KR20010074432A - 잡종 종자 제조 - Google Patents

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KR20010074432A
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나이트메리엘리자베스
젭슨이안
데일리앨런
베이리스마이클윌리엄
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돈 리사 로얄
신젠타 리미티드
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Abstract

본 발명은 잡종 종자를 생산하는 방법에 관한다. 이러한 방법 중 하나는 웅성 수정성 및 동형접합 열성 자성 불임성인 부 식물 및 자성 수정성 및 동형접합 열성 웅성 불임성인 모 식물을 인터플랜팅하는 단계, 타가-수분시키는 단계 및 이로부터 종자를 얻는 단계를 포함한다. 각 부모 식물의 게놈 물질은 또한 하나 이상의 번역 증대자에 임의로 작동 연결된 외인성 화학 유도자의 존부에 반응하는 촉진유전자 서열 또는 각 부모 식물의 수정성을 완전히 복구하는 유전자에 작동 연결된 인트론 서열을 포함하는 유전자 구축물(상기 유전자는 외부 화학 유도자를 식물에 도포하여 각 부모가 자가-수분되게함으로써 발현됨)을 내포할 수 있을 것이다.

Description

잡종 종자 제조{HYBRID SEED PRODUCTION}
본 발명은 잡종 종자를 제조하는 방법에 관한다.
특히, 본 발명은 작물 생식을 분자적으로 조절하는 것에 관한다. 천연적으로 자가-수분하는 작물로부터 잡종 종자를 제조하는데 이러한 식물의 자웅 생식을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 자가-수분할 수 있도록 부모 식물에 수정성을 복구하여 부모계를 유지할 수 있게 하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 식물에 합체시키기 위한 발현 카세트 및 자/웅 불임성 복구유전자 시스템에 이러한 발현 카세트을 사용하는 것에 관한다.
잡종 종자로부터 생장한 잡종 식물은 두 별개의 유전적 배경을 교배하는 이종 효과 때문에 유리하다. 잡종 종자의 생산은 자가-수분을 조절하고 부모 식물의 타가-수분을 확보하는 능력에 따라 달라진다.
화분 수정성을 조절하기 위하여 다수의 방법을 이용할 수 있다. 예를들어 별도로 수꽃 및 암꽃을 가지는 옥수수의 경우 화분 수정성 조절은 화분 분비 전에 개화한 수꽃 또는 수꽃대를 물리적으로 제거하여 자가-수분을 막아 행한다.
그러나 대부분의 주요 작물은 동일한 꽃 안에 관능적인 암수 생식 기관을 가진다. 이 경우 화분 생성 기관의 제거는 매우 노동집약적이고 비용이 많이 든다.화분 생성을 제거하거나 막기 위하여 화학물질(살배우체 제제)을 사용하는 것은 일시적인 웅성 불임성을 발생시키나 이러한 화학물질을 사용하는 것은 비용이 많이 든다. 화학물질에 대한 신뢰성 및 이들의 활성 기간 또한 문제이다.
웅성 불임성을 발생시키는 유전 메카니즘을 기초로 화분 조절 시스템을 개발하는 것에 상당한 관심이 집중되고 있다. 두가지 일반 타입, 즉 a)하나 이상의 핵 유전자에 인하여 화분 생성이 안 됨으로써 야기되는 핵 웅성 불임성 및 b)미토콘드리아내 유전자 결함으로 화분 생성이 저해된 세포질 웅성 불임성(CMS)이 있다.
최근 이용되는 핵 시스템은 한쪽 부모 식물에 웅성 불임성의 도입후 꽃밥과 타가-수분시켜 수정성 복구유전자를 도입하여 수정성 잡종 부모를 생성시키기는 것을 기초로 한다. 제WO96/01799호에 기술된 Paladin 시스템은 상이한데, 한 식물에서 함께 발현될 경우 웅성 불임을 야기하는 세포독 효과를 가지는 유전자들을 잡종 종자 생성시 분리하는 것을 기초로 한다.
쌀 및 밀은 자가-수분 식물이고 작은 자웅동체 꽃을 가지고 옥수수에서 잡종 종자를 얻기 위해 취하는 숫꽃대 분리 방법은 적용할 수 없다. 꽃밥을 손으로 제거하는 것은 어렵고 시간 소모적이다. 또, 밀 화분은 비교적 무겁고 짧은 시간 동안만 생존하므로 30분 이상 생존하는 경우가 드물다. 잡종 옥수수 생산에 사용되는 플랜팅 기법, 즉 암그루에서 물리적으로 분리한 수그루를 블록으로 플랜팅하여(웅성 불임성) 풍매화분이 일어나지 않게 하는 기법은, 따라서 밀 또는 쌀에서는 잘 되지 않는다. 이들 작물에서 자웅 모체는 교차 수분되도록 인터플랜팅되어야 한다. 잡종 종자는 95% 이상의 잡종을 포함할 것이 요구되므로 웅성 모체의자가-수분으로부터 발생하는 종자를 제거하거나 자가-수정할 수 없는, 즉 비잡종 종자를 생성시킬 수 없는 웅성 모체를 얻는 것이 필요하다. 수그루가 암그루가 견딜 수 있는 몇몇 화학적 처리, 예를들어 제초 처리에 민감하지 않을 경우 모 식물의 인터플랜팅은 첫번째 옵션이 어렵다는 것을 의미함이 명백하다.
우리의 국체 특허 출원 제PCT/GB90/00110호는 모 식물에서 생존할 수 있는 화분의 생합성을 파괴하는 단백질을 발현시키는 단계적 유전자 서열에 대하여 기술하고 있다. 그러나 이 경우 부모 식물 중 하나 만이, 즉 모 식물이 모식물의 자가-수분을 최소화하도록 불임이고 이 모 식물은 수정성 부 식물과 교배되어 수정성 잡종 종자를 생성시킨다. 그러나 문헌에는 부모 식물 둘다 자가-수분할 수 없는 잡종 종자를 생성시키는 방법에 대하여 기술하고 있지 않다.
본 발명은 잡종 종자의 생산, 특히 밀 및 쌀 종자의 생산과 관련된 문제를 극복하기 위하여 잡종 종자를 제조할 수 있는 두가지 방법에 관한다.
본 발명의 제1의 양상은 웅성 불임성이고 동형접합 열성 자성 불임성인 부 식물 및 자성 불임성이고 동형접합 열성 웅성 불임성인 모 식물을 인터플랜팅하여 타가-수분하고 이로부터 종자를 얻는 것을 포함하는 잡종 종자 생성 방법을 제공한다.
본 발명의 제2의 양상은 상기 방법을 잡종 종자를 얻는데 사용하는 용도이다.
본 발명의 제3의 양상은 전술한 방법으로 얻어지는 수정성 식물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제4의 양상은 전술한 식물의 자손, 이러한 식물의 종자 및 이러한 자손을 제공하는 것이다.
본 발명의 제5의 양상은
(a) 수꽃 특이 촉진유전자 서열인 제1 유전자 촉진유전자 서열
(b) 제1 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된, 수컷 수정성을 파괴할 수 있는 산물을 암호화하는 파괴유전자;
(c) 하나 이상의 해독 증대자 또는 인트론 서열에 임의로 작동연결되는 암꽃 특이 촉진유전자 서열인 제2 유전자 촉지유전자 서열;
(d) 제2 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된 암컷 수정성을 복구시킬 수 있는 산물을 암호화하는 복구유전자;
(e) 하나 이상의 해독 증대자 또는 인트론 서열에 임의로 작동연결되는 외인성 화학 유도자의 존재에 반응하는 제3 유전자 촉진유전자 서열; 및
(f) 제3 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된 수컷 수정성을 복구할 수 있는 산물을 암호화하는 복구 유전자
를 포함하는 발현 카세트를 제공하여 외인성 화학 유도자 존재로 수컷 수정성을 조절하는 것이다.
본 발명의 제6의 양상은
(a) 암꽃 특이 촉진유전자 서열인 제1 유전자 촉진유전자 서열
(b) 제1 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된, 암컷 수정성을 파괴할 수 있는 산물을 암호화하는 파괴유전자;
(c) 하나 이상의 해독 증대자 또는 인트론 서열에 임의로 작동연결되는 수꽃 특이 촉진유전자 서열인 제2 유전자 촉지유전자 서열;
(d) 제2 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된 수컷 수정성을 복구시킬 수 있는 산물을 암호화하는 복구유전자;
(e) 하나 이상의 해독 증대자 또는 인트론 서열에 임의로 작동연결되는 외인성 화학 유도자의 존재에 반응하는 제3 유전자 촉진유전자 서열; 및
(f) 제3 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된 암컷 수정성을 복구할 수 있는 산물을 암호화하는 복구 유전자
를 포함하는 발현 카세트를 제공하여 외인성 화학 유도자 존재로 암컷 수정성을 조절하는 것이다.
본 발명의 제7의 양상은 본 발명 제5 양상의 제1 발현 시스템을 제1 식물에 합체시켜 반접합성 모 식물을 얻는 단계 및 본 발명 제6 양상의 제2 발현 시스템을 제2 식물에 합체시켜 반접합성 부 식물을 얻는 단계; 외인성 화학 유도자를 형질전환체에 가하여 식물이 자가 수분할 수 있게 하는 단계; 얻어지는 종자로부터 식물을 생장시키는 단계; 선택된 웅성 및 자성 식물을 교배시키는 단계; 및 결과하는 잡종 종자를 얻는 단계를 포함하는 잡종 종자 생성시키는 추가 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제8의 양상은 상기 기술한 발현 카세트 중 하나 및 상기 형질전환된 식물 조직으로부터 유도한 재료로 형질전환된 식물 조직을 제공하는 것이다.
본 발명의 제9의 양상은 상기 기술한 재료 또는 조직을 포함하는 수정성 전체 식물을 제공하는 것이다.
본 발명의 제10의 양상은 본 발명 제7 양상으로 얻은 선택된 식물의 자손, 상기 기술한 바와 같은 발현 카세트가 게놈에 합체된, 바람직하게는 안정하게 합체되어 있는 자손 및 이러한 식물의 종자 및 자손을 제공한다.
본 발명의 제11의 양상은 게놈이 본 발명 제5 양상의 제1 발현 카세트를 포함하는 식물을 제공한다.
본 발명의 제12의 양상은 게놈이 본 발명 제6 양상의 제2 발현 카세트를 포함하는 식물을 제공한다.
본 발명의 제13의 양상은 이들 두 식물을 교배하여 이로부터 생성되는 결과 잡종 종자를 얻음으로써 잡종 종자를 얻는 것이다.
본 발명의 제14의 양상은 본 발명 제2 방법을 잡종 종자를 얻는데 사용하는 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 제15의 양상은 제3 유전자 촉진유전자 서열에 작동연결된 복구유전자가 타겟 조직내에서 유도적으로 발현되나 하나 이상의 다른 조직내에서 본질적으로 발현될 수 있어 피과유전자가 타겟 조직에서 효과적일 뿐인 상기 기술한 발현 카세트를 식물의 게놈에 합체시키는 것을 포함하는 식물 형질전환 방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명 제1 방법에서 각 부모 식물의 게놈 DNA는 하나 이상의 해독 증대자 또는 인트론 서열에 임의로 작동연결되고 각 부모 식물의 수정성을 완전히 복구하는 유전자에 작동연결된, 외인성 화학 유도자의 존부에 반응하는 촉진유전자 서열을 포함하는 유전자 구조물을 포함하고 유전자는 외인성 화학 유도자를 식물에 가하여 발현되어 각 부모 식물이 자가수분될 수 있다.
바람직하게는, 모 식물은 화분의 수명을 현저히 감소시키거나 생존가능한 화분의 생물발생을 파괴하는 열성 유전자에 대하여 반접합성이다.
바람직하게는, 부 식물은 수정이 방해되거나 화분의 점착, 수화 또는 발아가 방해되거나 화분 튜브 생장 또는 유도를 방해하는 방식으로 배주, 화주, 기문과 같은 암꽃 구조를 파괴하는 열성 유전자에 대하여 반접합성이다.
바람직하게는, 유도성 촉진유전자 서열은 Alc A 촉진유전자 서열 또는 GST-27 촉진유전자 서열이다.
바람직하게는, 모식물은 밀, 보리, 쌀, 옥수수, 사탕무우, 토마토, 해바라기, 캐놀라, 면, 대두 및 상추와 같은 기타 식물이다.
바람직하게는, 본 발명 제1 방법으로 생성된 F1 잡종 종자는 식물로 생장하는데 이들 모두 완전히 수정성이다.
바람직하게는, 본 발명 제1 방법으로 생성된 F2 잡종 종자는 불임되도록 격리시킨 식물로 생장하는데 약 25%가 자성불임성이다.
바람직하게는, 부모의 불임성은 자연적 또는 유전적으로 조작된 돌연변이에 기인한다.
바람직하게는, 본 발명 제2 방법에 사용되는 상기 기술한 제1 발현 카세트는 화분 생성을 파괴할 수 있는 산물을 암호화하는 파괴유전자를 포함한다.
바람직하게는, 상기 기술한 제1 발현 카세트는 식물의 타펫세포에서 발현될수 있는 산물을 암호화하는 파괴유전자를 포함한다.
바람직하게는, 제1 발현 카세트내 제3 유전자 촉진유전자 서열은 Alc A 촉진유전자 서열 또는 GST-27 촉진유전자 서열이다.
바람직하게는, 본 발명 제2 방법에 사용되는 상기 기술한 제2 발현 카세트는 화분 생성을 복구할 수 있는 산물을 암호화하는 복구유전자를 포함한다.
바람직하게는, 상기 기술한 제2 발현 카세트는 타펫세포 파괴를 극복할 수 있는 복구유전자를 포함한다.
바람직하게는, 제2 발현 카세트내 제3 유전자 촉진유전자 서열은 Alc A 촉진유전자 서열 또는 GST-27 촉진유전자 서열이다.
바람직하게는, 본 발명 제2 방법에서 웅성 식물은 웅성 수정성을 복구하는 반접합성 우성 유전자를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명 제2 방법에서 자성 식물은 자성 수정성을 복구하는 반접합성 우성 유전자를 포함한다.
바람직하게는, 얻어지는 F1 잡종 종자는 제1 발현 카세트의 제1 유전자 촉진유전자 서열이 배우체 촉진유전자 서열일 경우 꽃밥에서 약 50%의 생존성 화분이 생성되는 식물로 생장한다.
