JPH06506595A

JPH06506595A - 雄性不稔性植物、雄性不稔性植物の製法および該方法で使用する組換ｄｎａ

Info

Publication number: JPH06506595A
Application number: JP4509297A
Authority: JP
Inventors: ファン　テューネン　アドリアヌス　ヨハネス; ファン　デル　メール　イングリッド　マリア; モル　ヨゼフス　ニコラース　マリア
Original assignee: Mogen International NV
Current assignee: Mogen International NV
Priority date: 1991-04-16
Filing date: 1992-04-15
Publication date: 1994-07-28
Also published as: CZ214593A3; HU9302930D0; AU663871B2; HU219543B; TR27026A; US6005167A; SK111693A3; IL101592A0; HUT65482A; WO1992018625A1; CA2105592A1; UA39169C2; IE921206A1; BR9205894A; IL101592A; AU1698992A; EP0513884A1; RU2170255C2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】雄性不稔性植物、雄性不稔性植物の製法および該方法で使用する組換ＤＮＡ発明の属する分野本発明は組み換えＤＮＡ　、より特定的には植物の遺伝子操作に関連する組み換えＤＮＡに関するものである。本発明は、更に該組み換えＤＮＡの発現に基く核によりコードされた雄性不稔性を呈する植物、並びに育性または無性繁殖可能な、もしくはこれら両者の可能な該植物の部分にも関連する。

技術的背景成る種の様々な品種間の他家受粉により誘導された種子が、自家受粉により誘導された種子の子孫と比較して、収量、環境適合性並びに疾病耐性等においてより良好な諸特性をもつ子孫を与えることが、かなり以前から認められていた。この効果は一般的にヘテローソス効果と呼ばれている。その結果として、できる限り多くの農業並びに園芸作物のハイブリッド種子を得ることが種子工業の目的となっている。というのは、該ハイブリッド種子が高い商品的価値を有しているからである。

しかしながら、不幸なことに、多（の作物としての植物はその同一固体上に雄性および雌性繁殖器官を所有しており、これは他家受粉よりも自家受粉を強（促進する。従って、他家受粉による種子を得るためには、（適切に機能する）花粉が存在しないことによる、自家受粉不能な受容体植物を得ることが望ましい。次いで、これらの雄性不稔性株（ｐｌａｎｔｓ）または雌親株を雄性稔性ドナー植物との他家受粉において使用して、ハイブリッド種子を製造する。

ハイブリッド種子を大量に製造するためには、通常不稔性雄株および稔性雄株を圃場で一緒に育成し、他家受粉を可能とし、その後ハイブリッド種子を選別する。使用した不稔性雄株の型に応じて、ハイブリッド種子の選別または分離を収穫前に、即ち非−ハイブリッド種子を生成する雄性稔性ドナー株を破壊または除去することにより、あるいは収穫後に、例えばトウモロコシにおける種子の色、または他の容易に識別し得る表現型等のマーカーを基にして実施する。該収穫前の選別は、該雄性稔性親株が該雄性不稔性親株から識別可能であり、かつ実質的に除去もしくは破壊できる場合に可能となる。また、該雄性不稔性座か選別可能なマーカー（例えば、除草剤耐性）と密接に関連している場合には、ハイブリッド種子を有する該雄性不稔性株は適当な淘汰圧を適用することにより該雄性稔性株を凌駕し得る。

雄性不稔性親糸として、例えば物理的に除雄した植物を使用するか、または入手可能であれば細胞質もしくは核によりコードされた雄性不稔性変異体を使用する。かかる天然の雄性不稔性株は、調製に労力を要し、付随的な望ましからぬ諸特徴を有し、維持並びに増殖が困難であり、予測不能な遺伝を有し、もしくは商業的に興味ある作物における天然の雄性不稔性変異体の入手が制限されている等の諸欠点をもつ。

最近になって初めて、遺伝子操作で核によりコードされた雄性不稔性株がハイブリッド種子を生産するのに利用でき、かつ多くの天然の雄性不稔性変異体のもつ諸欠声１の少なくとも幾つかを示さないことが公知となった。

本技術の現状国際特許用＠Ｗｏ　９０１０８Ｂ３０．１ｃＩは一般的に復元可能な雄性不稔性株の産生法を提案しており、該方法は本質的にａ）タンパク阻害剤をコードする遺伝子またはｂ）所謂キラー遺伝子の何れかを発現することからなり、該両遺伝子は花の雄株て発現され、や（および関連組織の死に導へ例示されたキラー遺伝子は、発現された場合にミトコンドリアの代謝に影響を及はすものである。

国際特許出願ＷＯ９０１０８８３１，ＩｃＩには、分断遺伝子（ｄｉｓｒｕｐｊｅｒ　ｇｅｎｅ）の発現により細胞一呼吸を阻害し、これによりミトコンドリアの機能を阻害して、場合によってはこれら遺伝子を発現する細胞か死滅することを開示している。好ましい分断タンパクはａ）哺乳類脱共役タンパク（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ：　ＵＣＰ）　、ｂ）Ｆ＋−ＡＴＰアーセのβ− １サブユニツトに対する遺伝子の変異型（該変異は該サブユニットが機能的ＡＴＰ−ノンターセへの組み込み能を阻害するようなものである）　、（ｃ）　Ｆｏ −ＡＴＰアーセの０１１１遺伝子をコードするサブユニット９の変異かつ合成型、（ｄ）　ミトコンドリアへのタンパクの輸送を途絶するように変異させた型のミトコントリアングナルペプチド、（ｅ）分断融合タンパク（ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の発現をもたらす、酵母由来のβ−サブユニット（ＡＴＰアーゼ）遺伝子とＬ三旦由来のβ−ガラクトシダーセ遺伝子との間での融合を含む遺伝子−構築体である。本特許明細書によれば、好ましくはかかる発現はタベートまたは花粉〜特異的プロモータの制御により調節されるべきである。

国際特許出願ＷＯ８９／＋０３９６．　ＰＧＳは、一般的に植物の核ゲノムを、ＲＮＡをコードするＤＮＡを含むように維持された所謂雄性不稔性ＤＮＡまたは該雄性不稔性ＤＮＡを発現する任意の雄ズイ細胞として機能しおよび／または該細胞を発生する適当な代謝を妨害することができるポリペプチドで形質転換して、好ましくはこれによりかかる雄ズイ細胞全てを死滅させることにより雄性不稔性株を生産する方法を提案している。このような雄性不稔性ＤＮＡの例はＤＮアーゼ類、ＲＮアーセ類プロテアーゼ類または植物ホルモン合成酵素、例えばサイトカイニン等をコードするものである。また、該植物の雄ズイ細胞において自然に転写されたＤＮＡストランドに相補的なりＮＡストランドをコードするアンチセンスＤＮＡから雄性不稔性ＤＮＡ類を選別することも提案されている。ＴＡ２９遺伝子、ＴＡ２６遺伝子およびＴＡ１３遺伝子とは別に、タバコ由来の全てのタベートー特異的遺伝子が如何なる遺伝子を意味するかに関する何等の解決の糸口もない。コルツノ−（Ｋｏ　ｌ　ｔ　ｕｎｏｗ）等（１９９０）の論文では、該クローンＴＡＩ３およびＴＡ２９は所謂グリシンに富むタンパクＭＣＧＩｙｃｒｎｅ　ＲｉｃｈＰｒｏｔｅｉｎｓ）をコードするものとして同定され、一方でクローンＴＡ２６は依然として未知の性質をもつｃＤＮＡと対応しているとされた。

欧州特許出願ＥＰ−Ａ−０３２９３０８パラデインハイブリツド（Ｐａｌｌａｄｉｎ　Ｈｙｂｒｉｄｓ）においては、雄性不稔性株の生産方法が提案されており、該方法は本質的に機能性花粉粒の産生を遮断するか、もしくは機能性花粉粒の産生を遮断する化学試薬または生理的ストレスに対して敏感な花粉粒を発現させるアンチセンスＤＮＡを含有する組み換えＤＮＡ配列を該植物のゲノムに挿入することにより遺伝的に形質転換された雌親株を生産する方法を提案している。好ましくは、該アンチセンス遺伝子は花粉−特異的プロモータの制御下で発現する。この特許出願明細書によれば、機能的な花粉粒の生産にとって本質的な遺伝子は小胞子中で、好ましくは前成熟分裂期において特異的に発現される遺伝子から選択される。小胞子特異的クローンの例はアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）由来のＬ４およびＬｉ２である。前成熟分裂遺伝子の一般的表示および表現上記載されたクローン以外には、発現を遮断すべき該遺伝子の特性に関連する教示は何等与えられていない。

ベレニジングブールクリステリークベテンンヤッペリークオンダーウイーズ（■ ｅｒｅｎｉｇｉｎｇ　ｖｏｏｒ　Ｃｈｒｉｓｔｅｌｉｊｋ　Ｗｅｔｅｎｓｃｈａｐｐｅｌｉｉｋ　Ｏｎｄｅｒｗｉｉｓ）によるＥＰ−Ａ　０R３５４５１は、アンチセンス遺伝子構築体を使用した花のカルコンシンターセ遺伝子の発現の阻害が花の彩りを変更することを記載している。この実験における該アンチセンス遺伝子は構成カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモータの制御下に置かれた。花の彩りが変更された植物は依然として稔性の花粉を生成することができた。

カルコンノンターセはフラボノイド生合成におけるキー−酵素である。この酵素はマロニル−ＣｏＡ由来の３種のアセテート残基および４−フマロイル−ＣｏＡの１種の残基の段階的縮合を触媒して、ナリンゲニンカルコンを生成する（ヘラ −＆）＼−ルブロノク（Ｈｅｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ、　１９８０）。この中心的な中間体の異性化および更なる置換によりフラボノイド類が生成される。フラボノイド類は花および果実の着色におけるキー−機能をもつことが知られている二次的な代謝産物である。

また、フラボノイド類は植物病原体に対する防禦（ラム（Ｌａｍｂ）等、　＋９８９）　、　ＵＶ−光に対する保護（ノユメルツアー（Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ）等、　１９８Ｂ）および結節の誘発（ロング（Ｌｏｎｇ）等、　１９８９）に関与していると思われる。フラボノイド類は、またオーキシン輸送の調節（ジャコブズ＆ラベリー（Ｊａｃｏｂｓ　ａｎｄ　Ｒｕｂｅｒｙ）、　１９８８）および昆虫に対する抵抗性（ヘディン＆ワーン（Ｈｅｄｉｎ　ａｎｄ　Ｗａａｇｅ）、　＋９８６）にも関係している。

