CN103709240A - 介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法，所述MYB转录因子包含：（a）具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有调控花粉发育功能的由（a）衍生的蛋白质；或（c）如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明介导植物生育力的核苷酸序列以及使用其的方法中ZmMYB103为首次分离自玉米品种B73的转录因子，并且通过与EAR序列连接能够造成玉米可育花粉数量大幅降低，获得完全雄性不育的植株；所产生的玉米雄性不育植株不仅能够缩短杂交育种的周期，而且省去了杂交制种过程中去雄的步骤，降低了机械去雄对玉米植株的机械损伤和产量影响，保证了杂交种质的纯度和产量。

Description

介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法

技术领域

本发明涉及一种介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法，特别是涉及一种花粉形成的基因和通过使用扰乱该基因表达的构建体来生产雄性不育植株的遗传方法。

背景技术

杂种优势是指F1杂交种的表现比产生F1的亲本的表现优秀。在作物植物中杂种优势通常在生产中显示为较大的植物、胁迫耐受性、疾病抗性、一致性和提高的产量，这些被统称为杂交种活力。

杂种优势在很多重要的作物品种中已被观察到并记载，杂交种的发展已被植物育种家们视为常规。但是，当植物中存在有效的和经济的授粉控制方法以保证异花授粉和防止自花授粉时，杂交种才能被用于上述植物。授粉控制机制包括机械的、化学的和遗传的方法。

如果植物已空间隔离雄性和雌性的花或者分离雄性和雌性植株，则可以适用杂交种植物生产的机械方法。例如，在玉米植株的顶端花序中具有生产花粉的雄花，雌花在沿着茎的叶轴部。玉米的异交是通过对母本机械去雄以防止自交来确保的。尽管目前去雄被用于植物的杂交种种子生产中，如玉米，但是依据母本去雄的实际去雄成本和产量损失，上述过程是劳动密集型的且是昂贵的。另外，大部分作物植物的功能性雄性和雌性器官均在同一朵花中，因此去雄不是一个简单的过程。尽管可以在散粉前用手除去花粉形成器官，但上述杂交种生产的方法是极端劳动密集型的和昂贵的。

生产杂交植物的化学方法包括使用化学药品杀死或阻止可育花粉的形成。这些化学药品被称为杀配子剂，被用于给予暂时的雄性不育。由于化学药品的费用和有效性、以及应用的持续时长和可靠性，使用杀配子剂进行的杂交植物的商业化生产是受限制的。杀配子剂的一个严重的局限性在于其具有植物毒性的影响，其严重程度取决于基因型。其它局限性包括这些化学药品对于延长花期中的作物不一定是有效的，因为生长的新花可能没有被影响。因此，需要重复应用上述化学药品。

目前大田作物的许多商业化杂交植物生产体系依赖于花粉控制的遗传方法。在该体系中，被作为雌株的植物不能产生花粉或不能散粉、或产生不能有效自交的花粉。不能自交的植物被称为“自不相容”（SI）。应用自不相容体系中的困难包括自不相容的母本的可用性和繁殖以及自不相容的稳定性。在许多情况下，自不相容可以化学的方法克服，或在阻碍花粉的生化机制被激活前用手给未成熟的芽授粉。可被失效的自不相容体系通常易受胁迫气候条件的损害，所述胁迫气候条件可以破坏或降低生化阻碍自交的有效性。

涉及细胞质或细胞核基因的遗传体系可被用于产生雄性不育。细胞质雄性不育（CMS）是目前在作物中应用最广泛的花粉控制机制。但是，CMS有一些缺陷，包括感病性增强、在某种条件下不育失效、与恢复基因（所述基因能够抑制细胞质的雄性不育效果并被整合入父本以在F1杂交种中恢复花粉育性）连锁的不良性状、不可靠的恢复等。发生上述问题的作物例如玉米、油菜和小麦。

遗传工程方法与自然体系相比具有许多优势。新的雄性不育植物的基因型破坏是可以完全避免的，且不育不与特殊细胞质连锁即使在细胞质雄性不育中，新的雄性不育植物一般与通过有性繁殖方式引起不育有关。

细胞核编码的雄性不育（NMS）是由细胞核基因组中的突变引起的。植物遗传工程技术的出现，使得允许使用NMS基因的发展战略是可行的。

因此，植物育种家们和种子生产商们需要一种通用的且持续的雄性不育体系。必须克服的缺陷包括引起雄性不育的基因分离、100%雄性不育后代的生产、完全的雌性可育的实现和在F1杂交种中花粉可育的后续恢复。所以需要确定在花粉形成和发育方法中涉及的基因，上述方法可通过扰乱基因或基因产物的表达或活性以防止花粉形成；或者为转基因雄性不育植物和/或种子的生产开发一种方法，并且收获上述植物和/或种子。

发明内容

本发明的目的是提供一种介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法，即新的来自玉米的MYB103转录因子，以获得新的雄性不育株系。

为实现上述目的，本发明提供了一种MYB转录因子，包括：

（a）具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有调控花粉发育功能的由（a）衍生的蛋白质；或

（c）如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

为实现上述目的，本发明还提供了一种MYB转录因子的编码基因，包括：

（a）编码所述MYB转录因子的核苷酸序列；或

（b）在严格条件下与（a）限定的核苷酸序列杂交且编码具有调控花粉发育功能的蛋白质的核苷酸序列；或

（c）如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

所述严格条件可为在6×SSC（柠檬酸钠）、0.5%SDS（十二烷基硫酸钠）溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜1次。