바람직하게는, 얻어지는 F1 잡종 종자는 제1 발현 카세트의 제1 촉진유전자 서열이 포자체 촉진유전자 서열일 경우 모두 완전히 수정성인 식물로 생장한다.
바람직하게는, F2 잡종 종자는 불임되도록 격리된 식물로 생장하는데 이들 중 상당수가 자성불임성이다.
바람직하게는, 본 발명 제2 방법으로 얻어지는 자웅 반접합성 식물은 식물에 외인성 화학 유도자를 가하여 식물이 자가 수분하도록 함으로써 배가 및 유지된다. 이러한 점에서, 선택된 자웅 반접합성 식물의 자가수분 세대를 얻을 수 있고 잡종 종자가 필요할 경우 식물을 교배하여 잡종 종자을 얻을 수 있을 것이다.
바람직하게는, 본 발명 제2 방법에 사용되는 식물은 밀, 보리, 쌀, 옥수수, 사탕무우, 토마토, 해바라기, 캐놀라, 면, 대두 및 기타 식물이다.
바람직하게는, 본 발명 식물을 형질전환하는 방법에 사용하는 복구유전자는 본질적으로 식물이 재발생하는 유합조직에서 발현된다.
바람직하게는, 복구유전자는 암수 꽃구조에서 유도적으로 발현된다.
바람직하게는, 형질전환 방법에 사용되는 발현 카세트의 제3 유전자 촉진유전자 서열은 GST-27 또는 Alc A 촉진유전자 서열이다.
본 발명의 바람직한 구체예는 웅성불임성이고 반접합성 열성 자성불임성인 부 식물 및 반접합성 열성 웅성불임성 및 자성불임성인 모 식물을 인터플랜팅시키는 단계, 타가수분시키는 단계 및 이러부터 생성되는 종자를 얻는 단계를 포함하는 잡종 종자 제조 방법이다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예는
(a) 수꽃 특이 촉진유전자 서열인 제1 유전자 촉진유전자 서열
(b) 제1 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된, 수컷 수정성을 파괴할 수 있는 산물을 암호화하는 파괴유전자;
(c) 하나 이상의 해독 증대자 또는 인트론 서열에 임의로 작동연결되는 암꽃특이 촉진유전자 서열인 제2 유전자 촉지유전자 서열;
(d) 제2 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된 암컷 수정성을 복구시킬 수 있는 산물을 암호화하는 복구유전자;
(e) 하나 이상의 해독 증대자 또는 인트론 서열에 임의로 작동연결되는 외인성 화학 유도자의 존재에 반응하는 제3 유전자 촉진유전자 서열; 및
(f) 제3 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된 수컷 수정성을 복구할 수 있는 산물을 암호화하는 복구 유전자
를 포함하는 발현 시스템인데 이로써 외인성 화학 유도자 존재로 수컷 수정성이 조절되고 웅성불임성을 파괴할 수 있는 유전자는 식물의 타펫세포내에서 발현되는 산물을 암호화하는 파괴유전자이다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예는
(a) 암꽃 특이 촉진유전자 서열인 제1 유전자 촉진유전자 서열
(b) 제1 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된, 암컷 수정성을 파괴할 수 있는 산물을 암호화하는 파괴유전자;
(c) 하나 이상의 해독 증대자 또는 인트론 서열에 임의로 작동연결되는 수꽃 특이 촉진유전자 서열인 제2 유전자 촉지유전자 서열;
(d) 제2 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된 수컷 수정성을 복구시킬 수 있는 산물을 암호화하는 복구유전자;
(e) 하나 이상의 해독 증대자 또는 인트론 서열에 임의로 작동연결되는 외인성 화학 유도자의 존재에 반응하는 제3 유전자 촉진유전자 서열; 및
(f) 제3 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된 암컷 수정성을 복구할 수 있는 산물을 암호화하는 복구 유전자
를 포함하는 발현 시스템인데 이로써 외인성 화학 유도자 존재로 암컷 수정성이 조절되고 웅성불임성을 복구할 수 있는 유전자는 타펫세포내 화분 생성을 복구하는 산물을 암호화하는 유전자이다.
바람직한 수꽃 특이 촉진유전자 서열은 (펙틴 메틸 에스테라제에서 유도된) C5 및 MSF14 촉진유전자 서열이다.
"식물 재료"란 발달하는 곡과, 발아하는 곡과 또는 과립 또는 종자, 식물 또는 조직 또는 이의 세포, 이를테면 발달하는 곡과의 세포 또는 발아하는 종자 또는 발달하는 과립 또는 식물(예를들어 뿌리, 잎 및 줄기)을 포함한다.
"구축물", "잡종" 및 "접합체"와 같은 용어와 동의어인 "카세트"는 유전자 촉진유전자 서열에 직간접으로 결합된 대상 유전자를 포함한다. 간접 결합의 예는 대상 유전자 및 촉진유전자를 중개하는 인트론 또는 증대자 서열과 같은 적당한 이격 그룹이 제공된 것이다. 이러한 구축물은 또한 대상 세포의 형질전환에 적당한 파지 및 플라스미드를 포함한다.
"파괴유전자"는 우성 방식으로 작용하는 유전자로서 식물 생장의 적당한 단계에서 발현될 경우 식물이 통상적으로 작용하는 암꽃 구조 또는 통상적으로 작용하는 수꽃 구조를 형성하는 것을 막아 식물이 자성 또는 웅성 불임성이 되도록 할 것이다. 이러한 유전자는 융단조직 및 내피와 같은 조직을 파괴하여 효과를 발휘할 수 있을 것이다. 이 유전자는 꽃밥 및 관련 조직, 화분 모세포, 화분 및 관련조직의 세포사를 야기하는 화분 형성시 수꽃에서 특이적으로 발현할 수 있을 것이다. 이것은 또한 기문에서 발현하거나 화주관을 통과하여 화분 점착, 수화, 화분 발아 및 화분 튜브 생장 및 유도를 저해할 수 있을 것이다. 파괴유전자의 기원은 여러가지 자연 발생하는 공급원, 즉 인간 세포, 박테리아 세포, 이스트 세포, 식물 세포, 균 세포일 수 있고 또는 DNA 서열로 이루어질 수 있는, 약간은 자연에서 발견되고 약간은 자연에서 통상적으로 발견되지 않으며 또는 이 둘의 혼합물인 완전 합성 유전자일 수 있다. 이들 유전자는 바람직하게는 수정성 화분 생성에 양호한 에너지 공급원이 절대적으로 필요함이 공지되어 있는 바와 같이 미토콘드리아 대사에 영향을 미칠 것이다. 그러나 파괴유전자는 DNA 및 RNA 대사, 단백질 합성 및 기타 대사 경로와 같은 기타 필수적인 생화학적 작용에 효과적으로 타겟이 될 수 있을 것이다.
"복구 유전자"는 우성 방식으로 작용하는 유전자로서 발현될 경우 파괴유전자의 효과를 복구할 것이다. 바람직한 우성 복구유전자는 바스타이다.
"암꽃"은 암 생식 기관의 모든 것을 포함하는 것으로 의도되어 자방, 암술, 화주, 기문, 도관, 태반을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"수꽃"은 수꽃의 모든 부분을 포함하는 것으로 의도되어 융모, 꽃밥, 수술, 화분을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명 잡종 종자 생성 방법들은 상이하나 여러면에서 현존 방법에 비하여 많은 이점을 가진다. 웅성 및 자성불임성 둘다를 이용하는 것은 기술된 바 없다. 이러한 특징은 한쪽 부모의 자가수분을 방해하므로 자웅 모체 블록을 분리 플랜팅할 필요없이 잡종 종자를 생성시킬 수 있다. 이러한 자웅 모체 식물 인터플랜팅은 본질적으로 자가수분체인 밀 및 쌀과 같은 작물의 타가수분 가능성을 최대화한다. 밀 및 쌀의 예에서, 블록 플랜팅하지 않을 경우 이 방법은 모의 수정후 부
화학적으로 유도가능한 복구 시스템은 잡종 종자 생산 과정보다는 동형접합성의 부모계의 유지에 필요하다. 이것은 화학물질을 제한된 부분에 가끔씩만 가한다는 것을 의미한다. 많은 파괴-복구 시스템 또는 작동-억제 시스템을 본 발명에 사용할 수 있을 것이다.
웅성 및 자성불임성을 조절하는 본 발명 발현 카세트를 함유하는 식물을 또한 별도로 사용하여 다른 부모계를 가지는 F1 잡종을 만들 수 있을 것인데 이것은 꽃밥 또는 자방의 기계적 제거 또는 화학적 살배우체 제제의 사용과 같은) 적당한 다른 웅성 또는 자성불임성 조절 수단을 상대계에 사용할 경우 발현 카세트를 함유하지 않는다. 이들 F1 잡종으로부터 얻어지는 자손을, 분자로 발현 카세트 존재를 선별하면서, 적절한 수의 세대를 얻기 위해 다른 잡종 부모와 역교배할 경우 생화학 또는 자손-테스트 기법, 자웅 수정성 조절 시스템은 새로운 부모 배경으로 옮겨지거나 침투될 수 있다. 이와는 다르게 다른 부모계와의 F1 잡종은 적절한 자웅 수정성을 복구하는 외인성 화학 유도자의 도포로 자가-수분되어 정상적인 식물 번식 과정을 통하여 발현 카세트를 함유하는 새로운 잡종 부모를 선별할 수 있다. 이러한 유전자 침투 및 식물 번식의 사용은 본 발명 잡종 종자 생성 방법을 신규한 및 존재하는 F1 잡종 부모 조합과 함께 사용할 수 있게 할 것이다.
외인성 화학물질을 가하여 유도할 수 있는 촉진유전자는 업계에 공지되어 있다. 적당한 유도성 촉진유전자는 제초제 안전제와 같은 화학물질을 가하여 활성화되는 것들이다. 유도성 촉진유전자의 예는 우리의 국제 공개공보 제WO93/21334호에 기술된 Alc A/R 스위치 시스템, 국제 공개공보 제WO90/08826호 및 제WO93/031294호에 기술된 GST 스위치 시스템 또는 국제 공개공보 제WO96/37609호에 기술된 엑디손 스위치를 포함한다. 이러한 촉진유전자 시스템은 본원에서 "스위치 촉진유전자"로 언급된다. 스위치 촉진유전자와 함께 사용되는 스위치 화학물질은 이들 촉진유전자를 본 발명 방법에 특히 유용하게 만드는 농업적으로 허용가능한 화학물질이다.
본 발명에 Alc A/R 스위치 시스템의 성분인 Alc A 촉진유전자를 사용하는 한가지 이점은 사용되는 화학 유도자가 에탄올이라는 점이다. 이 화학물질은 뿌리 담금액, 수성 분무액 또는 기체로 도포할 수 있다는 점에서 유리하다. 1% 농도에서 효과적이고 작동유전자 및 환경에 무독성이다.
본 발명은 육종가 또는 재배자가 F1 잡종 종자로 생산하기를 원하고 적당한 형질전환 기법을 이용할 수 있는 혹종의 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물, 특히 밀 및 쌀 작물에 사용할 수 있다. 본 발명은 F1 잡종 종자 생산과 관련한 재배 비용을 감소시키는 이점이 있으며 잡종 종자의 순도 조절 및 부모계의 유지가 용이하다.
구체적인 용도로, 본 발명은 분자 공학 기법을 사용하여 불임성이 된 웅성 및 자성 모 식물의 생산에 관한다. 이들 식물의 불임성은 수정성 복구를 유도하는 화학물질을 도포하여 복구시킬 수 있다.
꽃밥은 꽃식물의 웅성 생식 과정 부위이다. 이것은 몇가지 조직 및 세포형으로 이루어지며 정자 세포를 포함하는 화분 입자 생성을 맡고 있다. 융모조직은 화분 형성에 중요한 역할을 하는 특수 조직이다. 이것은 화분 발달 초기에 화분 주머니를 둘러싸고 발달의 후기에 퇴화하여 성숙한 꽃밥의 조직된 형태에 존재하지 않는다. 융모조직은 화분 발달을 돕거나 화분 외벽에 포함되는 다수의 화합물을 생산하는데 자연적인 웅성 불임 돌연변이의 다수가 융모조직 분화 또는 기능 손상인 것으로 밝혀졌다. 따라서 융모조직은 기능적인 화분 입자 형성에 중요하다.
융모조직에서 특이적으로 발현되는 다수의 유전자가 확인 및 복제되었다. 이들은 Osg6B, Osg4B(Tsuchiya등 1994, Yokoi S등 1997), pE1, p T72(WO9213957), p CA55 콘(WO92/13956), TA29, TA13(Seurinck등, 1990), RST2 콘(WO9713401), MS14, 18, 10 및Brassica napus로부터의 A6, A9(Hird등 1993)를 포함한다.
쌀에서 분리한 융모조직 특이 촉진유전자는 담배에서 β1,3 글루카나제의 발현을 유도하는데 사용할 경우 웅성 불임성 식물로 생장하는 것으로 밝혀졌다(Tsuchiya등 1995). 바나제 발현을 유도할 경우 융모조직 특이 촉진유전자 T29는 웅성 불임성 담배를 생산하는데(Mariani 1990), pCA55, pE1 및 pT72는 웅성 불임성 밀을 생산하는데(De Block 1997) 사용되었다.
화분 특이 복제물은 옥수수(Hanson등 1989, Hamilton등 1989) 및 토마토(Twell등 1990, 1991)를 포함하는 다수의 종으로부터 얻었다.
꽃밥 특이 복제물은 다수 종, 특히 Brassica napus로부터의 Bp4A 및 C(Albani등 1990), 페투니아로부터의 chs(Koes등 1989), 쌀(Xu등 1993, Zou등 1994)에서 분리하였다.
이들 복제물의 밀 상동물 및 다른 것들은 문헌에서 발견되는 서열을 이용한 퇴화 PCR 및 밀 및 다른 게놈 라이브러리의 추후 스크리닝 및 복구 유전자의 발현을 이용한 조직 특이성 분석과 같은 방법으로 얻을 수 있을 것이다. 이들 방법은 문헌에 잘 나타나 있다.
