、５、９、および１１）も好適に用いられ得る。また、配列番号：１８に記載のネオザンチン開裂酵素をコードするDNA（cDNA,配列番号：１７、蛋白質, 配列番号：１８）（Neill, S.J. et al., J. Exp. Bot., 49: 1893-1894, 1998, Ac. No. AJ005813）も本発明において用いられ得る。ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードするDNAは、ストレス耐性を上昇させるための試薬（ストレス耐性上昇剤）ともなる。また本発明は、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードするDNAのストレス耐性を上昇させるための使用を提供する。
【００１４】
本発明のネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードするDNAには、ゲノムDNA、cDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、植物体から常法に従ってゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明のDNA（例えば、配列番号：１、５、９、１１、１３、または１５など）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明のDNA（例えば、配列番号：１、５、９、１１、１３、または１５など）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRを行うことによって調製することも可能である。また、cDNAは、植物体から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλファージベクター等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。また、本発明のDNAには、配列番号：１、５、９、１１、１３、または１５に記載のDNA配列のみならず、各蛋白質のアミノ酸をコードするコドンの任意の縮重に基づく塩基配列からなるDNAが含まれる。
【００１５】
また本発明のDNAには、例えば、配列番号：２、６、１０、１２、１４、または１６に記載の蛋白質において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードするDNAが含まれる。このようなDNAには、配列番号：１、５、９、１１、１３、または１５に記載の天然の植物由来の遺伝子の変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００１６】
アミノ酸配列が改変された蛋白質をコードするDNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、PCRによるin vitro変異導入法が挙げられる（伊沢毅、PCRによるin vitro mutagenesis、151-158頁、監修 島本功、佐々木卓治、細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ７新版植物のＰＣＲ実験プロトコール、秀潤社）。蛋白質におけるアミノ酸の改変は、人為的に行うのであれば、通常、200アミノ酸以内、好ましくは100アミノ酸以内、さらに好ましくは50アミノ酸以内、さらに好ましくは10アミノ酸以内である。また、塩基配列の変異によりコードする蛋白質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のネオザンチン開裂酵素をコードするアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNAであっても、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする限り、本発明のDNAに含まれる。また、例え、塩基配列が変異した場合でも、それが蛋白質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。
【００１７】
あるDNAがネオザンチン開裂酵素をコードしているか否かは、実施例５に記載されているように、大腸菌でDNAを発現させて組換え蛋白質を調製し、シス-ネオザンチンを基質としてその開裂を検出することにより決定することができる。
【００１８】
また、既知のネオザンチン開裂酵素をコードするDNAを基に、新たにネオザンチン開裂酵素遺伝子を単離することもできる。このための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Maniatis, T. et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（中山広樹著,細胞工学別冊バイオ実験イラストレイテッド第３巻新版, 秀潤社, 1998）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、既知のネオザンチン開裂酵素遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号：１、５、９、１１、１３、または１５などの配列）もしくはその一部をプローブとして、またこれらの配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、任意の植物からネオザンチン開裂酵素遺伝子をコードするDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうるネオザンチン開裂酵素をコードするDNAもまた本発明のストレス耐性を上昇させるために用いるDNAに含まれる。
【００１９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件を示せば、例えばプローブには、ランダムプライム法を用いて32ＰラベルしたDNAを用いる。ハイブリダイゼーション解析は、例えば文献記載の方法に従って行うことができる（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Mannual", 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）。DNAをナイロンフィルターに転写し、[32P]ラベルした断片と、例えば30％好ましくは50％ホルムアミド、6×SSC、5×Denhardt溶液、および 100μg/mlの変性サケ精子DNA中で、37℃好ましくは42℃でハイブリダイズさせる。ストリンジェントな条件における洗浄は、例えば 1×SSC、1% SDS（室温）で15分の洗浄を２回、好ましくは（よりストリンジェント） 0.5×SSC、0.5% SDS（37℃）で15分の洗浄を２回、より好ましくは（さらにストリンジェント） 0.1×SSC、0.1% SDS（60℃）15分の洗浄を２回行い、オートラジオグラフィーを行なう。「ストリンジェントな条件でハイブリダイズさせる」ことにより、上記の条件下で対象とする核酸に対して、塩基対の非共有結合的な平衡結合を特異的に生じさせることができる。
【００２０】
本発明のDNAによりコードされる蛋白質は、通常、配列番号：２、６、１０、１２、１４、または１６に記載の蛋白質とアミノ酸配列において少なくとも70％（例えば80％以上、90％以上、95％以上、または99％以上）の同一性を有する。ここで、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性（percent identity）は、KarlinおよびAltschul（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990）により構築され、KarlinおよびAltschul（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993）により改変されたアルゴリズムを用いて決定することができる。このようなアルゴリズムはAltschulら（J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990）のNBLASTおよびXBLAST等のプログラムに取り込まれている。BLASTの塩基配列の検索はNBLASTプログラム等により score = 100, wordlength = 12 で行うことができる。BLASTの蛋白質の検索はXBLASTプログラム等により score = 50, wordlength = 3 で行うことができる。２つの配列間でギャップが存在する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）により記載されたGapped BLAST等を用いることができる。BLASTやGapped BLASTを用いる場合、それぞれのプログラム（すなわちNBLASTおよびXBLAST等）のデフォルトのパラメーターを用いることができる（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。
【００２１】
また、配列番号：２、６、１０、１２、１４、または１６に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入などにより改変された蛋白質をコードするDNAには、例えば、少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換により得られる蛋白質をコードするDNAが含まれる。「アミノ酸の保存的置換」とは、あるアミノ酸残基を、このアミノ酸が属する、互いにアミノ酸の側鎖の化学的性質が類似しているグループ内の別のアミノ酸に置換することを言う。類似した側鎖を持つアミノ酸残基のグループは当分野において知られている。これらのグループには、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。
【００２２】
上記のようにして本発明のDNAを単離すれば、これを植物のストレス耐性の調節に用いることができる。ここで「単離されたDNA」とは、天然のDNAのいずれの構造とも同一でないか、あるいは少なくとも3つの別々の遺伝子を含む天然のゲノムDNA断片のいずれの構造とも同一でない構造を有するDNAを指す。従って、この用語は、例えば、（ａ）天然の生物のゲノムにおける天然のゲノムDNA分子の部分配列を持つDNA、（ｂ）ベクターあるいは原核生物または真核生物のゲノムDNAに導入されたDNAで、その結果生じた分子が天然のベクターまたはゲノムDNAと同一でないDNA、（ｃ）cDNA、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により産生された断片、または制限酵素切断断片などの分離された分子、ならびに（ｄ）ハイブリッド遺伝子すなわち融合蛋白質をコードする遺伝子の部分である組み換え核酸配列、などが含まれる。但し、例えばcDNAまたはゲノムDNAのライブラリーなど、（ｉ）異なるDNA分子の混合物中、（ｉｉ）異なるトランスフェクトされた細胞の混合物中、もしくは（ｉｉｉ）異なる細胞クローンの混合物中、に存在するDNA分子は単離されたDNAに含まれない。