为实现上述目的，本发明还提供了一种表达盒，包含在有效连接的调控序列调控下的所述MYB转录因子的编码基因。

进一步地，所述表达盒还包含阻遏物基元，所述阻遏物基元连接于所述MYB转录因子的编码基因读码框的3’末端。

更进一步地，所述阻遏物基元为编码LXLXLX氨基酸序列的EAR阻遏物基元，所述L为亮氨酸，所述X为任意氨基酸。

优选地，所述LXLXLX氨基酸序列可以为LDLNLELRISPP或LDLDLELRLGFA。

在上述技术方案的基础上，所述调控序列可以为花药特异性启动子。

优选地，所述花药特异性启动子可以为Ta39或MAC2。

为实现上述目的，本发明还提供了一种包含所述MYB转录因子的编码基因或所述表达盒的重组载体。

为实现上述目的，本发明还提供了一种扰乱植物花粉发育的方法，包括通过抑制所述MYB转录因子的编码基因的活性扰乱花粉形成。

优选地，所述扰乱植物花粉发育的方法还包括利用所述表达盒来抑制所述活性。

可选地，所述扰乱植物花粉发育的方法还包括利用所述MYB转录因子的编码基因的反义序列来抑制所述活性。

为实现上述目的，本发明还提供了一种诱导植物雄性不育的方法，包括利用所述扰乱植物花粉发育的方法以产生雄性不育植物。

进一步地，诱导的所述雄性不育是可逆的。

为实现上述目的，本发明还提供了一种产生雄性不育植株的方法，包括用所述表达盒转化植物细胞以产生转基因植株。

在上述技术方案的基础上，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

进一步地，所述植物为豆类、农作物、谷类、天然牧草、果期植物或开花植物。

优选地，所述植物为大豆、小麦、大麦、玉米、烟草、水稻、油菜或向日葵。

为实现上述目的，本发明还提供了一种产生杂交种子的方法，包括：

以异花授粉并列种植来自雄性可育系的第一种子和来自按照所述方法产生的雄性不育系的第二种子；

用来自所述雄性可育系的花粉异花授粉于所述雄性不育系；

收获授粉后所述雄性不育系的种子。

本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组，是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组。

本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋白质或多肽。本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下。

本领域技术人员所熟知的，DNA典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于DNA在植物中复制产生了DNA的其它互补链。这样，本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将DNA的一条链转录为一条mRNA的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mRNA实际上是从DNA的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子（密码子是三个核苷酸，一次读三个可以产生特定氨基酸），其可作为开放阅读框（ORF）阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的DNA有相当功能的RNA和PNA（肽核酸）。

本发明中核酸分子或其片段在严格条件下与本发明MYB转录因子的编码基因杂交。任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明MYB转录因子的编码基因的存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交。本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结构，就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性，则称其中一个核酸分子是另一个核酸分子的“互补物”。本发明中，当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“完全互补性”。如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子为“最低程度互补”。类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的，只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针，仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定的双链结构。

本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠（SSC）处理，然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明所述严格条件可为在6×SSC、0.5%SDS溶液中，在65℃下与SEQ ID NO:1发生特异性杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜1次。

因此，具有调控花粉发育功能并在严格条件下与本发明序列1杂交的序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40%-50%同源，大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源。即序列同一性的范围分布在至少大约40%-50%、大约60%、65%或70%同源，甚至至少大约75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的序列同源性。

本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的杀虫活性特征的部分和/片段（包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失）、变体、突变体、取代物（有替代氨基酸的蛋白质）、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有调控花粉发育功能的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的调控花粉发育的生物活性的蛋白。

本发明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列（核苷酸或氨基酸）的一部分或其人工改造形式（例如适合植物表达的序列），包括临近片段和与全长分子相比内部和/或末端的缺失，前述序列的长度可存在变化，但长度足以确保（编码）蛋白质为MYB转录因子。在一些情况下（特别是植物中的表达），使用编码截短蛋白质的截短基因可能是有利的。优选的截短基因一般编码全长蛋白质的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。

由于遗传密码子的丰余性，多种不同的DNA序列可以编码相同的氨基酸序列。产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的DNA序列包括在本发明的范围内。所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响调控花粉发育功能的序列，亦包括保留调控花粉发育功能的片段。

本发明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为：小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。

保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸和组氨酸）、酸性氨基酸（如谷氨酸和天冬氨酸）、极性氨基酸（如谷氨酰胺、天冬酰胺）、疏水性氨基酸（如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸）、芳香氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸），以及小分子氨基酸（如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸）。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年纽约学术出版社（Academic Press）出版的《Protein》中进行了描述。最常见的互换有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thu/Ser，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly，以及它们相反的互换。

对于本领域的技术人员而言显而易见地，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定（如参见，Cunningham和Wells，1989，Science244：1081-1085）。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的调控花粉发育功能，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定（参见，如de Vos等，1992，Science255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol224:899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters309：59-64）。

因此，与序列2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本发明中。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于60%，优选的大于75%，更优选的大于80%，甚至更优选的大于90%，并且可以大于95%。也可以根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸和蛋白质。例如与本发明示例的序列有49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性和/或类似性。

本发明的核苷酸序列在花粉形成期于花药组织中表达。同时所述核苷酸序列不仅仅表达于花药中，也不仅仅在花粉发育期所述核苷酸序列比在所有植物细胞中活跃的基因更特异。本发明不包含在花粉发育期于花药中不表达的基因。

优选地，所述核苷酸序列在花粉发育期大部分表达于花药中，这种核苷酸序列可被认定为“花药特异性”。

本发明花药组织是指植物中雄性生殖器官的组织，它完全发育或局部发育，包括构成花药的所有结构，如表皮、药室内壁、胞间层和绒毡层。

本发明所述核苷酸序列编码的蛋白属于DNA结合转录因子的MYB家族。MYB基因是在植物中发现的最大的转录因子家族，拟南芥基因组中已知的大约有180个MYB基因。第一个MYB基因分离自阿扁白血病毒（avian leukaemiaviruses），且现已被描述为在小鼠、果蝇、盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）、酵母和真菌中。拟南芥基因组编码的5%以上被评估为转录因子。这可以对约1700个基因中有180（10.6%）属于MYB家族作出解释。玉米表达了80多个MYB基因，矮牵牛大约至少有40个，水稻有20余个以及在金鱼草、大麦、豌豆、高粱和小立碗藓中已有报道。在植物中发现的大多数MYB基因是R2R3型的，尽管已报道了一些例外情形。具有单一重复单元的基因在马铃薯和拟南芥中已被发现。

