JP2002504343A - ハイブリッド種子の生産 - Google Patents

ハイブリッド種子の生産

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Abstract

(57)【要約】 ハイブリッド種子を調製する方法が記載される。このような１つの方法は、雄性稔性およびホモ接合性劣性雌性不稔である雄性親植物、ならびにホモ接合性劣性雄性不稔および雌性稔性である雌性親植物とを間植する工程、他家受粉させる工程、およびそれから生産される種子を得る工程を包含する。各親植物の遺伝物質はまた、必要に応じて１つ以上のエンハンサー配列またはイントロン配列に作動可能に連結され、各親植物の稔性を十分に回復する遺伝子に作動可能に連結される外因性化学誘導因子の存在または非存在に対して応答するプロモーター配列を含む、遺伝子構築物がまた各親植物に組込まれ得、この遺伝子が、外部の化学誘導因子の上記植物への適用によって発現され、それによって各親の自家受粉を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （ハイブリッド種子の生産） 本発明は、ハイブリッド種子の調製方法に関する。
【０００２】 特に、本発明は、作物植物の不稔性の分子制御に関する。このような植物にお
ける雄性不稔および雌性不稔は、天然に自家受粉する作物由来のハイブリッド種
子の調製において使用され得る。
【０００３】 本発明はまた、親植物における稔性を回復し、自家受粉を可能にし、それによ
って親系統の維持を可能にするための方法を提供する。
【０００４】 本発明はさらに、植物に組込むための発現カセットに関し、そして雄性／雌性
稔性回復システムにおけるこのような発現カセットの使用に関する。
【０００５】 ハイブリッド種子から生長したハイブリッド植物は、２つの異なる遺伝的背景
を交雑するヘテロ効果から利益を生ずる。ハイブリッド種子の生産は、自家受粉
を制御する能力ならびに雄性および雌性親植物の他家受粉を確実にする能力に基
づく。
【０００６】 花粉の稔性を制御するために多くの方法が利用可能である。例えば、雄花と雌
花が分離しているトウモロコシの場合、花粉の稔性の制御は、花粉が生産される
より前に、雄花の花序または雄穂を物理的に除去し、従って自家受粉を防ぐこと
によって達成される。
【０００７】 しかし、大部分の主な作物は、機能的な雄性および雌性生殖器官の双方を同一
の花内に有する。この例において、花粉を生産する器官の除去は、とても労働集
約的であり、費用が高い。花粉生産を殺傷またはブロックするために、特にコム
ギ、トウモロコシおよびイネにおける化学物質（生殖体撲滅薬）の使用は、一時
的に雄性不稔を生ずるが、このような化学物質の使用は、費用が高い。化学物質
の信頼度およびそれらの作用の長さもまた、問題である。
【０００８】 雄性不稔を生じる遺伝学的機構に基づき、花粉制御のシステムを開発する際に
重要な目的が存在する。２つの一般的な型が存在する：ａ）１つ以上の核遺伝子
に起因する花粉生産の失敗により生じる核雄性不稔、およびｂ）花粉生産がミト
コンドリア中の遺伝子の欠失によりブロックされる、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）
。
【０００９】 現在利用可能な核系は、一方の親植物への雄性不稔形質の導入、次いで稔性回
復遺伝子の導入に基づき、別の植物との他家受粉の結果、稔性のハイブリッド植
物を生成する。パラディン（Ｐａｌａｄｉｎ）系（ＷＯ９６／０１７９９に記載
される）は異なり、そして１つの植物において共に発現される場合、雄性不稔を
導く細胞傷害性効果を有する遺伝子のハイブリッド種子の生産中の分離に基づく
。
【００１０】 イネおよびコムギは、自家受粉植物であり、そして小さな雌雄同株の花を有す
るので、トウモロコシにおけるハイブリッド種子の生産で採用されるふさを取り
除くアプローチは適用可能でない。葯を手で取り除くことは、困難であり、時間
の浪費である。さらに、コムギの花粉は、比較的重たく、そして短時間のみ生存
可能であり、３０分より長くはめったに生存しない。従って、ハイブリッドトウ
モロコシの生産において使用される植付技術（すなわち、雌性親（雄性不稔）か
ら物理的に分離されたブロックにおいて雄性親を植え、そして風媒させる）は、
コムギやイネにおいてはうまく利用できない。これらの作物について雄性親およ
び雌性親を、他家受粉を確実に行うために間植する必要がある。ハイブリッド種
子は、９５％より多くのハイブリッドを含む必要があるので、雄性親の自家受粉
から生じる種子を取り除くか、または雄性親を自家受精不能にして、従って非ハ
イブリッド種子を生産し得ないようにさせるかの必要がある。明らかに、この親
植物の間植は、雄性植物が、雌性親が耐性であるある種の化学処理（例えば、除
草剤処理）に対して感受性でないならば、第１の選択肢は困難であることを意味
する。
【００１１】 本発明者らの国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９０／００１１０には、雌性親植
物における生存可能な花粉の生合成を破壊するタンパク質を発現する遺伝子配列
のカスケードが記載される。しかし、この場合、親植物の一方のみ、すなわち雌
性親植物は、雌性植物の自家受粉を最小限にするために不稔性であり、そしてこ
の雌性植物は、稔性の雄性親植物と交雑し、稔性のハイブリッド種子を生じる。
しかし、両親植物が自家受粉が不可能であるハイブリッド種子を生じる方法につ
いては文献には記載がない。
【００１２】 本発明は、ハイブリッド種子の生産に目下関連する問題、特にハイブリッドコ
ムギおよびイネ種子の生産に関連する問題を克服することを探求するハイブリッ
ド種子が生産され得る２つの方法に関する。
【００１３】 本発明の第１の局面に従って、ハイブリッド種子を調製する方法であって、本
方法は、雄性稔性およびホモ接合性劣性雌性不稔である雄性親植物、ならびにホ
モ接合性劣性雄性不稔および雌性稔性である雌性親植物を間植する工程、他家受
粉を可能にする工程、およびそこから生産される種子を得る工程を包含する方法
が提供される。
【００１４】 本発明の第２の局面に従って、ハイブリッド種子を生産するための上記方法の
使用を提供する。
【００１５】 本発明の第３の局面に従って、前記方法により生成される稔性植物を提供する
。
【００１６】 本発明の第４の局面に従って、前記の植物の子孫、そのような植物の種子およ
びそのような子孫を提供する。
【００１７】 本発明の第５の局面に従って、以下を含む発現カセットを提供する： （ａ）雄花特異的プロモーター配列である第１の遺伝子プロモーター配列； （ｂ）この第１の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結される雄性稔性を
破壊し得る産物をコードする破壊遺伝子； （ｃ）１つ以上の翻訳エンハンサー配列またはイントロン配列に必要に応じて
作動可能に連結される雌花特異的プロモーター配列である、第２の遺伝子プロモ
ーター配列； （ｄ）この第２の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結される雌性稔性を
回復し得る産物をコードする回復遺伝子； （ｅ）１つ以上の翻訳エンハンサー配列もしくはイントロン配列に必要に応じ
て作動可能に連結される、外因性化学誘導因子の存在に対して応答する、第３の
遺伝子プロモーター配列；および （ｆ）この第３の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結される雄性稔性を
回復し得る産物をコードする回復遺伝子； を含み、これによって、この外因性化学誘導因子の存在が雄性稔性を制御する、
発現カセット。
【００１８】 本発明の第６の局面に従って、以下を含む発現カセットが提供される： （ａ）雌花特異的プロモーター配列である第１の遺伝子プロモーター配列； （ｂ）雌性稔性を破壊し得る産物をコードする破壊遺伝子； （ｃ）１つ以上の翻訳エンハンサー配列またはイントロン配列に必要に応じて
作動可能に連結される雄花特異的プロモーター配列である、第２の遺伝子プロモ
ーター配列； （ｄ）この第２の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結される雄性稔性を
回復し得る産物をコードする回復遺伝子； （ｅ）１つ以上の翻訳エンハンサー配列もしくはイントロン配列に必要に応じ
て作動可能に連結される、外因性化学誘導因子の存在または非存在に対して応答
する、第３の遺伝子プロモーター配列；および （ｆ）この第３の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結される雌性稔性を
回復し得る産物をコードする回復遺伝子； を含み、これによって、この外因性化学誘導因子の存在が雌性稔性を制御する、
発現カセット。
【００１９】 本発明の第７の局面に従って、以下を包含するハイブリッド種子を生産するさ
らなる方法を提供する：本発明の第５の局面に従う第１の発現系を第１の植物に
組込んで、ヘミ接合性雌性親植物を発生させる工程、および本発明の第６の局面
に従う第２の発現系を第２の植物に組込んで、ヘミ接合性雄性親植物を発生させ
る工程； 外因性化学誘導因子を形質転換体に供し、これによってこの植物の自家受粉を可
能にする工程； この生じた種子から植物を生長させる工程； 雄性ホモ接合性植物および雌性ホモ接合性植物について選択する工程； この選択された雄性植物および雌性植物を交雑する工程；ならびに この生じたハイブリッド種子を得る工程。
【００２０】 本発明の第８の局面に従って、上記のような発現カセットのいずれか一つおよ
び前記の形質転換された植物組織由来の物質で形質転換された植物組織を提供す
る。
【００２１】 本発明の第９の局面に従って、上記のような組織または物質を含む稔性の完全
な植物を提供する。
【００２２】 本発明の第１０の局面に従って、本発明の第７の局面に従って生成される選択
された植物の子孫、それらのゲノムに組込まれた、好ましくは安定的に組込まれ
た上記のような発現カセットを含む子孫、ならびにそのような植物の種子および
そのような子孫を提供する。
【００２３】 本発明の第１１の局面に従って、ゲノムが本発明の第５の局面に従う第１の発
現カセットを含む、植物を提供する。
【００２４】 本発明の第１２の局面に従って、ゲノムが本発明の第６の局面に従う第２の発
現カセットを含む、植物を提供する。
【００２５】 本発明の１３番目の局面に従って、これらの２つの植物を交雑し、そしてそれ
から産生される生じたハイブリッド種子を得ることにより産生されるハイブリッ
ド種子が提供される。
【００２６】 本発明の１４番目の局面に従って、ハイブリッド種子を産生するための、本発
明に従う第２の方法の使用が提供される。
【００２７】 本発明の１５番目の局面に従って、上記に定義されるように、発現カセットを
植物のゲノムに組み込む工程を含む植物を形質転換する方法が提供される。ここ
で修復遺伝子（第３遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結されている）は、
標的組織において誘導的に発現されるが、１つ以上の他の組織では構成的に発現
され得、その結果、この破壊遺伝子は、標的組織でのみ有効である。第３のプロ
モーター配列は、特定の段階（例えば、カルス組織において）で構成的に発現さ
れ得る。
【００２８】 好ましくは、本発明の第１の方法では、それぞれの親植物のゲノムＤＮＡは、
その中に、外因性化学誘導物質の存在または非存在に応答するプロモーター配列
を含む遺伝子構築物を組み込み、必要に応じて１つ以上の翻訳エンハンサーまた
はイントロン配列に作動可能に連結されており、それぞれの親植物の稔性を完全
に回復する遺伝子に作動可能に連結されており、この遺伝子は、外部の化学誘導
物質の植物への適用により発現されており、これによりそれぞれの親の自家受粉
を可能にする。
【００２９】 好ましくは、雌性の親植物は、生存可能な花粉の生合成を破壊するか、または
花粉の生存度を有意に低下する劣性遺伝子についてホモ接合性である。
【００３０】 好ましくは、雄性の親植物は、劣性遺伝子についてホモ接合性である。これは
、受精が妨げられるか、または花粉の付着、水和もしくは発芽が阻害されるよう
な方法で胚珠、花柱、柱頭のような雌花構造を破壊するか、あるいは花粉管の成
長または誘導を阻害する。
【００３１】 好ましくは、誘導性のプロモーター配列は、Ａｌｃ Ａプロモーター配列また
はＧＳＴ−２７プロモーター配列である。
【００３２】 好ましくは、親植物は、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、サトウダイ
コン、トマト、ヒマワリ、アブラナ、綿実、ダイズおよび他の野菜（例えば、レ
タス）である。
【００３３】 好ましくは、本発明の第１の方法によって産生されるＦ１ハイブリッド種子は
、すべてが完全に稔性である植物を生み出す。
【００３４】 好ましくは、本発明の第１の方法によって産生されるＦ２ハイブリッド種子は
、不稔性に関して分離された植物を生み出し、約２５％が雌性不稔になる。
【００３５】 好ましくは、親の不稔性は、天然の変異体または遺伝的に操作された変異体に
よって生じる。
【００３６】 好ましくは、上記で規定されそして本発明の第２の方法において用いられる第
１の発現カセットは、花粉生産を破壊し得る産物をコードする破壊遺伝子を含む
。
【００３７】 好ましくは、上記で規定される第１の発現カセットは、植物のタペータム細胞
において発現され得る産物をコードする破壊遺伝子を含む。
【００３８】 好ましくは、第１の発現カセットにおける第３の遺伝子プロモーター配列は、
Ａｌｃ Ａプロモーター配列またはＧＳＴ−２７プロモーター配列である。
【００３９】 好ましくは、上記で規定されそして本発明の第２の方法において用いられる第
２の発現カセットは、花粉生産を回復し得る産物をコードする回復遺伝子を含む
。
【００４０】 好ましくは、上記で規定される第２の発現カセットは、タペータム細胞の破壊
を克服し得る回復遺伝子を含む。
【００４１】 好ましくは、第２の発現カセットにおける第３の遺伝子プロモーター配列は、
Ａｌｃ Ａプロモーター配列またはＧＳＴ−２７プロモーター配列である。
【００４２】 好ましくは、本発明に従う第２の方法における雄性植物は、雄性の稔性を回復
するホモ接合性の優性遺伝子を含む。
【００４３】 好ましくは、本発明に従う第２の方法における雌性植物は、雌性の稔性を回復
するホモ接合性の優性遺伝子を含む。
【００４４】 好ましくは、生産されたＦ１ハイブリッド種子は、葯が、およそ５０％の生存
可能な花粉を産生する植物を生じ、ここで第１の発現カセットの第１の遺伝子プ
ロモーター配列は、配偶体のプロモーター配列である。
【００４５】 好ましくは、生産されたＦ１ハイブリッド種子は、すべてが、完全に稔性であ
る植物を生じ、ここで第１の発現カセットの第１のプロモーター配列は、胞子体
のプロモーター配列である。
【００４６】 好ましくは、Ｆ２ハイブリッド種子は、不稔性について分離する植物を生じ、
その多数が雌性不稔である。
【００４７】 好ましくは、本発明に従う第２の方法により産生された雄性および雌性のホモ
接合性植物は、植物への外因性化学誘導物質の適用により増加され、そして維持
され、これによって植物の自家受粉を可能にする。これについて、選択された雄
性および雌性のホモ接合性植物の自家受粉のさらなる世代が作製され得、そして
ハイブリッド種子が必要な場合、この植物は、ハイブリッド種子を得るために交
雑され得る。
【００４８】 好ましくは、本発明の第２の方法において用いられる植物は、コムギ、オオム
ギ、イネ、トウモロコシ、サトウダイコン、トマト、ヒマワリ、アブラナ、綿実
、ダイズおよび他の野菜である。
【００４９】 好ましくは、本発明に従って植物を形質転換する方法において用いられる回復
遺伝子は、形質転換された植物が再生されるカルス組織において構成的に発現さ
れる。
【００５０】 好ましくは、この回復遺伝子は、雄性のまたは雌花構造において誘導的に発現
される。
【００５１】 好ましくは、形質転換プロセスにおいて用いられる発現カセットの第３の遺伝
子プロモーター配列は、ＧＳＴ−２７プロモーター配列またはＡｌｃ Ａプロモ
ーター配列である。
【００５２】 本発明の好ましい実施態様は、ハイブリッド種子の調製方法であって、この方
法は、雄性稔性およびホモ接合性の劣性雌性不稔である雄性親植物、ならびにホ
モ接合性の劣性雄性不稔および雌性稔性である雌性親植物を間植し、他家受粉を
可能にし、そしてそれから産生される種子を得る工程であって、ここでそれぞれ
の親植物のゲノムＤＮＡは、それぞれの親の稔性を完全に回復する遺伝子に作動
可能に連結された外因性化学誘導物質の存在、または非存在に応答性のプロモー
ター配列を含む遺伝子構築物を組み込み、この遺伝子は、外部の化学誘導物質の
植物への適用により発現され、これによりそれぞれの親植物の種子貯蔵物の増殖
を必要とする場合、それぞれの親が自家受粉することを可能にする工程 を含む、方法である。