【００２３】
これらのDNAを用いてストレス耐性を上昇させた形質転換植物体を作製する場合には、該DNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。
【００２４】
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや外的刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。また、植物の組織特異的なプロモーターを用いて、組織特異的に目的の遺伝子の発現を誘導すれば、ストレスに感受性が高い組織に特異的にストレス耐性を付与することが可能である。例えば、種子特異的な発現をするインゲンのβ-ファセオリン遺伝子（Bustos et al., EMBO J. 10:1469-1479 1991）やダイズのグリシニン遺伝子（Lelievre et al., Plant Physiol. 98:387-391, 1992）、葉特異的な発現をするエンドウのRbcS遺伝子(Lam and Chua, Science 248:471-474, 1990)やコムギのCab1遺伝子(Gotorn et al., Plant J. 3:509-518, 1993)、根特異的な発現をするタバコのTobRB7遺伝子(Yamamoto et al., Plant Cell, 3:371-382, 1991)などのプロモーターを用いることによって、目的の遺伝子を組織特異的に発現させることが可能である。また、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。例えば、乾燥や塩あるいは低温ストレスなどの環境ストレスに応答するプロモーターとしてrd29A遺伝子(Yamaguchi-Shinozaki, K. and Shinozaki, K. Plant Cell 6:251-264 1994)のプロモーターが挙げられる。また、乾燥、高塩濃度などの環境ストレスによって活性化するプロモーターも本発明において好適に用いられる。このようなプロモーターとしては、シロイヌナズナ AtNCED3 遺伝子およびカウピー CPRD65遺伝子のプロモーターなどが挙げられる。さらに、薬剤によって誘導される発現システムを用いることによって、目的の遺伝子を任意の時期にかつ任意の組織に発現させることが可能である。例えば、ステロイドホルモン(グルココルチコイド)によって誘導される発現システムとしてとしてＧＶＧ遺伝子（GAL4, VP16, Glucocorticoid receptor）を利用した誘導系(Aoyama, T. and Chua, N. H. Plant J. 11:605-12,1997)が挙げられる。
【００２５】
ベクターを挿入する植物細胞としては、特に制限はないが、例えば、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、イネ（Oriza sativa）、タバコ（Nicotiana tabacum）、トマト（Lycopersicon esculentum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、トウモロコシ（Zea mays）、ミヤコグサ（Lotus japonicus）等が挙げられる。またその他の農作物や樹木等に対しても有用である。植物は針葉樹、広葉樹、双子葉植物、単子葉植物などいずれでもよい。なお、ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００２６】
植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウム法、減圧浸透法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。例えば、イネおよびシロイヌナズナ等の形質転換体の作製は、文献「島本功・岡田清孝監修、モデル植物の実験プロトコール、細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ４、秀潤社」に従って行うことができる。
【００２７】
一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００２８】
このようにして作出された形質転換植物体は、野生型植物体と比較して、ABA含量が上昇している。あるいは、これらの形質転換植物体は、野生型植物体と比較して、そのストレス耐性が上昇している。ストレス耐性は、公知の方法により比較することができる。例えば、実施例に記載されているように、乾燥、高塩、低温、または高温などのストレス条件下で植物体を栽培し、その生長を比較すればよい。例えば、見かけの状態、植物体や葉、茎、根などの組織のサイズ、重量（生重量または乾燥重量）、色、相対生長速度、または光合成活性などを指標にして比較することができる。ストレス耐性は、少なくとも植物のいずれかの組織で上昇していればよい。また、植物体のABAレベルの測定は、イムノアッセイ、薄層クロマトグラフィー（TLC）、ガスクロマトグラフィー（GC）、HPLCなどの方法が知られている（高橋信孝・増田芳雄共編、植物ホルモンハンドブック(下)、pp.1-21、培風館; およびそこに引用されている文献を参照のこと）。例えば実施例７に記載されたように、ラベル化したABAを内部標準に用い、HPLCを用いた粗精製画分を最終的にGC・MSで定量することにより、信頼性の高い定量が可能である。
【００２９】
本発明により、乾燥地帯、寒冷地、高塩濃度などの環境ストレスに曝されている地域でも有用作物の栽培が可能となる。また、作物以外の植物に適用して、環境緑化に応用することも可能である。
【００３０】
また、本発明は、ストレス耐性を低下させるために用いる、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現を低下させることができるDNAに関する。該DNAは、ストレス耐性を低下させるための試薬（ストレス耐性低下剤）ともなる。また本発明は、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現を低下させることができるDNAのストレス耐性を低下させるための使用を提供する。
【００３１】
ストレス耐性が低下した植物は、雑草などに適用して環境から排除するために有用である。例えば、ストレス耐性の低下を誘導できるような植物を作製して、土地改良などに応用することができる。雑草のような生殖能力の高い植物品種に、化学物質（例えばグルココルチコイドなど）で誘導されるプロモーター下流にネオザンチン開裂酵素遺伝子の発現を抑制（例えばアンチセンス方向）するようなコンストラクトを導入する。この形質転換植物は化学物質が加えられなければ正常に生育するため、荒れ果てた土地において数年間その雑草を育てることによって土地を改良させることができる。その後、グルココルチコイドを散布することによって特異的に雑草のストレス耐性を低下させ、一網打尽に雑草を排除する。そして、栽培作物を作付けする。栽培作物は、ネオザンチン開裂酵素を過剰に発現する形質転換作物（センス方向に導入した植物）などを作付けすることができる。
【００３２】
本発明者らは、ネオザンチン開裂酵素遺伝子のアンチセンスRNAを発現する遺伝子構築物を用いて、ネオザンチン開裂酵素の発現を人為的に抑制した形質転換植物を初めて作出することに成功した。この植物体は、無潅水条件で野生型に比べ有意に枯れやすく、ストレス耐性が低下していることが判明した（図１５、１６）。このように、本発明者らは、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現を人為的に抑制する方法を確立し、これにより植物体のストレス耐性を低下させることに成功した。
【００３３】
本発明において、植物のストレス耐性を低下させるには、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現を低下させればよい。ここで遺伝子の発現には、遺伝子の転写および転写産物の翻訳が含まれる。また、発現の抑制には発現の完全な停止も含まれる。ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写や翻訳を抑制するには、該遺伝子をコードするDNA、その転写調節領域、または該遺伝子の転写産物を標的として、該遺伝子の発現を抑制すればよい。
【００３４】
本発明を適用する植物としては特に制限はなく、様々な植物を用いることができる。例えばシロイヌナズナなどが用いられる。また、発現を抑制する標的となりうるネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、例えば、トウモロコシ（Zea mays）であればVP14（Schwartz, S.H. et al., Science. 276: 1872-1874, 1997; Tan, B.V. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12235-12240, 1997）（cDNA：配列番号１３、蛋白質：配列番号：１４）、トマト（Lycopersicon esculentum）であればLeNCED1（Burbidge, A. et al., J. Exp. Bot., 47: 2111-2112, 1997；Burbidge, A. et al., Plant J., 17:427-431, 1999）（cDNA：配列番号１５、蛋白質：配列番号：１６）、シロイヌナズナであれば、AtNCED1（cDNA：配列番号：１、蛋白質：配列番号：２）、AtNCED3（cDNA：配列番号：５、蛋白質：配列番号：６）、および/またはAtNCED5（cDNA：配列番号：９、蛋白質：配列番号：１０）、カウピーであればCPRD65（cDNA：配列番号１１、蛋白質：配列番号：１２）等が挙げられる。他の植物由来のホモログ遺伝子も標的となりうる。他の植物のホモログ遺伝子は、例えば上記したハイブリダイゼーション等により同定・単離することが可能である。なお、本発明においてある植物のストレス耐性を低下させるために、他種植物の遺伝子または遺伝子配列情報（例えば上記の遺伝子）を利用して、ジーンサイレンシング法やアンチセンス法のような周知の方法を用いて、目的とする植物の標的遺伝子の発現を抑制することも可能である。従って、目的とする植物が有する標的遺伝子は、必ずしも単離または同定されていなくてもよい。