拟南芥中R2R3型MYB基因的功能特性研究表明该基因在不同器官（幼苗、幼嫩和成熟的叶片、茎生叶、茎、花芽、角果和根）中表达且对各种环境条件（不同的糖/氮状况、激素处理、病原体攻击、不同的光照状况和冷、旱胁迫）产生反应。植物MYB基因涉及许多功能，包括次生代谢的调控、细胞发育和信号转导。

一些MYB基因在响应植物激素、生物的和非生物的胁迫时表达。大多数功能已知的植物MYB基因涉及类苯基丙烷代谢的调控。

一些MYB基因已被提出涉及发育过程的调控，如发芽形态发生（AtMYB13）、侧生器官的生长和背腹性（PHANTASTICA）、胚发生（AtMYBR1&AtMYBR2）和花药发育（AtMYB103）。

花粉是开花植物中的单倍体雄配子体且携带胚珠受精所需的精子细胞。当花药成熟时这些微小的颗粒经过被称作开裂的过程在花药中发育并释放。

花粉的形成需要特异性基因在配子体和孢子体中暂时地和局部地表达。据估计在鸭跖草（Tradescantia paludosa）和玉米的成熟花粉中约存在20000mRNA转录产物。很可能在花粉形成的早期更多的转录产物已产生，这反映出该过程的复杂性质和对调控的需求。

多年来花粉形成的研究表明在大多数植物品种中具有显著的相似性。由于拟南芥的体型紧凑、生命周期短和小基因组已被全部测序，因此近几年将拟南芥作为研发的模式植物。

在被子植物中雄单倍体阶段的发育导致花粉（雄配子体）的产生。花粉在花药中发育，花药是一种由表皮、药室内壁、胞间层和绒毡层四层构成的结构。在药室内，毗邻绒毡层，存在发育成花粉的孢子生殖细胞。特异性基因在配子体（性母细胞）和孢子体（绒毡层）中暂时地和局部地表达是完整的花粉发育所需要的。成熟花粉粒由一个营养细胞和一个生殖细胞（二胞型）或一个营养细胞和两个精细胞（三胞型）构成，被内壁和外壁包围。大部分正常发育阶段已被确定。

孢子形成：孢子生殖细胞形成性母细胞，这些细胞经历两次减数分裂（减数分裂Ⅰ&Ⅱ）形成了包被β-1,3-葡聚糖（胼胝质）壁的单倍体小孢子的四分体。由于花粉素的沉积，花粉壁开始发育形成外壁。绒毡层细胞体积增大，出现了许多核糖体，内质网和高尔基体增殖且分泌小泡的数量增加。随着胼胝质壁降解，绒毡层达到最高分泌期且小配子体发育阶段随后发生。

在这个期间，游离的小孢子快速生长并伴随外壁层的进一步沉积。这与孢粉素合成和绒毡层分泌相一致。小孢子开始形成液泡，最初为许多小液泡，而后融合形成一单个大液泡。在这个阶段，外壁形成已完成，孢粉素合成已停止，内壁沉积和绒毡层内部降解已开始。

小孢子成熟：该阶段的特征是不对称的有丝分裂（有丝分裂Ⅰ），有丝分裂产生一个大营养细胞和一个较小的生殖细胞。所述营养细胞涉及下一步花粉发育和后期花粉管的形成。所述生殖细胞将经历另一个有丝分裂（有丝分裂Ⅱ）以产生两个精细胞。绒毡层破裂，释放胞质脂质体和与花粉有关的造油体以形成表层。所述表层涉及柱头上的相互作用，使得水合作用和小孢子成功萌发成为可能。

拟南芥和甘蓝型油菜共占产生三胞型成熟花粉的被子植物的30%，例如，在花粉开裂前生殖细胞分开。在70%产生二胞型花粉的被子植物中的生殖细胞经历一次有丝分裂，紧跟着在柱头面上萌发。尽管在花部形态、花粉大小以及区分各种属和科的花粉形状上有明显的不同，但是花粉发育的细胞学过程和时间范围是与被子植物相对一致的。花粉发育的保守性质表明涉及的过程和基因也可能是保守的。保守的花粉特异性基因已经存在示例。月见草（Oenotheraorganensis）中的P2基因与同时代表单子叶和双子叶的科内相似转录产物杂交。花粉特异性基因Bcpl和Bnml在十字花科内好像是保守的。

在非常幼嫩的花中花药原基是由未分化的分生组织细胞组成的。这些细胞形成一个孢子生殖细胞团，所述孢子生殖细胞团开始区分为绒毡层、胞间层、药室内壁和表皮。孢原细胞在花药中自我匹配并有丝分裂以产生绒毡层和性母细胞。

0.5mm芽长：性母细胞在0.5mm芽长经历减数分裂，在芽内所有花药室中同时发生。第二次有丝分裂产生分泌β-1,3-葡聚糖（胼胝质）壁的小孢子四分体。所述壁过早解体的突变体通常是雄性不育的，表明胼胝质沉积对于产生可育花粉是重要的。绒毡层细胞经历没有胞质分裂的有丝分裂，产生四倍体的双核细胞。

1.0mm芽长：在1.0mm，减数分裂完成，新的小孢子形成一个被胼胝质壁封闭的四分体。绒毡层细胞的大小和与内质网和高尔基体增殖有关的体积增大。液泡出现，小液泡发育且胞质脂质体也被观察到。绒毡层内壁与四分体壁和绒毡层失去它的切向壁有联系。