고등 식물에서 자성 생식 기관은 자방, 화주 및 기문으로 이루어지는 암술로 대표된다. 암술군은 다른 기관에 존재하지 않는 10,000개 이하의 상이한 mRNA를 함유하는 것으로 밝혀졌다(Kamalay 및 Goldberg 1980). 이들은 암술내 분화된 세포형들과 관련된 단백질을 암호화하는 "다운스트림" 뿐만 아니라 암술 발달을 조절하는 역할을 하는 조절 유전자를 포함한다. 자기-불화합성 및 이들의 상동기관을 지배하는 유전자는 주요 암술 발현 패턴을 포함하는 한부류의 유전자이다(Nasrallah등 1993). 기타 복제된 유전자는 β글루카나제(Ori등 1990), 펙테이트 리아제(Budelier등 1990) 및 관조직에서 발현되는 키티나제(Lotan등 1989) 및 화주에서 발현되는 프로테이나제 저해제(Atkinson등 1993)를 포함한다. 다른 것들은 병원 관련이거나 글리코시드 결합의 절단에 관련된 상동 유전자이다. 이들 효소는 화분 튜브가 생장하는 조직에서 단백질을 이화시켜 화분 튜브 생장을 용이하게 할 수 있을 것이다.
다수의 자성 불임성 돌연변이는 Arabidopsis에서 확인되었다. 예를들어 sin1(Robinson-Beers, 1992) 및 bell(bell)(Robinson-Beers 1992)은 자방 발달에 영향을 준다. Aintegumenta 돌연변이는 4분 염색체 단계에서 대포자발생을 막는다(Elliot,R.C등 1996, Klucher,K.M, 1996). 치사 자방 돌연변이 2는 관찰되었으나 옥수수에서 클론되지 않았다(Nelson등 1952). 암술특히 엔토키티나제는 다수의 종으로부터 클론되고(Ficker등 1997, Dzelzkalns등 1993, Harikrishna등 1996, Wemmer등 1994) 엑스텐신-류 유전자는 Nicotiana alata의 화주에서 발현되는 것으로 밝혀졌다(Chen C-G등 1992).
다음은 자방 특이 복제물 ZmOV23,13(Greco R, 비공개), OsOsMAB3A(Kang H.G등 1995), ZmZmM2(Theissen G등, 1995) 및 기문 특이 stig(Goldman, M.H등 1994), STG08, STG4B12(EP-412006-A)이다. Goldman등은 STIG1으로부터의 촉진유전자를 기문 분비존의 바나제 발현을 유도하는데 사용하였다. 이것은 암술에 분비존을 가지지 않는 꽃을 유도하므로 자성 불임성이었다. 화분 입자는 발아할 수 있으나 표면을 침투할 수 없었다.
오키드에서 7개의 자방 특이 cDNA를 분리하였다(Nadeau등 1996). 다시, 표준 분자 생물학 기법으로 이들의 밀 상동물등을 얻을 수 있을 것이다.
본 발명 방법의 또다른 양상은 웅성 및 자성 불임성에 영향을 미치는 유전자의 확인이다. 이러한 유전자는 불임성을 조절하는 여러가지 시스템에 사용할 수 있다.
전이성 인자를 가지는 옥수수 유전자를 태깅시키는 절차가 재검토되었다(Doring, 1989). 사용할 수 한 방법은 전이성 인자를 포함하지 않는 통상적인 옥수수 균주와 타겟 유전자의 우성 대립형질 및 호라성 전이성 인자를 포함하는 옥수수 계통을 교배시키는 것이다. 이러한 교배로 얻어지는 자손은 자가수분하거나 가장 바람직한 돌연변이, 즉 불임인 것들을 스크리닝할 수 있다. 전이성 인자를 수정성에 필수적인 유전자를 함유하는 곳으로 유전자는 여러가지 방법으로 회복시킬 수 있을 것이다. 미국 특허 제5,478,369호는 MS45로 기술된 유전자를 이 방법으로 분리하는 것에 대하여 기술하고 있다.
웅성 불임성은 En/SpmI/dSpm 전이성 태킹 시스템을 사용하여 웅성 불임성 2(ms2) 돌연변이 및 MS2 유전자를 얻음으로써 Arabidopsis thaliana에서 확인하였다. 이 MS2 유전자는 웅성 배우체 발생에 관련되는 것으로 보여졌고 세포벽 합성은 미세포자 모세포 감수분열 후 진행되지 않아 미세포자가 실질적으로 퇴화한다. MS2의 동형접합은 Brassica napus, Zea Mays에서 확인되고 오픈 리딩 프레임은 밀 미토콘드리아 DNA에서 발견되었다. 따라서 Arabidopsis에서 수정성에 중요한 유전자의 분리는 다른 종에서 동형접합체의 클로닝을 유도한다. 이러한 방법은 명백히 수정성에 중요한 다른 유전자를 분리하는데 취해질 수 있다.
이제 유전 수준에서 풀류 사이에 넓은 보존 영역이 존재하는 것은 명백하다. Ahn 및 Tranksley(1993)는 쌀 및 옥수수 사이의 관계를 보였고 Kurata등(1994)은 밀 게놈이 쌀과 함께 배열될 수 있음을, Moore등(1995)은 세 지도 모두를 배열할 수 있음을 보였다. 이것은 유전자 분리 수단으로서 비교 게놈 맵핑의 사용 방법을 열은 것이다.
유전자 클로닝에 대한 마이크로신테니 방법은 진화적으로 관련된 종간의 유전자 질서 및 분자 마커 유사성을 기초로 한다. 이 방법은 특히 작은 게놈 친족인 쌀을 이용할 수 있는 밀, 옥수수 및 보리와 같은 농업적으로 중요한 큰 게놈 작물종에 유리하다. Kilian등(1997)은 인터게놈 맵핑체로서 쌀을 사용하여 보리RpgI 및 rpg4 유전자를 맵-기준 클로닝하는 방법에 대하여 보고하였다.
상기 방법은 유전적으로 맵핑된 타겟 유전자에 한정되므로 효과적인 전이 태깅 시스템인 다른 유전자 분리 방법이 Izawa(1997)등의Ac/Ds시스템을 사용하는 쌀에서 개발되고 있다.
다수의 방법들이 수정에 필요한 유전자를 비활성화시키거나 배우체의 정상적인 생장을 방해하는 조직내 세포독성 화합물을 생성시키는데 유용하다고 제안되었다.
우리의 국제 특허 출원 제PCT/GB96/01675호는 zANT, 투불린, T-urf, ATP-아제 구성단위, cdc25, ROA, MOT에서 선택된 파괴유전자를 사용하여 타겟 식물 조직에서 유전자가 발현되는 것을 막는 방법에 대하여 기술한다.
몇가지 다른 공지된 비활성 시스템이 있다. 예를들어 바나제(Mariani등 1990), 디프테리아 톡신 A-사슬, 펙테이트 리아제. 앞서 기술한 세포독성 화합물을 발현시키는 두가지 예는 아비딘 발현 및 IamH/IamS이다.
융모조직 세포에서 β-1,3-글루카나제의 발현은 웅성 불임 식물을 발생시키는 것으로 보여진다(Worrall등 1992). 화분 발달에 중요한 유전자의 발현을 하향 조절할 수 있는 메카니즘으로서 안티-센스가 제안되었고 플라보노이드 생합성의 안티센스 저해는 사실 웅성 불임성을 초래하지 않는 것으로 밝혀졌다(Van der Meer 1992). 플라보노이드 발현 감소는 웅성 불임성을 얻기 위하여 옥수수에서 요구되었다(WO 93 18171 Pioneer Hi-Bred International). 다른 메카니즘 또한 기술되어 있다(Spena등 1992).
Baulcombe(1997)는 내인성 유전자의 발현을 말살하는 수단으로 유용할 수 있는 복제가능한 바이러스성 RNA 벡터(Amplicons)를 사용하여 형질전환 식물에서 유전자 잠재 방법에 대하여 기술한다. 이 방법은 우성 돌연변이를 생성시킨다는 것, 즉 이형접합 상태에서 유리하고 표적 유전자의 모든 복제물을 억제하고 동형도 억제할 수 있다는 이점이 있다. 이것은 육배체인 밀에서 명백히 유리하다. 수정성은 억제된 유전자의 관능적인 복제 발현을 유도하는 유도성 촉진유전자를 사용하여 복구될 수 있을 것이다.
Kempin(1997)등은 상동 재조합을 사용하여 관능 유전자를 타겟 파괴하는 것에 대하여 보고한다. 그러나 이 방법은 통상적으로 열성 돌연변이를 생성시켜, 즉 동형접합체에서만 유리하다. 이형접합 상태에서 검출될 수 있도록 이것은 직접 치사성이거나 예를들어 치사를 초래하는 세포독성 화합물이 쌓이도록 경로중 블록킹을 일으켜야 할 것이다. 자손의 넷중 하나가 불임인 불임 돌연변이를 검출하기 위하여 자가수분으로 열성 동형접합체를 생성시키는 것이 필요할 것이다. 억제된 유전자의 발현을 허용하는 스위치 구축물은 동형접합체를 역교배하여 얻어진 이형접합체로 도입되어야 할 것이다. 이것은 실시예1에 기술한 방법에 필요한 열성 돌연변이를 생성시킬 수 있는 유용한 방법이다.
리보자임은 엔도누클레오티드 분해 절단 반응을 촉매할 수 있는 RNA 분자이다. 이들은 트랜스로 반응을 촉매할 수 있고 상이한 서열에 타겟팅될 수 있으므로 유전자 발현을 모듈하는 수단으로서 가능한 안티센스 대체물이다(Hasselhof 및 Gerlach). Wegener등(1994)은 식물의 리보자임 유전자 발현에 의한 트랜스-우성돌연변이의 발생을 증명하였다.
자기-불화합성 식물이 자기-화합성으로 전환되거나 자기-화합성 식물이 자기-불화합성으로 젼환되어 자가-수분을 막는 방식으로 리보누클레아제를 암호화하는 배우체 S-유전자를 이용하는 구축물로 식물을 형질전환시키는 웅성 불임성 유도 수단으로서 S-유전자 발현을 변화시킴으로써 식물의 자기 불화합성 시스템을 대체하는 여러가지 방법이 공지되어 있다.
파괴유전자/복구유전자 조합의 예는 바나제 및 바스타 및 TPP 및 TPS를 포함한다. 먼저 불임성을 발생시킨 다음 수정성을 복구하는 바나제/바스타 시스템의 사용은 기술되었다(Mariani등 1992). Antirrhinum에서 얻어지는 융모조직 특이 촉진유전자 Tap1을 이용하여 담배의 융모조직 세포에서 발현될 경우(Nacken등 1991) 트레할로제 포스페이트 포스파타제(TPP)는 웅성 불임성을 유발한다. 이것은 이것이 발현되는 조직의 카보하이드레이트 대사 및 광합성 능력을 변화시킨 결과로 사료되어진다. 꽃밥은 네크로시스의 징후를 보이며 얻어지는 혹종의 화분은 죽어 있다. 야생형 담배와의 역교배로 정상적인 종자 발달이 이루어진다. 자손 분석은 불임성이 트랜스 유전자로 이탈됨을 보인다. TreC, 트레할로즈-6-포스페이트 하이드롤라제는 그 발현으로 트레할로즈-6-포스페이트 레벨을 교란시키는 제2 유전자이고 구성 플래스토시아닌 촉진유전자를 사용하여 발현될 경우 개화전에 싹이 제거되는 결과가 보여진다. 따라서, 발현이 융모조직에 한정될 경우 TPP가 융모조직에서 발현되는 것과 동일한 방식으로 웅성 불임성이 될 수 있을 것이다. 또한 GA 적용후 꽃봉오리는 식물 상에 남아있고 약간의 화분이 생성되어 몇몇의 경우 종자 생성을 유발하는 것으로 보여졌다.
동시에 트레할로즈 포스페이트 신타제(TPS) 및 TPP를 동몰 발현시키는 것은 식물 생리학에 전혀 영향을 주지 않음, 즉 TPS는 발현되는 조직의 카보하이드레이트 대사 및 광합성 능력에 미치는 TPP의 영향을 상쇄한다. 또한 융모조직내 TPS를 발현시키는 구축물로 불임성 담배 계통을 재형질전환시켜 수정성을 복귀할 수 있을 것으로 보여진다. 또한 바란다면 수정성이 복귀되도록 하는 유도성 촉진유전자를 조절하여 TPS를 발현시키거나 GA 적용을 최적화하는 것이 수정성을 복귀하는 대안일 수 있을 것이 분명하다. MADS 박스 유전자 FBP7과 같이 자방 주위 또는 내부의 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자로부터의 촉진유전자를 사용하여 TPP 또는 TreC의 발현을 유도하거나 자성 불임성을 얻을 수 있을 것이다. 밀 또는 옥수수, (Merlo 및 Folkerts), (Seed 및 Haas)와 같은 외떡잎 작물에서 동일한 효과를 얻기 위하여 코돈 사용의 최적화가 요구될 수 있을 것이다.
식물내 유전자 발현을 조절하는 수단으로서 다수의 작동유전자/억제유전자 시스템의 사용이 기술되었다. Wilde등은 E.coli lac 시스템을 사용하여 옥수수 캡 촉진유전자 조절하에 GUS의 발현(35S CaMV 촉진유전자에 의하여 야기되는 lac I 발현)을 억제하는 것을 밝혔다. 작동유전자 서열을 CAB 촉진유전자내 여러 위치에 삽입하여 억제 정도를 평가하였다. 작동유전자 서열의 위치에 따라 억제 범위를 관찰하였다. TATA 박스 및 전사 스타트 간의 치환에 의하여 작동유전자 서열을 포함시킬 경우 약 90% 이상 억제되었다. 이러한 억제는 IPTG를 가하여 완화시킬 수 있다. 이것은 담배 원형질체 및 안정한 형절전환체 둘다에서 보여졌다.
Lehming등은 lac 억제 유전자의 인식 나선에서 아미노산을 개질시켜 발현을 더 타이트하게 조절함으로써 결합 친화도를 극적으로 변화시킬 수 있다고 보고한다. 기타 이러한 시스템이 기술되었으며 개질된 35S CaMV 촉진유전자가 식물내에서 억제되어 테트라씨클린 억제 단백질이 높은 정도로 발현되나 테트라씨클린을 가할 경우 복구되는 Gatz(1991, 1992)등의 테트라씨클린 유도성 촉진유전자 시스템을 포함한다.