【００３５】
本発明におけるネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現の抑制は、該遺伝子の発現を抑制するためのDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることにより行うことができる。プロモーターとしては特に制限はなく、例えば上記のストレス耐性を上昇させる場合と同様のプロモーターを用いることができる。例えば、発現誘導型のプロモーターを用いれば、特定の条件でのみストレス耐性を低下させることができる。
【００３６】
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。
アンチセンス法とは、ある遺伝子から転写されたRNAに相補的なDNA分子（アンチセンス核酸）を用いて標的mRNAと二重鎖を形成させ、その発現を抑制しようとする人為的遺伝子発現制御法である。アンチセンスによる遺伝子発現制御法は1960年から1970年に見出され、1978年にはZamecnikらがアンチセンスオリゴマーを用いてニワトリ・ラウス肉腫ウイルスの複製および逆転写酵素の活性阻害を行うことに成功している(Zamecnik,P.C. and Stephenson,M.L. 1978, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 75, 280-284)。
【００３７】
アンチセンスDNAを導入する方法には、アンチセンスオリゴマーを直接細胞内に投与する方法や発現ベクターに標的遺伝子のアンチセンスDNAをつないで形質転換を行う方法があり、後述する実施例では後者を用いた例を記載している。具体的には、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターの下流にネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のcDNAをアンチセンス方向につないで植物細胞に導入する。植物細胞におけるアンチセンス効果は、Eckerらが一時的遺伝子発現法を用いて電気穿孔法により導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証された(Ecker,J.R. and Davis,R.W., Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 83:5372, 1986)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を抑制する例が報告されており(van der Krol,A.R. et al., Nature, 333:866, 1988)、現在では植物における遺伝子発現抑制の手段としてアンチセンス法は確立した技術である。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼにより局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進行しつつあるRNAとのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現制御などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実験講座２核酸IV 遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編,東京化学同人, pp.319-347, 1993）。
【００３８】
アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする内在性遺伝子の転写産物またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
【００３９】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。近年、リボザイムをコードするDNAを利用して遺伝子の発現抑制を行う研究がなされている。リボザイムとは生体内の反応を触媒する活性を持つRNAである。リボザイムには様々な活性を有するものがあるが、とりわけRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きなものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠・大塚栄子,蛋白質核酸酵素, 35:2191, 1990）。
【００４０】
たとえば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が9位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCのほかにAまたはUでも切断されることが示されている(Koizumi, M. et al., FEBS Lett. 228:225, 1988）。リボザイムの基質結合部位を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的な切断リボザイムを作ることが可能である(Koizumi, M. et al., FEBS Lett., 239:285, 1988；小泉誠・大塚栄子, 蛋白質核酸酵素, 35：2191, 1990；Koizumi, M. et al., Nucleic Acids Res., 17:7059, 1989）。例えば、アラビドプシスのAtNCED3遺伝子のコード領域には、このような部位が数百箇所存在する。また、ヘアピン型リボザイムは、たとえばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(Buzayan, J. M., Nature 323:349, 1986）。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Kikuchi, Y. and Sasaki, N., Nucleic Acids Res. 19:6751, 1992；菊池洋, 化学と生物, 30:112, 1992）。
【００４１】
標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されているとリボザイムの活性が消失する可能性がある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側にトリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である(Taira,K. et al., Protein Eng. 3:733, 1990；Dzianott, A. M. and Bujarski, J. J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:4823, 1989；Grosshans, C. A. and Cech, R. T., Nucleic Acids Res., 19:3875, 1991; Taira, K. et al., Nucleic Acids Res. 19:5125, 1991)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(Yuyama, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186:1271, 1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を切断し、当該遺伝子の発現を抑制することが可能である。リボザイムは、標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断することが好ましい。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００４２】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr. Biol. 7: R793, 1997, Curr. Biol. 6:810, 1996)。例えば、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現が共抑制された植物体を得るためには、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体からネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現が低下した形質を有する植物を選択すればよい。
共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、通常、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上の配列の同一性を有する。同一性または相補性を決定するために遺伝子情報処理ソフトウェアであるGenetyx(ソフトウェア開発株式会社)を用いることができる。このプログラムはLipman-Pearson法（Lipman, D.J. and Pearson, W. R. 1985, Science 227:1435-1441）を採用している。この方法は、まず配列データを比較し、相同性の高い配列データーについて、配列の欠落(GAP)を考慮し相同性を算出する。
【００４３】
本発明で利用される、遺伝子の発現を抑制する機能を有する上記のようなDNAを利用してストレス耐性が低下した形質転換植物体を作製する場合には、該DNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。用いられるベクターとしては、植物細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば、上記のストレス耐性を上昇させる場合と同様に特に制限はない。ベクターを挿入する植物細胞としても特に制限はない。植物は針葉樹、広葉樹、双子葉植物、単子葉植物などいずれでもよい。なお、ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００４４】
植物細胞へのベクターの導入、および形質転換植物細胞からの植物体の再生は、上記のストレス耐性を上昇させる場合と同様、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００４５】
このようにして作出された形質転換植物体は、野生型植物体と比較して、ABA含量が低下している。あるいは、これらの形質転換植物体は、野生型植物体と比較して、そのストレス耐性が低下している。このような植物は、例えば雑草などに適用して、効果的な除草を行うことができる。また、上記のように誘導性のプロモーターを利用することで、本発明の形質転換植物体を土地改良などに利用することが可能である。