このフラボノイド類の機能の多重性は該経路の種々の酵素をコードする遺伝子の該多重性に比例した複雑な調節を必要とする。例えば、アントシアニン生合成遺伝子の発現は花−特異性、光−依存性であり、かつ発生的に調節される（ファンツネン（ｖａｎ　Ｔｕｎｅｎ）等、　１９８８：　コース（Ｋｏｅｓ）、１９８９ａ）。しかしなから、他の組織におけるこれら遺伝子の発現はＵｖ−光、傷害発生または真菌の侵食により誘発することかできる（ディキノン（Ｄｉｘｏｎ）、　１９８６：コース（Ｋｏｅｓ）、　１９８９ａラム（Ｌａｍｂ）等、　＋９８９）。

二〇ＣＨ３−，Ａと、未成熟やく組織内で活性なフラボノイド合成遺伝子由来のプロモータ、例えばＣＨＳ−Ｊ　、　ＤＦＲ−ＡおよびＣＨＩ−Ｂとの比較はや（ボックス（ａｎｔｈｅｒ　ｂ。

Ｘ）と呼ばれる確実に保存された領域の存在を明らかにした（ファンツネン（ｖａｎ　Ｔｕｎｅｎ）等、　＋９８９）。該ＣＨ３−Ａプロモータの欠失解析は、該や（ボツクス自体かや（−特異的発現の原因とはならないが、該ＣＨ３−Ａプロモータ中に存在する他の配列と共に、やく−特異的発現の調節に関与することが示唆された（ファンデアメーア（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍｅｅｒ）等、　１９９０）。

１９８１年に、コー（Ｃｏｅ）等（＋９８１）は、健全と思われる白色の花粉がトウモロコツにおいて正常に機能しないことを観察し、顔料の合成または析出が花粉の機能にとって極めて重要であると示唆した。しかしながら、疑うつもりはないが、花粉の発現にフラボノイド類が関与することをこの論文では結論していない。我々の知る限りにおいて、その当時以降も、生きた花粉の発育中におけるフラボノイドの機能に関連する決定的な証拠は報告されていない。

同のヌクレオチド配列を意味する。

アンチセンス遺伝子　本明細書で定義したターゲット遺伝子と５０％を越える、好ましくは８０％を越える相同性をもつ遺伝子または該遺伝子由来のヌクレオチド配列を意味し、これはまた該ターゲット遺伝子に関して逆の５′〜３゛配向でプロモータに結合している。

遺伝子・ＲＮＡ分子および／またはポリペプチドとして発現することのできるヌクレオチド配列を意味する。

ハイブリッドプロモータ・天然には相互に結合しない、もしくは天然には該当する順序では存在しない複数のヌクレオチド配列または単一のヌクレオチドで構成されるプロモータを意味する。

抑制性遺伝子　遺伝子またはアンチセンス遺伝子であって、その発現が最終的にここで定義するようなターゲット遺伝子の発現を阻害するような遺伝子を意味する。

配列、または該配列由来のヌクレオチド配列を意味し、これらはＲＮＡ分子および／またはポリペプチドとして発現される。

回復遺伝子（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ）　ここに記載のターゲット遺伝子の一部と十分に同一、類似または相同性であって発現の際にここで定義したような抑制性遺伝子により生成される転写体と相補的に結合できる少なくとも１種のヌクレオチド配列を意味する。

ターゲット遺伝子　ユニで定義したような適当な抑制性遺伝子の適当な発現により発現が阻害される遺伝子を意味する。

本特許出願の目的にとって、数値的な塩基位置の全ての表示は目的の対応する遺伝子の推定転写開始サイトに関連する。

発明の概要本発明の目的は、雄性不稔性で、ハイブリッド種子の製造のために安全に利用できる植物（株）を提供することにある。更に、雄性不稔住棟を提供することも本発明の付随的な目的であり、該株は大規模にヘテロ接合雄性不稔性株を経済的に育利に生産するためのホモ接合型として得ることができる。

本発明は組み換えポリヌクレオチド類を提供し、これらは雄性不稔住棟を生産するのに育利に使用でき、本質的に（ａ）カルコン生合成経路の酵素をコードする該採肉のターゲット遺伝子の発現を阻害することのできる抑制性遺伝子、および（ｂ）該株のやく内で活性であり、該株の該やく内での発現を可能とするように該抑制性遺伝子に機能可能に結合したプロモータ、を含むことを特徴とする。

本発明による好ましいターゲット遺伝子はシンナメート４−ヒドロキシラーセ（Ｃ４Ｈ：　Ｅ、Ｃ，１，１４，１３，１１）、４−クマロイルーＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ：　Ｅ、Ｃ，６，２，１，１２）およびカルコンノンターセ（ＣＨ５：　Ｅ、Ｃ，２，３，１，７４）からなる群から選ばれる。ターゲット遺伝子として特に好ましいものは該採肉でカルコンシンターゼ（ＣＨ３）をコードする遺伝子である。

本発明の好ましい態様においては、咳抑制性遺伝子は該ターゲット遺伝子に対するアンチセンス遺伝子である。

もう一つの好ましい本発明の態様によれば、植物のやく内で活性な該プロモータは高レベルプロモータのフラグメントと、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）由来のｃｈｓ−Ａ遺伝子、ｃｈｉ−Ｂ遺伝子、ｃｈｓ−ＪおよびｄｆｒＡ遺伝子からなる遺伝子群のプロモータ領域から得ることのできるやくボックスとを含む。特に好ましい態様では、該高レベルプロモータはＣａＭＶ　３５Ｓプロモータと以下の配列をもつやくボックスとを含み、ＴＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＴ　（配列同定ＮＯ・２）該配列は該フラグメントの転写開始サイトに対して−９０なる位置に挿入されている。

本発明は、また雄性不稔住棟の生産方法をも提供し、該方法は（ａ）本発明による組み換えポリヌクレオチドを雄性稔性株の細胞に転移させる工程、（ｂ）組み込まれた該組み換えポリヌクレオチドをもつ細胞から完全な新規植物を発生させる工程、および（Ｃ）雄性不稔性の株を選別する工程を含む。

本発明のさらに別の態様は組み換え植物ゲノムに関連し、該ゲノムはそこに組み込まれた本発明による組み換えポリヌクレオチドを含む。

更に別の本発明の目的は、雄性不稔住棟の製造法において使用するための、以下のような配列をもつヌクレオチド配列に関連する。

ＴＮＧＡＧＧＷＧＡＭＲＤＡＲＷＷ　（配列同定Ｎｏ：　ｌ）ここて、ＮはＡＳＧ、ＣまたはＴてあり、ＷはＡまたはＴであり、ＭはＡまたはＣてあり、ＲはＡまたはＧであり、かつＤはＡ％ＧまたはＴである。本発明の更に好ましい態様は、雄性不稔住棟の製造法において使用するための、以下の配列群から選ばれる配列をもつオリゴヌクレオチド配列に関連する。

（ａ）　ＴＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＴ　（配列同定ＮＯ：　２）（ｂ）　ＴＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＡＴ　（配列同定ＮＯ：　３）（ｃ）　ＴＮＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴ　（配列同定ＮＯ：　４）（ｄ）　ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡ　（配列同定Ｎ０５）ここで、ＮはＡ、ＧＳＣまたはＴである。

本発明は、更に組み込まれた本発明による組み換えポリヌクレオチドをもつ雄性不稔住棟の自家愛情種子の生産法を提供し、該方法は（ａ）適当なフラボノイド化合物の存在下で、雄性稔性株の雌ずいと、同一の雄性不稔住棟の花粉とを接触させる工程、（ｂ）接離ずい上で該花粉を発芽させ、かつ該雄性不稔住棟を受精させる工程、および（ｃ）該株を結実させる工程を含むことを特徴とする。

上記方法において特に好ましくは、フラボノイド化合物はミリセチン、ケルセチンおよびケンベロールからなる群から選ばれ、好ましくは＋００　ｎｍ〜３μＭの範囲内の濃度で使用する。

本発明の更に別の好ましい態様においては、多数のへテロ接合雄性不稔住棟の使用により、経済的に育利にハイブリッド種子を生産する方法が提供され、該ヘテロ接合雄性不稔性株は所定の変種のホモ接合雄性不稔性株と同一の変種の雄性稔性株とを交雑することにより得られた。

本発明は、更に本発明の該株の何れかの交雑または自家受粉により得ることのできる（ハイブリッド）種子をも包含する。

本発明の他の好ましい態様はプラスミドｐＴｓ２０　、　ｐＴｓ２１およびｐＴＳ２２に関連する。

本発明の利点並び（こ適用分野は本発明の以下の詳細な記載から容易に理解されよう。

ロモータに挿入された。その下部には、種々のフラボノイド生合成遺伝子由来のや（ボックスか示されている。括弧内の数値は該やくボックスの起源となる遺伝子の転写開始サイトに対する相対的な位置を示す。

第２図は、キメラＧｔｌＳ−構築体またはキメラアンチセンス−ＣＨ３構築体を得るための種々のクローニング工程を模式的に示す図である。

第３図は雄性不稔性のハイブリッド種子の生産方法を模式的に示す図であり、このハイブリッド種子は結実（種子または果実）を必要としない作物に対して利用でき、Ｘは雌親変種であり、Ｙは雄親系であり、ＣａＭＶはカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータであり、ＡＢは該３５Ｓプロモータ中に挿入されたや（ボックスであり、ＣＨ３ａｓはアンチセンス力ルコンシンターセ遺伝子である。

第４図は雄性稔性であるハイブリッド種子の生産方法を模式的に示した図であり、このハイブリッド種子は本来的に結実性（種子または果実）である作物に対して使用でき、Ｃｔ（Ｓｓはセンス（正常な）カルコンシンターゼ遺伝子であり、全ての他の表示は第３図と同様である。

第５図は雄性稔性であるハイブリッド種子の生産法を模式的に示す図であり、このハイブリッド種子は本来的に結実性（種子または果実）である作物に対して使用でき、ＧＩＪＳｓはε、フリのβ−グルクロニダーゼ遺伝子であり、これらのＧＵＳｓ遺伝子およびＣＨ３ａｓ遺伝子は融合遺伝子を形成すべく物理的に結合されており、全ての他の表示は第３図と同様である。

第６図は雄性極性誘発性であるハイブリッド種子の生産法を模式的に示す図であり、このハイブリッド種子は本来的に結実性（種子または果実）である作物に対して使用でき、全ての表示は上記の図と同様である。