단백질 활성의 스테로이드 유도는 화학적인 독성 문제가 없는 화학적 유도성 발현 시스템을 제공할 수 있다. 글루코코르티코이드 수용체(GR), 오에스트로겐 수용체와 같은 포유류 및 곤충 스테로이드 수용체의 리간드 결합 도메인을 사용하여 포유류 세포의 단백질 활성을 조절할 수 있다(Picard등 1993). 단백질에 융합된 리간드 결합 도메인은 리간드가 도입될때까지 단백질을 비활성 상태로 유지한다. Lloyd등(1994)은 옥수수 전사 조절제의 융합을, GR. Simon(1996)등은 전사 유도를 맡는 Arabidopsis 개화기 유전자 산물과 GR의 융합을,Aoyama(1995)등은 GR 리간드-결합 도메인을 이용하여 스테로이드 조절하에 넣은 트랜스활성 단백질, Athb-1과 Ga14 또는 VP16의 융합을 기술한다. DNA를 결합시키는 동시에 전사를 활성화시키는 전사 활성화제의 능력은 이러한 전사 인자의 정해진 도메인으로 국소화됨은 공지되어 있다. 전사 활성화제 인자는 독립적으로 작용 모듈로 이루어짐이 밝혀졌다(Ptashne 1988, Mitchell 및 Tijan 1989). Ptashne 및 Gann(1980)등은 한 인자의 전사 활성을 맡는 단백질을 다른 인자의 DNA 결합 부분과 조합시켜 이스트 세포에서 잡종 단백질을 활성화시킬 수 있음을 보였다. 이들 성분들을 함유하는 시스템을 사용하여 억제를 완화하여 조절된 방식으로 유전자의 발현을 유도할 수 있을 것이다.
복구유전자 매개된 전이활성화에 의하여 식물내 유전자 발현을 조절하는 화학 리간드로서 용화 억제 호르몬 또는 작동약 중 하나를 사용하는 것에 대하여도 기술되었다.
바람직하게는 복구유전자를 유도적으로 발현시키는데 사용되는 스위치 시스템은 AlcA/R 스위치 시스템이다. 우리는 토마토 꽃밥 및 화분내 GUS의 유도성 발현을 밝혔고 밀에 유사한 구축물을 유도하여 AlcA/R 스위치 시스템을 사용한 웅성 및 자성 조직 GUS 발현을 밝혔다. 우리는 또한 안전제 유도성 GST 스위치 시스템을 사용하여 옥수수 수염, 배 및 내배유에서 GUS 발현을 유도하는 것을 밝혔다(Jepson등 1994). 기타 스위치 시스템 또한 물론 본 발명에 유용할 수 있을 것이다.
타겟 조직 이외의 조직에서 낮은 정도의 수꽃 및 암꽃 특이 촉진유전자의 "누수" 발현 결과 식물 형질전환시 세포독성 또는 파괴유전자의 발현으로 세포사를 유발하고 형질전환체의 회수가 이루어지지 않을 수 있을 것이다. 복구유전자의 발현을 유도하기 위하여 본 발명에 사용되는 유도성 촉진유전자는 다음 이유에서 이러한 가능성을 막을 수 있을 것이다.
GST-27 촉진유전자의 경우 칼루수에서 근본 발현이 관찰된다. 에탄올로 유도되는 AlcA 촉진유전자의 경우 7ng/100ml의 공기 농도에서 GUS 발현 유도가 관찰되었다. 이 농도의 에탄올을 조직 배양 매질에 가하여 복구유전자의 발현을 확보할 수 있다.
파괴유전자/복구유전자의 조합 예는 바나제 및 바스타 및 TPP 및 TPS를 포함한다.
전사 증대 서열, 특히 TMV Ω서열(Gallie등)의 사용은 복구유전자 즉 바스타의 발현이 파괴유전자 즉 바나제가 생성되는 것을 막기에 필요한 만큼 진행되도록 구성 조직 특이성 및 유도성 촉진유전자로부터의 발현 정도를 증가시키기 위하여 본 발명에 바람직하다. Gallie등은 원핵 및 진핵 mRNA의 번역이 68 누클레오티드, 담배 모자이크 바이러스의 5' 리더 서열, Ω로 불리는 U1 균주의 접촉 유도에 의하여 크게 증대됨을 보였다. 몇몇 다른 바이러스 리더 서열 또한 알팔파 모자이크 바이러스(A1MV) 및 브룸 모자이크 바이러스(BMV)와 같이 발현을 증대시키는데 보여졌다. 담배 엽육 원형질체에서는 약 20배 증대가 관찰되었다. 예를들어 담배 에치 바이러스와 같은 기타 증대 서열 또한 본 발명에 사용할 수 있을 것이다.
또한, 발현 정도를 증대시키는데 인트론 서열을 사용하는 것은 잘 기술되어 있다. 이들 중, 옥수수 원형질체에 도입되는 키머 구축물내 5' 번역 서열에 삽입시킬 경우 12-20배 발현 정도를 증가시키는 것으로 보여지는 옥수수 adh 1 인트론 1 서열(Mascarenhas등 1990) 및 역시 옥수수로부터의 sh 1 인트론이 연구되었다. CaMV35S 촉진유전자가 CAT 발현을 유도하는 구축물에 이러한 인트론을 합체시키는 것은 11-90배의 증가를 가져왔다(Vasil등 1989).
복구유전자 및 파괴유전자의 발현 정도는 또한 다음 방식으로 균형 및 조절될 수 있다. 복구 유전자를 발현시키기 위하여 발현 정도를 높이는 촉진유전자를, 반면 파괴 유전자를 발현시키기 위하여 발현 정도를 낮추는 촉진유전자를 사용할 수 있을 것이다. 이것은 파괴유전자 생성물이 복구유전자 생성물에 의하여 압도되어 세포독 또는 파괴유전자 분자를 모두 비활성화시켜 수정성이 완전히 복구되게 할 수 있을 것이다. 발현 정도를 조절하는 또다른 방법은 파괴유전자의 발현이 최적이 아니어서(Kozak 1989) 하향 조절되도록 AUG 개시 코돈 주위의 서열을 변화시켜 돌연변이법으로 수행할 수 있을 것이다.
본 발명 발현 시스템은 형질전환되는 구체적인 식물 종에 따라 Agrobacterium 형질전환체, 전기영동, 식물 세포 및 원형질체의 마이크로주입, 마이크로투사 충격, 박테리아 충격, 특히 "섬유" 또는 "휘스커" 방법과 같은 이용가능한 혹종의 방법으로 식물 또는 식물 세포내에 도입시킬 수 있다. 이후 적당한 경우 형질전환된 세포들은 신규한 핵물질이 게놈에 안정하게 합체된 전체 식물로 재생될 수 있을 것이다. 형질전환된 외떡잎 및 쌍떡잎 식물 모두 이러한 방식으로 얻을 수 있을 것이다. 공지된 방법의 상세한 사항은 모두 문헌을 참조할 수 있을 것이다.
Christou 및 Heie(1997)는 충격 방법을 사용한 쌀의 형질전환 및 Agrobacterium tumefaciens로 매개되는 쌀 형질전환 과정을 기술한다.
밀을 형질전환시키는 다른 공지된 방법은 배반 조직의 마이크로투사 충격의 사용을 기술한 Becker(1994)등 및 미성숙 배의 직접 충격을 따르는 형질전환 밀의 빠른 생성을 기술한 Vasil(1993)등을 포함한다. 도22는 충격에 의한 밀 형질전환의 타인라인을 나타낸다. 불임 구축물을 포함하는 형질전환체를 선별하기 위하여형질전환 방법에 선택 마커의 사용이 요구된다. 제초제 내성 유전자 또는 다른 마커의 사용이 잡종 종자 생산 과정에 필수적인 것은 아니다(그러나 편리하다고 사료되어질 수 있음). 본 발명 제2 방법에 사용되는 이형접합 식물은 자가 수분이 일어나게 하는 복구유전자의 발현을 유도하는 화학물질로 처리할 수 있다. 이러한 자가 수분의 자손은 분리하여 생장, 화학물질로 처리 및 자가 수분시킬 수 있다. 동형접합 계통의 자손은 불임을 위하여 분리시키지 않을 것이다. 이후 동형접합 불임 종자를 불리기 위하여 과정을 반복할 수 있을 것이다.
본 발명 발현 카세트의 개개의 성분은 하나 이상의 개별 벡터 상에 제공될 수 있을 것이다. 이들을 식물 세포의 형질전환 또는 동시-형질전환에 사용하여 요소 사이의 적절한 상호작용이 일어나게 할 수 있다.
이제 본 발명을 다음 도면을 참조로 실시예에 의하여 기술하기로 하겠다.
도1은 동형 열성 웅성 불임 모를 이용한 잡종 종자 생산 제1 방법에 사용되는 발현 카세트를 도식적으로 나타낸 것이다.
도2a 및 2b는 본 발명 제1 방법에 따른 열성 웅성 불임 모 및 자성 불임 부로부터의 F1 잡종 종자 세대 및 F2 세대에서의 분리를 도시한다.
도3은 제2 잡종 종자 생산 방법에 사용되는 발현 카세트를 대략적으로 도시한다.
도4는 수꽃 특이 촉진유전자 및 자성 조직 특이 촉진유전자를 사용하는 웅성 불임 자성 불임 모식물의 생산에 사용되는 발현 카세트를 도식적으로 나타낸 것이다.
도5는 수꽃 특이 촉진유전자 및 암꽃 특이 촉진유전자를 사용하는 웅성 불임 자성 불임 모식물의 생산에 사용되는 발현 카세트를 도식적으로 나타낸 것이다.
도6a, 6b 및 6c는 본 발명 제2 방법에 따른 포자체 촉진유전자 조절하에 웅성 불임성 모식물 및 자성 불임성 부식물을 사용하는 F1 잡종 식물 세대, F1 잡종 종자 생성 및 F2 자손의 분리를 도시한다.
도7a, 7b 및 7는 본 발명 제2 방법에 따른 포자체 촉진유전자 조절하에 자성 불임을, 배우체 촉진유전자 조절하에 웅성 불임을 조절하여 웅성 불임성 모식물 및 자성 불임성 부식물을 사용하는 F1 잡종 식물 세대, F1 잡종 종자 생성 및 F2 자손의 분리를 도시한다.
도8은 바이너리 식물 형질전환 벡터 pMOG1006를 도시한다.
도9는 바이너리 식물 형질전환 벡터 pMOG1006-FSE를 도시한다.
도10은 클로닝 벡터 pFSE4를 도시한다.
도11은 노던 분석으로 여러가지 옥수수 조직에서의 GST 발현을 도시한다.
도12는 GST 촉진유전자에 의한 담배잎에서의 GUS 리포터 유전자의 유도 발현을 도시한다.
도13은 GST 촉진유전자에 의한 옥수수잎에서의 GUS 리포터 유전자의 유도 발현을 도시한다.
도14는 GST 촉진유전자에 의한 옥수수대에서의 GUS 리포터 유전자의 유도 발현을 도시한다.
도15는 옥수수 내배유에서의 GUS 리포터 유전자의 유도 발현을 도시한다.
도16은 pPUG 및 RMS-3 클로닝 방법을 도시한다.
도17은 pGSTTAK 벡터를 도시한다.
도18은 RMS-3 벡터를 도시한다.
도19는 pSRN.AGS 지도, 쌍떡잎 종에 사용하는 유도성 GUS 발현 벡터를 도시한다.
도20은 pSRN.AGS 클로닝 방법, 쌍떡잎 종에 사용하는 유도성 GUS 발현 벡터를 도시한다.
도21은 pUIRN.AGS 지도, 외떡잎 종에 사용하는 유도성 GUS 발현 벡터를 도시한다.
도22는 충격에 의한 밀 형질전환 타임라인을 도시한다.
도23은 pSRN의 지도를 도시한다.
도24은 pAGS의 지도를 도시한다.
도25는 pMOG1006-SRN.AGS, 쌀 형질전환 벡터의 지도를 도시한다.
도26은 pGUN의 지도를 도시한다.
도27은 pdvh405의 지도를 도시한다.
도28은 Tap1AlcR-AlcAGluGUSIntnos를 나타낸다.
도29는 Stig1AlcR-AlcAGluGUSIntnos를 나타낸다.
도30은 옥수수 형질전환 벡터 Zm/RMS14를 나타낸다.
도31은 쌀 형질전환 벡터인 pMOG1006-C5-GUS를 나타낸다.
도32는 클로닝 벡터 pFSE를 나타낸다.
도33은 쌀 형질전환 벡터인 pMOG1006-MFS14-GUS를 나타낸다.
도34는 카세트A, MFS14-바나제/바스타-노스를 나타낸다.
도35는 카세트B, C5-바나제/바스타-노스를 나타낸다.
도36은 카세트C, CaMV 35S-AlcR-nos를 나타낸다.
도37은 카세트D, AlcA.Glu11-바스타-노스를 나타낸다.
도38은 카세트E, MFS14.Glu11-바스타-노스를 나타낸다.
도39는 카세트F, Stig1-바나제/바스타-노스를 나타낸다.
도40은 카세트G, Stig1.Glu11-바스타-노스를 나타낸다.
도41은 RMS30를 나타낸다.
도42는 RMS32를 나타낸다.
도43은 유도되지 않은 및 에탄올 유도된 야생형 및 형질전환 Alc-GUS 담배 칼루스에서의 GUS 발현을 나타낸다.
도44는 유도되지 않은 및 에탄올 증기 유도된 야생형 및 형질전환 Alc-GUS 담배 꽃밥에서의 GUS 발현을 나타낸다.
도45는 상기와 같으나 물 및 에탄올로 뿌리를 담궈 유도한 것이다.
도46은 유도되지 않은 및 유도된 암술에서 9-10mm 의 담배 꽃봉오리로부터의 GUS 발현을 나타낸다.
도47은 유도되지 않은 및 유도된 암술에서 17-22mm 의 담배 꽃봉오리로부터의 GUS 발현을 나타낸다.
도48은 유도되지 않은 및 유도된 암술에서 33-35mm 의 담배 꽃봉오리로부터의 GUS 발현을 나타낸다.
도49는 유도되지 않은 및 평지유씨 꽃에서의 GUS 발현을 나타낸다.
도50은 유도되지 않은 평지유씨 꽃을 나타낸다.
도51은 뿌리 담금 유도 2일후 평지유씨 암술에서의 GUS 발현을 나타낸다.