1.5mm芽长：在1.5mm芽中，纤维素的初生外壁在幼小孢子的质膜外发育。这为孢粉素的沉积提供了基质，孢粉素的前体在小孢子胞质中形成并在细胞外的质膜和胼胝质壁间分泌。这一过程起始外壁的形成，外壁给予了成熟花粉粒特有的雕文外观。胼胝质壁被β-1,3-葡聚糖（胼胝质）消化，从绒毡层分泌进入药室并释放小孢子。小孢子的液泡化起始于大量小液泡的出现。绒毡层分泌纤维素的且小的嗜锇颗粒。

2.0mm芽长：在2.0mm芽长时，单细胞的小孢子以在细胞质中形成一单个大液泡为特征。孢粉素沉积直至外壁形成完成。绒毡层的径向细胞壁消失并开始最后的退化。淀粉粒在绒毡层的质体中短暂地出现。

2.5mm芽长：在2.5mm芽中一次重要的不对称的有丝分裂发生，产生含有一个大营养细胞核一个较小的生殖细胞的二胞型小孢子。绒毡层细胞继续分泌营养物进入药室，但是细胞器显示出降解的特征。由于事实证明，减数分裂的性母细胞可从花药中移除并将继续在体外发育，因此许多重要的发育过程在这一阶段完成。

事实上，BnMYB103在0.5-2.0mm花芽长的强烈表达对于它在花粉发育早期调控基因表达具有暗示作用。在拟南芥和油菜中各种其它花药表达的基因已被鉴定。大部分所述基因的功能还未指明，这一过程中涉及的许多其它基因似乎在未来可被鉴定出来。但是，涉及减数分裂的基因、在花粉壁中发现的各种化合物的合成、绒毡层的功能以及相关过程在BnMYB103表达的期间都是需要的。该基因的调控表达将是必须的且转录调节因子（如BnMYB103）将发挥重要作用。

两个MYB基因间功能同源的最终测试将是通过转化BnMYB103恢复AtMYB103突变体。极有可能的，AtMYB103和BnMYB103在早期花粉发育的调控中享有一共同的功能，因为它们代表同源基因。

使用启动子::GUS构建体研究AtMYB103表达的结果表明该基因特异性地在发育的花中表达，该发育的花处于花粉母细胞分离和经历减数分裂以形成小孢子四分体阶段。在四分体阶段GUS活性是最高的，并且在小孢子的绒毡层和花药的胞间层中表达。GUS活性结果已经原位杂交实验得以验证。

AtMYB103在花药和花粉中重要过程的时候表达，表明该基因似乎涉及调控对于花粉发育所需的其它基因。

BnMYB103唯独在发育的花药中活跃。BnMYB103基因的表达仅发生在花粉发育的早期，随后该基因变为“沉默”。

反义MYB103基因构建体在花椰菜花叶病毒35S启动子的调控下被转入拟南芥植物中的实验导致在植物中产生有缺陷的花粉。

另外，MYB103基因可以通过遗传工程的方法引入，以至于该基因在花药中高水平表达，并且可以通过植物的简单化学处理诱导表达。

因此，可以使用本发明所述基因的正义或反义构建体以将本发明通过整合入许多相关可转化的植物品种的基因组中而成为现实。

本发明所述反义核苷酸序列是指与本发明的核苷酸序列或其部分互补的序列。所述反义核苷酸序列可以与内源基因绑定并阻碍阻止植物细胞中功能基因的表达。反义技术通常使用与该基因重要部分杂交的短10-20寡核苷酸片段以阻碍该基因的表达。该基因的这种重要的区域可以包括5’调控区域内的区域，如增强子和启动子区域，也可以包括转录起始位点。

本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子、增强子、前导序列、内含子以及其它可操作地连接到目的基因的调节序列。

本发明的启动子可以从其5’非翻译区域（5’UTR）的天然编码区域的5’区来分离。类似地，终止子可以从侧翼于其各终止密码子的3’区来分离。

本领域技术人员可以很容易地鉴定出启动子区域。鉴定出含有ATG基元的推定起始密码子，该起始密码子的上游就是推定的启动子。“启动子”是一段DNA调控区域，其通常包含能知道RNA聚合酶Ⅱ在对于特定编码序列的合适转录起始位点起始RNA合成的TATA盒。启动子可以额外包含其它识别序列，这些序列通常位于TATA盒的上游或5’端，它们被称为上游启动子元件，影响转录起始速率，例如作用于编码序列的组织表达和时间表达的那些元件、增强子等。以相同的方式，可以鉴定、分离出使得能在目标组织（例如雄性组织）中进行表达的启动子元件，将其与其它核心启动子一起使用，以验证雄性组织优先的表达。核心启动子是指起始转录所需的最小限度的序列，例如被称为TATA盒的序列，这是编码蛋白质的基因的启动子通常都具有的。

核心启动子可以使任何一种已知的核心启动子，例如花椰菜花叶病毒35S或19S启动子、泛素启动子、IN2启动子或玄参花叶病毒启动子。

还可以对启动子序列加以修饰，以提供异源核苷酸序列表达水平的范围。可以利用比整条启动子更少的区域，而驱动绒毡层优先表达的能力仍能保留。但是，mRNA的表达水平可能随着启动子序列一部分的缺失而减少。因此，可将启动子修饰为弱或强启动子。通常，“弱启动子”是指驱动编码序列以低水平表达的启动子。“低水平”是指大约1/10000转录本至大约1/100000转录本至大约1/500000转录本的水平。相反，强启动子驱动编码序列以高水平（或者大约1/10转录本至大约1/100转录本至大约1/1000转录本）表达。通常，启动子序列的至少大约30个核苷酸将被用于驱动核苷酸序列的表达。为增加转录水平，可以将增强子与启动子区域组合使用。增强子是发挥增加启动子区域表达作用的核苷酸序列，例如SV40增强子区域、35S增强子元件等。

