JP2002504335A - 花粉特異的プロモーター - Google Patents

花粉特異的プロモーター

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Abstract

(57)【要約】 トウモロコシ中のＺｍＣ５遺伝子のプロモーター配列、または花粉においてプロモーターとして作用するその改変体もしくはフラグメント。このプロモーターのＤＮＡ配列を、図５に示す。本発明のプロモーター配列を含む、発現カセットおよび発現系ならびに形質転換方法、形質転換植物をまた請求する。これらの核酸は、とりわけ、雄性不稔性植物および／またはハイブリッドの産生、ならびに花粉の形質転換に使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、花粉に特異的なプロモーター配列、プロモーターを含む構築物およ
びトランスジェニック植物細胞および植物、ならびにこのプロモーターを使用し
て花粉を形質転換し、そして植物における稔性を制御する方法に関する。
【０００２】 ２つの植物からの所望の遺伝的形質を単一の植物に導入するために、例えば、
種々の交配育種またはハイブリッド交配育種は、伝統的なアプローチを提示する
。整合的なハイブリッドを確実に得るために、親植物の自家受粉が起こらないこ
とを確実にする必要がある。
【０００３】 このことは、１つの親系統が雄性不稔性であることを確実にすることによって
達成され得る。雄性不稔性を産生するための様々な技術が公知であり、そして当
該分野で提唱されてきた。１つの方法は、雌性親植物の葯または雄穂の、手動ま
たは機械的のいずれかによる除去を含む。次いで、この植物は、雄親からの花粉
によってのみ受粉され得、それによりその子孫はハイブリッドである。しかし、
このようなプロセスは、労働集約的であり、そして全体的に信頼性が無い。なぜ
なら、いくつかの雌性植物は、脱雄穂プロセスを逃し得るか、またはいくつかの
場合、この植物は、脱雄穂が完了した後に二次雄穂を発生するからである。さら
に、この系において、雄性親は自家受粉が可能であり、それゆえ、ハイブリッド
種子の収穫の容易さを可能にするために、雄性親および雌性親を物理的に別々に
する必要がある。このことは、トウモロコシに適切な植え付け作業を妨害する。
なぜなら、花粉は軽く、そして大量に産生されるからである。しかし、このアプ
ローチは、より重い花粉を有する種に対して、ならびに雄性および雌性の花器官
が１つの花内に含まれる種（例えば、コムギ、イネ）においては適用不能である
。
【０００４】 花粉産生を防止する化学的方法もまた公知である。米国特許第４，８０１，３
２６号は、植物または土壌に適用されて花粉産生を防止し得る化学物質を記載す
る。しかし、この場合も、このような技術は労働集約的であり、そして全体的に
信頼性が無い。環境に対して付随する負荷を伴って、受粉が起こらないことを確
実にする適切な時間間隔で、十分な化学物質が適用されることが必須である。さ
らに、これらの化学物質は非常に高価である。
【０００５】 遺伝子操作が代替法として提供されており、それによって植物において雄性不
稔性が産生され得、維持され得、そして／または続いて回復され得る。
【０００６】 受粉が外部化合物の適用または利用可能性に基づいてスイッチを入れられるか
または切られることを可能にする誘導性プロモーターを含む系が記載されている
。例えば、ＷＯ９０／０８８３０は、花粉生合成を破壊するタンパク質を発現す
る遺伝子配列のカスケードによる、植物における雄性不稔性の誘導を記載する。
ＷＯ９３／１８１７１は、カルコンシンターゼ（ｃｈｓ）を誘導的に発現し、そ
して内因性ｃｈｓ遺伝子を「ノックアウト」することによって不稔性にされる雄
性不稔性植物に稔性を回復させる、ＧＳＴプロモーターの使用を記載する。
【０００７】 異なるアプローチが、ＷＯ９３／２５６９５（ＰＧＳ）に記載された。これは
、タペータム（ｔａｐｅｔａｌ）細胞において花粉致死遺伝子であるバルナーゼ
を発現する、タペータム特異的プロモーターの使用に基づく。これらの細胞は、
花粉発生に重要であるので花粉産生を破壊する。回復遺伝子であるバルスター（
ｂａｒｓｔａｒ）は、稔性を回復させるために使用され得る（Ｍａｒｉａｎｉら
、Ｎａｔｕｒｅ，第３５７巻：３８４−３８７）。
【０００８】 制御可能な様式で、花粉における花粉産生に直接的に影響を与える遺伝子を発
現することの利点が存在する。適切には、稔性は、所望である場合に回復される
べきである。
【０００９】 雄性不稔性を遺伝子操作するための系の成分は、花粉の産生または発生が依存
する花粉または組織のいずれかにおける発現を、特異的に駆動するプロモーター
の有効性である。
【００１０】 花粉および発芽中の花粉において特異的または高度に発現される、特徴付けら
れた遺伝子の多くは、細胞壁代謝における役割を果たすようなタンパク質をコー
ドし、例えば、このタンパク質は、以下のような、ペクチン分解に関与する酵素
をコードする遺伝子に対する相同性を有するものである：ポリガラクツロナーゼ
（ＳＭ Ｂｒｏｗｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（１９９０）２：２６３−２７４、
ＳＪ Ｔｅｂｂｕｔｔら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９４）２５：２
８３−２９９）、ペクチン酸リアーゼ（ＨＪ Ｒｏｇｅｒｓら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ ２０：４９３−５０２（１９９２）、ＲＡ Ｗｉｎｇら、Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １４：１７−２８（１９８９））、およびペクチンメチル
エステラーゼ（ＰＭＥ）（ＪＨ Ｍｕら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２５： ５３９−５４４（１９９４））。
【００１１】 花粉において高度に発現される他の遺伝子としては、以下をコードする遺伝子
が挙げられる：細胞骨格タンパク質（Ｉ．Ｌｏｐｅｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：７４１５−７４２０（１９９６）、ＨＪ Ｒｏｇ
ｅｒｓら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．４：８７５−８８２（１９９３）およびＣＪ Ｓｔａ
ｉｇｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．４：６３１−６４１（１９９３））、推定アスコ ルビン酸オキシダーゼ、Ｋｕｎｉｔｚタンパク質インヒビター、およびその機能
が公知の遺伝子に対する相同性によって推測され得ない多くの他のタンパク質。
このような遺伝子の時間的な発現が研究されており、そして多くは、小胞子生成
において後期に発現されて、成熟小胞子母細胞において最大に達することが見出
されている。いくつかの場合、花粉管における連続した発現もまた、実証されて
いる（ＡＫ Ｋｏｎｏｎｏｗｉｃｚら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４；５１３−５ ２４（１９９２））。これらの遺伝子は、「後期遺伝子」と称される。この段階