第７図は雄性極性誘発性であるハイブリッド種子の生産法を模式的に示す図であり、このハイブリッド種子は本来的に結実性（種子または果実）である作物に対して使用でき、ＮＳＰは回復遺伝子の非特異的部分であり、該回復遺伝子のＣＨ３５部分の推定共−抑制効果（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ　ｅｆｆｅｃ＋）を回避するだめのものであり、その他の全ての表示は上記の図と同様である。

発明の詳細な説明予想外のことに、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモータと融合したベチュニアハイブリダ（Ｐｅｊｕｎ換されたベチュニ了ハイブリダ（Ｐｅｊｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）株中のバクテリアβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レセプタ遺伝子の発現が、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモータにより誘発されたＧＬＩＳ発現と比較して、やく対花冠組織における著しく高い発現を結果することを見出した。また、発現がタベート細胞一層においても観測されたので、この細胞−堅持異性は変更された。このやくボックスを使用することなしに、該３５Ｓプロモータによりこれを達成することはできながった。

見掛は上は、以前信しられていたように該ＣＨ３−Ａ遺伝子中遺伝在中る付随的なンスー作用（ｃｉｓ−ａｃｊｉｎｇ）要素の存在なしに、このやくボックスはやく一特異的発現の誘発を可能とする。このハイブリッドプロモータはやく一特異的ではない。

というのは、発現が他の組織においても検出されるからである。このやくボックスはタベート細胞一層においても発現を誘発し得る。

該ＧＵＳ−レセプタ遺伝子について記載したものと同様な実験において、ベチュニの制御下に置き、この構築体を紫色の花を咲かせるペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ）　ＶＲハイブリッドの形質転換に使用した。該構築体を発現した形質転換株の選別後に、かつ該株を開花させた後に、これら株のうちの幾つがのやくが紫ではなく白色であることを見出した。白色のやくは初期の実験では全く得られず、そこでは該アンチャンスＣ）Ｉｓ−Ａ遺伝子がアンチセンス−ＣＨ３発現を制御する正常な３５Ｓプロモータと融合されていたが、該アンチセンス遺伝子は実際に該やく中に発現された。

かくして、ここで定義したやくボックスは、このやくボックスを高レベルプロモータ（その起源に制限はない）中に挿入された場合に、やく組織中の任意の遺伝子（またはアンチセンス遺伝子）のタベート細胞一層中での発現を誘発するへく機能することか結論付けられる。その上、や（組織中ての抑制遺伝子の発現のレベルは、ターゲット遺伝子の該やく組織中ての発現を阻害するのに十分に高いことも示される。

驚くべきことに、白色のやくをもつ形質転換したベチュニアハイブリダ（Ｐｅｊｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）株の自家愛情を試みた際に、該株は完全に雄性不稔性であることが明らかとなった。ペチュニアの天然変異系かあり、そこには機能性のカルコン異性化酵素は何等存在しない。カルコン異性化酵素はカルコン類のフラボノン類への転化に、即ち該フラボノイド生合成経路における更なる１工程に関与する。これら植物が雄性稔性であることは公知である。従って、この提案された方法に従って雄性不稔住棟を生産するためには、該生合成経路に関与してカルコンに導く酵素をコードする遺伝子群から抑制性遺伝子を選ぶ必要があるが、但しこれら遺伝子の阻害は概して該植物に対して致死的でないことを条件とする。

ペチュニアのアンチセンスＣＨＳ−Ａ遺伝子を正常なＣａＭＶ　３５Ｓプロモータの制御下に置いた他の実験において、このアンチセンス−Ｃｌ（Ｓ構築体が、タバコおよびジャガイモの花冠内の対応するターゲット遺伝子の発現を阻害する抑制性遺伝子としても使用できることを確立した。このことは、このアンチセンスによる方法かへテロ接合系においても有効であることを立証し、かつへＢ／３５Ｓプロモータの制御下でのペチュニア由来の該アンチセンス−ＣＨ３遺伝子で形質転換した場合に、異なる種の雄性不稔住棟を得ることができることを強く示唆している。

かくして、核によりコードされた雄性不稔住棟を生産する新規な方法が提供され、この方法はハイブリッド種子の生産で有利に使用できる。加えて、選択された変種株は、１種以上の組み換えポリヌクレオチドを該株の細胞内に挿入することにより遺伝的に形質転換される。該組み換えポリヌクレオチドは、本質的に１種以上の抑制性遺伝子を含み、該株のやく内で適性に発現された場合にカルコン生合成に関与する１種以上の酵素をコードする１種以上の遺伝子の発現を阻害することができる。

一般的に、雄性不稔住棟はカルコン生合成酵素をコードする適当なターゲット遺伝子の発現を阻害することにより得られ、この阻害は該ターゲット遺伝子に対する抑制性遺伝子の適切な発現により達成される。適当なターゲット遺伝子はカルコンの生合成に関与する酵素をコードする任意の遺伝子またはその直前のプリカーサ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ）から選択できるが、この群の遺伝子の阻害が該変種の他の所定の緒特性に負の影響を与えないことを条件とする。一般的に、ターゲット遺伝子はカルコンのプリカーサを転化する酵素をコードする遺伝子、例えばシンナメート４−ヒドロキシラーゼＣＣ４Ｈ：　Ｅ、Ｃ，Ｉ、１４．１３．　ＩＩ）、好ましくハ４−り７０イル−ＣｏＡリガーセ（４ＣＬ：　Ｅ、Ｃ，６，２，１，１２）、最も好ましくは該酵素の基質を直接カルコンに転化する酵素、カルコンシンターゼ（Ｅ、Ｃ，２，３，１，７４）である。

抑制性遺伝子は適当に別の範囲から選択でき、以下により詳細に説明するであろうセンスおよびアンチセンス遺伝子を包含する。適当なセンス抑制性遺伝子は、例えば該ターゲット遺伝子のＲＮＡ−生成物に対するリボザイム、または該ターゲット遺伝子の遺伝子生成物に対する（モノクローナル）抗体、あるいは入手可能であれば該ターゲット−酵素の選択的タンパク阻害剤をコードできる。また、該抑制性遺伝子は、本質的に該ターゲット遺伝子と同等であり、適切に発現された場合にはセンス−センス阻害（ｓｅｎｓｅ−ｓｅｎｓｅ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）または共−阻害（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）と呼ばれる依然として未知の機構に従って該ターゲット遺伝子を阻害するセンス遺伝子を含むことが可能である（国際特許出願ＷＯ９０／１１６８２：　ＤＮＡ植物工学社（ＤＮＡ　Ｐｌａｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎｃ、：り。

好ましくは、該抑制性遺伝子は該ターゲット遺伝子に対するアンチセンス遺伝子である。このアンチセンス遺伝子は、その長さおよび相同性が適当に高い阻害を保証するのに十分である限り、該ターゲット遺伝子に対して完全に相補的である必要はない。従って、該アンチセンス遺伝子は該対応するターゲット遺伝子の５ −末端、その３“−末端、もしくはその中間部分に対して（部分的に）相補的であるか、あるいは該ｔｆ応するターゲット遺伝子全体に対して（部分的に）相補的てあｔ〕得る。部分的に相補的であるとは、該アンチセンス遺伝子が該対応するターゲット遺伝子に対して完全に相同ではない状況を意味し、この完全に相同でないことは、例えば該アンチセンス遺伝子か該ターゲット遺伝子等に対して異型である（即ち、異なる起源から得られたものである）という事実に基く可能性がある。このア、チセ〉ス遺伝子は完全に合成されたものであってもよい。該アンチセンス遺伝子の選択に係わるこれら全ての変更は、相同のレベル、および／または全体としての相補性の程度か該ターゲット遺伝子の発現を阻害するのに十分である限り、本発明にとって決定的なものではない。

本発明の該抑制性遺伝子の適当な発現は該抑制性遺伝子をハイブリッドプロモータの制御下に置くことにより達成でき、該ハイブリッドプロモータは少な（とも１種のプロモータとやくホックスとを含み、該少なくとも１種のプロモータは植物（株）内で機能性であり、好ましくは高−レベルプロモータ、例えばＣａＭＶ　３５Ｓ　ＲＮＡ　（またはその誘導体）由来のものであり、該やくボックスは植物の成熟やく組織内で発現される遺伝子由来のものである。やくボックスの適当な代表的例は、特にＣＨ３−Ａ遺伝子、ＣＨ８−Ｊ遺伝子、Ｃ）ＩＩ−８遺伝子またはＤＦＲ−Ａ遺伝子等を由来とするものである。

好ましくは、該やくボックスはプロモータ中の−２０００と＋１との間、より好ましくは−１０００と＋１との間、最も好ましくは−１５０と−５０との間に挿入される。特に好ましい態様においては、該やくボックスは該ＣａＭＶ　３５Ｓプロモータの一９０位置に挿入される。

該やくホックスの起源となる植物源の選択は、該やくボックスが最終的に形質転換された宿主中で適当に機能する限りにおいて、それ程重要ではない。一般的に、該使用するやくボックスの相同が、該宿主植物のやく内での発現を増強することか知られているボックスについて、できる限り高いことが好ましい。このようなやくボックスは、該最終的な宿主植物、あるいは任意の他の植物内に生ずるやくボックスの既知の配列から適宜合成でき、もしくは異なる植物源等から誘導できる。

必ずしも必要ではないが、一般に組み換えＤＮＡまたはＲＮＡとして本発明による該ハイブリッドプロモータに融合された該抑制性遺伝子が位置する該遺伝物質は、植物の組み換えポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に組み込まれ、該組み換えポリヌクレオチドは選別可能な、またはスクリーニング可能な形質、例えば除草剤または抗生物質耐性と密接に関連しており、これら形質は形質転換された細胞の初期の選別または識別を可能とする。場合により、かかるマーカーの使用を省略することかできる。というのは、本発明による抑制性遺伝子の存在並びに発現が、該形質転換された植物が開花する場合には、これにより直接スクリーニングできるからである。組み換えポリヌクレオチド類は、通常プラスミドまたは他のレプリコン（例えば、ウィルス性ＤＮＡまたはＲＮＡ内に挿入されたもの）としてバクテリア中に維持されもしくは増殖される。また、組み換えポリヌクレオチド類は、例えば当分野の研究者には周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して、イン旦上三で増殖し得る。実際の方法は本発明にとって決定的なものではない。

