HU219543B - Eljárás hímsteril növények és az eljárásban használható rekombináns DNS előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás magban kódolt hímsterilitást mutatónövények előállítására a rekombináns DNS-tech- nika módszereinekalkalmazásával. Az eljárás során egy, a flavonoidok bioszintézisébenlényeges enzimet kódoló génnek a hím portokban való expressziójátgátolják, ennek eredményeképpen hímsteril virágport kapnak. Atalálmány tárgyát képezi továbbá az eljárásban alkalmazott, egygátlógént és egy vele működőképesen kapcsolt promotert tartalmazó, ahím portokban kifejeződésre képes rekombináns polinukleotid és ezttartalmazó hímsteril növény, gyümölcs, mag vagy utód is. ŕ

Description

A találmány tárgya rekombináns DNS, pontosabban növények genetikai manipulálására alkalmas rekombináns DNS. A találmány tárgyát képezik továbbá sejtmagban kódolt hímsterilitást mutató növények, amelyekben a hímsterilitás okozója az említett rekombináns DNS expressziója, illetve az említett növények részei, amelyek vagy szexuálisan, vagy aszexuálisan, vagy mindkét módon képesek szaporodni.

Régóta ismert tény, hogy ha egy faj különböző változataival (varieties) végzünk keresztbeporzást, akkor olyan utódokat kapunk, amelyek a terméshozam, a környezethez való alkalmazkodás és a betegségekkel szembeni ellenállás szempontjából jobb tulajdonságokkal rendelkeznek, mint az önbeporzás után létrejövő utódok. Ezt a hatást általában heterózishatásnak hívják. Ezért a vetőmagipar célja ilyen hibrid magvak előállítása annyi haszonnövényből és dísznövényből, amennyiből csak lehetséges, mivel kereskedelmi értékük magasabb.

Sajnos azonban számos növény mind a hím-, mind a nőivarú szaporítószerveket ugyanazon az egyeden hordozza, ami nagyon erősen elősegíti az önbeporzást a keresztbeporzással szemben. Ennélfogva ha a keresztbeporzással akarunk magvakat kapni, akkor kívánatos lenne, ha olyan akceptomövényeink lennének, amelyek nem képesek az önbeporzásra, a (megfelelően működő) virágpor hiányában. Ezek a hímsteril növények vagy anyák használhatók azután a keresztbeporzásra, egy hímtermékeny donomövénnyel való megtermékenyítésre hibrid magvak előállítása céljából.

Hibrid magvak nagy mennyiségben való előállításához általában a hímsteril növényeket együtt termesztik a szántóföldön a hímtermékeny növényekkel, és hagyják, hogy a keresztbeporzás lejátszódjon, majd a hibrid magvakat kiválogatják. A hímsteril növények típusától függően a hibrid magvak szelekcióját vagy elválasztását vagy a betakarítás előtt végzik, azaz oly módon, hogy elpusztítják vagy eltávolítják a hímtermékeny donomövényeket, amelyek a nem hibrid magvakat termelik, vagy pedig a betakarítás után, például egy genetikai bélyeg - ilyen például a mag színe a kukoricánál vagy valamilyen más, könnyen felismerhető fenotípus alapján. A betakarítás előtti szelekció akkor lehetséges, ha a hímtermékeny növények megkülönböztethetők a hímsteril növényektől, és a felismerést követően elpusztíthatok vagy eltávolíthatók. Egy másik módszer szerint ha a hímsterilitást okozó lókusz szorosan kapcsolódik egy szelektálható genetikai bélyeghez (például herbicidrezisztenciához), akkor a hímsteril növényt, amely a hibrid magvakat hordozza, olyan helyzetbe lehet hozni a megfelelő szelekciós nyomás alkalmazásával, hogy a hímtermékeny növényt túlnője.

Hímsteril szülői vonalként például fizikailag ivartalanított növényt használhatunk, vagy ha hozzáférhető, akkor természetes citoplazmatikus vagy sejtmagba kódolt hímsteril mutánsokat. A ilyen természetes hímsteril növényeknek az a hátrányuk, hogy nagyon munkaigényes az előállításuk, további nemkívánatos jellemzők találhatók bennük, nehéz fenntartani és szaporítani őket, és a kereskedelmi szempontból fontos terményeknél a hímsteril mutánsok csak korlátozott mértékben hozzáférhetők.

Csak újabban váltak ismertté a génsebészet módszereinek alkalmazásával a sejtmagban hímsterillé tett növények, amelyek hibrid magvak előállítására használhatók, és amelyekből a természetes hímsteril mutánsok legalább néhány hátrányos tulajdonsága hiányzik.

A WO 90/08830 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés javasol általános eljárásokat helyreállítható hímsteril növények előállítására, amelyek lényege az, hogy vagy

a) egy fehérjeinhibitort kódoló gént expresszálnak, vagy b) egy úgynevezett gyilkosgént, és az említett géneket a hím növényekben expresszálják, ennek következménye a hím portok és a hozzá kapcsolódó szövetek pusztulása. Ilyen gének például azok, amelyek expressziójának következménye a mitokondriális metabolizmusban nyilvánul meg.

Az ICI WO 90/08830 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésében a sejtlégzés gátlását írják le egy roncsológén expressziója révén, ezzel gátolják a mitokondriális funkciót, és ennek következménye azoknak a sejteknek a pusztulása, amelyekben ezek a gének expresszálódnak. Az előnyös roncsolófehérjék közé tartoznak :

a) az emlős-szétkapcsolófehérje (UCP; uncoupling protein),

b) az F,-ATP-áz β-l alegységének mutált formája, amelyben a mutációs változások nem teszik lehetővé, hogy az alegységek funkcionális ATP-szintetázzá álljanak össze,

c) az olil gén mutált, szintetikus formája, amely az FO-ATP-áz 9-es alegységét kódolja,

d) egy mitokondriális tranzitpeptid mutáns formái, amelyek nem teszik lehetővé a fehérjék transzportját a mitokondriumokba,

e) olyan génkonstrukciók, amelyek az élesztő ATP-áz β-alegysége és az Escherichia coli β-galaktozidázgénje közötti fúziót tartalmazzák, amely egy roncsoló fúziós fehérje expresszióját eredményezi.

Előnyösen az ilyen expressziónak a leírás szerint egy tapetum- vagy virágpor-specifikus promoter ellenőrzése alatt állónak kell lennie.

A PGS a WO 89/10396 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben általános módszereket javasol hímsteril növények előállítására oly módon, hogy a növény sejtmagjában levő örökítőanyagot az úgynevezett hímsterilitási DNS-sel transzformálja, amely DNS egy olyan RNS-t vagy polipeptidet kódol, amely képes megzavarni a normális metabolikus folyamatokat bármely olyan porzószálsejtben, amelyben a hímsterilitási DNS expresszálódik, és ennek előnyösen az a következménye, hogy az ilyen porzószálsejt elpusztul. Ilyen hímsterilitást okozó DNS lehet az, amely DN-ázokat, RNázokat, proteázokat vagy fitohormon-szintézishez szükséges enzimeket, például citokinineket kódol. Egy másik módszer szerint a hímsterilitást okozó DNS-t olyan antiszensz DNS-ek közül választják ki, amelyek a növény porzószálsejtjeiben természetes körülmények között átíródó DNS-szállal komplementer DNS-szálat kó2

HU 219 543 Β dóinak. A TA29 génen, a TA26 génen és a TA13 génen kívül ezek mind dohányból származó tapetumspecifikus gének, nincs utalás arra, hogy milyen génekre gondolnak. Koltunow és munkatársai egyik cikkükben [Koltunow A. M., Truettner, J. Cox, K. H., Wallroth, M., Goldberg, R. B.: Different temporal and spatial gene expression pattems occur during anther development, Plánt Cell, 2, 1201-1224 (1990)] a TA13 és TA29 kiónt azonosították, mint olyan kiónokat, amelyek az úgynevezett glicinben gazdag fehérjéket kódolják, míg a TA26 egy eleddig ismeretlen funkciójú cDNS-t tartalmaz.

Az EP-A 0 329 308 számon nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben (Palladin Hibrids) egy olyan módszert adnak meg, amelynek a segítségével hímsteril növényeket, genetikailag transzformált nőivarú szülőt lehet előállítani, lényegében oly módon, hogy az említett növény genomjába olyan antiszensz DNS-t tartalmazó rekombináns DNS-szekvenciákat építenek be, amelyek blokkolják a funkcionális virágporszemcsék képződését, illetve a keletkező virágporszemeket egy kémiai anyagra vagy fiziológiai stresszhatásra érzékennyé teszik, és ezzel gátolják a funkcionális virágporszemek termelődését. Az említett antiszensz gének előnyösen egy virágpor-specifikus promoter szabályozása mellett expresszálódnak. A funkcionáló virágporszemek termelődéséhez nélkülözhetetlen géneket ennek a szabadalmi bejelentésnek a specifikációja alapján olyan gének közül választjuk ki, amelyek specifikusan expresszálódnak a mikrospórákban, előnyösen a premeiotikus állapotban. Mikrospóraspecifikus kiónok például a Brassica napusból származó L4 és L19. Azonkívül, hogy általában a premeiotikus génekre és a kifejezetten említett kiónokra hivatkoznak, nincs további kitanítás azokra a génekre vonatkozóan, amelyeknek az expresszióját blokkolni kell.

Az EP-A 0 335 451 számon nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben leírják, hogy a kalkon-szintetáz gén expressziójának gátlása virágokban, egy antiszensz konstrukció alkalmazásával, megváltozott pigmentációt eredményez a virágokban. Az ebben a kísérletben használt antiszensz gént a karfiol-mozaikvírus (CaMV) konstitutív 35S promoterének szabályozása alá helyezték. A megváltoztatott virágpigmentációval rendelkező növények még képesek termékeny virágport termelni.

