CZ214593A3 - Plants exhibiting male sterility, process of obtaining thereof and recombinant dna for application of such process - Google Patents

Plants exhibiting male sterility, process of obtaining thereof and recombinant dna for application of such process Download PDF

Info

Publication number
CZ214593A3
CZ214593A3 CS932145A CS214593A CZ214593A3 CZ 214593 A3 CZ214593 A3 CZ 214593A3 CS 932145 A CS932145 A CS 932145A CS 214593 A CS214593 A CS 214593A CZ 214593 A3 CZ214593 A3 CZ 214593A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
plant
male
gene
plants
sterile
Prior art date
Application number
CS932145A
Other languages
English (en)
Inventor
Adrianus J Van Tunen
Ingrid M Van Der Meer
Josephus N M Mol
Original Assignee
Mogen Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mogen Int filed Critical Mogen Int
Publication of CZ214593A3 publication Critical patent/CZ214593A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12N9/1037—Naringenin-chalcone synthase (2.3.1.74), i.e. chalcone synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13011—Trans-cinnamate 4-monooxygenase (1.14.13.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Vynález se týká rekombinantní DNA, zejména pak rekombinantní DNA, která má vztah ke genetické manipulaci rostlin. Dále se vynález týká rostlin, které vykazují v jádře zakódovanou samčí sterilitu díky expresi této rekombinantní DNA. Konečně se vynález týká také části těchto rostlin, které jsou sexuálně a/nebo asexuálně reprodukovatelné.
Dosavadní stav techniky
Již dlouhou dobu je známo, že semena získaná křížením mezi různými odrůdami jednoho druhu poskytují potomstvo s lepšími vlastnostmi, pokud se týče výnosu, vhodnosti vzhledem k životnímu prostředí a odolnosti proti chorobám, ve srovnání s potomstvem pocházejícím ze semen získaných při samoopylení. Tento jev je obecně označován za heterózu. Z tohoto důvodu je cílem semenářství získat hybridní osivo u co největšího počtu zemědělských a zahradnických plodin, poněvadž takové osivo má vyšší obchodní hodnotu.
Naneštěstí však mnohé plodiny nesou samčí a samičí reprodukční orgány na stejném jedinci, což má za následek, že silně převládá samoopylení nad cizosprašností. Aby tedy bylo možno získat semena vzniklá křížením, bylo by potřeba mít k dispozici akceptorové rostliny, které nejsou samosprašné díky nepřítomnosti (správně fungujícího ) pylu. Těchto rostlin vykazujících samčí sterilitu či samičích rodičovských rostlin by pak bylo možno použít při křížové fertilizaci za použití samčí fertilní donorové rostliny, za vzniku hybridních semen.
Při produkci hybridního osiva ve velkém měřítku se pak obvykle rostliny vykazující samčí sterilitu a rostliny vykazující samčí fertilitu dohromady pěstují na poli, aby se jim umožnila cizosprašnost a potom se provede selekce semen hybridu. V závislosti na použitém typu rostliny vykazující samčí sterilitu se selekce či separace semen hybridu provádí před sklizní, tj . zničením nebo odstraněním donorových rostlin vykazujících samčí fertilitu, které poskytují nehybridní osivo, nebo po sklizni, například za použití markéru, jako je barva semen u kukuřice nebo jiný snadno rozeznatelný fenotyp. Selekce před sklizní je proveditelná v tom případě, že lze rostliny vykazující samčí fertilitu rozeznat od rostlin vykazujících samčí sterilitu a potom je odstranit nebo zničit. Alternativně, pokud* je lokus samčí sterility těsně spojen se selekčním markérem (jako je odolnost vůči herbicidům), mohou rostliny vykazující samčí sterilitu, které nesou hybridní semena, vyřadit při konkurenci rostliny vykazující samčí fertilitu, když se na kulturu aplikuje vhodný selekční tlak.
Jako rodičovské linie rostlin vykazujících samčí sterilitu se používá například fyzicky vykastrovaných rostlin nebo, pokud jsou k dispozici, mutantů vykazujících samčí sterilitu zakódovanou v cytoplasmě nebo jádře. Takové přírodní rostliny vykazující samčí sterilitu mají své nevýhody, a€ již je to velmi pracné získávání, přítomnost přídavných nežádoucích vlastnosti, obtížnost pěstování a rozmnožování, nepředvídatelná dědičnost nebo omezená dostupnost přírodních mutantů se samčí sterilitou u obchodně zajímavých plodin.
Teprve od nedávná jsou známé rostliny, u nichž je samčí sterilita zakódována v jádře za použití genetického inženýrství, kterých je možno používat při produkci hybridních semen a které postrádají alespoň některé z nevýhod většiny přírodních mutantů se samčí sterilitou.
V mezinárodní patentové přihlášce WO 90/08830 firmy ICI byly navrženy obecné způsoby produkce regenerovatelných rostlin se samčí sterilitou, které v podstatě zahrnují expresi buď a) genu kódujícího proteinový inhibitor nebo b) tzv. killer (žabí ječového) genu. Tyto geny se potom exprimují v samčích rostlinách, přičemž dochází k usmrcení buněk prašníků a připojených tkání. Jako příklady killer genů je možno uvést geny, které při expresi působí na mitochondriální metabolismus.
V mezinárodní patentové přihlášce WO 90/08831 firmy ICI byla popsána inhibice buněčné respirace expresí přerušovacího (disrupter) genu. Touto expresí se dosáhne inhibice funkce mitochondrií., která nakonec vede až k usmrcení buněk, v nichž se tyto geny exprimují. Přednostními přerušovacími (dirupter) proteiny jsou a) savčí odpřahovací (uncoupling) protein (UCP), b) proteiny, kódované mutovanou formou genu pro β-l podjednotku, F1~ATPasy, přičemž tyto mutační změny způsobí neschopnost těchto podjednotek spojit se ve funkční ATP-synthasu, c) proteiny, kódované mutovanou syntetickou formou olil genu, který kóduje podjednotky 9 F0-ATP-asy, d) mutované formy mitochondriálního přenašečového peptidů, které způsobí přerušení proteinového transportu do mitochondrií, e) přerušovací fúzní protein, jehož exprese se dosáhne použitím genových konstruktů, způsobujících fúzi mezi genem pro β-podjednotku (ATP-asy) z kvasinek a genem pro β-galaktosidasu z E. coli. Přednostně by taková exprese, podle upřesnění, měla být regulována řízením tapetum
- specifického nebo pylově-specifického promotoru.
V mezinárodní patentové přihlášce WO 89/10396 firmy PGS se navrhují obecné způsoby pro získání samčích sterilních rostlin transformací jaderného genomu rostliny
DNA, způsobující samčí sterilitu (tzv. male-sterility DNA). Tato DNA obsahuje úseky, které kódují RNA nebo polypeptid, obojí schopné narušit řádný metabolismus, fungování a/nebo vývoj které buňky, ve které se tato DNA exprimuje.
Přednostně vede exprese této DNA až k usmrcení takové buňky. Příkladem takové (male-sterility) DNA jsou ty úseky DNA, které kódují DNA-asy, RNA-asy, proteásy nebo enzymy syntézy fytohormonů jako je cytokinin. Alternativně je navrženo, že se uvedená (male-sterility) DNA vybere ze skupiny obsahující pozitivní řetězce DNA, které kódují vlákno DNA komplementární k vláknu DNA, které se přirozeně přepisuje v rostlinných tyčinkových buňkách. Kromě TA29 genu, TA-26 genu a TA13 genu, což jsou všechno tapetum-specifické geny, získané z tabákové rostliny, se neuvádí žádná stopa, vedoucí k určení zmíněných genů. V článku Koltunowa a dalších (Koltunow A. Μ., Truettner J., Cox K.H., Wallroth M. a Goldberg R.B. (1990),1 Different temporal and spatial gene expression patterns during anther development, Plant Cell 2, 1201-1224) se uvádí, že klony TA13 a TA29 byly identifikovány jako klony, kódující takzvané glycinově bohaté (Glycine Rich) proteiny, zatímco klon TA26 odpovídá cDNA dosud neznámé povahy.
V evropské patentové přihlášce EP-A-0 329308 firmy Palladin Hybrids se navrhuje způsob přípravy samčích sterilních rostlin, zahrnující přípravu geneticky transformované samičí rodičovské rostliny. Tento způsob zhruba spočívá v inzerci rekombinantních sekvencí DNA, obsahujících pozitivní DNA, do genomu uvedené rostliny. Pozitivní DNA blokuje produkci funkčních pylových zrn nebo způsobí, že vyvíjející se pylová zrna jsou citlivá na nějaké chemické činidlo nebo fyziologický stres, což jsou faktory blokující produkci funkčních pylových zrn. Přednostně je exprese uvedených antimediátorových genů řízena promotorem specifickým pro pylové geny. Geny, které jsou klíčové pro produkci funkčních pylových zrn, podle specifikace této patentové přihlášky, by se měly specificky exprimovat v mikrosporách, přednostně v premiotickém stadiu. Příklady mikrosporových specifických klonů jsou L4 a L19, získané z Brassica napus. Kromě obecného vyznačení premeiotických genů a letmo zmíněných klonů se v přihlášce neudává žádné další ponaučení s ohledem na povahu genů, jejich exprese se má blokovat.
Evropská patentová přihláška 0335451 firmy Vereniging voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs popisuje, že inhibice exprese genu pro chalcon synthasu v květech, dosažená použitím antimediátorového genového konstruktu způsobí změněné zbarvení květu. Antimediátorový gen byl v tomto pokusu umístěn pod kontrolu konstitutivního 35S promotoru mozaikového viru květáku (CaMV). Rostliny se změněným zbarvením květu jsou stále schopné tvořit fertilní pyl.