植物物質中への組み換えポリヌクレオチドの組み込みは、植物バイオテクノロジーの分野における平均的な熟練者のなし得る範囲内にある幾つかの技術を利用して実施できる。該宿主植物の細胞内への遺伝物質の組み込み法は、該方法が妥当な成功の機会および同様に妥当な予測し得る結果を与える限りにおいて、特別本発明に関連するものではない。このような方法は必ずしも最終的に望まれる結果のある程度の選択の必要性を阻むものではない。しかしながら、これは植物遺伝子工学の分野における通常の実務であり、かつ過度の実験を必要とするものでもない。例示の目的で記載する幾つかの実施例はカルシウム／ポリエチレングリコール法（フレ：、／　ス（Ｋｒｅｎｓ）等、　１９８２：ネグルチュ−（Ｎｅｇｒｕｔｉｕ）等、　１９Ｂ？）　、！レクトロボレーンヨン法（ンリト（Ｓｈｉ　ＩＩ　ｉ　ｔｏ）等、　１９８５）　、マイクロインジェクション法（クロッスウェイ（Ｃｒｏｓｓｗａｙ）等、　＋９８６）　、（ＤＮＡまたはＲＮＡ−被覆）粒子衝撃法（クライン（Ｋｌｅｉｎ）等、　１９８７）　、ウィルス感染法等を利用した原形質体の形質転換に５１！連する。好ましくは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉυｍ）種の天然ＤＮＡ転移系を使用する。このアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃ＋ｅｒｉｕｍ）技術の範囲内では所謂バイナリ−ベクター（ベバン（Ｂｅｖａｎ）等、　１９８４）系の使用が好ましい。

植物細胞へのＤＮＡの転移に対する適当なバクテリアバックグラウンド、ベクターの選択、適当な性別マーカー、インキュベーション条件、培地および必要なりＮＡクローニング技術の使用は全く平均的な熟練研究者のなし得る範囲内にある。

この形質転換された植物物質の選別および／またはスクリーニングの後、文献に広範に記載されている方法（例えば、ホルシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）等、　１９８５を参照のこと）を利用して、該形質転換された物質を完全な植物に再生させる。

形質転換および再生に利用できる任意の植物部分を使用できる。

この形質転換および／または再生法自体は本発明にとって重要ではないが、植物細胞への遺伝物質の組み込み、植物細胞のゲノムへの該遺伝物質の（コピー）の安定な組み込みを達成でき、かつ該植物物質が再生されて苗条となり得、該苗条か後に根付け（または移植）可能であり、新規な完全な植物を発生するものでなければならない。この技術の選択は使用する特定の型の植物物質に、および／または当業者の好みに依存するであろう。

形質転換された植物を得た後、その所定の緒特性の存在および／または該所定の緒特性が発現される程度につき評価することができる。第一の評価は該抑制性遺伝子の発現レベルおよび該形質転換された植物の雄性不稔性の程度を含むことかてきる。引き続き、該雄性不稔性形質等の安定なおよび／または予測可能な遺伝を示す形質転換した植物を選別することができる。次いで、該くヘテロ接合）雄性不稔住棟を、直接ハイブリッド種子の生産のために使用でき、もしくはまたホモ接合雄性不稔住棟を生産するために、収集した花粉で自家受粉することができる。更に、ホモ接合雄性不稔住棟を、（ａ）適当なフラボノイド化合物の存在下で雄性不稔住棟の雌ずいと接置−の雄性不稔住棟の花粉と接触させる工程、および（ｂ）接離ずい上で該花粉を発芽させ、かつ該雄性不稔住棟を受精させる工程、および（Ｃ）該株を結実させることにより生きたかつ不稔性の花粉で雄性不稔住棟を自家受粉させる工程を含む方法により得ることができる。

該雄性不稔性形質株の自家受粉で使用する前に、カルコンの存在下で未成熟の花粉を更に成熟させることも可能である。

この方法において、特に好ましいフラボノイド化合物はケルセチン、ケンペロールおよびミリセチンである。このフラボノイド化合物は公知の花粉媒体、例えばｒＢＫ−培地」に、約１０ｎｍ−１ｏμＭ、好ましくは約＋００　ｎＭ〜３μＭなる最終濃度で添加できる。最適濃度は化合物毎にかつ種毎に、また推定上は内因性のフラボノイド化合物の生産が該雄性不稔性形質で阻害される程度によっても変えることができる。しかしながら、こ二に与えられる一般的な教示によれば、適当なフラボノイドの濃度は大掛かりな実験の実施なしに種々の状況に対して決定できる。

明らかに、幾つかのホモ接合雄性不稔住棟をもつことの利点は、迅速にヘテロ接合雄性不稔性種子を大量に生産することを可能とし、該種子はハイブリッド種子の大量生産に直接利用できる。

本発明はハイブリッド種子の生産に興味ある自家受粉可能な任意の植物で実施できる。

本発明の第二の局面においては、ホモ接合雄性不稔住棟を生産する方法が提供され、該方法は本発明によるヘテロ接合雄性不稔住棟を花粉（その発現は株の未成熟や（中におけるカルコンの一時的な存在により助けられる）で自家受粉して、インビボでのカルコン合成の阻害を克服することからなる。本発明の本局面の１態様はカルコンを投与して、遺伝子発現の阻害作用を補償することを含む。僅かに異なる態様は、遺伝子発現阻害の補償を、インビボで（一時的に）カルコンを生産させることにより実施することを含む。これは該抑制性遺伝子（こ加えて、誘導プロモータの制御下にある回復遺伝子を導入して、適当な誘導物質の添加を通して外的に該回復遺伝子の発現を制御し得るようにすることで達成できる。好ましくは、かかる回復遺伝子は、アンチセンス転写物（例えば、ロノ＼−）　（Ｒｏｂｅｒｔ）等、　＋９９０参照のこと）に対する相補的結合により、例えば該ターゲット遺伝子の少なくとも一部を含む、即ち発現の際に該アンチセンス遺伝子の発現の効果を阻害することのできる融合遺伝子を含有する。

上で簡単に記載した如く、稔性の誘導性回復は種子または果実に商業的価値があるハイブリッド作物においても必要である。明らかに、雄性不稔性は圃場での受粉を可能とするように改良して、種子または果実を収穫し得るようにする必要かある。かかる回復性は、例えば圃場内の作物に誘導物質を投与することにより誘発することかでき、かくして十分に高い回復遺伝子の発現を達成して、該アンチセンス転写物を中性化する。

は対照的に、本発明の方法は体細胞にとって有害な生成物、例えばＤＮアーセ、ＲＮアーセまたはプロテアーゼをコードする遺伝子の発現を必ずしも包含しない。結局、やく内で発現が生ずる限りにおいて、厳密な発生または組織−特異的な発現を必要としない。

本発明による雄性不稔性植物（株）は高度に不稔性であり、かつ完全に雌性両性であると考えられる。

更に、圃場または温室でのハイブリッド種子の大規模生産の際の、雄性稔性植物、即ち推定上自家受粉体をハイブリッド種子を生産する雄性不稔性植物から、変更されたやくの着色に基いて識別することができる。引き続き、該自家受粉体を分離し、もしくは破壊し、あるいは必要ならばその非−ハイブリッド種子を別途収穫することかできる。

本発明の方法のもう一つの利点はホモ接合雄性不稔性植物の生産能であり、これはへテロ接合雄性不稔性親糸を維持し並びに繁殖する上で大きな利点をもたらす。僅かに数種のホモ接合植物のみが必要であり、その限定された数のために当分野で周知の技術によりインビトロで増殖することができる。このホモ接合雄性不稔系は雄性稔性親系と交雑され、引き続き該へテロ接合雄性不稔性種子は圃場での大規模なハイブリッド作物の生産に使用される。この対応するハイブリッド種子の５０％は雄性不稔性であり、かつその５０％は雄性両性である。この比が自家受粉により商業的生成物（即ち、種子または果実）を高収率で得るのに不十分である場合、誘導物質を投与して該回復遺伝子の発現を活性化することによって雄性不稔性を゛部分的に回復させることにより、この比を変えることができる。

ＤＮＡの単離、サブクローニング、制限解析、および配列決定は、当業者には周知の標準的手順（例えば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、　１９８２を参照のこと）を利用して実施した。個々のペチュニア形質転換体からのＤＮＡの単離およびＤＮＡゲルプロット分析はコーグ（Ｋｏｅｓ）等、　１９８７の記載の如Ｘ実施した。

ＧｔｌＳ抽出および蛍光並びに組織化学的ＧＵＳアッセイ新鮮な物質を形質転換された植物から採取し、ＧＵＳアッセイで使用した。ＧＵＳ抽出はジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）等（＋９８７）により記載された如く、液体窒素およびダウエックス−１（Ｄｏｗｅｘ−１：　シグマ社（Ｓｉｇｍａ））と共に組織を粉砕することにより実施した。蛍光法によるＧＵＳ活性の測定はジエファージン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）等（１９８７）の方法に従って実施した。既知量の４ −メチルウンベリフェリルの添加後の蛍光強度の増加を測定することにより、該抽出物の急冷に対して蛍光測定値を補正した。タンパク濃度は標準物質としてウシ血清アルブミンを使用して、バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）プロティンアッセイにより測定した。

ＧＵＳ活性の組織化学的特定はコーグ（Ｋｏｅｓ）等（＋９９０）により記載された方法により実施した。染色前に、やくを剃刀で２つに切断した。やく中のバックグラウンドＧＵＳ活性を排除するために、ｐＨ８，０のＸ−ｇｌｕｃ染色溶液を使用した。

細胞の寸法における変動、基賀の組織内への浸入、およびバックグラウンド酵素活性に起因する人工産物を排除するために、我々は形質転換されたおよび形質転換されていない植物のやくにつき、この組織化学的アッセイを繰り返し実施した。単一細胞レベルでの分析のために、Ｘ−ｇｌｕｃ−染色組織を固定し、コーグ（ＫｏｅＳ）等の方法（１９９０）に従ってパラフィン中に浸漬した。ミクロトームを使用して、厚み７μｍの切片を切断し、その写真を光照射野顕微鏡法により撮影した。

フラボノイド類の検出１０個の蕾からとったやくを１ｍｌの２Ｍ　ＨＣｉ中で、１６時間インキュベートして、加水分解（１００℃にて２０分）した後、フラボノイド類を少量のイノアミルアルコールで抽出し、溶１液として酢酸　塩酸　水（３０：３：１０）を使用して、セルロースＴＣＬプレート上で分離した。

ＲＮＡの単離およびＲＮアーセ保護５〜７個のＩＦ（４０−５０ｍｍ）から採取したやくを、コーグ（Ｋｏｅｓ）等の方法（＋９８９）によりＲＮＡを単離するのに使用した。内因性ＣＨＳ　ｍＲＮＡをＲＮアーゼ保護アッセイにより検出したが、このアッセイはファンツー不ン（ｖａｎ丁υｎｅｎ）等の方法（１９８８）に従って、ｐＴＺｌＢＵ中にクローン化した完全寸法のＣＨ３（Ａ）　ｃＤＮＡをプローブとして使用して（コーグ（Ｋｏｅｓ）等の方法（１９８９））実施した。