【００４６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本実施例において汎用した実験条件を以下に示す。
・カウピーの生育
カウピーの種（Vigna unguiculata IT84S-2246-4）を鉢に播き、温室で８日間、16時間明期（自然光に加え照度不足時は人工灯による補光）、25℃の条件下で、適度に水を撒きながら生育させた。
・乾燥処理
乾燥処理は、植物体を傷つけないように鉢から引き出し、計量後、室温、湿度約60％、弱光（300 lux）の条件下 Whatman 3MM 濾紙上に置くことで行った。コントロールでは、植物を鉢から取り出し、すぐによく水を含んだ土に戻して乾燥処理群と同じ条件下で維持した。
・DNA配列分析
自動プラスミド単離システム Model PI-100（KURABO）を用いてプラスミドDNAの鋳型を調製し、DNAシークエンサー Model 373A（ABI）で配列を決定した。塩基配列およびアミノ酸配列は GeneWorks ソフトウェアシステム（IntelliGenetics, Inc.）、Sequencher 3.0（Hitachi Software）およびウィスコンシン大学 Genetic Computer Group（GCG）プログラムを用いて解析した。
【００４７】
[実施例１] 乾燥処理により誘導される遺伝子のcDNAクローンの単離
８日間生育させたカウピーに10時間乾燥ストレスを与えた後単離したポリA+ RNAを用いてcDNAライブラリーを作製した。
まず、乾燥処理植物からのcDNAライブラリーの調製を以下にようにして行った。植物体全体を回収し、根から土を穏やかに洗い落とした後、室温、湿度約60％、弱光条件下 Whatman 3MM 濾紙上に10時間置くことで乾燥処理を行った。乾燥処理を施した植物から全RNAを以前記載されていた方法で調製した（Nagy, F. et al., "Analysis of gene expression in transgenic plants". In Gelvin and Schilperoort (eds), "Plant Molecular Biology Manual, B4"., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp.1-29, 1988）。文献（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Mannual", 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）に従って、全RNAをオリゴdTセルロースカラムに２回通してポリA+ RNA を調製した。カラムにアプライしたRNAの約2％がポリA+ RNA分画として回収された。ポリA+ RNAからcDNA Synthesis System Plus（Amersham Pharmascia Biotech）を用いて２本鎖cDNAを合成した。cDNA Cloning System（Amersham Pharmascia Biotech）を用いてcDNAからcDNAライブラリーを作製した。
【００４８】
ストレスを与えていないカウピーから単離したポリA+ RNAから調製したcDNAと、10時間乾燥ストレスを与えた植物から単離したポリA+ RNAから調製したcDNAとを用いて、上記のcDNAライブラリーのディファレンシャルスクリーニングを行った。文献（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Mannual", 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）に従って、プラークハイブリダイゼーションを行い、cDNAライブラリーから 1×104 プラークをスクリーニングした。
【００４９】
その結果、10時間乾燥ストレスを与えたカウピー由来の [32P]ラベルしたcDNAでより強いハイブリダイズシグナルが得られるプラークを得た。ファージクローンから in vivo でプラスミドを切り出し、大腸菌に形質転換した。得られたプラスミドは、制限酵素地図と各cDNA断片の境界部の配列により解析した。この解析によるcDNAをグループ分けを通して、CPRD（CowPea Responsive to Dehydration）65と名付けたcDNAクローンを同定することができた。
【００５０】
CPRD65クローンに対応する遺伝子の発現が乾燥処理により誘導されるかを、ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより解析した。８日目の植物体を土から引き出し、最大12時間までの様々な時間乾燥処理した。コントロールとして、同様のカウピーをいったん土から引き出し、すぐによく水を含む土に植え戻した。乾燥処理植物とコントロール植物から全RNAを単離し、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを行った。
【００５１】
全RNAをNagyらの方法（Nagy, F. et al., "Analysis of gene expression in transgenic plants". In Gelvin and Schilperoort (eds), "Plant Molecular Biology Manual, B4"., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp.1-29, 1988）に従って単離し、ホルムアルデヒドを含む 1％アガロースゲルで分離しナイロンフィルターに転写した（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Mannual", 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）。ナイロンフィルターは [32P]ラベルしたCPRD65 cDNA断片と 50% ホルムアミド、5×SSC、25mM リン酸ナトリウムバッファー（pH6.5）、10×Denhardt溶液、および 250μg/mlの変性サケ精子DNA中で42℃でハイブリダイズさせた。0.1×SSC、0.1% SDSで60℃で15分の洗浄を２回行い、オートラジオグラフィーを行った。
【００５２】
図１は、CPRD65遺伝子の乾燥処理に対する発現誘導のタイムコースを表す。CPRD65の発現は、乾燥ストレスにより有意に上昇することが判明した。CPRD65に対応するmRNAは乾燥処理を始めて２時間以内に蓄積が認められた。
【００５３】
10時間乾燥処理したカウピーは萎れたが、これらの萎れた植物をよく水をやった土に戻す（再吸水処理）と４時間以内に萎れから回復した。再吸水処理に伴って、CPRD65 mRNA のレベルは減少した（図１）。CPRD65遺伝子は、乾燥処理により転写が誘導され、再吸水処理により減少するという、乾燥ストレスに対する典型的かつ有意な応答を示した。このことから、CPRD65遺伝子は乾燥耐性に関与していることが示唆された。
【００５４】
[実施例２] CPRD65 cDNA のシークエンス解析
実施例１で単離されたCPRD65 cDNA断片は全長ではない可能性が考えられたため、CPRD65の部分cDNAをプローブにして同じcDNAライブラリーを再度スクリーニングして全長cDNA（配列番号：１１）を単離した。CPRD65の全長cDNAクローンがコードするアミノ酸配列（配列番号：１２）を図２に示す。全長CPRD65 cDNAは2432bpからなり、125bpの5'-flanking region（5'-隣接領域）と486bpの3'-flanking region（3'-隣接領域）を有する。3'-flanking regionには、ポリアデニレーションコンセンサス配列（AATAAA）が１つ見出された。この配列は、612アミノ酸のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを持っており、予想される蛋白質の分子量は67.6kDaと計算された。CPRD65蛋白質の予想されるアミノ酸配列を蛋白質データベースと比較したところ、図２に示すように、トウモロコシ（Zea mays）のVP14（61％）（Schwartz, S.H. et al., Science. 276: 1872-1874, 1997）およびトマト（Lycopersicon esculentum）のネオザンチン開裂酵素（69％）（Burbidge, A. et al., J. Exp. Bot., 47: 2111-2112, 1997; Burbidge, A. et al., Plant J., 17:427-431, 1999）と高いホモロジーを有することが判明した。VP14蛋白質と同様、予想されるCPRD65蛋白質はＮ末領域にトランジットポリペプチドを有していると思われた。CPRD65、VP14、およびトマトのネオザンチン開裂酵素のＮ末の配列の類似性は低いが、構造的な類似性を有している。
【００５５】
[実施例３] CPRD65遺伝子のゲノムサザンブロット解析
カウピーのCPRD65関連遺伝子を解析するため、ゲノムサザンブロットハイブリダイゼーションを２つのストリンジェンシーの条件で行った（図３）。
【００５６】
ゲノムサザン解析は文献記載の方法に従った（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Mannual", 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）。10μgのゲノムDNAを制限酵素で切断し、1％アガロースゲルで分離後ナイロンフィルターに転写した。フィルターは [32P]ラベルした断片と 30% ホルムアミド、6×SSC、5×Denhardt溶液、および 100μg/mlの変性サケ精子DNA中で42℃でハイブリダイズさせた。0.1×SSC、0.1% SDSで60℃で15分の洗浄を２回（Ｂ）、または 0.5×SSC、0.5% SDSで37℃で15分の洗浄を２回（Ａ）を行い、オートラジオグラフィーを行った。
【００５７】
CPRD65 cDNA は、その塩基配列から、内部にEcoRIとXbaIの制限酵素部位がなく、HindIIIの制限酵素部位が近接した２箇所に確認される。CPRD65 cDNAをプローブに使ったハイブリダイゼーションの結果、EcoRIまたはXbaIの切断に対し１本のバンドが、HindIII切断に対し２本のバンドが検出された。上記（Ａ）のストリンジェンシー条件では、さらに薄いバンドが何本か検出された。これらの結果は、CPRD65遺伝子は、関連遺伝子と共に小さな遺伝子ファミリーを形成していることを示唆している。
【００５８】
[実施例４] CPRD65遺伝子のノーザンブロット解析