Chalcon synthasa je klíčový enzym v biosyntéze flavonoidů. Tento enzym katalýzuje postupnou kondenzaci tří acetátových zbytků z malonyl-CoA a jednoho zbytku z 4-kumaroyl-CoA za vzniku naringenin chalconu. Izomerizace a další substituce tohoto centrálního meziproduktu konečně vede k tvorbě flavonoidů. Flavonoidy jsou sekundární metabolity, známé tím, že mají klíčovou funkci ve zbarvení květů a plodů. Kromě toho se zdá, že flavonoidy jsou zapojeny do obrany proti fytopathogenům (Lamb C.J. Lawson M. A. , Dron M. a Dixon R.A. (1989) Signals and transduction mechanisms for activation of plant defenses against microbial attack, Cell 56, 215-224), do ochrany proti UV-světlem (Schmelzer E. , Jahnen W. a Hahlbrock K. (1988) In šitu hybridization of light-induced chacone synthase mRNA, chalcone synthase, and flavonoid endproducts in epidermal cells of parsley leaves. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 2989-2993) a do indukce nodulace (Long S. (1989) Rhizobium-legume nodulation: Life together in the underground, Cell 56, 203-214). Flavonoidy také působí na regulaci transportu auxinu. (Jacobs M. a Rubery P.H. (1988) Natural occuring auxin transort regulators, Science 241, 246-349) a rezistenci vůči hmyzu (Hedin P.A. a Waage S.K. (1986) Roles of flavonoids in plant resistance to insects v Progress in Clinical and Biological Research, sv. 213: Plant Flavonoids in Biology and Medicine. vydavatelé: V. Cody, E. Midleton Jr. a J. B. Harborne (New York Alan R. Liss), str. 87-100).
Toto množství flavonoidových funkcí vyžaduje úměrně komplexní regulaci genů, kódujících různé enzymy dané dráhy. Například exprese genů pro biosyntézu antokyanů je květově specifická, závisí na světle a je vývojově řízena (Tunen A. J. , van Koes R.E., Spelt C.E., van der Krol A.R., Stuitje A.R. a Mol J. N.M. (1988) Cloning of the two chalcone flavanone isomerase genes from Petunia hybrida: Coordinate, light-regulated and differential expression of flavonoid genes, EMBO J. 7, 1257-1264; Koes R.E., Spelt C.E. a Mol J.N.M. (1989) The chalcone synthase multigene fam£ly of Petunia hybrida (V30): Differential light-regulated expression during flower development and UV light induction, Plant. Mol. Biol. 12, 213-225). Avšak exprese těchto genů v jiných tkáních může být indukována UV světlem, poraněním nebo napadením houbami (Dixon R.A.(1986) The phytoalexin responses: Eliciting, signalling and control of host gene expression, Biol. Rev. 61, 239-291; Koes a další (1989);
Lamb a další (1989), články uvedeny výše v textu).
Srovnání CHS-A promotoru s jinými promotory genů syntézy flavonoidů, které jsou aktivní v nezralých prašníkových tkáních (například CHS-J, DFR-A a CHI-B) vedlo k objevení přítomnosti silně konzervované oblasti nazvané anther box (prašníkový box) (van Tunen A.J., Hartman S.A., Mur L.A.
a Mol J. Ν. M. (1989) Regulation of chalcone isomerase (CHI) gene expression in Petunia hybrida: The use of alternativě promoters in corolla anthers and pollen, Plant Mol. Biol.
12, 539-551).
Deleční analýzy, CHS-A promotoru svědčí o tom, že anther boX samotný není odpovědný za anther-specifickou (prašníkove specifickou) expresi, ale že se může účastnit regulace anther-specifické exprese ve spojení s jinými sekvencemi přítomnými v CHS-A promotoru (van der Meer I.M. Spelt C.E., Mol J.N.M. a Stuitje A.R. (1990) Promotér analysis of the chalcone synhase (chsA) gene of Petunia hybrida: A67 bp promotér region directs flower-specific expression, Plant Mol. Biol. 15, 95-109).
V roce 1981 Coe a další (Coe E.H., Jr., McCormick S,M. and Modena S.H. (1981), White pollen in maize. J.
Hered. 72, 318-320) zjistili, že zdravě výpadjící bílý pyl v kukuřici nefunguje normálně a vznesli hypotézu, že syntéza pigmentů nebo její odstranění mohou být životně důležité pro fungování pylu. V tomto článku však autoři z výsledků nevyvodili, že flavonoidy se účastní na vývoji pylu, jestliže tento fakt přímo nezpochybnili. Pokud je nám známo, ani v dalších letech nebyl podán žádný přesvědčivý důkaz, týkající se funkce flavonoidů ve vývoji životaschopného pylu.
Následuje definice používaných pojmů:
Anther box (prašníkový box): nukleotidové sekvence, která je totožná nebo alespoň velmi homologní s jakoukoliv sekvencí uvedenou na obr. 1.
Antimediátorový gen: gen nebo od něj odvozená nukleotidové sekvence, z více než 50 % homologní, přednostně z více než % homologní, s cílovým genem zde definovaným, která je vázaná na promotor v opačné (od 5' ke 3' konci) orientaci vzhledem k cílovému genu.
Gen: nukleotidové sekvence, která se může exprimovat v podobě RNA molekuly a/nebo polypeptidu.
Hybridní promotor: promotor, který se skládá z nukleotidových sekvencí nebo jednotlivých nukleotidů, které spolu přirozeně nejsou spojeny nebo které se v promotoru přirozeně nenacházejí v tomto pořadí.
Inhibiční gen: gen nebo antimediátorový gen, jehož exprese vede k úplné inhibici exprese cílového genu, zde definovaného.
Promotor: nukleotidová sekvence, která je schopná vyvolat expresi genu nebo antimediátorového genu nebo nukleotidových sekvencí od nich odvozených, přičemž tato exprese vede k tvorbě RNA molekuly a/nebo polypeptidu.
Restaurační (obnovovací) gen: gen, přednostně fúzní gen, obsahující při nejmenším nukleotidovou sekvenci, která je dostatečně stejná,podobná nebo homologní s částí cílového genu zde definovaného, aby byla schopná, ze podmínek exprese, komplementárně asociovat s transkriptem, vytvořeným působením inhibičního genu, zde definovaného.
Cílový gen: gen, jehož exprese se má inhibovat vlastní expresí vhodného inhibičního genu, zde definovaného.
Pro účely této patentové přihlášky jsou všechna numerická vyznačení pozic bází, které jsou pod kontrolou určitého genu, vztažena k předpokládanému startovnímu místu transkripce odpovídajícího genu.
Podstata vynálezu
Úkolem tohoto vynálezu bylo získat rostliny se samčí sterilitou, které se mohou bezpečně použít pro produkci hybridního osiva. Úkolem vynálezu bylo dále poskytnout rostliny se samčí sterilitou, které by se daly získat v homozygotní podobě tak, aby se ve velkém měřítku vytvořily heterozygotní rostliny se samčí sterilitou, efektivně vzhledem k vynaloženým nákladům.
Předmětem vynálezu jsou rekombinantní polynukleotidy, které se mohou vhodně použít pro získání rostliny se samčí sterilitou a které v podstatě obsahují:
a) inhibiční gen schopný inhibovat expresi cílového genu uvedené rostliny, kódujícího enzym z metabolické dráhy pro biosyntézu chalconu a
b) promotor, který je aktivní v prasnicích uvedené rostliny, operabilně spojený s uvedeným inhibičním genem tak, aby se dosáhlo exprese tohoto genu v prasnicích uvedené rostliny.
Přednostní cílový gen podle tohoto vynálezu kóduje enzym vybraný ze skupiny, která se skládá z cinnamát 4-hydroxylasy (C4H; E.C. 1.14.13.11), 4-kumaroyl-GoA ligasy (4CL; E.C. 6.2.1.12) a chalcon synthasy (CHS; 3.C.2.3.1.74.) Zvláště přednostním cílovým genem je gen, kódující v rostlině chalcon synthasu (CHS). Přednostně podle tohoto vynálezu je inhibičním genem antimediátorový gen namířený proti cílovému genu. Dále přednostně podle tohoto vynálezu obsahuje promotor, aktivní v prasnicích dané rostliny, fragment vysoce účinného promotoru skupiny genů, skládající se z genů chs-A, chi-B, chs-J a dfrA z rodu Petunia. Zvláště přednostně obsahuje vysoce účinný promotor fragment CaMV 35S promotoru a anther box o sekvenci
TAGAGGTGACAGAAAT (SEQIDNO: 2) vložené v uvedeném fragmentu na pozici -90 vzhledem k startovnímu místu transkripce.
Předmětem vynálezu je také způsob získávání rostliny se samčí sterilitou, který se skládá z následujících kroků:
a) přenesení rekombinantního polynukleotidu podle tohoto vynálezu do buněk rostliny se samčí fertilitou,
b) vytvoření celých nových rostlin z buněk s inkorporovaným uvedeným rekombinantním polynukleotidem a
c) výběr rostliny se samčí sterilitou.
Vynález dále zahrnuje rekombinantní rostlinný genom, obsahující do něj inkorporovaný rekombinantní polynukleotid podle tohoto vynálezu. Dalším předmětem tohoto vynálezu je nukleotidová sekvence s pořadím bází:
TNGAGGWGAMRDARWW (SEQIDNO: 1) kde N = A, G, C, nebo T; W = A nebo Τ; M = A nebo C; R = A nebo G a D = A, G nebo T využitelná při získání rostliny se samčí sterilitou. Dalšími přednostními aplikacemi tohoto
vynálezu jsou použití oligonukleotidových sekvencí s následujícím pořadím bází:
(a) TAGAGGTGACAGAAAT (SEQIDNO: 2)
(b) TAGAGGTGACAAAAAT (SEQIDNO: 3)
(c) TNGAGGTGACAAAGAT (SEQIDNO: 4)
(d) TAGAGGAGAAGTAATA (SEQIDNO: 5)
kde N = A, G, C nebo T, přičemž tyto sekvence se mohou použít při získání rostliny se samčí sterilitou.
Předmětem vynálezu je dále způsob získání samooplodněných semen z rostliny se samčí sterilitou, do které je inkorporován rekombinantní polypeptid podle tohoto vynálezu. Tento způsob se skládá z těchto kroků:
a) kontaktování pestíku rostliny se samčí sterilitou s pylem ze stejné rostliny se samčí sterilitou v přítomnosti vhodné flavonoidové sloučeniny a
b) klíčení pylu na pestíku a oplodnění rostliny se samčí sterilitou a
c) tvorby semen v dané rostlině.