での発現の大部分は、生殖細胞よりはむしろ栄養細胞からであり、そしてこれら
の「後期」遺伝子の大部分は、栄養核から転写されるようである：しかしこのこ
とは、１つの「後期」遺伝子について実証されているのみである（Ｄ．Ｔｗｅｌ
ｌ，Ｐｌａｎｔ Ｊ２：８８７−８９２（１９９２））。葯において発現される
遺伝子の個別のクラスは、異なる発現プログラム（ｐｒｏｇｒａｍｍｅ）を有し
、四分子段階のすぐ後にまず検出可能であり、そして花粉成熟の前の発現におい
て適切に衰えることが見出されている。これらの「初期」遺伝子の主要な役割は
、花粉管生長よりもむしろ、小胞子の分化および発達の間であり得る。さらに、
米国特許第５，０８６，１６９号（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ）は、トウモロコシ
由来の第１の花粉特異的プロモーターの単離を記載する。
【００１２】 本出願人らは、花粉組織においてのみ特異的に発現されるさらなるプロモータ
ーを単離した。このプロモーターは、トウモロコシから単離された「後期」花粉
発現遺伝子、ＺｍＣ５に由来する。
【００１３】 従って、本発明の第１の局面に従って、トウモロコシにおけるＺｍＣ５遺伝子
のプロモーター配列を含む組換え核酸、またはその改変体もしくはフラグメント
が提供され、これは、花粉においてプロモーターとして作用する。
【００１４】 本明細書中で使用される用語「フラグメント」は、プロモーター活性を保持す
る塩基配列の１つ以上の領域を含む。ここでフラグメントは１つ以上の領域を含
み、それらはともに直接連結され得るか、またはさらなる塩基によって間隔を空
けられ得る。
【００１５】 発現「改変体」は、本発明を参照して、核酸配列からまたは核酸配列に１つ以
上のヌクレオチドの任意の置換、改変、修飾、置き換え、欠失または負荷を意味
し、得られた配列は花粉プロモーターの発現を示す。この用語はまた、核酸配列
に実質的にハイブリダイズし得る配列を含む。
【００１６】 本明細書中で使用される、発現「ＺｍＣ５遺伝子」は、本明細書中に記載され
る５６３アミノ酸配列をコードする、トウモロコシの遺伝子をいう。この配列を
コードするｃＤＮＡ配列は、ＥＭＢＬ Ｙ１３２８５で定義される。
【００１７】 本発明のプロモーター配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａに、ＮＣＩＭＢ
４０９１５として１９９８年１月２６日に寄託されたクローンに含まれる。こ れは、本明細書において以下に記載されるものに由来するＳａｌＩフラグメント
である。このプロモーター領域は、本明細書において以下の図１に示される、ト
ウモロコシのＺｍＣ５遺伝子の転写開始部位の上流の配列の約２ｋｂからなる領
域内にある。
【００１８】 本発明の好ましい実施態様に従って、図５に示されるＤＮＡ配列の少なくとも
一部、または図５にコードされるプロモーターに実質的に類似する活性を有する
プロモーターをコードする配列の少なくとも一部を含むプロモーター配列を含む
組換え核酸配列、あるいはその改変体もしくはフラグメントが提供される。
【００１９】 用語「実質的に類似する活性」は、本発明のＤＮＡに相補的でありかつハイブ
リダイズし、そして花粉において作用するプロモーターをコードする、ＤＮＡ配
列を含む。好ましくは、このようなハイブリダイゼーションは、低いおよび高い
、またはその間のストリンジェンシー条件で生じる。一般的な用語において、低
いストリンジェンシー条件は、約６０℃〜約６５℃の周囲温度で３×ＳＣＣとし
て規定され得、そして高いストリンジェンシー条件は、約６５℃で０．１×ＳＳ
Ｃとして規定され得る。ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン 酸三ナトリウムの緩衝液である。３×ＳＳＣは、ＳＳＣ等の強度の３倍である。
【００２０】 本発明の花粉特異的プロモーターは、花粉産生または生存度を妨害し得る遺伝
子を駆動することによって、雄性不稔性を操作するため、または花粉子実におい
て目的の遺伝子を特異的に発現するために使用され得る。
【００２１】 本発明の第２の局面に従って、プロモーター配列は、花粉における、特に後期
花粉産生における発現が所望である得る遺伝子と組み合わせて発現カセットの一
部を形成し得る。これらは、花粉または花粉産生において影響を有する遺伝子を
含む。このような遺伝子は、雄性稔性の制御に関与する遺伝子、殺虫性毒素（こ
れは、次いで、花粉を食餌する昆虫種に標的される）をコードする遺伝子、また
は花粉の栄養価を増強もしくは改変する遺伝子であり得る。さらに、このプロモ
ーター配列は、花粉形質転換において使用するための選択マーカーの発現を駆動
するために使用され得る。適切な選択マーカー遺伝子の例としては、カナマイシ
ン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびＰＡＴ耐性遺伝子のような抗
生物質耐性遺伝子が挙げられ、これらは安定な形質転換体が、種（例えば、トウ
モロコシ、イネ、コムギ）に依存して同定されることを可能にする。
【００２２】 用語「発現カセット」（これは、「ＤＮＡ構築物」「ハイブリッド」および「
結合体」のような用語と同義である）は、調節プロモーターに直接的または間接
的に接続されてカセットを形成する効果遺伝子を含む。間接的接続の例は、イン
トロン配列中間体のような適切なスペーサー基、プロモーターおよび標的遺伝子
の供給である。ＤＮＡ配列はさらに、異なるベクター上にあり得、それゆえ同じ
ベクター上に配置される必要はない。同じ物が、本発明に関連して、用語「融合
される」についてあてはまり、これは直接または間接な接続を含む。このような
構築物はまた、目的の細胞を形質転換するに適切なプラスミドおよびファージを
含む。
【００２３】 好ましい実施態様に従って、本発明の発現カセットは上記のプロモーター配列
を含み、これは、花粉発生に有害である遺伝子（例えば、バルナーゼ、アデニン
ヌクレオチド輸送体、変異体チューブリン、Ｔ−ｕｒｆ（ＷＯ９７／０４１１６
に請求される）またはトレハロースホスフェートホスファターゼ（ＴＰＰ）をコ
ードする遺伝子）の発現を制御するように配置される。
【００２４】 例えば、ＷＯ９３／２５６９５は、細胞傷害性タンパク質をコードする遺伝子
バルナーゼ（タペータム特異的プロモーターの制御下にある）の使用を記載する
。タペータム細胞におけるバルナーゼの発現は、これらの細胞を破壊し、そして
花粉産生の破壊を導く。
【００２５】 リボザイムは、ヌクレオチド鎖切断反応を触媒し得るＲＮＡ分子である。これ
らは、トランスで反応を触媒し得、そして異なる配列に対して標的され得る。そ
れゆえ、これらは、遺伝子発現を調節する手段として、アンチセンスの潜在的な
代替物である。ＨａｓｓｅｌｈｏｆおよびＧａｒｌａｃｈ（（１９８８）Ｎａｔ
ｕｒｅ 第３３４巻：５８５−５９１）またはＷｅｇｅｎｅｒら（（１９９４） Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２４５：４６５−４７０）は、植物におけるリボザ イム遺伝子の発現により、トランス優性変異の生成を実証した。必要であれば、
本発明の花粉特異的プロモーターは、花粉において特異的に発現されるようなリ
ボザイムの発現を制御するために使用され得る。