도52-55는 에탄올 유도된 평지유씨 꽃의 기문 및 화주에서의 GUS 발현을 나타낸다.
도56은 야생형 및 수 유도된 Alc-GUS 평지씨유 암술을 나타낸다.
도57은 2% 에탄올 뿌리 담금 2일후 Alc-GUS 평지씨유 암술을 나타낸다.
도58은 수처리 및 5% 에탄올 처리시킨 Alc-GUS 암술을 나타낸다.
도59는 유도후 평지씨유 꽃을 나타낸다.
도60a는 Alc A 촉진유전자에 유도되는 토마토 꽃밥에서의 GUS 발현을 나타내고 60b는 Alc A 촉진유전자에 유도되는 토마토 화분에서의 GUS 발현을 나타낸다.
도61은 옥수수에서 ZmC5 촉진유전자 서열을 암호화하는 DNA 서열을 나타낸다.
밑줄친 A는 추정되는 전사 개시 포인트 및 굵은 밑줄친 ATG는 번역 개시 포인트이다.
실시예 1
이 실시예에서 자연 또는 공학적 돌연변이 결과 부식물은 웅성 불임성이고 동형접합 자성 불임성이다. 모식물은 동형접합 열성 웅성 불임성 및 자성 불임성이다. 웅성 불임성은 유전조작되거나 교배에 의하여 유도 또는 자연 돌연변이될 수 있다. 예를들어 열성 작용하는 것으로 보이는 MS-45와 같은 유전자가 돌연변이되어 동형접합일 경우 불임을 초래할 수 있을 것이다.
부모 계통은 또한 불임성 유전자의 관능적 복제물에 작동 연결된 유도성 촉진유전자를 암호화하여 각각 모 및 부계의 유지 목적으로 수정성을 복구하는 DNA를 함유한다(도1을 참조하시오).
이들 두 부모를 교배하여 열성 웅성 불임성 및 자성 불임성 대립형질에 대하여 이형접합이어서 완전히 수정성인 F1 잡종을 생성한다. 그러나 F1 종자를 수확하고 재배할 경우 약 25%의 모식물이 불임이므로 잡종 강세 및 수율 손실을 유도하는 불임성으로 F2 세대는 분리한다(도 2a, 2b 및 2c를 참조하시오).
자성 열성 돌연변이가 옥수수에서 공지되어 있으나 유전자는 아직 복제되지 않았다.
실시예 2
모는 웅성 불임계, 즉 웅성 포자체 촉진유전자에 의하여 비활성 유전자가 발현되어 생존할 수 있는 관능적 화분의 생성을 막는다. 또한, 복구유전자는 자성 조직에서 발현된다. 자가 수정성은 복구유전자에 연결된 유도 촉진유전자에 의하여 복구될 수 있을 것이다. 이러한 발현 카세트(도4 참조)에 의한 형질전환은 반접합성 식물 MS RFRCS----------를 유발한다.
RCS= 화학적으로 복구될 수 있는 웅성 및 자성 수정성
MS = 우성 웅성 불임성
RM= 우성 웅성 수정성 복구유전자
FS = 우성 자성 불임성
RF= 우성 자성 수정성 복구유전자
잡종 종자 생산에 사용하는 이형접합성 식물을 얻기 위하여 Alc A/R 유전자 스위치의 경우 에탄올과 같은 외인성 화학 유도자로 반접합성 식물을 유도하여 자가-수분될 수 있게 하여야 한다.
불임 유전자가 우세한 효과를 내고 무효계만이 웅성 수정성이므로 식물의 4분의 3이 100% 불임 화분을 생성한다. 동형접합성 식물은 유도 및 자가-수분 절차를 반복하는 자가-수분에서 얻어지는 종자를 생장시킴으로써 이형접합성 식물과 구별할 수 있다. 이들의 자손은 앞서 기술한 바와 같이 불임을 위해 격리되고 유전자형에 따라 용이하게 얻어질 수 있다. 제초제 내성 또는 기타 선택성 마커 유전자 또한 사용할 수 있을 것이다. 동형접합성 식물의 경우 모든 자손은 웅성 불임성( 및 제초제 내성)이고, 이형접합성의 경우 잔손은 불임을 위해 계속 격리될것이다.
따라서, 이러한 방식으로 동형접합성 웅성 불임성, 이형접합성 자성 불임성 계통을 선택할 수 있다.
부
부 식물은 완전히 웅성 수정성이나 자성 불임성, 즉 동형접합성 자성 불임성, 웅성 수정성이다. 이 경우, 자성 불임성은 앞서 기술한 바와 같이 자성 꽃기관 발달에 해로운 방해 유전자를 자성 꽃기관에 발현시킴으로써 야기된다. 이와는 다르게, 화분 튜브를 파괴하거나 식물이 종자를 발달시키지 못하게 할 수 있을 것이다. 복구유전자는 또한 수꽃 조직에서 발현된다.
부 식물은 모 식물과 같은 방법으로 그러나 도5에 도시한 구축물을 사용하여 얻는다. 이 경우, 반접합성 식물은 다음 유전자형: FS RMRCS.....을 가지고 동형접합성 식물은 다음 유전자형: FS FS RMRMRCSRCS를 가진다.
실시예 3
이 실시예에서, 발현 카세트는 배우체(예를들어 화분 특이) 촉진유전자(도5 참조)를 포함한다. 부 식물은 상기 실시예2에서 기술한 바와 같다. 화분 특이 유전자의 예에는 1998년 1월 26일자 NCIMB 40915로서 The National Collection of Industrial and Marine Bacteria에 기탁된 C5 및 Zm13(Hanson등)을 포함한다. C5 촉진유전자 서열은 도61에 도시되어 있다. 다시 한번 웅성 불임성 계통을 얻어야 하고 반접합성 식물은 화학 처리 및 자가 수분시킨다.
이 경우, 동형접합성 계통, 즉 MS MS RFRFRCSRCS는 DAPI 스테이닝으로 확인할 수 있는 100% 불임성 화분을 생성한다. 이것은 DAPI 스테이닝으로 확인할 수 있는 50% 불임성 및 50% 수정성 화분을 생성하는 이형접합성 식물의 화분과 구별될 수 있다.
따라서, MS MS RFRFRCSRCS계통을 선별할 수 있다.
따라서 동형접합성 부모 어느쪽도 자가-수분시킬 수 없음을 알 수 있다.
실시예 2 및 3의 모 식물은 복구유전자를 발현시키는 자성 특이 촉진유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하고 부 식물은 복구유전자를 발현시키는 웅성 특이 촉진유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 부모 식물에서, 이들 발현 카세트는 촉진유전자의 특이성으로 인하여 수정성에 아무 영향을 미치지 않는다.
그러나 이들 두 부모 계통을 교배할 경우 결과는 배우체(예를들어 화분 특이) 또는 포자체(예를들어 융모조직 특이) 촉진유전자가 사용되어 모에 웅성 불임성을 생성시키는가에 따라 달라진다. 포자체 촉진유전자가 사용될 경우 수정성이 완전히 복구되고 F1 종자는 완전히 수정성, 즉 약 100%의 수정성 화분을 생성시킨다(도 6a, 6b 참조). 그러나 F1 종자를 보유하여 재배할 경우 상기와 같이 불임성을 격리한다(도6c 참조). 웅성 불임성을 얻기 위하여 배우체 촉진유전자를 사용할 경우 화분이 반수체이므로 수정성이 완전히 복구되지는 않고 약 50%의 화분만이 화분 수정성을 생성하는 관능 대립형질을 물려받을 것이다(도7a, 7b 참조). F2 자손은 앞서 기술한 바와 같이 격리된다(도 7c).
필요할 경우 시스템의 제3 성분에 의하여 동형접합성 불임 계통을 유지한다. 따라서, 각 부모 계통은 유도성 화학물질 도포시 모든 조직에서 복구유전자를 발현시켜 모에 화분 생성을 가능하게 하고 부에 정상적인 자방 및 조직 발달을 가능하게 하는 하나 이상의 인트론 서열 또는 증대제 서열에 작동 연결된 유도성 촉진유전자를 포함한다. 이후 자가-수분으로 부모 종자를 불릴 수 있다.
모든 실시예에서, 밭에 화학물질을 도포하는 것은 비교적 적은 부분에 가끔 행할 필요가 있는 부모 계통 종자를 생성시키기 위하여만 필요하다.
실시예에서 기술한 바와 같이, 비활성 유전자를 발현시키기 위하여 융모조직 특이(도6a, 6b 또는 6c) 또는 화분 특이 촉진유전자(도7a, 7b)를 사용할 수 있다. 융모조직 특이 촉진유전자를 사용하는 것이 수정성이 완전히 복구될 수 있어 바람직하다. 그러나 화분이 반수체이므로 화분 특이 촉진유전자를 사용할 경우 완전한 수정성 복구는 불가능하다. 그러나 화분 특이 촉진유전자를 사용하는 것이 유리할 수 있을 것이다. 예를들어 화분 특이 촉진유전자는 더 큰 조직 특이성을 가질 수 있을 것이다. 식물의 화학처리는 자가-수분할 수 있도록 수정성을 복구하는데 필요할뿐이다.
실시예 4
일반 복제 벡터의 제조
모든 분자 생물학 기법은 Maniatis등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2판(1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press: 1권 및 2권(D.N. Glover ed 1985)에 기술되거나 그 지정 제조자가 추천한 바와 같이 실행하였다.
pMOG 1006-Fse의 제조
pMOG1006(도8)는 선택가능한 마커로서 히그로마이신 내성 유전자를 포함하는 바이너리 벡터이고 쌀의 Agrobacterium 매개된 형질전환에 사용한다. 개질된 벡터는 EcoRI로 pMOG1006을 이화시키고 특유의 FseI 부위를 도입하는 다음 서열을 가지는 어닐링된 한쌍의 상보 올리고누클레오티드를 삽입시켜 제조하였다:
γ32로 표지된 링크1A 올리고누클레오티드로 잡종형성시켜 바른 올리고누클레오티드 서열을 가지는 복제물을 선별하고 시퀀싱에 의하여 특화한후 바람직하게 배향된 서열을 함유하는 복제물을 선별하였다(도9).
pVB6
pVB6은 특유의 FseI 부위를 함유하나 npt11 선별 마커를 포함하는 점에서 상기 기술한 바이너리 벡터와 유사하나 Agrobacterium 매개된 담배 형질전환에 사용된다.
pFse4(도10)의 제조
이 벡터는 다수의 발현 벡터를 함유하는 벡터 조합을 허용하도록 구축되었다. 이것은 다중 복제 부위 영역에 희소 8-염기 인식 제한 효소 부위를 사용하여 행하였다. pFSE(도32) DNA는 FseI로 이화시키고 존재하는 다중 복제 영역을 제거하였다. 다음 서열을 가지는 상보 올리고누클레오티드를 삽입하였다:
이 서열은 측부에 FseI 부위가 있는 EcoRI, NotI, HindIII, AscI, SwaI 및 PmeI를 도입한다. 발현 카세트를 pSK+에서 조합하고 아래 기술하는 바와 같이 각 카세트 측부에 특유 부위를 위치시키기 위하여 링커를 삽입한다. 전체 카세트를 pFSE4에 삽입하였다. 요구되는 바와 같이 pFSE4에 전체 카세트를 삽입하였다. 상기 기술한 pMOG1006-FseI 및 VB6 벡터에 FseI 단편으로서 다중 카세트를 제거할 수 있을 것이다.
실시예 5
담배로부터 얻은 STIG1 촉진유전자의 PCR 복제
Stratagene의 PfuTurbo DNA 폴리머라제 및 올리고누클레오티드 ST1-L2(5'-ATTCGACCTCGCCCCCGAGCTGTATATG-3') 및 ST1-R2(5'-GATGAGAATGAGAAGGTTGATAAAAGCC-3')를 사용하여 100ng의 담배 게놈 DNA로부터 1.6kb의 단편을 PCR-증폭시켰다. 온도순환 조건은 다음과 같았다: 3분간 95℃, 이어서 1분간 95℃에서 35회, 1분간 50℃, 4분간 72℃, 이어서 5분간 72℃에서 최종 인큐베이팅. 1.6kb의 증폭 생성물을 QIAGEN의 QIAquick 젤 추출 키트를 사용하여 젤-정제하고 Invitrogen의 pCR-ZERO Blunt 벡터내로 리게이팅시켰다. 삽입물의 DNA 서열을 조사하였더니 공개된 STIG1 서열(Goldman등 1994)과 100% 동일하였다. 이후 삽입물을 다시 조작하기 위하여 SacI-NotI 단편상에서 pBluescript SK+로 이동시켰다(pSK-STIG1).
실시예 6
화학 유도성 촉진유전자로부터 발현 테스트를 위한 식물 형질전환체 벡터의 제조
GST-GUS
옥수수 GST27 cDNA의 특화는 앞서 기술하였고 실험은 GST 27이 수염, 잎, 배 또는 내반에서 본질적으로 발현되지 않음을 보인다. 안전제 도포후, 이들 조직 모두에서 발현이 검출되었다(도11-15). GUS 발현을 유도하는 GST 27 촉진유전자를 이용하는 식물 형질전환 구축물은 미국 특허 제5,589,614호에 기술된 바와 같이 제조할 수 있을 것이다(도16). 이들은 담배 형질전환체에 대하여 pGSTTAK(도17)이고 옥수수 형질전환체에 대하여 RMS-3(도18)이다. 이들 벡터를 사용하여 안정한 담배 및 옥수수 형질전환체를 생성시킬 수 있을 것이다. 앞선 특허에 기술한 바와 같이 조제된 안전제를 잎 페인트(담배) 또는 뿌리 담금(옥수수)으로 가하여 GUS 발현을 관찰할 수 있을 것이다. 담배잎에서의 GUS 발현 유도 결과는 도12에 도시하였는데 명백한 발현 유도가 100배 이하로 일어났다. 유사하게, 옥수수에 대하여 안전제 처리후 잎에서 GUS 발현 유도가 있었다. 발현 유도는 수염 및 내반 조직 및 배에서도 관찰되었다.
RMS-3은 밀을 형질전환시키는데도 사용되었고 GUS 발현 유도가 연구되었다.히그로마이신을 선별 마커로 사용하는 개질된 벡터를 쌀에 도입시킬 수 있을 것이다.