様々な環境ストレスがCPRD65の発現に及ぼす影響を調べた。高塩、ABA、および水処理は、乾燥処理と同様に植物を土から引き出し、水耕法により、それぞれ、250mM NaCl、100μM ABA、および脱イオン水を含む溶液で生育させた。高温および低温ストレス処理は、鉢植した植物をそれぞれ、40℃および4℃のインキュベーターに移して行った。それぞれの場合で、植物のストレス処理は 0、1、2、5、10、および24時間行った。処理終了後、速やかに処理した植物を液体窒素中で凍結させた後、RNAを単離しノーザンブロット解析を行った。
その結果、この遺伝子の発現は高塩濃度条件において強く誘導されるが、低温または高温ストレスによっては誘導されないことが判明した（図４A）。CPRD65遺伝子の誘導は、ABA処理や水処理によっては検出されなかった。
【００５９】
乾燥ストレスによるCPRD65遺伝子発現に組織特異性が存在するかを調べるため、標準条件と乾燥条件下で葉、茎、または根から全RNAを調製し、ノーザンブロットハイブリダイゼーションを行った（図４B）。乾燥処理により、CPRD65遺伝子の転写産物は茎と葉で強く誘導されたが、根での誘導量は顕著ではなかった。
【００６０】
[実施例５] バクテリアで発現させたCPRD65蛋白質の酵素活性
CPRD65遺伝子から予想されるアミノ酸配列は、トウモロコシのVP14遺伝子がコードするネオザンチン開裂酵素のアミノ酸配列と高いホモロジーを有している（図２）。CPRD65遺伝子がネオザンチン開裂酵素をコードしているのかを調べるため、大腸菌で発現させた組換えCPRD65蛋白質の生化学的特性を分析した。CPRD65のコード領域のDNA断片をPCRで増幅し、pGEX4T-1（Pharmacia）のGST遺伝子に in frame で融合させ、キメラプラスミド pGST-CPRD65 を下記のように構築した。
【００６１】
CPRD65蛋白質をコードするDNAを、プライマー 5'-ATTGAATTCATGCCTTCAGCTTCAAAC-3'（配列番号：１９）および 5'-ATTGGATCCCAAAAGCTACACGCTGGTCCCC-3'（配列番号：２０）を用いてPCRにより増幅した。得られたPCR断片をpBluescript II SK+ ベクターのEcoRV部位に挿入した。PCRによりDNA配列に変異が生じていないか挿入したPCR断片の塩基配列を確認した。塩基配列に変異の認められないPCR断片をpBluescript II SK+ ベクターから制限酵素（EcoRI、XhoI）を用いてDNA断片として単離し、このDNA断片を pGEX4T-1（Amersham Pharmacia Biotech）のEcoRI、XhoI部位に挿入し、pGST-CPRD65を構築した。大腸菌 JM109 を pGST-CPRD65 または pGEX4T-1 で形質転換し、L培地で37℃で培養した。OD600 が約0.5になったところでイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド（IPTG)を加え、さらに17℃で12時間培養を続けた。細胞を回収し、洗浄した後、抽出バッファー [10mM Tris-HCl (pH8.0), 5mM MgCl2, 5% glycerol, 0.1mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), および 0.1mM dithiothreitol (DTT)] に懸濁した。融合蛋白質の精製とトロンビン切断の方法は、GST遺伝子融合システム（Amersham Pharmacia Biotech）の説明書に従った。蛋白質濃度はプロテインアッセイキット（Bio-Rad）を使って決定した。
【００６２】
上記のように大腸菌で GST-CPRD65 融合蛋白質を過剰発現させ、粗細胞抽出物からグルタチオンセファロース4Bを用いて蛋白質を精製した。この精製GST-CPRD65組換え蛋白質が、シス-ネオザンチン（cis-neoxanthin）、トランス-ビオラザンチン（trans-violaxanthin）、およびシス-ビオラザンチン（cis-violaxanthin）を切断し、ザントキシンを生成するかを調べた。
【００６３】
ネオザンチン開裂酵素活性のアッセイ方法は以前記載されている方法に従った（Schwartz, S.H. et al., Science. 276: 1872-1874, 1997）。シス-ネオザンチンとトランス-ビオラザンチンはホウレンソウ葉より調製した。シス-ビオラザンチンはオレンジの皮から調製した。反応液（100μl）は 100mM Bis-Tris (pH6.7), 0.05% Triton X-100, 10mM アスコルビン酸, 5mM FeSO4, および 蛋白質試料を含む。室温で１時間反応させた。反応後、水 1ml を加え、n-ヘキサン（1ml×2）、次に酢酸エチル（1ml×2）で抽出した。n-ヘキサン画分を濃縮し、Nucleosil 5 C18 (150mm長, 内径8mm)カラムによりHPLC分析を行った。カラムは、溶媒A（85% エタノール）と溶媒B（クロロホルム:メタノール=1:1）のリニアグラディエントで、流速 1.5ml/min で溶出させた。溶媒Bの濃度を25分かけて10％から50％に増加させ、5分間50％に維持した。溶出液はUV検出器で440nmの吸収をモニターした。酢酸エチル画分を、Nucleosil 5 C18 (150mm長, 内径8mm)カラムを用いたHPLCにより精製した。カラムは、50％の水メタノールで流速 1.5ml/min で溶出させ、UV検出器で260nmの吸収をモニターした。ザントキシン（xanthoxin）画分を集め、GC-MS分析を行った。各段階ではできる限り試料に光が当たらないようにした。
【００６４】
GC-MS分析は以下のようにして行った。5890ガスクロマトグラフ（Hewlett Packard）を装備したAUTOMASSマススペクトロメーター（日本電子）を分析に用いた。分析条件を以下に示す。イオン化, EI 70eV; カラム, DB-5 (15m長; 内径0.25mm; フィルム厚 0.25μm; J&W Scientific); キャリアガス, He (1ml min-1), 注入温度, 250℃; 伝達経路温度, 250℃; 初期加熱温度, 80℃。注入1分後に開始し、加熱温度を 30℃ min-1 の速度で200℃まで増加させ、さらに 5℃ min-1 の速度で230℃まで増加させた。
【００６５】
図５に示したように、HPLC分析によって、GST-CPRD65蛋白質とシス-ネオザンチンの混合反応により、予想されるC25産物とザントキシンが検出された。ザントキシンの生成は、GC-MS分析でザントキシンに特徴的なイオンを観察することによって確認した。イオンとそれらの相対強度を以下に示す：m/z 250 (4), 168 (32), 149 (77), 107 (61), および 95 (100)。ザントキシンおよびC25産物は、トランス-ビオラザンチンでは生成しなかった（データ省略）。トロンビンによりGST-CPRD65組換え蛋白質をGST部分とCPRD65部分に分離しても、これらの結果は変わらなかった。
【００６６】
[実施例６] CPRD65蛋白質のＮ末領域がシロイヌナズナから調製したプロトプラスト中でトランジットペプチドとして機能するかの解析
CPRD65蛋白質のＮ末領域は、葉緑体へのターゲティングに関与するトランジットペプチドの典型的な構造的特徴を有している。CPRD65蛋白質のこの構造的特徴から、CPRD65蛋白質は葉緑体を含む色素体に局在することが示唆される。このＮ末領域がトランジットペプチドとしての役割を有するかを調べるため、CaMV 35Sプロモーターおよびクラゲ（Aequorea victoria）の合成緑色蛍光蛋白質（sGFP）（Chiu, W. et al., Curr. Biol., 6: 325-330, 1996）遺伝子の間にCPRD65蛋白質のＮ末領域（1-148）がコードされた構造を有する 35S::CPRD65N-sGFP キメラ遺伝子を構築した。
【００６７】
CPRD65蛋白質のＮ末端ペプチド（1-148アミノ酸）に対応するDNAを、プライマー 5'-ATATATCTAGAATGCCTTCATCAGCTTCAAACACTTGG-3'（配列番号：２１）および 5'-ATATAGGATCCCTCCGGCACCGGCGCGAAGTTCCCG-3'（配列番号：２２）を用いたPCRにより増幅した。PCR断片を pBluescript II SK+ ベクターに挿入し、PCRによる配列の変異がないことを確認した。一過的発現ベクター（Chiu, W. et al., Curr. Biol., 6: 325-330, 1996）の35SプロモーターとsGFP遺伝子の間にDNA断片を挿入した。調製方法、DNAトランスフェクション、およびシロイヌナズナプロトプラストのインキュベーションは、以前記載されたように行った（Abel, S. and Theologis, A., Plant J., 5: 421-427, 1994）。
【００６８】
35S::CPRD65N-sGFP 融合構築物およびそのコントロール構築物（35S::sGFP）を、DNAトランスフェクション法によりシロイヌナズナから調製したプロトプラストへ導入した（Abel, S. and Theologis, A., Plant J., 5: 421-427, 1994）。形質転換２〜４日後に蛍光顕微鏡でプロトプラストを観察した。図６に示したように、35S::CPRD65N-sGFPをプロトプラストで一過的に発現させた場合、その蛍光は色素体に局在していた。一方、35S::sGFP構築物を導入した場合は、蛍光は色素体ではなく、主に細胞質に検出された。これらの結果は、CPRD65蛋白質のＮ末端領域はCPRD65蛋白質を色素体にターゲティングするトランジットペプチドとして機能することを示唆している。CPRD65蛋白質は色素体に局在し、色素体中でABAを産生するために機能していると予想される。
【００６９】
[実施例７] 生育８日目のカウピーの乾燥ストレスによるABAの蓄積
生育８日目のカウピーに乾燥ストレスを与え、内生ABAレベルの蓄積を測定した。
試料を液体窒素中でホモジナイズし、水-メタノール（20-80％）で2回抽出した。[2H3]ABA を加えた後、抽出物を濃縮し、標準的な溶媒分画を行い酢酸エチル可溶酸性画分を得た。Bond Elut カートリッジ（C18 およびDEA, Varian）を用いて以前記載された方法に従って精製を行った（Wijayanti, L. et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1533-1535, 1995）。乾燥させていない植物から精製した試料は Senshu Pak ODS-2101-N カラム（100mm長, 内径6mm）（Senshu Scientific Co.）を用いてHPLC分析を行った。分析条件は以前に記載さたものと同様にした（Wijayanti, L. et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1533-1535, 1995）。精製された試料は、エーテル含有ジアゾメタンでメチル化し、GC-SIM分析を行った。