インビトロでの花粉発芽標準的な温室条件下て植物を１８〜２２°Ｃにて成育させた。開花期における花から花粉を集め、３ｍＭのＨ，ＢＯ，、＋、７　ｍＭのＣａ（ＮＯ＋）＋、１０％のスクロース、０．７％の寒天を含むＰＨ５，８の固化した培地上で発芽させた。花粉を２４°Ｃにて２時間暗所でインキュベートし、かつピノ（Ｂｉｎｏ）等の方法（＋９８７）に従って１％の酢酸カーミンて染色した。

ラグメントとしてｐＲＡＪ　２７５　（ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）等、　１９８７）のＧＵＳ−：ｌ−ド領域を、ＣＨ３（Ａ）テイル（ファンデアミーア（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍｅｅｒ）等、　＋９９０）を含むＶＩＰ１２２のＳｍａｌサイトにクローニングし、ｐＴｓ１８を得ることにより形成した。このクローンｐＴｓ１８を５ａｉｌ　／Ｈ４ｎｄｌｌ＋フラグメントとしてプラスミドｐＴＺＩ８Ｒ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））に連結して、ｐＴＳ　ｌ　９を形成した。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したＶＩＰＩ０２のＣａＭＶ　３５Ｓプロモータ（ファンデアクロール（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ）等、　＋９８８）をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＴｓ１９に挿入し、ｐＴＳ２３を形成した（第２図をも参照のこと）。オリゴヌクレオチド５−ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＣＡＧ−３’　（、配列同定Ｎ０６）および５−ＣＴＧＣＡＧＡＴＴＴＣＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＣ−３’　（配列同定ＮＯニア）を相互にアニールし、Ｔ４キナーゼを使用して５ホスホリル化し、かつＥｃｏＲＶで消化した１丁Ｓ２３にクローン化して、ｐＴＳ２４を形成した。挿入されたや（ボックスの配向は該やくボックスに隣接する両制限サイトの一方を部分的に消化し、末端−標識されたフラグメントを配列ゲル（ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｇｅｌ）上を移動させることにより決定した。

全てのキメラＧＵＳ−構築体をＥｃｏＲ１／Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントとしてバイナリ−ベクターＢｉｎ　１９　（ベバン（Ｂｅｖａｎ）、　１９８４）に挿入した。

ＩＩ　キメラアンチセンス−ＣＨ３遺伝子の構集同様な合成やくボックスをも、ＣａＭＶ−アンチセンス−ＣＨ５（Ａ）−ｎｏｓ構築体を含有する、ＶＩＰ１０２のＣａＭＶプロモータ内のＥｃｏＲＶサイトにクローン化した（ファンデアクロール（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ）等、＋９８８）。配向およびクローン化したやくボックスの数は実施例Ｉに記載のように測定した。以下のアンチセンス− ＣＨ５（Ａ）構築体をペチュニア株ｐＴｓ２０（正常な配向の単一のボックスをもつ）　、ｐＴｓ２１（逆配向のやくボックスのコピー２個をもつ）およびｐＴＳ２２（正常な配向のやくボックスのコピー８個をもつ）に挿入した。全てのキメラアンチセンス−Ｃ）Ｉｓ（Ａ）構築体をＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄｌ１１フラグメントとしてバイナリ−ベクターＢｉｎ　１９　（ベバン（Ｂｅｖａｎ）、　＋９８４）に挿入した。

３５Ｓプロモータを含むｐＴＳ２４）または該アンチセンスーＣＨ５（Ａ）構築体（ｐＴｓ２０：　ｐＴＳ２１：　ｐＴＳ２２）を含有するバイナリ−ベクターを、プラスミドｐＲＫ２０＋３（ディツタ（Ｄｉｊｊａ）等、　＋９８０）を含む株を使用して、二股（ｊｒｉｐａｒｅｎｊａｌ）交配（ロンヤース（Ｒｏｇｅｒｓ）等、　１９８６）により、Ｅコリ１Ｍ８３　（メソンング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、　＋９７８）からアグロハクテリウムツメフ７ノエ、ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｊｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＬＢＡ　４４０４に転移させた。接合完了体を、ホルノユ（Ｈｏｒｓｃｈ）等により記載（＋９８５）された如く、ペチュニアハイブリダ（Ｐｅ＋ｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）の葉盤（ｌｅａｆ　ｄｉｓｃ）の形質転換のために使用した。葉磐は若い、開花していない株の大葉から調製した。ペチュニアハイブリダ（Ｐｅ＋ｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ’）変種Ｗ１１５を、該ＧＬＩＳ−慎築体による形質転換実験に使用し、かつペチュニアＶＲハイプリントを該アンチセンス−ＣＨ５（Ａ）構築体について使用した。

カナマイノン−含有培地上て苗条および根形成を誘導した後、これら株を土壌に配置し、かつ温室に移した。バイナリ−ベクターを含まない該ＬＢＡ４４０４株で処理した葉盤から再生（カナマイシンを含まない培地上）した株をコントロールとして使用した。

ＩＶ　ＧｌｊＳ−構築体を発現する形質転換された植物の分析遺伝子発現の調節に及ぼす該やくホックスの影響を研究するために、該ＧＵＳ−構築体をもつ形質転換された株を、実験部分に記載の方法を利用して、発現パターンにつき分析した。

ＡＢ／ＣａＭＶ　３５Ｓ−ＧＬｉＳ構築体を含有する約２５本の独立した形質転換されたペチュニア株およびコントロールＣａＭＶ−ＧｌｊＳ構築体を含有する２５本のベチュニ了株を解析した。導入した遺伝子の発現レベルか、所謂位置効果（ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃ（：ワイシング（Ｗｅｉｓｉｎｇ）等、　１９８８）のために独立した形質転換体間で異なる可能性かあるので、花冠中の外因性遺伝子の（ＪｊＳ活性を、各独立した形質転換体のやく内に見られる活性測定の内部標準として使用した。該ハイブリッドプロモータ構築体を含む植物に対する平均の比（即ち、−緒に採取した全ての植物に対する比）は該コントロールプロモータ構築体の平均比よりも高かった。これが有意であるか否かを検討するために、全ての別々の測定値をウイルコキノンランクテスト（Ｗｉ　１ｃｏｘ。

ｎ　ｒａｎｋ　＋ｅｓＤにより解析した。ａ＜０．０５で、Ａ８／ＣａＭＶ　３５Ｓ−プロモータＧＵＳ構築体を含有する形質転換体におけるやく対花冠のＧＵＳ活性は、コントロールＣａＭＶ構築体を含有する形質転換体と比較して、有意に高かった。このやくボックスの存在は花冠における活性と比較して、やく中におけるＣａＭＶ誘発性ＧＵＳ活性をファクター３だけ増大する。

該ＣａＭＶプロモータ内への該やくボックス配列の挿入が定性的な様式でや（内でのその発現を変更するか否かを決定するために、細胞型特異的ＧＵＳ発現を組織化学的に追跡した（実験部分を参照のこと）。断面において、ペチュニアのやくは（内側から外側に）や（隔の柔細胞に取り囲まれた維管束筒、４個の胞子形成組織（花粉）を含むやく室、および内被を含む。やく室の各々は胞子形成細胞の成育において機能する特定の細胞（タベート）の層により包囲されている。やく発育の後期段階で、該や（室は口辺細胞において破裂して花粉粒が遊離する。

多重独立ＣａＭＶ−ＧＵＳ形質転換体の部分したやくを該ＧＵＳ基質Ｘ−ｇｌｕｃと共にインキュベートしたところ、該やくの殆と全ての異なる細胞型においてＧＵＳ活性を表す濃い青色を発現した。このＣａＭＶプロモータは該維管束筒、や（隔および内被内にＧＵＳ活性を誘発したが、タベート細胞内にはＧＵＳ活性は何等観察されなかった。

ｐＨｓ、ｏにおける、形質転換されていないコントロール植物のや（には染色は観測されなかった。該染色バッファーのｐＨを７に下げると、形質転換されていないやく組織中にバンクグラウンド染色が観測されたので、全ての染色実験はｐＨ８，０で実施した。単一細胞レベルでの該ＣａＭＶ−ＧＵＳ形質転換やくの検査は、該ＣａＭＶ−ＧＵＳ形質転換やくか、タペート細胞以外の全ての細胞型において青色の沈殿を生成することを示した。該ＡＢ／ＣａＭＶ　３５Ｓプロモータにより誘発されてＧＵＳ遺伝子を発現する多重独立形質転換体の組織化学的分析は、正常なＣａＭＶ−ＧＵＳ発現体に比して僅かに異なるＧＩＪＳ染色パターンを示した。この正常なＣａＭＶ−ＧＬＩＳ染色パターンの他に、該タペート細胞の鮮やかな青色染色が見られる。このタペート細胞における青色の沈殿は単一細胞レベルではより一層明白である。蛍光法および組織化学的ＧＵＳアッセイ両者は、該ＣａＭＶプロモータへの該やくボックス挿入の明らかな効果を、ＧＵＳ発現のレベルにおけるのみならず、このハイブリッドプロモータにより誘発されるＧＵＳ発現の細胞型特異性において達成されることを示している。

■　該アンチセンス−ＣＨ５（Ａ）構築体を発現する形質転換された植物の分析全体どして３５末の独立したペチュニア（ＶＲハイブリッド）形質転換体を得、七の内の５本の植物は低下されたやく着色を呈する花を咲かせた。花冠の着色の阻害とやくの着色の阻害との間１″は何等相関性は見られなかった。着色されＴ −または着色されていないやくと正常に着色された花冠または着色性の低下した花冠のあらゆる組み合わせが見られた。形質転換に使用した３種の全ての構築体（即ち、ｐＴｓ２０：　ｐＴｓ２１：　ｐＴＳ２２）により、白色のやくが得られた。従って、やくの阻害は該挿入されたやくボックスの数および配向には無間係であるように思われる。ペチュニアＶＲハイブリッドのｐＴｓ２０横策体（正常な配向の該やくボックスのコピー１個）による形質転換は、ｌｌａの独立した形質転換株を与え、その内の５株は正常な表現型を示し、また他の５本の株は花冠の低下した着色性を呈し、１本の株は着色された花冠と白色のやくとをもつ花を形成した。ｐＴｓ２１　（逆配向の該やくホックスのコピー２個）による形質転換は１５本の独立した形質転換体を与え、その９本の株は何等効果を示さず、５本の株は低い花冠着色性をもつ花を形成し、その内の２本の株は白色のやくをちち、残りの１本の形質転換株は白色のやくと、野性型イニＷ色さねた花を存していた。ｐＴＳ２２（正常な配向の該やくボックスのコピー８個）を含む９本の独立した形質転換体の内、７本の株は野性型の表現型を有し、１本の株は低下された花冠着色性を呈する花を有し、かつ１本の株は白色のやくと正常に着色された花冠とをもつ花を咲かせた。