A kalkon-szintetáz a flavonoidbioszintézis egyik kulcsenzime. Ez az enzim katalizálja a malonil-CoA-ból származó három acetátcsoport és a 4-kumaroil-CoA lépésenkénti kondenzációját, ezzel eredményezve a naringenin kalkont (Heller and Hahlbrock, 1980). Ennek a központi intermediernek az izomerizációja és további szubsztitúciója végezetül a flavonoidok keletkezéséhez vezet. A flavonoidok szekunder metabolitok, amelyekről ismert, hogy kulcsszerepük van a növények és a gyümölcsök pigmentációjában. Emellett a flavonoidok láthatóan részt vesznek a fitopatogének elleni védekezésben [Lamb, C. J., Lawton, M. A., Dron, M., Dixon, R. A.: Signals and transduction mechanisms fór activation of plánt defenses against microbial attack, Cell, 56,

215-224 (1989)], az ultraibolya fény elleni védekezésben [van Tunen, A. J., Hartman, S. A., Mur, L. A., Mól, J. N. M.: Reguládon of chalcone isomerase (CHI) gene expression in Petúnia hybrida: The use of altematíve promoters in corolla, anthers and pollen, Plánt Mól. Bioi., 12, 539-551 (1989)] és a noduláció indukálásában [Long, S.: Rhizobium-legume nodulation: Life together in the underground, Cell, 56, 203-214 (1989)]. A flavonoidok részt vesznek az auxin transzport szabályozásában [Jacobs, M. and Rubery, P. H.: Natural occuring auxin transport regulators, Science, 241, 246-349 (1988)], valamint a rovarok elleni rezisztenciában [Hédin, P. A. and Waage, S. K.: Roles of flavonoids in plánt resistance to insects, In Progress in Clinical and Biological Research, Vol. 213: Plánt Flavonoids in Biology and Medicine. V. Cody, E. Middleton Jr. and J. B. Harbome, eds (New York: Alán R. Liss), pp. 87-100 (1986)].

A flavonoidok funkcióinak ez a sokszínűsége a bioszintézisút különböző enzimeit kódoló gének részlegesen komplex szabályozását követeli meg. Például az antocianinbioszintézis génexpressziója virágspecifikus, fénytől függő és a fejlődési folyamat által szabályozott [van Tunen, A. J., Hartman, S. A., Mur, L. A., Mól, J. N. M.: Reguládon of chalcone isomerase (CHI) gene expression in Petúnia hybrida: The use of altematíve promoters in corolla, anthers and pollen, Plánt Mól. Bioi., 12, 539-551 (1989); Koes, R. E., Spelt, C. E. and Mól, J. N. M.: The chalcone synthetase multigene family of Petúnia hybrida (V30): Differential, lightregulated expression during flower development and UV light induction, Plánt Mól. Bioi., 12, 213-225 (1989)]. Ezeknek a géneknek az expresszióját azonban más sejtekben ultraibolya fénnyel, sérüléssel vagy gombafertőzéssel lehet indukálni [Dixon, R. A., The phytoalexin respons: Eliciting, signalling and control of hőst gene expression, Bioi. Rév. 61, 239-291 (1986); Koes, R. E., Spelt, C. E. and Mól, J. N. M.: The chalcone synthetase multigene family of Petúnia hybrida (V30): Differential, light-regulated expression during flower development and UV light induction, Plánt Mól. Bioi., 12, 213-225 (1987); Lamb, C. J., Lawton, M. A., Dron, M., Dixon, R. A.: Signals and transduction mechanisms fór activation of plánt defenses against microbial attack, Cell, 56, 215-225 (1989)].

A CHS-A promotert más, a flavonoidbioszintézisben szerepet játszó olyan gének promotereivel összehasonlítva, amelyek az éretlen hím portok szövetében aktívak, például a CHS-J, DFR-A és CHI-B gének promotereivel, felfedezték, hogy nagyon erősen konzerválódott régiók vannak jelen, amelyeket anther (hímportok-) boxnak neveznek [van Tunen, A. J., Hartman, S. A., Mur, L. A., Mól, J. N. M.: Reguládon of chalcone isomerase (CHI) gene expression in Petúnia hybrida: The use of altematíve promoters in corolla, anthers and pollen, Plánt Mól. Bioi., 12, 539-551 (1989)]. Ennek a CHS-A promotemek a deléciós elemzése azt sugallja, hogy az anther box önmagában nem felelős a hímportok-specifikus expresszióért, de részt vehet a hímportok-specifikus expresszió szabályozásában más, a

HU 219 543 Β

CHS-A promoterben található szekvenciákkal együtt [van dér Meer, I. M., Spelt, C. E., Mól, J. N. M. and Stuitje, A. R,: Promoter analysis of the chalcone synthetase (chsA) gene of Petúnia hibrida: A 67 bp promoter region directs flower-specific expression, Plánt Mól. Bioi., 15, 95-109 (1990)].

1981-ben Coe és munkatársai [Coe, E. H., Jr., McCormick, S. M., and Modena, S. A.: White pollen in maize, J. Hered. 72, 318-320 (1981)] megfigyelték, hogy az egészségesnek látszó fehér virágpor nem működik rendesen a kukoricában, és azt sugallták, hogy a pigmentszintézis vagy -lerakódás létfontosságú lehet a virágpor működése szempontjából. A cikkben azonban nem vontak le következtetéseket a flavonoidoknak a virágpor fejlődésében játszott szerepéről, talán kételkedtek is benne. Amennyire tudjuk, az ezután következő években nem közöltek döntő bizonyítékot a flavonoidoknak az életképes virágpor fejlődésében játszott szerepéről.

Az alábbiakban röviden definiáljuk a találmány leírásában használt fontosabb fogalmakat.

Antherbox: egy nukleotidszekvencia, amely az 1. ábrán bemutatott szekvenciák bármelyikével azonos vagy legalábbis nagyon homológ.

Antiszensz gén: egy gén vagy egy ebből származó nukleotidszekvencia, amely 50%-nál magasabb, előnyösen 80%-nál magasabb homológiával rendelkezik egy, az alábbiakban meghatározott célgénnel, és amelyet egy promoterhez a normális 5’-3’-iránnyal, illetve a célgén irányával ellentétesen kötünk hozzá.

Gén: egy nukleotidszekvencia, amely egy RNS-molekula és/vagy egy polipeptid formájában expresszálható.

Hibrid promoter: egy olyan promoter, amely a természetben egymáshoz nem kapcsolódó vagy nem az adott sorrendben kapcsolódó nukleotidszekvenciákat vagy egyedi nukleotidokat tartalmaz.

Gátlógén: egy gén vagy antiszensz gén, amelynek az expressziója végeredményben egy, az alábbiakban meghatározott célgén expressziójának gátlásához vezet.

Promoter: nukleotidszekvencia, amely képes egy gén vagy antiszensz gén expresszióját kiváltani, szabályozni, illetve ennek nukleotidszekvenciái, az említett expresszió eredménye RNS-molekula és/vagy egy polipeptid.

Helyreállító gén: egy gén, előnyösen egy fúziós gén, amely legalább egy olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely elegendő mértékben azonos, hasonló vagy homológ egy alábbiakban meghatározott célgén egy részével, hogy képes, expresszió révén, komplementer asszociálódásra egy transzkriptummal, amelyet egy, az alábbiakban meghatározott inhibitorgén termelt.

Célgén: egy gén, amelynek expresszióját egy alkalmas, az alábbiakban meghatározott gátlógén megfelelő expressziójával gátolni lehet.

Ebben a leírásban a számmal jelzett bázispozíciók a megfelelő gén transzkripciós startpozíciójához viszonyított pozíciót jelzik.

A jelen találmány tárgya eljárás biztonságosan alkalmazható hibrid magvak termelésére képes hímsteril növények előállítására. A találmány tárgya továbbá olyan hímsteril növények előállítása, amelyeket homozigóta formában lehet előállítani, hogy olcsón lehessen heterozigóta hímsteril növényeket nagy mennyiségben előállítani a segítségükkel.

A találmány tárgyát képezik továbbá olyan rekombináns polinukleotidok is, amelyek megfelelő módon alkalmazhatók hímsteril növények előállítására, és amelyek lényegében az alábbi elemeket tartalmazzák:

a) egy gátlógén, amely képes egy célgén expresszióját gátolni az említett növényben, amely célgén a kalkonbioszintézis egyik enzimjét kódolja, és

b) egy promoter, amely az említett növény hím portokjában aktív, működőképesen az említett gátlógénhez van kapcsolva, és ezáltal az említett génnek az illető növény hím portokjában való expresszióját érjük el.

A találmány szerinti előnyös célgén egy, az alábbi csoportból választott enzimet kódol: cinnamát-4-hidroxiláz (C4H; E. C. 1.14.13.11), 4-kumaroil-CoA-ligáz (4CL; E. C. 6.2.1.12), és kalkon-szintetáz (CHS; E. C. 2.3.1.74). Cél-génként különösen előnyös a növényben kalkon-szintetázt kódoló gén.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a gátlógén egy antiszensz gén, amely a célgén ellen irányul.