Při zvláště přednostním způsobu se flavonoidová sloučenina vybere ze skupiny skládající se z myricetinu, kvercetinu a kamferolu a použije se přednostně v koncentračním rozmezí od 100 nmol do 3 μιηοΐ.
Dalším přednostním způsobem podle tohoto vynálezu je způsob produkce hybridního osiva který je efektivní vzhledem k vynaloženým nákladům. Této produkce se docílí při použití velkých množství heterozygotních rostlin se samčí sterilitou, které byly získány křížením homozygotní rostliny požadované odrůdy se samčí sterilitou s rostlinou téže odrůdy se samčí fertilitou.
Vynález dále zahrnuje (hybridní) osivo získané křížením nebo samoopylením jakýchkoliv rostlin podle tohoto vynálezu.
Jiným přednostním aspektem tohoto vynálezu jsou plazmidy pTS20, pTS21 a pTS22.
Výhody tohoto vynálezu a rozsah jeho aplikací se snadno zjistí z následujícího podrobného popisu vynálezu.
Přehled obrázků na výkrese
Obr. 1 ukazuje sekvenci syntetického anther boxu promotoru CHS-A, který byl vložen do CaMV 35S promotoru Anther boxy odvozené od různých genů biosyntézy flavonoidů jsou uvedeny pod sekvencí anther boxu promotoru CHS-A. Čísla v závorkách označují relativní umístění anther boxu vzhledem k startovními místu transkripce původního genu.
Obr. 2 představuje diagramové znázornění různých kroků klonování pro získání chimérových GUS-konstruktů nebo chimérových pozitivních -CHS konstruktů.
Obr. 3 představuje diagramové znázornění způsobu získání hybridního osiva se samčí sterilitou; toto hybridní osivo se může použít pro plodiny, u kterých se nežádá tvorba semen nebo plodů; symbol X značí samičí rodičovskou odrůdu; symbol Y značí samčí rodičovskou linii; zkratka CaMV znamená 35S promotor mozaikového viru květáku; zkratka AB znamená anther box, vložený do 35S promotoru; zkratka CHS znamená antimediátorový gen pro chalcon synthasu.
Obr.4 představuje diagramové znázornění způsobu získání hybridního osiva se samčí fertilitou; toto hybridní osivo se může použít pro plodiny, u kterých je nezbytné vytvoření semen nebo plodů zkratka CHS sense-negativní znamená normální gen pro chalcon synthasu; všechny ostatní zkratky a symboly mají stejný význam jako na obr. 3.
Obr. 5 představuje diagramové znázornění způsobu získání hybridního osiva se samčí fertilitou; toto hybridní osivo se může použít pro plodiny, u kterých je nezbytná tvorba semen nebo plodů; zkratka GUSs znamená gen pro β-glukoromidasu z E.coli; geny z GUSs a CHSas jsou fyzikálně spárovány tak, aby vytvořily fúzní gen,; všechny ostatní zkratky a symboly mají stejný význam jako na obr. 3.
Obr. 6 představuje diagramové znázornění způsobu získání hybridního osiva s indukovatelnou samčí fertilitou; toto hybridní osivo se může použít pro plodiny, u kterých je nezbytná tvorba semen nebo plodů; všechny zkratky a symboly mají stejný význam jako v předchozích obrázcích.
Obr. 7 představuje diagramové znázornění způsobu získání hybridního osiva s indukovatelnou samčí fertilitou; toto hybridní osivo se může použít pro plodiny, k kterých je nezbytná tvorba semen nebo plodů; zkratka NSP znamená nespecifickou část restauračního genu, která se používá proto, aby se zamezilo předpokládanému ko-supresívnímu účinku CHS části restauračního genu; všechny další zkratky a symboly mají stejný význam jako v předchozích obrázcích.
Následuje podrobný popis vynálezu:
Zjistilo se, že exprese reporterového genu, (reportér gene) pro bakteriální β-glukoronidasu (GUS) v transgenních rostlinách Petunia hybrida, která je řízena hybridním promotorem, obsahující anther box odvozený od CHS-A promotoru z Petunia hybrida fúzovaný s Ca MV 35S promotorem (zde v textu je dále tento promotor uváděný jako AB/CaMV 35S promotor) , vede k významně vyšší expresi v prašnících oproti korunní tkáni, ve srovnání s GUS expresí, řízenou CaMV promotorem. Také se změnila specifita vzhledem k typu buněk, protože exprese byla pozorována také ve vrstvě zárodečných (tapetum) buněk. Exprese, řízená 35S promotorem bez anther boxu, takto neprobíhá.
Anther box je zřejmě schopný řídit antherspecifickou (prašníkově specifickou) expresi bez přítomnosti dalších cis-působících elementů, které jsou přítomné v CHS-A genu, jejichž působení na expresi se dříve předpokládalo. Hybridní promotor není anther-specifický, protože exprese se detekuje také v jiných tkáních. Anther box může řídit také expresi ve vrstvě zárodečných (tapetum) buněk.
Při podobném pokusu, jako je ten, popsaný pro GUS reporterový gen, se antikodónový CHS gen (cDNA) z rodu Petunia umístil pod kontrolu AB/CaMN 35-S promotoru a tento konstrukt se použil pro transformaci červeně kvetoucí hybridní rostliny Petunia VR. Po selekci transformovaných rostlin, v nichž se tento konstrukt exprimoval, se vybrané rostliny nechaly vykvést. Zjistilo se, že prašníky některých z těchto rostlin jsou bílé místo červené. Bílé prašníky nebyly nikdy objeveny v předchozích experimentech, při kterých byl antímediátorový CHS-A gen fúzován s normálním 35-S promotorem, řídícím expresi CHS-antimediátorového genu, i když exprese antimediátorového genu v prasnicích doopravdy probíhala.
Vyvozuje se tedy, že funkce anther boxu, zde definovaného, může spočívat v řízení exprese jakéhokoliv genu (nebo antimediátorového genu) v zárodečné vrstvě (tapetum) buněk prašníkové tkáně, jestliže tento anther box je vložen do vysoce účinného promotoru, jehož původ není rozhodující. Kromě toho se dokonce ukazuje, že úroveň exprese inhibičního genu v prašníkové tkáni je dostatečně vysoká, aby inhibovala expresi cílového genu v prašníkové tkáni.
Při pokusu o samooplodnění transgenních rostlin Petunia hybrida s bílými prašníky se zjistilo, že jde pouze o rostliny se samčí sterilitou. Existují přirozené mutantní linie rodu Petunia, ve kterých se nevyskytuje funkční chalcon isomerasa. Chalcon isomerasa je enzym, účastnící se konverze chalconů na flavonony, t.j. jde o další krok flavonoidové biosyntetické dráhy. Je známo, že tyto rostliny jsou rostliny se samčí fertilitou. Z toho se může odvodit, že pro získání rostlin se samčí sterilitou podle navrženého způsobu se inhibiční gen musí vybrat ze skupiny genů, kódující enzymy účastnící se biosyntetické dráhy pro chalcon, jelikož inhibice těchto genů není pro rostlinu jako celek letální.
V jiných pokusech, ve kterých se antikodónový CHS-A gen umístí pod kontrolu normálního CaMV 3 5S promotoru, se zjistilo, že antikodonový CHS konstrukt se může použít jako inhibiční gen pro inhibici exprese odpovídajících cílových genů v korunách tabáku a také brambor. Tím se dokazuje, že tento přístup (přes antimediátorový gen) je funkční také v heterologních systémech. Také z toho vyplývá, že rostliny různých druhů se samčí sterilitou se mohou získat transformací antimediátorovým CHS genem z rodu Petunia, řízeným AB/35S promotorem.
Vynález tedy poskytuje nové způsoby pro získání rostlin se samčí sterilitou, zakódovanou v jádře. Tyto rostliny se mohou vhodně použít pro produkt hybridního osiva. Rostliny vybrané odrůdy se geneticky transformují zavedením jednoho nebo více rekombinantních polynukleotidů do buněk uvedených rostlin. Rekombinantní polynukleotidy obsahují alespoň jeden nebo více inhibičních genů, které mohou při vlastní expresi v prašnících dané rostliny inhibovat expresi jednoho nebo více genů, kódujících jeden nebo více enzymů, které se účastní biosyntézy chalconů.
Obecně se rostliny se samčí sterilitou získají inhibici exprese vhodného cílového genu, kódujícího enzym biosyntézy chalconu. Inhibice se dosáhne vlastní expresí inhibičního genu, zaměřeného proti cílovému genu. Vhodnými cílovými geny mohou být jakékoliv geny, které kódují enzymy účastnící se biosyntézy chalconu nebo jejich bezprostředních prekurzorů, protože inhibice takového genu neovlivní negativně jiné žádané charakteristidy dané odrůdy. Obecně se cílové geny mohou vybrat z genů, kódujících enzymy, které konvertují prekurzory chalconu. Těmito enzymy jsou cinamát 4-hydroxylasa (C4H; 3.C. 1,14.13.11), přednostně
4-kumaroyl-CoA ligasa (4CL; E.C. 6.2.1.12) zvláště přednostně chalcon synthasa (3.C.2.3.1.74.), která přímo konvertuje svůj substrát na chalcon.
Inhibiční geny se mohou vybrat z množství alternativ mezi něž patří mediátorové a antimediátorové geny, jak je to popsáno podrobněji dále v textu. Vhodné mediátorové inhibiční geny mohou například kódovat ribozym, zaměřený proti RNA-produktu cílového genu nebo (monoklonální) protilátku, zaměřenou proti genovému produktu cílového genu nebo selektivní proteinový inhibitor cílového enzymu, je-li takový inhibitor známý. Alternativně může inhibiční gen obsahovat mediátorový gen, který je v zásadě identický s cílovým genem a který při vlastní expresi inhibuje cílový gen dosud neznámým mechanismem uváděným jako mediátorově-mediátorová (sense-sense) inhibice nebo ko-suprese (co-suppresion) (mezinárodní patentová přihláška číslo WO 90/11682, firmy DNA Plant Technology inc.).