【００５３】 本発明のさらなる好ましい実施態様は、発現系であって、以下：− （ａ）雄花特異的プロモーター配列である第１の遺伝子プロモーター配列； （ｂ）第１の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結した雄性稔性を破壊し得
る産物をコードする破壊遺伝子； （ｃ）１つ以上の翻訳エンハンサーまたはイントロン配列に必要に応じて作動可
能に連結される雌性の組織特異的プロモーター配列である第２の遺伝子プロモー
ター配列； （ｄ）第２の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結した雌性の稔性を回復し
得る産物をコードする回復遺伝子； （ｅ）１つ以上の翻訳エンハンサーまたはイントロン配列に必要に応じて作動可
能に連結される外因性化学誘導物質の存在または非存在に応答性の第３の遺伝子
プロモーター配列； （ｆ）第３の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結される雄性稔性を回復し
得る産物をコードする回復遺伝子； を含み、これにより、外因性化学誘導物質の存在は雄性の稔性を制御し、ここで
雄性の不稔性を破壊し得る遺伝子は、植物のタペータム細胞において発現される
産物をコードする破壊遺伝子である、発現系。
【００５４】 本発明の別の好ましい実施態様は、発現系であって、以下：− （ａ）雌性の組織特異的なプロモーター配列である第１の遺伝子プロモーター配
列； （ｂ）雌性稔性を破壊し得る産物をコードする破壊遺伝子； （ｃ）１つ以上の翻訳エンハンサーまたはイントロン配列に必要に応じて作動可
能に連結する雄性の組織特異的プロモーター配列である第２の遺伝子プロモータ
ー配列； （ｄ）第２の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結した雄性の稔性を回復し
得る産物をコードする回復遺伝子； （ｅ）１つ以上の翻訳エンハンサーまたはイントロン配列に必要に応じて連結す
る外因性化学誘導物質の存在または非存在に応答性の第３の遺伝子プロモーター
配列；および （ｆ）第３の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結される雌性稔性を回復し
得る産物をコードする回復遺伝子； を含み、これにより、外因性化学誘導物質の存在は、雌性の稔性を制御し、そし
てここで雄性の稔性を回復し得る遺伝子は、タペータム細胞において花粉の生産
を回復する産物をコードする遺伝子である、発現系。
【００５５】 好ましい、雄花特異的プロモーター配列は、トウモロコシＭＳＦ１４およびＣ
５（ペクチンメチルエステラーゼ由来）のプロモーター配列である。
【００５６】 用語「植物物質」としては、発生穎花、発芽穎花もしくは発芽子実、または実
生、小植物もしくは植物、またはそれらの組織もしくは細胞（例えば、発生穎花
の細胞あるいは発芽実生または発生子実もしくは発生植物の組織（例えば、根、
葉および茎における））が挙げられる。
【００５７】 「構築物」、「ハイブリッド」および「結合体」のような用語と同義である用
語「カセット」は、遺伝子プロモーター配列に直接または間接に接続する目的の
遺伝子を含む。非直接的な接続の例は、プロモーターおよび目的の遺伝子を媒介
するイントロン配列またはエンハンサー配列のような適切なスペーサー基の提供
である。このような構築物はまた、目的の細胞を形質転換するために適切なプラ
スミドおよびファージを含む。
【００５８】 用語、「破壊遺伝子（ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ ｇｅｎｅ）」は、優性の様式で作
用する遺伝子であり、そして植物の発生の適切な段階で発現された場合、正常に
機能する雌花構造または正常に機能する雄花構造を形成する植物の不全を導き、
その結果、この植物は雌性不稔または雄性不稔になる。このような遺伝子は、タ
ペータムおよび内皮のような組織を破壊することによりその効果を及ぼし得る。
この遺伝子は、花粉形成の際に雄花において特異的に発現され得、これは葯およ
び関連組織、花粉母細胞、花粉および関連組織の細胞死を起こす。これはまた、
柱頭または花柱の伝達管において発現され得、従って花粉付着、水和、花粉発芽
および花粉管成長ならびに誘導のプロセスを妨害する。破壊遺伝子の起源は、種
々の天然に存在する供給源、例えば、ヒト細胞、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞
、真菌細胞に由来し得るか、またはそれらは、ＤＮＡ配列（そのいくつかは天然
に見出され得、そのいくつかは通常天然に存在しない）からなり得る完全に合成
的な遺伝子、もしくは両方の混合物であり得る。これらの遺伝子は、好ましくは
、ミトコンドリア代謝に対して効果を有する。なぜなら良好なエネルギー供給が
稔性の花粉の生産に絶対的に要求されることが公知であるからである。しかし、
破壊遺伝子は、他の必須の生化学機能（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ代謝、タン
パク質合成、ならびに他の代謝経路）に対して効果的に標的化され得る。この好
ましい優性の破壊遺伝子は、バルナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）である。
【００５９】 用語、「回復遺伝子（ｒｅｓｔｏｒｅｒ ｇｅｎｅ）」は、優性の様式で働く
遺伝子であり、そして発現された場合、破壊遺伝子の効果を逆にする。好ましい
優性な回復遺伝子は、バースターである。
【００６０】 用語、「雌花」は、雌性の生殖器官のすべての部分を含むことが意図され、こ
れには子房、卵、雌ずい、花柱、柱頭、伝達管、胎座を含むがこれらに限定され
ない。
【００６１】 用語、「雄花」は、雄花のすべての部分を含むことを意図し、これにはタペー
タム、葯、雄ずい、花粉を含むがこれらに限定されない。
【００６２】 本発明に従うハイブリッド種子生産の方法は、多くの手段における現在の方法
と異なっており、そして多数の利点を有する。雄性不稔および雌性不稔の両方の
利用は、以前には記載されていない。この特徴は、それぞれの親の自家受粉を妨
げ、従って雄性および雌性の親についての別の定植ブロックを必要とすることな
くハイブリッド種子の生産を可能にする。雄性親植物および雌性親植物のこの間
植は、コムギおよびイネ（本質的に自家受粉体である）のような作物における他
家受粉についての機会を最大にする。コムギおよびイネの例では、ブロック定植
を行わない場合、この方法は、雌性の親の受精後、雄性の親植物をのぞくために
除草剤を適用する必要なく、ハイブリッド種子の生産を可能にする。化学的誘導
性の回復系は、ハイブリッド種子生産プロセスについてよりもホモ接合性の親株
の維持のためにのみ必要とされる。これは、化学は限定された範囲で、そしてご
くまれに適用されることを意味する。多数の破壊−回復系、またはオペレーター
−リプレッサー系が本発明において用いられ得る。
【００６３】 雄性稔性および雌性稔性を制御する本発明の発現カセットを含む植物はまた、
雄性稔性または雌性稔性の適切な代替的制御（例えば、葯もしくは胚珠の機械的
除去、または化学的ガメトシドの使用）が他の株で用いられる場合、発現カセッ
トを含まないその他の親株を用いてＦ１ハイブリッドを作製するために別に用い
られ得る。次いで、これらのＦ１ハイブリッド由来の子孫が他のハイブリッド親
に対して適切な継代数で戻し交雑された場合、分子技術、生化学技術または子孫
試験技術を用いた発現カセットの存在についての選択の間、雄性稔性または雌性
稔性を制御するための系は、新しい親の背景に移行されるかまたは遺伝子移入さ
れ得る。あるいは、他の親株を用いるＦ１ハイブリッドは、植物育種の正常なプ
ロセスを通じて、発現カセットを含む新しいハイブリッド親を選択するために、
適切に雄性稔性または雌性稔性を回復させるための外因性化学誘導物質の適用を
通じて、自家受粉し得る。このような遺伝子移入および植物育種の使用により、
本発明のハイブリッド種子生産の方法が広範な種々の新しいおよび現存のＦ１ハ
イブリッド親の組み合わせと用いられることを可能にする。
【００６４】 外因性化学物質の適用により誘導されるプロモーターは、当該分野において公
知である。適切な誘導性プロモーターは、除草剤無毒化剤のような化学物質の適
用により活性化されるプロモーターである。誘導性プロモーターの例としては、
本発明者らの国際公開番号ＷＯ９３／２１３３４に記載されたＡｌｃ Ａ／Ｒス
イッチ系、国際公開番号ＷＯ９０／０８８２６およびＷＯ９３／０３１２９４に
記載されたＧＳＴスイッチ系、または国際公開番号ＷＯ９６／３７６０９に記載
されたエクジソンスイッチが挙げられる。このようなプロモーター系は、本明細
書において「スイッチプロモーター」と呼ばれる。スイッチプロモーターと組み
合わせて用いられるスイッチ化学物質は、農業上、受容可能な化学物質であり、
これは本発明の方法において特に有用なこれらのプロモーターを作製する。
【００６５】 本発明において、Ａｌｃ Ａ／Ｒスイッチ系の成分であるＡｌｃ Ａプロモー
ターを用いることの利点の１つは、用いられる化学誘導物質がエタノールである
ということである。この化学物質は、根の浸し液（ｄｒｅｎｃｈ）として、水性
のスプレーとして、または気体として適用され得るということが利点である。こ
れは、１％の濃度で有効であり、そして操作者および環境に対して非毒性である
。
【００６６】 本発明は、育種者または栽培者がＦ１ハイブリッド種子として生産したい、お
よび適切な形質転換技術が利用可能であるまたは利用可能になる、任意の単子葉
植物または双子葉植物（特にコムギおよびイネ作物）のために使用され得る。本
発明は、Ｆ１ハイブリッド種子生産に関する作物管理コストを減少する利点（ハ
イブリッド種子の純度コントロールおよび親株の維持の容易さ）を有する。
【００６７】 特定の適用において、本発明は、分子操作技術を用いて不稔性を与えられる雄
性および雌性の親植物の生成に関する。これらの植物の不稔性は、稔性の回復を
導く化学物質の適用を用いることにより逆転され得る。
【００６８】 顕花植物における雄性の生殖プロセスの部位は葯である。これは、いくつかの
組織および細胞型からなり、そして精細胞を含む花粉粒子を生成することに対し
て責任がある。タペータムは、花粉形成において重要な役割を果たす特化した組
織である。タペータムは、花粉の発生において早期に花粉嚢を囲み、発生の後期
の段階の間で変性し、そして成熟した葯において組織化された形態では現われな
い。このタペータムは、花粉の発生を補助するかまたは花粉の外壁に組み込まれ
る多数の化合物を生成し、そして天然の雄性不稔変異体の多くがタペータムの分
化または機能を損なったことを実証した。従って、タペータムの組織は、機能的
な花粉粒子の形成に重要である。
【００６９】 タペータムの組織において特に発現される多数の遺伝子が同定されそしてクロ
ーン化された。これらとしては、Ｏｓｇ６Ｂ、Ｏｓｇ４Ｂ（Ｔｓｕｃｈｉｙａら
、１９９４、Ｙｏｋｏｉ、Ｓら、１９９７）、ｐＥ１、ｐＴ７２（ＷＯ９２１３
９５７）、ｐＣＡ５５ｃｏｒｎ（ＷＯ９２／１３９５６）、ＴＡ２９、ＴＡ１３
、（Ｓｅｕｒｉｎｃｋら、１９９０）、ＲＳＴ２ｃｏｒｎ（ＷＯ９７１３４０１
）、ＭＳ１４、１８、１０およびＡ６、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ由来のＡ
９（Ｈｉｒｄら、１９９３）。
【００７０】 イネから単離されたタペータム特異的なプロモーターは、タバコにおけるβ１
，３グルカナーゼの発現を駆動するために用いられる場合、雄性不稔植物を生じ
ることが見られた（Ｔｓｕｃｈｉｙａら、１９９５）。タペータム特異的プロモ
ーターＴＡ２９は、バルナーゼの発現を駆動する場合、雄性不稔タバコ（Ｍａｒ
ｉａｎｉら、１９９０）を生成するために用いられ、そして雄性不稔のコムギ（
Ｄｅ Ｂｌｏｃｋら、１９９７）を生成するためにｐＣＡ５５、ｐＥ１およびｐ
Ｔ７２が用いられる。
【００７１】 花粉特異的なクローンは、トウモロコシ（Ｈａｎｓｏｎら、１９８９、Ｈａｍ
ｉｌｔｏｎら、１９８９）およびトマト（Ｔｗｅｌｌら、１９９０、１９９１）
を含む多数の種から得られた。
【００７２】 葯に特異的なクローンは、なかでも、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ由来のＢ
ｐ４ＡおよびＣ（Ａｌｂａｎｉら、１９９０）、ペチュニア（Ｋｏｅｓら、１９
８９）、イネ（Ｘｕら、１９９３、Ｚｏｕら、１９９４）由来のｃｈｓの多数の
種から単離された。
【００７３】 これらのクローンおよびその他のコムギ相同体は、文献においてみられる配列
を利用する変性ＰＣＲのような方法、そして、引き続くコムギおよび他のゲノム
ライブラリーのスクリーニング、ならびにレポーター遺伝子の発現を用いる組織
特異性の分析により得られ得る。これらの方法は、文献において十分に考証され
ている。
【００７４】 高等植物において、雌性の生殖器官は、雌ずいにより代表される、子房、花柱
、および柱頭から構成される。雌ずい群は、他の器官には存在しない異なるｍＲ
ＮＡを１０，０００まで含むことが示された（ＫａｍａｌａｙおよびＧｏｌｄｂ
ｅｒｇ、１９８０）。これらには、雌ずい発生を制御する原因である調節遺伝子
、およびその雌ずいにおいて分化された細胞型と関連するタンパク質をコードす
る「下流の」遺伝子が挙げられる。自己不適合性を支配する遺伝子およびそれら
の相同体は、雌ずい優先的な発現パターンを有する遺伝子の１つのクラスである
（Ｎａｓｒａｌｌａｈら、１９９３）。他のクローン化された遺伝子としては、
βグルカナーゼ（Ｏｒｉら、１９９０）、ペクチン酸リアーゼ（Ｂｕｄｅｌｉｅ
ｒら、１９９０）およびキチナーゼ（Ｌｏｔａｎら、１９８９）（これらは、伝
達組織により発現される）ならびに、花柱において発現されるプロテナーゼイン
ヒビター（Ａｔｋｉｎｓｏｎら、１９９３）が挙げられる。他は、病原性関連で
あるか、またはグリコシド結合の切断に関与する遺伝子の相同体である。これら
の酵素は、花粉管が成長する組織においてタンパク質を消化することにより花粉
管成長を容易にし得る。
【００７５】 多くの雌性不稔変異体は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて同定された。例え
ば、ｓｉｎ１（短い珠皮：ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｇｕｍｅｎｔ）（Ｒｏｂｉｎｓ
ｏｎ−Ｂｅｅｒｓら、１９９２）およびｂｅｌｌ（花冠：ｂｅｌｌ）（Ｒｏｂｉ
ｎｓｏｎ−Ｂｅｅｒｓら、１９９２）は、胚珠の発生に影響する。Ａｉｎｔｅｇ
ｍｅｎｔａの変異体は、４つの段階で大胞子形成をブロックする（Ｅｌｌｉｏｔ
、Ｒ．Ｃ．ら、１９９６、Ｋｌｕｃｈｅｒ、Ｋ．Ｍ．、１９９６）。致死性胚珠
の２変異体は、トウモロコシで観察されたが、クローン化されなかった（Ｎｅｌ
ｓｏｎら、１９５２）。雌ずい特異的な塩基性のエンドキチナーゼは、多数の種
からクローニングされた（Ｆｉｃｋｅｒら、１９９７、Ｄｚｅｌｚｋａｌｎｓら
、１９９３、Ｈａｒｉｋｒｉｓｈｎａら、１９９６、Ｗｅｍｍｅｒら、１９９４
）そして、エクステンシン様遺伝子は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ａｌａｔａの花柱
に発現されることが示された（Ｃｈｅｎ Ｃ−Ｇ、ら、１９９２）。
【００７６】 以下は、胚珠に特異的なクローンであるＺｍＯＶ２３、１３（Ｇｒｅｃｏ Ｒ
．ら、未発表）、ＯｓＯｓＭＡＢ３Ａ（Ｋａｎｇ Ｈ．Ｇ．ら、１９９５）、Ｚ
ｍＺｍＭ２（Ｔｈｅｉｓｓｅｎ Ｇ、ら、１９９５）、および柱頭特異的なｓｔ
ｉｇ１（Ｇｏｌｄｍａｎ、Ｍ．Ｈ．ら、１９９４）、ＳＴＧ０８、ＳＴＧ４Ｂ１
２（ＥＰ−４１２００６−Ａ）である。Ｇｏｌｄｍａｎらは、ＳＴＩＧ１遺伝子
由来のプロモーターを用い、柱頭の分泌領域におけるバルナーゼの発現を駆動し
た。これは、雌ずいにおいて分泌領域を有さない花を導き、従って雌性不稔であ
った。花粉粒子は、発芽し得るが、表面を透過し得ない。
【００７７】 ７つの胚珠特異的ｃＤＮＡは、ランから単離された（Ｎａｄｅａｕら、１９９
６）。また、これらおよび他の任意のコムギの相同体は、標準的な分子生物学の
技術により得られ得る。
【００７８】 本発明の方法の別の局面は、雄性不稔および雌性不稔に影響する遺伝子の同定
である。このような遺伝子は、不稔性を制御する種々の系において用いられ得る
。
【００７９】 転移因子を有するトウモロコシ遺伝子をタグ化するための手順は、概説された
（Ｄｏｒｉｎｇ、１９８９）。用いられ得る方法の１つは、活性な転移因子およ
び標的遺伝子の優性対立遺伝子を保有するトウモロコシ株を転移因子を保有しな
い正常トウモロコシ株と交雑することである。交雑からの子孫は、自殖され得、
そしてほとんどの所望される変異（すなわち、不稔性を導く変異）についてスク
リーニングされ得る。この不稔性の植物は、転移因子が稔性に必須の遺伝子を保
有する遺伝子座へ転移された強力な例を示す。次いで、この遺伝子は、種々の手
段により回収され得る。米国特許第５，４７８，３６９号は、ＭＳ４５として記
載された遺伝子の本方法による分離を記載する。
【００８０】 雄性稔性の遺伝子は、雄性不稔２（ｍｓ２）変異体およびＭＳ２遺伝子を獲得