A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a növény hím portokjában aktív promoter tartalmaz egy magas szintű expressziót biztosító promoter fragmentet, valamint egy anther boxot, amelyet az alábbi gének promoterrégiójából állíthatunk elő: chs-A gén, chi-B gén, valamint a chs-J és dfrA gén a Petúniából. Egy különösen előnyös megvalósítási mód szerint a magas szintű expressziót biztosító promoter a CaM¥ 35S promoter egy ffagmentjét, valamint az alábbi szekvenciával rendelkező anther boxot tartalmazza:

TAGAGGTGACAGAAAT (2. számú szekvencia) az említett fragmentbe a -90-es pozíciónál beépítve (a transzkripciós starthelyhez viszonyítva).

A találmány tárgya továbbá eljárás hímsteril növény előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:

(a) egy, a találmány szerinti rekombináns polinukleotidot egy hímtermékeny növény sejtjeibe juttatjuk be, (b) az említett rekombináns polinukleotidot beépülve tartalmazó sejtekből egész növényeket regenerálunk, és (c) kiválasztunk egy hímsteril növényt.

A találmány tárgya továbbá egy rekombináns növényi genom, amely egy, a találmány szerinti rekombináns polinukleotidot tartalmaz.

A találmány tárgya továbbá egy, az alábbi nukleotid-sorrendű szekvencia:

TNGAGGWGAMRDARWW (1. számú szekvencia), amelyben N=A, G, C vagy T, W=A vagy C, R=A vagy G, D=A, G vagy T, a hímsteril növényt eredményező eljárásban való felhasználás céljára. A találmány egy további, még előnyösebb megvalósítási módját az alábbi oligonukleotidok jelentik:

(a) TAGAGGTGACAGAAAT (2. számú szekvencia) (b) TAGAGGTGACAAAAAT (3. számú szekvencia)

HU 219 543 Β (c) TNGAGGTGACAAAGAT (4. számú szekvencia) (d) TAGAGGAGAAGTAATA (5. számú szekvencia), amelyekben N=A, G, C vagy T, a hímsteril növényt eredményező eljárásban való felhasználás céljára.

A találmány tárgya továbbá eljárás öntermékenyített magvak előállítására hímsteril növényből, amelybe a találmány szerinti rekombináns oligonukleotidot építettünk be, és amely az alábbi lépésekből áll:

(a) egy hímsteril növény bibéjét ugyanannak a hímsteril növénynek a virágporával hozzuk érintkezésbe, a megfelelő flavonoidvegyület jelenlétében, majd (b) hagyjuk, hogy a virágpor a bibén kicsírázzon, és a hímsteril virágot megtermékenyítse, és (c) hagyjuk, hogy a növény magot hozzon.

A fenti módszerben különösen előnyös egy flavonoidvegyület, amely lehet miricetin, kvercetin és kempferol előnyösen 100 nmol/1 és 3 pmol/l koncentrációtartományban való alkalmazása.

A találmány további előnyös tárgya hibrid magvak olcsó előállítása nagyszámú heterozigóta hímsteril növény segítségével, amelyeket úgy kapunk, hogy egy, a kívánt fajtába tartozó homozigóta hímsteril növényt egy ugyanabba a fajtába tartozó hímtermékeny növénnyel keresztezünk.

A találmány tárgyát képezi továbbá a (hibrid) mag, amelyet bármely, a találmány szerinti növény önmagával való megtermékenyítése vagy keresztezése útján kapunk.

A találmány tárgyát képezi továbbá a pTS20, pTS21 és pTS22 plazmid.

Az előnyök és az alkalmazás területe könnyen megérthető lesz a találmány alábbi, részletes leírásából.

Az alábbiakban ismertetjük a mellékletben megadott ábrákat. Az 1. ábrán a CHS-A egy szintetikus anther boxának a szekvenciája látható, amelyet a CaMV 35S promoterébe illesztünk bele. Alatta láthatók az egyéb, különböző flavonoidbioszintézis-génekből származó anther boxok. A zárójelben levő számok az anther box relatív pozícióját mutatják a származásául szolgáló gén transzkripciós startpozíciójához viszonyítva.

A 2. ábrán a kiméra GUS-konstrukciók vagy kiméra antiszensz-CHS konstrukciók klónozása lépéseinek diagramszerű ábrázolását látjuk.

A 3. ábrán hímsteril magvak előállítására szolgáló módszer diagramszerű ábrázolása látható; ez a hibrid mag használható olyan terményekhez, amelyeknél a mag vagy a gyümölcs beérésére nincs szükség; X jelentése nőivarú szülőfajta; Y jelentése hímivarú szülővonal; CaMV=karfiol-mozaikvírus 35S promotere, AB=anther box, a 35S promoterbe illesztve; CHSas=antiszensz kalkon-szintetáz gén.

A 4. ábrán hímtermékeny hibrid magvak előállítási módszerének diagramszerű leírása található; ezt a hibrid magot használhatjuk olyan terményekhez, amelyeknél a mag vagy a gyümölcs beérése lényeges; CHSs normális kalkon-szintetáz gén; minden más jelzés értelme ugyanaz, mint a 3. ábra jelzéseinek.

Az 5. ábrán hímtermékeny hibrid magvak előállítási módszerének diagramszerű leírása található; ezt a hibrid magot használhatjuk olyan terményekhez, amelyeknél a mag vagy a gyümölcs beérése lényeges; GUSs=az Escherichia coli glükuronidázgénje; a GUSs és a CHSas gének fizikailag egymáshoz vannak kapcsolva, hogy fúziós géneket hozzanak létre; minden más jelzés értelme ugyanaz, mint a 3. ábra jelzéseinek.

A 6. ábrán indukálható hímtermékenységgel rendelkező hibrid magvak előállítására szolgáló módszer diagramszerű leírása látható: ezt a hibrid magot olyan terményeknél lehet alkalmazni, amelyeknél a mag vagy a gyümölcs beérése lényeges; az összes jelzés értelme ugyanaz, mint az előző ábrákon.

A 7. ábrán indukálható hímtermékenységgel rendelkező hibrid magvak előállítására szolgáló módszer diagramszerű leírása látható; ezt a hibrid magot olyan terményeknél lehet alkalmazni, amelyeknél a mag vagy a gyümölcs beérése lényeges; NSP=a helyreállító gén nem specifikus része, hogy elkerüljük a helyreállító gén CHSs részének feltehető koszuppresszív hatását; az összes jelzés értelme ugyanaz, mint az előző ábrákon.

Meglepődve tapasztaltuk, hogy egy bakteriális β-glükuronidáz (GUS)-riportergén expressziója a transzgenikus Petúnia hybrida növényekben, egy hibrid promoter szabályozásával, amely a Petúnia hybrida CHS-A promoteréből származó anther boxot a CaMV 35S promoterhez fúzionáltatva tartalmazza (a továbbiakban mint AB/CaMV 35S promotert említjük) lényegesen magasabb a hím portokokban, mint a pártaszövetekben, ha a CaMV promoter által szabályozott GUS expressziójával hasonlítjuk össze. Emellett a sejttípus-specifitás is megváltozott, mivel az expressziót a tapetumsejtrétegben is megfigyeltük. Ez nem figyelhető meg csak a 35S promoterrel, amely nem tartalmazza az anther boxot.

Láthatóan az anther box képes antherspecifikus expresszióra további cisz-hatóelemek jelenléte nélkül is, amelyek a korábbi vélemények szerint a CHS-A génen találhatók. A hibrid promoter nem antherspecifikus, mivel az expressziót más szövetekben is megfigyeltük. Az anther box képes expressziót kiváltani a tapetumsejtrétegben is.

Egy ahhoz hasonló kísérletben, mint amit a GUS riportergénre leírtunk, egy Petúniából származó antiszensz-CHS gént (cDNS) helyezünk egy AB/CaMV 35S promoter szabályozása alá, és ezt a konstrukciót használjuk a bíborszínű virágú Petúnia VR hibrid transzformálására. A transzformált növények kiválasztása után, amelyek a konstrukciót expresszálták, majd miután hagytuk a növényeket virágozni, azt találtuk, hogy ezek közül a növények közül néhánynak a hím portokja bíborszínű helyett fehér volt. Fehér hím portokokat a korábbi kísérletekben nem kaptunk, amelyek során az antiszensz CHS-A gént a normál 35S promoterhez fuzionáltattuk az antiszensz-CHS expresszió szabályozására, jóllehet az antiszensz gén valóban expresszálódott a hím portokokban.

Ebből az következik, hogy egy, az előzőkben definiált anther box úgy működhet, hogy irányítja bármely, a hím portok szövetében levő génnek (vagy antiszensz génnek) az expresszióját a tapetumsejtrétegben, ha ezt az anther boxot egy erős promoter mögé illesztjük be,

HU 219 543 Β amelynek eredete nem fontos. Emellett azt is kimutattuk, hogy egy gátlógén expressziójának szintje a hím portok szövetében elég magas ahhoz, hogy meggátolja egy célgén expresszióját a hím portok szövetében.

Meglepő módon, miután megpróbáltuk a fehér portokkal rendelkező transzgenikus Petúnia hybrida növényeket önmagukkal megtermékenyíteni, kiderült, hogy teljesen hímsterilek. Léteznek olyan természetes mutáns Petúnia-vonalak, amelyekben nincs működőképes kalkon-izomeráz enzim. A kalkon-izomeráz a kalkonok flavanonokká való konverziójában játszik szerepet, azaz egy lépéssel előrébb van a flavonoid-bioszintézisútban. Ismert, hogy ezek a növények hímtermékenyek. Tehát le lehet vonni azt a következtetést, hogy ha a javasolt módszerrel hímtermékeny növényeket akarunk kapni, akkor a gátlógént egy olyan géncsoportból kell megválasztani, amelyek a kalkonhoz vezető bioszintézisútban szerepelnek, addig, ameddig ezeknek a géneknek a gátlása nem letális az egész növényre.

