SK111693A3 - Male-sterile plants, methods for obtaining male-sterile plants and recombinant dna for use therein - Google Patents

Male-sterile plants, methods for obtaining male-sterile plants and recombinant dna for use therein Download PDF

Info

Publication number
SK111693A3
SK111693A3 SK1116-93A SK111693A SK111693A3 SK 111693 A3 SK111693 A3 SK 111693A3 SK 111693 A SK111693 A SK 111693A SK 111693 A3 SK111693 A3 SK 111693A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
male
plant
gene
plants
sterile
Prior art date
Application number
SK1116-93A
Other languages
English (en)
Inventor
Adrianus J Van Tunen
Ingrid M Van Der Meer
Josephus N M Mol
Original Assignee
Mogen Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mogen Int filed Critical Mogen Int
Publication of SK111693A3 publication Critical patent/SK111693A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12N9/1037—Naringenin-chalcone synthase (2.3.1.74), i.e. chalcone synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)
    • C12Y114/13011—Trans-cinnamate 4-monooxygenase (1.14.13.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Vynález sa týka rekombinačnej DNA, najmä Dotom rekombinačnej DNA, ktorá má vzťah ku genetickej manipulácii rastlín. Ďalej sa vynález týka rastlín, ktoré vykazujú v jadre zakódovanú samčiu sterilitu váaka exoresii tejto rekombinačne j DNA· Nskoniec sa vynález týka tiež časti týchto 5 rastlín, ktoré sú sexuálne a/alebo asex-uálne reDrodukovatelné.
Doterajší stav, techniky
Už dlhý čas je známe, že semená získané krížením medzi rôznymi odrodami jedného druhu poskytujú potomstvo s lepšími vlastnosťami, pokial sa týka výnosu, vhodnosti vzhíadom k životnému prostrediu a odolnosti voči chorobám, v porovnaní s potomstvom pochádzajúcim zo semien získaných pri samoopelení. Tento jav je všeobecne označovaný za heterózu. Z tohto dôvodu je cielom semenárstva získať hybridné osivo · v u čo najväčšieho počtu poľnohospodárskych a záhradníckych plodín, pretože také osivo má väčšiu obchodnú hodnotu.
ivanešťastie však mnohé plodiny nesú samčie a sami. čie reprodukčné orgány na jednom jedinci, čo má za následok, že silno prevláda samoopelenie nad cudzoopelivo.sťou.
. Aby teda bolo možné získať semená vzniknuté krížením, bolo by potrebné mať k dispozícii akceotorové rastliny, ktoré nie sú samoopelivé váaka neprítomnosti /správne fungujúceho/ Delu. Tieto rastliny vykazujúce samčiu sterilitu alebo samičie rodičovské rastliny by Dotom bolo možné použiť dtí krížovej fertilizácii za ooužitia samčej fertilnej donorovej rastliny, za vzniku hybridných semien.
Fri produkcii hybridného osiva vo velkom meradle sa potom obvykle rastliny vykazujúce samčiu sterilitu a rastliny vykazujúce samčiu fertilitu dohromady pestujú na poli, aby sa im umožnila cudzoopelivosť a potom sa uskutoční selekcia semien hybridu. V závislosti od použitého typu rastliny vykazujúcej samčiu sterilitu sa selekcia alebo separácia semien hybridu vykonáva pred zberom, t.j. zničením alebo odstránením donorových rastlín vykazujúcich samčiu fertilitu, ktoré poskytujú nehybridné osivo, alebo po zber.e, napríklad za použitia markeru, ako je farba semien u kukurice alebo iný lahko rozoznateíný fenotyp. Selekcia pred zberom je uskutočnitelná v tom prípade, že sa dajú rastliny vykazujúce samčiu fertilitu rozoznať od rastlín vykazujúcich samčiu sterilitu a potom ich odstrániť alebo zničiť. Alternatívne, pokiaí je lokus samčej sterility tesne spojený so selekčným markerom /ako je odolnosť voči herbicídom/, môžu rastliny vykazujúce samčiu sterilitu, ktoré nesú hybridné semená, vyradiť pri konkurencii rastliny vykazujúce samčiu fertilitu, ked sa na kultúru aplikuje vhodný selekčný tlak.
Ako rodičovská línia rastlín vykazujúcich samčiu sterilitu sa používajú napríklad fyzicky vykastrované rastliny alebo, pokial sú k dispozícii, mutanty vykazujúce samčiu sterilitu zakódovanú v cytoplazme alebo jadre. Také prírodné rastliny vykazujúce samčiu sterilitu majú svoje nevý✓ hody, či už je to velmi oracné získavanie, prítomnosť prídavných nežiaducich vlastností, obtiažnost pestovania a rozmnožovania, neoredvídatelná dedičnosť alebo obmedzená dostupnosť prírodných mutantov so samčou sterilitou ori obchodne zaujímavých plodinách.
Iba odnedávna sú známe rastliny, u ktorých je samčia sterilita zakódovaná v jadre za použitia génového inžinierstva, ktoré je možné používať nri produkcii hybridných se
- 3 mien a ktoré nemajú aspoň niektoré z nevýhod väčšiny prírodných mutantov so samčou sterilitou.
V medzinárodnej patentovej prihláške WO 90/08830 firmy ICI boli navrhnuté všeobecné spôsoby produkcie regenerovatelných rastlín so samčou sterilitou, ktoré v podstate zahŕňajú expresiu buč a/ génu kódujúceho proteínový inhibítor alebo b/ tzv. killer /zabijačového/ génu. Tieto gény ss potom exprimujú v samčích rastlinách, pričom dochádza k usmrteniu buniek prášníkov a pripojených tkanív. Ako príklady killer génov je možné uviesť gény, ktoré pri expresii dôsobia na mitochondriálny metabolizmus.
V medzinárodnej patentovej prihláške WO 90/08831 firmy tqi bola popísaná inhlbícia bunkovej respirácie exoresiou prerušovacieho /disrupter/ génu. Touto expresiou sa dosiahne inhibícia funkcie mitochondrií, ktorá nakoniec vedie až k usmrteniu buniek, v ktorých sa tieto gény exprimujú. prednostnými preruáovacími /disrupter/ proteínmi sú a/ samčie vypriahovacie /uncoupling/ proteíny /UOF/, b/ proteíny, kódované mutovanou formou génu pre 0-1 podjednotku, F-^-ATPázy, pričom tieto mutačné zmeny spôsobia neschopnosť týchto podjednotiek spojiť sa vo funkčnú ATP-syntetázu, c/ proteíny, kódované mutovanou syntetickou formou olil génu, ktorý kóduje podjednotky 9 FQ-ATP-ázy, d/ mutované formy mitochondriálneho prenášačového peptidu, ktoré spôsobia prerušenie proteínového transportu do mitochondrií, e/ orerušovací fúzny proteín, ktorého expresia sa dosiahne použitím génových konštruktov, spôsobujúcich fúziu medzi génom pre ^-Dodjednotku /ATP-ázy/ z kvasiniek a génom pre galaktozidázu z E. coli. prednostne by taká expresia, pódia upresnenia, mala byt regulovaná riadením tapetum - špecifického alebo Deíovo-špecifického promótora.
medzinárodnej patentovej prihláške 10 89/10396 firmy PGS sa navrhujú všeobecné spôsoby na získanie samčích sterilných rastlín transformáciou jadrového genómu rastliny
DNA, spôsobujúce samčiu sterilitu /tzv. male-sterility DNA/· Táto DNA obsahuje úseky, ktoré kódujú RNA alebo Dolypeotid, schopné narušil riadny metabolizmus, fungovanie a/alebo vývoj bunky, v ktorej sa táto DNA exprimuje. Prednostne vedie expresia tejto DNA až k usmrteniu takej bunky. Príkladom takej /male-sterility/ DNA sú tie úseky DNA, ktoré kódujú DNAf ázy, RNA-ázy, proteázy alebo enzýmy syntézy fytohormonov ako je cytokinín. Alternatívne je navrhnuté, že sa uvedená /male-sterility/ DNA vyberie zo skupiny obsahujúcej pozitívne z
reťazce DNA, ktoré kódujú vlákno DNA komplementárne k vláknu DNA, ktoré sa prirodzene prepisuje v rastlinných tyčinkových bunkách. Okrem TA29 génu, TA-26 génu a TA13 génu, čo šú všetko tapetum-špecifické gény získané z tabakovej rastliny, sa neuvádza žiadna stopa, vedúca k určeniu zmienených génov. V článku Koltunowa a äalších /koltunow A. M·, Truettner J., Cox K. H·, Wallroth M· s Goldberg R. B. /1990/, Different temporal and spatial gene expression Datterns during anther development, Plánt Celí 2, 1201-1224/ sa uvádza, že klony TA13 a TA29 boli identifikované ako klony, kódujúce takzvané glycínovo bohaté /Glycine Rich/ proteíny, zatial čo kloň TA26 zodpovedá cDNA doteraz neznámej povahy.
európskej patentovej prihláške EP-A-C 329308 firmy Palladin Hybrids sa navrhuje spôsob Drípravy samčích stez rilných rastlín, zahŕňajúci prípravu geneticky transformovanej samičej rodičovskej rastliny. Tento spôsob zhruba soočíva v inzercii rekombinačných sekven.cií DNA, obsahujúcich pozitívnu DNA, do genomu uvedenej rastliny. Pozitívna .'DNA blokuje produkciu funkčných pelových zŕn alebo spôsobí, že vyvíjajúce sa Delové zrná sú citlivé na nejaké chemické činidlo alebo fyziologický stres, čo sú faktory blokujúce orodukciu funkčných pelových zŕn. rrednostne je expresia uvedených antimediátorových génov riadená Dromotorom špecifickým pre pelové gény. Gény, ktoré sú klúčové pre orodukciu funk- 5 čných Delových zŕn, podlá špecifikácie tejto patentovej prihlášky, by sa mali špecificky exprimovať v mikrospórach, prednostne v premiotickom štádiu. Príklady mikrosDÓrových špecifických klonov sú. L4 a Ll?, získané z Prassica naous. Okrem všeobecného vyznačenia oremiotických ~énov a letmo zmienených klonov sa v prihláške neudáva žiadne dalšie Donaučenie s ohladom na povahu génov, ich expresia sa má blokovať .
Európska patentová prihláška 0335451 firmy Vereniging voor Ohristelijk Wetenschappelijk Onderwijs popisuje, že inhibícia expresie génu pre chalcon syntetázu v kvetoch, dosiahnutá Doužitím antimediátorového génového konštruktu spôsobí zmenené ,sfarbenie kvetu. Antimediátorový gén bol v tomto pokuse umiestnený pod kontrolu konštitutívneho 35S promótora mozaikového vírusu karfiolu /CaVV/. Rastliny so zmeneným sfarbením kvetu sú stále schopné tvoriť fertilný peí.