やくの青色性の低下がやくにおけるＣＨ３ｍＲＮＡレベルの減少に起因するか否かを調べるために、全ＲＮＡを白色やくと紫色のやくとから単離し、ＲＮアーセ保護法により分析した。この保護実験においては、プローブとして＋２Ｐて桿識したアンチセンスＶ３０−Ｃ）Ｉｓ　ＲＮＡを使用し、内因性Ｖｌｉ’　Ｃ）Ｉｓ転写体を４種のサブフラグメントに消化した。やく着色の阻害はやくにおけるＣＨ３定常状０ｍＲＮＡレヘルの特異的な減少を伴うことが分かった。

驚いたことに、連鎖分析のための該形質転換された株の自家−交雑中に、白色やくが不稔性であることか明らかとなった。着色されていないやくをもつ形質転換体は、自家受粉後に成熟した健全な外観の種子プールを与えなかった。極めて稀にのみ幾らかの種子か形成されたか、これらは発芽しなかった。

やく（および花粉）の発育のとの段階で白色孔粉粒が退化し始めるかを決定するために、部分された異なる発育段階の白色やくおよび花粉をＲ微鏡観察下で分析した。該白色やくの発育は正常なペチュニアやくの発育から大きなずれを示さなかった。しかしながら、花粉粒は西分子、即ち初期小胞子段階後に発育の停止が見られた。白色やく由来の花粉のインビトロ発芽において、花粉管は形成されないことか示された。

この花粉発育の初期段階はフヨボノイド遺伝子発現の開始と一致する。これらのデータは該初期三核段階における花粉発育中のフラボノイド類の推定的機能を示す。従って、例えば回復遺伝子の合成を誘発することによる花粉発育の補助はほぼこの段階て開始すべきであると結論ずけることができる。

Ｆ、物質の存在を確認するために、白色のやくをもっ雄性不稔性形質転換体をペチュニア変種Ｖ３０て受粉した。この雄性不稔住棟は完全に雌性徳性てあった。

該初代形質転換体の子孫の分析は、組み込まれた形質が安定であり、か−っ予測可能な様式でその子孫に遺伝され得ることが立証された。白色花粉をもつペチュニア不稔性形質転換体をペチュニアハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）（Ｖ３０）で交雑し、そのＦ、子孫を「白色花粉」表現型および挿入断片の存在両者についてサザーンブロソト法により分析した。ＤＮＡを数種の子孫株の葉から抽出し、サザーンフロ。

ト法により分析したところ、１個の挿入断片をもつアンチセンス表現型の完全な共−分離か見られた。

実施例ｖ１　雄性不稔住棟の自家受精不稔性ペチュニア花粉をアンチセンス−ｃｈｓ株の穏やかな発現因子から採取し、フラボノール類、ケルセチン、ケンペロールまたはミリセチンとの組み合わせで自家受粉する目的で使用した。これらの株を、少数（１％未満）の生きた未成熟の花粉の存在に基いて選択した。これら花粉をインじトロで成熟させることが可能テアル。約１００　ｎＭ〜３μＭの範囲の最終濃度でケルセチン、ケンベロールまたはミリセチンを補充した通常の花粉培地（ＢＫ−培地・滅菌水中に１００　ｍｇ／ＩのＨＪＯ＋、３００　ｍｇ／ＩのＣａＮ０．．２００　ｍｇ／ｌの！ｉｆｇｓｏ、　、　ｔｏｏ　ｍｇ／ｌのＫＮＯ，および１２，５％のスクロースを含む）中に該不稔性花粉を入れ、ついで雄性不稔性母株の雌ずいにピペットで分配した。

該フラホノイド化合物は上記のような濃度ｖ２囲て在勤であり、最適濃度は個々の使用した雄性不稔住棟により大幅に変化するので、最適濃度で投与することは不可能である。これは、多分幾らかの抗−ｃｈｓ株か依然として少量のカルコンシンターセを生成しており、これか再生器官中に存在するフラホノイド化合物の濃度に影響を与えているという事実により説明できる。受粉後、結実を観測し、該種子を収積した。これらの種子は正常に発芽し、これら種子から完全に成育した株か得られた。

これら株の自家受粉を試みた際に、これらか依然として雄性不稔性である二とか分かった。これら株を雄性両性トナーとの交雑におけるホモ接合母株として使用して、ハイブリッド種子生産のためのへテロ接合雄性稔住棟を迅速に大量に得ることができる。

花粉の不稔性を克服するために使用した該化合物が多くの植物に見られるフラボノール類であることから、正常な植物の例えば雌すい、花冠組織および推定上メントール（ｍｅｎｔｏｒ）花粉（照射により不稔性とされた花粉）の抽出物を、本発明による雄性不穏住棟由来の花粉を補足するために使用することも可能である。

配列表（＋）一般的情報（１）出願人（、八）名前　モーゲノインターナショナル（ＭＯＧＥＮ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）〜、■。

（Ｂ）ストリート　アインノユタインベグ（Ｅｉｎｓｊｅｉｎｗｅｇ）　９７（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：　ＮＬ−２３３３ＣＢ（Ｇ）　を話番号　０７１−２５８２８２（Ｈ）ファクシミリ番号　０７１−２２１４７１（１、発明の名称　雄性不稜住棟、雄性不稔住棟の製法およびこの方法で使用する組み換えＤＮＡ（ｉｉｉ）配列数　７（ｉｖ）　コンピュータ読出し梨− （Ａ）媒体型　フロッピーディスク（Ｂ）コンピュータ　ＩＢＭ　ＰＣコンバーチプル（Ｃ）操作システム　ＰＣ− ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ノットウェアー　パチンチンリリース（Ｐａｊｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ）　＃１．Ｏ：バージョンＪ１．２５　（ＥＰＯ）（ｖ）現出願のデータ出願番号（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ｌに関する情報。

（１）配列特性（Ａ）長さ　１６塩基対（Ｂ）型−核酸（Ｃ）連鎖状９２本鎖（Ｄ）トポロジー　線状（ｉ　ｉ）　分子型　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｉｉｉ）仮想か　ノー（Ａ）生物　ペチュニアハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）（Ｄ）他のｆｆＮ：／標識・ＥｃｏＲＩ（ｘｌ）配列の表示　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　ＩＴＮＧＡＧＧＷＧＡＭ　ＲＤＡＲＷＷ　１６（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２に関する情報（ｉ）配列特性（Ａ）長さ　１６塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）連鎖状態　２本鎖（Ｄ）トポロン−線状（１１）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮想か　イエス（ｉｖ）　アンチ−センスか・ノー（ｖＤ　起源。

（Ａ）生物：ペチュニアハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）（ｘｉ）　配列の表示：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２ＴＡＧＡＧＧＴＧＡ（：　ＡＧＡＡＡＴ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋　３に関する情報。

（ｉ）配列特性。

（Ａ）長さ　１６塩基対（Ｂ）型：　核酸（Ｃ）連鎖状態・２本鎖（Ｄ）トポロジー　線状（ｊｌ）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮想か　イエス（宜Ｖ）　アンチ−センスか　ノー（Ｖｌ）起源（Ａ）生物：ペチュニアハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）（ｘｌ）配列の表示　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３ＴＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＡＴ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　４に関する情報：（１）配列特性。

（Ａ）長さ、１６塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）連鎖状態、２本鎖（Ｄ）トポロジー　線状（ｉｉ）　分子型　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｉｉｉ）仮想か　イエス（１ｖ）　アンチ−センスか　ノー（ｖＤ　起源・（Ａ）生物、ペチｓニアハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）（ｘｉ）　配列の表示：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４ＴＮにＡＧＧＡＧＡＡ　ＡＡＡＧＡＴ　１ｓ（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・５に関する情報・（ｉ）配列特性。

＋６　（Ａ）長さ、Ｉ６塩基対（Ｂ）型：　核酸（Ｃ）連鎖状０：２本鎖（Ｄ）トポロジー・線状（］１）分子型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮想か・イエス（ｉｖ）　アンチ−センスか二ノー（ｖｉ）　起源（Ａ）生物：ペチュニアハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）（ｘｉ）　配列の表示：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　５ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡ　ＧＴＡＡＴＡ　１６（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・６に関する情報（ｉ）配列特性・ ”　（Ａ）長さ　２８塩基対（Ｂ）型、　核酸（Ｃ）連鎖状態　２本鎖（Ｄ）トポロジー：線状（］ｉｉ分子型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）仮想か：イエス（１ｖ）アンチ−センスか：ノー（ｘｉ）　配列の表示：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ＋　６ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡ　ＧＧＴＧＡＣＡＧＡＡ　ＡＴＣＴＧＣ八（、２８（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　７に関する情報：おけるフラボノイド類の役ＩＩ（Ｒｏｌｅｓ　ｏｆ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　ｐｌａｎｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　１ｎｓｅｃｔｓ）。インプログレスインクリニカル＆バイオロジカルリサーチ（Ｉｎ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、　Ｖｏｌ、　２１３：生物学および医学における植物フラボノイド類（Ｐｌａｒ＋＋　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、　Ｖ、コブイー（Ｃｏｄｙ）、　Ｅ、ミドルトン（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ）　、］ｒ、　、　＆Ｊ、　Ｂ、　バーボーン（Ｈａｒｂｏｒｎｅ）編にューヨーク、アラン（Ａｌａｎ）　Ｒ，リス（Ｌｉｓｓ））、　ｐｐ、　８７−１００ヘケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）等、　Ａ、　（＋９８３）、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、　３０３．　ｐｐ、　１７９−１８０ホル：／　ユ（ｌ（ｏｒｓｃｈｌ　Ｒ，Ｂ、　、フライ（Ｆｒｙ）、　Ｊ、Ｅ、、ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎｎ）、　Ｎ、Ｌ、、アイヒホルツ（Ｅ＋ｃｈ１１ｏ１　ｊｚ）、　Ｄ、　、　Ｏジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）、　Ｓ、Ｇ、＆フレイリー（Ｆｒａｌｅｙ）、　Ｒ。