本发明中，所述构建体中的启动子可以使天然启动子或被取代的启动子。所述构建体中的启动子可以是诱导型启动子，使得可通过暴露给诱导剂来控制构建体中正义或反义分子的表达。任何植物相容性启动子元件都可用于所述构建体，可以是植物基因启动子，例如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基的启动子；或者根癌农杆菌的肿瘤诱导质粒的启动子，例如胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶启动子；或者病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒（CaMV）19S和35S启动子或玄参花叶病毒35S启动子；大麦脂转移蛋白启动子LTP2；泛素启动子；END2启动子和聚半乳糖醛酸酶PG47启动子。

可获得的植物相容性启动子的范围包括组织特异性启动子和诱导型启动子。诱导型调控元件是能应答于诱导剂直接或间接激活一条或多条DNA序列或基因的转录的元件。不存在诱导剂时，DNA序列或基因将不能被转录。典型地，与诱导型调控元件特异结合以激活转录的蛋白质因子以无活性形式存在，其再通过诱导剂直接或间接转化为活性形式。诱导剂可以是化学试剂，例如蛋白质、代谢产物、生长调控因子、除草剂或酚类化合物或直接通过热、冷、盐或毒性元素施加或通过病原体肌动蛋白或疾病剂（例如病毒）间接施加的生理胁迫。含有诱导型调控元件的植物细胞可暴露于诱导剂，通过喷雾、浇水、加热或类似方法将诱导剂应用到细胞或植物上。

任何诱导型启动子均可用于本发明。示例性的诱导型启动子包括蜕皮素受体启动子；来自ACE1系统的应答于铜的启动子；来自玉米的In2-1和In2-2基因，其应答于苯磺酰胺除草剂安全剂；玉米GST启动子，其由用作为前紧急除草剂的疏水亲电化合物激活；和烟草PR-1a启动子，其由水杨酸激活。其它受化学调控的启动子包括甾醇应答型启动子以及四环素诱导型和四环素遏制型启动子。

组织优先型启动子可用于靶向特定的植物组织中增强的转录和/或表达。启动子可在目标组织中表达也在其它植物组织中表达，可在目标组织中强烈表达以及比其它组织程度低得多的表达，或者可高度优选在目标组织中表达。本发明中，启动子是偏好于在植物的雄性或雌性组织中表达。本领域技术人员已知的很多此类启动子都可以使用。例如5126启动子，其偏好于指导其连接的基因在植物雄性组织中表达。其它例子还包括Ms45启动子、SF3启动子、BS92-7启动子；SGB6调控元件；TA29启动子；Ⅱ型类金属硫蛋白基因启动子和油菜Bca9启动子。

雄性配子优先型启动子包括上文所述的PG47启动子以及ZM13启动子；肌动蛋白解聚因子启动子；玉米果胶甲基酯酶类似基因的启动子ZmC5；钙调素结合蛋白Mpcbp的启动子。

本发明中所述“有效连接”表示核酸序列的联结，所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连，使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表示：启动子与所述序列相连，相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子。备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的表达时，制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结，并且连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列（即基因表达元件，例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转录终止子）、提供DNA转移和/或整合功能的序列（即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点）、提供选择性功能的序列（即抗生素抗性标记物、生物合成基因）、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列（即多接头序列、位点特异性重组序列）和提供复制功能的序列（即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列）。

基于基因的目的用途，本发明中所述构建体还可以包括其它组分，例如选择标记、靶向或调控序列、稳定序列或引导序列、内含子等。所述构建体还将在目标异源核苷酸序列的3’端包括在植物中具有功能的转录和翻译终止区域。终止区域可以从根癌农杆菌的Ti质粒获得，例如胭脂碱合成酶和章鱼碱合成酶的终止区域。

所述构建体可额外的含有5’前导序列，所述前导序列可发挥增强翻译的作用，其包含但不限于，小RNA病毒前导序列，EMCV前导序列（脑心肌炎病毒5’非编码区）；马铃薯Y病毒组前导序列，例如TEV（烟草蚀纹病毒）前导序列；MDMV（玉米矮缩花叶病毒）前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质（BiP）；来自紫花苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列（AMVRNA4）；烟草花叶病毒（TMV）前导序列；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列（MCMV）。所述构建体还可含有增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，例如内含子。

在希望将异源核苷酸序列的表达产物引向特定细胞器，特别是质体、造粉体，或者引向内质网，或在细胞表面或细胞外分泌的情况下，所述构建体还可包含转运肽（又称分泌信号序列或导向序列）的编码序列，对受体蛋白质来说，所述转运肽可以是异源的，其包含但不限于，酰基运载蛋白的转运肽、RUBISCO的小亚基、植物EPSP合酶、玉米Brittle-1叶绿体转运肽等。用于向特定细胞器表达产物有很多选择，例如，大麦α淀粉酶序列通常被用于指导向内质网的表达。

本发明提供了能表达所述构建体的载体。一般而言，所述载体应当在植物细胞中具有功能。有时，载体在大肠杆菌中具有功能是优选的（例如，生产蛋白质用于产生抗体、DNA序列分析、构建插入、获得核酸的量时）。

缺乏一个或多个内源MYB基因表达的植物细胞的生产是可以实现的，例如通过相应的反义RNA、可以实现共抑制效果的正义RNA的表达或相应构建的核糖酶的表达，所述核糖酶特异性地分裂编码本发明蛋白的转录产物，例如使用本发明的核苷酸序列或AtMYB103基因。

控制目标基因表达的系统可以是阻遏物/恢复物系统，该目标基因可被用于本发明但也可在本发明限制外发现功用。在该系统中重要基因的功能通过使用转录阻遏物而被抑制。

转录阻遏物使用各种抑制基因来阻碍它们的目标基因的转录。一个适合在植物中使用的阻遏物基元具有氨基酸序列LDLDLELRLGFA。另一个适合在植物中使用的阻遏物具有氨基酸序列LDLNLELRISPP。这些基元被称为EAR（ERF-相关的两亲性抑制）。显然氨基酸序列LXLXLX对于EAR基元的抑制功能是至关重要的。