Más kísérletekben, amelyekben a Petúnia antiszensz CHS-A gént normális CaMV 35 S promoter szabályozása alá helyeztük, megállapítottuk, hogy az antiszenszCHS konstrukció használható gátlógénként, hogy meggátoljuk a megfelelő célgén expresszióját a dohány és a burgonya pártájában. Ez igazolja, hogy az antiszensz megközelítés heterológ rendszerekben is működik, és erősen azt sugallja, hogy a különböző fajokhoz tartozó hímsteril növények előállíthatok, ha a Petúnia antiszensz-CHS génjével transzformáljuk őket, amely az AB/35S promoter szabályozása alatt áll.

Tehát új módszert dolgoztunk ki sejtmagban kódolt hímsteril növények előállítására, amelynek segítségével hibrid magvakat lehet készíteni. Ennek során a kiválasztott fajtába tartozó növényeket genetikailag transzformáljuk, oly módon, hogy az említett növény sejtjeibe egy vagy több rekombináns polinukleotidot juttatunk be, amely(ek) lényegében egy vagy több gátlógént tartalmaz(nak), amely(ek) a növény hím portokjában megfelelő módon expresszálva képes(ek) meggátolni egy vagy több, a kalkonbioszintézisben szerepet játszó enzimet kódoló gén expresszióját.

Általában a hímsteril növényeket úgy állítjuk elő, hogy egy megfelelő, egy kaikon bioszintetikus enzimet kódoló célgén expresszióját gátoljuk, oly módon, hogy megfelelően expresszálunk egy, a célgén elleni gátlógént. A megfelelő célgéneket bármely olyan gének közül választhatjuk, amelyek a kalkonok vagy közvetlen prekurzoraik bioszintézisében részt vevő enzimeket kódolnak, azzal a feltétellel, hogy az ebbe a csoportba tartozó gén gátlása nincs negatív hatással a fajta egyéb tulajdonságaira. A célgéneket olyan enzimeket kódológének közül választhatjuk, amelyek egy kaikon prekurzorait alakítják át, ilyen például a cinnamát-4-hidroxiláz (CH₄; E. C. 1.14.13.11), előnyösen a 4-kumaroil-CoA ligáz (4CL; E. C. 6.2.1.12), legelőnyösebben a kalkonszintetáz enzim (E. C. 2.3.1.74), amely a szubsztrátját közvetlenül kalkonná alakítja.

A különböző lehetőségekből megfelelőképpen választható gátlógéneket, beleértve a normális és az antiszensz géneket, az alábbiakban részletesebben ismertetjük. Az alkalmas normális gátlógének közé tartoznak például azok, amelyek egy ribozimet kódolnak, amely a célgén RNS-terméke ellen irányul, vagy egy (monoklonális) antitestet, amely a célgén terméke ellen irányul, vagy a célenzim szelektív fehérjeinhibitorát, ha hozzáférhető. Egy másik módszer szerint a gátlógén tartalmazhat egy normális gént, amely lényegében azonos a célgénnel, de amely megfelelő expressziójával gátolja a célgént egy eddig ismeretlen mechanizmus szerint, amelyet normál-normál gátlásnak vagy koszuppressziónak neveznek (WO 90/11682 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés, DNA Plánt Technology Inc.).

A gátlógén előnyösen egy, a célgén ellen irányuló antiszensz gén. Az antiszensz génnek nem kell feltétlenül teljesen komplementernek lennie a célgénnel, azzal a feltétellel, hogy hossza és homológiája elegendő ahhoz, hogy a megfelelő magas fokú gátlást biztosítsa. Tehát az antiszensz gén lehet (részlegesen) komplementer a megfelelő célgén 5’-végével, 3’-végével vagy a középső részével, illetve (részlegesen) komplementer az egész génnel. A részleges komplementaritás alatt azt a szituációt értjük, amikor az antiszensz gén nem teljesen homológ a megfelelő célgénnel, ami lehet annak a ténynek a következménye, hogy például az antiszensz gén heterológ (azaz egy másik forrásból származik) a célgénhez viszonyítva, és hasonlók. Az antiszensz gén lehet teljesen szintetikus is. Az összes említett variáció, amit az antiszensz génnel kapcsolatban említettünk, nem lényeges a találmány szempontjából, ameddig a homológia szintje és/vagy a komplementaritás összértéke elegendő ahhoz, hogy a célgén expresszióját gátolja.

A találmány szerinti gátlógén megfelelő expresszióját úgy érhetjük el, hogy a gátlógént egy hibrid promoter mögé építjük be, amely promoter tartalmaz legalább egy, a növényekben működő promotert, előnyösen egy magas szintű expressziót biztosító promotert, például a CaMV 35S-t (vagy annak származékát), valamint egy olyan génből származó anther boxot, amely a növények éretlen hím portok szövetében expresszálódik. Az alkalmas anther boxot megkaphatjuk például többek között a CHS-A génből, a CHS-J génből, a CHI-B génből vagy a DFR-A génből, valamint hasonlókból.

Az említett anther boxot előnyösen egy promoterbe építjük be a -2000 és +1 pozíciók közé, előnyösebben a -1000 és +1 pozíciók közé, legelőnyösebben a -150 és -50 pozíciók közé. A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint az anther boxot a CaMV 35S promoter -90-es pozíciójába építjük be.

A forrásnövény megválasztása, amelyből az anther box származik, nem lényeges, mindaddig, ameddig az anther box megfelelően működik a végső transzgenikus gazdaszervezetben. Általában az az előnyös, ha a használt anther box homológiája a lehető legnagyobb azokkal a boxokkal, amelyekről ismert, hogy fokozzák a gazdanövény hím portokjában az expressziót. Egy ilyen anther boxot szintetikusan is előállíthatunk a végső gazdanövényben vagy bármely más növényben előforduló, egy más növényi forrásból származó anther box ismert szekvenciája alapján vagy hasonlóképpen.

HU 219 543 Β

Általában, de nem szükségszerűen a genetikai anyagot, amely a gátlógént a találmány szerinti hibrid promoterhez fuzionáltatva tartalmazza rekombináns DNS vagy RNS formájában, egy rekombináns polinukleotiddal, DNS-sel vagy RNS-sel juttatjuk be a növénybe, szorosan kapcsolva egy szelektálható vagy vizsgálható tulajdonsághoz, például egy herbicid- vagy antibiotikumrezisztenciához, hogy ezzel lehetővé tegyük a transzformáit sejtek korai szelekcióját vagy felismerését. Egy másik módszer szerint nincs szükség ilyen genetikai bélyegre, mivel egy, a találmány szerinti gátlógén jelenléte és expressziója közvetlenül vizsgálható, ha a transzgenikus növények virágoznak. A rekombináns polinukleotidokat általában baktériumokban tartjuk fenn és szaporítjuk plazmidok vagy más replikonok formájában (például virális DNS-be vagy RNS-be építve). Egy másik módszer szerint a rekombináns polinukleotidokat in vitro szaporíthatjuk, például a polimeráz-láncreakcióval (PCR), amely jól ismert a szakterület ismerői számára. Az aktuális módszer nem lényeges a találmány szempontjából.

A rekombináns polinukleotidok bejuttatása a növénybe számos technika alkalmazásával történhet, amelyek a növényi biotechnológia területén átlagos jártassággal rendelkező szakemberek számára jól ismertek. A genetikai anyagnak a növénybe való bejuttatásának módja nem fontos, ameddig a módszer ésszerű esélyt ad a sikerre, és hasonlóképpen ésszerűen előre látható eredményeket ad. Ez a módszer nem zárja ki feltétlenül azt, hogy bizonyos mértékű szelekcióra szükség van a várt végeredmény eléréséhez. Ez azonban általános gyakorlat a növényi génsebészet területén, és nem jelent fölösleges kísérletezést. Ilyen például, csak illusztrálási céllal, a protoplasztok transzformálása a kalcium/polietilénglikol módszer alkalmazásával [Krens et al., 1982; Negrutiu et al., 1987], az elektroporáció [Shillito, R. D. et al., Bio/Technology, 3, 1099-1102 (1985)], a mikroinjekciózás [Crossway et al., 1986], (DNS-sel vagy RNS-sel borított) mikrorészecskékkel való bombázás [Klein et al., 1987], vírusokkal való fertőzés és hasonlók. Előnyösen az Agrobacterium fajok természetes DNS-transzfer rendszerét használjuk. Az Agrobacterium-technológián belül az úgynevezett ingázó- (bináris) vektorok használata az előnyös [Bevan M., Binary Agrobacterium vectors fór plánt transformation, Nucl. Acids Rés., 12, 8711-8712 (1984)]. A megfelelő bakteriális háttér használata a DNS növényekbe való beviteléhez, a vektorok, a megfelelő szelekciós bélyegek, inkubálási körülmények, tenyésztő táptalajok megválasztása mind a szakterületen jártas szakember ismeretei közé tartozik. A transzformált növényi anyag szelektálása és/vagy átvizsgálása után a transzformált anyagot teljes növénnyé regeneráljuk, a szakirodalomban alaposan megtárgyalt módszerek felhasználásával [Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffinann, N. L., Eichholtz, D., Rogers, S. G. and Fraley, R. T., A simple and generál method fór transferring genes intő plants, Science, 227, 1229-1231 (1985)]. Bármely olyan növény használható, amely transzformálható és regenerálható.