Ｔ、　（１９８５）植物中に遺伝子を転移するｔ：めの簡単かつ一般的な方法（Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ　ｇｅｎｅｓ　１ｎｔｏ　ｐｌａｎｔｓ）、　サイエンス（Ｓｃｉ■獅■ ｅ）、　２２７．　ｐｐ、　１２２９−１２３１ジ士コブズ（Ｊａｃｏｂｓ）、　Ｍ、＆ラハリーぐＲｕｂｅｒｙ）、　Ｐ、Ｈ，（＋９８８）天然産オーキシン輸送ｙ１節剤（Ｎａｔｕｒａｌ　ｏｃｃｕｒｉｎｇ　ａｕｘｉｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４１．　Ｉ）９．２４６−３４９ノエフ７−ノ’、　（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）、　Ｒ，Ａ、、プルゲス（Ｂｕｒｇｅｓｓ）、　Ｓ、Ｍ、　＆ヒルンユ（ＨｉｒＳｈ）、　Ｄ、　（１９８６）Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３．　ＰＰ、　８４４７−８４５１ノエフ７−ノン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ＞、　Ｒ，Ａ、　カバナー（Ｋａｖａｎａｇハ）、Ｔ、Ａ、＆ベバン（Ｂｅｖａｎ）。

Ｍ、Ｗ、　（１９８７）：　Ｇｕｓ融合　高級植物における高感度かつ多目的遺伝子融合マーカーとしてのβ−グルクロニダーセ（Ｇｕｓ　ｆｕｓｉｏｎｓ　β −ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ　ａｓ　ａ　５ｅｎｓｉｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｖｅｒｓａｔｉｌｅ　ｇｅｎｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｍａｒｋｅｒ　ｉｎ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ）、　ＥＭＢＯＪ、、@６．　ｐｐコーズ（Ｋｏｅｓ）、　Ｒ，Ｅ、、スベルト（Ｓｐｅｌｔ）、　Ｃ，Ｅ、、モル（Ｍｏｌ）、　Ｊ、Ｎ、Ｍ、　＆ゲラッッ（Ｇｅｒａｔｓ）、　Ａ、Ｇ、Ｍ、　（１９８７）ペチュニアハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉｓ　ｈｙｂｒｉｄａ）　（Ｖ２Ｏ）のカルコンシンターゼ多重遺伝子族（Ｔｈｅ　ｃｈａｌｃｏｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ　ｍｕｌｊｉｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　Ｐｅｔｕｎｉａ　Ｈｙｂｒｉｄａ　（Ｖ２Ｏ）　配列の相同、染色体局所化および進化の特徴（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｈ。

ｍｏｌｏｇｙ、　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　１ｏｃａｌｉｚａｊｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ａｓｐｅｃｔｓ）、　Ｐｌａ獅煤@Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１０．　ｐｐ、　３７５−３８５コーズ（Ｋｏｅｓ）、　Ｒ，Ｅ、、スベルト（Ｓｐｅｌｔ）、　Ｃ，Ｅ、　＆モル（Ｍａｔ）、　Ｊ、Ｎ、Ｍ、　（１９８９）　ペチュニアハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）　（Ｖ２Ｏ）のカルコンシンターゼ多重遺伝子族ＣＴｈｅ　ｃｈａｌｃｏｎｅ　ｓｙｒ＋ｊｈａｓｅ　ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ　（ＶR０乃開花期の判別、光−調節された発現およびＵＶ光誘導（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ、　ｌｉｇｈｔ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｆＩｏｗｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｔＪＶ　Ｉｉｇｈｔ　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ）、　oｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　、旦ｐｐ、　２１３−２２５フーズ（Ｋｏｅｓ）、　Ｒ，Ｅ、、７７：／ブロックランド（ｖａｎ　Ｂｌｏｋｌａｎｄ）、　Ｒ，、カトロノチオ（Ｑｕａｊｔｒｏｃｃｈｉｏ）、　Ｆ、、ファンソーネン（ｖａｎ　Ｔｕｎｅｎ）、　Ａ、Ｊ、　＆モル（Ｍｏｌ）、　Ｊ、Ｎ、Ｍ。

（＋９９０）・ペチュニア内のカルコンノンターゼブロモータは着色されたおよび未着色の細胞型において活性である（Ｃｈａｌｃｏｎｅ　ｓｙｒ＋ｊｈａｓｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　ｉｎ　ｐｅｔｕｎｉａ　ａｒｅａｃｔｉｖｅ　ｉｎ　ｐｉｇｍｅｎｔｅｄ　ａｎｄ　ｕｎｐｉｇｍｅｎｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｔｙｐｅｓ）、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１．２．　垂吹A　３７９− コルツノ−（Ｋｏｌｔｕｎｏｗ）、　Ａ、Ｍ、、ｌ−ルードナー（Ｔｒｕｅ＋ｔｎｅｒン、Ｊ、、ｌックス（ＣＯＸ）、　Ｎａ９２つオールロス（Ｗａｌｌｒｏｔｈ）、Ｍ、＆コ−ルドウルグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）、　Ｒ，Ｂ、　（＋９９０）種々の時間的および空間的遺伝子発現パターンかや（の発育中に生ずる（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｊｅｒｍｐｏｒａｌ　ａｎｄ　５ｐａｔｉａｌ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｏｃｃｕｒ　ｄｕｒｉｎｇ　ａｎｔ■■ 秩@ｄｅｖｅ１ｏｐｍｅｔ＋ｊ）、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１．２．　ｐｐ、　１２０１−１２２４ラム（Ｌａｍｂ）、　Ｃ，Ｊ、、Ｃｌ−１ン（Ｌａｔｖｊｏｎ）、　Ｍ、Ａ、、ドロ：／　（Ｄｒｏｎ）、　Ｍ、　＆ディキノン（Ｄｉｘｏｎ）、　Ｒ，Ａ、　（１９８９）・微生物の攻撃に対する植物防禦の活性化のためのシグナルおよび形質導入のメカニズム（Ｓｉｇｎａｌｓ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　ａｃｔｉｖａｎｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｄｅｆｅｎｓｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｍ１ｃｒｏｂｉａｌ　ａｔｔａｃｋ）、　Ｃｅ１１．５６．　ｐｐ、@２１５−２２４０ング（Ｌｏｎｇ）、　Ｓ、　（１９８９）：すＩビウムー豆果結節形成（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ−１ｅｇｕｍｅ　ｎｏｄｕｌａｌｉｏｎ）地下における共生（Ｌｉｆｅ　ｔｏｇｅｔｈｅｒ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｕｎｄｅｒｇｒｏｕｎｄ）、　Ｃｅ１ｌ、５６．　ｐｐ。

マニアティス（Ｍａｎｉａｊｉｓ）、　Ｔ、、フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、　Ｅ、Ｆ、＆サンプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、　Ｊ、　（１９８２）モレキュラークローニング　実験室マニュアル（コールドスブリノグハーハー、　ＮＹ・コールドスプリングハーハーラボラトリー）　（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ、　ＮＹ：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ奄獅■狽撃≠窒ａB ｒ　１．ａｈｏｒａｊｏｒｙ））マリアニ（Ｌｌａｒｉａｎｉ）、　Ｃ，、ドゥブソケレール（Ｄｅ　Ｂｅｕｃｋｅｌｅｅｒ）、　Ｍ、、　）ルードナー（Ｔｒｕｅ（（ｎｅｒ＞、　Ｊ、、リーマンズ（Ｌｅｅｍａｎｓ）、　ＪＪゴールドベルグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）、　Ｒ，Ｂ、　（１９９０）リボ核酸遺伝子による植物中の雄性不稔性の誘発（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｌｅ　５ｔｅｒｉｌｉｌｙ　ｉｎ　ｐｌａ旧ｓ　ｂｙ　ａ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ　ｇｅｎｅ）、　Ｎａｔｕｒｅ、　３４ムｐｐ、　７３７−７４１メソノング（Ｍｅｓｓｉｎｇｌ　Ｊ、　（１９７８）＋　リコンビナントＤＮＡテクニカルブレタンＮ１１（パブリケーン３ン（１？ｉｃｏｍｂｉｎａｎｊ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）、ＮｏB ７９−９９．２、ｐｐ、　４３−４８フアンデアクロール（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ）、　Ａ、Ｒ，、レンチング（Ｌｅｎｔｉｎｇ）、　Ｐ、Ｊ、、ビーンストラ（Ｖｅｅｎｓｊｒａ’）、　Ｊ、Ｇ、、ファンデアメーア（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍｅｅｒ）、１．Ｍ、、コーグ（に０ｅｓ）、　Ｒ，Ｅ、、　Ｙラノツ（Ｇｅｒａｔｓ）、＾、Ｇ、Ｍ、、モル（Ｍｏｌ）、　Ｊ、Ｎ、Ｍ、　＆ストイチｚ　（Ｓｔｕｉ　ｔｊｅ）、　Ａ、Ｒ，（＋９８９）・形質転換されたＭ物中の「アンチセンスカルコンシンターゼ遺伝子Ｊは花の着色性を阻害する（Ａｎ　”ａｎｊｉｓｅｎｓｅ　ｃｈａｌｃｏｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ”　ｉｎｌｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　１ｎｈｉｂＨｓ　ｆｌｏｗｅｒ　ｐｉｇｍｅｎｊａｔｉｏｎ）、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、３３R゜１１１１、８６６−８６９ファンデアメーア（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍｅｅｒ）、　１．Ｍ、、スベルト（Ｓｐｅｌｔ）、　Ｃ，Ｅ、、モル（Ｍｏｌ）、　Ｊ。

Ｎ、Ｍ、　＆ストイチェ（Ｓｔｕ山ｅ）、　Ａ、Ｒ，（１９９０）　ペチュニアノへイブリダのカルコンシンターゼ（ｃｈｓＡ）遺伝子のプロモータ分析、６７塩基対領域は花−特異的発現を促進する（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｈａｌｃｏｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ　（ｃｈｓＡ）　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｐ■狽浮獅奄■ ｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　＋５．　ｐｐ、　９５−１０９フアンデアメーア（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｍｅｅｒ）、　１．Ｍ、、　ストイチｚ（Ｓｔｕｉｔｉｅ）、　Ａ、Ｒ，＆モル（Ｍｏ１）、　Ｊ、Ｎ、Ｍ、　（１９９１）　一般的フェニルプロパノイドおよびフラボノイド遺伝子発現の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄ　ａｎｄ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　ｇｅｎｅ　ｅ■垂窒■■ ｓｉｏｎ）植物遺伝子発現の制１（Ｉｎ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、Ｄ、Ｐ、Ｓ、ベルマ（Ｖｅｒ＋ｎａ）編、（ザテルフォードプレス（Ｔｈｅ　Ｔｅ１ｆｏｒｄ　Ｐｒｅｓｓ）、コールドウェル（Ｃａｌｄｗｅｌｌ）、　二ｓ−シャーシー）、印刷中ブレツト（Ｐｌｅｇｔ）、　Ｌ、　＆ビバＢｉｎｏ）、　Ｒ，Ｊ、　（１９８９）：形質転換されたおよび形質転換されていない植物からの雄性配偶体の発育中のβ−グルクロニダーセ活性（β−ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｄｕｒｉｎｇ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｌｅ　ｇａｍｅｔｏｐｈ凾狽■ @ｆｒｏｍｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ａｎｄ　ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ）、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　２＋６．　ｐ吹A　３２１−３２０パート（Ｒｏｂｅｒｔ）等、　Ｌ、Ｓ、、　（１９９０）　バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。