Inhibičním genem je přednostně antimediátorový gen, zaměřený proti cílovému genu. Antimediátorový gen nemusí nezbytně být úplně komplementární k cílovému genu. Pokud jde o jeho délku a homologii stačí taková, aby se získal vhodně vysoký stupneň inhibice. Antimediátorový gen může být (částečné) komplementární k 5'-konci, k 3'-konci nebo ke střední části odpovídajícího cílového genu nebo může být (částečně) komplementární k celému odpovídajícími cílovému genu. Termínem částečně komplementární se rozumí situace, kdy mediátorový gen není plně homologní s odpovídajícím cílovým genem, což může být způsobeno skutečnosti, že například antimediátorový gen je heterologní (t.j. získaný z odlišného zdroje) s cílovým genem a podobně. Antimediátorový gen může být také úplně syntetický. Všechny tyto variace, týkající se volby antimediátorového genu nejou pro tento vynález rozhodující, když stupeň homologie a/nebo celkový rozsah komplementárních oblastí stačí pro inhibici exprese cílového genu.
Vlastní exprese inhibičního genu podle tohoto vynálezu se může docílit umístěním inhibičního genu pod kontrolu hybridního promotoru, který obsahuje při nejmenším promotor funkční v rostlinách, přednostně odvozený od vysoce účinného promotoru, např. CaMV 35S RNA promotor (nebo jeho deriváty) a anther box odvozený od genu, který se exprimuje v nezralé prašníkové tkáni rostlin, vhodní představitelé anther box se mohou získat mimo jiné z genů CHS-A, CHS-J, CHI-B nebo DFR-A a podobně.
Přednostně se uvedený anther box vloží do promotoru v oblasti mezi pozicemi -2000 a +1, zvláště přednostně mezi pozicemi -150 a -50. Zvláště přednostně se anther box vloží na místo -90 v CaMV 35S promotoru.
Volba rostlinného zdroje, z nějž se získá anther box, není rozhodující, pokud anther box normálně funguje v konečném transgenním hostiteli. Obecně se dává přednost tomu, aby homologie použitého anther boxu s boxy, o kterých je známo, že zvyšují expresi v prašnících dané hostitelské rostliny, byla co nejvyšší. Takový anther box se může vhodně syntetizovat se známé sekvence anther boxu, vyskytujícího se v konečné hostitelské rostlině nebo v jakékoliv jiné rostlině nebo se může získat z odlišného rostlinného zdroje nebo jiným způsobem.
Obecně ale nikoliv nezbytně se genetický materiál, na němž je umístěn inhibiční gen fušovaný s hybridním promotorem podle tohoto vynálezu, v podobě bud rekombinantní DNA nebo RNA, zavede do rostlin na rekombinantním polynukleotidu bučf DNA nebo RNA, který je těsně vázaný s rozlišitelným znakem jako je rezistence k herbicidu nebo antibiotiku. Tato vazba umožní časový výběr nebo rozlištění transformovaných buněk. Použití takového markéru se může vynechat, protože přítomnost a exprese inhibičního genu podle tohoto vynálezu se může rozlišit přímo, když transgenní rostliny kvetou. Rekombinantní polynukleotidy se obvykle uchovávají nebo množí v bakteriích ve formě plazmidů nebo jiných replikonů (napři, vložené do virové DNA nebo RNA). Alternativně se rekombinantní polynukleotidy mohou množit in vitro např. pomocí řetězové polymerační reakce (PCR), která je dobře známá odborníkům v tomto oboru. Vlastní způsob není pro vynález rozhodující.
Zavedení rekombinantních polynukleotidů do rostliného materiálu se může provést použitím několika technik, které jsou všechny dobře dosažitelné pro běžného odborníka, pracujícího v oboru rostlinné biotechnologie. Způsob zavedení genetického materiálu do buněk hostitelské rostliny není konkrétně relevantní, pokud tento způsob zaručuje rozumnou šanci na úspěch a podobně rozumně předvídatelný výsledek. Takový způsob nutně nevylučuje potřebu určitého stupně selekce konečně žádaného výsledku.
To je však běžná praxe v oboru rostlinného genového inženýrství a není potřeba proto provádět rozsáhlé experimenty. Příklady, zmíněných způsobů, které jsou vyjmenovány čistě pro ilustraci, jsou transformace protoplastů při použití vápenatých iontů s polyethylen19 glykolem, elektroporace (Shillito R.D. a další (1985) Bio/Technology 3, 1099-1102), mikroinjekce, bombardování částicemi (povlečenými DNA nebo RNA), infekce viry a podobně Přednostně se používá přirozený DNA transferový systém z druhů rodu Agrobacterium a mezi těmito systémy se dává přednost použití tzv. binárního vektoru (Bevan M.
(1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acids Res. 12, 8711-8712).
Pracovník, průměrně zkušený v daném oboru, si může vybrat, jaký zvolí bakteriální materiál pro přenos DNA do rostlinné buňky a také volba vektorů, vhodných selekčních markterů, inkubačních podmínek, kultivačních médií a nezbytných technik klonování DNA závisí na něm. Po selekci a/nebo testování a výběru transformovaného rostlinného materiálu se tento materiál regeneruje, aby se vytvořila celá rostlina, s použitím způsobů podrobně popsaných v literatuře (viz např. Horsch R.B., Fry J.E., Hoffmann N.L., Eichholz D. , Rogers S.G. a Fraley R.T. (1985), A simple and generál method for transferring genes into plants. Science 227, 1229-1231). Může se použít jakákoliv část rostliny, která je přístupná transformaci a regeneraci.
Samotný způsob transformace a/nebo regenerace není rozhodující pro tento vynález, pokud se jím docílí zavedení genetického materiálu do rostlinné buňky a stabilní integrace (kopie) genetického materiálu do genomu rostlinné buňky. Je také potřeba, aby se uvedený rostlinný materiál mohl regenerovat a při regeneraci se vytvořil výhonek, který by se mohl dále zakořenit (nebo naočkovat), čímž by se utvořila celá nová rostlina. Výběr techniky závisí na konkrétním typu použitého rostlinného materiálu a/nebo na tom, čemu dává odborník v oboru přednost.
Po získání transformovaných rostlin se tyto rostliny mohou hodnotit z hlediska přítomnosti žádaných vlastnosti a/nebo rozsahu, v jakém se žádané vlastnosti exprimuj í. První hodnocení může zahrnovat úroveň exprese inhibičního genu a míru samčí sterility transgenních rostlin. Potom se mohou vybrat transgenní rostliny, které vykazují stabilní a/nebo předvídatelnou dědičnost znaku samčí sterility a podobně. Dále se (heterozygotní) samčí sterilní rostliny mohou používat přímo pro produkci hybridního osiva nebo, alternativně, se mohou samoopylit zachráněným pylem, aby se získaly homozygotní rostliny se samčí sterilitou. Alternativně se mohou homozygotní rostliny se samčí sterilitou získat samoopylením rostlinami se samčí sterilitou s životaschopným, ale sterilním pylem. Postup se skládá z následujících kroků:
a) kontaktování pestíku rostliny se samčí sterilitou s pylem ze stejné rostliny se samčí sterilitou v přítomnosti vhodné flavonoidové sloučeniny a
b) klíčením pylu na pestíku a oplodnění rostliny se samčí sterilitou a
c) tvorba semen v dané rostlině.
Nezralý pyl se může nechat dále dozrát v přítomnosti chalconů před použitím při samoopylení mateřské rostliny se samčí sterilitou. Zvláště přednostními flavonoidovými sloučeninami používanými při tomto způsobu jsou kvercetin, kamferol a myicetin. Flavonoidová sloučenina se může vhodně přidat k obvyklému pylovému médiu jako je BK-médium tak, aby se výsledná koncentrace pohybovala v rozmezí od asi 10 nmol do 10 μπιοί, přednostně od asi 100 nmol do 3μπιο1. Optimální koncentrace se může lišit s ohledem na použitou sloučeninu a použitý druh a dokonce zřejmě i s ohledem na míru inhibice produkce endogenních flavonoidových sloučenin v dané rostlině se samčí sterilitou. Avšak obecně se vhodné flavonoidové koncentrace mohou určit pro různé situace bez náročné experimentální práce. Je zřejmé, že vlastnictví několika homozygotních rostlin se samčí sterilitou nám umožní s výhodou rychle získat velká množství heterozygotního se samčí sterilitou, které se může přímo použít pro produkci hybridního osiva ve velkém měřítku.
Vynález se může aplikovat na jakoukoliv rostlinu, schopnou samoopylení, u které je žádoucí produkce hybridního osiva.
Druhým aspektem tohoto vynálezu je způsob získání homozygotních rostlin se samčí sterilitou samoopylením heterozygotních rostlin se samčí sterilitou způsobem podle tohoto vynálezu. Samoopylení se provádí pylem, jehož vývin se zachrání vzhledem k dočasné přítomnosti chalconu v nezralých prašnících dané rostliny, čímž se překoná inhibice chalcon syntézy in vivo. Vynález zahrnuje také podávání chalcorty aby se kompenzoval vliv inhibice exprese genu. Kompenzace inhibice genové exprese se také může provést trochu odlišným způsobem, a to umožněním (dočasným) produkce chalconů in vivo. Tento způsob kompenzace se může dosáhnout zavedením restauračního genu pod kontrolu indukovatelného promotoru do buňky s inhibičním genem. Exprese reparačního genu se tak může řídit z vnějšku přidáním vhodného induktoru. Takový restaurační gen přednostně obsahuje například fúzní gen, obsahující přinejmenším část cílového genu, která je schopná při expresi inhibovat vliv exprese antimediátorového genu komplementární asociací s antimediátorovým transkriptem (viz Robert L. S. a další 1990) Bio/Technology 8, 459).
z·
Indukovatelné obnovení plodnosti, jaké je krátce uvedeno výše, je také nutné u hybridních plodin, jejichž obchodní hodnota spočívá v semenech nebo plodech. Je zřejmé, že samčí sterilita se pak musí přerušit, aby se umožnilo opylení na poli a získala semena nebo plody. Obnovení plodnosti se může vyvolat podáváním induktoru plodině na poli, vedoucím k dostatečně vysoké expresi restauračního genu, aby se dosáhlo neutralizace antimediátorového transkriptu.