GST-바스타
옥수수 형질전환 벡터 Zm/RMS 14(상기 기술됨)는 안전제 유도된 GST-27 촉진유전자에 융합된 바스타 유전자를 포함한다. WU25는 이러한 유전자 융합을 포함하는 PCR에 의하여 나타났다. 온실에서 생장한 식물에 안전제 뿌리 담금에 의한 R-29148 부가에 의하여 불임성의 복구가 증명되었다. 처리된 식물은 처리되지 않은 식물에 비하여 수염 크기가 증가하였다. 수염의 수정성 및 크기에 안전제가 미치는 영향은 없었다. 수염 크기 증가와 관련하여, 온실에서 뿌리 담금 시료에서 취한 또다른 시료에서 미세포자 발달을 관찰하였다. 밭에서 생장한 식물에 잎 도포후 유사한 효과가 관찰되었으나 처리되지 않은 식물에서는 혹종의 실험에서 관찰되지 않았다. 미세포자 발달의 재개는 바나제가 바스타를 억제하여 융모조직 세포 제거를 극복하는 것과 관련되는 것으로 사료되어진다. 광범위한 안전제 처리에 노출된 식물에서 미세포자 발생이 진행되어 미성숙 포스트-유사분열 화분으로 채워진 꽃밥이 얻어졌다. 반대로, 불임 식물로부터의 꽃밥은 파괴되었다.
pSRNAGS
바이너리 식물 형질전환 벡터, pSRNAGS(도19)는 도20에 기술한 방법으로 구축하였다. 이 벡터는 Alc R 유전자를 발현시키는 35S CaMV 촉진유전자 및 GUS를 발현시키는 키머 35S-Alc A 촉진유전자를 포함한다.
pUIRN.AGS
AlcR 유전자(도21)의 발현시키는데 편재 인트론에 연결된 편재 촉진유전자가 사용되는, 옥수수 및 밀을 형질전환시키는데 사용하는 pUC 베이스 벡터를 제조하였다. 유전자전이 밀을 얻는 타임 라인은 도22에 도시하였다.
pMOG1006-SRNAGS(쌀)
EcoRI 및 HindIII로 플라스미드 pSRN(도23)을 이화시켜 2.6kb의 단편(Alc-R-nos)을 방출하고 이것을 EcoRI-HindI 단편으로서 pMOG1006내로 클로닝시켰다. 이후 560 bp CaMV 35S 촉진유전자 단편을 EcoRI 부위로 클로닝시켜 35S-AlcR-nos를 얻고 바람직하게 배향된 복제물을 서열 분석으로 선별하였다(pSAN). 플라스미드 pAGS(도24)를 HindIII으로 이화시켜 2.5kb의 단편(AlcA-GUS-nos)을 pMOG1006-SRN의 HindIII 부위내로 클로닝하여 래pMOG1006-SRN-AGS(도25)로 불리는 최종 구축물을 생성시켰다. 제한 및 서열 분석에 의하여 HindIII 단편의 배향을 조사하였다.
융모조직, 암술, 화분 및 기타 생식 조직에서 AlcR의 발현 정도를 최적화하기 위하여 AlcR을 발현시키는 조직 특이 촉진유전자를 사용하여 다음 벡터를 제조하였다.
AlcA-Glu11-GUSint-nos
QUIckChange 키트를 사용하여 pGUN(도26)내 GUS 유전자 말단의 SacI를 PstI 부위로 바꾸고 GUS 유전자(+인트론)를 함유하는 NcoI-SacI 이화물을 사용하여 카세트D(이하 참조)내 바스타 유전자를 치환하여 AlcA 촉진유전자-글루카나제 증대제-GUS-nos를 함유하는 벡터를 생성시켰다. 이것은 PmeI 단편으로 잘라 pFSE4내로 클로닝하였다.
Tap1-AlcR-nos-AlcA-Glu11-GUSint-nos
AlcA-Glu11-GUSint-nos(Glu11은 글루카나제 5' 번역되지 않은 영역)를 PmeI 단편으로서 PmeI 컷 pFSE4내로 클로닝하였다.
원래 Antirrhinum에서 분리하여 이제 pvdh405(도27)로부터 클로닝한 융모조직 특이 Tap1 촉진유전자를 EcoR1 단편으로서 pSK-AlcR-nos(pSRN으로부터 pSK+내로 EcoRI-HindIII 단편을 클로닝시켜 발생시킴)내로 클로닝하고 Tap1-AlcR-nos는 NotI단편으로서 pFSE4-AlcA-Glu11-GUSint-nos내로 클로닝하였다. 얻어지는 FseI 삽입물은 pVB6내로 삽입시켜 최종 담배 형질전환 벡터(도28)를 얻었다.
Stig1-AlcR-nos-AlcA-Glu11-GUSint-nos
이 구축물은 담배로부터 클로닝한 암술 이동관 특이 Stig1 촉진유전자를 EcoRI-NcoI 단편으로서 pSK-AlcR-nos내로 클로닝한 것을 제외하고 상기와 같이 제조하여 상기와 같이 추가 조작을 하였다(도29).
실시예 7
웅성 촉진유전자의 조직 특이성을 조사하기 위한 벡터의 구축
pMS14-GUS
MFS14(Wright등 1993)로부터의 5.8Kb의 촉진유전자 단편을 GUS 리포터 유전자에 융합시켰다. GUS의 발현은 잎이 아니라 꽃봉오리 발달의 초기 발달 단계의 꽃밥에서만 관찰되었다.
pMS14-바나제
동일한 촉진유전자 단편을 바나제에 융합시켜 옥수수 형질전환 벡터ZM/RMS14(도30)를 생성시켰다. 이러한 융합은 클로닝 단계에서 바나제에 대하여 보호하기 위하여 관능 박테리아 촉진유전자와 프레임 바스타를 함유시켰다. 유전자전이 옥수수 식물을 얻어 추가 분석을 위하여 몇단계 진행시켰다. 특히 한 식물 WU25를 몇가지 세부사항에 대하여 연구하였다. 팻 유전자를 검출하기 위한 잎 페인트 및 PCR로 판단할때 형질전환 유전자를 받은 자손 모두 완전히 불임임 반면 형질전환 유전자가 부족한 자손은 완전히 수정성이었다. 불임 수염은 일반적으로 수정성 형제보다 작고 화분이 부족한 꽃밥을 가지며 수염 역할을 하지 못했다. 다른 모든 경우 불임성 식물은 수정성 비형질전환 형제와 차이가 없었다.
pC5-GUS
옥수수로부터의 펙틴 메틸 에스테라제의 게놈 복제물(도61에 나타낸 바와 같이 C5로 명명됨)을 분리하고 GUS와의 전사 융합에 촉진유전자를 사용하여 조직 특이성을 연구하였다. Agrobacterium 형질전환에 의하여 담배에 벡터를 도입하고 형질전환체를 캐너마이신에 대하여 선별하였다. 열개된 꽃밥에서 얻은 화분 입자를 수거하여 GUS 활성을 위하여 스태이닝하였다. 두 식물은 약 50%의 청색 스태이닝 화분을 보였다. 형질전환성이 아닌 대조구에서는 스태이닝이 관찰되지 않았다. 꽃밥 발달 단계를 포함하는 일련의 조직에석 추출물을 얻고 GUS 발현에 대하여 플루오로적으로 분석하였다. 발달하는 열개된 꽃밥을 제외한 조직에서는 매우 낮은 정도의 발현만이 관찰되었다. 현미경 스태이닝은 발현 타이밍이 유전자전이 담배 및 옥수수에서 본래 환경인 ZmC5 촉진유전자가 수분 발달 말기에 작용함을 보이는 노던 데이타와 일치함을 나타낸다.
pMOG1006-C5-GUS(쌀)
EcoRI 및 BamHI로 C5-GUS(bin)를 잘라 2.1kb의 BamHI-EcoRI 단편(GUS-nos)을 얻고 이것을 EcoRI-BamHI 컷 pMOG1006 및 1.9kb의 BamHI 단편(C5 촉진유전자)으로 클로닝하고 이것을 이후 pMOG1006-Gus-nos내로 클로닝하여 최종 벡터인 pMOG1006-C5-GUS를 생성시키고 시퀀싱하여 촉진유전자의 배향을 확인하였다(도31).
pMOG1006-MFS14-GUS(쌀)
BamHI를 사용하여 RMS30(도41)으로부터 2.3kb의 MFS14 촉진유전자를 분리하여 pFSE(도32)내로 클로닝하였다. 이후 GUS 인트론 카세트를 PstI 단편으로서 pGUN으로부터 pFSE-MFS14 벡터내로 클로닝하였다. 이후 전체 MFS14-GUSint-nos 단편을 FseI 단편으로서 pMOG1006-Fse(도33)내로 클로닝하였다.
실시예 8
불임성을 생성하고 수정성을 복구하는 벡터의 제조
카세트A의 제조-MFS14-바나제-nos-우성 포자체 웅성 불임성 카세트
RMS14로부터의 nos 종결유전자를 EcoRI-HindIII 단편으로서 분리하고 동일한 두 효소로 pSK+내로 클로닝하였다. 얻어지는 플라스미드를 HindIII으로 이화하고 다음 서열을 가지는 한쌍의 상보성 올리고누클레오티드를 어닐링하였다.
카세트B의 제조-C5-바나제-우성 포자체 웅성 불임성 카세트
이화된 SalI 부위로 올리고누클레오티드 링커 MKLINK4(5'-TCGATTCGGCGGCCGCCGAA-3')를 삽입시킴으로써 pBluescipt SK+(Stratagene)의 특유 부위 SalI를 NotI 인지 부위로 대체하였다. 박테리아-촉진유전자-유도 바스타 암호화 영역이 따르는 바나제 암호화 영역을 포함하는 0.9kb의 BamHI-HindIII 단편을 개질시킨 pBluescript의 해당 단편내로 삽입하였다. HindIII-NotI 단편 상의 nos 말단유전자를 얻어지는 벡터의 해당 단편내로 삽입하였다. 이후 제조자의 지시에 따라 Stratagene의 QuickChange 시스템을 사용하고 올리고누클레오티드 DAM-3A(5'-GGTCGACTCTAGAGGAACCCCGGGTACCAAGC-3') 및 DAM-3S(5'-GCTTGGTACCCGGGGTTCCTCTAGAGTCGACC-3')을 사용하여 원하지 않는 BamHI 부위를 제거하였다. 얻어지는 플라스미드(pSK-BBN으로 명명)를 BamHI로 완전히 이화시키고 새우 알카리성 포스페이트로 탈포스포릴화(37℃, 1시간)하였다. 이것에 C5 5'측영역의 1.9kb BamHI 단편을 리게이팅시킨 다음 BamHI 및 PstI로 이화시켜 각각 곤충의 존재 및 배향을 체크하였다. 얻어지는 플라스미드를 pSK-C5-BBN(도35)으로 명명하였다. 이후 전체 카세트를 EcoR1-Not1으로서 바이너리 식물 형질전환 벡터 pVB6로 분리하였다. 이후 구축물을 동결-해동 방법으로 Agrobacterium Tumefaciens내로 도입하였다. 표준 기법을 사용하여 DNA를 담배내로 도입하였다.
카세트 C-35S-AlcR-nos의 제조
pUC3으로 공지된 벡터로부터 EcoRI-HindIII 단편을 분리하였는데 이 단편은 AlcR 암호 서열 및 nos 종결유전자를 함유한다. 이 단편을 EcoRI-HindIII 컷 pSK+내로 클로닝하였다. ΔHindIII-NotI-PmeI-ΔHindIII에 대한 제한부위를 함유하는 다음 서열을 가지는 어닐링된 한쌍의 상보성 올리고누클레오티드를 HindIII부위내로 삽입하여 Pme1 및 Not1 부위를 가하고 카세트의 3' 말단에서 HindIII 부위를 제거하였다.:
35S CaMV 촉진유전자를 포함하는 pUC3으로부터의 EcoRI 단편을 EcoRI 부위로 클로닝하고 제한 및 서열 분석에 의하여 배항하였다(도36). 전체 카세트는 추가 조작을 위해 NotI 단편으로 잘라낼 수 있고 AlcA-Glu11-바스타-nos 카세트가 삽입될 수 있는 PmeI 부위를 함유할 수 있다.
카세트 D AlcA-Glu11-바스타-nos의 제조
벡터 pMJB1을 XhoI 및 NcoI로 이화하여 TMV 오메가 증대자를 제거하였다. 글루카나제 11 5'UTR을 암호화하고 XhoI 및 NcoI 부위가 측부에 달린 다음 서열을 가지는 두 올리고누클레오티드를 통상과 같이 어닐링하고 컷 벡터내로 리게이팅시켰다:-
시퀀싱한 벡터를 HindIII 및 XhoI로 이화하여 35S CaMV 촉진유전자를 제거하고 AlcA 촉진유전자를 HindIII-XhoI 단편 상에 리게이팅시켰다. RMS9로부터 PCR에 의하여 NcoI 및 BamHI를 가지는 바스타를 암호화하는 단편을 얻었다. 이후 이것을 NcoI-BamHI로 상기 벡터 컷 내로 삽입하여 AlcA-Glu11-바스타-nos를 함유하는완전한 카세트를 얻었다. 카세트 조작을 용이하게 하기 위하여 ΔHindIII-PmeI-ΔHindIII 및 ΔEcoRI-PmeI-ΔEcoRI를 암호화하는 올리고누클레오티드를 사용하여 각 말단에 PmeI 부위를 가하였다(도37). 이로써 AlcA/R 스위치 성분 둘다 NotI 단편으로서 pFSE4내로 이동할 수 있도록 상기 기술한 35S-AlcR-nos 카세트내로 이 카세트를 삽입하는 것이 가능하다.
카세트 E의 제조 MFS14-Glu11-바스타-nos-웅성 수정성 복구 카세트
MFS14 촉진유전자의 3' 말단을 가지는 320bp의 BamHI-SacI 단편을 BamHI-SacI 컷 pSK+내로 클로닝하였다. 표준 절차에 따라 Qiagen사의 QuickChange 키트를 사용하여 HindIII 부위를 제거하였다. 부위를 제거하는데 사용된 올리고누클레오티드 다음 서열을 가졌다:-
제한 분석 및 시퀀싱에 의하여 부위의 제거를 확인하였다. 이후 ΔSacI-HindIII-SacI 부위를 암호화하는 어닐링된 올리고누클레오티드를 삽입하여 신규한 HindIII 부위를 SacI 부위 근처에 도입하였다.