するためのＥｎ／Ｓｐｍ−Ｉ／ｄＳｐｍトランスポゾンタグ化系を用いて、Ａｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおいて同定された（Ａａｒｔｓら、１
９９３）。このＭＳ２遺伝子は、雄性の配偶子形成に関与することが示され、 細胞壁合成は、小胞子母細胞の減数分裂後、進行されず、そして小胞子は、最終
的に分解される。ＭＳ２の相同体は、Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｚｅａ
Ｍａｙｓにおいて同定され、そしてオープンリーディングフレームに対する相同
体がコムギのミトコンドリアＤＮＡに見出された。従って、Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓにおける稔性に対して重要な遺伝子の単離は、他の種における相同体のクロ
ーニングを導く。このアプローチは、明白に、稔性に重要な他の遺伝子を単離す
るためにとられ得る。
【００８１】 現在、遺伝子的なレベルでイネ科植物種の間に保存された共直線性の広範な領
域の存在について、証拠が存在する。ＡｈｎおよびＴａｎｋｓｌｅｙ（１９９３
）は、イネとトウモロコシとの間の関係を示し、そしてＫｕｒａｔａら（１９９
４）は、コムギのゲノムがイネと整列され得ることを示し、そしてＭｏｏｒｅら
（１９９５）は、３つのマップすべてが整列され得ることを示した。これは、遺
伝子単離の手段として比較ゲノムマッピングを使用する道を開く。
【００８２】 遺伝子クローニングのためのマイクロシンテニー（ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｅｎｙ
）のアプローチは、分子マーカーにおける新たな類似性および進化的な関連種の
間の遺伝子の順序に基づく。このアプローチは、イネに比べて小さいゲノムを利
用し得るコムギ、トウモロコシおよびオオムギのような農業上重要な大きいゲノ
ムの穀類の種について特に魅力的である。Ｋｉｌｉａｎら（１９９７）は、ゲノ
ム内マッピングのビヒクルとしてイネを用いるオオムギのＲｐｇＩおよびｒｐｇ
４遺伝子のマップピングに基づくクローニング上の進歩を報告する。
【００８３】 上記のアプローチは、遺伝的にマッピングされた標的遺伝子に限定される。遺
伝子単離の代替方法（トランスポゾンタグ化系に有効である）は、トウモロコシ
のＡｃ／Ｄｓ系を用いてイネにおいて開発されている（Ｉｚａｗａら、１９９７
）。
【００８４】 多数の方法が、稔性に必要な遺伝子を不活性にするために、または配偶体の正
常な発生を妨げるため組織において細胞傷害性の化合物を生成するために有用で
あることが示唆された。
【００８５】 本発明者らの国際特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９６／０１６７５は、ｚＡＮＴ、
チューブリン、Ｔ−ｕｒｆ、ＡＴＰアーゼサブユニット、ｃｄｃ２５、ＲＯＡ、
ＭＯＴから選択される破壊遺伝子（ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ ｇｅｎｅ）を使用して
、標的植物組織における遺伝子発現を阻害する方法を記載する。
【００８６】 いくつかの他の公知の不活性化系が存在する。例えば、バルナーゼ（Ｍａｒｉ
ａｎｉら、１９９０）、ジフテリア毒素Ａ鎖、ペクチン酸リアーゼである。以前
に記載された細胞傷害性化合物を発現する２つの例は、アビジン発現およびＩａ
ｍＨ／ＩａｍＳである。
【００８７】 タペータム細胞におけるβ−１，３−グルカナーゼの発現は、雄性不稔植物を
生じることが示されている（Ｗｏｒｒａｌｌら、１９９２）。アンチセンスは、
花粉の発生に対して重要な遺伝子の発現がダウンレギュレートされ得る機構とし
て提案されており、そしてこれは、フラボノイド生合成のアンチセンス阻害が実
際に雄性不稔を誘導することを示している（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒ １９９
２）。フラバノール発現の減少は、雄性不稔を生じるトウモロコシにおいて特許
請求されている（ＷＯ９３ １８１７１ Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ−Ｂｒｅｄ Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。他の機構もまた、記載されている（Ｓｐｅｎａら
、１９９２）。
【００８８】 Ｂａｕｌｃｕｍｂｅ（１９９７）は、複製可能なウイルスＲＮＡベクター（Ａ
ｍｐｌｉｃｏｎTM）の使用を介して、トランスジェニック植物における遺伝子サ
イレンシングの方法を記載する。このベクターはまた、内因性遺伝子のノックア
ウト発現の手段として有用であり得る。この方法は、優性変異を生じる（すなわ
ち、ヘテロ接合状態においてスコア付けされ得（ｓｃｏｒａｂｌｅ）、そして標
的化遺伝子の全てのコピーをノックアウトし、そしてまたアイソフォームをノッ
クアウトし得る）利点を有する。これは、６倍体であるコムギにおいて、明らか
な利点である。次いで、稔性は、誘導性プロモーターを使用することによって回
復され、ノックアウト遺伝子の機能的なコピーの発現を駆動し得る。
【００８９】 Ｋｅｍｐｉｎら（１９９７）は、相同性組換えを使用する、機能的な遺伝子の
標的化された破壊を報告する。この方法は正常であるが、劣性変異を生じる（す
なわち、ホモ接合体においてのみスコア付けされ得る）。ヘテロ接合状態におい
て検出可能であるために、致死性を誘導する細胞傷害性化合物が増加するように
、直接的に致命的であるか、または、例えば経路においてブロックを生じるかの
いずれかでなければならない。不稔性変異を検出するために、自家受粉によって
劣性のホモ接合体を生成する必要性がある。ここで、４つの子孫における１つが
不稔性であった。ノックアウト遺伝子の発現の可能にするスイッチ構築物は、ホ
モ接合体を戻し交配することによって得られたヘテロ接合体に導入されなけらば
ならない。これは、実施例１において後述される方法のために必要な劣性変異を
生成するために、潜在的に有用な方法である。
【００９０】 リボザイムは、内ヌクレオチド分解性（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｏｌｙｔｉｃ）
の切断反応を触媒し得るＲＮＡ分子である。これらは、トランスにおいて反応を
触媒し得、そして異なる配列に対して標的化され得る。従って、これらは、遺伝
子発現を調節する手段として、アンチセンスに対して潜在的な代替物である（Ｈ
ａｓｓｅｌｈｏｆおよびＧｅｒｌａｃｈ）。Ｗｅｇｅｎｅｒら（１９９４）は、
植物において、リボザイム遺伝子の発現によるトランス優性変異の生成を実証し
ている。
【００９１】 いくつかの方法は、雄性不稔を導入する手段としてＳ遺伝子発現を改変するこ
とによる植物自身の不適合系の変更について、公知であり、これにおいて植物は
、自己不適合植物は自己適合性に変換されるか、または自己適合植物が自己不適
合性に変換され、従って、自家受粉を妨げるような方法において、リボヌクレア
ーゼをコードする配偶体のＳ遺伝子を利用する構築物を用いて形質転換される。
【００９２】 破壊／回復遺伝子の組合せの例は、バルナーゼおよびバルスター（ｂａｒｓｔ
ａｒ）ならびにＴＰＰおよびＴＰＳを含む。まず不稔性を生じるための、次いで
稔性を回復するための、このバルナーゼ／バルスター系の使用が記載されている
（Ｍａｒｉａｎｉら（１９９２））。トレハロースリン酸ホスファターゼ（ＴＰ
Ｐ）が、キンギョソウ（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）由来のタペータム特異的プロ
モーター、Ｔａｐ１（Ｎａｃｋｅｎら、１９９１）を使用してタバコのタペータ
ム細胞において発現される場合、雄性不稔を生じる。これは、発現される組織の
炭水化物代謝および光合成能の変化の結果として考えられる。葯は壊死の徴候を
示し、そして生産されたいずれの花粉も死滅する。野生型タバコを用いる戻し交
配は、正常な種子発生を生じる。子孫の分析は、不稔性が導入遺伝子で分離する
ことを示す。ＴｒｅＣ（トレハロース−６−リン酸ヒドロラーゼ）は、トレハロ
ース−６−リン酸のレベルを混乱させる第２の遺伝子であり、そして、構成的プ
ラストシアニンプロモーターを使用して発現される場合、この結果は開花の前に
芽切除（ｂｕｄ ｅｘｃｉｓｉｏｎ）であることを示している。従って、発現が
タペータムに限定される場合、雄性不稔は、ＴＰＰがタペータムで発現される場
合と同じ方法で生じ得る。また、ＧＡ適用後、花芽がこの植物上に残存し、そし
てある花粉が生産され、いくつかの場合において、種子生産を導くことを示して
いる。
【００９３】 これはまた、トレハロースリン酸シンターゼ（ＴＰＳ）およびＴＰＰの同時等
モル発現が、植物生理学に対して影響を与えないことを示す（すなわち、ＴＰＳ
は、これらが発現される組織の炭水化物代謝および光合成能に際してＴＰＰの効
果を相殺する）。これはまた、タペータムにおいてＴＰＳを発現する構築物を用
いて不稔性タバコ株を再形質転換することによって稔性を回復し得ることを示し
ている。明らかに、ＴＰＳの発現はまた、誘導性プロモーターの制御下に置かれ
て、所望される場合に稔性が回復されることを可能にし得るか、またはＧＡ適用
の最適化が、稔性の回復の代替手段であり得る。胚珠の周囲または胚珠中の組織
において特異的に発現される遺伝子由来のプロモーター（例えば、ＭＡＤＳボッ
クス遺伝子ＦＢＰ７）を使用して、雌性不稔を得るためにＴＰＰまたはＴｒｅＣ
の発現を駆動し得る。コドン使用頻度のいくつかの最適化は、コムギまたはトウ
モロコシのような単子葉作物において同様の効果を得るために必要とされ得るよ
うである（ＭｅｒｌｏおよびＦｏｌｋｅｒｔｓ）（ＳｅｅｄおよびＨａａｓ）。
【００９４】 多くのオペレーター／レプレッサー系の使用は、植物において遺伝子発現を制
御する手段として記載されてきた。Ｗｉｌｄｅらは、トウモロコシｃａｂプロモ
ーターの制御下でＧＵＳの発現（３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターによって駆動さ
れるｌａｃ Ｉ発現）を抑制するためのＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃ系の使用を実証し
た。オペレーター配列はＣＡＢプロモーター内の種々の位置で挿入され、そして
抑制の程度が評価された。オペレーター配列の位置に依存して、抑制の範囲を観
察した。オペレーター配列が、ＴＡＴＡボックスと転写開始位置との間の置換に
よって組み込まれた場合、約９０％の抑制が得られた。この抑制は、ＩＰＴＧの
添加によって軽減され得る。これは、タバコプロトプラストおよび安定な形質転
換体の両方において示された。
【００９５】 Ｌｅｈｍｉｎｇらは、結合親和性における劇的な変化は、ｌａｃレプレッサー
の認識ヘリックス中のアミノ酸の改変によって達成され得、従って発現のより厳
しい制御を与えることを報告する。他のこのような系は、Ｇａｔｚら（１９９１
、１９９２）によって開発されたテトラサイクリン誘導性プロモーター系（これ
は、改変された３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターが、高レベルのテトラサイクリン
レプレッサータンパク質を発現する植物において抑制されるが、テトラサイクリ
ンが添加される場合に回復される）に記載され、そして含む。
【００９６】 タンパク質活性のステロイド誘導は、化学的に誘導性の発現系を提供し得、こ
の系は、化学的毒性の問題を被らない。哺乳動物ステロイドレセプターおよび昆
虫ステロイドレセプター（例えば、糖質コルチコイドレセプター（ＧＲ）、エス
トロゲンレセプター）のリガンド結合ドメインを使用して、哺乳動物細胞におい
てタンパク質の活性を調節し得る（Ｐｉｃａｒｄら、１９９３）。タンパク質に
融合したリガンド結合ドメインは、リガンドが導入されるまで、不活性状態にお
いてこのタンパク質を維持する。Ｌｌｏｙｄら（１９９４）は、トウモロコシ転
写調節因子とＧＲとの融合を記載する。Ｓｉｍｏｎら（１９９６）は、転写の誘
導の原因となる、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ開花期遺伝子産物とＧＲの融合を記載
し、そしてＡｏｙａｍａら（１９９５）は、ＧＲリガンド結合ドメインによるス
テロイド制御下に置かれた植物トランス活性化タンパク質（Ａｔｈｂ−１）とＧ
ａｌ４またはＶＰ１６の融合を記載する。ＤＮＡに結合し、そして同時に転写を
活性化するための転写活性因子の能力が、このような転写因子の規定されたドメ
インに局在化することは公知である。転写活性因子が独立に機能するモジュール
から構成されることが実証されている（Ｐｔａｓｈｎｅ １９９８）およびＭｉ
ｔｃｈｅｌｌおよびＴｉｊａｎ（１９８９）。ＰｔａｓｈｎｅおよびＧａｎｎ（
１９８０）ならびに他者は、ある因子の転写活性化の原因となる部分を別の因子
のＤＮＡ結合部分と組合せることが可能であり、そしてその結果、ハイブリッド
タンパク質が酵母細胞において活性化することを示している。これらの成分を組
み込む系を使用して、抑制を軽減し得、従って制御された様式において遺伝子の
発現を誘導し得る。
【００９７】 レセプター媒介性トランス活性化によって植物における遺伝子発現を制御する
ための化学的リガンドとしての、若年性ホルモンまたは１つのそのアゴニストの
使用もまた、記載されている。
【００９８】 好ましくは、回復遺伝子を誘導的に発現するために使用されるスイッチ系は、
ＡｌｃＡ／Ｒスイッチ系である。本発明者らは、トマト葯および花粉においてＧ
ＵＳの誘導性発現を実証し、そしてＡｌｃＲ／Ｒスイッチ系を使用する雄性およ
び雌性組織のＧＵＳ発現を実証するために、コムギに同様の構築物を導入してい
る。本発明者らはまた、セーフナー（ｓａｆｅｎｅｒ）誘導性ＧＳＴスイッチ系
を使用して、トウモロコシ雄穂、絹、胚および胚乳において誘導性ＧＵＳ発現を
実証している（Ｊｅｐｓｏｎら、１９９４）。他のスイッチ系もまた、当然のこ
とながら、本発明において有用であり得る。
【００９９】 標的組織以外の組織において、非常に低いレベルでの雄性および雌性花特異的
プロモーターからの「漏出性」発現の結果としての、植物形質転換の間の細胞傷
害性遺伝子または破壊遺伝子の発現は、細胞死を生じ得、そして形質転換体の回
復を生じ得ない。回復遺伝子の発現を駆動するために本発明において使用される
誘導性プロモーターは、以下の理由のために、この可能性に対していくらかの保
護を提供し得る。
【０１００】 ＧＳＴ−２７プロモーターの場合において、構成的発現はカルスにおいて観察
されている。エタノールで誘導されるＡｌｃＡプロモーターの場合において、Ｇ
ＵＳ発現の誘導は、７ｎｇ／１００ｍｌ空気の濃度で観察されている。この濃度
のエタノールを組織培養培地に添加して、回復遺伝子の発現を保証し得る。
【０１０１】 破壊／回復遺伝子の組合せの例としては、バルナーゼおよびバルスター、なら
びにＴＰＰおよびＴＰＳが挙げられる。
【０１０２】 翻訳エンハンサー配列（特にＴＭＶ Ω配列）の使用（Ｇａｌｌｉｅら）は、
回復遺伝子（例えば、バルスター）の発現が破壊遺伝子（例えば、生成されてい
るバルナーゼ）を阻害するために必要な発現をはるかに超える、構成的な組織特
異的プロモーターおよび誘導性プロモーターからの発現レベルの増加を与えるた
めに、本発明において好ましい。Ｇａｌｌｉｅらは、原核生物ｍＲＮＡおよび真
核生物ｍＲＮＡの翻訳が、６８ヌクレオチド（タバコモザイクウイルスのＵ１菌
株（Ωと呼ばれる）の５’リーダー配列）の連続的な誘導体によって非常に増大
されることを示した。いくつかの他のウイルス性リーダー配列もまた、発現を増
大することが示されている（例えば、アルファルファモザイクウイルス（ＡＩＭ
Ｖ）およびエニシダモザイクウイルス（ＢＭＶ））。タバコ葉肉プロトプラスト
において、約２０倍の増大が観察された。他のエンハンサー配列（例えば、タバ
コエッチ（ｅｔｃｈ）ウイルス）もまた、本発明において使用され得る。
【０１０３】 さらに、発現レベルを増大するイントロン配列の使用が、首尾良く実証される
。これらの中でトウモロコシａｄｈ １イントロン１配列（これは、トウモロコ
シプロトプラスト中に導入されるキメラ構築物の５’翻訳化配列において挿入さ
れる場合に、発現レベルを１２〜２０倍増大させることが示される）（Ｍａｓｃ
ａｒｅｎｈａｓら、１９９０）およびトウモロコシ由来のＳｈ１イントロンにお
いても研究される。ＣａＭＶ３５ＳプロモーターがＣＡＴ発現を駆動している構
築物中へのこのイントロンの封入は、１１倍と９０倍との間の増大を生じる。（
Ｖａｓｉｌら、１９８９）。
【０１０４】 回復遺伝子および破壊遺伝子の発現レベルはまた、以下の方法において平衡化
または調節化され得る。高レベルの発現を与えるプロモーターを使用して、回復
遺伝子の発現を駆動し得る一方、低レベルの発現を与えるプロモーターを使用し
て、破壊遺伝子の発現を駆動し得る。これは、この破壊遺伝子産物が回復遺伝子
産物によって無力化され、それによって全ての細胞傷害性分子または破壊分子を