’jhalcon syntetáza je kľúčový enzým v biosyntéze flavonoidov. Tento enzým katalyzuje Dostupnú kondenzáciu troch acetátových zvyškov z malonyl-OoA a jedného zvyšku zo 4-kumaroyl—ľoA za vzniku naringenin chálconu. Izomerizácia a oalsia substitúcia tohto centrálneho medzioroduktu nakoniec vedie k tvorbe flavonoidov. Tlavonoidy sú sekundárne metabolity, známe tým, že majú klúčovú funkciu v sfarbení kvetov a Dlodov. Okrem toho sa zdá, že flavonoidy sú zapojené do obrany proti fytopatogénom /Lamb C«J., Lawson M· A·, Dron y. a Dixon R. A· /1939/ Signals and transduction mechanisms for activation of Dlant defenses against microbial attack, uell 56, 215-224/, do ochrany DrotiUV-svetlu /Schmelzer E·, Jahnen ľ/, a Hahlbrock /1988/ in situ hybridization of light-induced chacone synthase mSNA, chalcone synthase, and flavonoid endoroducts in enidermal cells of oarsley leaves, proc. Mati. Acad. Sci. USA 85, 2939-2993/ ε do indukcie
- 6 nodulácie /Long S· /1989/ Rhizobium-legume nodulation : Life together in the underground, Celí 56, 203-214/. Flavonoidy tiež pôsobia na reguláciu transportu auxínu. /Jacobs M. a Pubery P.H· /1988/ Natural occuring auxin transport regulátore, Science 241, 46-3497 a rezistenciu voči hmyzu /Hedin p.A· a Waage S-K· /1986/ P.oles of flavonoids in plánt resistance to insects v Progress in ulinical and Eiological Hesearch, zv. 213: Plánt Flavonoids in Biology and Medicíne, vydavatelia: V. Cody, E. Midleton Jr. a J. B· Harborne /New York Alan R. Liss/, str. 87-100/·
Toto množstvo flavonoidných funkcií vyžaduje úmerne komplexnú reguláciu génov, kódujúcich rôzne enzýmy danej dráhy, napríklad expresia génov* pre biosyntézu antokyánov je kvetovo Špecifická, závisí od svetla a je vývojowriadená /Tunen A«J·, van Koes R.E·, Spelt U.F·, van der Krol A.R., Stuitje Α·η· a Mol J. Ν·Μ. /1988/ Cloning of the two chalcone flavanone isomerase genes from Petunia hybrida: Coordinate, light-regulated and diferential expresion. of flavonoid genes, EMBO J- 7, 1257-1264; K°es R.E. , Spelt C. E. a Mol J. N.M· /1989/ The chalcone synthase multigene family of Petu- . nia hybrida /730/: Differenthial light-regulated expresion during flower development and UV light induction, Plánt. Mol tíiol. 12, 213-225/· Avšak expresia týchto génov v iných tkanivách môže byť indukovaná UV svetlom, poranením alebo napadnutím hubami /Dixon R.A. /1986/ The phytoalexin responses: Eliciting, signalling and control of host gene expression, aiol. Rev. 61, 239-291; Koes a další /1989/; Lamb a další /1989/, články uvedené vyššie v texte/.
Porovnanie UUS-A promótoru s inými Dromótormi génov syntézy flavonoidov, ktoré sú aktívne v nezrelých nrašníkových tkanivách /napríklad CHS-J, DER-A a CHI-B/ viedlo k objaveniu prítomnosti silno konzervovanej oblasti nazvanej anther box /prašníkový box/ /van Tunen A.-J·, Hartman S.A.,
Mur L«A· a líol J. N. Pvl. /1969/ Regulation of chalcone isomerase /OHI/ gene expression .in Petunia hybrida: The use of alternatíve promoters in corolia anthers and Dollen, Plánt Mol. Biol. 12, 539-55V'·
Delečné analýzy OHS-A promotora svedčia o tom, že anther box samotný nie je zodpovedný za enther-špecifickú /prašníkovo špecifickú/ expresiu, ale že sa môže zúčastňoval regulácie anther-špecifickej expresie v spojení s inými sekvenciami prítomnými v 2HS-A promótore /van der Meer I. M. Spelt υ·Ε·, Mol J.N·M. a Stutje A.R. /1990/ Promoter analysis of the chalcone synthase /chsA/ gene of Petunia hybrida: A67 bp promoter región directs flower-specific exDression, Flant Mol. Biol. 15, 95-109/»
V roku 1981 Coe a äalší /Coe Ε·Η·, Jr., McCormick S-M· and Modena S»H. /1961/, White polien in maize. J. Hered. 72, 318-320/ zistili, že zdravo vyzerajúci biely pel v kukurici nefunguje normálne a vzniesli hypotézu, že syntéza pigmentov alebo jej odstránenie môžu byt životne dôležité pre fungovanie pelu. V tomto článku však autori z výsledkov nevyvodili, že flavonoidy sa zúčastňujú na vývoji pelu, pokial tento fakt priamo nespochybnili. Pokiaí je známe, ani v dalších rokoch nebol podaný žiadny presvedčivý dôkaz, týkajúci sa funkcie flavonoidov vo vývoji životaschopného pelu.
Nasleduje definícia používaných Dojmov;
Anther box /prašníkový box/; nukleotiaová sekvencia, ktorá je totožná alebo aspoň velmi homológna s akoukoivek sekvenciou uvedenou na obr. 1.
Antimediátorový gén: gén alebo od neho odvodená nukleotiaová sekvencia, viac než z 50 ? homológna, orednostne viac než z 80 % homológna, s cielovým génom tu definovaným, ktorá je viazaná na promotor v ooačnej /od 5'k 3'koncu/ orientácii vzhíadom k delovému génu.
Gén: nukleotidová sekvencia, ktorá sa môže exprimova? v podobe RMA molekuly a/alebo polypeptidu.
Hybridný promótor: promótor, ktorý sa skladá z nukleotidových sekvencií alebo jednotlivých nukleotidov, ktoré nie sú spolu prirodzene spojené alebo ktoré sa v promótore prirodzene nenachádzajú v tomto poradí. __
Inhibičný gén: gén alebo antimediátorový gén, ktorého exDresia vedie k úplnej inhibícii expresie cielového génu, tu definovaného .
promotor: nukleotidová sekvencia, ktorá je schopná vyvolá? expresiu génu alebo antimediátorového génu alebo nukleotičových sekvencií od nich odvodených, Dričom táto expresia vedie k tvorbe RMA molekuly a/alebo polypeptidu.
reštauračný /obnovovací/ gén: gén, prednostne fúzny gén, obsahujúci prinajmenšom nukleotidová sekvenciu, ktorá je do* statočne rovnaká, podobná alebo homologna s častou cielového génu tu definovaného, aby bola schopná, z podmienok expresie komplementárne asocioval s transkriptom, vytvoreným pôsobením inhibičného génu, tu definovaného.
:jielový gén: gén, ktorého expresia sa má inhibovat vlastnou expresiou vhodného inhibičného génu, tu definovaného.
Fre účely tejto patentovej prihlášky sú všetky numerické vyznačenia pozícií báz, ktoré sú Dod kontrolou určitého génu, vztiahnuté k predpokladanému štartovému miestu transkripcie zodDOvedajúceho génu.
podstata vynálezu
Úlohou tohto vynálezu bolo získať rastliny so samčou sterilitou, ktoré sa môžu bezpečne použiť na produkciu hybridného osiva. Úlohou vynálezu bolo dalej poskytnúť rastliny so samčou sterilitou, ktoré by sa dali získať v homozygotnej podobe tak, aby sa vo velkom meradle vytvorili heterozygotné rastliny so samčou sterilitou, efektívne vzhladom na vynaložené náklady.
Predmetom vynálezu sú rekombinačné polynukleotidy, ktoré sa môžu vhodne použil na získanie rastliny so samčou sterilitou a ktoré v podstate obsahujú:
a/ inhibičný gén schopný inhibovať expresiu cieíového génu uvedenej rastliny, kódujúceho enzým z metabolickej dráhy nre oiosyntézu chalconu a b/ promótor, ktorý je aktívny v prašníkoch uvedenej rastliny, operabilne spojený s uvedeným inhibičným génom tak, aby sa dosiahla expresia tohto génu v prašníkoch uvedenej rastliny.
Frednostný cieíový gén pódia tohoto vynálezu kóduje enzým vybratý zo skupiny, ktorá sa skladá z cinnamát 4-hydroxylázy /C4H; E.C· 1.14·13·11/> 4-kumaroyl-CoA ligázy /4CL; E.C. 6.2.1.12/ a chalcon syntetázy /CHS; 3.0.2·3.1.74./ Obzvlášť prednostným cielovým génom je gén, kódujúci v rastline chalcon syntetázu /CHS/· Prednostne podlá tohto vynálezu je inhibičným génom antimediátorový gén namierený oroti delovému génu. Ďalej prednostne podlá tohto vynálezu obsahuje promótor, aktívny v prašníkoch danej rastliny, fragment vysoko účinného promotora skupiny génov, skladajúcej sa z génov chs-A, chi-H, chs-J a dfrA. z rodu Petunia. Cbzvlášť prednostne obsahuje vysoko účinný promótor fragment UaMV 35S promótora a anther box so sekvenciou
TAGAGGTGACAGAAAT (SEQIDNO: 2) vloženou v uvedenom fragmente na pozícii -90 vzhladom k štartovému miestu transkripcie.
Predmetom vynálezu je tiež spôsob získavania rastliny so samčou sterilitou, ktorý sa skladá z nasledujúcich krokov:
a/ prenesenie rekombinačného polynukleotidu podlá tohto vynálezu do buniek rastliny so samčou feŕtilitou, b/ vytvorenie celých nových rastlín z buniek s inkorDorovaným uvedeným rekombinačným polynukleotidom a c/ výber rastliny so samčou sterilitou.
Vynález dalej zahŕňa rekombinačný rastlinný genóm, obsahujúci do neho inkorporovaný rekombinačný polynukleotid podlá tohto vynálezu. Ďalším predmetom tohto vynálezu je nukleotidová sekvencia s poradím báz:
TNGAGGWGAMRDARWW (SEQIDNO: 1) kde N = A, G, C, alebo T; ’.V = A alebo T; M = A alebo C; R = = A alebo C- a D = A, G alebo T, využiteíná pri získaní rastliny so samčou sterilitou. Ďalšími prednostnými aplikáciami tohto vynálezu sú použitia oligonukleotidových sekvencií s nasledujúcim poradím báz:
(a) (b) (c) (d)
TAGAGGTGACAGAAAT (SEQIDNO: 2)
TAGAGGTGACAAÄAAT (SEQIDNO: 3)
TNGAGGTGACAAAGAT (SEQIDNO: 4)
TAGAGGAGAAGTAATA (SEQIDNO: 5) kde N = A, G, C alebo T, pričom tieto sekvencie sa môžu použil pri získaní rastliny so samčou sterilitou.
- 11 Predmetom vynálezu je áalej spôsob získanie samooplodnených semien z rastliny so samčou sterilitou, do ktorej je inkorporovaný rekombinačný polypeptid podlá tohto vanálezu. Tento spôsob sa skladá z týchto krokov:
a/ kontaktovanie piestika rastliny so samčou sterilitou s pelom z tej istej rastliny so samčou sterilitou v prítomnosti vhodnej flavonoidnej zlúčeniny a b/ klíčenie pelu na piestiku a ODlodnenie rastliny so samčou sterilitou a ~ c/ tvorby semien v danej rastline.
Pri obzvlášť prednostnom spôsobe sa flavonoidová zlúčenina vyberie zo skuDiny skladajúcej sa z myricetínu, kvercetínu a kamferolu a použije sa prednostne v koncentračnom rozmedzí od 100 nmol do 3 junol.
Ďalším prednostným spôsobom podlá tohto vynálezu je soôsob produkcie hybridného osiva, ktorý je efektívny vzhľadon na vynaložené náklady. Táto produkcia sa docieli ori neužití veľkých množstiev heterozygotných rastlín so samčou sterilitou, ktoré boli získané krížením homozygotnej rastliny požadovanej odrody so samčou sterilitou s rastlinou rovnakej odrody so samčou fertilitou.
Vynález dalej zahŕňa /hybridné/ osivo získané krížením alebo samoopelením akýchkoľvek rastlín podľa tohto vynálezu.