시퀀싱에 의하여 정의된 링커의 올바른 배향 및 제한 분석에 의하여 신규한 부위의 존재를 확인하였다. 바람직한 배향은 BamHI 부위에 대하여 SacI의 외부에 HindIII 부위를 두었다. 이후 ΔBamHI-XhoI-ΔBamHI를 암호화하는 올리고누클레오티드를 사용하는 동일한 방식으로 BamHI 부위를 제거하고 신규한 XhoI 부위를 도입하였다. 이것은 다음 서열을 가진다:-
링크6 GAT CGT ATC TCG AGA TAC
통상적인 방법으로 BamHI 부위의 부재 및 XhoI 부위의 도입을 확인하였다.
HindIII 및 SacI로 RMS14를 이화하고 MFS14 촉진유전자의 나머지를 암호화하는 5.5Kb 단편을 분리하였다. 이 단편을 상기 HindIII-SacI 컷 벡터내에 삽입하고 시퀀싱에 의하여 촉진유전자의 통합을 확인하였다. MFS14 촉진유전자 전체를 HindIII-XhoI 카세트로서 절단하고 말단에 링커를 가하기 전 단계에서 AlcA 촉진유전자를 대체하는 카세트 D에 삽입하였다. 이 카세트에 대하여 각 말단에 Swa1을 도입하는 카세트 링커를 사용하였다(도38).
카세트 F의 제조 Stig1-바나제-nos - 자성 포자체 불임성 카세트
벡터 pSK-STIG1에 STIG1 촉진유전자의 번역 개시 부위에 가깝게 BamHI 부위를 도입하였다. 올리고누클레오티드로 Stratagene QuickChange Kit를 사용하여 수행하였다:-
1.6kb STIG1 촉진유전자를 BamHI 단편 상에 방출하고 BamHI-이화된 pSK-BBN내로 클로닝하였다. 벡터 및 촉진유전자 서열 사이의 PCR 증폭에 의하여 촉진유전자의 존재 및 정확학 배열을 측정하였다. STIG1-BBN 카세트를 NotI-EcoRI 단편 상 벡터 pFSE4로 옮기고 얻어지는 플라스미드를 pFSE4-STIG1-BBN(도39)으로 명명하였다. 이후 전체 카세트를 FseI 단편으로서 VB6에 옮겼다.
카세트 G의 제조 Stig-Glu11-바스타-nos - 자성 수정성 복구 카세트
구축물 pAlcA-GluII-바스타-nos-pp를 개질시켜 HindIII 제한 부위를 EcoRI 부위로 대체하였다. 이것은 Stratagene QuickChange 키트 및 다음 올리고누클레오티드를 사용하여 수행하였다:-
벡터 pSK-STIG1에 STIG1 촉진유전자의 번역 개시 부위에 가깝게 XhoI 부위를 도입하였다. Stratagene의 QuickChange Kit 및 다음 올리고누클레오티드를 사용하여 수행하였다:-
1.6kb STIG1 촉진유전자를 XhoI-EcoRI 단편 상에 방출하고 XhoI 및 EcoRI로 pAlcA-gluII-바스타-nos-pp를 이화시켜 제조한 더 큰 단편내로 클로닝하여 AlcA 촉진유전자를 STIG1 촉진유전자로 대체하였다(도40). 전체 카세트를 PmeI 단편 상에서 잘라내어 pVB6 및 pMOG1006-Fse내로 클로닝하였다.
전환가능한 TPS 벡터-AlcA-TPS-nos Tap1-AlcR-nos의 제조
Tap1-AlcR-nos 카세트에 대하여 기술하였다. pAGS내 GUS 유전자는 TPS로 교체하고 신규한 카세트는 HindIII 카세트로서 pFSE4내로 클로닝하였다. 앞서 기술한 Tap1-AlcR-nos는 NotI 단편으로서 pFSE4-AlcA-TPS-nos 벡터내로 클로닝하였다. 전체 Fse1 단편을 절단하여 pVB6내로 클로닝하였다. 이제 이 벡터를 사용하여, Tap1-TPP-nos 발현 카세트를 함유하는 구축물로 형질전환시켜 담배를 불임성으로 재형질전환시킬 수 있다.
실시예 9
식물 형질전환 벡터의 제조
pFSE4에서 상기 카세트를 혹종으로 조합시킬 수 있을 것이고 이후 얻어지는 Fse1 단편을 pMOG1006-Fse 또는 pVB6으로 이동시켜 담배 또는 쌀로 형질전환시킬 수 있다.
A+C+D = 복구유전자를 화학적으로 유도하여 수정성을 복구할 수 있는 포자체 웅성 불임성 식물
E = 타가 수분시킬 경우 자손에서 수정성을 복구하는 포자체 웅성 수정성 복구 식물
F+C+D = 복구유전자를 화학적으로 유도하여 수정성을 복구할 수 있는 포자체 자성 불임성 식물
G = 타가 수분시킬 경우 자성 수정성 자손을 내는 포자체 자성 수정성 복구 식물
B+D = 복구유전자를 화학적으로 유도하여 수정성을 복구할 수 있는 배자체 웅성 불임성 식물
본원에서 기술한 바와 같이 F1 잡종 식물의 부모 세대는 다음과 같이 얻는다:-
부, 즉 자성 불임성
모, 즉 웅성 불임성
실시예 10
신규한 PIG 유전자를 테스트하는 벡터의 구축
RMS30 및 RMS32(담배)
튜불린 유전자를 p튜불린으로부터의 Hinf1으로 클로닝하고 상기에서 생성된 pFSE-MFS14내로 클로닝하였다. 얻어지는 MFS14-튜불린-nos를 FSE 단편으로서 pVB6내로 클로닝하여 RMS30을 얻었다(도41).
MFS14+lac 작동 촉진유전자를 BamHI 단편으로서 RMS32로부터 잘라내고 pFSE내로 클로닝하였다. 튜블린 유전자의 삽입후, MFS14-lac-op-튜불린-nos FseI 단편을 pVB6내로 클로닝하여 RMS32를 얻었다(도42).
RMS30 및 RMS32(쌀)
MFS14 촉진유전자(+/- lac-op)-튜불린-nos를 함유하는 FseI 단편을 pMOG1006-Fse내로 클로닝하여 식물 형질전환 벡터를 발생시켰다.
Zea Mays에 불임을 일으키는데 사용하는 트레할로제-포스페이트 포스파타제(TPP) 및 트레할로제-6-포스페이트 하이드롤라제(TreC)의 최적화
Zea Mays에서의 발현에 최적화된 TPP 및 TreC 암호화 영역의 버젼(각 코돈의 중복 위치에 대하여 G 또는 C가 선호됨)을 Operon Technologies Inc에 의하여 합성하였다. 누클레오티드 서열은 자연 발생하는 비율(the Genbank Codon Usage Database, Release 108에 따름)의 대표 빈도에서 1.0% 이상의 생체내 존재하는 코돈을 사용하는 아미노산 서열로부터 유도한다. 또한 클로닝을 용이하게 하기 위한 3' akfeksdml PstI, NcoI 및 BamHI 부위를 포함하는 번역 개시 부위에 가까운 유용한 제한 효소 부위가 포함된다.
코돈 최적화된 TPP 및 TreC Zea Mays의 사용을 테스트하기 위한 구축물
벡터 pFSE-MFS14내 MFS14 촉진유전자 5' 말단의 BamHI 부위는 다음 올리고누클레오티드와 Stratagene의 QuickChange 시스템을 사용하여 제거한다:-
합성 TPP 및 TreC 유전자를 BamHI-PstI 단편 상에서 절단하고 개질된 pFSE-MFS14 벡터내 MFS14 촉진유전자 및 nos 종결유전자간에 클로닝한다. 촉진유전자 및 암호화 서열간에 adh1 인트론을 삽입하여 발현 정도를 부스팅한다. 완전한 카세트를 IGPD 박테리아 선별 마커 및 유전자전이 식물의 선별을 위한 제초제 내성 유전자 카세트를 함유하는 pUC 베이스 클로닝 벡터에 옮긴다.
실시예 11
유전자전이 식물의 제조
pSRN.AGS는 담배, 평지씨 및 토마토(이들 식물은 Alc-GUS 식물로 불림) pMOG1006-Fse-SRNAGS내로 도입하고 pMOG1006-C5-GUS는 Agrobacterium 매개된 형질전환에 의하여 쌀로 도입하였다.
상기 주어진 각 카세트 조합을 함유하는 식물 형질전환 벡터를 Agrobacterium 매개된 형질전환에 의하여 담배 및/또는 쌀로 도입하였다. PCR로 식물을 분석하고 원형 삽입물을 함유하는 것들을 클론에 의하여 번식시켜 온실에 옮겨 개화시까지 생장시켰다. RMS30 및 32는 또한 담배에 도입하였다.
pUIRN.AGS는 투사 충격 방법에 의하여 밀 및 옥수수내로 도입하고 선별 마커를 포함하는 플라스미드로 동시-충격법에 의하여 유전자전이 식물을 회수하였다. 여러가지 성분을 테스트하기 위하여 다른 벡터를 미세투사 충격으로 옥수수로내로 형질전환시킨다.
실시예 12
유전자전이 식물의 분석
AlcA 촉진유전자로부터의 GUS 발현에 대한 연구
조직 배양에서
특히 형질전환 과정의 칼루스 상에서 다소 발현될 경우 바나제와 같은 세포독 유전자에 결합된 촉진유전자를 함유하는 구축물로 형질전환시킨 후 밀 식물이 회복가능한지를 평가하기 위하여 담배 칼루스에서의 발현을 연구하여 GST27 촉진유전자의 경우에서와 같이 발현이 볼질적인지 여부 또는 이것이 에탄올 도포로 유도될 수 있는지를 조사하였다.
표준 조직 배양 조건하에 생장시킨 4주된 Alc-GUS(35S-AlcR-nos/AlcA-GUS-nos) 담배 식물을 사용하여 에탄올 존재 및 부재시 칼루스에서의 AlcA 촉진유전자의 발현을 테스트하였다. 잎 디스트를 생성시켜 3%(w/v) 수크로즈 및 0.8%(w/v) Bacto-agar, 1㎍/ml 6-BAP 및 100ng/ml NAA 호르몬이 포함된 MS 매질 상에 두었다. 약간의 디스크를 0.1%(v/v) 에탄올을 함유하는 매질 상에 두었다. 3주후 칼루스 생성이 진행되었을때 형광 GUS 분석에 칼루스 시료를 사용하고 그 결과를 도43에 도시하였다.
GUS 수준은 칼루스에서 AlcA 촉진유전자 누수되고 식물 조직 배양 매질에 에탄올을 가할때 수준이 증가함을 보인다. 따라서, 세포독 유전자 촉진유전자와 동일한 구축물에서 복구유전자를 움직이는 AlcA 촉진유전자를 사용하여 유전자전이를 회복할 수 있을 것이다.
온실에서
AlcA/R 유전자 스위치는 분무, 증기 또는 뿌리 담금과 같은 도포 방법으로 화학 유도자 에탄올을 가할때 담배 잎에 복구유전자 또는 특성 유전자의 수준을 높임이 밝혀졌다(Caddick등, Salter등). 유전자전이 AlcA-GUS 담배, 평지씨 및 토마토 식물을 사용하여 꽃조직에서의 유전자 유도를 조사하였다.
담배
1) 담배 AlcA-gus 담배 꽃줄기 주위에 플라스틱 백을 묶고 50ml의 5% 에탄올을 함유하는 작은 포트를 백 안에 넣었다. 3일후 상이한 꽃봉오리 단계로부터 얻은 꽃밥을 수거하여 GUS 발현을 조사하였다. 결과는 도44에 나타내었다. 이것은 야생형, AlcA-GUS 유도되지 않은 및 AlcA-GUS 유도된 식물로부터의 4개의 독립 꽃봉오리로부터 얻은 GUS 값을 나타낸다. 꽃봉오리는 mm 단위로 측정하고 각 막대는 5가지 꽃밥을 나타낸다. 그래프는 에탄올 증기 처리를 받지 않은 AlcA-GUS 식물과 비교하여 유도된 식물의 꽃밥은 더 고농도의 GUS를 포함함을 보인다.
2) 야생형 및 Alc-GUS 담배 식물로부터의 꽃 줄기를 잘라 300ml의 물 또는 1%, 2% 또는 5%의 에탄올을 함유하는 비이커에 넣고 2일간 온실에 둔 후 형광 GUS 분석을 위하여 꽃봉오리로부터 꽃밥을 수거하였다. 45도는 야생형, 수처리한 Alc-GUS 꽃줄기 및 1%, 2% 또는 5%의 에탄올 처리한 Alc-GUS 꽃줄기로부터 얻은 꽃밥을 나타내는 이 실험의 GUS 데이타를 나타내는 막대 그래프이다. 이 실험은 또한 에탄올에 의하여 리포터 유전자의 발현이 수처리한 꽃에서 보여지는 것 이상의 정도로 꽃밥에서 유도됨을 보인다. 유도된 AlcA-GUS 꽃밥으로부터의 GUS 발현 정도는 MFS14-GUS 식물 이상이었다.
3) 성숙한 AlcA-GUS 담배 식물은 250ml의 물 또는 5%의 에탄올로 온실에서 뿌리담금 하였다. 야생형 및 35S-GUS 식물은 또한 에탄올로 처리하였다. 이틀후 여러가지 꽃봉오리로부터의 암술을 절개하여 GUS 활성을 위하여 스태이닝하였다. 도46은 물 및 5% 에탄올 처리한 Alc-GUS 식물의 9-10mm 봉오리로부터의 암술을 나타낸다. 광합성은 명백히 에탄올 처리가 암술의 GUS 유도를 이끌었음을 보인다. 도47 및 48은 다시 수처리 및 에탄올 처리한 Alc-GUS 식물로부터 각각 17-22mm 및 33-35mm 봉오리에서 얻은 암술의 기문/화주 부분을 나타낸다. GUS 스태이닝은 야생형과 유사한 수처리 식물에 필적할만큼 이 부분에서 존재한다.
4) Alc-CAT 식물(35S-AlcR-nos/AlcA-CAT-nos) 또한 테스트하였는데 에탄올 유도후 꽃조직에서 리포터 유전자 수준이 올라갔음을 보였다.