AtMYB103在植物中已测试可诱导阻遏物系统。由于该基因在拟南芥中高表达且编码在可育花粉发育中重要因素的转录因子，因此该基因是一个合适的候选。在系统中AtMYB103基因的功能通过使用阻遏物基元可被抑制，但通过杂交又被恢复。

通过扰乱花粉形成为本发明提供了一种提供雄性不育植物的方法，该雄性不育植物是不能产生花粉的转基因植物。通过能够抑制花粉发育基因的定向表达以产生雄性不育的能力，或反义链和设计的共抑制构建体的表达是特别重要的，共抑制构建体可以可控的方式抑制花粉形成所需的基因。

为了实现雄性不育，重要的是花粉形成已被完全扰乱，而不仅仅是被产生。根据本发明阻碍一个或多个MYB核苷酸序列可以提供花粉形成的完全扰乱，由此产生100%雄性不育植物。除了MYB103，如果涉及雄性特异性发育的其它基因也被阻碍，那么阻碍的效率可以被提高。在拟南芥中，阻碍AtMYB103和AtMYB32可以获得100%雄性不育植物。

在拟南芥中，AtMYB103插入突变体展现出完全雄性不育并伴随着绒毡层过早降解和皱缩的花粉。丧失功能的突变体植物也可以通过使用AtMYB103/EAR嵌合阻遏物来获得。植物是雄性不育的且对绒毡层和花粉发育的影响与在插入突变体中所观察到相似。

ZmMYB103蛋白最可能是一种转录激活剂，且在花粉发育早期可以激活绒毡层退化过程的特殊通路。破坏通路将使程序性细胞死亡。

ZmMYB103EAR转基因在诱导雄性不育中是非常有效的，说明有效抑制所需的嵌合阻遏转录产物的水平与内源ZmMYB103转录产物的水平相比是相对较低的。由于ZmMYB103启动子仅在绒毡层发育早期有活性，因此它能很好地用于表达其它嵌合阻遏物以获得雄性不育。

ZmMYB103蛋白被转变为显性负阻遏物，意味着它作为转录激活剂正常地发挥作用，或者它与激活剂相互作用。转录激活区域被分为三个组，即酸性、富含脯氨酸和富含谷氨酰胺。MYB区域外序列的检测确定了一在C末端（256-282aa）26个氨基酸的酸性序列，伴随10个带负电荷的和4个带正电荷的氨基酸。这一推定的激活区域可以被嵌合阻遏物中的EAR基元抑制。

尽管这些方法对于缓解认知到的与遗传修饰生物有关的任何问题特别具有实用性，特别优选的是使用的MYB基因是品种特异的。

本发明中所述构建体可另外含有对除草剂形成抑制或中和作用的基因，优选为除草剂抗性基因，其包括但不限于，对磺酰脲类的抗性基因、对溴苯腈的抗性基因、对草甘膦的抗性基因、对草胺膦的抗性基因、对草丁膦的抗性基因、对咪唑啉酮类的抗性基因和对2，4-二氯苯氧乙酸酯（2，4-D）的抗性基因。

将本发明中所述构建体或所述重组载体导入植物，常规转化方法包括但不限于，农杆菌介导的转化、微量发射轰击、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入。

本发明中所述的将核苷酸序列“引入”植株时，其表示可通过直接转化的方法发生，所述方法例如对植物组织的农杆菌介导的转化、微粒发射轰击、电穿孔等；或者可通过将具有异源核苷酸序列的植株与另一植株杂交来进行，使得后代具有并入它们基因组的核苷酸序列。此类育种技术是本领域技术人员公知的。

本发明提供了一种介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法，具有以下优点：

1、首次分离。本发明介导植物雄性生育力的蛋白质ZmMYB103为首次分离自玉米品种B73的转录因子。

2、败育彻底。本发明介导植物雄性生育力的基因ZmMYB103来源于玉米，通过与EAR序列连接能够造成玉米可育花粉数量大幅降低，获得完全雄性不育的植株。

3、效益好，纯度高。本发明介导植物雄性生育力的基因ZmMYB103通过与EAR序列连接产生的玉米雄性不育植株不仅能够缩短杂交育种的周期，更有针对性的解决当前雄性不育系资源匮乏，杂交制种纯度不高的现状；而且省去了杂交制种过程中去雄的步骤，降低了机械去雄对玉米植株的机械损伤和产量影响，保证了杂交种质的纯度和产量，从而实现最大程度的经济效益。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法的重组克隆载体DBN01-T构建流程图；

图2为本发明介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法的重组表达载体DBN100369构建流程图；

图3为本发明介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法的转基因玉米植株T₀代的花粉和花药发育图；

图4为本发明介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法的转基因玉米植株T₁代的花粉和花药发育图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法的技术方案。

第一实施例、获得ZmMYB103序列

由拟南芥AtMYB103的已知序列（如序列表中SEQ ID NO:3所示），获得玉米品种B73转录因子ZmMYB103的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。

为了通过扰乱ZmMYB103功能以调控雄性不育，需要建立一显性ZmMYB103阻遏物。当与其它转录因子融合时，12个氨基酸的EAR序列显示出显性抑制基元的作用，如LDLDLELRLGFA。编码EAR序列的短核苷酸序列被融合于ZmMYB103开放读码框的3’末端，产生一ZmMYB103+G+EAR融合物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。

所述ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；合成的所述ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列（SEQ ID NO:4）的5’端还连接有RsrII酶切位点，所述ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列（SEQ ID NO:4）的3’端还连接有SnaBI酶切位点。

第二实施例、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌

1、构建含有ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列的重组克隆载体DBN01-T

将ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列连入克隆载体pGEM-T（Promega，Madison，USA，CAT：A3600）上，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T载体说明书进行，得到重组克隆载体DBN01-T，其构建流程如图1所示（其中，Amp表示氨苄青霉素抗性基因；f1表示噬菌体f1的复制起点；LacZ为LacZ起始密码子；SP6为SP6RNA聚合酶启动子；T7为T7RNA聚合酶启动子；ZmMYB103+G+EAR为ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列（SEQ ID NO:4）；MCS为多克隆位点）。

然后将重组克隆载体DBN01-T用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞（Transgen，Beijing，China，CAT：CD501），其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组克隆载体DBN01-T），42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时（100rpm转速下摇床摇动），在表面涂有IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）和X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的氨苄青霉素（100毫克/升）的LB平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，氨苄青霉素100mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒：将菌液在12000rpm转速下离心1min，去上清液，沉淀菌体用100μl冰预冷的溶液I（25mM Tris-HCl，10mM EDTA（乙二胺四乙酸），50mM葡萄糖，pH8.0）悬浮；加入150μl新配制的溶液II（0.2M NaOH，1%SDS（十二烷基硫酸钠）），将管子颠倒4次，混合，置冰上3-5min；加入150μl冰冷的溶液III（4M醋酸钾，2M醋酸），立即充分混匀，冰上放置5-10min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，在上清液中加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置5min；于温度4℃、转速12000rpm条件下离心5min，弃上清液，沉淀用浓度（V/V）为70%的乙醇洗涤后晾干；加入30μl含RNase（20μg/ml）的TE（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0）溶解沉淀；于温度37℃下水浴30min，消化RNA；于温度-20℃保存备用。

提取的质粒经RsrII和SnaBI酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明重组克隆载体DBN01-T中插入的所述ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，即ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列正确插入。

2、构建含有ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列的重组表达载体DBN100369

用限制性内切酶RsrII和SnaBI分别酶切重组克隆载体DBN01-T和表达载体DBNBC-01（载体骨架：pCAMBIA2301（CAMBIA机构可以提供）），将切下的cZmMYB103核苷酸序列片段插到表达载体DBNBC-01的RsrII和SnaBI位点之间，利用常规的酶切方法构建载体是本领域技术人员所熟知的，构建成重组表达载体DBN100369，其构建流程如图2所示（Kan：卡那霉素基因；RB：右边界；ZmMAC2：ZmMAC2启动子序列（SEQ ID NO:5）；ZmMYB103+G+EAR：ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列（SEQ ID NO:4）；Nos：胭脂碱合成酶基因的终止子（SEQ ID NO:6）；Ubi：玉米Ubiquitin（泛素）基因启动子（SEQ ID NO:7）；PMI：磷酸甘露糖异构酶基因（SEQ ID NO:8）；LB：左边界）。

将重组表达载体DBN100369用热激方法转化大肠杆菌T1感受态细胞，其热激条件为：50μl大肠杆菌T1感受态细胞、10μl质粒DNA（重组表达载体DBN100083），42℃水浴30秒；37℃振荡培养1小时（100rpm转速下摇床摇动）；然后在含50mg/L卡那霉素（Kanamycin）的LB固体平板（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，用NaOH调pH至7.5）上于温度37℃条件下培养12小时，挑取白色菌落，在LB液体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH调pH至7.5）中于温度37℃条件下培养过夜。碱法提取其质粒。将提取的质粒用限制性内切酶RsrII和SnaBI酶切后鉴定，并将阳性克隆进行测序鉴定，结果表明重组表达载体DBN100369在RsrII和SnaBI位点间的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:4所示核苷酸序列，即ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列。

3、重组表达载体转化农杆菌

对己经构建正确的重组表达载体DBN100369用液氮法转化到农杆菌LBA4404（Invitrgen，Chicago，USA，CAT：18313-015）中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA（重组表达载体）；置于液氮中10分钟，37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平（Rifampicin）和100mg/L的卡那霉素（Kanamycin）的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶BamHI和AatII对重组表达载体DBN100369酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体DBN100369结构完全正确。

第三实施例、转入ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列的玉米植株的获得及验证

1、获得转入ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列的玉米植株

按照常规采用的农杆菌侵染法，将无菌培养的玉米品种综31（Z31）的幼胚与第二实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2构建的重组表达载体DBN100369中的T-DNA（包括ZmMAC2启动子序列、ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列、玉米Ubiquitin基因的启动子序列、PMI基因和Nos终止子序列）转入到玉米染色体组中，获得了转入ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列的玉米植株；同时以野生型玉米植株作为对照。

对于农杆菌介导的玉米转化，简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚，用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够将ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞（步骤1：侵染步骤）。在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液（OD₆₆₀=0.4-0.6，侵染培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮（AS）40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L，pH5.3））中以启动接种。幼胚与农杆菌共培养一段时期（3天）（步骤2：共培养步骤）。优选地，幼胚在侵染步骤后在固体培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮（AS）100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上培养。在此共培养阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤。在“恢复”步骤中，恢复培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）中至少存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素（头孢霉素），不添加植物转化体的选择剂（步骤3：恢复步骤）。优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着，接种的幼胚在含选择剂（甘露糖）的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织（步骤4：选择步骤）。优选地，幼胚在有选择剂的筛选固体培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上培养，导致转化的细胞选择性生长。然后，愈伤组织再生成植物（步骤5：再生步骤），优选地，在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培养基（MS分化培养基和MS生根培养基）上培养以再生植物。

筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基（MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，25℃下培养分化。分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基（MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8）上，25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实。在温室中，每天于28℃下培养16小时，再于20℃下培养8小时。

2、用TaqMan验证转入ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列的玉米植株

取转入ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列的玉米植株的叶片约100mg作为样品，用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测ZmMYB103基因的拷贝数。同时以野生型玉米植株作为对照，按照上述方法进行检测分析。实验设3次重复，取平均值。

检测ZmMYB103基因拷贝数的具体方法如下：

步骤11、分别取转入ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆，每个样品取3个重复；

步骤12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述样品的基因组DNA，具体方法参考其产品说明书；

步骤13、用NanoDrop2000（Thermo Scientific）测定上述样品的基因组DNA浓度；

步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；

步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数，以经过鉴定已知拷贝数的样品作为标准品，以野生型玉米植株的样品作为对照，每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：