Iným prednostným aspektom tohto vynálezu sú plazmidy pTS20, PTS21 a pTS22· výhody tohto vynálezu a rozsah jeho aolikácií sa lahko zistia z nasledujúceho podrobného dodísu vynálezu.
Prehled obrázkov na výkrese
Obr. 1 ukazuje sekvenciu syntetického anther boxu promótora CHS-A, ktorý bol vložený do Ca’vľV 35S promótora. Anther boxy, odvodené od rôznych génov biosyntézy flavonoidov sú uvedené pod sekvenciou anther boxu promótora UHS-A. Čísla v zátvorkách označujú relatívne umiestnenie anther boxu vzhladom k štartovému miestu transkripcie pôvodného génu.
Obr. 2 nredstavuje diagramové znázornenie rôznych krokov klonovania na získanie chimérových GHS-konštruktov alebo chimérových pozitívnych CHS-konštruktov.
Obr. 3 predstavuje diagramové znázornenie SDÔsobu získania hybridného osiva so samčou sterilitou; toto hybridné osivo sa môže použiť pra plodiny, pri ktorých sa nežiada tvorba semien alebo plodov; symbol x označuje samičiu rodičovskú odrodu; symbol Y označuje samčiu rodičovskú líniu; skratka CaMV znamená 35S promótor mozaikového vírusu karfiolu; skratka AB znamená anther box, vložený do 3ÔS promótora; skratka OHS znamená antimediátorový gén pre chalcon syntetázu.
Cbr. í predstavuje diagramové znázornenie spôsobu získania hybridného osiva so samčou fertilitou; toto hybridné osivo sa môže použiť pre plodiny, u ktorých je nevyhnutné vytvorenie semien alebo plodov, skratka OHS sense-negatívny znamená normálny gén pre chalcon svntetázu; všetky ostatné skratky a symboly majú rovnaký význam ako na obr. 3.
Cbr. 5 predstavuje diagramové znázornenie spôsobu získania hybridného osiva so samčou fertilitou; toto hybridné osivo sa môže použiť pre plodiny, u ktorých je nevyhnutná tvorba semien alebo plodov; skratka GUSs znamená gén pre
- 13 jo-glukoromidázu z E. coli; gény z C-USs a b'HSas sú fyzikálne spárované tak, abyvytvorili fúzny gén, ; všetky ostatné skratky a symboly majú rovnaký význam ako na obr. 3·
Obr. ' predstavuje diagramové znázornenie spôsobu získania hybridného osiva s indukovatelnou samčou fertilitou; toto hybridné osivo sa môže použil pre plodiny, u ktorých je nevyhnutná tvorba semien alebo plodov; všetky skratky a symboly majú rovnaký význam ako v predchádzajúcich obrázkoch.
Obr. 7 predstavuje diagramové-znázornenie spôsobu získania hybridného osiva s indukovatelnou samčou fertilitou; toto hybridné osivo sa môže použil pre plodiny, u ktorých je nevyhnutná tvorba semien alebo plodov; skratka NSP znamená nešpecifickú čast reštauračného génu, ktorá sa používa preto, aby sa zamedzilo predpokladanému ko-supresívnemu účinku C’HS časti reštauračného génu; všetky čalšie skratky a symboly majú rovnaký význam ako v predchádzajúcich obrázkoch.
Nasleduje podrobný popis vynálezu:
Zistilo sa, že expresia reDorterového génu, /reportér gene/ pre bakteriálnu fr-glukoromidázo/GUS/ v transgénnych rastlinách ?etunia hybrida, ktorá je riadená hybridným promótorom, obsahujúca anther box odvodený od GHS-A promótora z Petunia hybrida fúzionovaný s UA MV 35S promótorom /tu v texte je dalej tento promótor uvádzaný ako AB/CaMV 35S promótor/, vedie k významne vyššej expresii v prašníkoch oproti korunnému tkanivu, v porovnaní s GUS expresiou, riadenou CaMV promótorom. Tiež sa zmenila špecifickosť vzhladom k typu buniek, pretože expresia bola pozorovaná tiež vo vrstve zárodkových /tapetum/ buniek. Expresia, riadená 35S promótorom bez anther boxu,takto neprebieha.
- 14 Anther box je zrejme schopný riadit anther-špecifickú /prašníkovc špecifickú/ expresiu bez prítomnosti áalších cis-posobiacich elementov, ktoré sú prítomné v b’HS-A géne, ktorých pôsobenie na expresiu sa skôr predpokladalo.
*
Hybridný promotor nie je anther-špecifický, pretože expresia sa deteguje tiež v iných tkanivách. Anther box môže tiež riadil expresiu vo vrstve zárodočných /tapetum/ buniek.
Pri podobnom pokuse, ako je ten Dopísaný Dre GUS reporterový gén, sa antikodónový UHS gén /cDNA/ z rodu Petunia umiestnil pod kontrolu AB/CaMN 35-S promótora a tento konštrukt sa použil na transformáciu červeno kvitnúcej hybridnej rastliny Petunia VR. Po selekcii transformovaných rastlín, v ktorých sa tento konštruktexprimoval, sa vybraté rastliny nechali vykvitnúc, zistilo sa, že Orašníky niektorých týchto rastlín sú biele a nie červené. Biele orašníky neboli nikdy objavené v predchádzajúcich experimentoch, pri ktorých bol antimediátorový CHS-A gén fúzionovaný s normálnym 35~S promótorom, riadiacim expresiu OHS-antimediátorového génu, aj keď expresia antimediátorového génu v prašníkoch v skutočnosti prebiehala.
Vyvodzuje sa teda, že funkcia anther boxu, tu definovaného, môže spočívat v riadení expresie akéhokolvek génu /alebo mediátorového génu/ v zárodočnej vrstve /taoetum/ buniek prašníkového tkaniva, ak tento anther box je vložený do vysoko účinného promótora, ktorého pôvod nie je rozhodujúci.
v Ckrem toho sa dokonca ukazuje, že úroveň exDresie inhibičného génu v prašníkovom tkanive je dostatočne vysoká, aby inhibovala expresiu delového génu v prašníkovom tkanive.
Pri pokuse o samooolodnenie transgénnych rastlín Petunia hybride s bielymi prašníkmi sa zistilo, že ide iba
- 15 o rastliny so samčou sterilitou. Existujú prirodzené mutantné línie rodu Petunia, v ktorých sa nevyskytuje funkčná chal con izomeráza. uhalcon izomeráza je enzým, zúčastňujúci sa konverzie chalconov na flavonony, t.j. ide o další krok flavonoidovej biosyntetickej dráhy. Je známe, že tieto rastliny sú rastliny so samčou fertilitou. Z toho sa môže odvodiť, že na získanie rastlín so samčou sterilitou podlá navrhnutého spôsobu sa inhibičný gén musí vybrat zo skupiny génov, kódujúcich enzýmy zúčastňujúcich sa biosyntetickej dráhy pre chalcon, pretože inhibícia týchto génov nie je pre rastlinu ako celok letálna. — ✓
V iných pokusoch, v ktorých sa antikodonový 2HS-A gén umiestni pod kontrolu normálneho uaMV 35S promótora, sa zistilo, že antikodonový CHS konštrukt sa môže použiť ako inhibičný gén nre inhibíciu expresie zodpovedajúcich delových génov v korunách tabaku a tiež zemiakov. Tým sa dokazuje, že tento prístup /'cez antimediátorový gén/ je funkčný tiež v heterológnych systémoch. Tiež z t oho vyplýva, že rastliny rôznych druhov so samčou sterilitou sa môžu získať transformáciou antimediátorovým uT-rS génom z rodu Petunia, riadeným AB/35S promótorom.
Vynález teda poskytuje nové spôsoby na získanie /
rastlín so samčou sterilitou, zakódovanou v jadre. Tieto rastliny sa môžu vhodne použiť pre Drodukt hybridného osiva, rastliny vybratej odrody sa geneticky transformujú zavedením jedného alebo viacerých rekombinačných polynukleotidov do buniek uvedených rastlín. Kekombinačné polynukleotidy obsahujú aspoň jeden alebo viac inhibičných génov, ktoré môžu pri vlastnej expresii v prašníkoch danej rastliny inhibovať exDresiu jedného alebo viacerých génov, kódujúcich jeden alebo viac enzýmov, ktoré sa zúčastňujú na biosyntéze chalcor.u.
všeobecne sa rastliny so samčou sterilitou získajú inhibíciou expresie vhodného delového génu, kódujúceho enzým biosyntézy chalconu. Inhibícia sa dosiahne vlastnou excresiou inhibičného génu, zameraného oroti delovému génu. Vhodnými delovými gér.mi môžu byt akékoľvek gény, ktoré kódujú enzýmy zúčastňujúce sa na biosyntéze chalconov alebo ich bezprostredných orekurzorov, pretože inhibícia takého génu neovplyvní negatívne iné žiadané charakteristiky danej odrody. všeobecne sa delové gény môžu vybrat z génov, kódujúcich enzýmy, ktoré konvertujú prekurzory chalconu. Týmito enzýmami sú cinamát 4-hydroxyláza /C4H; 3«3 1.14.13«11/, prednostne 4-kumaroyl-uoA ligáza /4CL; Ε·0· 6.2.1.12/ , zvlaží prednostne chalcon syntetáza /3·0·2·3.1.74·/, ktorá priamo konvertuje svoj substrát na chalcon.
inhibičné gény sa môžu vybrať z množstva alternatív medzi ktoré patria mediátorové a antimediátorové gény, ako je to popísané podrobnejšie dalej v texte. Vhodné mediátorové inhibičné gény môžu nanríklad kódovat ribozym, zameraný proti PNA-produktu cieľového génualebo /monoklonálnu/ pŕotilátku, zameranú oroti génovému oroduktu delového génu alebo selektívny proteínový inhibítor delového enzýmu, ak je taký inhibítor známy. Alternatívne môže inhi'oičný gén obsahoval mediátorový gén, Ktorý je v zásade identický s delovým génom a ktorý Dri vlastnej expresii inhibuje doteraz neznýmym mechanizmom uvádzaným ako mediátorovo-mediátorová /sensesense/ inhibícia alebo ko-supresia /co-suDpresion/ /medzinárodná patentová prihláška číslo WQ 90/11662) firmy DNA plánt Technology inc. /.
Inhibičným génom je prednostne antimediátorový gén, zameraný proti delovému génu. Antimediátorový gén nemusí nevyhnutne byí komplementárny k delovému génu. Pokial ide o jeho dĺžku a homológiu, stačí taká, aby sa získal vhodne vysoký stupeň inhibície. Antimediátorový gén môže byl /čiastočne/ komplementárny k 5'koncu, k 3'koncu alebo k strednej časti zodpovedajúceho delového génu alebo môže byt /čiastoč ne/ komplementárny k celému zcdoovedajúcemu delovému génu. Termínom čiastočne komplementárny sa rozumie situácia, kedy mediátorový gén nie je úolne homológny so zodpovedajúcim delovým génom, čo môže byí spôsobené skutočnosťou, že napríklad antimediátorový gén je heterológny /t. j. získaný z odlišného zdroja/ s delovým génom a nodobne. Antimediátorový gén môže byt tiež úolne syntetický. Všetky tieto variácie týkajúce sa voľby antimediátorového génu nie-sú nre tento vynález rozhodujúce, ked stupeň homológie a/alebo celkový rozsah komplementárnych oblastí stačí pre inhibíciu expresie delového génu.
vlastná expresia inhibičného génu podlá tohto vynálezu sa môže docielil umiestnením inhibičného génu pod kontrolu hybridného oromotora, ktorý obsahuje prinajmenšom oromótor funkčný v rastlinách, prednostne ocvodený od vysoko f , účinného oromotora, napr. caMV 39S RNA promotor /alebo jeho deriváty/ a nther box odvodený od génu, ktorý sa exprimuje v nezrelom prašníkovom tkanive rastlín. Vhodní predstavitelia anther boxu sa môžu okrem iného získal z génov 'JHS-A, CTS-.J, CHI-B alebo ĽF’-A a podobne.