A transzformálási és/vagy regenerálási módszer önmagában nem kritikus a találmány szempontjából addig, ameddig a genetikai anyag bejut a növényi sejtbe, és a genetikai anyag (egy másolata) stabilan integrálódik a növényi sejt genomjába, és az említett növényi anyag alkalmas hajtássá regenerálódni, amely azután meggyökereztethető (vagy graftolható), ennek eredményeképpen egy teljesen új növény regenerálódik. A technika megválasztása a használt növényi anyagtól függ, illetve egy gyakorlott kutató választásától.

Miután megkaptuk a transzformált növényeket, azokat kiértékelhetjük abból a szempontból, hogy a keresett tulajdonság megtalálható-e a növényen és/vagy a keresett tulajdonság milyen mértékben expresszálódik a növényben. Az első értékelés során vizsgálhatjuk a gátlógén expressziójának szintjét, valamint azt, hogy a transzgenikus növény milyen mértékben hímsteril. Ezt követően azokat a transzgenikus növényeket választhatjuk ki, amelyek a hímsteril tulajdonságot stabilan és/vagy előre megjósolható módon örökítik át. Ezt követően a (heterozigóta) hímsteril növényeket közvetlenül lehet hibrid magvak előállítására használni, illetve megmentett virágpor segítségével önmagával beporozhatjuk, hogy homozigóta hímsteril növényeket kapjunk. Egy másik módszer szerint homozigóta hímsteril növényeket úgy állíthatunk elő, hogy a hímsteril növényeket életképes, de steril virágporral termékenyítjük meg oly módon, hogy

a) egy hímsteril növény bibéjét ugyanannak a hímsteril növénynek a virágporával hozzuk érintkezésbe megfelelő flavonoidvegyület jelenlétében, majd

b) hagyjuk, hogy a virágpor kicsírázzon a bibén, és megtermékenyítse a hímsteril növényt, majd

c) hagyjuk, hogy a növény magvakat hozzon.

Lehetséges az is, hogy az éretlen virágport hagyjuk megérni kalkonok jelenlétében, mielőtt a hímsteril anyanövény önbeporzására használnánk.

A módszer során különösen előnyösen használható flavonoidvegyületek a kvercetin, kempferol és a miricetin. A flavonoidvegyületet megfelelő módon hozzá lehet adni a szokványos virágportáptalajhoz, például a „BK-táptalajhoz”, körülbelül 10 nmol/1-10 pmol/l végkoncentrációban, előnyösen körülbelül 100 nmol/1-3 pmol/l végkoncentrációban. Az optimális koncentráció változhat vegyületről vegyületre, valamint fajtáról fajtára; feltehetően annak mértékétől függően, hogy az endogén flavonoidvegyület keletkezése mennyiben gátlódik a hímsteril növényben. Azonban az alábbiakban ismertetett általános kitanítás szerint a megfelelő flavonoidkoncentrációkat a különböző körülmények között meg lehet határozni, anélkül hogy fölösleges kísérleteket végeznénk. Természetesen az előnyös, ha van néhány homozigóta hímsteril növényünk; mert ez lehetővé teszi, hogy gyorsan, nagy mennyiségben kapjunk heterozigóta hímsteril magvakat, amelyeket közvetlenül lehet használni a hibrid magvak nagy mennyiségben való előállítására.

A találmány szerinti eljárást bármely olyan növénnyel végrehajthatjuk, amely képes az önbeporzásra, és amelynél fontos a hibrid magvak előállítása.

A találmány egy másik tárgya eljárás homozigóta hímsteril növény előállítására, oly módon, hogy a talál7

HU 219 543 Β mány szerinti heterozigóta hímsteril növényeket virágporral önmagával termékenyítjük meg, amelynek a fejlődését annak köszönhetjük, hogy a növény éretlen hím portokjában időlegesen jelen van kaikon, és ezzel le lehet küzdeni a kalkonszintézis in vivő gátlását. A találmány ezen tárgyának egyik megvalósítási módja kalkonok adagolását tartalmazza, hogy ezzel kompenzáljuk a génexpresszió gátlásának hatását. Egy csekély mértékben eltérő megvalósítási mód szerint a gének expressziójának gátlását azzal kompenzáljuk, hogy lehetővé tesszük a kalkonok (időleges) in vivő termelődését. Ezt úgy érhetjük el, hogy a gátlógén mellett egy helyreállító gént is bejuttatunk a genomba, a helyreállító gén egy indukálható promoter szabályozóhatása alatt áll, hogy képesek legyünk a helyreállító gén expresszióját kívülről, megfelelő indukálószer hozzáadásával szabályozni. Az ilyen helyreállító gén előnyösen tartalmaz például egy fúziós gént, amely a célgénnek legalább egy részét tartalmazza, amely képes az expresszió hatására gátolni az antiszensz gén expresszióját, oly módon, hogy komplementer módon asszociálódik az antiszensz transzkriptummal [Róbert, L. S. et al., Bio/Technology, 8, 459 (1986)].

A termékenység indukálható helyreállítása, amint azt az előzőkben jeleztük, szükséges a hibrid terményeknél is, amelyeknél a kereskedelmi értéket a mag vagy a gyümölcs képezi. Természetesen a hímsterilitást meg kell szüntetni a termőterületen, hogy ezzel lehetővé tegyük a virágporzást, hogy ezáltal magvakat vagy gyümölcsöket kapjunk. Az ilyen helyreállítást például úgy lehet elérni, hogy az indukálószert a termőterületen adjuk a terményhez, aminek az a következménye, hogy a helyreállító gén elég magas szinten expresszálódik, és ezzel az antiszensz transzkriptum semlegesítését lehet elérni.

Szemben a korábbi módszerekkel, amelyeket sejtmagban kódolt hímsteril növények előállítására használtak, a jelen találmány nem szükségszerűen foglalja magában olyan gének expresszióját, amelyek a szomatikus sejtekre toxikus anyagokat kódolnak, azaz például DNázokat, RNázokat vagy proteázokat. Ennek következtében nincs szükség egy szigorú, a fejlődési folyamat által szabályozott vagy szövetspecifikus expresszióra, ameddig az expressziót a hím portokban tudjuk elérni.

A találmány szerinti hímsteril növények nagyon sterilek, és anyanövényként teljesen termékenyek.

Emellett a hibrid magvak nagy mennyiségben való előállítása során, a termőterületen vagy üvegházakban, a hímtermékeny növények, azaz a feltételezett önbeporzók, megkülönböztethetők a hímsteril növényektől, amelyek a hibrid magvakat termelik, a megváltozott hímportok-pigmentáció alapján. Ezt követően az önbeporzók elválaszthatók vagy ha szükséges, akkor elpusztíthatok, és a nem hibrid magvaik külön begyűjthetők.

A találmány szerinti módszerek további előnye az, hogy elő lehet állítani homozigóta hímsteril növényeket, amelyek komoly előnyt jelentenek a heterozigóta hímsteril szülői vonal fenntartásában és szaporításában. Csak néhány homozigóta növényre van szükség, amelyek, korlátozott számuk következtében in vitro körülmények között szaporíthatok, a szakterületen jártas szakemberek számára jól ismert módszerek alkalmazásával. A homozigóta hímsteril vonalat keresztbetermékenyítjük egy hímtermékeny szülői vonallal, majd ezt követően a heterozigóta hímsteril magvakat használjuk a hibrid termények termőterületen való előállítására. A megfelelő hibrid magvak 50%-a hímsteril, 50%-a hímtermékeny. Adott esetben ez az arány nem elegendő ahhoz, hogy a kereskedelmi terméket nagy termésátlaggal kapjuk (azaz magvakat vagy gyümölcsöt) önbeporzással, akkor ezt az arányt javítani lehet oly módon, hogy a hímsterilitást részlegesen helyreállítjuk, oly módon, hogy egy indukálószert adunk a növényekhez, amely aktiválja a helyreállító gén expresszióját.

Kísérleti rész DNS-módszerek

A DNS izolálását, szubklónozását, restrikciós elemzését és szekvenálását a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára ismert standard eljárásokkal végezzük [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Az egyes Petúnia transzformánsokból a DNS izolálását és a DNS elemzését blottechnikával, Koes és munkatársai módszerével végezzük [Koes, R. E., Spelt, C. E. and Mól, J. N. M.: The chalcone synthetase multigene family of Petúnia hybrida (V30): Differential, light-regulated expression during flower development and UV light induction, Plánt Mól. Bioi., 12, 213-225 (1987)].

GUS-extrakciók és fluorometriai, valamint hisztokémiai GUS-vizsgálatok

Friss anyagot gyűjtünk a transzgenikus növényekről, és GUS-vizsgálatokban alkalmazzuk. A GUS-extrakciókat Jefferson és munkatársai módszerével végezzük [Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A. and Bevan, M. W., GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants, EMBO J., 6, 3901-3907 (1987)], oly módon hogy a szövetet folyékony nitrogénben Dowex-l-gyel (SIGMA) dörzsöljük el. A fluorimetriás GUS-aktivitás-mérést Jefferson és munkatársai módszerével végezzük [Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A. and Bevan, M. W., GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants, EMBO J., 6, 3901-3907 (1987)]. A fluoreszcencia-értékeket a kivonat kioltására korrigáljuk, oly módon, hogy mérjük a fluoreszcencia növekedését azután, hogy ismert mennyiségű 4-metilumbelliferilt adtunk a kivonathoz. A fehérjekoncentrációkat a Bio-Rad fehérjét meghatározó módszerével (protein assay) mérjük, standardként szarvasmarha-szérumalbumint használva.