【００７０】
図７に示すように、乾燥処理２時間以内にABAの蓄積が始まった。10時間乾燥処理した植物のABAレベルはストレスを与えないコントロール植物に比べ140倍に高まった。CPRD65 mRNA の蓄積のタイミングはABA mRNA の蓄積のタイミングよりも早かった（図７）。
【００７１】
CPRD65遺伝子の発現は乾燥ストレスにより葉および茎で強く誘導されたが、根での誘導は僅かであった（図４B）。乾燥ストレス下でのCPRD65の発現と内生ABAの蓄積との関係を調べた。生育８日目のカウピーを葉、茎、および根に分け、それぞれを乾燥処理した。これらの器官の内生ABAレベルを、乾燥処理の前後で測定した。図８に示したように、内生ABA量は乾燥ストレスにより、葉および茎で劇的に蓄積が認められたが、根では僅かしか蓄積しなかった。図４Bおよび８に示したように、乾燥ストレスにおけるABAの組織特異的な蓄積パターンは、CPRD65遺伝子の発現パターンと一致していた。
【００７２】
[実施例８] カウピー葉のザントフィル（xanthophyll）分析
CPRD65蛋白質の基質を検索するため、カウピー葉のザントフィルを分析した。
試料をアセトンで２回抽出し、濃縮した後、80％メタノール（1ml）に溶解し、Bond Elut C18 カラムにロードした。80％メタノール4mlを加えてカラムを洗浄し、5mlのメタノール-水-クロロホルム（71:9:20）でザントフィルを溶出した。溶出液を濃縮し、Nucleosil 5 C18 と Senshu Pak Silica-2551-S (250mm長, 内径6mm)のカラムを用いてHPLC分析を行った。ODS-HPLCの条件は上記と同一である。シリカHPLCでは、流速は 1.5ml/min とし、溶媒Aは酢酸エチル-n-ヘキサン（1:1）、溶媒Bは酢酸エチルを用いて、溶媒Bを30分かけて10％から100％までリニアに勾配をつけた。可視光とUVのスペクトル分析によりザントフィルを同定した。
【００７３】
可視光とUVの光学スペクトル分析により、トランス-ネオザンチン、トランス-ビオラザンチン、シス-ネオザンチンがカウピー葉の主要なザントフィルとして、シス-ビオラザンチンが微量成分として検出された（データ省略）。トランス-ネオザンチン、トランス-ビオラザンチンおよびシス-ネオザンチンの内生量は、正常生育条件と乾燥条件下において大きな変化は認められなかった。
【００７４】
以上のように、カウピーの乾燥誘導性遺伝子 CPRD65 はネオザンチン開裂酵素をコードしており、その産物は色素体に局在していることが判明した。CPRD65遺伝子は、乾燥や高塩条件下において、主に葉と茎で強く誘導される。乾燥条件では、葉と茎にABAが高度に蓄積され、それはCPRD65遺伝子の発現と同様のパターンを示す。これらの結果は、CPRD65蛋白質が、カウピーの乾燥ストレスにおけるABA生合成に主に関与する酵素であることを強く示唆している。
【００７５】
[実施例９] ネオザンチン開裂酵素遺伝子のホモログをコードするアラビドプシスcDNAクローンの単離
CPRD65をプローブにして、アラビドプシスのcDNAライブラリー（Abe, H. et al., Plant Cell, 9:1859-1868, 1997）をスクリーニングした。その結果、強いハイブリダイゼーションシグナルを示す多数のプラークが得られた。これらのプラークからファージクローンを単離し、制限酵素でcDNA領域を切り出して pBluscript SK+ 中に挿入し、大腸菌を形質転換した。DNA配列の解析により、これらのクローンは１つのグループに分類された。これをAtNCED3と名付けた。AtNCED3はネオザンチン開裂酵素をコードするCPRD65と有意な相同性を示した（図９）。AtNCED3 cDNAの塩基配列を配列番号：５に、AtNCED3蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。
【００７６】
[実施例１０] AtNCED1, 2, 4, 5 の単離及び系統樹解析
CPRD65 及び AtNCED3 の塩基配列を用いてDNAデータベースを検索した結果、高い相同性が認められた配列を４個見出した（Ac. No. AL021713, AL021687, AJ005813, AB028621）。
AL021713の配列上に存在する相同性の高い遺伝子を単離するために、gDNAを鋳型にPCR法（プライマー5'-CCCGGGATCCCTCAAGCCTCTCTATACCG-3'／配列番号：２３、5'-CCCGGGATCCTTTATACGGATTCTGAGGGAG-3'／配列番号：２４）で目的遺伝子断片を増幅した。その断片をプローブとしてgDNAライブラリー（クローンテック社）から目的遺伝子を含むクローンを単離し再度PCR法（プライマー5'-CCCGGGATCCCTCAAGCCTCTCTATACCG-3'／配列番号：２３、5'-CCCGGGATCCTTTATACGGATTCTGAGGGAG-3'／配列番号：２４）で遺伝子を増幅しpBluescript II SK+（Stratagene）のEcoRVサイトにクローニングしDNA塩基配列を決定した。この遺伝子をAtNCED1とした。AtNCED1 cDNAの塩基配列を配列番号：１に、AtNCED1蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００７７】
AL021687の配列上に存在する相同性の高い遺伝子を単離するためにgDNAを鋳型にPCR法（プライマー5'-ATTGAATTCATGGACTCTGTTTCTTCTTCTTCC-3'／配列番号：２５、5'-ATTGAATTCTTAAAGCTTATTAAGGTCACTTTCC-3'／配列番号：２６）で目的遺伝子断片を増幅した。その断片をプローブとしてgDNAライブラリーから目的遺伝子を含むクローンを単離し再度PCR法（プライマー5'-ATTGAATTCATGGACTCTGTTTCTTCTTCTTCC-3'／配列番号：２５、5'-ATTGAATTCTTAAAGCTTATTAAGGTCACTTTCC-3'／配列番号：２６）で遺伝子を増幅しpBluescript II SK+（Stratagene）のEcoRVサイトにクローニングしDNA塩基配列を決定した。この遺伝子をAtNCED2とした。AtNCED2 cDNAの塩基配列を配列番号：３に、AtNCED2蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
【００７８】
AJ005813の配列上に存在する相同性の高い遺伝子を単離するためにgDNAを鋳型にPCR法（プライマー5'-AAGAATTCATGGCGGAGAAACTCAGTGATGGCAGC-3'／配列番号：２７、5'-AAAAGAATTCGGCTTATATAAGAGTTTGTTCCTGG-3'／配列番号：２８）で目的遺伝子断片を増幅した。その断片をプローブとしてcDNAライブラリーから目的遺伝子を含むクローンを単離し再度PCR法（プライマー5'-AAGAATTCATGGCGGAGAAACTCAGTGATGGCAGC-3'／配列番号：２７、5'-AAAAGAATTCGGCTTATATAAGAGTTTGTTCCTGG-3'／配列番号：２８）で遺伝子を増幅しpBluescript II SK+ （Stratagene）のEcoRVサイトにクローニングしDNA塩基配列を決定した。この遺伝子をAtNCED4とした。AtNCED4 cDNAの塩基配列を配列番号：７に、AtNCED4蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：８に示す。
【００７９】
AB028621の配列上に存在する相同性の高い遺伝子を単離するためにP1クローンMUJ8のDNAを単離しPCR法（5'-CGGGATCCATGCAACACTCTCTTCGTTCTGATCTTCTTC-3'／配列番号：２９、5'-CGGGATCCTCAGAAAACTTGTTCCTTCAACTGATTCTCGC-3'／配列番号：３０）で遺伝子を増幅しpBluescript II SK+（Stratagene）のEcoRVサイトにクローニングしDNA塩基配列を決定した。この遺伝子をAtNCED5とした。AtNCED5 cDNAの塩基配列を配列番号：９に、AtNCED5蛋白質のアミノ酸配列を配列番号：１０に示す。
【００８０】
AtNCED1〜5のアミノ酸配列のアライメントを図１０に示す。各配列から予想されるアミノ酸配列とデータベース上にある配列の関係を調べるため系統樹解析を行った（図１１）。系統樹は、遺伝子解析ソフトである GeneWorks（Intelligenetics, Inc.）を用いて作製した。アルゴリズムはUPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean；分子進化遺伝学、根井正利著、五條堀孝、斎
藤成也共訳、培風館、p252-256）を使用した。
【００８１】
[実施例１１] AtNCED遺伝子のノーザンブロット解析
同定した各AtNCED遺伝子の発現に関して、様々な環境ストレスが及ぼす影響をノーザンブロット解析により調べた。
【００８２】
各ストレス処理には、寒天プレートにて3週間栽培した植物体を用いた。乾燥ストレスは、寒天培地から植物体を引き抜き濾紙の上で風乾させた（相対湿度50％）。塩ストレス、ABA処理、コントロールとしての水処理は、それぞれ250mM NaCl溶液、100μM ABA溶液、蒸留水を入れたシャーレに根だけが浸かるように引き抜いた植物体をシャーレの中に置きシャーレにフタをして室温にて一定時間放置した。低温ストレス及び高温ストレスは寒天プレートごとそれぞれ4℃、及び４0℃の恒温培養器に一定時間放置した。
【００８３】
上記の環境ストレス処理を行った植物体を液化窒素中で破砕し、全RNAを抽出 (Nagy, F., Kay, S. A. and Chua, N. -H. (1988) Analysis of gene expression in transgenic plants. In Gelvin and Schilperoort, eds, Plant Molecular Biology Manual, B4. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 1-29)し、1％のアガロースゲル中で1レーン当たり20μgずつ電気泳動した。電気泳動後のゲルからRNAをナイロンメンブレンに転写し、32PでラベルしたcDNAプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションをおこなった（Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.）。