不活性化し、十分な稔性回復を可能にすることを保証する。発現レベルを調節す
るさらなる方法は、破壊遺伝子の発現が最適ではなく（Ｋｏｚａｋら（１９８９
））、従ってダウンレギュレートするこのような方法において、ＡＵＧ開始コド
ン周囲の配列を変更するための変異誘発の使用によって実行され得る。
【０１０５】 本発明の発現系は、形質転換されている特定の植物種に依存する任意の利用可
能な方法（例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換、エレクトロポレーシ
ョン、植物細胞およびプロトプラストの微量注入、微粒子銃、細菌銃、特に、「
ファイバー繊維」または「ウイスカー（ｗｈｉｓｋｅｒ）」法）を介して、植物
または植物細胞に導入され得る。次いで、適切な場合において、この形質転換細
胞は、新しい核物質がゲノム中に安定に組み込まれた植物全体に再生され得る。
形質転換された単子葉植物および双子葉植物の両方は、このような方法において
得られ得る。参照は、公知な方法の十分な詳細についての参考文献に対してなさ
れ得る。
【０１０６】 ＣｈｒｉｓｔｏｕおよびＨｅｉｅ（１９９７）は、銃の方法論を使用するイネ
の形質変換、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによ
って媒介されるイネの形質転換に対する進歩を記載する。
【０１０７】 コムギを形質転換するための、他の公開された方法としては、Ｂｅｃｋｅｒら
（１９９４）（これは、胚盤組織の微粒子銃の使用を記載する）およびＶａｓｉ
ｌら（１９９３）（これは、未成熟胚の直接銃（ｄｉｒｅｃｔ ｂｏｍｂａｒｄ
ｍｅｎｔ）後のトランスジェニックコムギの迅速な生成を記載する）が挙げられ
る。図２２は、銃によるコムギの形質転換についての時系列を記載する。
【０１０８】 選択マーカーの使用は、不稔性構築物を有する形質転換体を選択するための形
質転換プロセスにおいて要求される。これは、抗生物質選択マーカーまたは除草
剤耐性遺伝子であり得る。除草剤耐性遺伝子または他のマーカーの使用は、ハイ
ブリッド種子生産のプロセスに対して必須ではない（しかし、簡便であると考え
られ得る）。本発明の第２の方法において使用されるヘミ接合植物は、自家受粉
が生じることを可能とする回復遺伝子の発現を誘導する化学物質を用いて処理さ
れ得る。この自家受粉の子孫は分離されて、そして成長し得、化学物質で処理さ
れ、そして自家受粉され得る。ホモ接合株由来の子孫は、不稔性については分離
しない。次いで、このプロセスの繰り返しを実行して、ホモ接合の不稔種子を大
量にし得る。
【０１０９】 本発明の発現カセットの個々の成分は、１つ以上の個々のベクターに関して提
供され得る。これらを使用して、エレメント間の適切な相互作用が生じることを
可能にするように、植物細胞を形質転換または同時形質転換し得る。
【０１１０】 （実施例１） この実施例において、雄性親植物は、天然の、または操作された変異の結果と
して、雄性稔性およびホモ接合の雌性不稔である。雌性親植物は、ホモ接合劣性
の雄性不稔および雌性稔性である。雄性不稔は、遺伝子的に操作され得、または
交配によって導入され得、あるいは天然の変異に起因し得る。例えば、雄性不稔
は、ＭＳ４５（これは、劣性様式において作用することが示されている）のよう
な遺伝子における変異に起因し得て、ホモ接合である場合に不稔性のみを誘導す
る。
【０１１１】 親株はまた、不稔性遺伝子の機能的なコピーに作動可能に連結された誘導性プ
ロモーターをコードするＤＮＡ配列を含み、従って、雌性親株および雄性親株そ
れぞれの維持の目的のために稔性を回復する（図１を参照のこと）。
【０１１２】 これらの２つの親植物の交配は、劣性の雄性不稔対立遺伝子および雌性不稔対
立遺伝子についてヘテロ接合であるＦ１ハイブリッドを生成し、従って十分に稔
性である。しかし、農夫が収穫し、そしてＦ１種子を成長させた場合、Ｆ２世代
は、ヘテローシスおよび収量の損失（約２５％の雌性植物が不稔であるような）
を生じる不稔性について分離する（図２ａ、２ｂ、２ｃを参照のこと)。
【０１１３】 雌性劣性の変異はトウモロコシにおいて公知であるが、この遺伝子は、いまだ
クローニングされていない。
【０１１４】 （実施例２） ハイブリッド種子を生産する第２の方法は、遺伝的操作によってほぼ全体にも
たらされた不稔性に基づいて定式化されている（図３を参照のこと）。
【０１１５】 （雌性親） 雌性親は雄性不稔株である（すなわち、不活化遺伝子が雄性の胞子型プロモー
ターによって発現され、それによって生存可能な機能的な花粉の生産を妨げる）
。さらに、回復遺伝子は、雌性組織において発現される。自己稔性は、回復遺伝
子に連結される誘導性プロモーターによって回復され得る。このような発現カセ
ット（図４を参照のこと）を用いる形質転換は、ヘミ接合植物（ＭＳ ＲFＲCS ）を誘導する。 ＲCS ＝化学的に回復し得る雄性稔性および雌性稔性 ＭＳ ＝優性雄性不稔 ＲM ＝優性雄性稔性の回復 ＦＳ ＝優性雌性不稔 ＲF ＝優性雌性稔性の回復 ハイブリッド種子の生産における使用のためのホモ接合植物を得るために、この
ヘミ接合植物は、外因性化学的誘発因子（例えば、Ａｌｃ Ａ／Ｒ遺伝子スイッ
チの場合のエタノール）を用いて誘導されなければならず、そして自家受粉を可
能にしなければならない。
【０１１６】
【表１】 この植物の４分の３は、不稔性遺伝子が優性な効果を有する（ヌル（ｎｕｌｌ
）株のみが雄性不稔である）場合、１００％不稔性の花粉を生産する。このホモ
接合植物は、自家受粉から得られる種子を成長させることによってヘテロ接合植
物と区別されて、誘導および自家受粉の手順を繰り返し得る。これらの子孫を、
不稔性について分離し、そして以前に記載されたように、遺伝子型に依存して、
容易にスコア付けし得る。除草剤耐性または他の選択マーカー遺伝子もまた使用
して、スコア付けし得る。ホモ接合植物の場合において、全ての子孫は雄性不稔
（および除草剤耐性）であり、ヘテロ接合の場合において、この子孫は不稔性に
ついて分離され続ける。
【０１１７】 従って、ホモ接合の雄性不稔、ホモ接合の雌性稔性株は、この方法において選
択され得る。
【０１１８】 （雄性親） 雄性親植物は、完全に雄性稔性であるが雌性不稔である（すなわち、雌性不稔
、雄性稔性のホモ接合体）。この場合、先に規定したように、雌性不稔は、雌花
器の発達に有害である阻害遺伝子を雌花器において発現することによってもたら
される。あるいは、花粉管が破壊され得るか、または植物が他の点で種子からの
発達を妨げられ得る。回復遺伝子はまた、雄花組織においても発現される。
【０１１９】 雄性親植物は、雌性親植物と同じ様式であるが、図５に示される構築物を用い
て得られる。この場合、ヘミ接合体の植物は、以下の遺伝子型を有し、：− ＦＳ ＲM ＲCS．．．．．．．．．．． およびホモ接合体の植物は、以下の遺伝子型を有する ＦＳ ＦＳ ＲM ＲM ＲCS ＲCS。
【０１２０】 （実施例３） 本実施例において、発現カセットは、配偶子体型（例えば、花粉特異的）プロ
モーターを含む（図５を参照のこと）。雄性親植物は、上記の実施例２において
記載されるようなものである。花粉特異的プロモーターの例は、Ｚｍ１３（Ｈａ
ｎｓｏｎら）およびＣ５を含み、これは１９９８年１月２６日にＮＣＩＭＢ ４
０９１５として、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａに寄託された。
Ｃ５プロモーター配列は、図６１に示される。今一度、ホモ接合体の雄性不稔系
統が得られなければならず、ヘミ接合体植物は、化学的に処理されそして自家受
粉される。
【０１２１】
【表２】 この場合、ホモ接合体系統（すなわち、ＭＳ ＭＳ ＲF ＲF ＲCS ＲCS）
は、ＤＡＰＩ染色によって同定され得る１００％不稔性の花粉を生産する。この
ことは、ＤＡＰＩ染色によってまた同定され得る５０％の不稔性花粉および５０
％の稔性花粉を生産するヘテロ接合体植物由来の花粉から識別され得る。
【０１２２】 従って、ＭＳ ＭＳ ＲF ＲF ＲCS ＲCS系統が選択され得る。
【０１２３】 従って、雄性のホモ接合体の親または雌性のホモ接合体の親は、いずれも自家
受粉され得ないように思われ得る。
【０１２４】 実施例２および３の雌性親植物は、回復遺伝子の発現を駆動する雌性特異的プ
ロモーターを含む発現カセットを保有し、そして雄性親植物は、回復遺伝子の発
現を駆動する雄性特異的プロモーターを含む発現カセットを保有する。親植物体
において、これらの発現カセットは、プロモーターの特異性に起因して稔性に全
く影響しない。
【０１２５】 しかし、これら２つの親系統が交雑される場合、その結果は、配偶子体型（例
えば、花粉特異的）または胞子体型（例えば、タペータム特異的）プロモーター
が、雌性親において雄性不稔を生じるために使用されたか否かに依存する。胞子
体型プロモーターが使用される場合、稔性の完全な回復が達成され、そしてＦ１
種子は完全に稔性である（すなわち、およそ１００％の稔性花粉を産生する）（
図６ａ、６ｂを参照のこと）。しかし、Ｆ１種子が保持され、そして農業家によ
って成育された場合、不稔性が上記のように分離する（図６ｃを参照のこと）。
雄性不稔を得るために配偶子体型プロモーターが使用される場合、花粉は半数体
であるため、稔性の完全な回復は達成されず、そして約５０％の花粉のみが花粉
稔性を生じる機能的対立遺伝子を遺伝する（図７ａ、７ｂを参照のこと）。先に
記載のように、Ｆ２子孫は分離する（図７ｃ）。
【０１２６】 必要である場合、この系の第３の成分によってホモ接合体の不稔性系統の維持
が達成される。従って、各親系統は誘導性プロモーターを含む。このプロモータ
ーは、必要に応じてエンハンサー配列または１つ以上のイントロン配列に連結さ
れ、これは誘導化学物質の適用の際に全ての組織において回復系の発現を駆動し
、従って雌性親における花粉の生産、ならびに雄性親における正常な胚珠および
組織の発達を可能にする。次いで、自家受粉は親種子のバルク化を可能にし得る
。
【０１２７】 全ての実施例において、圃場での化学物質の適用は、親系統の種子を生産する
ためのみに必要とされ、この適用は数少なくかつ比較的小さなエーカー数におい
てなされることが必要である。
【０１２８】 記載の実施例において、不活化遺伝子の発現を駆動するためにタペータム特異
的プロモーター（図６ａ、６ｂ、または６ｃ）または花粉特異的プロモーター（
図７ａ、７ｂ）を使用することが可能である。タペータム特異的プロモーターの
使用は、稔性が完全に回復され得るので好ましい。しかし、花粉は半数体である
ため、花粉特異的プロモーターが使用される場合、稔性の完全な回復は可能では
ない。しかし、花粉特異的プロモーターを使用することに利点が存在し得る。例
えば、花粉特異的プロモーターはより優れた組織特異性を有し得る。植物体の化
学処理は、自家受粉を可能にするための稔性の回復のためのみに必要とされる。
【０１２９】 （実施例４） （一般的クローニングベクターの調製） 全ての分子生物学的技術を、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版（１９８９）
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ：第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編 １９８５）に記載される
ようにか、または指定の製造業者によって推薦されるようにのいずれかで実施し
た。
【０１３０】 （ｐＭＯＧ１００６−Ｆｓｅの調製） ｐＭＯＧ１００６（図８）は、選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝
子を保有するバイナリーベクターであり、そしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに
媒介されるイネの形質転換に使用される。改変されたベクターを、ＥｃｏＲＩを
用いてｐＭＯＧ１００６を消化すること、および独特のＦｓｅＩ部位を導入する
以下の配列： Ｌｉｎｋ１Ａ ＡＡＴ ＴＧＡ ＴＣＧ ＧＣＣ ＧＧＣ ＣＣＴ ＡＧ Ｌｉｎｋ１Ｂ ＡＡＴ ＴＣＴ ＡＧＧ ＧＣＣ ＧＧＣ ＣＧＡ ＴＣ を有する相補的オリゴヌクレオチドのアニールされた対を挿入することによって
調製した。正確なオリゴヌクレオチド配列を含有するクローンを、γ32Ｐで標識
されたＬｉｎｋ１Ａオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって選
択し、そして所望の配向の配列を含むクローンを、配列決定による特徴付けの後
に選択した（図９）。
【０１３１】 （ｐＶＢ６） ｐＢＶ６は、その内部に、独特のＦｓｅＩ部位を含むという点で上記のバイナ
リーベクターに類似しているが、ｎｐｔ１１選択マーカーを保有し、そしてＡｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに媒介されるタバコの形質転換に使用される。
【０１３２】 （ｐＦｓｅ４の調製（図１０）） このベクターを、多くの発現カセットを含むベクターの組み立てを可能にする
ために構築した。これを、多重クローニング部位領域内の稀有の８塩基認識の制
限酵素部位を使用することによって達成した。ｐＦＳＥ（図３２）ＤＮＡを、Ｆ
ｓｅＩで消化し、存在する多重クローニング部位を取り出した。以下の配列を有
する相補的オリゴヌクレオチドを挿入した：−
【０１３３】
【化１】 この配列は、独特のＥｃｏＲＩ部位、ＮｏｔＩ部位、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、Ａｓ
ｃＩ部位、ＳｗａＩ部位およびＦｓｅＩ部位に隣接したＰｍｅＩ部位を導入する
。発現カセットを、ｐＳＫ＋に組み立て、そして下記のような独特の部位を有す
る各カセットに隣接するようにリンカーを挿入した。必要であれば、次いでｐＦ
ＳＥ４中にカセット全体を挿入した。次いで、多重カセットをＦｓｅＩフラグメ
ントとして、上記のｐＭＯＧ１００６−ＦｓｅＩベクターおよびＶＢ６ベクター
に移し得る。
【０１３４】 （実施例５） （タバコ由来のＳＴＩＧ１プロモーターのＰＣＲクローニング） ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼならびにオリ
ゴヌクレオチドＳＴ１−Ｌ２（５’−ＡＴＴ ＣＧＡ ＣＣＴ ＣＧＣ ＣＣＣ
ＣＧＡ ＧＣＴ ＧＴＡ ＴＡＴ Ｇ−３’）およびＳＴ１−Ｒ２（５’−Ｇ
ＡＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＧＡＧ ＡＡＧ ＧＴＴ ＧＡＴ ＡＡＡ ＡＧＣ Ｃ
−３’）を使用して、１００ｎｇのタバコゲノムＤＮＡから１．６ｋｂのフラグ
メントをＰＣＲ増幅した。熱サイクル条件は、以下の通りである：− ９５℃で３分間、次いで９５℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で４分間を３
５サイクル、次いで７２℃で５分間の最終インキュベーション。１．６ｋｂの増
幅産物をＱＩＡＧＥＮのＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキッ
トを使用してゲル精製し、そしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ−ＺＥＲＯ Ｂ
ｌｕｎｔベクター中に連結した。挿入物のＤＮＡ配列を決定し、そしてこれは公
表されているＳＴＩＧ１配列（Ｇｏｌｄｍａｎら、１９９４）と１００％同一性
を示した。次いで、さらなる操作のために、挿入物をＳａｃＩ−ＮｏｔＩフラグ
メントで、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋中に移した（ｐＳＫ−ＳＴＩＧ１）
。
【０１３５】 （実施例６） （化学的誘導性プロモーターからの発現を試験するための、植物形質転換ベク
ターの調製） （ＧＳＴ−ＧＵＳ） トウモロコシＧＳＴ２７ ｃＤＮＡの特徴付けが以前に報告されており、そし
て実験は、ＧＳＴ２７がシルク、葉、胚、または胚乳においては構成的に発現さ
れないことを示した。毒性緩和剤適用の後、これらの組織の全てにおいて発現が
検出された（図１１〜１５）。ＧＵＳの発現を駆動するためのＧＳＴ２７プロモ
ーターを利用する植物形質転換構築物は、米国特許第５，５８９，６１４号にお
いて記載されるように作製され得る（図１６）。これらは、タバコの形質転換に
ついてはｐＧＳＴＴＡＫ（図１７）であり、そしてトウモロコシの形質転換につ
いてはＲＭＳ−３（図１８）である。これらのベクターは、安定なタバコ形質転
換体およびトウモロコシ形質転換体を産生するために使用され得る。処方された
毒性緩和剤を、上述の親において記載されたように、葉への塗布（タバコ）また
は根の浸漬（トウモロコシ）のいずれかとして適用し得、そしてＧＵＳの発現が
観察された。タバコ葉におけるＧＵＳ発現の誘導についての結果を、図１２にお
いて示す；明らかな発現の誘導が、１００倍まで生じた。同様に、トウモロコシ
については、毒性緩和剤処理の後、葉においてＧＵＳ発現が誘導された。発現の
誘導はまた、雄穂組織および胚乳組織ならびに胚において観察された。