以下引物和探针用来检测ZmMYB103核苷酸序列：

引物1（MF1）：CTGCTAGTTTGTCGTCCCAGC如序列表中SEQ ID NO:9所示；

引物2（MR1）：TTCTCGCAGCACGGGATC如序列表中SEQ ID NO:10所示；

探针1（MP1）：CAGGCATCGCCAAGCAAGTGGAGTAG如序列表中SEQID NO:11所示；

PCR反应体系为：

所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μl，100μM浓度的探针50μl和860μl1×TE缓冲液，并且在4℃，贮藏在琥珀试管中。

PCR反应条件为：

利用SDS2.3软件（Applied Biosystems）分析数据。

实验结果表明，ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列的玉米植株获得了含有单拷贝ZmMYB103基因的转基因玉米植株。

第四实施例、分析转基因玉米植株

针对植株整体形态对第三实施例中的具有单拷贝的所述转入ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列的玉米植株（T₀）21株加以评估，针对花药和花粉进行分析。除了雄性生育力的程度之外，在所述转入ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米对照植株之间没有观察到其它形态不同。结果表明：具有单拷贝的所述转入ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列的玉米植株（T₀）是不同程度（部分-完全）雄性不育的，其中表现为完全雄性不育的有6株（图3，花药干瘪呈黄色，无花粉染色），占测试转基因株数的28.6%；表现为部分雄性不育的有13株（图3，花药较干瘪呈黄绿色，少量不正常的花粉染色），占测试转基因株数的61.9%；表现为完全雄性可育的有2株（图3，花药饱满呈绿色，正常花粉染色），占测试转基因株数的9.5%。而野生型玉米对照植株则是完全雄性可育的（图3，花药饱满呈绿色，正常花粉染色）。由完全雄性不育的所述转入ZmMYB103+G+EAR核苷酸序列的玉米植株获得T₁代种子，播种后长成T₁代植株，所有T₁代植株都没有花粉形成（图4）。

由此证明ZmMYB103+G+EAR能够使得玉米植株可育花粉数量大幅降低，从而导致不同程度的雄性不育，以获得新型雄性不育系资源。

综上所述，本发明介导植物雄性生育力的核苷酸序列以及使用其的方法中ZmMYB103为首次分离自玉米品种B73的转录因子，并且通过与EAR序列连接能够造成玉米可育花粉数量大幅降低，获得完全雄性不育的植株；所产生的玉米雄性不育植株不仅能够缩短杂交育种的周期，更有针对性的解决当前雄性不育系资源匮乏，杂交制种纯度不高的现状，而且省去了杂交制种过程中去雄的步骤，降低了机械去雄对玉米植株的机械损伤和产量影响，保证了杂交种质的纯度和产量，从而实现最大程度的经济效益。

最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (19)

1.一种MYB转录因子，其特征在于，包括：

（a）具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

（b）在（a）中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸且具有调控花粉发育功能的由（a）衍生的蛋白质；或

（c）如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种MYB转录因子的编码基因，其特征在于，包括：

（a）编码权利要求1所述MYB转录因子的核苷酸序列；或

（b）在严格条件下与（a）限定的核苷酸序列杂交且编码具有调控花粉发育功能的蛋白质的核苷酸序列；或

（c）如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

3.一种表达盒，其特征在于，包含在有效连接的调控序列调控下的权利要求2所述MYB转录因子的编码基因。

4.根据权利要求3所述表达盒，其特征在于，所述表达盒还包含阻遏物基元，所述阻遏物基元连接于权利要求2所述MYB转录因子的编码基因读码框的3’末端。

5.根据权利要求4所述表达盒，其特征在于，所述阻遏物基元为编码LXLXLX氨基酸序列的EAR阻遏物基元，所述L为亮氨酸，所述X为任意氨基酸。

6.根据权利要求5所述表达盒，其特征在于，所述LXLXLX氨基酸序列可以为LDLNLELRISPP或LDLDLELRLGFA。

7.根据权利要求4所述表达盒，其特征在于，所述调控序列可以为花药特异性启动子。

8.根据权利要求7所述表达盒，其特征在于，所述花药特异性启动子可以为Ta39或MAC2。

9.一种包含权利要求2所述MYB转录因子的编码基因或权利要求3-8任一项所述表达盒的重组载体。

10.一种扰乱植物花粉发育的方法，其特征在于，包括通过抑制权利要求2所述MYB转录因子的编码基因的活性扰乱花粉形成。

11.根据权利要求10所述扰乱植物花粉发育的方法，其特征在于，还包括利用权利要求3-8任一项所述表达盒来抑制所述活性。

12.根据权利要求10所述扰乱植物花粉发育的方法，其特征在于，还包括利用权利要求2所述MYB转录因子的编码基因的反义序列来抑制所述活性。

13.一种诱导植物雄性不育的方法，其特征在于，包括利用权利要求10-12任一项所述扰乱植物花粉发育的方法以产生雄性不育植物。

14.根据权利要求13所述诱导植物雄性不育的方法，其特征在于，诱导的所述雄性不育是可逆的。

15.一种产生雄性不育植株的方法，其特征在于，包括用权利要求3-8任一项所述表达盒转化植物细胞以产生转基因植株。

16.根据权利要求15所述产生雄性不育植株的方法，其特征在于，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

17.根据权利要求16所述产生雄性不育植株的方法，其特征在于，所述植物为豆类、农作物、谷类、天然牧草、果期植物或开花植物。

18.根据权利要求17所述产生雄性不育植株的方法，其特征在于，所述植物为大豆、小麦、大麦、玉米、烟草、水稻、油菜或向日葵。

19.一种产生杂交种子的方法，其特征在于，包括：

以异花授粉并列种植来自雄性可育系的第一种子和来自按照权利要求15-18任一项所述方法产生的雄性不育系的第二种子；

用来自所述雄性可育系的花粉异花授粉于所述雄性不育系；

收获授粉后所述雄性不育系的种子。

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