Prednostne sa uvedený anther box vloží do oromotora v oblasti medzi pozíciami -2000 a +1, ozvlášt prednostne medzi pozíciami -I50 a -50· Cbzvlášt prednostne sa anther box vloží na miesto -90 v CaMV 35S oromotora.
voľba rastlinného zdroja, z ktorého sa získa anther box, nie je rozhodujúca, pokial anther box normálne funguje v konečnom transgénnom hostiteľovi, všeobecne sa dáva orednosť tomu, aby homológia použitého anther boxu s boxami, o ktorých je známe, že zvyšujú expresiu v orašníkoch danej hostiteľskej rastliny, bola čo najvyššia, ’ľaký anther box sa môže vhodne syntetizoval zo známej sekvencie anther boxu, vyskytujúceho sa v konečnej hostiteľskej rastline alebo v akejkoľvek inej rastline alebo sa môže získal z odlišného rastlinného zdroja alebo iným spôsobom.
Všeobecne ale nie nevyhnutne sa genetický materiál, na ktorom je umiestnený inhibičný gén fuzionovaný s hybridným promótorom podlá tohto vynálezu, v podobe buč rekombinačnej DNA alebo P.NA, zavedie do rastlín na rekombinačnom polynukleotide bud DNA alebo PNA, ktorý je tesne zviazaný s rozlíšitelným znakom ako je rezistencia k herbicídu alebo antibiotiku. Táto vazba umožní časový výber alebo rozlíšenie trasnformovaných buniek. Použitie takého markera sa môže vynechať, pretože prítomnosť a expresia inhibičného génu podlá tohto vynálezu sa môže rozlíšiť priamo, ked transgénne rastliny kvitnú, pekombinačné polynukleotidy sa obvykle uchovávajú alebo množia v baktériách Vo forme olazmidov alebo iných reolikonov /napr. vložené do vírusovej DNA alebo RNA/. Alternatívne sa rekombinačné polynukleotidy môžu množil in vitro napr. pomocou reťazovej polymerizačnej reakcie /POP/, ktorá je dobre známa docborníkom v tomto obore. Vlastný spôsob nie je pre vynález rozhodujúci.
Zavedenie rekombinačných polynukleotidov do rastlinného materiálu sa môže vykonať použitím niekolkých techník, ktoré sú všetky dobre dosiahnutelhé pre bežného odborníka, pracujúceho v obore rastlinnej biotechnológie. Soôsob zavedenia genetického materiálu do buniek hostitelskej rastliny nie je konkrétne relevantný, pokial tento soôsob zaručuje rozumnú šancu na úspech a podobne rozumne predvídatelný výsledok. Taký spôsob nutne nevylučuje potrebu určitého stupňa selekcie konečne žiadaného výsledku. ~o je však bežná prax v obore rastlinného génového inžinierstva a nie je potrebné oreto vykonával rozsiahle experimenty, ríklady zmienených spôsobov, ktoré sú vymenované len na ilustráciu, sú transformácie protonlastov Dri ooužití vápenatých iónov s polyetylénglykolom,
- ίο elektroporácia /Shillito R.R· a další /1985/ Rio/Technology 3, 1C99-1102/ > mikroin jekcie, bombardovanie časticami /potiahnutými ”A alebo HRA/, infekcia vírusmi a podobne. Frednostne sa používa prirodzený FNA transferový systém z druhov rodu Agrobacterium a medzi týmito systémami sa dáva prednosť použitiu tzv. binárneho vektora /Bevan y. /1984/ Binary Agrobacterium vectors for plánt transformation, pjucI. Acids Bes. 12, 8711-8712/· pracovník priemerne skúsený v danom obore si môže vybrať, aký bakteriálny materiál zvolí -pre prenos D^A do rastlinnej bunky a tiež volba vektorov, vhodných selekčných markerov, inkubačných podmienok, kultivačných médií a nevyhnutných techník klonovania SNA 'závisí od neho. Po selekcii a/alebo testovaní a výbere transformovaného rastlinného materiálu sa tento materiál regeneruje, aby sa vytvorila celá rastlina s použitím spôsobov podrobne popísaných v literatúre /via napr. ::orsch P..B· , Prv J.B. , Roffman Ľ.L·., Eichholz D·, Pogers S.C-· a Fraley R.ľ· /1985/, A simole and generál method for transferring genes into olants. Science 227, 1229-1231/· yože sa použiť akákoľvek časť rastliny, ktorá je prístupná transformácii a regenerácii.
Samotný spôsob transformácie a/alebo regenerácie nie je rozhodujúci ore tento vynález, pokial sa ním docieli zavedenie genetického materiálu do rastlinnej bunky a stabilná integrácia /kópia/ genetického' materiálu do genomu rastlinnej bunky. Je tiež potrebné, aby sa uvedený rastlinný materiál v
mohol regenerovať a pri regenerácii sa vytvoril výhonok, ktorý by sa mohol dalej zakoreniť /alebo naočkovať/, čím by sa utvorila celá nová rastlina. Výber techniky závisí od konkrét neho typu použitého rastlinného materiálu a/alebo od toho, čo mu dáva odborník v obore prednosť.
- 20 Fo získaní transformovaných rastlín sa tieto rastliny môžu hodnotiť z híadiska orítomnosti žiadaných vlastností a/'alebo rozsahu, v akom sa žiadané vlastnosti exorimujú. rrvé hodnotenie mcže zahŕňať úroveň exoresie inhibičr.éhc génu a mieru samčej steility transgénnych arastlín. Potom sa môžu vybrať transgénne rastliny, ktoré vykazujú stabilnú a/ -alebo preavídatelnú dedičnosť znaku samčej sterility a podobne. ŕalej sa /hetrozygotné/ samčie rastliny môžu používať priamo na produkciu hybridného osiva alebo, alternatívne, sa môžu samoopeliť zachráneným pelom, aby sa získali homozygotné rastliny so samčou sterilitou. Alternatívne sa môžu homozygotné rastliny so samčou sterilitou získať samoooelením rastlinami so samčou sterilitou so životaschopným, ale sterilným pelom. postuo sa skladá z nasledujúcich krokov:
a/ kontaktovanie oiestika rastliny so samčou sterilitou s nelom z tej istej rastliny so samčou sterilitou v orítomnosti vhodnej flavonoidovej zlúčeniny a b/ klíčením pelu na piestiku a oplodnenie rastliny so samčou sterilitou a c/ tvorba semien v danej rastline.
Nezrelý pel sa môže nechat dozrieť v prítomnosti chalconov pred použitím pri samoopelení materskej rastliny so samčou sterilitou. Zvlášť Orednostnými flavonoidnými zlúčeninami používanými pri tomto soôsobe sú Kvercetín, kamferol a myricetín. Flavonoidová zlúčenina sa môže vhodne Dridat k obvyklému pelovému médiu, ako je BK-médium tak, aby sa výsledná koncebtrácia pohybovala v rozmedzí oc asi 10 nmol do 1C umol, prednostne od asi 100 nmol do 3 pmol. Cotimálna koncentrácia sa môže líšiť s chladom na použitú zlúčeninu a použitý druh, a dokonca zrejme s ohladom na mieru inhibície
- ?1 produkcie endogénnych flavoncidových zlúčenín' v danej rastline so samčou sterilitou. Avšak všeobecne sa vhodné flavonoidové koncentrácie môžu určil pre rôzne situácie bez náročnej experimentálnej práce. Je zrejmé, že vlastníctvo niekolkcý homozytných rastlín so samčou sterilitou nám umožní s výhodou rýchlo získat veíké množstvá heteroz.ygotného so samčou sterilitou, ktoré sa môže Driamo použil na produkciu hybridného osiva vo velkom meradle.
vynález sa môže aplikoval na akúkolvek rastlinu, schoonú samoopelenia, u ktorej je žiadúca produkcia hybridného osiva.
Truhým ^aspektom tohto* vynálezu je soosob získania homozygotných rastlín so samčou sterilitou samoopelením hetev rozygotných rastlín so samčou sterilitou spôsobom codla tohto vynálezu. Samoopelenie sa vykonáva pelom, ktorého vývin sa zachráni vzhladom na dočasnú prítomnost chalconu v nezrelých prašníkoch danej rastliny, čím sa prekoná inhibícia chalcon syntézy in vivo. Vynález zahŕňa tiež podávanie chalconu, aby sa kompenzoval vplyv inhibície expresie génu. Kompenzácia inhibície génovej expresie sa tiež môže vykonal trochu odlišným spôsosbom, a to umožnením /dočasným/ produkcie chalconov in vivo. Tento spôsob kompenzácie sa môže dosiahnúl zavedením reštauračného génu pod kontrolu .indukovatélného promotora do bunky s inhibičným génom, ľxnresia reoaračného génu sa tak môže riadil z vonkajška pridaním vhodného induktora. Taký reštauračný gén prednostne obsahuje napríklad fúzny gén, obsahujúci prinajmenšom časí delového génu, ktorá je schopná pri expresii inhiooval volyv expresie antimediátorového génu komplementárnou asociáciou s antimeôiátorovým transkriotom /vid pobert I.· S. a ďalší/199C/ Bio/Technology d 4597· * < G ~
Inoukovatelné obnovenie plodnosti, aké je Krátko uvedené vyššie, je tiež nutné u hybridných plodín, ktorých obchodná hodnota sDOčíva v semenách alebo Dlodoch. Je zrejmé, že samčia sterilita sa ootom musí Drerušit, aby sa umožnilo onelenie na poli a získali semená alebo plody. Obnovenie olodnosti sa môže vyvolať podávaním induktora plodine na doli, vedúcim k dostatočne vysokej expresii reštauračného génu, aby sa dosiahla neutralizácia antimediátorového transkriptu.
Vynález má tieto výhody:
V protiklade k mnohým predchádzajúcim spôsobom zísz kania rastlín so samčou sterilitou zakódovanou v jadre nezahŕňa tento spôsob nutne expresiu génov, ktoré kódujú nrodukty toxické Dre somatické bunky, ako sú DNA.ázy, PFAázy alebo nroteázy. Bosledkom je, že prísne vývojová alebo tkanivovo-ŠDecifická expresia nie je nutná, pokiaľ sa expresia odohráva v prašníkoch.
rastliny so samčou sterilitou podľa tohto vynálezu sú vysoko sterilné e vykazujú len sanáciu fertilitu.
Ďalej sa počas produkcie hybridného sosiva na ooli alebo v skleníku vo veľkom meradle môžu oddeliť rastliny so samčou fertilitou, t.j. nredDokladané samoooelovače, od rastlín, so samčou sterilitou, ktoré produkujú hybridné osivo. Sfarbenie orašníkov obidvoch rastlín je totiž rozdielne. Samoopelovače sa ootom môžu separovať alebo zničiť alebo, ak je to žiaduce, sa ich nehybridné osivo môže Dozberať oddelene .