【０１３６】 ＲＭＳ−３はまた、コムギを形質転換するために使用され、そしてＧＵＳ発現
の誘導が研究された。選択可能なマーカーとしてハイグロマイシンを使用する改
変ベクターは、イネに導入され得る。
【０１３７】 （ＧＳＴ−バルスター） バルスター遺伝子を保有するトウモロコシ形質転換ベクターＺｍ／ＲＭＳ１４
（上記）を、毒性緩和剤誘導性ＧＳＴ−２７プロモーターに融合した。ＷＵ２５
は、この遺伝子融合物を含有することがＰＣＲによって示された。温室で成育し
た植物への毒性緩和剤Ｒ−２９１４８の根浸漬での適用によって、不稔性の逆転
が実証された。処理された植物は、未処理の植物に対して雄穂の大きさの増大を
示した。非トランスジェニック稔性植物において、雄穂の大きさまたは稔性につ
いて毒性緩和剤の影響は全くなかった。雄穂の大きさの増大と関連して、温室で
根を浸漬したサンプルから採取された葯サンプルにおいて、花粉粒の発達が観察
された。同様の効果は、圃場で成育した植物への葉の適用の後に見られたが、い
かなる実験においても未処理の植物では見られなかった。花粉粒の発達の回復は
、バルナ−ゼのバルスター阻害と関連し、従ってタペータム細胞の除去を克服す
るように思われる。毒性緩和剤での延長処置に曝露された植物において、花粉粒
形成が進行して未成熟の有糸分裂後の花粉で満たされた葯を生じる。対照的に、
不稔性植物の葯は、崩壊される。
【０１３８】 （ｐＳＲＮＡＧＳ） バイナリー植物形質転換ベクターであるｐＳＲＮＡＧＳ（図１９）を、図２０
に記載のストラテジーに従って構築する。このベクターは、ＧＵＳの発現を駆動
するキメラの３５Ｓ−Ａｌｃ ＡプロモーターおよびＡｌｃ Ｒ遺伝子の発現を
駆動する３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターを含む。
【０１３９】 （ｐＵＩＲＮ．ＡＧＳ） トウモロコシおよびコムギを形質転換する際の使用のためのｐＵＣに基づいた
ベクターを調製した。ここで、ユビキチンイントロンに連結したユビキチンプロ
モーターは、Ａｌｃ Ｒ遺伝子の発現を駆動するために使用される（図２１）。
トランスジェニックコムギを得るための時間線（ｔｉｍｅ ｌｉｎｅ）を図２２
に示す。
【０１４０】 （ｐＭＯＧ１００６−ＳＲＮＡＧＳ（イネ）） プラスミドｐＳＲＮ（図２３）を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて
消化して、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｄＩフラグメントとしてｐＭＯＧ１００６中にクロ
ーン化された２．６ｋｂのフラグメント（ＡｌｃＲ−ｎｏｓ）を放出した。次い
で、５６０ｂｐのＣａＭＶ ３５ＳプロモーターフラグメントをＥｃｏＲＩ部位
にクローン化して３５Ｓ−ＡｌｃＲ−ｎｏｓを生成し、所望の配向にあるクロー
ンを配列分析によって選択した（ｐＳＲＮ）。プラスミドｐＡＧＳ（図２４）を
ＨｉｄＩＩＩで消化し、そして２．５ｋｂのフラグメント（ＡｌｃＡ−ＧＵＳ−
ｎｏｓ）をｐＭＯＧ１００６−ＳＲＮのＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化して、
ｐＭＯＧ１００６−ＳＲＮ−ＡＧＳと呼ばれる最終構築物を生成した（図２５）
。ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの配向を、制限分析および配列決定分析によって
決定した。
【０１４１】 タペータム、雌ずい、花粉および他の生殖組織におけるＡｌｃＲの発現レベル
を至適化するため、組織特異的プロモーターを使用して、ＡｌｃＲの発現を駆動
するように以下のベクターを調製した。
【０１４２】 （ＡｌｃＡ−Ｇｌｕ１１−ＧＵＳｉｎｔ−ｎｏｓ） ｐＧＵＮ（図２６）中のＧＵＳ遺伝子の末端にあるＳａｃＩ部位を、ＱＵＩｃ
ｋＣｈａｎｇｅキットを従来通りに使用してＲｓｔＩ部位に変更した。そしてＧ
ＵＳ遺伝子（＋イントロン）を含む引き続くＮｃｏＩ−ＳａｃＩ消化物を使用し
て、カセットＤ（後ろを参照のこと）中のバルスター遺伝子を置換し、ＡｌｃＡ
プロモーター−グルカナーゼエンハンサー−ＧＵＳ−ｎｏｓを含むベクターを生
成した。これはＰｍｅＩフラグメントとして摘出され、そしてｐＦＳＥ４中にク
ローン化される。
【０１４３】 （Ｔａｐ１−ＡｌｃＲ−ｎｏｓ−ＡｌｃＡ−Ｇｌｕ１１−ＧＵＳｉｎｔ−ｎｏ
ｓ） ＡｌｃＡ−Ｇｌｕ１１−ＧＵＳｉｎｔ−ｎｏｓ（Ｇｌｕ１１は、グルカナーゼ
の５’非翻訳領域）を、ＰｍｅＩ切断されたｐＦＳＥ４中にＰｍｅＩフラグメン
トとしてクローン化した。
【０１４４】 Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍから最初に単離され、そして現在ｐｖｄｈ４０５から
クローン化されるタペータム特異的Ｔａｐ１プロモーター（図２７）を、ｐＳＫ
−ＡｌｃＲ−ｎｏｓ中にＥｃｏＲＩフラグメントとしてクローン化し（ＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＳＲＮからｐＳＫ＋にクローニングする
ことによって作製される）、そして得られたＴａｐ１−ＡｌｃＲ−ｎｏｓを、Ｎ
ｏｔＩフラグメントとしてｐＦＳＥ４−ＡｌｃＡ−Ｇｌｕ１１−ＧＵＳｉｎｔ−
ｎｏｓ中にクローン化した。得られたＦｓｅＩ挿入物を、ｐＶＢ６中に挿入して
、最終的なタバコ形質転換ベクターを作製した（図２８）。
【０１４５】 （Ｓｔｉｇ１−ＡｌｃＲ−ｎｏｓ−ＡｌｃＡ−Ｇｌｕ１１−ＧＵＳｉｎｔ−ｎ
ｏｓ） この構築物を、タバコからクローン化された雌ずい輸送（ｔｒａｎｓｍｉｔｔ
ｉｎｇ）領域に特異的なＳｔｉｇ１プロモーター（以下を参照のこと）が、ｐＳ
Ｋ−ＡｌｃＲ−ｎｏｓ中にＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩフラグメントとしてクローン化
されることを除いて上記のように作製し、そしてさらなる操作を上記のように実
施した（図２９）。
【０１４６】 （実施例７） （雄性プロモーターの組織特異性を評価するためのベクターの構築） （ｐＭＳ１４−ＧＵＳ） ＭＦＳ１４由来の５．８Ｋｂのプロモーターフラグメント（Ｗｒｉｇｈｔら、
１９９３）を、ＧＵＳレポーター遺伝子に融合した。ＧＵＳの発現は、花芽発達
の初期ステージの葯においてのみ検出されたが、葉においては検出されなかった
。
【０１４７】 （ｐＭＳ１４−バルナーゼ） 同じプロモーターフラグメントを、トウモロコシ形質転換ベクターであるＺＭ
／ＲＭＳ１４を作製するためにバルナーゼに融合した（図３０）。この融合物は
また、バルスター遺伝子のフレームの外側を、クローニング工程の間のバルナー
ゼに対する保護を提供するための機能的細菌性プロモーターと共に含む。トラン
スジェニックトウモロコシ植物体が得られ、そしていくつかをさらなる分析のた
めに進行させた。特に１つの植物ＷＵ２５を、完全稔性の植物由来の花粉との交
雑に由来する子孫を分析することによって詳細に研究した。ｐａｔ遺伝子を検出
するためのＰＣＲおよび葉の塗布によって評価されるように、導入遺伝子を遺伝
する全ての子孫は完全に不稔性であったが、一方で導入遺伝子を欠損する子孫は
完全に稔性であった。不稔性雄穂は一般的に、稔性の姉妹植物体上の雄穂よりも
小さく、そして花粉を欠き、そして雄穂から突出（ｅｘｃｅｒｔ）しない葯を保
有する。全ての他の点においては、不稔性植物は、稔性の非トランスジェニック
姉妹植物体から識別可能でない。
【０１４８】 （ｐＣ５−ＧＵＳ） トウモロコシ由来のペクチンメチルエステラーゼのゲノムクローン（図６１に
示されるＣ５と命名される）を単離し、そしてプロモーターを、組織特異性を研
究するためにＧＵＳとの転写融合物において使用した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ形質転換によってタバコにこのベクターを導入し、そして形質転換体をカナ
マイシンによって選択した。烈開した葯からの花粉粒を回収し、そしてＧＵＳ活
性について染色した。２つの植物体がおよそ５０％の青色染色花粉を示した。非
トランスジェニックのコントロールにおいては全く染色は見られなかった。葯の
発達ステージを含む一連の組織から抽出物を作製し、そしてＧＵＳ発現について
蛍光定量的に分析した。発達中の葯および烈開した葯以外の組織においては、非
常に低レベルの発現しか見られなかった。花粉粒染色は、トランスジェニックタ
バコおよびトランスジェニックトウモロコシの両方において、自然環境のＺｍＣ
５プロモーターは花粉発達の後期に機能することを示すノーザンのデータと、発
現の時期がうまく一致することを示す。
【０１４９】 （ｐＭＯＧ１００６−Ｃ５−ＧＵＳ（イネ）） Ｃ５−ＧＵＳ（ｂｉｎ）を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断して２．１ｋ
ｂのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ＧＵＳ−ｎｏｓ）（これは、Ｅｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩで切断されたｐＭＯＧ１００６中にクローン化される）お
よび１．９ｋｂのＢａｍＨＩフラグメント（Ｃ５プロモーター）（これは引き続
いて、このｐＭＯＧ１００６−Ｇｕｓ−ｎｏｓ中にクローン化されて最終的なベ
クターであるｐＭＯＧ１００６−Ｃ５−ＧＵＳを生成する）を生成した。このプ
ロモーターの配向は、配列決定によって確認された（図３１）。
【０１５０】 （ｐＭＯＧ１００６−ＭＦＳ１４−ＧＵＳ（イネ）） ２．３ＫｂのＭＳＦプロモーターを、ＢａｍＨＩを用いてＲＭＳ３０ベクター
（図４１）から単離し、そしてｐＦＳＥ中にクローン化した（図３２）。次いで
、このＧＵＳイントロンカセットを、ｐＧＵＮからＰｓｔＩフラグメントとして
ｐＦＳＥ−ＭＦＳ１４ベクター中にクローン化する。次いで、このＭＳＦ１４−
ＧＵＳｉｎｔ−ｎｏｓフラグメント全体を、ＦｓｅＩフラグメントとしてｐＭＯ
Ｇ１００６−Ｆｓｅ中にクローン化した（図３３）。
【０１５１】 （実施例８） （不稔性および回復稔性を生成するためのベクターの調製） （カセットＡ− ＭＦＳ１４−バルナーゼ−ｎｏｓ−優性胞子体型雄性不稔カ
セットの調製） ＲＭＳ１４由来のｎｏｓターミネーターをＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグ
メントとして単離し、同じ２つの酵素を用いて切断したｐＳＫ＋中にクローン化
した。得られたプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そして以下の配列：− Ｌｉｎｋ２Ａ ＡＧＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＡＴ ＴＣＧ ＴＣＴ Ｌｉｎｋ２Ｂ ＡＧＣ ＴＡＧ ＡＣＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＧＡ を有する相補的オリゴヌクレオチドの対（すなわち、切断されたベクターと連結
されたΔＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩをコードする）をアニー
ルした。推定の形質転換されたコロニーをナイロンメンブレン上に画線し、そし
てγ３２Ｐで標識されたＬｉｎｋ２Ａオリゴヌクレオチドを用いる通常の様式に
おいて探索した。多くの陽性コロニーを配列決定によって分析し、そしてＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位が２つのＥｃｏＲＩ部位に対して内部にある配向を有する１つのク
ローンをさらなる操作のために選択した。ベクターの連結を妨げるために、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩを用いて切断しそしてエビのアルカリホスファターゼを用いて処理し
たこのベクターに、ＭＳＦ１４プロモーターならびにバルナーゼおよびバルスタ
ーコード配列を保有するＲＭＳ１４から単離されたＨｉｎｄＩＩＩを連結した。
所望の配向にＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含有する形質転換体を、配列解析に
よって同定した（図３４）。ＭＳＦ１４−バルナーゼ／バルスター−ｎｏｓを保
有するフラグメント全体をＥｃｏＲＩフラグメントで摘出し、そしてイネおよび
タバコへの導入のために、ｐＦｓｅ４を通してｐＢＶ６およびｐＭＯＧ１００６
−Ｆｓｅ中に挿入した。
【０１５２】 （カセットＢ−Ｃ５−バルナーゼ−優性配偶子体型雄性不稔カセットの調製） ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の独特のＳａｌＩ部
位を、消化されたＳａｌＩ部位へのオリゴヌクレオチドリンカーＭＫＬＩＮＫ４
（５’−ＴＣＧ ＡＴＴ ＣＧＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＣＧ ＡＡ−３’）の挿
入によって、ＮｏｔＩ認識部位を置換した。０．９ｋｂの、バルナーゼのコード
領域と次いで細菌性プロモーター駆動のバルスターコード領域を保有するＢａｍ
ＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、この改変されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
の対応フラグメント中に挿入した。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメント上の
ｎｏｓターミネーターを、得られたベクターの対応フラグメント中に挿入した。
次いで、所望されないＢａｍＨＩ部位を、製造業の指示に従い、かつオリゴヌク
レオチドＤＡＭ−３Ａ（５’−ＧＧＴ ＣＧＡ ＣＴＣ ＴＡＧ ＡＧＧ ＡＡ
Ｃ ＣＣＣ ＧＧＧ ＴＡＣ ＣＡＡ ＧＣ−３’）およびＤＡＭ−３Ｓ（５’
−ＧＣＴ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＣＧ ＧＧＧ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＡＧ ＡＧＴ
ＣＧＡ ＣＣ−３’）を用いて、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋＣｈａｎ
ｇｅ ｓｙｓｔｅｍを使用して取り出した。得られたプラスミド（ｐＳＫ−ＢＢ
Ｎと命名される）をＢａｍＨＩで完全に消化し、エビのアルカリホスファターゼ
で脱リン酸化した（３７℃、１時間）。Ｃ５の５’隣接領域の１．９ｋｂのＢａ
ｍＨＩフラグメントをこれに連結し、次いでＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し
て、挿入物の存在と配向をそれぞれチェックした。得られたプラスミドを、ｐＳ
Ｋ−Ｃ５−ＢＢＮと名付けた（図３５）。次いでカセット全体を、ＥｃｏＲＩ−
ＮｏｔＩフラグメントとして、バイナリー植物形質転換ベクターであるｐＶＢ６
に移した。次いで、構築物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ中に、凍結融解法によって導入した。標準的な方法を、ＤＮＡをタバコに導
入するために使用した。
【０１５３】 （カセットＣ−３５Ｓ−ＡｌｃＲ−ｎｏｓの調製） ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＵＣ３として公知のベクターか
ら単離した。このフラグメントは、ＡｌｃＲコード配列およびｎｏｓターミネー
ターを含む。このフラグメントをＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＳＫ
＋中にクローン化した。ΔＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＰｍｅＩ−ΔＨｉｎｄＩ
ＩＩについての制限部位を保有する以下の配列：− Ｌｉｎｋ５Ａ ＡＧＣ ＴＡＴ ＴＡＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＴＡ ＴＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＣＧ Ｔ Ｌｉｎｋ５Ｂ ＡＧＣ ＴＡＣ ＧＣＧ ＴＴＴ ＡＡＡ ＣＡＴ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＴＡＡ Ｔ を有する相補的オリゴヌクレオチドのアニールされた対を、ＨｉｎｄＩＩＩ部位
に挿入し、このようにしてカセットの３’末端にＰｍｅＩ部位およびＮｏｔＩ部
位を付加し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を欠失した。３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターを
保有するｐＵＣ３由来のＥｃｏＲＩフラグメントをこのＥｃｏＲＩ部位にクロー
ン化し、そして制限分析および配列決定分析によって方向付けした（図３６）。
カセット全体を、ＮｏｔＩフラグメントとしてさらなる操作のために摘出し得る
。これはＰｍｅＩ部位を含み、ここでＡｌｃＡ−Ｇｌｕ１１−バルスター−ｎｏ
ｓカセットを挿入し得る。
【０１５４】 （カセットＤ ＡｌｃＡ−Ｇｌｕ１１−バルスター−ｎｏｓの調製） ｐＭＪＢ１ベクターをＸｈｏＩおよびＮｃｏＩを用いて消化して、ＴＭＶオメ
ガエンハンサーを取り出す。以下の配列：−
【０１５５】
【化２】 を有する、グルカナーゼ１１の５’ＵＴＲをコードしそしてＸｈｏＩ部位および
ＮｃｏＩ部位に隣接された２つのオリゴヌクレオチドを、通常どおりにアニール
し、そして切断されたベクター中に連結した。配列決定されたベクターをＨｉｎ
ｄＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化して、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩフラグメント中
に連結された３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターおよびＡｌｃＡプロモーターを取り
出した。ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ末端を有するバルスターをコードするフラグ
メントを、ＲＭＳ９からＰＣＲによって得た。次いでこれをＮｃｏＩ−ＢａｍＨ
Ｉで切断された上記のベクター中に挿入して、ＡｌｃＡ−Ｇｌｕ１１−バルスタ
ー−ｎｏｓを保有する完全なカセットを提供した。カセットの操作を容易にする
ために、ΔＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｍｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩおよびΔＥｃｏＲＩ−Ｐ
ｍｅＩ−ΔＥｃｏＲＩをコードするオリゴヌクレオチドの使用によって、各末端
にＰｍｅＩ部位を付加する（図３７）。これは、ＡｌｃＡ／Ｒスイッチの両成分
がＮｏｔＩフラグメントとしてｐＦＳＥ４中に移動されることを可能にする、上
記の３５Ｓ−ＡｌｃＡ−ｎｏｓカセット中にこのカセットを挿入することを可能
にする。
【０１５６】 （カセットＥ ＭＦＳ１４−Ｇｌｕ１１−バルスター）−ｎｏｓ（雄性稔性回
復カセット）の調製） ＭＦＳ１４プロモーターの３’末端を保有する３２０ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｓａ
ｃＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ切断ｐＳＫ＋にクローニングした。
ＨｉｎｄＩＩＩ部位を、標準的な手順に従ってＱｉａｇｅｎからのＱｕｉｋＣｈ
ａｎｇｅキットを用いて除去した。この部位を除去するために用いたオリゴヌク
レオチドは、以下の配列を有していた：
【０１５７】
【化３】 この部位の欠失を、制限分析により、および配列決定により確認した。次いで
、新たなＨｉｎｄＩＩＩ部位を、ΔＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ部位を
コードするアニーリングしたオリゴヌクレオチドの挿入により、ＳａｃＩ部位の
付近に導入した。
【０１５８】
【化４】 新たな部位の存在を、制限分析により確認し、そしてリンカーの正しい向きを
、配列決定により規定した。所望の向きにより、ＨｉｎｄＩＩＩ部位が、Ｂａｍ
ＨＩ部位に対してＳａｃＩ部位の外側に与えられた。次いで、ＢａｍＨＩ部位を
除去し、そして新たなＸｈｏＩ部位を、ΔＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ−ΔＢａｍＨＩ
をコードするオリゴヌクレオチドを用いて同様に導入した。これは、以下の配列
を有した： Ｌｉｎｋ６ ＧＡＴ ＣＧＴ ＡＴＣ ＴＣＧ ＡＧＡ ＴＡＣ。
【０１５９】 ＢａｍＨＩ部位が存在しないこと、およびＸｈｏＩ部位の導入を、通常の方法
において確認した。
【０１６０】 ＲＭＳ１４を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｃＩで消化し、そしてＭＦＳ１４プ
ロモーターの残りをコードする５．５Ｋｂのフラグメントを単離した。次いで、
このフラグメントを、上記のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ切断ベクターに挿入し、
そしてプロモーターの完全性を配列決定により確認した。次いで、ＭＦＳ１４プ
ロモーターの全体を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｈｏＩカセットとして切り出し、そし
てＡｌｃＡプロモーターを末端へのリンカーの付加の前の段階で置換してカセッ
トＤ中に挿入した。このカセットについては、各末端にＳｗａ１部位導入リンカ
ーを用いた（図３８）。
【０１６１】 （カセットＦ Ｓｔｉｇ１−バルナーゼ−ｎｏｓ（雌性胞子体不稔性カセット
）の調製） ＢａｍＨＩ部位を、ベクターｐＳＫ−ＳＴＩＧ１中のＳＴＩＧ１プロモーター
の翻訳開始部位付近に導入した。このことを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｑｕｉｃ
ｋＣｈａｎｇｅ Ｋｉｔを以下のオリゴヌクレオチドとともに用いて達成した：
【０１６２】
【化５】 次いで、１．６ｋｂ ＳＴＩＧ１プロモーターを、ＢａｍＨＩフラグメントに
おいて遊離させ、そしてＢａｍＨＩ消化ｐＳＫ−ＢＢＮ中にクローニングした。
このプロモーターの存在および正しい方向を、ベクターとプロモーター配列との
間のＰＣＲ増幅により決定した。ＳＴＩＧ１−ＢＢＮカセットを、ＮｏｔＩ−Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントでベクターｐＦＳＥ４に移入し、得られたプラスミドをｐ
ＦＳＥ４−ＳＴＩＧ１−ＢＢＮと命名した（図３９）。次いで、このカセット全
体を、ＦｓｅＩフラグメントとしてＶＢ６に移入した。
【０１６３】 （カセットＧ Ｓｔｉｇ１−Ｇｌｕ１１−バースター−ｎｏｓ（雌性稔性回復
カセット）の調製） 構築物ｐＡｌｃＡ−ＧｌｕＩＩ−バースター−ｎｏｓ−ｐｐを改変して、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ制限部位をＥｃｏＲＩ部位で置換した。このことを、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｋｉｔおよび以下のオリゴヌクレオチドを用
いて達成した：
【０１６４】
【化６】 ＸｈｏＩ部位を、ベクターｐＳＫ−ＳＴＩＧ１中のＳＴＩＧ１プロモーターの
翻訳開始部位付近に導入した。このことを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋ
Ｃｈａｎｇｅ Ｋｉｔを以下のオリゴヌクレオチドとともに用いて達成した：
【０１６５】
【化７】 次いで、１．６ｋｂ ＳＴＩＧ１プロモーターを、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩフラ
グメントにおいて遊離させ、そしてｐＡｌｃＡ−ｇｌｕＩＩ−バースター−ｎｏ
ｓ−ｐｐのＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩでの消化により生成される、より大きなフ
ラグメント中にクローニングして、ＡｌｃＡプロモーターをＳＴＩＧ１プロモー
ターで置換した（図４０）。このカセット全体をＰｍｅＩフラグメントに切り出
し、そしてｐＶＢ６およびｐＭＯＧ１００６−Ｆｓｅ中にクローニングした。
【０１６６】 （切替可能なＴＰＳベクター（ＡｌｃＡ−ＴＰＳ−ｎｏｓ Ｔａｐ１−Ａｌｃ
Ｒ−ｎｏｓ）の調製） Ｔａｐ１−ＡｌｃＲ−ｎｏｓカセットは、記載されている。ｐＡＧＳ中のＧＵ
Ｓ遺伝子をＴＰＳで置換し、そして新たなカセットをＨｉｎｄＩＩＩカセットと
してｐＦＳＥ４中にクローニングした。先に記載したＴａｐ１−ＡｌｃＲ−ｎｏ
ｓを、ＮｏｔＩフラグメントとしてこのｐＦＳＥ４−ＡｌｃＡ−ＴＰＳ−ｎｏｓ
ベクター中にクローニングした。Ｆｓｅ１フラグメント全体を切り出し、そして
ｐＶＢ６中にクローニングした。このベクターはここで、Ｔａｐ１−ＴＰＰ−ｎ
ｏｓ発現カセットを保有する構築物を用いて形質転換することにより、タバコを
形質転換して不稔性にするために使用され得る。
【０１６７】 （実施例９：植物形質転換ベクターの調製） 上記のカセットの任意の組合せを、ｐＦＳＥ４において作製し得、そして続い
ての、得られるＦｓｅ１フラグメントのｐＭＯＧ１００６−ＦｓｅまたはｐＶＢ
６のいずれかへの移入は、タバコまたはイネへの形質転換を可能にする。
【０１６８】 以下の組合せのカセットを、植物形質転換ベクターとして作製した： Ａ＋Ｃ＋Ｄ＝稔性が、回復遺伝子の化学的誘導によって回復可能である、胞子
体雄性不稔植物 Ｅ ＝上記の植物に他家受粉した場合に子孫において稔性を回復する、
胞子体雄性稔性回復植物 Ｆ＋Ｃ＋Ｄ＝稔性が、回復遺伝子の化学的誘導により回復可能である、胞子体
雌性不稔植物 Ｇ ＝上記の植物に他家受粉した場合に雌性稔性子孫を生産する、胞子
体雌性稔性回復植物 Ｂ＋Ｄ ＝稔性が、回復遺伝子の化学的誘導により回復され得る、配偶体雄
性不稔植物。
【０１６９】 本明細書中に記載される通りのＦ１ハイブリッド植物の親の作製を、以下の方
法で達成する： 雄性親、すなわち、雌性不稔
【０１７０】
【表３】 雌性親、すなわち、雄性不稔
【０１７１】
【表４】
【０１７２】 （実施例１０：新たなＰＩＧ遺伝子を試験するためのベクターの構築） （ＲＭＳ３０およびＲＭＳ３２（タバコ）） チューブリン遺伝子を、ｐチューブリン（ｐｔｕｂｕｌｉｎ）からのＨｉｎｆ
１フラグメントとしてクローニングし、そして上記で作製したｐＦＳＥ−ＭＦＳ
１４にクローニングした。得られたＭＦＳ１４−チューブリンｎｏｓを、ｐＶＢ
６中にＦＳＥフラグメントとしてクローニングして、ＲＭＳ３０を生成した（図
４１）。
【０１７３】 ＭＦＳ１４＋ｌａｃオペレータープロモーターを、ＲＭＳ３２からＢａｍＨＩ
フラグメントとして切り出し、そしてｐＦＳＥ中にクローニングした。チューブ
リン遺伝子の挿入に続いて、ＭＦＳ１４−ｌａｃ−ｏｐ−チューブリン−ｎｏｓ
ＦｓｅＩフラグメントをｐＶＢ６中にクローニングして、ＲＭＳ３２を生成し
た（図４２）。
【０１７４】 （ＲＭＳ３０およびＲＭＳ３２（イネ）） ＭＦＳ１４プロモーター（＋／−ｌａｃ ｏｐ）−チューブリン−ｎｏｓを含
有するＦｓｅＩフラグメントをｐＭＯＧ１００６−Ｆｓｅ中にクローニングして
植物形質転換ベクターを作製した。
【０１７５】 （Ｚｅａ ｍａｙｓにおいて稔性を生じるために用いられるトレハロースリン
酸ホスファターゼ（ＴＰＰ）およびトレハロース−６−リン酸ヒドロラーゼ（Ｔ
ｒｅＣ）の最適化） Ｚｅａ ｍａｙｓにおける発現のために最適化したバージョンのＴＰＰコード
領域およびＴｒｅＣコード領域（これは、各コドンの冗長位置においてＧまたは
Ｃについての優先度を有する）を、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．により合成する。ヌクレオチド配列は、インビボで１．０％を超えて、
そして天然に存在する比を代表する頻度（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａ
ｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｒｅｌｅａｓｅ １０８による）で存在するコドンを
用いて、それらのアミノ酸配列から誘導する。ＢａｍＨＩおよびＮｃｏＩを含む
翻訳開始部位付近に有用な制限酵素部位が、ならびにクローニングを容易にする
３’末端にＰｓｔＩ部位もまた含まれる。
【０１７６】 （コドンを最適化したＴＰＰおよびＴｒｅＣ Ｚｅａ ｍａｙｓの使用を試験
するための構築物） ベクターｐＦＳＥ−ＭＦＳ１４中のＭＦＳ１４プロモーターの５’末端のＢａ
ｍＨＩ部位を、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅシステムを以下
のオリゴヌクレオチドとともに用いて除去する：
【０１７７】
【化８】 次いで、合成ＴＰＰおよびＴｒｅＣ遺伝子を、ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメ
ントに切り出し、そして改変されたｐＦＳＥ−ＭＦＳ１４ベクター中のＭＦＳ１
４プロモーターとｎｏｓターミネーターとの間にクローニングする。ａｄｈ１イ
ントロンをこのプロモーターとコード配列との間に挿入して発現レベルを高める
。次いで、完全なカセットを、ＩＧＰＤ細菌選択マーカーおよび除草剤耐性遺伝
子カセットをトランスジェニック植物の選択のために含有する、ｐＵＣに基づく
クローニングベクターに移入する。
【０１７８】 （実施例１１：トランスジェニック植物の作製） ｐＳＲＮ．ＡＧＳをタバコ、脂肪種子セイヨウアブラナ、およびトマト（これ
らの植物をＡｌｃ−ＧＵＳ植物という）に導入し、ｐＭＯＧ１００６−Ｆｓｅ−
ＳＲＮＡＧＳおよびｐＭＯＧ１００６−Ｃ５−ＧＵＳをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ媒介形質転換を介してイネに導入した。
【０１７９】 上記に示したカセットの組合せの各々を含む植物形質転換ベクターを、Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換によりタバコおよび／またはイネに導入した
。外植片をＰＣＲにより分析し、そしてインタクトな挿入物を含有する外植片を
クローン繁殖させ、そして温室に移植し、そして開花するまで増殖させた。ＲＭ
Ｓ３０およびＲＭＳ３２もまたタバコに導入した。
【０１８０】 ｐＵＩＲＮ．ＡＧＳを、プロジェクタイルボンバードメント（ｐｒｏｊｅｃｔ
ｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）方法によりコムギおよびトウモロコシに導入
し、そして選択マーカーを保有するプラスミドの同時ボンバードメントによって
トランスジェニック植物を回復させた。種々の構成成分を試験するための他のベ
クターを、マイクロプロジェクタイルボンバードメントによりトウモロコシに形
質転換する。
【０１８１】 （実施例１２：トランスジェニック植物の分析） （ＡｌｃＡプロモーターからのＧＵＳ発現についての研究） （組織培養において） 植物が、細胞傷害性遺伝子（例えば、バルナーゼ）に結合したプロモーターを
含む構築物での形質転換後に、特にプロモーターが形質転換プロセスのカルス段
階でいくらかの発現を有する場合に、回復可能であるか否かを評価するために、
タバコカルスにおける発現を試験して、発現が、ＧＳＴ２７プロモーターの場合
のように構成的であるか否か、または発現がエタノールの適用により誘導され得
るか否かを決定した。
【０１８２】 標準的な組織培養条件下で生長させた４週齢のＡｌｃ−ＧＵＳ（３５Ｓ−Ａｌ
ｃＲ−ｎｏｓ／ＡｌｃＡ−ＧＵＳ−ｎｏｓ）タバコ植物を用いて、カルスにおけ
るＡｌｃＡプロモーターの発現を、エタノールありおよびなしの両方で試験した
。リーフディスクを生成し、そして３％（ｗ／ｖ）スクロースおよび０．８％（
ｗ／ｖ）Ｂａｃｔｏ寒天、１μｇ／ｍｌ ６−ＢＡＰ、ならびに１００ｎｇ／ｍ
ｌ ＮＡＡホルモンを補充したＭＳ培地上に置いた。何枚かのディスクを、０．
１％（ｖ／ｖ）エタノールを含有するこの培地上に置いた。３週間後、カルス生
成が進行した場合、カルスサンプルを蛍光光度ＧＵＳアッセイのために用いた。
この結果を図４３に示す。
【０１８３】 このＧＵＳレベルは、ＡｌｃＡプロモーターがカルスにおいて漏出性であり、
そしてそのレベルが植物組織培養培地へのエタノールの添加によって増加し得る
ことを示す。それゆえ、トランスジェニックは、細胞傷害性遺伝子を駆動するプ
ロモーターとして、同じ構築物中で回復遺伝子を駆動するＡｌｃＡプロモーター
を用いて回復され得る。
【０１８４】 （温室において） ＡｌｃＡ／Ｒ遺伝子切替は、噴霧、蒸気、または浸漬として適用のいずれかに
よる化学インデューサーエタノールの添加（Ｃａｄｄｉｃｋら，Ｓａｌｔｅｒら
）によってタバコの葉における良好なレベルのレポーターまたは形質遺伝子の誘
導を与えることが実証された。トランスジェニックＡｌｃＡ−ＧＵＳタバコ、脂
肪種子セイヨウアブラナ、およびトマト植物を用いて、花組織における遺伝子誘
導を調べた。
【０１８５】 （タバコ） １）タバコＡｌｃＡ−ＧＵＳタバコ花茎の周囲をプラスチックバッグでシール
し、そして５０ｍｌの５％エタノールを含有する小さなポットをこのバッグの中
側に置いた。３日後、異なる花蕾段階からの葯を収集し、そしてＧＵＳ発現につ
いてアッセイした。結果を図４４に示す。これは、野生型植物、非誘導ＡｌｃＡ
−ＧＵＳ植物、および誘導ＡｌｃＡ−ＧＵＳ植物からの４つの独立した花蕾から
のＧＵＳの値を示す。花蕾を、ｍｍで測定した。そして各棒は５つの葯を表す。
このグラフは、エタノール蒸気処理を受けなかったＡｌｃＡ−ＧＵＳ植物と比較
して、誘導した植物からの葯が、より高レベルのＧＵＳをこの葯に含むことを示
す。
【０１８６】 ２）野生型タバコ植物およびＡｌｃ−ＧＵＳタバコ植物からの花茎を切断し、
そして水、１％エタノール、２％エタノール、または５％エタノールのいずれか
を３００ｍｌ含有するビーカーに入れ、そして温室に２日間置き、その後、蛍光
光度ＧＵＳアッセイのために花蕾から葯を収集した。図４５は、野生型、水処理
Ａｌｃ−ＧＵＳ花茎、および１％エタノール、２％エタノール、または５％エタ
ノール処理Ａｌｃ−ＧＵＳ花茎からの葯を示す、この実験からのＧＵＳデータを
表す棒グラフである。この実験はまた、レポーター遺伝子の発現が、水で処理し
た花において見られたレベルを超えるレベルで葯においてエタノールにより誘導
されたことを実証する。誘導されたＡｌｃＡ−ＧＵＳ葯からのＧＵＳ発現のレベ
ルは、ＭＦＳ１４−ＧＵＳ植物からのＧＵＳ発現のレベルよりも上であった。
【０１８７】 ３）成熟ＡｌｃＡ−ＧＵＳタバコ植物を、温室において２５０ｍｌの水または
５％エタノールのいずれかに根を浸漬させた。野生型および３５Ｓ−ＧＵＳ植物
をまた、エタノールで処理した。２日後、種々のサイズの花蕾からの雌蕊を切り
出し、そしてＧＵＳ活性について染色した。図４６は、水処理Ａｌｃ−ＧＵＳ植
物および５％エタノール処理Ａｌｃ−ＧＵＳ植物からの９〜１０ｍｍの蕾からの
雌蕊を示す。この写真は、エタノール処理が雌蕊におけるＧＵＳの誘導を導いた
ことを明確に実証する。図４７および４８は、また水処理Ａｌｃ−ＧＵＳ植物お
よびエタノール処理Ａｌｃ−ＧＵＳ植物からの、それぞれ、１７〜２２ｍｍの蕾
および３３〜３５ｍｍの蕾からの雌蕊の柱頭／花柱領域を示す。ＧＵＳ染色は、
野生型と類似である水処理植物と比較して、この領域全体に存在する。
【０１８８】 ４）Ａｌｃ−ＣＡＴ植物（３５Ｓ−ＡｌｃＲ−ｎｏｓ／ＡｌｃＡ−ＣＡＴ−ｎ
ｏｓ）をまた試験し、そしてエタノールでの誘導後の花組織におけるレポーター
遺伝子レベルの増加を示した。
【０１８９】 （脂肪種子セイヨウアブラナ） １）脂肪種子セイヨウアブラナ（ＯＳＲ）ＡｌｃＡ−ＧＵＳ植物を、２５０ｍ
ｌの水、１％エタノールまたは２％エタノールのいずれかに０日目および１日目
の両方に根を浸漬させた。次いで、これらの植物からの花サンプルを、最初の誘
導の２日後に採取した。蛍光光度ＧＵＳ分析のために採取したサンプルは、成熟
花（成熟とは、花が完全に開いていたことを示す）からの葯、成熟花からの柱頭
／花柱、未成熟花（花弁が開いていない花蕾）からの葯、未成熟花からの柱頭／
花柱、および子房を含む花雌蕊の最終的な残りであった。
【０１９０】 図４９は、ＧＵＳデータをグラフとして示し、そして左から右へと、水誘導Ａ
ｌｃ−ＧＵＳ、１％エタノール誘導Ａｌｃ−ＧＵＳ、および２％エタノール誘導
Ａｌｃ−ＧＵＳの脂肪種子セイヨウアブラナ植物からの結果を示す。各セクショ
ンにおける最初の２つの棒は、それぞれ、非誘導葯および非誘導柱頭／花柱のＧ
ＵＳレベルを表す。各棒は、３つの反復物を示し、各反復物は、３つの異なる花
からの葯、または８つの異なる花からの柱頭／花柱、または６つの異なる花から
の子房を含む。
【０１９１】 このデータは、水処理脂肪種子セイヨウアブラナをエタノール誘導植物に対し
て比較した場合に、花組織におけるＧＵＳレベルの増加を明確に示す。２％エタ
ノール処理植物で試験した全ての組織は、非誘導レベル、および水処理コントロ
ール植物の両方からのＧＵＳの増加を示す。
【０１９２】 ２）脂肪種子セイヨウアブラナＡｌｃ−ＧＵＳ花を、エタノールでの誘導後に
ＧＵＳ染色に供した。図５０は、誘導前のＡｌｃ−ＧＵＳ花の写真であり、そし
て図５１は、２５０ｍｌの５％エタノールでの根浸漬の２日後の同じ植物からの
花の写真である。これは、この処理が、レポーター遺伝子の誘導を柱頭／花柱領
域、ならびに花糸において導いたことを示す。
【０１９３】 図５２は、萼片および花を除去した未成熟花蕾を示す。右側のエタノール処理
植物は、左側の水処理コントロールと比較した、柱頭／花柱領域におけるＧＵＳ
発現を示す。図５３〜５５は、これのさらなる例である。図５６は、野生型から
の雌蕊切片および水誘導脂肪種子セイヨウアブラナＡｌｃ−ＧＵＳ植物を示す。
図５７は、２％エタノールに２日間根を浸漬した後に花サンプルを採取した植物
からの雌蕊切片を示す。これは、雌蕊領域全体でのＧＵＳの誘導を示す。図５８
は、水処理植物および５％エタノール処理植物からの雌蕊を示す。さらに、化学
薬品のエタノールの適用が、雌性組織におけるＧＵＳの誘導を導いたことが示さ
れる。
【０１９４】 図５９は、実験からの花を示し、ここで、花茎を切断し、そして５％エタノー
ルのビーカー中に入れ、そして２日間置き、その後花序全体をＧＵＳ活性につい
て染色した。青色染色が、花の花糸、萼片、花弁、および柱頭／花柱領域におい
て明らかである。
【０１９５】 （トマト） Ａｌｃ−ＧＵＳトマトの花を、タバコの花についての上記のように、エタノー
ル蒸気を用いて誘導した。誘導の２日後、葯および花粉を染色して、ＧＵＳ発現
を検出した。図６０ａおよび６０ｂにおいて見られ得るように、青色染色が、両
方の組織において観察された。
【０１９６】 （イネ） イネにおけるＡｌｃ切替の誘導性を試験するための初期の実験は、ＧＵＳ活性
についてのアッセイの２日前にエタノール蒸気に曝露したリーフディスクを含む
、水栽培法試験を含む。一旦温室に入れたら、全植物を円錐花序形成／開花期の
前およびその間に１〜５％エタノールに根を浸漬して、花組織におけるＧＵＳ発
現の誘導を調べる。
【０１９７】 （ＧＵＳアッセイ） 花材料を、２〜３００μｌの抽出緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％
サルコシル、１０ｍＭ ｂ−メルカプトエタノール）中で粉砕した。サンプルを
微量遠心分離機中で１５分間回転させ、そして５μｌの上清を、ＢＳＡを標準と
してＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイのために用いた。２０μｌを、抽出緩
衝液および４００μｌのアッセイ緩衝液（１ｍＭ ４−ＭＵＧおよび２０％メタ
ノールを含む以外は抽出緩衝液と同じ）で５分の１に希釈した。１００μｌを採
取し（Ｔ0サンプル）、そして９００μｌの停止緩衝液（０．２Ｍ炭酸ナトリウ ム）に添加し、そして残りを３７℃にて２時間インキュベートし、その後、さら
に１００μｌ（Ｔ2サンプル）を９００μｌの停止緩衝液に添加した。
【０１９８】 サンプルの蛍光を、分光光度計において測定し、そしてＧＵＳをｎＭ ４Ｍ
Ｕ／ｍｇタンパク質／時間で示した。
【０１９９】 （コムギ） 胚盤組織に、ｐＵＩＲＮ．ＡＧＳをボンバードメントし、そして組織をエタノ
ール蒸気に曝露する。ＧＵＳ発現についての染色を２〜３日後に行い、多数の青
色スポットが見られる場合、ＡｌｃＡプロモーターが誘導されるＧＵＳ発現が導
かれることを示す。
【０２００】 得られるトランスジェニックＡｌｃ−ＧＵＳ植物を成熟するまで生長させ、そ
して種子を収集し、誘導性のＧＵＳ発現を子孫植物においてイネについて上記し
たのと同じ方法で決定する。
【０２０１】 （ＧＵＳ組織化学） ＧＵＳ染色について、ＢｌｕｍｅおよびＧｒｉｅｒｓｏｎ（１９９７）のプロ
トコルを用いた。
【０２０２】 （不稔性の調査） １）雄性不稔植物 ａ）カセットＡでの形質転換により作製された胞子体雄性不稔植物を、花粉が
ないこと、または死んだ花粉が存在することにより同定する。種子を、花粉提供
者として野生型タバコを用いて戻し交配により生産する。
【０２０３】 ｂ）カセットＢでの形質転換により作製された配偶体不稔植物を、花粉の生体
染色を用いて同定し、５０％の花粉が不稔性であり、５０％が稔性である。
【０２０４】 ２）雌性不稔植物 カセットＦでの形質転換により作製された胞子体雌性不稔植物を、野生型花粉
と他家受粉する能力がないことにより同定する。カセットＥおよびＧでの形質転
換により作製された回復系植物は、両方の場合、自家受粉し、子孫が生長し、そ
してホモ接合系統がＴ２種子のカナマイシンでの選択による通常の方法において
選択される。
【０２０５】 （稔性の誘導性回復） 胞子体不稔植物と野生型植物との間の交雑の子孫は、導入遺伝子の存在を伴っ
て不稔性が１：１に分離すると期待され、そして増殖の早期段階でＰＣＲ分析に
より選択される。誘導実験を行って稔性の回復を調べる。これらの不稔性植物は
、根の浸漬または噴霧または蒸気の適用によってエタノールで処理されて、関連
組織においてバースターの発現を誘導し得るからである。適切な時期での誘導が
、自家受粉が生じることを可能にし、そしてそれに続く種子生産が容易に評価さ
れ得ることが期待される。ホモ接合性植物を、通常の手段によって得られる子孫
から選択し、そしてホモ接合性回復系植物との交配によって構成的回復を試験す
るために用いる。
【０２０６】 しかし、野生型植物とのＣ５−バルナーゼ．ＡｌｃＡ−バースター植物の戻し
交配、または自家受粉を進行させることは、５０％が完全に稔性であり、そして
５０％がその５０％しか稔性でない花粉を生成する集団の回復をもたらす。しか
し、これらの植物は、エタノール噴霧、根の浸漬、または蒸気処理で誘導されて
バースターを発生中の花粉で発現して自家受粉を可能にし得る。これらの場合の
ホモ接合性植物は１００％不稔性であり、一方、ヘミ接合性植物は５０％不稔性
である。染色により得られた結果の相違は、誘導効率および自家受粉効率につい
て結論を下すのを可能にする。
【０２０７】 （他家受粉による稔性の構成的回復） 雄性回復系植物との雄性不稔植物の交配は、回復系植物からの花粉を（葯は死
んだ花粉のみを含むとはいえ、存在する任意の葯の除去後に）雄性不稔植物の雌
蕊に移すことにより達成される。次いで、受粉した雌蕊に袋をかぶせて、環境中
の野生型または他の花粉により汚染されることを防ぐ。生産される種子を収集す
る。子孫を生長させ、そして花粉の生産を観察および測定する。このようにして
稔性の回復が正常花粉の生産を導く。
【０２０８】 雌性不稔植物の交配は、これらの植物からの花粉を、また、雌性稔性回復系植
物からの葯の除去後に雌性稔性回復系植物の雌蕊に移すことにより達成される。
この花に上記のように袋をかける。生産される種子を収集する。子孫を生長させ
、そして花に袋をかぶせる。これらの植物が自家受粉する能力を観察する。この
ようにして稔性の回復が、自家受粉が生じることを可能にする。同様の方法で、
カセットＥおよびＦ（すなわち、雌性不稔であり、かつ雄性回復系遺伝子を保有
する）での形質転換により生成された植物、ならびにカセットＡおよびＧでの形
質転換（すなわち、雄性不稔であり、かつ雌性回復系遺伝子を保有する）により
生成された植物を分析する。
【０２０９】 本発明の他の改変は、本発明の範囲を逸脱することなく、当業者に明らかであ
る。
【０２１０】
【表５】
【図面の簡単な説明】
本発明は、現在、添付された以下の図に対して参照がなされ得る実施例によっ
てのみ記載される：
【図１】 図１は、ホモ接合で劣性である雄性不稔の雌性親を使用する、第１のハイブリ
ッド種子生産の方法において使用される発現カセットの概略提示を示す。
【図２ａ】 図２ａは、本発明の第１の方法に従う、ホモ接合性で劣性である雄性不稔雌性
親および雌性不稔雄性親由来のＦ１ハイブリッド種子の生産ならびにＦ２世代に
おける分離を示す。
【図２ｂ】 図２ｂは、本発明の第１の方法に従う、ホモ接合性で劣性である雄性不稔雌性
親および雌性不稔雄性親由来のＦ１ハイブリッド種子の生産ならびにＦ２世代に
おける分離を示す。
【図３】 図３は、第２のハイブリッド種子生産プロセスにおいて使用される発現カセッ
トの概略図を示す。
【図４】 図４は、雄性花特異的プロモーターおよび雌性組織特異的プロモーターを使用
する雄性不稔の雌性稔性親植物の作製において使用される、発現カセットの概略
提示を示す。
【図５】 図５は、雄性花特異的プロモーターおよび雌性花特異的プロモーターを使用す
る雌性不稔の雄性親植物の作製において使用される、発現カセットの概略提示を
示す。
【図６ａ】 図６ａは、本発明の第２の方法（Ｆ１ハイブリッド種子の生産およびＦ２子孫
の分離）に従う、両方の胞子体型プロモーターの制御下における雄性不稔の雌性
親植物および雌性不稔の雄性親植物を使用する、Ｆ１ハイブリッド植物の生産を
示す。
【図６ｂ】 図６ｂは、本発明の第２の方法（Ｆ１ハイブリッド種子の生産およびＦ２子孫
の分離）に従う、両方の胞子体型プロモーターの制御下における雄性不稔の雌性
親植物および雌性不稔の雄性親植物を使用する、Ｆ１ハイブリッド植物の生産を
示す。
【図６ｃ】 図６ｃは、本発明の第２の方法（Ｆ１ハイブリッド種子の生産およびＦ２子孫
の分離）に従う、両方の胞子体型プロモーターの制御下における雄性不稔の雌性
親植物および雌性不稔の雄性親植物を使用する、Ｆ１ハイブリッド植物の生産を
示す。
【図７ａ】 図７ａは、本発明の第２の方法（Ｆ１ハイブリッド種子の生産およびＦ２子孫
の分離）に従う、雄性不稔の雌性親植物および雌性不稔の雄性親植物を使用する
、Ｆ１ハイブリッド植物の生産を示す。雄性不稔は、配偶体型プロモーターの制
御下にあり、そして雌性不稔は胞子体型プロモーターの制御下にある。
【図７ｂ】 図７ｂは、本発明の第２の方法（Ｆ１ハイブリッド種子の生産およびＦ２子孫
の分離）に従う、雄性不稔の雌性親植物および雌性不稔の雄性親植物を使用する
、Ｆ１ハイブリッド植物の生産を示す。雄性不稔は、配偶体型プロモーターの制
御下にあり、そして雌性不稔は胞子体型プロモーターの制御下にある。
【図７ｃ】 図７ｃは、本発明の第２の方法（Ｆ１ハイブリッド種子の生産およびＦ２子孫
の分離）に従う、雄性不稔の雌性親植物および雌性不稔の雄性親植物を使用する
、Ｆ１ハイブリッド植物の生産を示す。雄性不稔は、配偶体型プロモーターの制
御下にあり、そして雌性不稔は胞子体型プロモーターの制御下にある。
【図８】 図８は、バイナリー植物形質転換ベクター、ｐＭＯＧ１００６を示す。
【図９】 図９は、バイナリー植物形質転換ベクター、ｐＭＯＧ１００６−ＦＳＥを示す
。
【図１０】 図１０は、クローニングベクター、ｐＦＳＥ４を示す。
【図１１】 図１１は、ノーザン分析による、種々のトウモロコシ組織におけるＧＳＴ発現
を示す。
【図１２】 図１２は、ＧＳＴプロモーターによる、タバコ葉におけるＧＵＳレポーター遺
伝子の誘導性発現を示す。
【図１３】 図１３は、ＧＳＴプロモーターによる、トウモロコシ葉におけるＧＵＳレポー
ター遺伝子の誘導性発現を示す。
【図１４】 図１４は、ＧＳＴプロモーターによる、トウモロコシ雄穂におけるＧＵＳレポ
ーター遺伝子の誘導性発現を示す。
【図１５】 図１５は、トウモロコシ胚乳におけるＧＵＳレポーター遺伝子の誘導性発現を
示す。
【図１６】 図１６は、ｐＰＵＧおよびＲＭＳ−３のクローニングストラテジーを示す。
【図１７】 図１７は、ｐＧＳＴＴＡＫベクターを示す。
【図１８】 図１８は、ＲＭＳ−３ベクターを示す。
【図１９】 図１９は、双子葉植物種における使用のための誘導性ＧＵＳ発現ベクターであ
る、ｐＳＲＮ．ＡＧＳのマップを示す。
【図２０】 図２０は、双子葉植物種における使用のための誘導性ＧＵＳ発現ベクターであ
る、ｐＳＲＮ．ＡＧＳのクローニングストラテジーを示す。
【図２１】 図２１は、単子葉植物種における使用のための誘導性ＧＵＳ発現ベクターであ
る、ｐＵＩＲＮ．ＡＧＳのマップを示す。
【図２２】 図２２は、ボンバードメントによるコムギの形質転換についての時間系列（ｔ
ｉｍｅｌｉｎｅ）を示す。
【図２３】 図２３は、ｐＳＲＮのマップを示す。
【図２４】 図２４は、ｐＡＧＳのマップを示す。
【図２５】 図２５は、イネ形質転換ベクターである、ｐＭＯＧ１００６−ＳＲＮ．ＡＧＳ
のマップを示す。
【図２６】 図２６は、ｐＧＵＮのマップを示す。
【図２７】 図２７は、ｐｄｖｈ４０５のマップを示す。
【図２８】 図２８は、Ｔａｐ１ＡｌｃＲ−ＡｌｃＡＧｌｕＧＵＳＩｎｔｎｏｓを示す。
【図２９】 図２９は、Ｓｔｉｇ１ＡｌｃＲ−ＡｌｃＡＧｌｕＧＵＳＩｎｔｎｏｓを示す。
【図３０】 図３０は、トウモロコシ形質転換ベクターである、Ｚｍ／ＲＭＳ１４を示す。
【図３１】 図３１は、イネ形質転換ベクターである、ｐＭＯＧ１００６−Ｃ５−ＧＵＳを
示す。
【図３２】 図３２は、クローニングベクター、ｐＦＳＥを示す。
【図３３】 図３３は、イネ形質転換ベクターである、ｐＭＯＧ１００６−ＭＦＳ１４−Ｇ
ＵＳを示す。
【図３４】 図３４は、カセットＡである、ＭＦＳ１４バルナーゼ／バルスター−ｎｏｓを
示す。
【図３５】 図３５は、カセットＢである、Ｃ５−バルナーゼ／バルスター−ｎｏｓを示す
。
【図３６】 図３６は、カセットＣである、ＣａＭＶ ３５Ｓ−ＡｌｃＲ−ｎｏｓを示す。
【図３７】 図３７は、カセットＤである、ＡｌｃＡ．Ｇｌｕ１１−バルスター−ｎｏｓを
示す。
【図３８】 図３８は、カセットＥである、ＭＦＳ１４．Ｇｌｕ１１−バルスター−ｎｏｓ
を示す。
【図３９】 図３９は、カセットＦである、Ｓｔｉｇ１−バルナーゼ／バルスター−ｎｏｓ
を示す。
【図４０】 図４０は、カセットＧである、Ｓｔｉｇ１．Ｇｌｕ１１−バルスター−ｎｏｓ
を示す。
【図４１】 図４１は、ＲＭＳ３０を示す。
【図４２】 図４２は、ＲＭＳ３２を示す。
【図４３】 図４３は、誘導されていない、およびエタノールで誘導された野生型タバコカ
ルス、ならびに誘導されていない、およびエタノールで誘導されたトランスジェ
ニックＡｌｃ−ＧＵＳタバコカルスにおけるＧＵＳ発現を示す。
【図４４】 図４４は、誘導されていない、およびエタノール蒸気で誘導された野生型タバ
コカルス、ならびに誘導されていない、およびエタノール蒸気で誘導されたトラ
ンスジェニックＡｌｃ−ＧＵＳタバコ葯におけるＧＵＳ発現を示す。
【図４５】 図４５は、上記のようであるが、水およびエタノールで根を浸漬することによ
る誘導を示す。
【図４６】 図４６は、９〜１０ｍｍのタバコ花芽から誘導されない雌蕊、および誘導され
た雌蕊におけるＧＵＳ発現を示す。
【図４７】 図４７は、１７〜２２ｍｍのタバコ花芽から誘導されない雌蕊、および誘導さ
れた雌蕊におけるＧＵＳ発現を示す。
【図４８】 図４８は、３３〜３５ｍｍのタバコ花芽から誘導されない雌蕊、および誘導さ
れた雌蕊におけるＧＵＳ発現を示す。
【図４９】 図４９は、誘導されない脂肪種子セイヨウアブラナ花、および誘導された脂肪
種子セイヨウアブラナ花におけるＧＵＳ発現を示す。
【図５０】 図５０は、誘導されない脂肪種子セイヨウアブラナ花を示す。
【図５１】 図５１は、根を浸漬誘導した２日後の脂肪種子セイヨウアブラナ雌蕊における
ＧＵＳ発現を示す。
【図５２】 図５２は、エタノール誘導された脂肪種子セイヨウアブラナ花の柱頭および花
柱におけるＧＵＳ発現を示す。
【図５３】 図５３は、エタノール誘導された脂肪種子セイヨウアブラナ花の柱頭および花
柱におけるＧＵＳ発現を示す。
【図５４】 図５４は、エタノール誘導された脂肪種子セイヨウアブラナ花の柱頭および花
柱におけるＧＵＳ発現を示す。
【図５５】 図５５は、エタノール誘導された脂肪種子セイヨウアブラナ花の柱頭および花
柱におけるＧＵＳ発現を示す。
【図５６】 図５６は、野生型および水で誘導されたＡｌｃ−ＧＵＳ脂肪種子セイヨウアブ
ラナ雌蕊を示す。
【図５７】 図５７は、２％エタノールで根を浸漬した２日後のＡｌｃ−ＧＵＳ脂肪種子セ
イヨウアブラナ雌蕊を示す。
【図５８】 図５８は、水で処理されたＡｌｃ−ＧＵＳ雌蕊、および５％エタノールで処理
されたＡｌｃ−ＧＵＳ雌蕊を示す。
【図５９】 図５９は、誘導後の脂肪種子セイヨウアブラナ花を示す。
【図６０ａ】 図６０ａは、Ａｌｃ Ａプロモーターによって駆動される、トマト葯における
ＧＵＳ発現を示す。
【図６０ｂ】 図６０ｂは、Ａｌｃ Ａプロモーターによって駆動される、トマト花粉におけ
るＧＵＳ発現を示す。
【図６１】 図６１は、トウモロコシにおけるＺｍＣ５プロモーター配列をコードするＤＮ
Ａ配列を示す。下線を付したＡは、推定転写開始位置であり、そして太字でかつ
下線を付したＡＴＧは、翻訳開始位置である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 Ｆｅｒｎｈｕｒｓｔ，Ｈａｓｌｅｍｅｒ ｅ，Ｓｕｒｒｅｙ ＧＵ27 ３ＪＥ，Ｕｎ ｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ (72)発明者 ダリー， アラン イギリス国 アールジー42 ６イーティー バークシャー， ブラックネル， ジア ロッツ ヒル リサーチ ステーション内 (72)発明者 ベイリス， マイケル ウイリアム イギリス国 ジーユー27 ３ジェイイー サリー， ハスレメアー， ファーンハー スト（番地なし) Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA04 CA06 CA07 CA19 CB02 CD14 CD17 CD21 CG01 CG05 HA01 4B024 AA08 BA80 DA01 GA25

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ハイブリッド種子を調製する方法であって、該方法は、雄性
    稔性およびホモ接合性劣性雌性不稔である雄性親植物、ならびにホモ接合性劣性
    雄性不稔および雌性稔性である雌性親植物とを間植する工程、他家受粉を可能に
    する工程、およびそれから生産される種子を得る工程を包含する方法であって、
    ここで、各親植物のゲノムＤＮＡは、それに、各親植物の稔性を十分に回復する
    遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の翻訳エンハンサー配列もしくはイント
    ロン配列に必要に応じて作動可能に連結された、外因性化学誘導因子の存在また
    は非存在に対して応答するプロモーター配列を含む遺伝子構築物を組み込んであ
    って、該遺伝子は外部の化学誘導因子の該植物への適用によって発現され、それ
    によって各親の自家受粉を可能にする、方法。
  2. 【請求項２】 前記雌性親植物が、生存可能な花粉の生物発生を有意に破壊
    するかまたは該花粉の生存力を低下させる劣性遺伝子についてホモ接合性である
    、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記雄性親植物が、胚珠、花柱、柱頭の生成もしくは機能、
    または花粉の発芽、付着、水和、花粉管の伸長もしくは誘導を破壊する劣性遺伝
    子に対してホモ接合性である、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記外因性化学誘導因子の存在または非存在に対して応答す
    るプロモーター配列が、Ａｌｃ Ａプロモーター配列またはＧＳＴ−２７プロモ
    ーター配列である、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記親植物が、コムギ、オオムギ、イネ、トウモロコシ、ト
    マト、ヒマワリ、テンサイ、カノーラ、綿実、ダイズおよび他の野菜である、請
    求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記生産されるＦ１ハイブリッド種子が植物を生じ、該植物
    全てが完全な稔性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記生産されるＦ２ハイブリッド種子が不稔性について分離
    する植物を生じ、約２５％が雌性不稔である、請求項１〜６のいずれか１項に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】 前記親の前記不稔性が自然にまたは遺伝学的に操作された変
    異により生じる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 【請求項９】 ハイブリッド種子を生産するための、請求項１〜８のいずれ
    か１項に記載の方法の使用。
  10. 【請求項１０】 請求項１から８のいずれか１項に記載の方法によって生成
    される稔性植物。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の植物の子孫、そのような植物の種子、
    およびそのような子孫。
  12. 【請求項１２】 発現カセットであって、該カセットは、以下： （ａ）雄花特異的プロモーターである第１の遺伝子プロモーター配列； （ｂ）該第１の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結される雄性稔性を破
    壊し得る産物をコードする破壊遺伝子； （ｃ）１つ以上の翻訳エンハンサー配列またはイントロン配列に必要に応じて
    作動可能に連結される雌性組織特異的プロモーター配列である、第２の遺伝子プ
    ロモーター配列； （ｄ）該第２の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結される雌性稔性を回
    復し得る産物をコードする回復遺伝子； （ｅ）１つ以上の翻訳エンハンサー配列もしくはイントロン配列に必要に応じ
    て作動可能に連結される外因性化学誘導因子の存在または非存在に対して応答す
    る、第３の遺伝子プロモーター配列；および （ｆ）該第３の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結される雄性稔性を回
    復し得る産物をコードする回復遺伝子； を含み、これによって、該外因性化学誘導因子の存在が雄性稔性を制御する、 発現カセット。
  13. 【請求項１３】 前記破壊遺伝子が、花粉生産を破壊し得る産物をコードす
    る、請求項１２に記載の発現カセット。
  14. 【請求項１４】 前記破壊遺伝子が、前記植物のタペータム細胞において発
    現され得る産物をコードする、請求項１２に記載の発現カセット。
  15. 【請求項１５】 前記第３の遺伝子プロモーター配列が、Ａｌｃ Ａプロモ
    ーター配列またはＧＳＴ−２７プロモーター配列である、請求項１２〜１４のい
    ずれか１項に記載の発現カセット。
  16. 【請求項１６】 発現カセットであって、該カセットは、以下： （ａ）雌花特異的プロモーター配列である第１の遺伝子プロモーター配列； （ｂ）雌性稔性を破壊し得る産物をコードする破壊遺伝子； （ｃ）１つ以上のエンハンサー配列またはイントロン配列に必要に応じて作動
    可能に連結される雄性組織特異的プロモーター配列である、第２の遺伝子プロモ
    ーター配列； （ｄ）該第２の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結される雄性稔性を回
    復し得る産物をコードする回復遺伝子； （ｅ）１つ以上のエンハンサー配列もしくはイントロン配列に必要に応じて作
    動可能に連結される外因性化学誘導因子の存在または非存在に対して応答する、
    第３の遺伝子プロモーター配列；および （ｆ）該第３の遺伝子プロモーター配列に作動可能に連結される雌性稔性を回
    復し得る産物をコードする回復遺伝子； を含み、これによって、該外因性化学誘導因子の存在が雌性稔性を制御する、発
    現カセット。
  17. 【請求項１７】 前記回復遺伝子が、花粉生産を回復し得る産物をコードす
    る、請求項１６に記載の発現カセット。
  18. 【請求項１８】 前記回復遺伝子が、タペータム細胞において花粉生産を回
    復し得る産物をコードする、請求項１６に記載の発現カセット。
  19. 【請求項１９】 前記第３の遺伝子プロモーター配列が、Ａｌｃ Ａプロモ
    ーター配列またはＧＳＴ−２７プロモーター配列である、請求項１６〜１８のい
    ずれか１項に記載の発現カセット。
  20. 【請求項２０】 ハイブリッド種子を生産する方法であって、該方法は、請
    求項１２〜１５のいずれか１項に記載の発現カセットを第１の植物に組込んで、
    ヘミ接合性雌性親植物を発生させる工程、および請求項１６〜１９のいずれか１
    項に記載の発現カセットを第２の植物に組込んで、ヘミ接合性雄性親植物を発生
    させる工程； 外因性化学誘導因子を形質転換体に供する工程であって、これによって該植物の
    自家受粉を可能にする、工程； 該生じた種子から植物を生長させる工程； 雄性ホモ接合性植物および雌性ホモ接合性植物について選択する工程； 該選択された雄性植物および雌性植物を交雑する工程；ならびに 該生じるハイブリッド種子を得る工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 前記雄性植物が、雄性稔性を回復するホモ接合性優性遺伝
    子を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記雌性植物が、雌性稔性を回復するホモ接合性優性遺伝
    子を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記生産されるＦ１ハイブリッド種子が植物を生じ、該植
    物の葯が、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の発現カセットの第１の遺伝
    子プロモーター配列が配偶体プロモーター配列である生存可能な花粉を約５０％
    生産する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記生産されるＦ１ハイブリッド種子が植物を生じ、該植
    物の全てが完全稔性であり、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の発現カセ
    ットの第１の遺伝子プロモーター配列が胞子体プロモーター配列である、請求項
    ２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記Ｆ２ハイブリッド種子が不稔性について分離される植
    物を生じ、該植物のうち有意な数の植物が雌性不稔である、請求項２０〜２２の
    いずれか１項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 前記雄性ホモ接合体植物および雌性ホモ接合体植物が、外
    因性化学誘導因子の該植物への適用によって増殖および維持され得、それによっ
    て、該植物の自家受粉が可能になる、請求項２０に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記植物が、コムギ、イネ、トウモロコシ、トマト、ヒマ
    ワリ、テンサイ、カノーラ、綿実、ダイズまたは他の野菜である、請求項２０〜
    ２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の、１つ以上の発
    現カセット用いて形質転換された植物組織またはその一部分、および該形質転換
    された植物組織由来の物質。
  29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の組織または物質を含む稔性の完全植物
    。
  30. 【請求項３０】 請求項２９に記載の植物の子孫であって、該子孫が、それ
    らのゲノムに組込まれた、好ましくは安定的に組込まれた、１つ以上の、請求項
    １２〜１９のいずれか１項に記載の発現カセット、または該発現カセットの一部
    分、ならびにそのような植物の種子およびそのような子孫を含む、植物の子孫。
  31. 【請求項３１】 ゲノムが請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の発現カ
    セットを含む、植物。
  32. 【請求項３２】 ゲノムが請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の発現カ
    セットを含む、植物。
  33. 【請求項３３】 請求項３１に記載の植物を請求項３２に記載の植物と交雑
    し、そしてそこから生産されるハイブリッド種子を得ることによって生産される
    、ハイブリッド種子。
  34. 【請求項３４】 ハイブリッド種子を生産するための、請求項２０〜２７の
    いずれかの１項に記載の方法の使用。
  35. 【請求項３５】 請求項１２〜１５または請求項１６〜１９のいずれか１項
    に記載される発現カセットを前記植物のゲノムに組込む工程を包含する、植物を
    形質転換する方法であって、ここで、第３の遺伝子プロモーター配列に作動可能
    に連結される前記回復遺伝子が、前記標的組織において誘導的に発現されるが、
    前記破壊遺伝子が該標的組織においてのみ有効であるように、１つ以上の他の組
    織において構成的に発現され得る、方法。
  36. 【請求項３６】 前記回復遺伝子がカルス組織において構成的に発現される
    、請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記回復遺伝子が雄花構造または雌花構造において誘導的
    に発現される、請求項３５または３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記第３の遺伝子プロモーター配列が、ＧＳＴ−２７プロ
    モーター配列である、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記第３の遺伝子プロモーター配列が、Ａｌｃ Ａプロモ
    ーター配列である、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 図２、６および７のいずれか１つを参照して本明細書中に
    前述されるように、実質的にハイブリッド種子を生産する方法。
  41. 【請求項４１】 図１および３〜５のいずれか１つを参照して本明細書中に
    前述されるような、実質的な発現カセット。
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JP2005522196A (ja) * 2002-03-19 2005-07-28 ユニヴェルシテ リブル ドゥ ブリュッセル 遺伝的に改変された真核細胞又は生物の選択のための毒物／解毒剤遺伝子系

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