Vynález má tyto výhody:
V protikladu k mnoha předchozím způsobům získání rostlin se samčí sterilitou zakódovanou v jádře nezahrnuje tento způsob nutné expresi genů, které kódují produkty toxické pro somatické buňky, jako jsou DNAasy, RNAasy nebo proteasy. Důsledkem je, že přísně vývojová nebo tkáňověspecifická exprese není nutná, pokud se exprese odehrává v prašnících.
Rostliny se samčí sterilitou podle tohoto vynálezu jsou vysoce sterilní a vykazují jenom samičí fertilitu.
Dále se během produkce hybridního osiva na poli nebo ve skleníku ve velkém měřítku mohou oddělit rostliny se samčí fertilitou, t.j. předpokládání samoopylovači, od rostliny se samčí sterilitou, které produkují hybridní osivo. Zbarvení prašníků obou typu rostlin je totiž rozdílné. Samoopylovači se potom mohou separovat nebo zničit nebo je-li to žádoucí, se jejich nehybridní osivo může sklidit odděleně.
Další výhodou způsobů podle tohoto vynálezu je schopnost získat homozygotní rostliny se samčí sterilitou. To poskytuje velké výhody při uchovávání a propagaci heterozygotní rodičovské linie se samčí sterilitou. Je potřeba mít pouze několik homozygotních rostlin, které se vzhledem ke svému omezenému počtu mohou propagovat in vitro technikami dobře známými v daném oboru. Homozygotní linie se samčí sterilitou se křížově oplodní rodičovskou linií se samčí fertilitou a heterozygotní osivo se samčí sterilitou se potom použije k vytvoření hybridních plodin ve velkém měřítku na poli. Polovina z tohoto hybridního osiva bude se samčí sterilitou a druhá polovina se samčí fertilitou. V případě, že tento poměr není dostatečný pro získání vysokého výtěžku obchodního produktu (t.j. semen nebo ovoce) samooplodněním, může se zvýšit částečnou obnovou samčí sterility podáním induktoru, aby se aktivovala exprese restauračního genu.
Příklady provedení vynálezu
V dále uvedených příkladech se používá následujících metod zkoušení:
DNA - metodologie
Izolace DNA, klonování, restrikční analýzy a sekvenování se provedou standardními postupy, které jsou dobře známé odborníkům v oboru, viz například Manítas T.
Fritsch E.F. a Sambrook J. (1982) molekulární klonování: laboratorní příručka (Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory). Izolace DNA z jednotlivých transformantů rodu Petunia a analýza DNA blotu v gelu se provedou způsobem popsaným v článku: Koes R. E, Spelt C.E. , Mol J.N.M a Gerats A.G.M. (1987), The chalcone synthase multigene family of Petunia hybrida (V30): Sequence homology, chromosomal localization and evolutionary aspects, Plant Mol. Biol. 10, 375-385.
Extrakce β-glukuronidasy (GUS) a její fluorometrické a histochemické stanovení.
Pro stanovení GUS se shromáždí čerstvý materiál z transgenních rostlin. GUS extrakce se provedou způsobem, který popsali Jefferson R.A., Kavanagh T.A a Bevan M.W. (1987) Gus fusions: β-glucoronidase as a sensitive and versatile gene fusion markér in higher plants, EMBO J. 6, 3901-3907. Tento způsob zahrnuje rozemletí tkáně s Dowexem-1 (výrobce Sigma) v kapalném dusíku. Fluorometrická stanovení aktivity GUS se provedou podle Jeffersona a dalších (1987), citace uvedena výše v textu. Korekce fluorescenčních měření pro ochlazený extrakt se zjistí měřením zvýšení fluorescence po přídavku známého množství 4-methylumbeliferylu. Koncentrace bílkovin se stanoví pomocí sady pro stanovení proteinů od firmy Bio Rad s hovězím sérovým albuminem jako standardem.
Histochemická lokalizace GUS aktivity se provede postupem který popsali Koes R. E. van Blokland R., Quattrocchio F., van Tunen A. J. a Mol J.N.M (1990).
Chalcone synthase promoters in petunia are active in pigmented and unpigmented cell types, Plant Cell 2, 379-392. Před barvením se vyříznou žiletkou prašní ky po dvou. Aby se eliminovalo pozadí GUS aktivity v prašnících, použije se X-gluk barvící roztok o pH 8,0.
Histochemické stanovení v prašnících transgenních a netransformovaných rostlinách se provede opakovaně, aby se vyloučily artefakty, které mohou být způsobeny rozdílnou velikostí buněk, proniknutím substrátu do tkáně a pozadím enzymové aktivity. Analýza na úrovni jedné buňky se provede po fixaci a uvěznění tkání, barvených X-gluk v parafínu podle Koese a dalších (1990), citace uvedena výše v textu. Za použití mikrotomu se nařežou 7μιη silné řezy a ty se fotografují pod světelným mikroskopem.
Stanovení flavonoidů
Po hydrolýze (20 minut při teplotě 100 °C) se prašníky z deseti poupat inkubuji 16 hodin v 1 ml 2M HC1. Flavonoidy se extrahují malým množstvím isoamylalkoholu a dělí se na celulosových TLC plotnách. Jako vyvíjecí soustava se používá směs: kyselina octová : kyselina chlorovodíková : voda (30 : 3 : 10).
Izolace RNA a ochrana před účinkem RNAasy
Pro izolaci RNA, kterou popsali Koes a další (1989) (citace uvedena výše v textu), se použijí prašníky z 5 až 7 poupat (o velikosti 40 až 50 mm). Endogenní CMS mRNA se stanovuje za současné ochrany před účinkem RNAasa podle van Tunena a dalších (1988) (citace uvedena výše v textu). Při stanovení se použije jako próba CMS(A) cDNA v celé velikosti, klonovaná v plazmidu pTZ18U (Koes a další 1989, citace uvedená výše v textu).
Klíčení pylu in vitro.
Rostliny se pěstují při teplotě 18 až 22 °C za standardních skleníkových podmínek. Pyl se sebere z květů ve fázi zrání prašníků (anthesis) a nechá se vyklíčit na ztuženém médiu, obsahujícím 3 mM H3BO3, 1,7 mM Ca(NO3)2, 10% sacharosy, 0,7% agaru o pH 5,8. Pyl se inkubuje 2 hodiny při teplotě 24 °C ve tmě a barví se 1% roztokem acetokarmínu, jak popsali Bino R. J., Hille J. a Franken J. (1987) Kanamycin resistance during in vitro development of pollen from transgenic tomato plants, Plant Cell Rep. 6,
333-336.
Příklady vynálezu
Příklad 1
Konstrukce chimerových GUS-genů (gen pro β-glukoromidasu)
Chimérové GUS konstrukty se vytvoří klonováním GUS kódující oblasti plazmidu pRAJ 275 (Jefferson a další 1987, citace výše v textu). Tato oblast, v podobě EcoR/HindlII fragmentu, doplněného působením Klenowovy polymerasy, se klonuje na Smál místě viru VIP122, která obsahuje CHS(A) ocas (tail) (van der Meer a další 1990, citace výše v textu). Klonováním vznikne klon pTS18, který se ligací spojí s plazmidem pTZ18R (výrobce Promega) v podobě Sall/Hindlll fragmentu a tím se získá klon pTS19. Do pTS19, štěpeného EcoRI a BamHI se vloží Ca MV 35S promotor z VIP102 (van der Krol A. R. Lenting P.J., Veenstra J. G. van der Meer I. Μ. , Koes R. E., Gerats A. G. M, Mol J. Ν. M. a Stuitje A. R.
(1986) An antisense chalcone synthase gene in transgenic plants inhibits flower pigmentation. Nátuře 333, 866-869), štěpený stejnými restrikčními enzymy, čímž vznikne pTS23 (viz také obr. 2). Oligonukleotidy
5'-GAGCTCTAGAGGTGACAGAAATCTGCAG-3' (SEQIDNO: 6) a 5’-CTGCAGATTTCTGTCACCTCTAGAGCTC-3' (SEQIDNO: 7) se nechají spojit dohromady, fosforylují se na 5' konci použitím T4 kinasy a klonují se v pTS23, štěpeném EcoRV. Tím se získá pTS24. Orientace vloženého antherboxu se stanoví částečným štěpením jednoho z obou restrikčních míst, obklopujících antherbox. Na konci značené fragmenty se podrobí sekvenování v gelu. Všechny chimérové GUS konstrukty se vloží v podobě EcoRI/HindlII fragmentů do binárního vektoru Bin 19 (Bevan 1984, citace výše v textu).
Příklad 2
Konstrukce chimérových antikodónových CHS genů
Stejný syntetický antherbox se také klonuje na EcoRV místě v CaMV promotoru VIP102, obsahujícím CaMV-antikodónový-CHS(A)-nos konstrukt (van der Krol a další 1989, citace výše v textu). Orientace a počet klonovaných anther boxů se určí způsobem, popsaným v příkladu 1. Následující antikodónové CHS(A) konstrukty se zavedou do rostlin rodu Petunia: pTS20 (s jednoduchým antherboxem v normální orientaci), pTS21 (se dvěma kopiemi antherboxu v obrácené orientaci) a pTS22 (s osmi kopiemi antherboxu v normální orientaci). Všechny chimérové antikodónové CHS(A) konstrukty se vloží v podobě EcoRI/HindlII fragmentů do binárního vektoru Bin 19 (Bevan 1984, citace výše v textu).
Příklad 3
Transformace rostlin rodu Petunia
Binární vektory, obsahující GUS konstrukty (pTS23, obsahující normální CaMV 35S promotor; pTS24 obsahující hybridní AB-CaMV 35S promotor) nebo antikodónové CHS(A) konstrukty (pTS20; pTS21; pTS22) se převedou z E. coli kmene JM83 (Messing J. (1978) Recombinant DNA Technical Bulletin NIH Publication č. 79-99, 2, 43-48) do Agrobacterium tumefaciens kmene LBA 4404 (Hoekama A. a další (1983), Nátuře 303, 179-180). Převedení se provede třírodičovským párováním (triparental mating) (Rogers L.S. a další (1986) Methods in Enzymology 118, 627-641) s použitím kmene, který obsahuje plazmid pRK2013 (Ditta a další (1980), Proceeding of the National Academy of Sciences USA 12, 7347-7351). Pro transformaci terčíků listů Petunia hybrida se použijí exkonfugáty způsobem, který popsali Horsch a další (1985), citace výše v textu. Terčíky listů se připraví z horních listů mladých, nekvetoucích rostlin. Při transformačních pokusech s GUS konstrukty se použije Petunia hybrida odrůda W115. Pro transformace s antimediátorovými CHS(A) konstrukty se použijí rostliny rodu Petunia, VR hybrid. Po indukci tvorby výhonků a kořenů na médiu, obsahujícím kanamycin, se rostliny přenesou do půdy a dají se do skleníku. Jako kontrolní slouží rostliny regenerované (na médiu bez kanamycinu) z listových terčíků transformovaných materiálem z Agrobacterium tumefaciens kmene LBA 4404, což je kmen bez binárního vektoru.