虹ｐ、　４５９ファンロジャース（ｖａｎ　Ｒｏｇｅｒｓ）、　（１９８６）：メハソズインエンザイモロジー（Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、　１１８．　ｐｐ、　６２７−６４１シュメルツｙ−（Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ）、　Ｅ、、ヤーネン（Ｊａｈｎｔｎ）、　Ｗ、＆ホールプロ７り（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ）、　Ｋ、　（１９８８）　パセリ葉の表皮細胞内の光−有機性力ルコンノンターゼｍＲＮＡ、カルコンシンターゼ、およびフラボノイド最終生成物のその場での局所化（Ｉｎ　ｓｉ＋ｕ　Ｉｏｃａｌｉｚａｊｉｏｎ　ｏｆ　ｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｈａｌｃｏｎｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ　ｍＲＮＡ、　ｃｈａｌｃｏ獅■@ａｓｙｎｊｈａｓｅ、　ａｎｄ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　ｅｎｄｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｉｎ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｏｆ　ｐａｒｓｌｅｙ　１ｅ≠魔■刀j、　Ｐｒファンツーネン（ｖａｎ　Ｔｕｎｅｎ）、　Ａ、Ｊ、、　コーグ（Ｋｏｅｓ）、　Ｒ，Ｅ、、スベルト（Ｓｐｅｌｔ）、　Ｃ，Ｅ。

、ファンデアクロール（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ）、　Ａ、Ｒ，、ストイチｚ（Ｓｔｕｉｔｊｅ）、　Ａ、Ｒ，＆％ル（Ｍｏｌ）、　Ｊ、Ｎ、Ｍ、　（１９８８）：ペチュニアハイブリダ由来の２種のカルコンフラバノン異性化酵素遺伝子のクローニング　フラボノイド遺伝子の同調、光−調節かつ判別発現（Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｃｈａｌｃｏｎｅ　ｆｌａｖａｎｏｎｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　oｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ：　Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ、　ｌｉｇｈｔ−ｒ＋４ｕｌａｔｅｄ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓ奄盾氏@ｏｆ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　ｇｅｎｅｓ）、　ＥＭＢＯＪ、、　７．　ｐｐ、　１２５７− １２６３フアンツーネン（ｖａｎ　Ｔｕｎｅｎ）、　Ａ、Ｊ、、ハート７ン（Ｈａｒｔｍａｎ）、　Ｓ、Ａ、、ムーア（Ｍｕｒ）、　Ｌ。

＾　＆モル（Ｍｏｌ）、　Ｊ、Ｎ、Ｍ、　（１９８９）・ペチュニアハイブリダ中でのカルコン異性化酵素（ＣＨＩ）遺伝子発現の調節：花冠、やくおよび花粉における代替プロモータの第１図第Ｃ図株Ｘ１．　両性株　Ｘ２．　不稔性Ｆ１種子　、不稔性へテロ接合第　＋　図株　ｘｉ、両性　株　Ｙｌ・　稔住棟Ｘ２．　不稔性　株　Ｙ２．　両性ヘテ。接合　ヘテロ接合Ｆ１　種子、　両性異型第ｒ図第す図株　×１．両性株　Ｘ２．　回復遺伝子が誘発されない場合には不稔性Ｆ１　種子、不稔性。

ヘテロ接合９銹発後は両性第７　図株　Ｘ２．　回復遺伝子が誘発されない場合には不稔性Ｆ１種子、不稔性゛ヘテロ接合 °回復遺伝子の誘発後には稔性フロントページの続き（７２）発明者　ファン　デル　メール　イングＩＪ、ソド　マリアオランダ　エヌエル　１０９３　イエーエムアムステルダム　トンセラエルストラード一ドフーヴエドルプ　ファーザントストラート６

Claims

【特許請求の範囲】

１．雄性不稔性植物を生産するのに好適に使用できる組み換えポリヌクレオチドであって、本質的に（ａ）カルコン生合成経路の酵素をコードし、該植物内に存在するターゲット遺伝子の発現を阻害することのできる抑制性遺伝子、および（ｂ）該植物のやく内で活性であり、該植物の該やく内での発現を可能とするように該抑制性遺伝子に機能可能に結合したプロモータ、を含むことを特徴とする、上記組み換えポリヌクレオチド。
２．該ターゲット遺伝子がシンナメート４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ；Ｅ．Ｃ．１．１４．１３．１１）、４−クマロイル−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ；Ｅ．Ｃ．６．２．１．１２）およびカルコンシンターゼ（ＣＨＳ；Ｅ．Ｃ．２．３．１．７４）からなる群から選ばれる酵素をコードする請求の範囲第１項に記載の組み換えポリヌクレオチド。
３．該抑制性遺伝子がアンチセンス遺伝子である請求の範囲第１項または第２項に記載の組み換えポリヌクレオチド。
４．植物のやく中で活性な該プロモータが高−レベルプロモータと、ｃｈｓ−Ａ遺伝子、ｃｈｉ−Ｂ遺伝子、ｃｈｓ−Ｊ遺伝子およびｄｆｒ　Ａ遺伝子からなる遺伝子群のプロモータ領域から得ることのできるやくボックスとを含む請求の範囲第３項記載の組み換エポリヌクレオチド。
５．該高−レベルプロモータがＣａＭＶ３５Ｓプロモータのフラグメントと、該フラグメントの転写開始サイトに関して−９０位置に挿入された以下の配列：ＴＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＴをもつやくボックスとを含む上記請求の範囲第１〜４項の何れか１項に記載の組み換えポリヌクレオチド。
６．（ａ）請求の範囲第１〜５項の何れか１項に記載の組み換えポリヌクレオチドを雄性稔性植物の細胞に転移させる工程、（ｂ）組み込まれた該組み換えポリヌクレオチドをもつ細胞から完全な新規植物を発芽させる工程、および（ｃ）雄性不稔性の植物を選別する工程を含むことを特徴とする雄性不稔性植物の生産方法。
７．組み込まれた、請求の範囲第１〜５項の何れか１項に記載の組み換えポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組み換え植物ゲノム。
８．請求の範囲第７項に記載の組み換え植物ゲノムを含むことを特徴とする雄性不稔性植物。
９．請求の範囲第８項記載の雄性不稔性植物から誘導される細胞、果実、種子または子孫。
１０．請求の範囲第８項記載の雄性不稔性植物の自家受精された種子の生産方法であって、（ａ）適当なフラボノイド化合物の仔在下で、雄性稔性植物の雌ずいと、同一の雄性不稔性植物の花粉とを接触させる工程、（ｂ）該雌ずい上で該花粉を発芽させ、かつ該雄性不稔性植物を受精させる工程、および（ｃ）該植物を結実させる工程を含むことを特徴とする、上記方法。
１１．雄性不稔性植物の該雌ずいと該花粉とを接触させる前に、ミリセチン、ケルセチンおよびケンペロールからなる群から選ばれるフラボノイド化合物を１００ｎｍ〜３μＭの範囲内の濃度で含有する適当な花粉媒体中に該花粉を懸濁する請求の範囲第１０項記載の方法。
１２．該花粉媒体が、滅菌水中において１００ｍｇ／ｌのＨ２ＢＯ３、３００ｍｇ／ｌのＣａＮＯ３、２００ｍｇ／ｌのＭｇＳＯ４、１００ｍｇ／ｌのＫＮＯ３、１２．５％のスクロースなる組成を有する請求の範囲第１１項記載の方法。
１３．上記請求の範囲第１０〜１２項の何れか１項に記載の方法を利用して得た自家受精種子。
１４．請求の範囲第１３項記載の種子から得られるホモ接合雄性不稔性植物。
１５．請求の範囲第８項記載の雄性不稔性植物から誘導し得る細胞、果実、種子または子孫。
１６．請求の範囲第１４項記載のホモ接合雄性不稔性植物を雄性稔性植物で受精し、生成する種子を収穫し、該種子からヘテロ接合雄性不稔性植物を育成することにより、ヘテロ接合雄性不稔性植物の生産方法。
１７．請求の範囲第８項または第１４項記載の雄性不稔性植物を雄性稔性植物と交雑し、生成するハイブリッド種子を収穫することを特徴とするハイブリッド種子の生産方法。
１８．請求の範囲第１７項記載の方法により得られたハイブリッド種子。
１９．雄性不稔性植物の生産方法で使用するための、ｃｈｓ−Ａ遺伝子、ｃｈｉ −Ｂ遺伝子、ｃｈｓ−Ｊ遺伝子およびｄｆｒ　Ａ遺伝子からなる群から選ばれる遺伝子のプロモータ領域から得ることのできるやくボックス。
２０．以下の配列を含み、雄性不稔性植物の生産方法で使用するためのオリゴヌクレオチド：ＴＮＧＡＧＧＷＧＡＭＲＤＡＲＷＷ（配列同定ＮＯ：１）ここで、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴであり、ＷはＡまたはＴであり、ＭはＡまたはＣであり、ＲはＡまたはＧであり、かつＤはＡ、ＧまたはＴである。
２１．雄性不稔性植物の生産方法において使用するための、以下の配列群から選ばれる配列を含むオリゴヌクレオチド：（ａ）ＴＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＴ（配列同定ＮＯ：２）（ｂ）ＴＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＡＴ（配列同定ＮＯ：３）（ｃ）ＴＮＧＡＧＧＴＧＡＣＡＡＡＧＡＴ（配列同定ＮＯ：４）（ｄ）ＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＴＡＡＴＡ（配列同定ＮＯ：５）ここで、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである。
２２．ｐＴＳ２０、ｐＴＳ２１およびｐＴＳ２２からなる群から選ばれるプラスミド。