Ďalšou výhodou spôssobov nocia tohto vynálezu je schopnosť získať homozygotné rastliny so samčou sterilitou. no poskytuje velké výhody Dri uchovávaní a propagácii heterozygotnej rodičovskej línie so samčou sterilitou. Je potrebné mat len niekolko homozygotných rastlín, ktoré sa vzhladom k svojmu obmedzenému počtu môžu propagovať in vitro technikami dobre známymi v danom obore. pomozygotná línia so samčou sterilitou sa krížovo oolodní rodičovskou líniou so samčou fertilitou a heterozygotné osivo so samčou sterilitou sa potom použije na vytvorenie hybridných plodín vo veíkom meradle na poli. Polovica z tohto hybridného osiva bude so samčou sterilitou a druhá so samčou fertilitou. V príoade, že tento pomer nie je dostatočný na získanie vysokého výťažku obchodného produktu /t.j. semien alebo-ovocia/ samooolodnením môže sa zvýšiť čiastočnou obnovou samčej sterility podaním induitora, aby sa aktivovala expresia reštauračného génu.
Príklady predvedenia vynálezu
V dalej uvedených príkladoch sa používajú nasledujúce metódy skúšania:
DNA - metodológia
Izolácia ’ΨΑ, klonovanie, reštrikčné analýzy a sekvenovanie sa vykonajú štandardnými postupmi, ktoré sú dobre známe odborníkom v obore, viô napríklad Yanitas T·, Pritsch E·F· a Sambrook J. /log?/ molekulové klonovanie: laboratórna príručka /Yolecular cloning: A Laboratory Yanual, oold Spring Harbor Laboratory/. Izolácia DNA z jednotlivých transformantov rodu Petunia e analýza DNA blotu sa vykonajú spôsobom popísaným v článku:Koes R. E, Spelt C.E., Mol J.N.M a
Gerats A.G.M. (1987), The chalcone synthase multigene family of Petunia hybrida (V30): Sequence homology, chromosomal localization and evolutionary aspects, Plánt Mol. Biol. 10, 375-385.
Extrakcia. 3-glukoronidázy /GT’S/ a jej fluorometrické a histochemické stanovenie.
Ka stanovenie GUS sa zhromaždí čerstvý materiál z transgénnych rastlín. GUS extrakcie sa vykonajú spôsobom, ktorý popi sali Jefferson R. A. , Kavanagh T. A a Bevan M.W.
(1987) Gus fusions: β-glucoronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants, EMBO J. 6, 3901-3907. -yento sposob zahŕňa rozomletie tkaniva s Oowexom-1 /výrobca Sigma/ v kvapalnom dusíku, luorometrické stanovenia aktivity GUS sa uskutočnia podlá Jeffersona a dalších /1987/, citácia uvedená vyššie v texte. Korekcia fluorescenčných meraní pre ochladený extrakt sa zistí meraním zvýšenia fluorescencie po prídavku známeho množstva 4-metylumbeliferylu. Koncentrácia bielkovín sa stanoví pomocou sady na stanovenie oroteínov od firmy uio Had s hovädzím sérovým albumínom ako štandardom.
Histochemická lokalizácia GUS aktivity sa vykoná oostupom, ktorý popísaliKoes R. E. van Blokland R.,
Quattrocchio F., van Tunen A. J. a Mol J.N.M (1990).
Chalcone synthase promoters in petunia are active in pigmented and unpigmented celí types, Plánt Celí 2, 379-392.’ Fred farbením sa vyrežú žiletkou orašníky po dvoch. Aby sa eliminovalo pozadie GUS aktivity v orašníkoch, Doužije sa X-gluk farbiaci roztok s pH 8,0·
Histochemické stanovenie v prašníkoch transgénnych a netransformovaných rastlinách sa vykoná opakovane, aby sa vylúčili artefakty, ktoré môžu byt soôsobené rozdielnou velkostou buniek, oreniknutím substrátu do tkaniva a nozadím enzýmovej aktivity. Analýza na úrovni jednej bunky sa vykoná no fixácii a uväznení'’ tkanív, farbených X-gluk v oarafíne nodla Koesa a dalších /1990/, citácia uvedená vyššie v texte. Za ooužitia mikrotomu sa narežú 7^m hrubé rezy a tie sa fotogra25 fujú pod svetelným mikros 'kočom.
Stanovenie f lavór, o id o v
-o hydrolýze /20 minút ori tedote 1C0 0/ sa orašníky z desitich núčikov inkubujú lí hodín v 1 ml pw HCl. Flavonoidy sa extrahujú malým množstvom izoamylalkoholu a delia sa na celulózových TLO olatniach. Ako vyvíjajúca sústava sa používa zmes: kyselina octová : kyselina chlorovodíková : voda / 30 : 3 :10/·
Izolácia RNA a ochrana Dred účinkom HNAázy
Na izoláciu HNA, ktorú popísali Koes a ďalší /193$/ /citácia uvedená vyššie v texte/, sa ooužijú prašníky z 5 až 7 púčikov /s velkostcu 40 až 50 mm/. Endogénna O'.'S ms?iA sa stanovuje za súčasnej ochrany ored účinkom H.NAázy podlá van ’ľunena a ďalších
Pri stanovení sa /1988/ /citácia uvedená vyššie v texte/, použije ako próba OMS/A/ cpMA v celej veľkosti klonovaná v plazmide oTZlPP /Koes a ďalší 198$, citácia1 uvedená vyššie v texte/
Klíčenie oelu in vitro.
rastliny sa pestujú ori teolote 10 až 22 °C za štandardných skleníkových podmienok. Kel sa zoberie z kvetov vo fáze zrenia Drašníkov /anthesis/ e nechá sa vyklíčiť ne stuženom médiu, obsahujúcom 3 mM 1,7 mK Ca/NO^/2, 10% sacharózy, 0,7% agaru s pH 5,3· Pel sa inxubuje 2 hodiny nri teplote 24 °'J v tme a farbí sa 1% roztokom acetokarmínu, ako oopísali Bino R. J., Hille J. a Franken J. (1987)
Kanamycin resistance during in vitro development of polien from transgenic tomato plants, Plánt Celí Rep. 6, 333-336.
Príklady vynálezu
Príklad 1 ’-'onštrukcia chimérových GTTS-génov /gén nre $-glukoromidázu/
Chimérové GDS konštrukty sa vytvoria klonovaním GUS kódujúcej oblasti plazmidu pPA-' 275 /Jefferson aďalší 1987, citácia vyššie v texte/. Táto oblast, v podobe EcoR/HindlII fragmentu, doplneného pôsobením Klenowovej polymerázy sa klonuje na Smal mieste vírusu VIP122, ktorá obsahuje CHS/A/ chvost /tail/ /van der Keer a další 1990, citácia vyššie v texte/· Klonovaním vznikne kloň pTSlS, ktorý sa ligáciou spojí s plazmidom pTZlpp /výrobca Promega/ v podobe Sall/HindlII fragmentu, a tým sa získa kloň pTS19. Do pTS‘19, štepeného EcoRI a BamHI se vloží Ca MV 3 5S promótor z VIP10 2 (van der Krol A. R. Lenting P.J., Veenstra J. G. van der Meer I. M., Koes R. E., Gerats A. G. M, Mol J. N. M. a Stuitje A. R.
(1986) An antisense chalcone synthase gene in transgenic plants inhibits flower pigmentation. Náture 333, 866-869), štepený rovnakými reštrikčnými enzýmami, čím vznikne oTS23 /vid tiež obr. 2/· Oligonukleotidý
5'-GAGCTCTAGAGGTGACAGAAATCTGCAG-3' (SEQIDNO: 6) a 51-CTGCAGATTTCTGTCACCTCTAGAGCTC-3' (SEQIDNO: 7) sa nechajú spojiť dohromady, fosforylujú sa na 5'konci použitím T4 kinázy a klonujú sa v pT'S23, štepenom EcoRV. Tým sa získa pTS24. Orientácia vloženého anther boxu sa stanoví čiastočným štepením jedného z oboch reštrikčných miest, obklopujúcich antherbox. r-ia konci označené fragmenty sa podrobia sekvenovaniu v géle, všetky chimérové GTTS konštrukty sa vložia v podobe EcoRI/HindlII fragmentov do binárneho vektora Bin 1? /Bevan 1984, citácie vyššie v texte.
Príklad 2
Konštrukcia chimérových antikodóŕových ÍJVS génov
Rovnaký syntetický antherbox sa tiež klonuje na t
EcoRV mieste, v Oa^V promotore VIP1O2 > obsahujúcom uaW-antikodónový-UHS/A/-nos konštrukt /van der Krol a ďalší 1909 > citácia vyššie v texte/. Orientácia a počet klonovaných anther boxov sa určí spôsobom popísaným v príklade 1. Nasledujúce antikodónové UHS/A/ konstrukty sa zavedú do rastlín rodu Petunia: pTS2C /s jednoduchým antherboxonL_v normálnej orientácii/, pTS21 / s dvomi kópiami antherboxu v obrátenej orientácii/ a DTS22 / s ôsmimi kópiami antherboxu v normálnej orientácii/. Všetky chimérové antikodónové CHS/A/ konstrukty sa vložia v podobe EcoRl/HindJII fragmentov do binárneho vektora 3in 19 /Bevan 19c4, citácia vyššie v texte/.
r í k 1 a d 3 transformácia rastlín rodu Petunia
Binárne vektory, obsahujúce C-US konstrukty /pTS23, obsahujúce normálny jaMV 359 promótor; pTS24 obsahujúci hybridný AB-CaMV 355 promótor/ alebo antikodónové 'JFS/A/ konstrukty (pTS20; pTS21; pTS22) sa prevedú - z E. coli kmeňa. JM83 (Messing J. (1978) Recombinant DNA Technical Bulletin NIH Publication č. 79-99, 2, 43-48) do Agrobacterium tumefaciens kmeňa LBA 4404 (Hoekama A. a ďalší (1983), Náture 303, 179-180); Prevedenie sa vykoná trojrodičovským párovaním (triparental mating) (Rogers L.S. a ďalší (1986) Methods in Enzymology 118, 627-641) s použitím kmeňa, ktorý obsahuje plazmid pRK2013 (Ditta a dalši (1980), Proceeding of the National Academy of Sciences USA 12, 7347-7351).
Na transformáciu terčíkov listov retunia hybride sa noužijú
- exkonfugáty spôsobom, ktorý popísali Horsch a aalší /1985/, citácia vyššie v texte. Terčíky listov sa pripravia z horných listov mladých, nekvitnúcich rastlín. Pri transformačných pokusoch s GUS konštruktami sa použije Petunia hybrida odroda Afll5. Pre transformácie s antimediátorovými JSC-S/A/ konštruktami sa použijú rastliny rodu Petunia, VR hybrid, -o indukcii tvorby výhonkov a koreňov na médiu, obsahujúcom kanamycín, sa rastliny prenesú do pôdy a dajú sa do skleníka. Ako kontrolné slúžia rastliny regenerované /na médiu bez kanamycínu/ z listových terčíkov transformovaných materiálom z Agrobacteriu rium tumefaciens kmeňa IBA 4404, čo je kmeň bez binárneho vektora.
príklad 4
Analýza transgénnych rastlín, v ktorých sa exprimujú GUS konštrukty
Aby sa zistil vplyv antherboxu na reguláciu génovej exoresie, analyzujú sa trasngénne rastliny nesúce GUS konštrukty, pričom sa študujú soosoby uskutočnenia exoresie s použitím metód, popísaných v experimentálnej Časti.