Příklad 4
Analýza transgenních rostlin, ve kterých se exprimují GUS konstrukty
Aby se zjistil vliv antherboxu na regulaci genové exprese, analyzují se transgenní rostliny nesoucí GUS konstrukty, přičemž se studují způsoby provedení exprese s použitím metod, popsaných v experimentální části.
Analyzuje se asi 25 nezávislých transgenních rostlin rodu Petunia, obsahujících AB/CaMV 35S-GUS konstrukt a 25 rostlin rodu Petunia, obsahujících kontrolní CaMV-GUS konstrukt. Protože úroveň exprese zavedeného genu se může lišit mezi jednotlivými transformanty vzhledem k tzv. pozičními efektu (Weising a další (1988) Annu. Rev. Genet.
22, 241-277) používá se GUS aktivita exogenního genu v koruně květu jako vnitřní standard při měření aktivity, nacházející se v prašnících, pro každý jednotlivý transformant. Průměrný poměr těchto aktivit (průměr se počítá ze všech rostlin) je vyšší pro rostliny s hybridním promotorovým konstruktem než pro rostliny s kontrolním promotorovým konstruktem. Všechna oddělená měření se analyzují Wilcoxonovým řadovým (rank) testem, aby se zkontrolovala jejich významnost. Na hladině významnosti α < 0,05 je GUS aktivita v prasnicích ve srovnání s aktivitou v koruně květu významně vyšší v transformantech, které obsahují AB/CaMV 35S-promotorový GUS konstrukt, než v transformantech, obsahujících kontrolní CaMV konstrukt. Přítomnost anther boxu zvyšuje třikrát hodnotu GUS aktivity, řízenou CaMV konstruktem v prašnících, ve srovnání s korunou květu.
Aby se stanovilo, zda inzerce sekvence anther boxu do CaMV promotoru změní kvalitativně jeho expresi, histochemicky se sleduje GUS exprese, specifická pro daný druh buněk (viz Experimentální část). Prašník rodu Petunia obsahuje v průřezu (z vnitřku k vnějšku) cévní válec obklopený parenchematickými buňkami spojovací tkáně, čtyři tobolky obsahující sporogenní tkáň (pyl) a endothecium.
Každá tobolka je obklopená vrstvou specifických zárodečných buněk (tapetum). Tyto buňky zajišťují výživu sporogeních buněk. V pozdějších fázích vývoje prašníků tobolky ve stomiu prasknou a pylová zrna se uvolní.
Příčné řezy prašníků mnoha nezávislých CaMV-GUS transformantů se inkubují s GUS substrátem X-gluk. Po inkubaci vykazují silnou modrou barvu, která znamená přítomnost GUS aktivity, v téměř všech typech buněk v prašnících. CaMV promotor řídí GUS aktivitu v cévním válci, spojovací tkáni a endotheciu, ale v zárodečných (tapetum) buňkách se žádná GUS aktivita nepozoruje. Modré zbarvení se nepozoruje v prašnících netransformovaných kontrolních rostlin při pH 8,0. Jestliže se pH barvícího pufru sníží na hodnotu 7,0, může se v netransformované prašníkové tkáni objevit zbarvení pozadí, a proto se všechny barvicí experimenty provádí při pH 8,0. Zkouška CaMV-GUS transformovaných prašníků na jednobuněčné úrovni ukazuje, že
I v CaMV-GUS transformovaných prašnících je modrá sraženina ve všech typech buněk kromě buněk tapeta. Histochemická analýza mnoha nezávislých transformantů, v nichž se exprimují GUS geny, přičemž tato exprese je řízena AB/CaMV 35S promotorem, ukazuje, že existuje mírný rozdíl v GUS barvení těchto transformantů ve srovnání s barvením normálních CaMV-GUS transformantů (neřízených AB(CaMV 35S promotorem). Kromě normálního CaMV-GUS-zbarvení se objeví jasně modré zbarvení v tapetum buňkách. Modrá sraženina v tapetum buňkách je dokonce zřetelnější při zkoušce na jednobuněčné úrovni. Jak fluorometrické tak histochemické GUS stanovení ukazuje, že existuje zřetelný vliv inzerce anther boxu do CaMV promotoru nejen na úrovni GUS exprese ale také na úrovni specifity typu buněk, v nichž je GUS exprese řízena tímto hybridním promotorem.
Příklad 5
Analýza transgenních rostlin, v nichž se exprimují antimediátorové - CHS (A) konstrukty
Celkem se získá 35 nezávislých transformantů (VR hybridů) rodu Petunia, z nichž 5 rostlin má květy s omezeně zbarvenými prašníky. Neexistuje závislost mezi inhibici zbarvení koruny květu a inhibici zbarvení prašníků. Najdou se všechny kombinace zbarvených nebo nezbarvených prašníků s normálně zbarvenými korunami kvétu nebo korunami květu s omezenými zbarvením. Bílé prašníky se mohou získat po transformaci kterýmkoliv ze tří konstruktů (t.j. pTS2O, pTS21, pTS22). Inhibice zbarvení prašníků proto pravděpodobně nezávisí na množství kopií a orientaci vloženého anther boxu. Transformací VR hybridu rodu Petunia konstruktem pTS20 (jedna kopie anther boxu v normální orientaci) se získá 11 nezávislých transgenních rostlin, z nichž 5 má normální fenotyp, dalších 5 rostlin má omezeně zbarvenou korunu kvetu a jedna rostlina má zbarvenou korunu a bílé prašníky. Transformací konstruktem pTS21 (2 kopie anther boxu v obrácené orientaci) se získá 15 nezávislých transformantů, z nichž 9 má normální fenotyp; 5 rostlin má květy s omezeným zbarvením koruny a dvě z těchto rostlin mají bílé prašníky; jedna transformovaná rostlina má květy zbarvené jako rostliny s divokým fenotypem, ale má bílé prašníky. Z devíti nezávislých transformantů, které obsahují konstrukt pTS22 (8 kopií anther boxu v normální orientaci) má 7 rostlin fenotyp divokého typu, jedna rostlina má květy s omezeným zbarvením koruny a jedna rostlina nese květy s normálně zbarvenými korunami a bílými prašníky.
Aby se zjistilo, zda redukce zbarvení prašníků vzniká redukcí na úrovni transkripce CHS genů na mRNA v prašnících, izoluje se všechna RNA z bílých a z červeně zbarvených prašníků. Izolovaná RNA se analyzuje způsobem s chráněním před účinkem RNAasy. Při tomto chráněném experimentu, v němý se použije 32P-značená antikodónová V30-CHS RNA jako próba, se endogenní VR CHS transkripty štěpí na čtyři subfragmenty. Ukazuje se, že inhibice zbarvení prašníků je doprovázena specifickou redukcí na úrovni přepisu CHS genů v ustáleném stavu do mRNA v prašnících.
Při samokřížení transgenních rostlin, prováděném kvůli vazebné (linkage) analýze, se překvapivě vysvětlilo, že bílý pyl je sterilní. Transformanty s nezbarvenými prašníky nemohou po samoopylení tvořit zralá, zdravě vypadající semena. Semena se tvoří jenom velmi zřídka a když, tak neklíčí.
Aby se určilo, ve kterém stadiu vývoje prašníků (a pylu) začínají bílá pylová zrna degenerovat, zkoumají se pod mikroskopem říčné řezy bílých prašníků a pylu v různých vývojových stadiích. Vývoj bílých prašníků se moc neliší od normálního vývoje prašníků rodu Petunia. Avšak u pylových zrn se ukazuje zastavení vývoje po utvoření tetrády t.j. v časném mikrosporovém stadiu. Při klíčení pylu z bílých prašníků in vitro se netvoří žádná pylová vlákna.
Toto časné stadium vývoje pylu se časově shoduje s počátkem exprese genů pro syntézu flavonoidů.To ukazuje na pravděpodobnou funkci flavonoidů při vývoji pylu v časném dvojjaderném stadiu. Z toho se může vyvodit, že obnova vývoje pylu např. indukcí syntézy restauračního genu by měla začít asi v tomto stadiu.
Transformanty s bílými prašníky se samčí sterilitou se opylí odrůdou V30 rodu Petunia, aby se získala Fl generace. Rostliny se samčí sterilitou se vyznačují úplnou samičí fertilitou.
Analýza potomstva primárních transformantů ukazuje, že zavedené znaky jsou stabilní a potomstvo je může předvídatelně dědit. Sterilní transformant rodu Petunia s bílým pylem se kříží s rostlinou Petunia hybrida )V30) a rostliny z Fl generace se analyzují jak na přítomnost fenotypového projevu bílý pyl tak na přítomnost inzertu v Southern blotu. DNA se extrahuje z listů několika rostlin Fl generace. Analýza Southern blot ukazuje úplnou ko-segregaci antimediátorového fenotypu s jedním inzertem.
Příklad 6
Samooplodnéní rostlin se samčí sterilitou
Sterilní pyl rostlin rodu Petunia se odebere z rostlin, ve kterých se mírně exprimují antimediátorové chs geny. Pylu se použije pro samooplodnění ve spojení s flavonoly kvercetinem, kamferolem nebo myricetinem.
Rostliny se vyberou podle přítomnosti malého množství (méně než 1 %) životaschopného nezralého pylu; tento pyl se může nechat dozrát in vitro. Sterilní pyl se zanese do normálního pylového média. (BK-medium; 100 mg/1 H3BO3, 300 mg/1 CaN03, 200 mg/1 MgSO4, 100 mg/1 KNO3, 12,5 % sacharosy, ve sterilní vodě), obohaceného kvercetinem, myricetinem nebo kamferolem tak, aby se výsledná koncentrace těchto látek pohybovala v rozmezí od asi 100 nmol do 3 μιηοΐ. Médium s pylovými zrny se potom pipetuje na pestíky mateřských rostlin se samčí sterilitou.