【００２６】 Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９７）は、複製可能なウイルスＲＮＡベクター（Ａ
ｍｐｌｉｃｏｎｓTM）の使用（これはまた、内因性遺伝子の発現をノックアウト
する手段として有用であり得る）による、トランスジェニック植物における遺伝
子サイレンシングの方法を記載する。この方法は、優性変異を産生する、すなわ
ち、ヘテロ接合性状態で保存可能であり、そして標的された遺伝子のすべてのコ
ピーをノックアウトし、そしてアイソフォームもまたノックアウトし得るという
利点を有する。このことは、六倍体であるコムギにおいて明らかな利点である。
次いで、稔性は、誘導性プロモーターを使用することによって回復されて、ノッ
クアウト遺伝子の機能的コピーの発現を駆動し得る。ＡｍｐｌｉｃｏｎTMベクタ
ーのエレメントとして花粉特異的プロモーターを含むことによって、遺伝子の発
現は、次いで、花粉において特異的に起こる。
【００２７】 細胞傷害性または破壊遺伝子の、花粉産生を破壊する手段としての使用は、稔
性を回復するための回復遺伝子の発現を必要とする。適切には、構築物はさらに
、上記有害遺伝子（例えば、バルナーゼの場合のバルスターまたはＴＰＰの場合
のＴＰＳのような回復遺伝子）の効果を克服し得るヌクレオチド配列、または有
害遺伝子にセンスもしくはアンチセンスである構築物をコードする配列を含むカ
セットを含む。
【００２８】 有害遺伝子の発現を制御する代替手段は、オペレーター配列を使用することで
ある。オペレーター配列（例えば、ｌａｃ、ｔｅｔ、４３４など）は、ＷＯ９０
／０８８３０に記載されるように、プロモーター領域に挿入され得る。次いで、
リプレッサー分子は、これらのオペレーター配列に結合し得、そして下流の遺伝
子（例えば、花粉発生に有害な遺伝子）の転写を防止する（Ｗｉｌｄｅら（１９
９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１，１２５１）。さらに、オペレーター配列を、（Ｌｅ ｈｍｉｎｇら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６，３１４５−３１５３）に記載され るように、Ｌａｃ ＩΔＨｉｓ変異体のような増強された結合能力を用いて操作 することが可能である。このことは、１７位での、チロシンからヒスチジンへの
アミノ酸の変更を有し、従って発現の緊密な制御を与える。リプレッサーの誘導
性発現との組み合わせを使用する場合、次いで、これは、不活化遺伝子の発現が
遮断されることを可能にする。
【００２９】 この方法において、発現カセットは、上記のような植物の稔性の制御に使用さ
れ得る発現系に組み込まれ得る。
【００３０】 用語「発現系」は、上記で規定される系が、適切な器官、組織、細胞、または
培地で発現され得ることを意味する。この系は、１つ以上の発現カセットを含み
得、そしてまた、調節プロモーターの使用により標的遺伝子の発現が増加するこ
とを確実にするさらなる成分を含み得る。
【００３１】 本発明の第３の局面に従って、以下を含む発現系が提供される： （ａ）花粉において特異的に発現される、第１のプロモーター配列； （ｂ）発現された場合、上記の花粉特異的プロモーターの制御下で、花粉生合
成を破壊する、第１の遺伝子； （ｃ）外来性化学誘導物質の存在または非存在に応答する、第２のプロモータ
ー配列；ならびに （ｄ）上記の第１の遺伝子の発現を阻害し得るエレメント、または上記の第２
のプロモーター配列に作動可能に連結されそしてその制御下で、上記の第１の遺
伝子によってコードされるタンパク質を阻害し得るエレメントのいずれかをコー
ドする、第２の遺伝子。
【００３２】 上記のエレメント（ａ）および（ｂ）および（ｃ）および（ｄ）は、１つまた
は２つの個々のベクターによって提供され得るが、好ましくは、同じベクターに
含まれて、同時分離を確実にする。これらは、植物細胞を形質転換または同時形
質転換するために使用され得、エレメント間の適切な相互作用が行われることを
可能にする。
【００３３】 第２のプロモーター配列および第２の遺伝子は、第１の遺伝子の化学的「スイ
ッチ」の入切を提供する。ここで、第２のプロモーター配列は、外因性化学誘導
物質の存在に応答し、花粉または植物への化学誘導物質の適用は、第２の遺伝子
のスイッチを入れる効果を有し、それにより、第１の遺伝子の効果を相殺する。
化学誘導物質の非存在は、同様の効果を有し、ここで、第２のプロモーター配列
は、化学誘導物質の非存在下でのみ活性である。
【００３４】 エレメント（ｃ）および（ｄ）は、上記の有害遺伝子（例えば、バルナーゼの
場合はバルスターまたはＴＰＰの場合はＴＰＳのような回復遺伝子）の効果を克
服し得るヌクレオチド配列、または有害遺伝子もしくは誘導性プロモーターと作
動可能に相互接続されて使用されるオペレーター配列の場合にリプレッサー分子
をコードする遺伝子にセンスもしくはアンチセンスである構築物をコードする配
列、を含む発現カセットの形態に適している。
【００３５】 本発明の発現系はさらに、除草剤耐性遺伝子または抗生物質耐性遺伝子のよう
な選択マーカーを含み得、安定な形質転換体が、種（例えば、トウモロコシ、イ
ネ、コムギ）に依存して同定されることを可能にする。除草剤耐性遺伝子の存在
はまた、分離する集団において、雄性不稔性子孫の選択を可能にする。
【００３６】 このような発現系を用いる植物の形質転換は、雄性不稔性植物の産生を生じ、
そしてこのような植物を産生する方法は、本発明の第４の局面を形成する。
【００３７】 本発明のこの実施態様に従う発現系（ここで、遺伝子は、生存可能な花粉産生
に有害である）は、ハイブリッドの産生に有用であるが、雄性不稔性系統がホモ
接合体を作製し得る場合、特に有用である。「後期」プロモーター（例えば、上
記のＺｍＣ５プロモーター）が使用される場合、この遺伝子産物は花粉発生にお
いて後期に発現されるので、一次形質転換体およびヘテロ接合体は、不稔性を１
：１に分離する（すなわち、花粉の５０％が稔性であり、そのため非ハイブリッ
ド種子を導く自家受粉が生じ得る）を花粉を産生する。
【００３８】 ホモ接合性の不稔性植物を得るために、誘導性プロモーターは、適切な化学物
質（例えば、ＡｌｃＡ／Ｒスイッチの場合はエタノール、またはＧＳＴスイッチ
についてはセイフナー（ｓａｆｅｎｅｒ））を使用して回復遺伝子の発現を駆動
するように切り替えなければならない。次いで、これは、有害遺伝子を不活化し
、そのため、自家受粉が、以下のモデルに従って生じることを可能にする。
【００３９】
【表１】 ホモ接合性子孫（ＭＳＭＳＲｃｓＲｃｓ）からの全ての花粉は不稔性である。
ヘテロ接合性子孫（ＭＳＲｃｓ− − −）からの花粉の５０％は不稔性である。
無効（− − − − − −）子孫からの花粉の全ては稔性である。ＤＡＰＩのよ
うな生染色を用いるこれらの系統からの花粉の染色は、１００％不稔性花粉を産
生する植物の同定を可能にする。あるいは、誘導および自家受粉は、この分離す
る集団において反復され得、そして子孫が不稔性の分離について分析され得る。
明確には、ホモ接合性系統の自家受粉に由来する全ての子孫は、それ自体、ホモ
接合性であり、そして雄性不稔性である。すなわち、それらはすべて１００％不
稔性の花粉を産生するのに対し、ヘテロ接合性系統の自家受粉から生じる子孫は
、不稔性について分離し続ける。あるいは、雄性不稔性を生じる遺伝子が除草剤
耐性を付与する遺伝子に連結される場合、子孫は、初期の実生段階で除草剤を噴
霧され得、除草剤寛容性は、不稔性遺伝子と分離される。この様式において、雄
性不稔性親を同定し得、そしてハイブリッド産生のために選択し得る。
【００４０】 一旦同定されると、このホモ接合性不稔性系統は、改変されていない近交系雄
性親系統による交差受粉によるＦ１ハイブリッドの産生に使用され得る。以下を
参照のこと。
【００４１】
【表２】 従って、全てのＦ１種子はハイブリッドであり、そして不稔性についてヘテロ
接合性であり、このことは、各植物からの花粉の５０％が稔性であることを意味
する。トウモロコシのような作物種において、これは、各雄穂により産生される
花粉の垂直容量に起因して、圃場にわたる完全な受粉を確実にする、豊富な生存
可能な花粉である。コムギにおいても、自家受粉は、花がまだ閉じている間に生
じるので、これは収率の損失がないことを確実にするために十分な花粉であるべ
きであり、従って風などによる損失を減少する。植物の栄養部分が収穫される種
において、次いで、花粉の生存性の減少は、考慮されるべき要因ではない。
【００４２】 農夫が後の植え付けのためのＦ２種子を保持するべきである点で、ハイブリッ
ド種子プロデューサーのための、さらなる利点もまた存在する。農夫は雑種強勢
の損失の結果として収率の損失を被る。以下を参照のこと。
【００４３】
【表３】 これらの方法は、例えば、ハイブリッド産生において、誘導性プロモーターを
使用する活性化によって、不稔性の逆転を可能にし得る。
【００４４】 本発明の第５の局面に従って、植物の稔性を制御する方法が提供され、この方
法は、上記のような発現系を用いて上記の植物を形質転換する工程、および稔性
が回復されるべきである場合、誘導性プロモーターを活性化する工程を包含する
。
【００４５】 適切な誘導性プロモーターとしては、外部化学刺激（例えば、除草剤セーフナ
ーの適用によって制御されるプロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの
例としては、例えば、以下のような２成分系が挙げられる：本発明者らの公開さ
れた国際公開番号ＷＯ９３／２１３３４に記載されるａｌｃＡ／ａｌｃＲ遺伝子
スイッチプロモーター系、本発明者らの国際公開番号ＷＯ９６／３７６０９に記
載されるエクジソンスイッチ系、または国際特許出願番号ＷＯ９０／０８８２６
および同ＷＯ９３／０３１２９４に記載されるＧＳＴプロモーター（これらの教
示を、本明細書中で参考として援用する）。このようなプロモーター系は、本明
細書中で、「スイッチプロモーター」と称される。スイッチプロモーターと組み
合わせて使用されるスイッチ化学物質は、本発明の方法においてこの系を特に有
用にする、農業的に受容可能な化学物質である。
【００４６】 本発明の花粉特異的プロモーターが雄性不稔性を得るために使用される場合、
稔性の完全な回復は、本方法によって達成され得ない。なぜなら、花粉は一倍体
であるからである。これは、回復遺伝子の活性化の後に産生される花粉の５０％
のみが稔性であることを意味する。これは、本発明のプロモーターを使用する発
現が高度に組織特異的であるという事実によって計数され得る。
【００４７】 この性質は、本発明のプロモーターの使用を、いくつかの非常に特別な適用に
おいて特に有用にする。例えば、いくつかの場合において、花粉の形質転換が必
要である。この場合において、花粉特異的プロモーターの使用は、非常に所望さ
れ得る。このような適用の例は、ＭＡＧＥ ＬＩＴＥＲ（雄性胚系統形質転換）
として公知であり、そしてＳｔｏｇｅｒら（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ
ｓ １４（１９９５）２７３−２７８）によって記載される。この方法において 、花粉は、微量注入ボンバードメントによって形質転換される。花粉特異的プロ
モーターは、例えば、選択マーカー遺伝子を駆動するために使用される。プロモ
ーターが花粉特異的であるという事実は、いくつかの利点を付与する。まず第１
に、このマーカーは花粉においてのみ発現され、植物の残りの部分では発現され
ず、そのため残りの植物組織は、望まれないマーカーを含まない。さらに、花粉
においてのみ選択マーカーを有することは、通常の方法によって再び形質転換す
ることおよび異なる選択マーカーを有する必要のないことの可能性を可能にする
(すなわち、より容易に遺伝子スタッキングを可能にする)。なぜ花粉の形質転換
が重要であるかという理由は、花粉が胞子体型の発生を受けさせられ得る(すな わち、半数体および半数体を倍加した植物を生じる)ということである。これは 、ホモ接合性が１工程で達成されることを意味する。あるいは、形質転換された
花粉は、伝統的な形質転換経路より速いプロセスで再度、野生型植物を受粉し、
従って導入された導入遺伝子を保有する種子を得るために使用され得る。
【００４８】 本発明の発現系は、利用可能な方法のいずれかによって植物中または植物細胞
中に導入され得、この方法としては、組換えＴｉプラスミドを含むＡｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる感染、エレクトロポレーション 、植物細胞およびプロトプラストのマイクロインジェクション、微量注入ボンバ
ードメント、細菌ボンバードメント、特定の「繊維（ｆｉｂｒｅ）」または「ホ
イスカー（ｗｈｉｓｋｅｒ）」方法、ならびに花粉管形質転換が挙げられ、これ
らは、形質転換される特定の植物種に依存する。次いで、形質転換された細胞は
、適切な場合、完全な植物に再生され得、ここで、新たな核物質は、ゲノム中に
安定に組み込まれる。形質転換された単子葉植物および双子葉植物の両方が、こ
の方法で得られ得る。公知の方法の全詳細についての文献の参照をし得る。この
ような方法は、本発明のさらなる局面を形成する。
【００４９】 本発明の方法は、広範なハイブリッド植物（例えば、コムギ、イネ、トウモロ
コシ、綿、ヒマワリ、テンサイ、ならびにレタス、ナタネおよびトマト）の産生
に有用である。
【００５０】 上記のような植物遺伝子発現系を含む植物細胞は、これらの細胞を含む植物と
ともに、本発明のさらなる局面を形成する。
【００５１】 本発明の第９の局面に従って、複製可能なウイルスＤＮＡベクター（Ａｍｐｌ
ｉｃｏｎTM）が提供され、これは、上記に規定される組換え核酸を含む。
【００５２】 本発明の第１０の局面に従って、花粉細胞を、上記の発現系を用いて形質転換
する方法が提供される。
【００５３】 ここでは、本発明を、添付の図面を参照する例示の目的でのみ特に記載する。
【００５４】 （実施例１） （ＺｍＣ５ ｃＤＮＡおよびゲノムクローン） トウモロコシ（近交系Ａ１８８）花粉および出芽花粉（ＨＪ Ｒｏｇｅｒｓら 、Ｐｌａｎｔ Ｊ４（１９９３）８７５−８８２）ｃＤＮＡライブラリーを、花 粉および苗条ポリ（Ａ）−ＲＮＡに対して作製したｃＤＮＡプローブを使用して
、以下の標準的な手順に従ってスクリーニングした（ＦＭ Ａｕｓｕｂｅｌら、 Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０））。放射性標識した花粉ｃＤＮＡ に対するハイブリダイゼーションを示すが、放射性標識した苗条ＤＮＡに対する
ハイブリダイゼーションは示さない全てのクローン（総計１，１０１）を拾った
。ランダムなコロニーを拾い、そして５’末端で配列決定し、そしてその配列を
最新のデータベースと比較した。８００ｂｐのインサートを有するあるクローン
は、公知のペクチンメチルエステラーゼと、有意な配列同一性を示した。花粉ｃ
ＤＮＡライブラリーを、このｃＤＮＡインサートを用いて再スクリーニングし、
そして全長ＺｍＣ５クローン（ＺｍＣ５ｃ）を同定し、そして配列決定した。
【００５５】 トウモロコシ（近交系Ｂ７３）ゲノムライブラリー（８×１０6プラーク）を 、ランダムプライミングによって標識したｃＤＮＡクローンＺｍＣ５ｃの５’の
２７０ｂｐに対応するＰＣＲフラグメントを使用してスクリーニングした（Ａｕ
ｓｂｅｌら、前出）。１つのポジティブクローンＺｍＣ５ｇを、プラーク精製し
た。ｐＵＣ１９にサブクローニングしたＺｍＣ５ｇの２．５ｋｂ ＳａｌＩフラ グメントの配列の、ＺｍＣ５ｃ（ＮＣＩＭＢ ４０９１５として寄託された）と の比較は、２つの配列が重複し、そしてそれらが同一であることを示した。この
ことはこのクローンが同じ遺伝子を提示することを示す。このｃＤＮＡを有する
ゲノムクローンの２．５ｋｂフラグメントの間の重複の提示を、図１に示す。
【００５６】 転写開始点を、コード配列（データは示さず）のヌクレオチド１〜２１（５’
−ＡＣＣＴＡＧＧＡＧＡＧＣＣＴＴＴＧＣＣＡＴ−３’）および５６〜８２（５
’−ＡＧＣＧＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＧＣＧＡＣＣＡＣＡＣＣＧＡ−３’）に相補
的な２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用してマッピングした。この産物
は、推定ＡＴＧ（図１）のわずか１５塩基上流のＡヌクレオチド上に転写開始点
を明解に配置する。他の花粉特異的遺伝子は、長い５’非翻訳配列を有すること
が見出されている（ＳＪ Ｔｅｂｂｕｔｔら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（
１９９４）２５：２８３−２９９）。従って、ＺｍＣ５ｇのこの領域は、非常に
短いであるようである。この短い５’ＵＴＬについて計算された自由エネルギー
は、０．９ｋＪ／ｍｏｌであり（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｍｅｔｈｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ．（１９８９）１８０：２６２−２８８）、いかなる安定な二次構造も形成し得
ないようにする。
【００５７】 １６９２ｂｐのオープンリーディングフレームを同定し、そして推定ＡＴＧ開
始コドン（図１）は、コンセンサス配列とよく一致する（ＨＡ Ｌｕｔｃｋｅら 、ＥＭＢＯ Ｊ ６（１９８７）４３−４８）。推定ＴＡＴＡＡモチーフ（ＣＰ Ｊｏｓｈｉ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６４８−６６５３（１９ ８７））は３２で開始するが、多くの他の植物遺伝子において見出されていない
ように、転写開始点（図１）から６０ｂｐ上流において認識可能なＣＡＡＡＴモ
チーフは見出されない。ＺｍＣ５ｃは、明確に認識可能なＡＡＴＡＡＡポリアデ
ニル化部位シグナルを欠く。これは異常ではない：植物遺伝子の３０％は、認識
可能なＡＡＴＡＡＡモチーフを欠く（ＢＤ Ｍｏｇｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
２（１９９０）１２６１−１２７２）。ＺｍＣ５ｃにおいて、ポリＡ付加部位 から１６ｂｐ上流の５つのＡ残基のストレッチはポリアデニル化部位として作用
し得るが、他の花粉特異的転写物は、ＡＡＴＡＡＡモチーフとポリ（Ａ）+付加 部位との間の平均距離より長いことが見出されている（Ｔｅｂｂｕｔｔら、前出
）。
【００５８】 （実施例２） （ＺｍＣ５の推定アミノ酸配列） ＺｍＣ５の予測したアミノ酸配列（５６３アミノ酸）を、ＥＭＢＬおよびＧｅ
ｎＢａｎｋデータベースと比較し、植物（３０．９％と４１．４％との間）およ
び微生物ＰＭＥ（１８．６％と２０．８％との間）の両方に対する高度の相同性
を明らかにした。アミノ酸配列のアラインメントは、タンパク質（これは、酵素
の触媒ドメインまたは活性部位であるようである４つの領域を含む）のＣ末端に
主に制限される植物および微生物の両配列にわたる保存性を示した（Ｄ．Ａｌｂ
ａｎｉら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（１９９１）１６：５０１−５１３、Ｏ
Ｍａｒｃｏｖｉｃら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １：１２８８−１２９２（１９
９２））。Ａ．ｎｉｇｅｒ ＰＭＥのインビトロ変異誘発（Ｂ Ｄｕｗｅら、Ｂｉ
ｏｔｈｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔｓ １８：６２１−６２６（１９９６）は、領域 Ｉ内のヒスチジン残基（これは、ＺｍＣ５において保存される）は、酵素の活性
部位に位置し得、そしてＡ．ｎｉｇｅｒにおいて酵素活性が必要であることを示
した。しかし、このヒスチジンは、植物および真菌の両起源のいくつかのＰＭＥ
において、他のアミノ酸残基によって置き換えられ、このことは、全てのＰＭＥ
において必須ではないことを示唆する。植物ＰＭＥの比較において、ＺｍＣ５は
、Ｂ．ｎａｐｕｓの「初期」花粉発現Ｂｐ１９遺伝子（Ｄ．Ａｌｂａｎｉら、前
出）に対するよりも、Ｐ．ｉｎｆｌａｔａの「後期」花粉発現ＰＰＥ遺伝子（Ｊ
Ｈ Ｍｕら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：５３９−５４４（１９９４））
に対して緊密な関係を示す。
【００５９】 (実施例３) （ＺｍＣ５遺伝子数の評価） ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、またはＨｉｎｄＩＩＩのいずれかで消化した１５μ
ｇのＤＮＡを含むトウモロコシの（近交系Ａ１８８）ゲノムサザンブロットを、
放射性標識した全長ＺｍＣ５ ｃＤＮＡインサートを用いてプローブした。図２ におけるブロットの各レーンにおける２つの強力なハイブリダイズバンドは、ト
ウモロコシゲノムにおける少なくとも２つの類似する遺伝子の存在を示唆する。
より大変弱いシグナルを示すいくつかのさらなるバンドは、この遺伝子ファミリ
ーが、いくつかのあまり関連しないメンバーも含み得ることを示唆する。
【００６０】 （実施例４） （ＺｍＣ５の空間的かつ時間的発現） ８つのトウモロコシ組織からの１０μｇの全ＲＮＡを含むノーザンブロットを
、ｃＤＮＡ ＺｍＣ５ｃでプローブして、遺伝子の発現プログラムを決定した。 約２．０ｋｂの転写物を、花粉および出芽花粉においてのみ検出した（図３（Ａ
））。このことは、この技術の検出の制限内で、この遺伝子の発現は、これらの
２つの組織に制限されるようであることを示す。葉、根、苗条、穂軸（ｃｏｂ）
、胚乳、または胚において検出可能なシグナルはなかった。小穂発達の間の発現
プログラムもまた決定した。図３（Ｂ）は、０．２５、０．５および１．０ｃｍ
の小穂、成熟花粉および出芽花粉からの全ＲＮＡを含むノーザンブロットを示す
。エチジウムブロミド染色したゲルは、各ゲルのレーンにおいてＲＮＡの等量の
ローディングを実証する。
【００６１】 小穂を、アクト−カーマイン（ａｃｔｏ−ｃａｒｍｉｎｅ）で葯を染色するこ
とによってステージし、そしてこの葯が、以下の段階で細胞を含むことを見出し
た：減数分裂前胞子形成細胞（ｐｒｅ−ｍｅｉｔｏｔｉｃ ｓｐｏｒｐｏｇｅｎ ｏｕｓ ｃｅｌｌ）（０．２５ｃｍ）、中期分裂前期Ｉ（０．５ｃｍ）、成熟花 粉粒（１．０ｃｍ）。しかし、継続する段階の間のいくつかの重複は、同じ小穂
内の２つの小花の間の発達段階における変動に起因して、回避不能である。この
ノーザンブロット分析は、微小胞子形成の初期段階における細胞を含む小穂を含
む任意の他のトウモロコシ組織において検出可能な発現を伴わずに、ＺｍＣ５の
発現が成熟開裂花粉および出芽花粉に制限されることを示す。
【００６２】 （実施例５） （トランスジェニック植物におけるＺｍＣ５プロモータ／ＧＵＳ構築物の発現
） 転写融合物を、ＺｍＣ５ｇの５’領域とレポーター遺伝子β−グルクロニダー
ゼの間に作製し（図４Ａ）、そしてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換による
タバコの形質転換に使用した。この構築物を以下のように作製した：２つのＳｐ
ｈＩ部位（ＡＴＧの５’側の２ｋｂの配列を含む２．５ｋｂ ＳａｌＩフラグメ ント中に１つ、およびポリリンカー中に１つ）を使用して、−６１位〜＋４０３
位の３’末端を除去した（図１）。これを、ＳｐｈＩ消化したＰＣＲフラグメン
ト（領域−６１〜＋１（３’末端に位置するさらなる制限部位（ＢａｍＨＩ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ）、および転写開始部位（図１および４Ａ）に位置する
ＨｉｎｄＩＩＩ部位を除去するための変異）を含む）によって直接置換した。次
いで、もともとの５’のＳａｌＩ部位および導入した３’のＳａｌＩ部位を使用
して、ＺｍＣ５プロモーター領域を切除し、これをｐＧＵＳのＳｍａＩ部位にク
ローニングした。次いで、ＺｍＣ５プロモーター−ＵＩＤ−Ａ転写融合物を、ｐ
Ｂｉｎ１９ベクターに移入し（図４Ａ）、そしてＮｉｃｏｔｉｎａ ｔａｂａｃ ｕｍ ｖａｒ ＳａｍｓｕｎのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性リーフ−ディ
スク形質転換のために使用した。形質転換体をカナマイシンで選択し、そして一
次トランスジェニック植物を再生した。このうち２つ（導入遺伝子の発現につい
て陽性）を出芽させて、Ｔ２世代へとした。
【００６３】 トランスジェニック植物の開裂した葯からの花粉粒を採取し、そしてＪ．Ａ．
Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ（１９８７）５：３ ８７−４０５）によって記載されるように、ＧＵＳ活性について染色した。２つ
の植物は、約５０％の青色染色花粉を示す陽性であった（図４Ｂ）。非トランス
ジェニックコントロールにおいて青色の着色は検出されなかった。組み込み部位
の数を調査するために、２つのトランスジェニック系統からの植物を自家受粉さ
せ、そして子孫を、カナマイシンに対する耐性について計数した。トランスジェ
ニックＧＣ５−２から評価した子孫のうち３０３植物体はカナマイシン耐性であ
り、８植物体はカナマイシン感受性であり、少なくとも２つの組み込み部位を示
す平均比３８：１を得た。トランスジェニック植物ＧＣ５−７の子孫は、単一組
み込み部位を示すカナマイシン耐性対カナマイシン感受性の平均比３．８：１を
生じた（１つの組み込み部位についての予測比は３：１、２つについては１５：
１、および３つについては６３：１である）。
【００６４】 抽出物を、５つの発生段階の葯を含む組織の範囲から作製し、そしてモミのＧ
ＵＳの発現を蛍光定量的に分析した（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、前出）。図４（Ｃ）
は、２つのトランスジェニック植物由来のＧＵＳ活性を示す。非常に低いレベル
の発現のみが、発生中の開裂組織および成熟開裂組織以外の組織において検出可
能である。タバコにおいて、芽の発達段階は、芽の長さと相関し得るが（Ｔｅｂ
ｂｕｔｔら、前出）、これは生長条件に依存する。従って、Ｂｕｄ−１は、有糸
分裂／四分子段階の小胞子に対応し、Ｂｕｄ−２は一核（ｕｎｉｎｕｃｌｅａｔ
ｅ）小胞子に対応し、Ｂｕｄ−３は小胞子有糸分裂に対応し、Ｂｕｄ−４は初期
から中期の二核配偶体に対応し、Ｂｕｄ−５は中期から後期の二核配偶体に対応
する。ＤＡＰＩ染色によって評価される小胞子段階（データは示さず）は、タバ
コにおけるＺｍＣ５プロモーターの発現の時期が、ノーザンデータに基づくトウ
モロコシにおけるその発現（図３；図４Ｃ）と良好に一致することを示す。従っ
て、トウモロコシおよびトランスジェニックタバコの両方におけるネイティブ環
境において、ＺｍＣ５プロモーターは花粉発生において後期に機能し、そして実
際には、小胞子有糸分裂前には不活性である。ＧＣ５−２を有する２つのトラン
スジェニック系統間で、試験したほとんどの組織においてより高いレベルの発現
を示すという、発現におけるいくらかの変動が注目され得る。発現レベルにおけ
る変動は、トランスジェニック集団において一般的に見出され、そして導入遺伝
子９ＳＬＡの挿入の部位に基づいている（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂ
ｉｏｌ ２１：１７−２６（１９９３））。
【００６５】 （実施例６） （ＡｌｃＡ誘導性プロモーターによって駆動される花粉におけるＧＵＳの発現
） ＧＵＳの発現を駆動するＡｌｃＡプロモーターおよびＡｌｃＲの発現を駆動す
る３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターを含む植物形質転換ベクターは、タバコおよび トマト植物に導入されている。ＧＵＳ発現を、根の浸漬（ｒｏｏｔ ｄｒｅｎｃ ｈ）としてエタノールで誘導する前および後に、全ての組織において研究し得る
。
【００６６】 トマトの葯および花粉のＧＵＳ染色は、誘導後のＧＵＳの明確な発現を示す。
同じ結果を、他の種由来の花粉から予測する。
【００６７】 （実施例７） （Ｃ５−バルナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）カセット（優勢配偶体の雄性不稔性カ
セット）の調製） ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の唯一のＳａｌＩ 部位を、オリゴヌクレオチドリンカーＭＫＬＩＮＫ４（５’−ＴＣＧＡＴＴＣＧ
ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＡ−３’）の消化したＳａｌＩ部位への挿入によって、
ＮｏｔＩ認識部位と置換した。バルナーゼのコード領域に続いて細菌プロモータ
ーで駆動したバルスター（ｂａｒｓｔａｒ）コード領域を保有する０．９ｋｂの
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、改変したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
の対応するフラグメントに挿入した。ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメント上
のｎｏｓターミネーターを、得られたベクターの対応するフラグメントに挿入し
た。次いで、望んでいないＢａｍＨＩ部位を、製造業者の指示書に従ってＳｔｒ
ａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅシステムを使用し、そしてオリゴヌク
レオチドＤＡＭ−３Ａ（５’−ＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＡＣＣＣＣＧ
ＧＧＴＡＣＣＡＡＧＣ−３’）およびＤＡＭ−３Ｓ（５’−ＧＣＴＴＧＧＴＡＣ
ＣＣＧＧＧＧＴＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣ−３’）を使用して除去した
。得られたプラスミド（ｐＳＫ−ＢＢＮと命名した）を、ＢａｍＨＩを用いて完
全に消化し、エビアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化した（３７℃、１
時間）。Ｃ５の５’隣接領域の１．９ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントをこれに連 結し、続いてＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化し、それぞれ、インサートの存在
および方向について確認した。得られたプラスミドをｐＳＫ−Ｃ５−ＢＢＮ（図
６）と名付けた。次いで、カセット全体を、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩフラグメント
として除去し、バイナリー植物形質転換ベクターｐＶＢ６にする。次いで、この
構築物を、凍結融解法によって、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｍｅｆａｃ ｉｅｎｓに導入する。標準的な技術を使用して、このＤＮＡをタバコに導入する
。
【００６８】 （実施例８） （不稔性トランスジェニック植物の分析） 一次形質転換体を、組織培養において、カナマイシン上での生長について選択
し、そしてこれをＰＣＲ分析によって確認する。この植物を、温室において生長
させて成熟させる。花粉を、開裂後の葯から収集し、そして生株を使用して、花
粉が稔性であるか不稔性であるか否かを確認する。花粉の５０％は、不稔性であ
ると予測される。これらの植物の野生型植物との戻し交配（葯の除去後）、また
は自家受粉させることで、花粉の５０％が不稔性である子孫を生じる。
【００６９】 本発明の範囲から逸脱しない本発明に対する他の改変は、当業者に明らかであ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＺｍＣ５ ｃＤＮＡの、その対応する遺伝子の５’領域からの２．４ ｋｂフラグメントとのアラインメントを示す図である。転写開始点を示し（*） 、そして推定翻訳開始に下線を付す。Ｓａ＝ＳａｌＩ、Ｓ＝ＳｍａＩ、Ｓｐ＝Ｓ
ｐｈＩ、Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｘ＝ＸｈｏＩ、Ｐ＝ＰｓｔＩ。
【図２】 図２は、トウモロコシ（近交系Ａ１８８）ゲノムＤＮＡのサザンブロットを示
す。各レーンは、レーン１についてはＥｃｏＲＩで、レーン２についてはＨｉｎ
ｄＩＩＩで、そしてレーン３についてはＢａｍＨＩで消化した、１５μｇのゲノ
ムＤＮＡを含む。サザンブロットを、放射性標識したＺｍＣ５ ｃＤＮＡプロー ブとハイブリダイズした。
【図３】 図３は、エチジウムブロマイド染色したゲルを示し、このゲルは、種々のトウ
モロコシ組織の全ＲＮＡの１８Ｓ ＲＮＡおよびＺｍＣ５ ｃＤＮＡプローブでプ
ローブした同じゲルのノーザンブロットを示す。 （Ａ）ゲルを、種々のトウモロコシ組織からの１０μｇの全ＲＮＡで充填した。
（Ｂ）ゲルを、苗条、発生段階の一連の小穂、花粉、および出芽花粉から単離さ
れた１０μｇの全ＲＮＡで充填した。
【図４Ａ】 図４Ａは、ＺｍＣ５：：ｕｉｄＡ構築物および接合配列の物理マップである。
それぞれ、星印、上向き矢印および黒菱形で示したＡ残基は、ＺｍＣ５転写開始
点に対応し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を除くための（クローニングの容易さのため）
ＴからＡへの変異およびＺｍＣ５プロモーター領域の３’末端に対応する。ｕｉ
ｄＡ翻訳開始点に下線を付す。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、トランスジェニックＺｍＣ５：：ｕｉｄＡタバコからの花粉におけ
るＧＵＳ活性の組織化学分析を示し、これは、青色染色の分離を示す。
【図４Ｃ】 図４Ｃは、２つのトランスジェニック系統（ＧＣ５−２（白抜きカラム）およ
びＧＣ５−７（黒カラム））由来のトランスジェニックタバコ組織におけるＺｍ
Ｃ５のプロモーター活性を示す。各系統からのデータは、２つの独立したアッセ
イの平均（非トランスジェニックコントロールに対して正規化した）を示す。芽
の段階は以下の通り：Ｂｕｄ−１は５〜８ｍｍの芽に対応する（減数分裂／四分
子段階の小胞子）、Ｂｕｄ−２：１０〜１２ｍｍの芽（単核小胞子）、Ｂｕｄ−
３：１３〜１５ｍｍ（小胞子有糸分裂）、Ｂｕｄ−４：（１７〜２２ｍｍ）初期
から中期の二核配偶体、Ｂｕｄ−５：（２７〜４５ｍｍ）中期から後期の二核配
偶体（Ｔｅｂｂｕｔｔら、前出）。
【図５】 図５は、トウモロコシにおけるＺｍＣ５プロモーター配列をコードするＤＮＡ
配列を示す。下線を付したＡは、推定転写開始点であり、そして太字で下線を付
したＡＴＧは、翻訳開始点である。
【図６】 図６は、Ｃ５−バルナーゼ／バルスター−ｎｏｓを含む発現カセットを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 Ｆｅｒｎｈｕｒｓｔ，Ｈａｓｌｅｍｅｒ ｅ，Ｓｕｒｒｅｙ ＧＵ27 ３ＪＥ，Ｕｎ ｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ (72)発明者 ロジャース， ヒラリー ジョアン イギリス国 シーエフ１ ３ティーエル カーディフ， ピー．オー．ボックス 915， ユニバーシティ オブ ウェール ズ， スクール オブ ピュア アンド アプライド バイオロジー内 (72)発明者 ヒュセイ， パトリック ジョセフ イギリス国 ティーダブリュー20 ０イー エックス サリー， イグハム， イグハ ム ヒル， ロイヤル ホロウェイ ユニ バーシティ オブ ロンドン， スクール オブ バイオロジカル サイエンシーズ 内 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD14 CG01 HA01 4B024 AA08 AA11 AA20 BA07 BA79 CA04 CA09 DA01 DA05 EA04 FA02 FA10 GA27 HA13 HA14 4B065 AA11X AA89X AA89Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA25 CA27 CA53

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 トウモロコシ中のＺｍＣ５遺伝子のプロモーター配列、また
    は花粉においてプロモーターとして作用する、その改変体もしくはフラグメント
    を含む、組換え核酸配列。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の組換え核酸配列であって、図１に示される
    トウモロコシのＺｍＣ５遺伝子の転写開始部位の約２ｋｂ上流を含む、組換え核
    酸配列。
  3. 【請求項３】 請求項１または請求項２に記載の組換え核酸配列であって、
    図５に示されるＤＮＡ配列の少なくとも一部、または図５に示されるＤＮＡ配列
    と実質的に同様の活性を有するプロモーターをコードする配列の少なくとも一部
    を含むプロモーター配列またはその改変体もしくはフラグメントを含む、組換え
    核酸配列。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸配列を含む発現カ
    セットであって、ここで該カセットは、花粉において発現されることが所望され
    、かつ花粉産生において影響を有し得る産物、殺虫性毒素をコードするか、また
    は花粉の栄養価を増強するかもしくは改変する遺伝子を制御するように配置され
    る、発現カセット。
  5. 【請求項５】 前記遺伝子が花粉発生に有害である遺伝子を含む、請求項４
    に記載の発現カセット。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載の発現カセットであって、ここで前記遺伝子
    が、バルナーゼ、アデニンヌクレオチドトランスロケーター、変異体チューブリ
    ン、Ｔ−ｕｒｆもしくはトレハロースホスフェートホスファターゼ（ＴＰＰ）、
    またはリボザイムのいずれかをコードする遺伝子を含む、発現カセット。
  7. 【請求項７】 前記遺伝子が選択マーカー遺伝子を含む、請求項４に記載の
    発現カセット。
  8. 【請求項８】 前記選択マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子を含む、請求
    項７に記載の発現カセット。
  9. 【請求項９】 請求項４〜８のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、
    発現系。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の発現系であって、花粉に有害である遺伝
    子を含み、そして化学誘導性プロモーターと作動可能に相互接続された、該有害
    遺伝子の効果を克服し得るペプチドまたはタンパク質をコードする第２の核酸配
    列を含む発現カセットをさらに含む、発現系。
  11. 【請求項１１】 前記核酸配列が回復遺伝子を含む、請求項１０に記載の発
    現系。
  12. 【請求項１２】 前記回復遺伝子がバルスターまたはＴＰＳである、請求項
    １１に記載の発現系。
  13. 【請求項１３】 請求項１０に記載の発現系であって、前記核酸配列が、前
    記有害遺伝子にセンスまたはアンチセンスである構築物をコードし、それにより
    その発現を抑制する、発現系。
  14. 【請求項１４】 請求項１０に記載の発現系であって、ここで前記第２の核
    酸配列が、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸配列に作動可能に連結され
    るオペレーター配列と相互作用するｌａｃ、ｔｅｔ、４３４、ｌａｃ−Ｈｉｓに
    対するリプレッサータンパク質またはＡｍｐｌｉｃｏｎTMをコードし、それによ
    り、花粉において発現されることが所望される第１の遺伝子の発現を予防する、
    発現系。
  15. 【請求項１５】 前記誘導制プロモーターが、ＡｌｃＡ／Ｒ、ＧＳＴ、また
    はエクジソン誘導性プロモーターである、請求項１０〜１４のいずれか１項に記
    載の発現系。
  16. 【請求項１６】 選択マーカーをさらに含む、請求項９〜１５のいずれか１
    項に記載の発現系。
  17. 【請求項１７】 花粉において発現されることが所望される前記遺伝子が、
    除草剤耐性遺伝子に連結される、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の発現系
    。
  18. 【請求項１８】 以下： （ａ）花粉において特異的に発現される、第１のプロモーター配列； （ｂ）発現される場合、該花粉特異的プロモーターの制御下で、花粉の生合成
    を破壊する、第１の遺伝子； （ｃ）外因性の化学誘導物質の存在または非存在に応答する、第２のプロモー
    ター配列；および （ｄ）該第１の遺伝子のいずれかの発現を阻害し得るエレメント、または該第
    ２のプロモーター配列に作動可能に連結されかつその制御下で、該第１タンパク
    質を阻害し得るエレメントをコードする、第２の遺伝子、 を含む、発現系。
  19. 【請求項１９】 植物を産生する方法であって、該方法は、請求項９〜１８
    のいずれか１項に記載の発現系を用いて植物細胞を形質転換する工程を包含する
    、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項９〜１８のいずれか１項に記載の発現系を含む、植
    物細胞。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の細胞を含む、植物。
  22. 【請求項２２】 植物における雄性不稔性を誘導する方法であって、該方法
    は、請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の発現系を用いて植物を形質転換す
    る工程を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 植物の稔性を制御する方法であって、該方法は、請求項１
    １または請求項１８に記載の発現系を用いて該植物を形質転換する工程、および
    稔性が回復されることが必要とされる場合、前記誘導性プロモーターを活性化す
    る工程を包含する、方法。
  24. 【請求項２４】 前記誘導性プロモーターが、化学物質の前記植物への適用
    によって活性化される、請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え核酸を含む、
    複製可能なウイルスＲＮＡベクター（ＡｍｐｌｉｃｏｎTM）。
  26. 【請求項２６】 花粉を形質転換するための方法であって、請求項９または
    請求項１８に記載の発現系を用いて花粉細胞を形質転換する工程を包含する、方
    法。
  27. 【請求項２７】 本明細書中に、添付の図面のいずれか１つを参照して実質
    的に記載される、組換え核酸、発現カセット、発現系、または方法。
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