A GUS-aktivitás hisztokémiai lokalizálását Koes és munkatársai módszerével végezzük [Koes, R. E., van Blokland, R., Quattrochio, F., van Tunen, A. J. and Mól, J. N. M., Chalcone synthetase promoters in petúnia are active in pigmented and unpigmented cell types, Plánt Cell, 2, 379-392 (1990)]. A festés előtt a hím portokokat borotvapengével kettőbe vágjuk. A háttér GUS-aktivitás hím portokban való eliminálásához pH=8,0 kémhatású X-gluc festőoldatot használunk.

HU 219 543 Β

A műtermékek kiküszöböléséhez, amelyek a sejtméretek különbözőségéből, a szubsztrátnak a szövetbe való hatolásából és a háttéraktivitásból fakadnak, ismételten elvégeztük a hisztokémiai vizsgálatokat transzgenikus és nem transzformált növényeken. Az egysejt-szinten végzett elemzéshez az X-gluc által festett szöveteket fixáljuk, majd paraffinba ágyazzuk Koes és munkatársai módszerével [Koes, R. E., van Blokland, R., Quattrochio, F., van Tunen, A. J. and Mól, J. N. M., Chalcone synthetase promoters in petúnia are active in pigmented and unpigmented cell types, Plánt Cell, 2, 379-392 (1990)]. Egy mikrotommal 7 pm vastag szeleteket vágunk, amelyeket világos mezős mikroszkópiával fényképezünk.

A flavonoidok kimutatása

Tíz csíra hím portokját inkubáljuk 1 ml 2 mol/1 koncentrációjú HCl-ban 16 óra hosszat, hidrolízis után (20 perc 100 °C-on) a flavonoidokat kis mennyiségű izoamil-alkohollal extraháljuk, majd vékonyréteg-kromatográfiás lemezeken választjuk el, ecetsav: sósav: víz 30:3:10 arányú elegyet használva fúttatószerként. RNS-izolálás és RNáz-védelem

5-7 csíra hím portokjait (40-50 mm-esek) használjuk RNS izolálására, Koes és munkatársai módszerének alkalmazásával [Koes, R. E., Spelt, C. E. and Mól, J. N. M.: The chalcone synthetase multigene family of Petúnia hybrida (V30): Differential, light-regulated expression during flower development and UV light induction, Plánt Mól. Bioi., 12, 213-225 (1989)]. Az endogén CHS mRNS-t RNáz-protekciós vizsgálattal mutatjuk ki [van Tunen, A. J., Hartman, S. A., Mur, L. A., Mól, J. N. M.: Regulation of chalcone isomerase (CHI) gene expression in Petúnia hybrida: The use of altematíve promoters in corolla, anthers and pollen, Plánt Mól. Bioi., 12, 539-551 (1989)], egy pTZ18U-ba klónozott teljes hosszúságú CHS(A) cDNS-t használva próbaként [Koes, R. E., Spelt, C. E. and Mól, J. N. M.: The chalcone synthetase multigene family of Petúnia hybrida (V30): Differential, light-regulated expression during flower development and UV light induction, Plánt Mól. Bioi., 12, 213-225 (1989)].

In vitro virágpor-csíráztatás

A növényeket 18-22 °C-on növesztjük, standard üvegházi körülmények között. Virágport gyűjtünk a virágokról az „anthesis” stádiumában, majd szilárd táptalajon csíráztatjuk, amely 3 mmol/1 bórsavat, 1,7 mmol/1 kalcium-nitrátot, 10% szacharózt és 0,7% agart tartalmaz (pH=5,8). A virágport 2 óra hosszat inkubáljuk 24 °C-on a sötétben, majd 1% acetokarminnal festjük Bino és munkatársai leírása szerint [Bino, R. J., Hille, J. and Frankén, J. Kanamycin resistance during in vitro development of pollen írom trangenic tomato plants, Plánt Cell Rep., 6, 333-336 (1987)].

Példák

1. példa: Kiméra GUS-génekkészítése

A kiméra GUS-konstrukciókat úgy állítjuk elő, hogy a pRAJ 275 kódolórégióját [Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A. and Bevan, M. W., GUS fúsions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants, EMBO J., 6, 3901-3907 (1987)] klónozzuk egy EcoRI/HindlII fragment formájában, amelyet Klenowpolimerázzal feltöltöttünk, a VIP 122 Smal hasítási helyére, amely a CHS(A) farkat tartalmazza [van dér Meer, I. M., Spelt. C. E., Mól, J. N. M. and Stuitje, A. R.: Promoter analysis of the chalcone synthetase (chsA) gene of Petúnia hybrida: A 67 bp promoter region directs flower-specific expression, Plánt Mól. Bioi. 15, 95-109 (1990)], így kapjuk a pTS18 plazmidot. A pTS18 kiónt a pTZ18R plazmidba (Prómega) ligáljuk egy Sall/HindlII fragment formájában, így kapjuk a pTS19 plazmidot. A VIP102 CaMV35S promoterét [van dér Krol, A. R., Lenting, P. J., Veenstra, J. G., van dér Meer, I. M., Koes, R. E., Gerats, A. G. M., Mól, J. N. M. and Stuitje, A. R., An ,antisense chalcone synthase gene’ in transgenic plants inhibits flower pigmentation, Natúré, 333, 866-869 (1989)] EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd az EcoRI és BamHI enzimekkel emésztett pTS19 plazmidba építjük be, így kapjuk a pTS23 plazmidot (lásd a

2. ábrát). Az 5’-GAGCTCTAGAGGTGACAGAAATCTGCAG-3’ (6. számú szekvencia) és az 5’-CTGCAGATTTCTGTCACTCTAGAGCTC-3’ (7. számú szekvencia) oligonukleotidokat hagyjuk egymáshoz illeszkedni, majd az 5’-végükön T4 kinázzal foszforilezzük, és EcoRV enzimmel emésztett pTS23 plazmidba klónozzuk, így kapjuk a pTS24 plazmidot. A beépített anther box orientációját az anther boxot határoló egyik vagy mindkét restrikciós hasítási hely részleges emésztésével és a végükön jelzett fragmentek szekvenálógélen való futtatásával határozzuk meg. Az összes kiméra GUS-konstrukciót EcoRI/HindlII fragmentek formájában építjük be a Bin 19 ingázóvektorba [Bevan M._T Binary Agrobacterium vectors fór plánt transformation, Nucl. Acids Rés., 12, 8711-8712 (1984)].

2. példa: Kiméra antiszensz-CHS gének készítése Ugyanezt az anther boxot klónozzuk a

VIP 102 CaMV promoterének EcoRV hasítási helyére, amely a CaMV-antiszensz-CHS(A)-nos konstrukciót tartalmazza [van dér Krol, A. R., Lenting, P. J., Veenstra, J. G., van dér Meer, I. M., Koes, R. E., Gerats, A. G. M., Mól, J. N. M. and Stuitje, A. R., An ,antisense chalcone synthase gene’ in transgenic plants inhibits flower pigmentation, Natúré, 333, 866-869 (1989)]. A klónozott anther boxok orientációját és számát az 1. példában leírtak alapján határozzuk meg. A következő antiszensz-CHS(A) konstrukciókat juttatjuk be a Petúnia növényekbe:

pTS20 (egyetlen anther box a normális orientációban) pTS21 (két antherbox-másolat ellentétes orientációban) pTS22 (nyolc antherbox-másolat normális orientációban).

Mindegyik kiméra antiszensz-CHS(A) konstrukciót EcoRI/HindlII fragment formájában visszük be a Binl9 ingázóvektorba [Bevan M., Binary Agrobacterium vectors fór plánt transformation, Nucl. Acids Rés., 12, 8711-8712(1984)].

HU 219 543 Β

3. példa: Petúnia növények transzformálása

A GUS-konstrukciókat tartalmazó ingázóvektorokat (pTS23, amely a normál CaMV 35S promotert tartalmazza; pTS24, amely a hibrid AB-CaMV 35S promotert tartalmazza) vagy az antiszensz-CHS(A) konstrukciókat (pTS20, pTS21, pTS22) Escherichia coli JM83-ból [Messing, J., Recombinant DNA Technical Bulletin NIH Publication No. 79-99,2, 43-48 (1978)] Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 törzsbe visszük át [Hoekema, A. et al., Natúré, 303, 179-180 (1983)] háromszülős keresztezéssel [Rogers et al. (1986)] egy pRK.2013 plazmidot tartalmazó törzset használva [Ditta et al., Proceeding of the National Academy of Sciences, USA, 12, 7347-7351 (1980)]. Az exkonjugánsokat használjuk Petúnia hybrida levélkorongok transzformálására Horsch és munkatársai leírása szerint [Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffmann, N. L., Eichholtz, D., Rogers, S. G and Fraley, R. T., A simple and generál method fór transferring genes intő plants, Science, 227, 1229-1231 (1985)]. A levélkorongokat fiatal, nem virágzó növények legfelső leveleiből készítjük. A Petúnia hybrida W115 variánst használjuk a GUS-konstrukciókkal végzett transzformációs kísérletekben, míg a Petúnia VR hibridet használjuk az antiszensz-CHS(A) konstrukciókban. Miután indukáltuk a hajtásokat és a gyökeret kanamicint tartalmazó táptalajon, a növényeket földbe tesszük és üvegházba visszük át. Kontrollként azok a növények szolgálnak, amelyeket kanamicinmentes táptalajon regenerálunk ingázóvektort nem tartalmazó LBA4404 törzzsel transzformáit levélkorongokból.

4. példa: A GUS-konstrukciót expresszáló transzgenikus növények elemzése

Az anther boxnak a génexpresszió szabályozására kifejtett hatásának tanulmányozására a GUS-konstrukciókat tartalmazó transzgenikus növényekben elemezzük az expressziós mintázatot, a kísérleti részben közölt módszereket alkalmazva.