Flavonoidové sloučeniny jsou účinné v rozmezí koncentrací uvedeném výše v textu; optimální koncentrace se nemůže uvést, protože se silně liší v závislosti na jednotlivé použité rostlině se samčí sterilitou. To se pravděpodobně dá vysvětlit skutečností, že některé rostliny s antimediátorovými chs geny přesto tvoří malé množství chalkon synthasy, která zřejmé ovlivňuje koncentrace flavonoidových sloučenin v reprodukčních orgánech.
Po oplodnění nastane tvorba semen. Semena se potom sklidí. Semena klíčí normálně a získají se z nich plně rozvinuté rostliny.
Při pokusu o samooplodnění těchto rostlin se zjistí, že jsou to stále rostliny se samčí sterilitou. Tyto rostliny se mohou použít jako homozygotní mateřské rostliny při křížení s donorovými rostlinami se samčí fertilitou, aby se rychle získala velká množství heterozygotních rostlin se samčí fertilitou pro produkci hybridního osiva.
Protože se předpokládá, že sloučeniny, použité na překonání sterility pylu jsou flavonoly, vyskytující se v mnoha rostlinách, mohou se podle tohoto vynálezu pro indukci zrání pylu z rostlin se samčí sterilitou použít také například extrakty z pestíků, korunní tkáně a pravděpodobně také ze zralého pylu (který se inaktivuje ozářením).
Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel:
(A) Jméno: MOGEN Internationl N.V (B) Ulice: Einsteinweg 97 (C) Město: LEIDEN (E) Stát: Nizozemsko (F) Poštovní směrovací číslo (ZIP): NL-2333CB (B) Telefon: 071-258282 (H) Telefax: 071-221471 (ii) Název vynálezu: Rostliny vykazující samčí sterilitu, způsob jejich získávání a rekombinantní DNA pro použití při tomto způsobu (iii) Počet sekvencí: 7 (iv) strojově čitelná forma:
(A) střední typ: disktety (B) počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) softwqare: Patentln Release č. 1.0, verze
1,25 (EPO) (v) Údaje o současné přihlášce:.
(2) Informace o SEQ ID NO: l:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka 16 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Pozitivní řetězec : ne (vi) Původní zdroj:
(A) Organismus: Petunia hybrida (D) Jiné informace: značka = EcoRI (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1
TNGAGGWGAM RDARWW (2) Informace o SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka 16 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ano (iv) Pozitivní řetězec : ne (vi) Původní zdroj:
(A) Organismus: Petunia hybrida (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2
TAGAGGTGAC AGAAAT (2) Informace o SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka 16 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Pozitivní řetězec : ne (vi) Původní zdroj:
(A) Organismus: Petunia hybrida (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO. 3
TAGAGGTGACAAAAT (2) Informace o SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 16 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ano (iv) Pozitivní řetězec : ne (vi) Původní zdroj:
(A) Organismus: Petunia hybrida (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO. 4
TNGAGGAGAA AAAGAT (2) Informace o SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 16 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomové) (iii) Hypotetická: ano (iv) Pozitivní řetězec : ne (vi) Původní zdroj:
(A) Organismus: Petunia hybrida (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO. 5
TAGAGGAGAA GTAATA (2) Informace o SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 28 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ano (iv) Pozitivní řetězec : ne (xi) popis sekvence: SEQ ID NO. 6
GAGCTCTAGA GGTGACAGAA ATCTGCAG (2) Informace o SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 28 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězcovost: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ano (iv) Pozitivní řetězec : ne (xi) popis sekvence: SEQ ID NO. 7
GAGCTCTAGA GGTGACAGAA ATCTGCAG

Claims (15)

1. Rekombinantní polynukleotid, který je použitelný pro získání rostliny se samčí sterilitou v podstatě obsahuj ící
a) inhibiční gen schopný inhibovat expresi cílového genu, přítomného v dané rostlině a kódujícího enzym z metabolické dráhy pro biosyntézu chalkonů, a
b) promotor, který je aktivní v prasnicích dané rostliny, operabilně spojený s inhibičním genem tak, aby se dosáhla exprese tohoto inhibičního genu v prasnicích dané rostliny, pokud je v nich přítomen, čímž dojde k narušení normálního vývoje pylu.
2. Rekombinantní polynukleotid podle nároku 1, v němž cílový gen kóduje enzym vybraný ze skupiny, skládající se z cinnamát 4-hydroxylasy (C4H; E.C. 1.14.13.11), 4-kumaroyl-CoA ligasy (4 CL; E.C. 6.2.1.12) a chalcon synthasy (CHS; E.C.2.3.1.74.).
3. Rekombinantní polynukleotid podle nároku 1 nebo 2, v němž inhibiční gen je antimediátorový gen.
4. Rekombinantní polynukleotid podle nároku 3, v němž promotor, který je aktivní v prasnicích rostliny, obsahuje fragment vysoce účinného promotoru a anther box (prašníkový box), který se může získat z promotorové oblasti skupiny genů, skládající se z genů chs-A, chi-B, chs-J a dfrA.
5. Rekombinantní polynukleotid podle kteréhokoliv z nároku 1 až 4, v němž vysoce účinný promotor obsahuje fragment CaMV 35S promotoru a anther box (prašníkový box) o sekvenci:
TAGAGGTGACAGAAAT vložený do uvedeného fragmentu na pozici -90 vzhledem k startovacími místu transkripce.
6. Způsob získání rostliny se samčí sterilitou, vyznačující se tím, že že se skládá z následujících kroků:
a) přenesení rekombinantního polynukleotidu podle kteréhokoliv z nároku 1 až 5 do buněk rostliny se samčí fertilitou,
b) vytvoření celých nových rostlin z buněk s inkorporovaným rekombinantním polynukleotidem, a
c) selekci rostliny se samčí sterilitou.
7. Rekombinantní rostlinný genom, v němž je inkorporován rekombinantní polynukleotid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
8. Způsob získávání samooplodněných semen rostliny se samčí sterilitou, získatelné způsobem podle nároku 6, vyznačující se tím, že se skládá z následujících kroků:
a) kontaktování pestíku rostliny se samčí sterilitou s pylem téže rostliny se samčí sterilitou v přítomnosti vhodné flavonoidové sloučeniny
b) klíčení pylu na pestíku a oplodnění rostliny se samčí sterilitou, a
c) vytvoření semen v této rostlině.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačuj ící se t í m, že pyl se suspenduje ve vhodném pylovém médiu, které obsahuje flavonoidovou sloučeninu vybranou ze skupiny, skládající se z myricetinu, kvercetinu a kamferolu, přičemž koncentrace této sloučeniny v médiu před kontaktováním pestíku rostliny se samčí sterilitou s pylem se pohybuje v rozmezí od 100 nmol do 3 μιηοΐ.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se t í m, že pylové médium má následující složení:
100 mg/1 HgBOg, 300 mg/1 CaNOg, 200 mg/1 MgSO4, 100 mg/1 KNOg, 12,5 % sacharosy ve sterilní vodě.
11. Způsob produkce heterozygotních rostlin se samčí sterilitou, vyznačující se ťí m, že se oplodní homozygotní rostliny se samčí sterilitou, získatelné způsobem podle nároku 6, rostlinou se samčí fertilitou, sklidí se semena a vypěstují se heterozygotní rostliny se samčí sterilitou z uvedených semen.
12. Způsob získávání hybridního osiva, vyznačující se tím, že zahrnuje křížení rostliny se samčí sterilitou podle nároku 6 nebo 11 s rostlinou se samčí fertilitou a sklizení hybridních semen.
13. Použití anther boxu (prašníkového boxu) získátelného z promotorové oblasti genu, vybraného ze skupiny, skládající se z genů chs-A, chi-B, chs-J a dfrA, při způsobu získávání rostliny se samčí sterilitou.
14. Použití oligonukleotidu obsahujícího sekvenci TNGAGGWGAMRDARWW (SEQIDNO: 1), ve které N = A, G, C nebo T;
W = A nebo Τ; M = A nebo C; R = A nebo G a D = A, G, nebo T při způsobu získávání rostliny se samčí sterilitou.