【００８４】
その結果、AtNCED3 遺伝子は乾燥、高塩濃度、および低温条件で発現が強く誘導されることが判明した。高温条件では誘導は見られなかった。また、ABA処理または水処理では、AtNCED3遺伝子の発現誘導は検出されなかった（図１２）。
【００８５】
[実施例１２] バクテリアで発現させた AtNCED 蛋白質の酵素特性
AtNCED3遺伝子から予想されるアミノ酸配列は、ネオザンチン開裂酵素をコードするカウピーの CPRD65 遺伝子のものと高いホモロジーを有している（図９）。AtNCED3 遺伝子がネオザンチン開裂酵素をコードしているかを調べるため、大腸菌で発現させた組換え AtNCED3 蛋白質の生化学的な特性を解析した。
【００８６】
プライマー（5'-ATTGAATTCATGGCTTCTTTCACGGCAACGGC-3'／配列番号：３１、および5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'／配列番号：３２）を用いて、クローニングしたAtNCED3 cDNA を鋳型にAtNCED3蛋白質をコードするDNAをPCRで増幅した。得られたPCR断片をpBluescript II SK+ (Stratagene)のEcoRVサイトにクローニングした。PCRによりDNA塩基配列に変異が導入されていないかを決定した。変異の認められないDNA断片を、グルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）遺伝子を含む pGEX4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech) のEcoRIサイトにフレームが合うようにクローニングし、キメラプラスミド pGST-AtNCED3 を構築した。大腸菌JM109株を pGST-AtNCED3 または pGEX4T-1 で形質転換し、L培地中で37℃で培養した。OD600 が約0.5になったところで isopropylβ-D-thiogalactopyranoside (IPTG) を加え、17℃で12時間培養を続けた。大腸菌を回収し、洗浄後、抽出バッファー [10 mM Tris-HCl (pH8.0), 5 mM MgCl2, 5% glycerol, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), および 0.1 mM dithiothreitol (DTT)] に懸濁した。融合蛋白質の精製およびトロンビンによる切断は、glutathione-Sepharose 4B [the GST gene fusion system (Amersham Pharmacia Biotech)]を用いてその説明書に従って行った。蛋白質の濃度は protein assay kit (Bio-Rad, CA, USA) を用いて決定した。
【００８７】
ネオザンチン開裂酵素活性のアッセイを行った結果、GST-AtNCED3蛋白質とシス-ネオザンチンを含む反応液中に、予想される C25産物とザントキシンが検出されたことから、AtNCED3蛋白質はネオザンチン開裂活性を有することが確認された。同様の実験により、AtNCED1およびAtNCED5にもネオザンチン開裂活性が検出された。
【００８８】
[実施例１３] トランスジェニック体の作製
供試体としてシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ecotype Columbia）をもちいた。培養土を入れた直径9cmのプラスティック製ポットに野生型シロイヌナズナを播種し、22℃、16時間日長の条件下で6週間栽培したのち形質転換に用いた。
【００８９】
カナマイシン耐性マーカーとカリフラワーモザイクウィルスの35SプロモーターをもつpBE2113ベクター（Mitsuhara, I. et al. Plant Cell Physiol. 37：49-59 (1996)）からGUSレポーター遺伝子を無くしたベクター(pBE2113NOT）を作製し、シロイヌナズナから単離したAtNCED3のcDNAをそのBamHIサイトに正方向（センス方向）または逆方向（アンチセンス方向）につないだ。得られたベクターを三者混合法により土壌細菌（Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 (pMP90)）に導入した。目的の遺伝子を導入した土壌細菌をカナマイシン（Km）耐性により選択し、減圧浸潤法（Bechtold, N. et al. C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sci. 316, 1194-1199 (1993) ）をもちいて野生型シロイヌナズナに感染させた。感染後の植物体から乾燥種子を採取し、カナマイシンを添加した寒天プレートに播種して栽培し形質転換第1世代個体（T1）を選抜した。形質転換体第1世代から得られた形質転換体第2世代（T2）の種子をカナマイシン添加プレートに播種し、カナマイシン耐性を示すものから第3世代（T3）の種子を採取した。さらに、第3世代種子を同様にカナマイシン添加プレートに播種し、すべての種子が薬剤耐性を示すものをT3ホモのラインとして以後の実験にもちいた。最終的にAtNCED3遺伝子のセンス、アンチセンス形質転換体を２系統ずつ単離した。
【００９０】
[実施例１４] 形質転換体におけるAtNCED3遺伝子の発現の評価
シロイヌナズナ野生株及びAtNCED3遺伝子のシロイヌナズナ形質転換株におけるAtNCED3遺伝子の発現をノーザンハイブリダイゼーション法で評価した。
【００９１】
形質転換体におけるAtNCED3遺伝子の発現解析には、1ヶ月栽培した植物体を用いた。乾燥ストレスは、植物体を引き抜き濾紙の上で風乾させた（相対湿度50％）。上記の環境ストレス処理を行った植物体を液化窒素中で破砕し、全RNAを抽出 (Nagy, F., Kay, S. A. and Chua, N. -H. (1988) Analysis of gene expression in transgenic plants. In Gelvin and Schilperoort, eds, Plant Molecular Biology Manual, B4. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp 1-29)し、1％のアガロースゲル中で1レーン当たり20μgずつ電気泳動した。電気泳動後のゲルからRNAをナイロンメンブレンに転写し、32PでラベルしたＲＮＡプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションをおこなった（Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.）。
【００９２】
その結果、乾燥ストレスより前において、野生株では AtNCED3遺伝子の発現が認められないが、センス植物体ではすでにAtNCED3遺伝子の発現が認められた。一方、乾燥処理を行うと、野生株ではAtNCED3遺伝子の発現の乾燥誘導が認められたが、アンチセンス植物では乾燥ストレス処理を行ってもAtNCED3遺伝子の発現は認められなかった（図１３）。
【００９３】
[実施例１５] 形質転換体における内生ABA量の評価
シロイヌナズナ野生株及びAtNCED3遺伝子のシロイヌナズナ形質転換株における内生ABA量の測定をした。
【００９４】
シロイヌナズナ野生株及び形質転換体における内生ABA量は、1ヶ月栽培した植物体を用いた。試料を液体窒素中でホモジナイズし、水-メタノール（20-80％）で2回抽出した。[2H3]ABA を加えた後、抽出物を濃縮し、標準的な溶媒分画を行い酢酸エチル可溶酸性画分を得た。Bond Elut カートリッジ（C18 およびDEA, Varian）を用いて以前記載された方法に従って精製を行った（Wijayanti, L. et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1533-1535, 1995）。乾燥させていない植物から精製した試料は Senshu Pak ODS-2101-N カラム（100mm長, 内径6mm）（Senshu Scientific Co.）を用いてHPLC分析を行った。分析条件は以前に記載されたものと同様にした（Wijayanti, L. et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59: 1533-1535, 1995）。精製された試料は、エーテル含有ジアゾメタンでメチル化し、GC-SIM分析を行った。
【００９５】
その結果、野生株に対してセンス植物体ではABA量の上昇が、アンチセンス植物体ではABA量の減少が認められた（図１４）。
【００９６】
[実施例１６] 乾燥耐性の評価結果
得られた形質転換植物の種子を、栄養塩類を含む寒天プレート（Valvekens, D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5536-5540 (1988)）に播種し上記の栽培条件下で2週間栽培して下記の実験に供した。
上記植物体を土（バーミキュウライト：パーライト＝１：１）を入れた直径9cmのプラスティック製ポットに４個体ずつ移植し、22℃、16時間日長の条件下で栽培した。播種3週間後（移植の２週間後）に植物体の入ったポットを水やりを止めることによって無潅水状態にし、自然に植物体に乾燥ストレスを与えた。無潅水処理開始14日後、17日後に写真撮影した。無潅水処理開始後14日にはAtNCED3遺伝子をアンチセンス方向に導入した植物体は枯れた（図１５）。これに対し、センス方向に導入した形質転換植物体では、萎れはほとんど見られなかった。
無潅水処理開始17日後には野性株も枯れたが、センス方向に導入した形質転換植物体は乾燥に対する有意な耐性を示した（図１６）。
【００９７】
【発明の効果】
本発明により、ストレス耐性が上昇または低下した植物を作出することが可能となった。ストレス耐性が上昇した植物は、これまで生育が不可能であった厳しい環境の土地でも生育することができる。また、ストレス耐性が低下した植物は、雑草などに応用することができる。本発明の方法を農作物に適用すれば栽培面積の拡大と収量の増大が期待できる。