Körülbelül 25 független, az AB/CaMV 35S-GUS konstrukciót tartalmazó Petúnia növényt és 25, a kontroll CaMV-GUS konstrukciót tartalmazó Petúnia növényt elemzünk. Mivel a bejuttatott gén expressziójának szintje különbözhet a független transzformánsok között az úgynevezett pozíciós hatás következtében [Weising et al., Annu. Rév. Génét., 22, 241-277 (1988)], ezért az exogén génnek a pártában mért GUS-aktivitását használjuk belső standardként az egyes transzformánsok hím portokjában mért aktivitás belső standardjaként. A hibrid promoterkonstrukciót tartalmazó növényeknél az átlagos arány (azaz az összes növényből vett összege) magasabb, mint a kontroll-promoterkonstrukciót tartalmazó növényeknél. Annak ellenőrzésére, hogy ez szignifikáns-e, az összes külön mérést a Wilcoxon-rankteszttel elemezzük. Az a <0,05 szinten a GUS-akti vitás a hím portokokban a pártával szemben lényegesen magasabb azokban a transzformánsokban, amelyek az AB/CaMV 35S promoter GUS-konstrukciót tartalmazzák, mint azokban a transzformánsokban, amelyek a kontroll-CaMV konstrukciót tartalmazzák.

Az anther box jelenléte 3-szorosára fokozza a CaMV által meghajtott GUS-aktivitást a hím portokokban a pártában mért aktivitáshoz viszonyítva.

Abból a célból, hogy meghatározzuk, vajon az anther box szekvencia beépítése a CaMV promoterbe megváltoztatja-e mennyiségileg az expressziót a hím portokokban, a sejttípus-specifikus GUS-expressziót követjük hisztokémiai módszerekkel (lásd a kísérleti részt). A keresztmetszetekben a Petúnia hím portok (belülről kifelé) egy vaszkuláris hengert tartalmaz, a kötőszövet parenchymasejtjeivel körülvéve, majd négy lókuszt, amelyek a sporogén szövetet (virágpor) tartalmazzák, valamint az endotheciumot. Mindegyik lókuszt egy specifikus sejtekből álló réteg vesz körül (tapetum), amely a sporogén sejteket táplálja. A hím portok későbbi fejlődési fázisában a lókuszok tönkremennek a stomiumnál, és a virágporszemek kiszabadulnak.

Több független CaMV-GUS transzformáns hím portokjának keresztmetszeti felületét az X-gluc GUSszubsztráttal inkubáljuk, ami erős kék elszíneződést mutatott a hím portoknak majdnem az összes különböző sejttípusában. A CaMV promoter vezérli a GUS-aktivitást a vaszkuláris hengerben, a kötőszövetben és az endotheciumban, de a tapetumsejtekben nem figyelhető meg GUS-aktivitás. Festődés nem figyelhető meg a transzformálatlan kontrollnövényekben pH=8,0 mellett. Ha a festőpuffer pH-ját 7-re csökkentjük, akkor háttérfestődés figyelhető meg a transzformálatlan hímportok-szövetekben, ezért az összes festési kísérletet pH=8,0 mellett végezzük. A CaMV-GUS-szal transzformáit hím portokok vizsgálata egyedi sejtszinten azt mutatta, hogy a CaMV-GUS-szal transzformált hím portok összes sejttípusában kék festék kicsapódása figyelhető meg, a tapetumsejtek kivételével. Több független, AB/CaMV 35S promoterrel vezérelt GUS-gént expresszáló transzformáns egy kicsit eltérő GUSfestődési mintázatot mutat a normális CaMV-GUS-t expresszáló sejtekhez képest. A normális CaMV-GUS festődési mintázat mellett a tapetumsejtek tiszta kék festődése is megfigyelhető. A kék kicsapódás a tapetumsejtekben sokkal jobban elkülöníthető egyedi sejtszinten. Mind a fluorimetriás, mind a hisztokémiai GUSvizsgálat az anther box CaMV promoterbe való épülése világos hatását mutatja, nemcsak a GUS-expresszió szintjén, hanem az említett hibrid promoter által vezérelt GUS-expresszió sejttípus-specifitása szintjén is.

5. példa: Az antiszensz-CHS(A) konstrukciókat expresszáló transzgenikus növények elemzése

Harmincegy független Petúnia (VR hibrid) transzformánst kaptunk összesen, amelyek közül 5 növény hozott virágot csökkent hímportok-pigmentációval. Nincs korreláció a párta pigmentációja és a hím portok pigmentációja gátlásában. A pigmentált és nem pigmentált hím portok minden kombinációja megfigyelhető normálisan pigmentált pártákkal, illetve csökkentett pigmentációjú pártákkal. A transzformációhoz használt mindhárom konstrukcióval (azaz pTS20, pTS21, pTS22) fehér hím portokok kaphatók. A hím portokok gátlása tehát függetlennek tűnik a beépített anther

HU 219 543 Β boxok számától és orientációjától. A Petúnia VR hibrid pTS20 konstrukcióval (egy anther box a normális orientációban) való transzformációja 11 transzgenikus növényt eredményezett, amelyek közül 5 mutatott normál fenotípust, 5 növény mutatta a párta csökkentett pigmentációját és egy növény hozott olyan virágokat, amelyben a párta színes volt és a hím portok fehér. A pTS21-gyel való transzformáció (két kópia anther box ellentétes orientációban) 15 független transzformánst eredményezett, amelyek közül kilencben nem volt megfigyelhető hatás; 5 növény olyan virágokat hozott, amelyekben a pártapigmentáció csökkent mértékű, és ezek közül kettő fehér hím portokokkal rendelkezett; egy transzformáns fenotípusa mutatott vad típusú színes virágokat fehér hím portokkal. A pTS22-t tartalmazó (8 kópia anther box normálorientációban) kilenc független transzformáns közül hétnek volt vad fenotípusa; egy növény hozott csökkent pigmentációjú virágokat, és egy növény hozott olyan virágokat, amelyekben fehér hím portokok és normálisan színezett párták voltak.

Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk azt, hogy a hím portok pigmentációjának csökkenése a hím portokban levő CHS mRNS-szint csökkenéséből származik-e, a fehér és bíborszínű hím portokokból össz-RNS-t izolálunk, és vizsgáltuk az RNáz-protekciós módszerrel. Ebben a protekciós kísérletben ³²P-vel jelzett antiszensz V30-CHS RNS-t használva próbaként, az endogén VR CHS transzkriptumok négy alffagmentre emésztődnek. A hím portok pigmentációjáról kiderült, hogy azt a hím portokokban levő CHS mRNS steady State szintjének specifikus csökkenése kíséri.

Meglepő módon, a transzgenikus növények kapcsoltsági vizsgálat céljából végzett önbeporzása során világossá vált, hogy a fehér virágpor steril. A nem pigmentált hím portokokat tartalmazó transzformánsok nem voltak képesek érett, egészségesnek látszó magvakat hozni az önbeporzás után. Csak nagyon ritkán keletkezett néhány mag, de ezek nem csíráztak ki. Annak meghatározására, hogy a hím portok (és virágpor) fejlődésének melyik stádiumában kezdenek a fehér virágporszemek degenerálódni, különböző fejlődési stádiumban levő fehér hím portokok keresztmetszeti felületét vizsgáljuk mikroszkóp alatt. A fehér hím portokok fejlődése nem tért el túlságosan a normális Petúnia hím portokjának fejlődésétől. A virágporszemek azonban a tetrád-, azaz korai mikrospóraállapotba való fejlődés után megálltak. A fehér hím portokokból származó virágpor in vitro saijadzása azt mutatja, hogy nem keletkeznek virágportubusok.

A virágpor fejlődésének ez a korai állapota egybeesik a flavonoidgének expressziójának beindulásával. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a flavonoidoknak feltételezhetően van reakciójúk a virágpor fejlődésének korai binukleáris állapotában. Ebből az a következtetés vonható le, hogy a virágpor fejlődésének a helyreállítása, azaz például a helyreállító gén szintézisének indukciójával, körülbelül ebben az állapotban kezdődhet.

Az FI generáció biztosítására a fehér portokkal rendelkező hímsteril transzformánsokat a V30 Petúnia variánssal porozzuk be. A hímsteril növények teljesen termékeny anyanövények.

A primer transzformánsok utódainak elemzésével megállapítható, hogy a bejuttatott tulajdonságok stabilak, és az utódok előre meghatározható módon örökölhetik. Egy fehér virágport termelő steril Petúnia transzformánst keresztezünk a Petúnia Hybrida (V30) növénnyel, majd az FI nemzedéket mind a „fehér virágpor” fenotípus alapján, mind pedig az inszertnek Southern blottal végzett elemzése alapján elemezzük. Számos utódnövény leveleiből DNS-t vonunk ki, és a Southern blot-elemzés az egy inzerttel rendelkező antiszensz fenotípus teljes koszegregációját mutatja.

6. példa: A himsteril növények önbeporzása

Steril Petúnia virágport veszünk az antiszensz-chs-t közepesen expresszáló növényekből, és önbeporzásra használjuk a kvercetin-, kempferol- vagy miricetinflavonolokkal kombinálva. Ezeket a növényeket azon az alapon választjuk ki, hogy kisszámú (1%-nál kevesebb) életképes, éretlen virágport tartalmaznak; ezeket a virágporszemeket in vitro életképessé lehet tenni. A steril virágport normál virágportáptalajra visszük (BK táptalaj: 100 mg/1 bórsav, 300 mg/1 kalcium-nitrát, 200 mg/1 magnézium-szulfát, 100 mg/1 kálium-nitrát, 12,5% szacharóz steril vízben), amelyet kvercetinnel, miricetinnel vagy kempferollal egészítünk ki 100 nmol/1-3 pmol/l végkoncentrációra, majd anyanövények bibéjére pipettázzuk.

A flavonoidvegyületek ez előzőkben jelzett koncentrációtartományban hatékonyak; az optimális koncentráció nem adható meg, mivel ez nagyon erősen függ az egyes használt hímsteril növényektől; ez valószínűleg azzal a ténnyel magyarázható, hogy néhány antiszensz-chs növény még termel kis mennyiségben kalkon-szintázt, amely nyilvánvalóan befolyásolja a szaporítószervekben jelen levő flavonoidvegyületek koncentrációját.

A beporzás után magok megjelenése figyelhető meg, majd a magokat összegyűjtjük. A magvak normálisan csíráznak, és ezekből a növényekből teljes növények kaphatók.

Ezeknek az önbeporzására végzett kísérletek azt az eredményt adják, hogy ezek még hímsterilek. Ezek a növények használhatók homozigóta anyanövényekként egy hímtermékeny donorral való keresztezésben, azzal a céllal, hogy gyorsan nagy mennyiségben kapjunk heterozigóta hímtermékeny növényeket hibrid magvak előállítása céljából.

Várható, hogy mivel a virágpor sterilitásának leküzdésére használt vegyületek flavonolok, amelyek számos növényben előfordulnak, ezért a normál növényi bibékből, pártaszövetből és feltehetően a mentor virágporból (besugárzással sterillé tett virágpor) készített kivonatok is használhatók arra, hogy a találmány szerinti hímsteril növényből származó virágport kiegészítsük vele.

Az alábbiakban részletesen megadjuk a leírásban említett szekvencialisták adatait:

(1) Információk az 1. számú szekvenciáról:

(i) A szekvencia jellemzői:

HU 219 543 Β (A) Hossz: 16 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: nem (iv) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:

(A) Szervezet: Petúnia hybrida (D) Más információ: label=EcoRI (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia: TNGAGGWGAM RDARWW (2) Információk a 2. számú szekvenciáról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 16 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: igen (iv) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:

(A) Szervezet: Petúnia hybrida (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia:

TAGAGGTGAC AGAAAT (3) Információk a 3. számú szekvenciáról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 16 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: igen (iv) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:

(A) Szervezet: Petúnia hybrida (xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia:

TAGAGGTGACAAAAAT (4) Információk a 4. számú szekvenciáról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 16 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: igen (iv) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:

(A) Szervezet: Petúnia hybrida (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia:

TNGAGGAGAA AAAGAT (5) Információk az 5. számú szekvenciáról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 16 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: igen (iv) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:

(A) Szervezet: Petúnia hybrida (xi) A szekvencia leírása: 5. számú szekvencia: TAGAGGAGAA GTAATA (6) Információk a 6. számú szekvenciáról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 28 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: igen (iv) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:

(A) Szervezet: Petúnia hybrida (xi) A szekvencia leírása: 6. számú szekvencia:

GAGCTCTAGA GGTGACAGAA ATCTGCAG (7) Információk a 7. számú szekvenciáról:

(i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hossz: 28 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: DNS (genomiális) (iii) Elméleti: igen (iv) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:

(A) Szervezet: Petúnia hybrida (xi) A szekvencia leírása: 7. számú szekvencia:

CTGCAGATTT CTGTCACTCT AGAGCTC

Claims (19)

1. Rekombináns polinukleotid, amely egy szaporodási szervekkel rendelkező növény olyan célgénje ellen irányul, amelynek kifejeződése a növénynek mind a hímivarú, mind a nőivarú termékenységét biztosítja, és amely növényben olyan bioszintézisút áll fenn, amelyben egy sor olyan enzim termelődik, amelyek kaikon lépésenkénti szintézisét katalizálják, és az említett célgén a kaikon bioszintézisútjának egy enzimjét kódolja, amely rekombináns polinukleotid tartalmaz:

(a) egy olyan RNS-molekulát vagy polipeptidet kódoló gént, amely a növényben elégséges szinten termelődve az említett célgén kifejeződését gátolva a növényt hímsterillé teszi a növény nőivarú termékenységének érintetlenül hagyásával, és (b) egy, az előbbi gátlógénhez működőképesen kapcsolódó promotert, amely promoter elegendően aktív a növény hím portokjaiban az említett RNS-molekulának vagy polipeptidnek a növény hím portokjaiban megfelelő szinten való kifejeződésének elősegítésére.

2. Az 1. igénypont szerinti rekombináns polinukleotid, amely egy, a cinnamát-4-hidroxiláz (CH₄; E. C. 1.14.13.11), 4-kumaroil-CoA ligáz (4CL; E. C. 6.2.1.12) és a kalkon-szintetáz enzim (CHS; E. C. 2.3.1.74) által alkotott csoportba tartozó enzimet kódoló célgén kifejeződését gátlógénterméket kódoló gént tartalmaz.

HU 219 543 Β

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti rekombináns polinukleotid, amely gátlógénként egy antiszensz gént tartalmaz.

4. A 3. igénypont szerinti rekombináns polinukleotid, amely egy magas szintű expressziót biztosító promoterfragmentumból és egy, a chs-A gén, chi-B gén, chs-J gén és a dffA gén által alkotott csoportba tartozó gén promoterrégiójából származó anther boxból álló, a növény hím portokjaiban aktív promotert tartalmaz.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns polinukleotid, amely magas szintű expressziót biztosító promoterfragmentumként a CaMV 35S promoter egy fragmentumát, valamint egy

TAGAGGTGAC AGAAAT szekvenciájú anther boxot tartalmaz az említett fragmentumnak a transzkripciós startpozíciójához viszonyított -90-es pozíciójába beépítve.

6. Eljárás hímsteril növény előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) az 1 -5. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns polinukleotidot juttatunk be egy hímtermékeny növény sejtjeibe;

(b) a rekombináns polinukleotidot beépítve tartalmazó sejtekből teljes új növényeket hozunk létre; és (c) kiválasztjuk a hímsteril növényt.

7. Rekombináns növényi genom, amely beépülve egy, az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns polinukleotidot tartalmaz.

8. Hímsteril növény, amely a 7. igénypont szerinti rekombináns növényi genomot tartalmaz.

9. Sejt, gyümölcs, mag vagy utód, amely egy 8. igénypont szerinti hímsteril növényből származik, és az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns polinukleotidot tartalmaz.

10. Eljárás egy 8. igénypont szerinti hímsteril növény önbeporzott magvainak előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) éretlen pollent nyerünk a hímsteril növénytől, és ezt egy alkalmas flavonoidvegyület jelenlétében érlelésig inkubáljuk; majd (b) a hímsteril növény bibéjét érintkezésbe hozzuk az érlelt pollennel; majd (c) hagyjuk, hogy a pollen kicsírázzon a bibén és megtermékenyítse a hímsteril növényt; és (d) hagyjuk, hogy a növény magot hozzon.

11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pollent egy, a miricetin, kvercetin és kempferol által alkotott csoportból választott flavonoidvegyületet 100 nM-tól 3 μΜ-ig terjedő koncentrációtartományban tartalmazó alkalmas pollentáptalajban szuszpendáljuk a pollennek a hímsteril növény bibéjével való érintkezésbe hozása előtt.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pollent a következő összetevőket steril vízben oldva tartalmazó táptalajban szuszpendáljuk: 100 mg/1 H₃BO₃,300 mg/1 Ca(NO₃)₂,200 mg/1 MgSO₄,100 mg/1 KNO₃,12,5 tömeg%.

13. Önbeporzással kapott mag, amelyet a 10-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás alkalmazásával állítottunk elő, és az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti polinukleotidot tartalmaz.

14. Eljárás heterozigóta hímsteril növények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 8. igénypont szerinti homozigóta hímsteril növényt egy hímtermékeny növénnyel megtermékenyítünk, betakarítjuk a magokat, és a magokból heterozigóta hímsteril növényeket nevelünk.

15. Eljárás hibrid magvak előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 8. igénypont szerinti hímsteril növényt egy hímtermékeny növénnyel keresztezünk, és begyűjtjük a hibrid magokat.

16. Hímsteril növény előállítására alkalmazó anther box, amely egy, a chs-A gén, chi-B gén, chs-J gén és dfrA gén által alkotott csoportból választott gén promoterrégiójából nyerhető.

17. Hímsteril növényt eredményező eljárásban alkal mazható oligonukleotid, amely a

TNGAGGWGAMRDARWW (1. számú szekvencia) szekvenciát tartalmazza, amelyben N=A, G, C vagy T; W=A vagy T; M=A vagy C; R=A vagy G; és D=A, G vagy T.

18. Hímsteril növényt eredményező eljárásban alkalmazható oligonukleotid, amely a (a) TAGAGGTGACAGAAAT (2. számú szekvencia), (b) TAGAGGTGACAAAAAT (3. számú szekvencia), (c) TNGAGGTGACAAAGAT (4. számú szekvencia), (d) TAGAGGAGAAGTAATA (5. számú szekvencia) szekvenciák - amelyekben N=A, G, C vagy T - által alkotott csoportból választott szekvenciát tartalmaz.

19. A pTS20, pTS21, illetve pTS22 plazmidokból álló csoportból választott plazmid, amely tartalmaz egy kiméra CaMV-antiszensz-CHS (A) konstrukciót, amelynek promoterébe vagy egyetlen anther box a normális orientációban, vagy két antherbox-másolat ellentétes orintációban vagy nyolc antherbox-másolat normális orientációban van működőképesen beépítve.