15. Použití oligonukleotidu obsahujícího sekvenci vybranou ze skupiny skládající se z:
CS932145A 1991-04-16 1992-04-15 Plants exhibiting male sterility, process of obtaining thereof and recombinant dna for application of such process CZ214593A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP91200910 1991-04-16
PCT/NL1992/000075 WO1992018625A1 (en) 1991-04-16 1992-04-15 Male-sterile plants, method for obtaining male-sterile plants and recombinant dna for use therein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ214593A3 true CZ214593A3 (en) 1994-07-13

Family

ID=8207615

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS932145A CZ214593A3 (en) 1991-04-16 1992-04-15 Plants exhibiting male sterility, process of obtaining thereof and recombinant dna for application of such process

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6005167A (cs)
EP (1) EP0513884A1 (cs)
JP (1) JPH06506595A (cs)
AU (1) AU663871B2 (cs)
BR (1) BR9205894A (cs)
CA (1) CA2105592A1 (cs)
CZ (1) CZ214593A3 (cs)
HU (1) HU219543B (cs)
IE (1) IE921206A1 (cs)
IL (1) IL101592A (cs)
RU (1) RU2170255C2 (cs)
SK (1) SK111693A3 (cs)
TR (1) TR27026A (cs)
UA (1) UA39169C2 (cs)
WO (1) WO1992018625A1 (cs)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5432068A (en) * 1990-06-12 1995-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Control of male fertility using externally inducible promoter sequences
US5824524A (en) * 1990-06-12 1998-10-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating fertility and method of using same
US6297426B1 (en) 1990-06-12 2001-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of mediating female fertility in plants
US5478369A (en) * 1990-06-12 1995-12-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
AU668548B2 (en) * 1992-03-09 1996-05-09 Washington State University Research Foundation Methods for the regulation of plant fertility
WO1994009143A1 (en) * 1992-10-15 1994-04-28 Mogen International N.V. Genetic moderation or restoration of plant phenotypes
CA2161515A1 (en) * 1993-05-03 1994-11-10 Willem Johannes Stiekema Method for obtaining male-sterile plants
EP0628635A1 (en) * 1993-06-08 1994-12-14 Nunhems Zaden Bv Process for generating male sterile plants
WO1994029465A1 (en) * 1993-06-08 1994-12-22 Nunhems Zaden B.V. Process for generating male sterile plants
US5837850A (en) * 1994-04-21 1998-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Regulatory element conferring tapetum specificity
DE4440200A1 (de) * 1994-11-10 1996-05-15 Bayer Ag DNA-Sequenzen und ihre Verwendung
US5633438A (en) * 1994-11-22 1997-05-27 Pioneer Hi-Bred International Microspore-specific regulatory element
EP0776973A1 (en) * 1995-12-08 1997-06-04 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek Fatty aldehyde decarbonylase for transforming bacterial cells and plants
US5919919A (en) * 1996-02-06 1999-07-06 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By Agriculture And Agri-Food Canada Brassica sp. gene promoter highly expressed during tapetum development
US6077991A (en) 1996-03-28 2000-06-20 Washington State University Research Foundation Compositions and methods for production of male-sterile plants
US6410718B1 (en) 1996-09-11 2002-06-25 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Materials and methods for the modification of plant lignin content
US6204434B1 (en) 1996-09-11 2001-03-20 Genesis Research & Development Corporation Limited Materials and methods for the modification of plant lignin content
US5850020A (en) * 1996-09-11 1998-12-15 Genesis Research & Development Corporation, Ltd. Materials and method for the modification of plant lignin content
US7087426B2 (en) 1996-09-11 2006-08-08 Agrigenesis Biosciences Ltd. Materials and methods for the modification of plant lignin content
US6037523A (en) * 1997-06-23 2000-03-14 Pioneer Hi-Bred International Male tissue-preferred regulatory region and method of using same
US7154024B2 (en) 1997-06-23 2006-12-26 Pioneer Hi-Bred, Inc. Male tissue-preferred regulatory sequences of Ms45 gene and method of using same
CA2301500A1 (en) 1997-08-27 1999-03-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes encoding enzymes for lignin biosynthesis and uses thereof
GB9719359D0 (en) * 1997-09-11 1997-11-12 Nickerson Biocem Ltd The Use of DNA Sequences
FR2768745B1 (fr) * 1997-09-23 2001-10-05 Agronomique Inst Nat Rech Promoteur specifique des microspores et procede d'obtention de plantes hybrides
ZA9811228B (en) 1997-12-12 1999-06-14 Mogen Int New constitutive plant promoters
US7303917B2 (en) 1998-03-20 2007-12-04 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Eastern Cereal & Oilseed, Research Center Modification of pollen coat protein composition
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
BRPI9908967B1 (pt) 1998-03-20 2017-05-30 Benitec Australia Ltd processos para reprimir, retardar ou de outro modo reduzir a expressão de um gene alvo em uma célula de planta
US8598332B1 (en) 1998-04-08 2013-12-03 Bayer Cropscience N.V. Methods and means for obtaining modified phenotypes
US20040214330A1 (en) 1999-04-07 2004-10-28 Waterhouse Peter Michael Methods and means for obtaining modified phenotypes
CA2325344C (en) 1998-04-08 2017-12-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
BR9915021A (pt) 1998-10-09 2001-08-14 Genesis Res & Dev Corp Ltd Materiais e métodos para a modificação de conteúdo de lignina da planta
AU5640200A (en) * 1999-06-29 2001-01-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Gene affecting male fertility in plants
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
CA2391991A1 (en) * 1999-11-19 2001-05-31 National Institute Of Agrobiological Sciences Method for lowering pollen fertility by using pollen-specific zinc finger transcriptional factor genes
PT2944695T (pt) 1999-12-16 2017-05-26 Monsanto Technology Llc Novas construções de expressão vegetais
EP1116794B1 (en) * 2000-01-13 2009-06-17 Riken Transgenic plants carrying neoxanthin cleavage enzyme gene
US7105718B2 (en) 2000-03-31 2006-09-12 The Regents Of The University Of Colorado Compositions and methods for regulating metabolism in plants
US6956118B2 (en) * 2001-02-08 2005-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Promoter sequences providing male tissue-preferred expression in plants
US7230168B2 (en) * 2001-12-20 2007-06-12 The Curators Of The University Of Missouri Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase
DE10212892A1 (de) 2002-03-20 2003-10-09 Basf Plant Science Gmbh Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression
GB0213749D0 (en) * 2002-06-14 2002-07-24 Tozer Seeds Ltd Method of producing hybrid seeds and plants
US7667096B2 (en) 2003-06-03 2010-02-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Conditional sterility in plants
WO2005070088A2 (en) * 2004-01-15 2005-08-04 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Chimeric sequences for tissue-specific gene expression in plants
US7604968B2 (en) * 2004-03-01 2009-10-20 Regents Of The University Of Minnesota Microorganisms for the recombinant production of resveratrol and other flavonoids
CA2620387C (en) 2005-09-20 2018-09-18 Basf Plant Science Gmbh Methods for controlling gene expression using ta-sirna
WO2008013450A1 (en) * 2006-07-24 2008-01-31 Plant Research International B.V. A two-component system for seedless fruit development
ITMI20071291A1 (it) * 2007-06-28 2008-12-29 Univ Degli Studi Milano Sistema di contenimento transgenico attraverso l'inibizione recuperabile della germinazione in semi transgenici.
US8450090B2 (en) 2009-10-06 2013-05-28 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for promoting fatty acid production in plants
EP2825656A1 (en) 2012-03-13 2015-01-21 Pioneer Hi-Bred International Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
EA201491670A1 (ru) 2012-03-13 2015-07-30 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Генетическое снижение мужской репродуктивной функции у растений
WO2013138309A1 (en) * 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
MX2014011043A (es) * 2012-03-13 2015-06-02 Pioneer Hi Bred Int Reduccion genetica de la fertilidad masculina en plantas.
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
EP2781151A1 (en) 2013-03-18 2014-09-24 Bayer CropScience AG Methods of separating hybrid seed from a mixture of seeds
CN110301349B (zh) * 2019-08-12 2021-09-14 浙江省农业科学院 一种绿色宝塔花椰菜杂交种的选育方法
CN112251459B (zh) * 2020-08-27 2023-01-20 云南大学 一种制备和鉴定雄性配子体不育的方法
CN115428730B (zh) * 2022-09-30 2023-12-19 南京农业大学 一种利用山奈酚提高果树自花结实率的方法
CN117247967B (zh) * 2023-11-10 2024-02-20 北京首佳利华科技有限公司 雄性不育基因ZmPKSA及其在创制玉米雄性不育系中的应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710511A (en) * 1971-04-21 1973-01-16 Univ Illinois Procedures for use of genic male sterility in production of commercial hybrid maize
GB8901677D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Hybrid seed production
NZ227835A (en) * 1988-02-03 1992-09-25 Paladin Hybrids Inc Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
WO1990008828A2 (en) * 1989-02-02 1990-08-09 Paladin Hybrids Inc. Molecular methods of hybrid seed production
NL8800756A (nl) * 1988-03-25 1989-10-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Genetisch gemanipuleerde plantecellen en planten, alsmede daarvoor bruikbaar recombinant dna.
GB8810120D0 (en) * 1988-04-28 1988-06-02 Plant Genetic Systems Nv Transgenic nuclear male sterile plants
GB8901675D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Inhibitor of gene expression
US5231020A (en) * 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5034323A (en) * 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5432068A (en) * 1990-06-12 1995-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Control of male fertility using externally inducible promoter sequences

Also Published As

Publication number Publication date
HU9302930D0 (en) 1994-01-28
AU663871B2 (en) 1995-10-26
HU219543B (hu) 2001-05-28
TR27026A (tr) 1994-10-10
US6005167A (en) 1999-12-21
SK111693A3 (en) 1994-02-02
IL101592A0 (en) 1992-12-30
HUT65482A (en) 1994-06-28
WO1992018625A1 (en) 1992-10-29
CA2105592A1 (en) 1992-10-17
UA39169C2 (uk) 2001-06-15
IE921206A1 (en) 1992-10-21
BR9205894A (pt) 1994-09-27
IL101592A (en) 1998-12-27
JPH06506595A (ja) 1994-07-28
AU1698992A (en) 1992-11-17
EP0513884A1 (en) 1992-11-19
RU2170255C2 (ru) 2001-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6005167A (en) Male-sterile plants, method for obtaining male-sterile plants and recombinant DNA for use therein
JP3143120B2 (ja) 変更された花、種又は胚芽をもつ植物
CA2223454A1 (en) Molecular methods of hybrid seed production
US8710301B2 (en) Method for producing male sterile plants using plant beclin 1/ATG6 expression
JPH02503988A (ja) 改変雄蕊細胞を有する植物
JPH03503004A (ja) 変更された花を有する植物
AU742366B2 (en) Induction of male sterility in plants by expression of high levels of avidin
JP2000116258A (ja) 二元性潜在性細胞毒性法によるハイブリッド種子の産生方法
US6683230B1 (en) Hybrid seed production
EP1702508A1 (en) Method of producing sterile plant, plant obtained by using the same and use thereof
AU3656300A (en) A method for inhibiting the expression of target genes in plants
JP2002533089A (ja) 作物植物での異系交雑および望ましくない遺伝子拡散を制限するための方法および遺伝子組成物
WO1999046396A2 (en) Glyphosate as a gametocide
JPH10504706A (ja) 雄性不稔植物の維持のためのアントシアニン遺伝子の使用
US20040064857A1 (en) Nuclear male sterile plants, methods of producing same and methods to restore fertility
CN103667209B (zh) 影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途
CN103709240B (zh) 介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法
AU778752B2 (en) Tapetum-specific promoters
MXPA00008850A (en) Glyphosate as a gametocide
HU221518B (hu) Hímfertilitást közvetítő nukleotidszekvenciák és eljárások azok alkalmazására
MXPA97009731A (en) Induction of male sterility in plants through the expression of high levels of avid

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic