CN110199803B - 两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法，包括有效低温累积值的鉴定、有效低温累积效应的响应天数的鉴定和幼穗花粉育性调查等步骤。本发明创新地对不育起点温度、有效低温值与响应天数、日照长短等因素进行综合研究，提出了两系不育系水稻在育性敏感期内，只需每天当中有一定时段的低温诱导，其他时段可以高出临界温度，达到一定的有效低温累积后既可实现转育的有效低温累积效应法则，将有利于对两系不育系水稻育性转换规律的拓展和有效补充，亦将有利于两系不育系繁种、制种地的时空选择，确保两系杂交水稻制种安全或扩大繁种的时空选择范围，促进两系杂交水稻的进一步发展，具有重要的参考价值和良好的应用前景。

Description

两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法

技术领域

本发明属于两系不育系水稻繁殖、杂交制种领域，具体涉及两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法。

背景技术

两系不育系水稻可以一系两用，在特定的光温条件(长日、低温，即低于不育系的不育起点温度)下可以实现自我繁殖，在相反条件下可以实现杂交制种，比三系杂交稻少了一个环节，节约了生产成本；而且两系不育系基本上不受亲源恢保关系的制约，杂交配组自由，有利于更大范围的利用杂种优势。然而，也正是因为这种特殊的育性转换关系(对光温条件的特殊要求)，限制了两系不育系繁种、制种的自由性，从而制约着两系杂交稻的进一步发展。如2001～2002年长江中下游地区8月上旬出现连续低温，使得安徽省两系杂交水稻制种的纯度严重超标，不合格率高达40％(黄明,陈立云.两系杂交水稻制种的安全性问题及其对策[J].作物研究,2006(5):371-375.)；2007年海南异常低温致使两系制种失败，给种子企业造成巨大损失(陈立云,雷东阳,唐文邦,肖应辉.两系法杂交水稻研究和应用中若干问题的思与行[J].中国水稻科学,2010,24(6):641-646)；2016～2017年长江中下游地区异常低温，致使全国许多种子企业的两系杂交制种损失惨重。

目前，生产上均是根据历史气象资料，把两系不育系的育性敏感期安排在不出现连续4天以上低于不育起点温度天气的时期作为安全制种的首选原则。然而这种安排，只考虑敏感期内的日平均温度，且仅以不育系的不育起点温度作为唯一衡量指标。但如前所述，生产实践表明，即使遵循了现有技术中的原则，还是出现了与常规预期不同的情形。

这里所说的异常低温是指日均温高于不育起点温度而每天有数小时(夜间)低于不育起点温度的时段，这种异常低温与不育起点温度的差值，称为有效低温值。因此，两系不育系育性转换，不能只传统地采用日均温这单一的气象资料衡量。针对因短时间内的异常低温所导致的两系不育系育性恢复问题，有必要开展育性转换规律的拓展和深入研究，这对促进两系杂交水稻的进一步发展具有重要的指导意义与价值。

发明内容

本发明的首要目的在于围绕两系杂交水稻在繁制种生产实践过程中遇到异常低温(“打摆子”天气)所出现的育性恢复而造成巨大经济损失的难题，提供一种两系不育系育性转换的有效低温累积效应的鉴定方法，以用于指导两系不育系水稻繁、制种的时空选择。

本发明的另一目的在于提供所述的两系不育系育性转换的有效低温累积效应的鉴定方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

总结近年来在生产实践中所出现的问题，结合发明人8年多的两系水稻育种及研究结果，证实了两系不育系水稻在育性敏感期内的，只需每天当中有一定时段的低温诱导，其他时段可以高出临界温度(日均温高于不育起点温度)，连续4～7天(具体天数视不同低温值、时间长短、不育系品种而不同)，达到一定的有效低温累积，既可以实现转育。发明人把这种现象称为两系不育系育性转换的有效低温累积效应法则。所述的有效低温累积效应法则为系统研究两系不育系育性转换与有效低温累积的相关性，解释两系不育系在日均温高于不育起点温度但又伴有异常低温时段条件下所发生育性恢复的原因。

本发明基于发明人发现的有效低温累积效应法则，提出一种两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法，包括如下步骤：

一种两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法，包括如下步骤：

(1)待测两系不育系水稻播种后进行常规大田肥水管理，生长发育到幼穗分化期第Ⅳ期(雌雄蕊形成期)，将其挖蔸移栽进行后续处理；

(2)有效低温累积值的鉴定：Tc表示两系不育系水稻的不育起点温度，T_△表示有效低温值；将步骤(1)的待测两系不育系水稻在温度T1下处理t1时长，在温度T2下处理t2时长，其中，温度T1＞Tc，温度T2＜Tc，T2＝Tc-T_△，用以模拟敏感期内出现异常低温现象(尤其是夜间低温)，在0～10℃设置若干个T_△处理梯度；在每个T_△处理梯度内设置不同时长的t2处理梯度，且t1+t2+n＝24h，其中，n为0～12h间的任意时长，以T_△＝0为对照；

(3)有效低温累积效应的响应天数的鉴定：按照步骤(2)的T_△处理梯度设置或在其中选择若干个待考察的T_△处理梯度，在每个T_△梯度内分别设置若干不同处理天数的处理组，对步骤(1)的待测两系不育系水稻进行处理，以T_△＝0为对照；

步骤(2)和步骤(3)的顺序可调整；

(4)将经步骤(2)和(3)处理后的两系不育系水稻移回大田继续生长，分别进行幼穗花粉育性调查，所述的幼穗花粉育性调查包括花粉育性镜检获得花粉可染率、不育系套袋自交结实率鉴定。

步骤(2)中所述的T_△梯度可根据需要进行设置，例如，设置7个梯度，T_△＝1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃；梯度之间的温度间隔可根据需要进行调整，例如间隔0.2℃、0.5℃、1℃等均是可行的。

优选的，步骤(2)中所述的T_△处理梯度在1～5℃的范围内进行设置，设置的T_△越高，说明温度越低，当T_△设置太高时，日均温已经趋近不育起点温度之下。

步骤(2)所述的有效低温累积值的鉴定可在自然光照下进行，优选按如下光照设置，以更好地敏感期内模拟异常低温情况下的日照条件：

优选的，步骤(2)中t2优选在7～17h的时长范围内设置；t2梯度可根据需要进行设置，例如，设置6个梯度，步长值为2h。

优选的，步骤(2)中所述的n＝6h。

比如某不育系的不育起点温度为23.0℃(即Tc＝23.0℃)，T_△1＝2.5℃时，若t1＝t2＝9h，则日均温度＝24.06℃；t1＝7h，t2＝11h，则日均温＝23.52℃；t1＝5h，t2＝13h，则日均温＝22.98℃；t1＝3h，t2＝15h，则日均温＝22.44℃。可通过计算公式为

计算有效积温累积值，其中d为处理天数。

优选的，步骤(3)中所述的设置若干组不同处理天数的处理组，例如，设置4天、5天、6天、7天4组不同处理天数的处理组，处理天数之间的间隔时长可根据需要进行调整，例如间隔1天、2天、4天等均是可行的。

所述的不育起点温度Tc可通过文献资料报道获得，或者优选通过如下方法进一步获得在特定光长下精准的不育起点温度Tc：

在特定光长下设置至少4个处理温度梯度，优选4～13个处理温度梯度，分别进行至少4天的光温处理，处理结束后分别进行幼穗花粉育性调查，根据中华人民共和国农业部发布的标准NY/T 1215-2006，花粉育性镜检的花粉可染率≤0.5％，套袋自交结实率≤0.5％，所对应的最高温度为该不育系的不育起点温度，从而获得所述的两系不育系水稻在特定光长下的精准不育起点温度。

优选的，所述的光长在11～15h内选择；更优选的，在11.5～14.5h内选择；最优选为13.5h，该光长最接近生产上两系不育系制种时育性敏感期的实际日照长度。

优选的，每个处理温度梯度的样品数量至少为6株。

更优选的，特定光长下，如11.5h、12.5h、13.5h、14.5h的光温处理设置分别如下所示：

步骤(3)中所述的处理可在自然光照条件下进行。

优选的，步骤(3)中所述的处理组的样品数优选为至少6株。

优选的，步骤(2)或步骤(3)中所述的处理在人工气候培养箱或精准恒温冷水槽中进行。

优选的，步骤(2)或步骤(3)中的每个处理组采用同一分期播种的不育系材料，以进一步保证数据的准确性。若处理数量较大，可进行分批播种处理，例如，每10天播一期，每期种植100个单株，共播10期但不限于10期。

优选的，步骤(4)中所述的花粉育性镜检获得花粉可染率在抽穗开花后进行，所述的不育系套袋自交结实率鉴定在套袋后14天进行。

所述的花粉育性镜检优选在抽穗后连续3天进行。

所述的花粉育性镜检获得花粉可染率的具体步骤为：每天上午取当天即将开花的小穗的上中下各2个颖花，共6个颖花制片；将花药混合置于载玻片上，用镊子轻轻捣碎，滴一滴10g·L^-1浓度的碘-碘化钾溶液染色，去掉药壁后盖好盖玻片，用吸水纸吸去多余的碘-碘化钾溶液；置于10×10倍显微镜下观察，取3个代表性视野观察花粉粒的形状和染色反应，计数每个视野内的花粉可染率。

不育系套袋自交结实率鉴定的具体步骤为：取样后的单穗摘去已开花的颖花，然后进行套袋，让其继续生长自交结实，14天后去掉纸袋，分别统计其自交结实情况：结实率％＝每穗结实数/每穗总粒数×100。

所述的两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法在水稻制种或繁种中的应用。

优选的，所述的应用为两系不育系水稻制种和/或繁种提供时空选择信息：

根据步骤(2)有效低温累积值的鉴定，当花粉可染率和套袋自交结实率均≥0.5％时，所对应T_△处理的t2即为有效低温累积的临界处理时长；

根据步骤(3)有效低温累积效应的响应天数的鉴定，当花粉可染率和套袋自交结实率均≥0.5％时，所对应T_△的处理天数n天(取最低值)为该不育系在有效低温值T_△下的响应天数；比如某不育系在T_△＝2.0℃条件下处理到第4天开始出现育性≥0.5％，则该不育系的有效低温累积效应的响应天数在T_△＝2.0℃条件下为4天；

在进行制种时，即使日均温高于不育起点温度时，亦需避开连续n天且每天有t2时长以上温度低于(Tc-T_△)的天气；繁种则相反。

本发明提供了一种两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法，创新地对不育起点温度、有效低温值与响应天数、日照长短等因素进行综合研究、考虑，可用于对有效低温累积效应进行深入和系统研究，理论方面，将有利于对两系不育系水稻育性转换规律的拓展和有效补充；生产实践方面，将有利于两系不育系繁种、制种地的时空选择(制种上要避开这种有效低温累积存在的时空范围；反之，繁殖时可以巧妙利用，以扩大时空选择范围)，促进两系杂交水稻的进一步发展。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

目前，两系杂交水稻的制种都是根据母本即两系不育系的不育起点温度和制种地的历史气象资料来安排播种期。比如长江中下游地区，一般选择将两系不育系育性敏感期安排在8月中下旬，历史气象资料表明该时间段的日平均气温维持在不育系的不育起点温度之上。然而残酷的历史事实表明，长江中下游地区的两系制种失败时有发生，均是因为8月中下旬的育性敏感期出现了异常低温。比如1999年的南京、武汉等地出现连续8天以上的日均温23.5℃左右低温天气、2016～2017年长沙、南京、武汉等地也连续出现异常低温，气温在23.5～25.0℃之间，其中2017年8月下旬出现了连续4天日均温在22.5℃左右的低温天气。上述异常低温，导致两系不育系的育性发生转育而自交结实，严重影响了杂交稻的纯度，造成制种企业损失惨重。生产上使用的两系不育系，其不育起点温度基本都在23.0℃～23.5℃左右，个别不育系为22.5℃左右(比如“C815S”、“株1S”等)。除2017年8月下旬南京的异常低温属于日均温低于不育系的不育起点温度的情况以外，其他的异常低温，其日均温还是略高于不育系的不育起点温度。这么说来，单一用不育系的不育起点温度是无法解释这一现象的(日均温低于不育起点温度才会使不育系发生育性转换)。

目前的现有技术及生产实践忽略了不育系育性转换对异常低温天气(但日均温高于不育起点温度)的夜间低温累积量的响应，这可能就是问题的根源所在。本发明提出的两系不育系育性转换的有效低温累积效应，能对上述现象做出合理解释。两系不育系的育性转换，不一定要求育性敏感期内的日均温都低于不育系的不育起点温度，只需每天当中有一定低于不育起点温度的时间段，并达到一定的天数累积，既可以使不育系发生育性转换，这就是有效低温累积效应。

本发明的优点在于，为两系不育系有效低温累积效应提供了一种鉴定方法，能让制种单位或个人，根据不育系的有效低温累积效应，结合历史气象资料，合理选择制种时空，避开上述异常低温的时段，而不要单一采用日均温与该不育系的不育起点温度做衡量指标，以确保两系杂交水稻制种安全。

此外，本发明的优点还在于，有效扩大两系不育系的繁殖的时空选择范围。一般来自全国的两系不育系单位和个人，都选择海南三亚(比如陵水、乐东等地)作为南繁基地，或者说以陵水为分界岭，以南地区才是两系不育系的最佳南繁地区，这是行内公认公知的。但是在陵水以北的万宁市，发明人连续6年在万宁市东兴农场基地均成功实现繁殖。只要安排不育系敏感期出现在2月上旬前后；根据2011年至2016年的历史气象资料，该段时间夜间低温在20.0～23.0℃左右，白天温度浮动在24.0～28.0℃之间，有短暂几日29.0～30.0℃(发明人每年实测)，日均温(23.5℃左右)在不育系的不育起点温度上下浮动，根据不育系育性转换的有效低温累积效应法则，两系不育系是可以实现育性转换的。因此，巧妙地利用有效低温累积效应，对两系不育系的繁殖有利；实现更科学地指导两系不育系水稻繁、制种的时空选择。

附图说明

图1是不同有效低温值及处理天数的“航93S”花粉可染率的结果分析图。

图2是不同有效低温值及处理天数的“培矮64S”花粉可染率的结果分析图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

如下实施例中所用的两系不育系水稻“培矮64S”的品种权号：CNA19990001.9，可以向育种单位湖南杂交水稻研究中心购买获得；申请人就两系不育系水稻“航93S”进行了植物新品种的申请，审批机关已予以公告，品种权受理公告号为CNA024071E(公告日期2019-01-01)，申请人保证自本专利申请的申请日起二十年内向公众提供该生物材料。

实施例1两系不育系水稻“航93S”的育性转换的有效低温累积效应鉴定

(一)分期播种，每隔10天播一期。2018年3月1日播第一期，3月11日播第二期，依此类推，至5月30日播完第十期；每期种植100个单株，按常规大田肥水管理。

由于本实施例设计的全套光温处理数是107个，累积需要处理504个单株，根据试验条件，一般不可能一次性完成所有处理(人工气候箱或者精准恒温冷水槽数量限制)，需要分批处理。

(二)当不育系水稻生长发育到幼穗分化期第Ⅳ期(雌雄蕊形成期)，将其挖蔸移至人工气候培养箱或精准恒温冷水槽进行低温处理，每个处理6个单株。

1、不育起点温度的精准鉴定

光温设置参考农业部部颁标准(NY/T1215-2006)并稍作修改，具体设置如表1所示，采用人工气候培养箱处理；温度设置均为恒温，光照强度分30,000Lx(昼)和0Lx(夜)两档。

不育系不育起点温度的判断依据标准：表1中各处理中，花粉育性镜检的花粉可染率≤0.5％，套袋自交结实率≤0.5％，所对应的最高温度为该不育系的不育起点温度(NY/T1215-2006)。

表1不育起点温度精准鉴定的光温组合处理设置(共31个处理)

(1)第一期播种的“航93S”于2018年5月22日进入幼穗分化第Ⅳ期，选择长势一致的单株，按照表1的设置，先对11.5h的4个温度设置和12.5h的5个温度设置分别进行人工气候箱处理4天，每处理6个单株。处理结束后，标记有效处理单穗(叶枕距±1cm的单穗)并移回大田种植，在自然条件下正常生长。

(2)按照(1)中的方法，对第二期(2018年6月1日进入幼穗分化Ⅳ期)挖蔸进行表1中13.5h的9个温度处理设置进行分别处理。

(3)按照(1)中的方法，对第三期(2018年6月10日进入幼穗分化Ⅳ期)挖蔸进行表1中14.5h的13个温度处理设置进行分别处理。

(4)上述(1)、(2)、(3)处理结束并已标记好的单穗，进行幼穗花粉育性调查。

花粉育性镜检：抽穗后连续3天进行花粉育性镜检，每天上午取当天即将开花的小穗的上中下各2个颖花，共6个颖花制片；将花药混合置于载玻片上，用镊子轻轻捣碎，滴一滴10g·L^-1浓度的碘-碘化钾溶液染色，去掉药壁后盖好盖玻片，用吸水纸吸去多余的碘-碘化钾溶液；置于10×10倍显微镜下观察，取3个代表性视野观察花粉粒的形状和染色反应，计数每个视野内的花粉可染率。

不育系套袋自交结实率鉴定：取样后的单穗摘去已开花的颖花，然后进行套袋，让其继续生长自交结实。14天后去掉纸袋，分别统计其自交结实情况：结实率％＝每穗结实数/每穗总粒数×100。

(5)对上述(4)的调查结果整理

如表2所示，两系不育系水稻“航93S”在光长为11.5h时，不育起点温度为23.5℃；在光长为12.5h、13.5h和14.5h时，不育起点温度分别为23.5℃、23.0℃和22.9℃。

表2“航93S”不育起点温度鉴定的光温处理下的育性(花粉可染率和自交结实率)调查结果

2、“航93S”育性转换的有效低温累积效应的鉴定

采用人工气候培养箱处理，设置一天当中有t1小时温高于不育起点温度(Tc)，t2小时温度低于Tc，用以模拟敏感期内出现异常低温现象(尤其是夜间低温)，Tc表示该不育系的不育起点温度；T_△表示有效低温值(即t2的处理温度与Tc的差值)，设置7个档次：T_△＝1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃。其中t2的时间段从7到17h不等(步长值为2.0h，共6个设置)，t1+t2+6h＝24h；结合T_△、t1和t2的设置，共42个处理。表3右侧的光照设置(模拟日照)与温度处理设置不同步，相互独立，互不干扰。

上述步骤(5)中已得知不育系“航93S”的在光长为13.5h时(此光长最接近生产上两系不育系制种时育性敏感期的实际日照长度)的不育起点温度为23.0℃，接下来是基于不育起点温度的有效低温累积效应的鉴定，分为有效低温累积值的鉴定和有效低温累积效应的响应天数的鉴定两大部分。具体设置见表3。

表3一天当中有效低温累积的光温组合处理设置

注：Tc代表不育系的不育起点温度；T_△代表有效低温值(即实际处理温度T与Tc的差值)。t₁，t₂分别代表一天当中对应温度的处理时间，同时满足t₁+t₂+6＝24(h)。

设置一天当中有t1小时温高于不育起点温度(Tc)，t2小时温度低于Tc，用以模拟敏感期内出现异常低温现象(尤其是夜间低温)，Tc表示该不育系的不育起点温度；T_△表示有效低温值(即Tc与t2的处理温度的差值)，设置7个档次：T_△＝1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃。其中t2的时间设置为7h、9h、11h、13h、15h、17h(共6个设置)，根据t1+t2+6h＝24h，对应t1的时间设置分别为11h、9h、7h、5h、3h、1h。结合T_△、t1和t2的设置，共42个处理，每个处理设置3个重复，取平均值。

按t1＝11h、9h、7h、5h、3h、1h分成6组处理，每组处理含T_△＝1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃(共7个设置)。为了数据的准确性，每组处理只用一个分期播种的不育系材料，即第四期分期播种的用于t1＝11h的设置、第五期的用于t1＝9h的设置、第六期的用于t1＝7h的设置，以此类推，第九期播种的用于t1＝1h的设置。处理结束后的植株安排及调查均按“1、不育起点温度的精准鉴定”的步骤(4)执行，其调查结果列于表4。

表4“航93S”有效低温累积效应表(光长13.5h，不育起点温度23.0℃，处理7天)

“航93S”有效低温累积值的计算。

以t1＝11h，t2＝7h为例，T△＝2.5℃时，表示夜间以低于不育起点温度2.5℃(即23.0-2.5＝20.5℃)处理t2即7小时，对应的有效积温累积值为ΣT_△＝T_△*t2*7d/24h＝5.10(℃·d)，日均温＝{6h*25℃+t1*26℃+t2*(Tc-T_△)}/24h＝24.15℃；同样的方法计算T_△＝2.0℃时，ΣT_△＝4.08(℃·d)，日均温为24.29℃，具体有效低温累积值列于表4。

从表4可以看出，42个处理中，只有19个处理的日均温低于“航93S”的不育起点温度(23.0℃，13.5h)，这种情况下，“航93S”的自然都会发生育性转换；传统上，在两系不育系制种时已经避开了育性敏感期内的出现这种异常低温天气。但是，另有23个处理的日均温高于不育起点温度，而这23个处理中，有育性转换的处理占了18个，即在日均温高于不育起点温度的情况下，联系出现一天当中有一定时间段的有效低温出现，不育系也可能出现育性转换，这就是本发明所述的有效低温累积效应，这也是近年来生产上两系杂交稻制种失败的主要原因之一。

3、有效低温累积效应的响应天数鉴定

当第十期播种的“航93S”生长发育到幼穗分化期第Ⅳ期(2018年8月13日进入幼穗分化Ⅳ期)，将其挖蔸移至精准恒温冷水槽进行如下处理：将有效低温值T_△设置为6个梯度，恒温处理：0℃(对照)、1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃(实际处理温度为：不育起点温度-T_△，即23.0℃-T_△)，每个梯度分别处理4d、5d、6d、7d，共24个处理，每个处理6个单株。采取自然光照，实际光照时长约13.5h，从处理开始后第4d、5d、6d、7d开始陆续将有效处理的3个单株移回大田继续生长，按“1、不育起点温度的精准鉴定”中步骤(4)的方法进行育性调查，其结果列于表5。

表5不同有效低温累积在不同有效处理天数处理下花粉可染率(％)，13.5h

结果证实“航93S”育性转换的有效低温累积效应是存在的，但是需要一定的响应天数或者说要达到一定的有效低温累积值。如表5所示，有效低温T_△＝0℃(对照)时，处理4～7天，“航93S”花粉都是不育的，可染率为0；T_△＝1.0℃时，处理7天才出现8.79％的花粉可染率；T_△＝1.5℃、2.0℃、2.5℃时，均从处理第6天才开始出现花粉转育，第7天的花粉可染率更高；T_△＝3.0℃时，花粉育性从处理第5天开始转育，花粉可染率为1.25％，到第7天时达到最高，为44.30％。由图1可以看出，随着有效低温值和处理天数的增加，“航93S”的花粉育性随之上升。

4、总结及其生产实践指导意义

由表4和表5结果可以看出，“航93S”在杂交制种时的育性敏感期，即使日均温高于不育起点温度23.0℃，也不能出现连续7天且每天有13h以上低于22.0℃或者9h以上低于21.5℃或者7h以上低于21.0℃的低温时段的天气，否则会有育性转换的风险。生产上应该根据当地历史气象资料，把“航93S”的育性敏感期安排在没有上述异常低温天气的时段。反之，在陵水以北的万宁市，两系不育系的繁殖可以延迟到4月～5月收种，即不育敏感期可以安排在2月上旬前后(该段时间虽然日均温略高于不育起点温度，但是夜间低温符合有效低温累积效应)，发明人连续6年的成功繁殖已经实践证实了这点。

实施例2两系不育系水稻“培矮64S”的育性转换的有效低温累积效应鉴定

鉴定方法：分期播种、光温设置及植株处理与调查等均按实施例1所述的方法进行。

鉴定结果：

(1)“培矮64S”的不育起点温度的精确鉴定

按照实施例1中“1、不育起点温度的精准鉴定”的步骤(4)的处理，鉴定结果如表6所示，不育系“培矮64S”在光长为13.5h时的不育起点温度为24.0℃(比“航93S”高1.0℃)。

表6“培矮S”不育起点温度鉴定的光温处理下的育性(花粉可染率和自交结实率)调查结果

(2)“培矮64S”育性转换的有效低温累积效应及其有效低温值

由表6已得知不育系“培矮64S”在光长为13.5h时(此光长最接近生产上两系不育系制种时育性敏感期的实际日照长度)的不育起点温度为24.0℃，按实施例1中所述方法，“培矮64S”育性转换的有效低温累积效应鉴定结果列于表7。以t1＝11h，t2＝7h为例，T_△＝2.5℃时，表示夜间以低于不育起点温度2.5℃(即24.0-2.5＝21.5℃)处理t2即7小时，对应的有效积温累积值为ΣT_△＝T_△*t2*7d/24h＝5.10(℃·d)，日均温＝{6h*25℃+t1*26℃+t2*(Tc-T_△)}/24h＝24.44℃；同样的方法计算T_△＝2.0℃时，ΣT_△＝4.08(℃·d)，日均温为24.58℃(表7)。

表7“培矮64S”有效低温累积效应表(光长13.5h，不育起点温度24.0℃，处理7天)

(3)“培矮64S”育性转换有效低温累积效应的响应天数

按实施例1中所述的方法进行，其结果列于表8。如表8和图2所示，“培矮64S”育性敏感期，有效低温T_△＝0℃(对照，即“培矮64S”的不育起点温度：24.0℃)时，处理4～7天，“培矮64S”花粉都是不育的，可染率为0；T_△＝1.0℃(即处理温度为23.0)时，处理6天才出现8.79％的花粉可染率；T_△＝1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃(即处理温度分别为：22.5℃、22.0℃、21.5℃、21.0℃)时，均从处理第5天才开始出现花粉转育，并随处理天数的增加逐步升高，第7天达到最高值。由图2可以看出，随着有效低温值和处理天数的增加，“培矮64S”的花粉育性随之上升。

表8不同有效低温累积在不同有效处理天数处理下花粉可染率(％)，13.5h

(4)总结及其生产实践指导意义

从表7可以看出，42个处理中，有28个处理的日均温都在“培矮64S”的不育起点温度(24.0℃，13.5h)之下，“培矮64S”都发生了不同程度的育性转换，这是可以用不育起点温度来解释，即不育系敏感期内的日均温低于不育起点温度时，不育系将发生育性转换。但是，另有14个处理的日均温高于“培矮64S”的不育起点温度(24.0℃，13.5h)，除T_△＝1.0℃、t1＝11h、t2＝7h(日均温＝24.48℃)之外，其余处理条件下，“培矮64S”仍然发生了育性转换，这就是育性转换的有效低温累积效应所导致的。结合“培矮64S”育性转换有效低温累积效应的响应天数鉴定结果，我们建议“培矮64S”在杂交制种时的育性敏感期，即使日均温高于不育起点温度24.0℃(一般自然光照条件在13.5h左右)，不能出现连续5天以上日均温低于24.0℃或者连续7天且每天有9h以上低于23.0℃低温时段的天气，否则会有育性转换的风险。生产上应该根据当地历史气象资料，把“培矮64S”的育性敏感期安排在没有上述异常低温天气的时段。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)待测两系不育系水稻播种后进行常规大田肥水管理，生长发育到幼穗分化期第Ⅳ期，即雌雄蕊形成期，将其挖蔸移栽进行后续处理；

(2)有效低温累积值的鉴定：Tc表示两系不育系水稻的不育起点温度，T_Δ表示有效低温值；将步骤(1)的待测两系不育系水稻在温度T1下处理t1时长，在温度T2下处理t2时长，其中，温度T1＞Tc，温度T2＜Tc，T2＝Tc-T_Δ，在0～10℃设置若干个T_Δ处理梯度；在每个T_Δ处理梯度内设置不同时长的t2处理梯度，且t1+t2+n＝24h，其中，n为0～12h间的任意时长，以T_Δ＝0为对照，T_Δ处理梯度和梯度之间的温度间隔、t2处理梯度均可根据需要进行设置；

通过计算公式为

计算有效低温累积值，其中d为处理天数；

(3)有效低温累积效应的响应天数的鉴定：按照步骤(2)的T_Δ处理梯度设置或在其中选择若干个待考察的T_Δ处理梯度，在每个T_Δ梯度内分别设置若干不同处理天数的处理组，对步骤(1)的待测两系不育系水稻进行处理，以T_Δ＝0为对照，处理天数和处理天数之间的间隔时长均可根据需要进行调整；

步骤(2)和步骤(3)的顺序可调整；

(4)将经步骤(2)和(3)处理后的两系不育系水稻移回大田继续生长，分别进行幼穗花粉育性调查，所述的幼穗花粉育性调查包括花粉育性镜检获得花粉可染率、不育系套袋自交结实率鉴定；

所述的不育起点温度Tc可通过文献资料报道获得，或者通过如下方法获得在特定光长下精准的不育起点温度Tc：

在特定光长下设置至少4个处理温度梯度，分别进行至少4天的光温处理，处理结束后分别进行幼穗花粉育性调查，花粉育性镜检的花粉可染率≤0.5％，套袋自交结实率≤0.5％，所对应的最高温度为该不育系的不育起点温度，从而获得所述的两系不育系水稻在特定光长下的精准不育起点温度；

步骤(3)中所述的处理组的样品数为至少6株；

所述的花粉育性镜检获得花粉可染率的具体步骤为：每天上午取当天即将开花的小穗的上中下各2个颖花，共6个颖花制片；将花药混合置于载玻片上，用镊子轻轻捣碎，滴一滴10g·L^-1浓度的碘-碘化钾溶液染色，去掉药壁后盖好盖玻片，用吸水纸吸去多余的碘-碘化钾溶液；置于10×10倍显微镜下观察，取3个代表性视野观察花粉粒的形状和染色反应，计数每个视野内的花粉可染率；

不育系套袋自交结实率鉴定的具体步骤为：取样后的单穗摘去已开花的颖花，然后进行套袋，让其继续生长自交结实，14天后去掉纸袋，分别统计其自交结实情况：结实率＝每穗结实数/每穗总粒数×100％。

2.根据权利要求1所述的两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法，其特征在于，所述的处理温度梯度为4～13个处理温度梯度；

每个处理温度梯度的样品数量至少为6株；

步骤(4)中所述的花粉育性镜检获得花粉可染率在抽穗开花后进行，所述的不育系套袋自交结实率鉴定在套袋后14天进行。

3.根据权利要求1所述的两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法，其特征在于，在特定光长11.5h、12.5h、13.5h、14.5h的光温处理设置分别如下所示：

所述的花粉育性镜检在抽穗后连续3天进行。

4.根据权利要求1所述的两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法，其特征在于，所述的特定光长为13.5h；

步骤(2)中所述的T_Δ处理梯度设置为T_Δ＝1.0℃、1.5℃、2.0℃、2.5℃、3.0℃、3.5℃、4.0℃；

步骤(2)中所述的t2处理梯度设置为7h、9h、11h、13h、15h、17h；

步骤(3)中所述的处理在自然光照条件下进行。

5.根据权利要求1所述的两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)所述的有效低温累积值的鉴定可在自然光照或如下光照设置进行：

步骤(3)中所述的不同处理天数的处理组的设置为：处理4天、处理5天、处理6天、处理7天4组。

6.根据权利要求1所述的两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中所述的n＝6h；

步骤(2)或步骤(3)中所述的处理在人工气候培养箱或精准恒温冷水槽中进行；

步骤(2)或步骤(3)中的每个处理组采用同一分期播种的不育系材料。

7.权利要求1-6任一项所述的两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法在水稻制种或繁种中的应用。

8.根据权利要求7所述的两系不育系水稻育性转换有效低温累积效应的鉴定方法在水稻制种或繁种中的应用，其特征在于，所述的应用为两系不育系水稻制种和/或繁种提供时空选择信息：

根据步骤(2)有效低温累积值的鉴定，当花粉可染率和套袋自交结实率均≥0.5％时，所对应T_Δ处理的t2即为有效低温累积的临界处理时长；

根据步骤(3)有效低温累积效应的响应天数的鉴定，当花粉可染率和套袋自交结实率均≥0.5％时，所对应T_Δ的最小处理天数n天为该不育系在有效低温值T_Δ下的响应天数；

在进行制种时，即使日均温高于不育起点温度时，亦需避开连续n天且每天有t2时长以上温度低于T2的天气；繁种则相反。

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