【００９８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】乾燥または再吸水処理によるCPRD65遺伝子の発現のノーザンブロット解析を示す図である。生育８日目のカウピーを 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, および 12時間の乾燥処理、または、10時間乾燥処理を行った後、0, 1, 2, 5, 10, および 24時間再吸水処理し、全RNAを調製した。各レーンには、10μgの全RNAをロードした。RNAは 1％アガロースゲルで分画し、ナイロン膜にブロットした後、[32P]ラベルした CPRD65クローンのcDNAインサートをプローブにしてハイブリダイズさせた。
【図２】 CPRD65、VP14（Zea mays のネオザンチン開裂酵素, Schwartz, S.H. et al., Science. 276: 1872-1874, 1997）、および LeNCED1 蛋白質（Lycopersicon esculentum のネオザンチン開裂酵素, Burbidge, A. et al., J. Exp. Bot., 47: 2111-2112, 1997; Burbidge, A. et al., Plant J., 17:427-431, 1999）の予想アミノ酸配列の比較を示す図である。ハイフンは、アライメントを最適化するために挿入したギャップを表す。囲みは同一のアミノ酸を表す。影を付けた部分は、類似したアミノ酸を表す。
【図３】カウピー品種 2246のゲノムDNAのサザンブロット解析を示す図である。ゲノムDNA（各レーン10μg）をEcoRI(E)、HindIII(H)、およびXbaI(X)で切断し、1％アガロースゲルで分画した後、ナイロン膜に転写した。フィルターは、[32P]ラベルした CPRD65 cDNA断片とハイブリダイズさせた。「Ａ」と「Ｂ」は、それぞれストリンジェンシーの異なるハイブリダイゼーションの条件を表す（実施例参照）。DNA断片のサイズマーカーはkbpで示されている。
【図４】 (A) 高塩（NaCl）、高温、低温、およびアブシジン酸処理（ABA）によるCPRD65遺伝子の誘導のノーザンブロット解析を示す図である。処理後、図示した時間にカウピーから全RNAを単離した。各レーンには、全RNAを10μgずつロードした。各レーンの上に処理時間（時間）を示した。 (B) 10時間の乾燥処理の有無によるCPRD65遺伝子のノーザンブロット解析を示す図である。各レーンには、カウピー品種 2246の葉、茎、および根から単離した全RNAを10μgずつロードした。RNAは、1％アガロースゲルで分画し、ナイロン膜にブロットした後、[32P]ラベルした CPRD65 cDNAインサートをプローブにしてハイブリダイズさせた。
【図５】 GST（A）または GST-CPRD65 組換え蛋白質（B）のカロテノイド代謝のHPLC特性を示す図である。シス-ネオザンチンを基質として含む反応混合液を用いた。cN; シス-ネオザンチン、C25; C25産物。
【図６】 CPRD65N-sGFPキメラ蛋白質のプロトプラストにおける色素体ターゲティングを示す図である。35S-sGFP構築物（A, C, E）または 35S-CPRD65N-sGFPキメラ構築物（B, D, F）を A. thaliana から調製したプロトプラストにポリエチレングリコール（PEG）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクトしたプロトプラストを光学顕微鏡（A, B）、または緑（E, F）または赤（C, D）の干渉フィルターを付けた蛍光顕微鏡で観察した。E および F は GFP、C および D は葉緑体の局在を示す。
【図７】乾燥におけるABAの蓄積とCPRD65遺伝子発現との関係を示す図である。図１のナイロンフィルター上の放射活性を定量し、図示したようにプロットした。ABAの定量方法は、実施例を参照のこと。エラーバーは標準誤差を示す。実験は３回行った。
【図８】器官毎に分離したカウピーを乾燥処理した時の内生アブシジン酸（ABA）の蓄積を示す図である。ABAの定量方法は図７（実施例７）と同様に行った。
【図９】 AtNCED3とCPRD65のアミノ酸配列を比較を示す図である。ハイフンは、アライメントを最適化するために挿入したギャップを表す。囲みは同一のアミノ酸を表す。影を付けた部分は、類似したアミノ酸を表す。
【図１０】 AtNCED1、2、3、4、および 5 のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。ハイフンは、アライメントを最適化するために挿入したギャップを表す。囲みは同一のアミノ酸を表す。影を付けた部分は、類似したアミノ酸を表す。
【図１１】 AtNCED1、2、3、4、5、および CPRD65 のアミノ酸配列とデータベース上にある関連する配列との関係を調べるため系統樹解析を行った結果を示す図である。LeNCED1はトマト由来（Ac.No. Z97215）、VP14はトウモロコシ由来（Ac.No. U95953）の蛋白質を示す。
【図１２】各種ストレスに対するAtNCED遺伝子の発現を示す図である。
【図１３】 AtNCED3の形質転換体におけるAtNCED3遺伝子の発現を示す図である。上段は乾燥処理前、下段は乾燥ストレス処理後の植物のAtNCED3遺伝子の発現を示す。AtNCED3遺伝子のセンス鎖を発現する植物体（過剰発現）（AおよびB）ならびにアンチセンス鎖を発現する植物体（発現抑制）（CおよびD）は、それぞれ２系統用いて試験を行った。
【図１４】 AtNCED3の形質転換体における内生ABA量を示す図である。野生型に比べ、AtNCED3遺伝子のセンス鎖を発現する植物体（過剰発現）（AおよびB）では内生ABA量の上昇が、アンチセンス鎖を発現する植物体（発現抑制）（CおよびD）では内生ABA量の減少が認められた。
【図１５】ネオザンチン開裂酵素トランスジェニック植物の乾燥耐性試験の結果を示す図である。潅水停止から14日後の植物とその植物の葉の相対水分量を示す。
【図１６】ネオザンチン開裂酵素トランスジェニック植物の乾燥耐性試験の結果を示す図である。潅水停止から17日後の植物を示す。
Claims (13)
- 植物のストレス耐性を上昇させるために用いる、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードするDNA；
（ａ）配列番号：６、１０、または１２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号：６、１０、または１２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質であって、配列番号：６、１０、または１２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有する蛋白質、または
（ｃ）配列番号：５、９、または１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと、0.1x SSC, 0.1% SDS (60°C)で15分の洗浄を二回行うというストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードする蛋白質。 - 植物のストレス耐性を低下させるために用いる、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNAであって、
（ａ）ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、
（ｂ）ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写産物を開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、または
（ｃ）植物細胞における発現時に、共抑制効果により、ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現を抑制させるRNAをコードするDNA、
該ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質が、下記（１）から（３）のいずれかに記載の蛋白質であることを特徴とするDNA；
（１）配列番号：６、１０、または１２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
（２）配列番号：６、１０、または１２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなる蛋白質であって、配列番号：６、１０、または１２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％以上の同一性を有する蛋白質、または
（３）配列番号：５、９、または１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡと、0.1x SSC, 0.1% SDS (60°C)で15分の洗浄を二回行うというストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡがコードする蛋白質。 - ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質がアラビドプシス由来である、請求項１または２に記載のDNA。
- 請求項１から３のいずれかに記載のDNAが導入された形質転換植物細胞。
- 請求項４に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
- 請求項５に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
- ネオザンチン開裂活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の発現が野生型に比べ上昇または低下している請求項５または６に記載の植物体。
- アブシジン酸量が野生型に比べ上昇または低下している、請求項５から７のいずれかに記載の植物体。
- ストレス耐性が野生型に比べ上昇または低下している、請求項５から８のいずれかに記載の植物体。
- 請求項５から９のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
- 請求項１から３のいずれかに記載のDNAを保持するベクター。
- 請求項５から９のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項１から３のいずれかに記載のDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
- 請求項１から３のいずれかに記載のDNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物のストレス耐性を上昇または低下させる方法。
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