Analyzuje sa asi 25 nezávislých transgénnych rastlín rodu Petunia, obsahujúcich AB/Sa/'V 35S-GUS konštrukt a 25 rastlín rodu Petunia, obsahujúcich kontrolný 'jafr’V-GUS konštrukt. Pretože úroveň expresie zavedeného génu sa môže líšit medzi jednotlivými transformantmi vzhladom k tzv. nozičnému efektu /Weising a další /1985/ Annu. Rev. Genet. 22, 241-277/ používa sa GUS aktivita exogénneho génu v korune kvetu ako vnútorný štandard pri meraní aktivity, nachádzajúci' sa v prasníkoch, pre každý jednotlivý transformant. Priemerný pomer týchto aktivít /Priemer sa počíta zo všetkých rastlín/ je vyšší pre rastliny s hybridným promótorovým konštruktom než pre rastliny s kontrolným promotorovým konštruktom. Všetky oddelené merania sa analyzujú ’ilcoxonovým radovým /rank/ testom, aby sa skontrolovala ich významnosť. ?'a hladine významnosti </< C,05 je GUS aktivita v Drašníkoch v Dorovnaní s aktivitou v korune kvetov významne vyššia v transf ormantoch, ktoré obsahujú AB/Ca'V 35S-promótorový GUS konštrukt, než v transformantoch, obsahujúcich kontrolný CaMV konštrukt. Prítomnosť anther boxu zvyšuje trikrát hodnotu GUS aktivity, riadenou uaMV konštruktom v prašníkoch, v porovnaní s korunou kvetu.
Aby sa stanovilo, či inzercia__sekvencie anther boxu do Ca”V promotoru zmení kvalitatívne jeho expresiu, histochemick sa sleduje GUS expresia, špecifická pre daný druh buniek /vid Experimentálnu časť/. Prašník rodu Petunia obsahuje v priereze /z vnútrajška k vonkajšku/ cievny valec obklopený parenchematickými bunkami spojovacieho tkaniva, štyri tobolky obsahujúce sporogénne tkanivo /pel/ a endothecium. Haždá tobolka je obklopená vrstvou špecifických zárodočných buniek /tapetum/. Tieto bunky zaisťujú výživu sDorogénnych buniek. V neskorších fázach vývoja Drašníkov tobolky v stomiu prasknú a pelové zrná sa uvolnia.
Priečne rezy Drašníkov mnohých nezávislých CalV-GUS transformantov sa inkubujú s GUS substrátom x-gluk. Fo inkubácii vykazujú intenzívnu modrú farbu, ktorá znamená prítomnosť GUS aktivity, v takmer všetkých typoch buniek v orašníkoch. uaMV promotor riadi GUS aktivitu v cievnom valci, spojovacom tkanive a endítheciu, ale v zárodočných /tapetum/ bunkách sa žiadna GUS aktivita nepozoruje. Modré sfarbenie sa nepozoruje v prašníkoch netransformovaných kontrolných rastlín pri pH 8, G. Ak sa pH farbiaceho pufra zníži na hodnotu ~,G, môže sa v netransformovanom Drašníkovom tkanive objaviť sfarbenie pozadia, a preto sa všetky farbiace experimenty vykonávajú dtí pH 8,C. Skúška ^aj.’V-GUS transformovaných prašníkov na jednobunkovej úrovni ukazuje, že v (js?/:V-GTTS transformovaných prašníkoch je modrá zrazenina vo všetkých typoch buniek okrem tapeta. Histochemická analýza mnohých nezávislých transformantov, v ktorých sa exprimujú GUS gény, pričom táto expresia je riadená AB/CaMV 35S promótorom, ukazuje, že existuje mierny rozdiel v GUS farbení týchto transformantov v Dorovnaní s farbením normálnych CaMV-GUS transformantov /neriadených AB/Cavv 35S promótorom/. Okrem normálneho (jaMV-GUS-sfarbenia sa objaví svetlo modré sfarbenie v tapetum bunkách, ľ.'odrá zrazenina v tapetum bunkách je dokonca zreteľnejšia pri skúške na jednobunkovej, úrovni. Fluorometrické i histochemické GUS stanovenie ukazuje, že existuje zretelný vplyv inzercie anther boxu do CaMV promótora nielen na úrovni GUS expresie, ale tiež na úrovni špecifickosti typu buniek, v ktorých je GUS expresia riadená týmto hybridným promótorom.
príklad p
Analýza transgénnych rastlín, v ktorých sa exurimujú antimediátorové - OHS /A/ konštrukty íjelkom sa získa 35 nezávislých transformantov /VB hybridov/ rodu Petunia, z ktorých 5 rastlín má kvety s obmedzene sfarbenými prašníkmi. Neexistuje závislosť medzi inhibíciou sfarbenia koruny kvetu a inhibíciou sfarbenia úradníkov. Nájdu sa všetky kombinácie sfarbených alebo nesfarbených Drašníkov s normálne sfarbenými korunami kvetu alebo korunami kvetu s obmedzeným sfarbením. Biele prašníky sa môžu získať po transformácii ktorýmkoľvek z troch konštruktov /t.j pTS20, 0TS21, PTS22/· Inhibícia sfarbenia úradníkov ureto nravdepodobne nezávisí od množstva kópií a orientácie vloženého anther boxu. Transformáciou VP hybridu rodu Petunia konštruktom pTS20 /jedna kópia anther boxu v normálnej
- 31 orientácii/ sa získa 11 nezávislých transgénnych rastlín, z ktorých 5 má normálny fenotyo, äalších 5 má obmedzene sfarbenú korunu kvetu e jedna rastlina má sfarbenú korunu a biele prašníky. Transformáciou konštruktom pTS21 /2 kópie anther boxu v obrátenej orientácii/ sa získa 15 nezávislých transformantov, .z ktorých 9 má normálny fenotyn; 5 rastlín má kvety s obmedzeným sfarbením koruny a dve z týchto rastlín majú biele Drašníky; jedna transformovaná rastlina má kvety sfarbené ako rastliny s divým fenotypom, ale má biele prašníky. Z deviatich nezávislých transformantov, ktoré obsahujú konštrukt pTS22 /3 kópií anther boxu v“normálnej orientácii/ má 7 rastlín fenotyp divého typu, jedna rastlina má kvety s obmedzeným sfarbením koruny a jedna rastlina nesie kvety s normálne sfarbenými korunami a bielymi prašníkmi.
Aby sa zistilo, či redukcia sfr'oenia Drašníkov vzniká redukciou na úrovni transkripcie CHS géno na m^NA v orašníkoch, izolujú sa všetky RMA z bielych a z červeno sfarbených Drašníkov. izolovaná sa analyzuje spôsobom s chránením pred účinkom HNAázy. rri tomto chránenom experimente, ..70 , . > , v ktorom sa použije JI_‘D-značena antikodonova V30—RNA ako oróba, sa endogénne VR CFS transkriDty štiepia na Štyri subfragmenty. Ukazuje sa, že inhibícia sfarbenia Drašníkov je SDrevádzaná špecifickou redukciou na úrovni oreDisu génov v ustálenom stave do mPT’A v DraŠníkoch.
Pri samokrížení transgénnych rastlín, uskutočňovanom kvôli väzobnej /linkage/ analýze, sa Drekvapivo vysvet-, lilo, že biely pel je sterilný. Transformanty s nesfarbenými prašníkmi nemôžu po samoopelení tvorit zrelé, zdravo vyzerajúce semená. Semená sa tvoria len velmi zriedka a keď, tak neklíčia.
Aby sa určilo, v ktorom štádiu vývoja orašníkov /a
- 32 Delu/ začínajú biele pelové zrná degenerovať, skúmajú sa cod mikroskopom oriečne rezy bielych prašníkov a celu v rôznych vývojových štádiách. Vývoj bielych orašníkov sa velmi nelíši od normálneho vývoja orašníkov rodu retunia. Avšak u Delových zŕn sa ukazuje zastavenie vývoja po utvorení tetrády, t. j. v ranom mikrospcrovom štádiu. Pri klíčení Delu z bielych prašníkov in vitro sa netvoria žiadne pelové vlákna.
Toto rané štádium vývoja pelu sa časovo zhoduje s počiatkom expresie génov pre syntézu flavonoidov. To ukazuje na pravdepodobnú funkciu flavonoidov pre. vývoji Delu v ranom dvoj jadrovom štádiu. Z toho sa môže vyvodiť, že obrova vývoja pelu, napr. indukciou syntézy reštauračného génu by mala v
začat asi v tomto štádiu.
T'ransformanty s bielymi orašníkmi so samčou sterilitou sa ODelia odrodou V3C rodu retunia, aby sa získala F1 generácia. Rastliny so samčou sterilitou sa vyznačujú úolnou samičou fertilitou.
Analýza potomstva primárnych transformantov ukazuje, že zavedené znaky sú stabilné a Dotomstvo môže predvídatelne ich dediť. Sterilný transformant rodu Retunia s bielym Delom sa kríži s rastlinou Retunia hybrida /730/ e rastliny z PI generácie sa analyzujú na prítomnosť fenctypového Drejavu biely pel i na prítomnosť inzertu v Southern blote. DNA sa extrahuje z listov niekoľkých rastlín ~1 generácie. Analýza Southern blot ukazuje úplnú ko-segregáciu antimediátorového fenotypu s jedným inzertom.
Príklad c
Samooplodnenie rastlín so samčou sterilitou
Tterilný pel rastlín rodu petunia sa odoberie z rastlín, v ktorých sa mierne exprimujú antimediátorové chs gény. Pel sa použije na samooplodnenie v snojení s flavonolmi kvercetínom, kamferolom alebo myricetínom. P.astliny sa vyberú podlá prítomnosti malého množstva /menej než 1 $/ životaschopného nezrelého pelu; tento pel sa môže nechal dozrieť in vitro. Sterilný pel sa zanesie do normálneho Delového média /BK-médium: 1QO mg/1 H-^BOy 300 mg/1 CawO^, 2C0mg/l MgSC^, 100 mg/1 KNO^, 12,5 % sacharózy, v sterilnej vode/, obohateného kvercetínom, myricetínom alebo kamferolom tak, aby sa výsledná koncentrácia týchto látok pohybovala v rozmedzí od asi 100 nmol do 3 gmol. ľ.'.édium s Delovými zrnami sa Dotom díoetuje na piestiky materských rastlín eo samčou sterilitou.
Flavonoidové zlúčeniny sú účinné v rozmedzí koncentrácií uvedenom vyššie v texte; optimálna koncentrácia sa nemôže uviesť, pretože sa velmi líši v závislosti od jednotlivej použitej rastliny so samčou sterilitou. To sa Dravdepodobne dá vysvetliť skutočnosťou, že niektoré rastliny s antimediátorovými chs génmi napriek tomu tvoria malé množstvo chalkon syntetázy, ktorá zrejme ovplyvňuje koncentrácie flavonoidových zlúčenín v reprodukčných orgánoch.
Po oplodnení nastane tvorba semien. Semená sa Dotom pozberajú. Semená klíčia normálne a získajú sa z nich úplne rozvinuté rastliny.
Pri pokuse o samooplodnenie týchto rastlín sa zistí, že sú stále so samčou sterilitou. Tieto rastliny sa môžu Doužiť·ako homozygotné materské rastliny nri krížení s donorovými rastlinami so samčou fertilitou, aby sa rýchlo získali veľké množstvá heterozygotných rastlín so samčou fertilitou nre produkciu hybridného osiva.
Pretože sa predpokladá že zlúčeniny, neužité na prekonanie sterility celu sú flavcnoly, vyskytujúce sa v mnohých rastlinách, môžu sa oocla tohto vynálezu na indukciu zrenia pelu z rastlín so samčou sterilitou použiť tiež napríklad extrakty z oiestikov, korunného tkaniva a pravdepodobne tiež zo zrelého pelu /ktorý sa inaktivuje ožiarením/.
Zoznam sekvencií /1/ Všeobecné informácie /i/ Prihlasovateí:
/A/ Meno: MOGEN Internationl N.V /B/ Ulica: Einsteinweg 97 /0/ Mesto: LEIDEN /E/ Štát: Holandsko /F/ Poštové smerovacie číslo /ZTP/: NI-2333OB /G/ Telefón: 071-258282 /H/ Telefax: 071-221471 /ii/ Názov vynálezu: Rastliny vykazujúce samčiu sterilitu, spôsob ich získavania a rekom'oinačná DNA na použitie pri tomto spôsobe /iii/ Počet sekvencií: 7 /iv/ Strojovo čitatelná forma:
/A/ stredný typ: diskety /3/ počítač: IBM PC kompatibilný /0/ operačný systém: PO-DOS/MS-DOS /D/ software: Patentln Release č. 1.0, verzia 1,25 /EPO/ /v/ Údaje o súčasnej prihláške:.
'/2/ Informácie o SEQ ΙΟ NO: 1:
/i/ Charakteristika sekvencie:
/A/ Dĺžka 16 párov báz /B/ Typ: nukleová kyselina /0/ P.etazcovost: dvojreíazcová /D/ Topológia: lineárna /
/ii/ Typ molekuly: DNA /genómová/ /iii/ Hypotetická: nie /iv/ pozitívny retazec: nie — /vi/ pôvodný zdroj:
/A/ Organizmus: Petunia hybrida /D/ iné iformácie: značka = EcoRl /xi/ popis sekvencie: SEQ ID N0:l
TNGAGGWGAM RDARWW /2/ Informácie o SEQ ID NO: 2:
/i/ Charakteristika sekvencie:
/A/ Dĺžka 16 párov báz /B/ Typ: nukleová kyselina /0/ Retazcovosí: dvojrelazcová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly: DNA /genómová/ /iii/ Hypotetická: áno /iv/ pozitívny reíazec: nie /vi/ pôvodný zdroj:
/A/ Organizmus: Petunia hybrida /xi/ Popis sekvencie: SEQ ID NO:2
TAGAGC-TGAC AGAAAT
- 36 /2/ Informácie o SEQ ID NO: 3:
/i/ Charakteristika sekvencie:
/A/ Dĺžke 16 oárov báz /B/ Typ: nukleová kyselina /C/ Reťazcovosť: dvojreťazcová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly; DNA /genómová/ /iii/ Hypotetická: nie /iv/ Pozitívny reťazec: nie — /vi/ pôvodný zdroj:
/A/ Organizmus: Petunia hybrida /xi/ Popis sekvencie: SPQ ID NO· 3
TAGAGGTGACAAAAT /2/ Informácie o SEQ ID NO: 4:
/i/ Charakteristika sekvencie:
/A/ Dĺžka: 16 párov báz /E/ Typ: nukleová kyseline /0/ Reťazcovosť; dvojretazcová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly: DNA /genómová/ /iii/ Hypotetická; áno /iv/ Pozitívny reťazec: nie /vi/ pôvodný zdroj:
/A/ Organizmus: Petunia hybride /xi/ popis sekvencie: SEQ ID NO· 4
TNGAGGAGAA AAAGAT /2/ Informácie o SEQ ID NO: 5:
- 37 /i/ Charakteristika sekvencie:
/A/ Bižka; 16 párov báz /B/ Typ: nukleová kyselina /C/ Peťazcovosť; dvojreťazcová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly: DNA /genómová/ /iii/ Hypotetická: áno /iv/ Pozitívny reťazec: nie /vi/ pôvodný zdroj:
/A/ Organizmus: Petunia—hybrida /xi/ Popis sekvencie: SEQ ID MC· 5
TAGAGGAGAA C-TA AT A /2/ Informácie o SEQ ID NO: 6:
/i/ Charakteristika sekvencie:
/A/ DÍžka: 28 párov báz /B/ Typ: nukleová kyselina /C/ Peťazcovosí: dvojreťazcová /D/ ^ooológia: lineárna /ii/ Typ molekuly: DNA /genómová/ /iii/ Hypotetická: áno /iv/ pozitívny reťazec: nie /xi/ Popis sekvencie: SEQ ID NO· 6
GAGCTCTAGA GGTGACAGAA ATCTGCAG /2/ Informácie o SEQ ID NC: 7:
/i/ charakteristika sekvencie:
/A/ Dĺžka: 28 oárov báz
- 3?
/3/ Typ: nukleová kyselina /0/ P.eí azcovosť; dvo jretazcová /D/ Topológia: lineárna /ii/ Typ molekuly: DNA /genómová/ /iii/ Hypotetická: áno /iv/ pozitívny reťazec: nie /xi/ Popis sekvencie; SEQ ID NO· 7
GAGCTCTAGA GGTGACAGAA ATCTGCAG
P y Ή·/'#- Ϋ3

Claims (17)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Rekombinačný pclynuklectid, ktorý je ooužitelný na získanie rastliny so samčou sterilitou v podstate obsahujúci a/ inhibičný gén schopný inhiooval exoresiu delového génu, prítomného v danej rastline a kódujúceho enzým z metabolickej dráhy pre biosyntézu chalkonov, a b/ promotor, ktorý je aktívny v prašníkoch danej rastliny operabilne spojený s inhibičným génom tak, aby sa dosiahla expresia tohto génu v prašníkoch danej rastliny.
  2. 2· Rekombinačný nukleotid podlá nároku 1, v ktorom cielový gén kóduje enzým vybratý zo skupiny, skladajúcej sa z cinamát 4-hyaroxylázy /C4H; E.C· 1.14.13«11/, 4-kumaroylCoA ligázy /4 CL; Ε·Τ· 6·2·1·12/ a chalcon syntetázy /CHS;
    E.C.2.3-1.74·/·
  3. 3. Rekombinačný polynukleotid oodla nároku 1 alebo
    2, v ktorom inhibičný gén je antimediátorový gén.
  4. 4. Rekombinačný polynukleotid podlá nároku 3» v ktorom promótor, ktorý je aktívny v prašníkoch rastliny, obsahuje fragment vysoko účinného promotora a.anther box /prašníkový box/, ktorý sa môže získal z promotorovej oblasti skupiny génov, skladajúcich sa z génov chs-A, chi-B, chs-J a dfrA·
    Rekombinačný polynukleotid podlá ktoréhokoívek z nárokov 1 až 4, v ktorom vysoko účinný promótor obsahuje fragment Ca^V 35S promótora a anther box /orašníkový box/ so sekvenciou;
    - 4C
    TAGAGGTGACAGAAAT vložený do uvedeného fragmentu na pozícii -90 vzhladom k štartovaciemu miestu transkripcie.
    C. Spôsob získania rastliny so samčou sterilitou, vyznačujúci sa tým, že sa skladá z nasledujúcich krokov:
    a/ prenesenie rekombinačného polynukleotidu podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5 do buniek rastliny so samčou fertilitou, b/ vytvorenie celých nových rastlín z buniek s inkorporovaným rekombinačným polynukleotidom, a c/ selekcia rastliny so samčou sterilitou.
  5. 7. Rekombinačný rastlinný génom, v ktorom je inkorporovaný rekombinačný Dolynukleotid podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.
  6. 8. Rastlina so samčou sterilitou, obsahujúca rekombinačný rastlinný genóm podlá nároku 7·
  7. 9· Bunka, plod, semeno alebo ootomok rastliny, ktoré sa môžu získať z rastliny so samčou sterilitou podlá nároku 8·
  8. 10. Spôsob získavania samooplodnených semien rastliny so samčou sterilitou podie nároku S, vyznačujúci sa t ý m, že sa skladá z nasledujúcich krokov:
    a/ kontaktovanie piestika rastliny so samčou sterilitou s peíom tej istej rastliny so samčou sterilitou v orítomnosti vhodnej flavonoidovej zlúčeniny b/ klíčenie pelu na oiestiku a oplodnenie rastliny so samčou sterilitou, a
    - 41 c/ vytvorenie semien v tejto rastline.
  9. 11. Spôsob podlá nároku 10, vyznačujúci sa t ý m, že pel sa suspenduje vo vhodnom Delovom médiu, ktoré obsahuje flavonoidovú zlúčeninu vybratú zo skUDiny, skladajúcej sa z myricetínu, kvercetínu a kainferolu, Dričom koncentrácia tejto zlúčeniny v médiu pred kontaktovaním piestika rastliny so samčou sterilitou s pelom sa pohybuje v rozmedzí od 100 nmol do 3 jimol.
    ,
  10. 12-Spôsob podlá nároku 11, vyznačujúci i sa t ý m, že pelové médium má nasledujúce zloženie:
    0 100 mg/1 , 300 mg/1 CatfO^, 20C mg/1 MgSC^, 100 mg/1 , 12,5 # sacharózy v sterilnej vode.
  11. 13. Samooolodnením získané semená získatelné snosobom popísaným v ktjromkolvek z nárokov 10 až 12·
    1Δ. Homozygotná rastlina so samčou sterilitou získatelná zo semien podlá nároku 13.
  12. 15· Bunka, plod, semená alebo ootomok rastliny, získateínej z rastliny so samčou sterilitou Dodla nároku 8.
  13. 16· Spôsob produkcie heterozygotných rastlín so samčou sterilitou, vyznačujúci sa tým, že sa ododnia homozygotné rastliny so samčou sterilitou Dodla nároku 14 rastlinou so samčou fertilitou, pozberajú sa semená a vypestujú sa heterozygotné rastliny so samčou sterilitou z uvedených semien.
  14. 17· Spôsob získavania hybridného osiva, v y z nečujúci sa t ý m, že zahŕňa kríženie rastliny so samčou sterilitou podlá nároku S alebo 14 s rastlinou so samčou fertilitou a zber hybridných semien.
    · -ybridné osivo získané srosobom podlá nároku 17 lc. Anther box /prašníkový box/ získatelný z oromotorovej oblasti génu, vybratého zo skupiny, skladajúcej sa z génov chs-A, chi-8, chs-J a dfrA, na použitie pri spôsobe získavania rastliny so samčou sterilitou.
  15. 20· Cligonukleotid obsahujúci sekvenciu
    TNGAGGWGAMRDARW /SEQIDNO: 1/, v ktorej n = A, C-, C alebo T; W = A alebo T; M = A alebo C; R = A alebo G a D = A, G, alebo T, na použitie pri spôsobe získavania-rastliny so samčou sterilitou.
  16. 21. Cligonukleotid obsa'hujúci sekvenciu vybratú zo skuoiny skladajúcej sa z:
    (a) (b) (C) (d)
    TAGAGGTGACAGAAAT (SEQIDNO: 2) TAGAGGTGACAAAAAT (SEQIDNO: 3)
    TNGAGGTGACAAAGAT (SEQIDNO: 4)
    TAGAGGAGAAGTAATA (SEQIDNO: 5) kde N = A, G, O, alebo T, na použitie pri spôsobe získavania rastliny so samčou sterilitou.
  17. 22· Plazmid vybratý zo skupiny, skladajúcej sa z plazmidov pTS20, pTS21 a pTS22·
    PViW -K
SK1116-93A 1991-04-16 1992-04-15 Male-sterile plants, methods for obtaining male-sterile plants and recombinant dna for use therein SK111693A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP91200910 1991-04-16
PCT/NL1992/000075 WO1992018625A1 (en) 1991-04-16 1992-04-15 Male-sterile plants, method for obtaining male-sterile plants and recombinant dna for use therein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK111693A3 true SK111693A3 (en) 1994-02-02

Family

ID=8207615

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1116-93A SK111693A3 (en) 1991-04-16 1992-04-15 Male-sterile plants, methods for obtaining male-sterile plants and recombinant dna for use therein

Country Status (15)

Country Link
US (1) US6005167A (sk)
EP (1) EP0513884A1 (sk)
JP (1) JPH06506595A (sk)
AU (1) AU663871B2 (sk)
BR (1) BR9205894A (sk)
CA (1) CA2105592A1 (sk)
CZ (1) CZ214593A3 (sk)
HU (1) HU219543B (sk)
IE (1) IE921206A1 (sk)
IL (1) IL101592A (sk)
RU (1) RU2170255C2 (sk)
SK (1) SK111693A3 (sk)
TR (1) TR27026A (sk)
UA (1) UA39169C2 (sk)
WO (1) WO1992018625A1 (sk)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5432068A (en) * 1990-06-12 1995-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Control of male fertility using externally inducible promoter sequences
US6297426B1 (en) 1990-06-12 2001-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of mediating female fertility in plants
US5824524A (en) * 1990-06-12 1998-10-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating fertility and method of using same
US5478369A (en) * 1990-06-12 1995-12-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
BR9306047A (pt) * 1992-03-09 1997-11-18 Univ Washington Métodos para a regulagem de fertilidade de planta
CA2146113A1 (en) * 1992-10-15 1994-10-15 Adrianus Johannes Van Tunen Genetic moderation of restoration or plant phenotypes
CA2161515A1 (en) * 1993-05-03 1994-11-10 Willem Johannes Stiekema Method for obtaining male-sterile plants
EP0701619A1 (en) * 1993-06-08 1996-03-20 Nunhems Zaden Bv Process for generating male sterile plants
EP0628635A1 (en) * 1993-06-08 1994-12-14 Nunhems Zaden Bv Process for generating male sterile plants
US5837850A (en) * 1994-04-21 1998-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Regulatory element conferring tapetum specificity
DE4440200A1 (de) * 1994-11-10 1996-05-15 Bayer Ag DNA-Sequenzen und ihre Verwendung
US5633438A (en) * 1994-11-22 1997-05-27 Pioneer Hi-Bred International Microspore-specific regulatory element
EP0776973A1 (en) * 1995-12-08 1997-06-04 Centrum Voor Plantenveredelings- En Reproduktieonderzoek Fatty aldehyde decarbonylase for transforming bacterial cells and plants
US5919919A (en) * 1996-02-06 1999-07-06 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By Agriculture And Agri-Food Canada Brassica sp. gene promoter highly expressed during tapetum development
US6077991A (en) 1996-03-28 2000-06-20 Washington State University Research Foundation Compositions and methods for production of male-sterile plants
US5850020A (en) * 1996-09-11 1998-12-15 Genesis Research & Development Corporation, Ltd. Materials and method for the modification of plant lignin content
US6410718B1 (en) 1996-09-11 2002-06-25 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Materials and methods for the modification of plant lignin content
US7087426B2 (en) 1996-09-11 2006-08-08 Agrigenesis Biosciences Ltd. Materials and methods for the modification of plant lignin content
US6204434B1 (en) 1996-09-11 2001-03-20 Genesis Research & Development Corporation Limited Materials and methods for the modification of plant lignin content
US7154024B2 (en) 1997-06-23 2006-12-26 Pioneer Hi-Bred, Inc. Male tissue-preferred regulatory sequences of Ms45 gene and method of using same
US6037523A (en) * 1997-06-23 2000-03-14 Pioneer Hi-Bred International Male tissue-preferred regulatory region and method of using same
HUP0002477A3 (en) 1997-08-27 2002-09-30 Pioneer Hi Bred Int Genes encoding enzymes for lignin biosynthesis and uses thereof
GB9719359D0 (en) * 1997-09-11 1997-11-12 Nickerson Biocem Ltd The Use of DNA Sequences
FR2768745B1 (fr) * 1997-09-23 2001-10-05 Agronomique Inst Nat Rech Promoteur specifique des microspores et procede d'obtention de plantes hybrides
ZA9811228B (en) * 1997-12-12 1999-06-14 Mogen Int New constitutive plant promoters
KR20010042069A (ko) 1998-03-20 2001-05-25 베니텍 오스트레일리아 리미티드 유전자 발현 조절방법
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
US7303917B2 (en) 1998-03-20 2007-12-04 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Eastern Cereal & Oilseed, Research Center Modification of pollen coat protein composition
US8598332B1 (en) 1998-04-08 2013-12-03 Bayer Cropscience N.V. Methods and means for obtaining modified phenotypes
US20040214330A1 (en) 1999-04-07 2004-10-28 Waterhouse Peter Michael Methods and means for obtaining modified phenotypes
WO1999053050A1 (en) 1998-04-08 1999-10-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
ATE358731T1 (de) 1998-10-09 2007-04-15 Arborgen Llc Polypeptide mit 4-cumarate:coa ligase-aktivität und deren verwendungen.
AU5640200A (en) * 1999-06-29 2001-01-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Gene affecting male fertility in plants
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
CA2391991A1 (en) * 1999-11-19 2001-05-31 National Institute Of Agrobiological Sciences Method for lowering pollen fertility by using pollen-specific zinc finger transcriptional factor genes
AU782697B2 (en) 1999-12-16 2005-08-18 Monsanto Technology Llc DNA constructs for expression of heterologous polypeptides in plants
JP4621361B2 (ja) * 2000-01-13 2011-01-26 独立行政法人理化学研究所 ネオザンチン開裂酵素遺伝子を用いるトランスジェニック植物
US7105718B2 (en) 2000-03-31 2006-09-12 The Regents Of The University Of Colorado Compositions and methods for regulating metabolism in plants
US6956118B2 (en) * 2001-02-08 2005-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Promoter sequences providing male tissue-preferred expression in plants
US7230168B2 (en) 2001-12-20 2007-06-12 The Curators Of The University Of Missouri Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase
DE10212892A1 (de) 2002-03-20 2003-10-09 Basf Plant Science Gmbh Konstrukte und Verfahren zur Regulation der Genexpression
GB0213749D0 (en) * 2002-06-14 2002-07-24 Tozer Seeds Ltd Method of producing hybrid seeds and plants
WO2005001101A1 (en) 2003-06-03 2005-01-06 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Conditional sterility in plants
US7491811B2 (en) * 2004-01-15 2009-02-17 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Repressor-mediated tissue-specific gene expression in plants
US7604968B2 (en) * 2004-03-01 2009-10-20 Regents Of The University Of Minnesota Microorganisms for the recombinant production of resveratrol and other flavonoids
WO2007039454A1 (en) 2005-09-20 2007-04-12 Basf Plant Science Gmbh Methods for controlling gene expression using ta-siran
WO2008013450A1 (en) * 2006-07-24 2008-01-31 Plant Research International B.V. A two-component system for seedless fruit development
ITMI20071291A1 (it) * 2007-06-28 2008-12-29 Univ Degli Studi Milano Sistema di contenimento transgenico attraverso l'inibizione recuperabile della germinazione in semi transgenici.
US8450090B2 (en) 2009-10-06 2013-05-28 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for promoting fatty acid production in plants
WO2013138309A1 (en) * 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
US9783814B2 (en) 2012-03-13 2017-10-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
CA2867377A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
WO2013138354A1 (en) 2012-03-13 2013-09-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic reduction of male fertility in plants
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
EP2781151A1 (en) * 2013-03-18 2014-09-24 Bayer CropScience AG Methods of separating hybrid seed from a mixture of seeds
CN110301349B (zh) * 2019-08-12 2021-09-14 浙江省农业科学院 一种绿色宝塔花椰菜杂交种的选育方法
CN112251459B (zh) * 2020-08-27 2023-01-20 云南大学 一种制备和鉴定雄性配子体不育的方法
CN115428730B (zh) * 2022-09-30 2023-12-19 南京农业大学 一种利用山奈酚提高果树自花结实率的方法
CN117247967B (zh) * 2023-11-10 2024-02-20 北京首佳利华科技有限公司 雄性不育基因ZmPKSA及其在创制玉米雄性不育系中的应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710511A (en) * 1971-04-21 1973-01-16 Univ Illinois Procedures for use of genic male sterility in production of commercial hybrid maize
GB8901677D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Hybrid seed production
NZ227835A (en) * 1988-02-03 1992-09-25 Paladin Hybrids Inc Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
NL8800756A (nl) * 1988-03-25 1989-10-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Genetisch gemanipuleerde plantecellen en planten, alsmede daarvoor bruikbaar recombinant dna.
GB8810120D0 (en) * 1988-04-28 1988-06-02 Plant Genetic Systems Nv Transgenic nuclear male sterile plants
GB8901675D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Inhibitor of gene expression
EP0456706B1 (en) * 1989-02-02 2005-05-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular methods of hybrid seed production
US5034323A (en) * 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5231020A (en) * 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5432068A (en) * 1990-06-12 1995-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Control of male fertility using externally inducible promoter sequences

Also Published As

Publication number Publication date
CA2105592A1 (en) 1992-10-17
CZ214593A3 (en) 1994-07-13
HUT65482A (en) 1994-06-28
UA39169C2 (uk) 2001-06-15
HU219543B (hu) 2001-05-28
IE921206A1 (en) 1992-10-21
EP0513884A1 (en) 1992-11-19
IL101592A0 (en) 1992-12-30
AU663871B2 (en) 1995-10-26
JPH06506595A (ja) 1994-07-28
US6005167A (en) 1999-12-21
TR27026A (tr) 1994-10-10
WO1992018625A1 (en) 1992-10-29
HU9302930D0 (en) 1994-01-28
BR9205894A (pt) 1994-09-27
IL101592A (en) 1998-12-27
AU1698992A (en) 1992-11-17
RU2170255C2 (ru) 2001-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK111693A3 (en) Male-sterile plants, methods for obtaining male-sterile plants and recombinant dna for use therein
Fischer et al. Stilbene synthase gene expression causes changes in flower colour and male sterility in tobacco
US6265640B1 (en) Nucleotide sequences mediating fertility and method of using same
AU770893B2 (en) A method for inhibiting the expression of target genes in plants
EP1000164B1 (en) Induction of male sterility in plants by expression of high levels of streptavidin
AU2005203861B2 (en) Method of producing sterile plant, plant obtained by using the same and use thereof
Spena et al. Anther-specific expression of the rolB gene of Agrobacterium rhizogenes increases IAA content in anthers and alters anther development and whole flower growth
JPH02503988A (ja) 改変雄蕊細胞を有する植物
CA2223460C (en) Induction of male sterility in plants by expression of high levels of avidin
JPH06504910A (ja) コメ由来の雄ずい特異的プロモーター
CA2223454A1 (en) Molecular methods of hybrid seed production
JPH03504806A (ja) 変更された花、種又は胚芽をもつ植物
US6239327B1 (en) Seed specific polycomb group gene and methods of use for same
JPH06507065A (ja) アブラナ亜種のタペータムに特異的なプロモーター
JP2002504343A (ja) ハイブリッド種子の生産
AU674029B2 (en) Genetic moderation or restoration of plant phenotypes
JPH10509023A (ja) 雄性稔性を仲介するヌクレオチド配列およびその使用方法
AU3465597A (en) Process of producing transgenic plants in which flowering is inhibited, and dna sequences used in said process
JP2001057886A (ja) 遺伝子の発現量を増大させる新規ｄｎａ断片
CN103709240A (zh) 介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法
HU221518B (hu) Hímfertilitást közvetítő nukleotidszekvenciák és eljárások azok alkalmazására
MXPA97009731A (en) Induction of male sterility in plants through the expression of high levels of avid
MXPA00008850A (en) Glyphosate as a gametocide
CA2315900A1 (en) Apple mads-box protein, gene encoding said protein, antibody against said protein, method for detecting transcript of said gene or protein expressed therefrom and process for preparing transgenic plant containing said gene
CZ2000182A3 (cs) Vyvolání samčí sterility u rostlin silnou expresí avidinu