평지씨
1) 평지씨(OSR) Alc-GUS 식물을 0 및 1일에 250ml의 물 또는 1% 또는 25의 에탄올로 뿌리담금하였다. 이들 식물로부터 제1 유도 2일후 꽃 시료를 취하였다. 형광 GUS 분석을 위하여 취해진 시료는 성숙한 꽃으로부터의 꽃밥(성숙이란 이것이 완전히 개화되었음을 나타냄), 성숙한 꽃으로부터의 기문/화주, 미성숙한 꽃으로부터의 꽃밥(개화되지 않은 꽃임이 있는 꽃봉오리), 미성숙한 꽃으로부터의 기문/화주 및 씨방을 포함하는 암술의 나머지였다.
도49는 GUS 데이타를 그래프로 도시한 것이고 왼쪽에서 오른쪽으로 수유도된 Alc-GUS, 1% 에탄올 유도된 Alc-GUS 및 2% 에탄올 유도된 Alc-GUS 평지씨 식물을 나타낸다. 각 섹션에서 첫 두 막대는 각각 유도되지 않은 꽃밥 및 유도되지 않은 기문/화주 GUS 수준을 나타낸다. 각 막대는 상이한 6개의 꽃으로부터의 씨방 또는 상이한 8개의 꽃으로부터의 기문/화주 또는 상이한 3개의 꽃으로부터의 꽃밥을 함유하는 각 복제물 3회 복제한 것을 나타낸다.
데이타는 명백히, 에탄올 유도한 식물에 수처리한 평지씨를 비교할 경우 꽃조직에서 GUS 수준이 증가함을 보인다. 2% 에탄올-처리한 식물에서 조사한 조직 모두는 유도하지 않은 및 수처리한 대조구 식물 모두에서 GUS가 증가하였음을 보인다.
2) 평지씨 Alc-GUS 꽃을 에탄올 유도후 GUS 스태이닝시켰다. 도50은 유도전 Alc-GUS 꽃의 그래프이고 도51은 250ml의 5% 에탄올로 뿌리담금한 이틀후 동일한 식물에서의 꽃의 그래프이다. 이것은 처리가 기문/화주 부분 및 꽃실에서 복구유전자 유도를 이끌었음을 보인다.
도52는 꽃받침 및 꽃이 제거된 미성숙한 꽃봉오리를 나타낸다. 오른쪽의 에탄올 처리한 식물은 왼쪽의 수처리한 대조구에 필적하는 화주/기문 부분에서의 GUS 발현을 보인다. 도53-55는 이의 다른 예이다. 도56은 야생형 및 물 유도된 평지씨 Alc-GUS 식물로부터의 암술 섹션을 나타낸다. 도57은 꽃시료를 취하기 이틀전 2% 에탄올로 뿌리담금한 식물로부터의 암술 섹션을 나타낸다. 이것은 암술 부분을 통하여 GUS의 발현을 보인다. 도58은 수처리한 식물 및 5% 에탄올 처리한 식물로부터의 암술을 나타낸다. 이것은 다시 화학적 에탄올의 도포가 자성 조직에 GUS의 발현을 유도하였음을 보인다.
도59는 꽃줄기를 잘라 5% 에탄올 비이커에 놓고 GUS 활성을 위한 만개 스태이닝전에 이틀간 방치한 실험에서의 꽃을 나타낸다. 블루 스태이닝은 꽃의 씨실, 꽃받침, 꽃잎 및 기문/화주 부분에서 명백하다.
토마토
담배 꽃에 대하여 상기 기술한 바와 같이 에탄올 증기를 사용하여 Alc-GUS 토마토 꽃을 유도하였다. 유도 이틀후 꽃밥 및 화분을 스태이닝하여 GUS 발현을 검출하였다. 도60a 및 60b에서 볼 수 있는 바와 같이 양 조직에서 블루 스태이닝이 관찰되었다.
쌀
쌀에서 Alc 스위치의 비유도성을 테스트하는 초기 실험에는 GUS 활성 평가 전 이틀간 잎 디스트를 에탄올 증기에 노출시키는 것이 포함하는 수경재배 테스트가 포함된다. 꽃조직에서 GUS 발현 유도를 조사하기 위하여 패니클 형성/개화 단계시 및 그 전에 온실에서 전체 식물을 1-5% 에탄올로 뿌리담금한다.
GUS 분석
꽃 물질을 2-300㎕의 추출 완충액(100mM의 소듐 포스페이트 완충액 pH7, 10mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 1% Sarcosyl, 10mM b-머캅토에탄올)에서 분쇄하였다. 시료를 15분간 원심분리기에서 돌리고 5㎕의 상청액을 표준과 같이 BSA로 Bradford 단백질 분석에 사용하였다. 추출 완충액 및 400㎕의 분석 완충액(1mM의 4-MUG 및 20%의 메탄올을 함유하는 것 외에는 추출 완충액과 동일)으로 5중 1로 20㎕를 희석하였다. 100㎕(T0시료)를 취하여 900㎕의 스톱 완충액(0.2M 소듐 카보네이트)에 가하고 나머지는 37℃에서 2시간 인큐베이팅시킨 다음 다시 100㎕(T2시료)를 취하여 900㎕의 스톱 완충액에 가하였다.
분광광도계에서 시료의 형광성을 측정하고 mg 단백질/시간당 nM 4M U로서 GUS를 나타내었다.
밀
pUIRN.AGS로 배반조직에 충격을 가하고 조직을 에탄올 증기에 노출시켰다. AlcA 촉진유전자가 GUA 발현을 이끌도록 유도되었음을 나타내는 무수한 푸른 점이보일 때 GUS 발현을 위하여 스태이닝한다.
얻어지는 유전자전이 Alc-GUS 식물을 성숙시켜 종자를 수거하고 쌀에 대하여 상기 기술한 바와 동일한 방식으로 자손 식물에 대하여 유도성 GUS 발현을 측정한다.
GUS 조직화학
GUS 스태이닝에 대하여, Blume 및 Grierson의 프로토콜(1997)을 사용하였다.
불임성 조사
1) 웅성 불임성 식물
a) 카세트 A로 형질전환시켜 발생시킨 포자체 웅성 불임성 식물을 죽은 화분의 존재 또는 화분 부족으로 확인한다. 종자는 화분 공여체로서 야생형 담배와 역교배시켜 얻는다.
b) 카세트 B로 형질전환시켜 발생시킨 배우체 불임성 식물은 50%가 불임이고 50%가 수정성인 화분을 생체염색하여 확인한다.
2) 자성 불임성 식물
카세트 F로 형질전환시켜 발생시킨 포자체 자성 불임성 식물은 야생형 화분과 타가수분할 수 없는 것으로 확인한다. 카세트 E 및 G로 형질전환시켜 발생시킨 두 경우 복구유전자 식물은 자가수분하고 자손을 생장시켜 T2 종자의 캐나마이신에 대한 선별에 의하여 통상적인 방식으로 동형접합 계통을 선별한다.
수정성의 유도 복구
포자체 불임 식물 및 야생형 식물간의 교배 자손은 형질전환 유전자의 존재로 1:1 불임으로 나누어질 것으로 예상되며 PCR 분석에 의하여 초기 생장 단계에서 선별한다. 이들 불임 식물들은 적당한 조직에서 바스타의 발현을 유도하기 위하여 뿌리 담금 또는 분무 또는 증기 도포로 에탄올 처리할 수 있으므로 수정성의 복구를 조사하기 위하여 유도 실험을 한다. 적절한 시간의 유도는 자가수분을 가능하게 하여 종자 생성이 용이하게 이루어질 수 있을 것으로 예상된다. 동형접합 식물은 통상적인 방법으로 얻어지는 자손으로부터 선별하고 동형접합 복구유전자 식물과 교배시켜 근본적인 복구를 테스트하는데 사용한다.
그러나 C5-바나제.AlcA-바스타 식물을 야생형 식물과 역교배하거나 자가수분이 진행되도록 하는 것은 50%는 완전히 수정성이고 50%는 50%만 수정성인 화분을 생성시키는 집단을 회수하게 한다. 그러나 이들 식물은 에탄올 분무, 뿌리담금 또는 증기 처리로 유도되어 자가수분 가능한 화분 발달시 바스타를 발현시킬 수 있다. 이 경우 동형접합 식물은 100% 불임인 반면 이형접합 식물은 50% 불임이다. 스태이닝에 의하여 얻어지는 결과의 차이는 자가수분 및 유도 효율에 대하여 결론을 낼 수 있게 한다.
타가수분에 의한 수정성의 근본적 복구
웅성 불임성 식물과 웅성 복구유전자 식물의 교배는 복구유전자 식물의 화분을 웅성 불임성 식물의 암술에 옮겨 한다(죽은 화분만을 함유할지라도 존재하는 꽃밥을 모두 제거한 후). 화분된 암술을 백에 넣어 주변의 야생형 또는 다른 화분에 의한 오염을 막는다. 생성된 종자를 수거한다. 자손을 생장시켜 화분 생성을 관찰 및 측정한다. 이러한 방식으로 수정성의 복구는 정상적인 화분 생성으로이끈다.
자성 불임성 식물의 교배는 이들 식물의 화분을 꽃밥을 제거한 후의 웅성 불임성 북구유전자 식물의 암술에 옮겨 한다. 꽃을 상기와 같이 백에 넣는다. 생성된 종자를 수거한다. 자손을 생장시켜 꽃을 백에 넣는다. 이들 식물의 자가수분 능력을 관찰한다. 이러한 방식으로 수정성의 복구는 자가수분이 일어나게 할 수 있다. 동일한 방식으로 자성 불임성이고 웅성 복구유전자를 함유하는 카세트 E 및 F 및 웅성 불임성이고 자성 복구유전자를 함유하는 카세트 A 및 G로 형질전환시켜 발생시킨 식물을 분석한다.
본 발명 영역에서 벗어나지 않는 본 발명의 다른 변형들은 당업자에 명백할 것이다.
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Claims (42)

  1. 웅성 수정성 및 동형접합 열성 자성 불임성인 부 식물 및 자성 수정성 및 동형접합 열성 웅성 불임성인 모 식물을 인터플랜팅하는 단계, 타가-수분시키는 단계 및 이로부터 종자를 얻는 단계를 포함하는 잡종 종자 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 각 부모 식물의 게놈 DNA가 하나 이상의 번역 증대자에 임의로 작동 연결된 외인성 화학 유도자의 존부에 반응하는 촉진유전자 서열 또는 각 부모 식물의 수정성을 완전히 복구하는 유전자에 작동 연결된 인트론 서열을 포함하는 유전자 구축물(상기 유전자는 외부 화학 유도자를 식물에 도포하여 각 부모가 자가-수분되게함으로써 발현됨)을 내포하고 있는 방법.
  3. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 모 식물이 화분의 생존성을 감소시키거나 생존하는 화분의 생물발생을 현저하게 파괴하는 열성 유전자에 대하여 동형접합인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 부 식물이 자방, 화주, 기문 생성 또는 작용 또는 화분 발아, 점착, 수화, 화분 튜브 생장 또는 배향을 파괴하는 열성 유전자에 대하여 동형접합인 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 화학 유도자의 존부에 반응하는 촉진유전자 서열이 AlcA 촉진유전자 서열 또는 GST-27 촉진유전자 서열인 방법.
  6. 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 부모 식물이 밀, 보리, 쌀, 오수수, 토마토, 해바라기, 사탕무우, 캐놀라, 목화, 대두 및 기타 식물인 방법.
  7. 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 생성되는 F1 잡종 종자가 모두 완전히 수정성인 식물로 생장하는 방법.
  8. 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 생성되는 F2 잡종 종자가 약 25%가 자성 불임성으로 불임에 대하여 나누어지는 식물로 생장하는 방법.
  9. 전기한 항들 중 어느 한 항에 있어서, 부모의 불임성이 자연적 또는 유전적으로 조작된 돌연변이에 의하여 야기되는 방법.
  10. 전기한 항들 중 어느 한 항의 방법을 잡종 종자를 생성하는데 사용하는 용도.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법으로 생산된 불임 식물.
  12. 제11항 부모의 자손, 그러한 식물의 자손 및 그러한 자손.
  13. (a) 수꽃 특이 촉진유전자 서열인 제1 유전자 촉진유전자 서열
    (b) 제1 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된, 수컷 수정성을 파괴할 수 있는 산물을 암호화하는 파괴유전자;
    (c) 하나 이상의 해독 증대자 또는 인트론 서열에 임의로 작동연결되는 암꽃 특이 촉진유전자 서열인 제2 유전자 촉지유전자 서열;
    (d) 제2 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된 암컷 수정성을 복구시킬 수 있는 산물을 암호화하는 복구유전자;
    (e) 하나 이상의 해독 증대자 또는 인트론 서열에 임의로 작동연결되는 외인성 화학 유도자의 존재에 반응하는 제3 유전자 촉진유전자 서열; 및
    (f) 제3 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된 수컷 수정성을 복구할 수 있는 산물을 암호화하는 복구 유전자
    를 포함하는 발현 카세트
  14. 제13항에 있어서, 파괴유전자가 수분 생성을 파괴할 수 있는 산물을 암호화하는 발현 카세트.
  15. 제13항에 있어서, 파괴유전자가 식물의 융모조직 세포내에서 발현될 수 있는산물을 암호화하는 발현 카세트.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 유전자 촉진유전자 서열이 Alc A 촉진유전자 서열 또는 GST-27 촉진유전자 서열인 발현 카세트.
  17. (a) 암꽃 특이 촉진유전자 서열인 제1 유전자 촉진유전자 서열
    (b) 제1 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된, 암컷 수정성을 파괴할 수 있는 산물을 암호화하는 파괴유전자;
    (c) 하나 이상의 해독 증대자 또는 인트론 서열에 임의로 작동연결되는 수꽃 특이 촉진유전자 서열인 제2 유전자 촉지유전자 서열;
    (d) 제2 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된 수컷 수정성을 복구시킬 수 있는 산물을 암호화하는 복구유전자;
    (e) 하나 이상의 해독 증대자 또는 인트론 서열에 임의로 작동연결되는 외인성 화학 유도자의 존재에 반응하는 제3 유전자 촉진유전자 서열; 및
    (f) 제3 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된 암컷 수정성을 복구할 수 있는 산물을 암호화하는 복구 유전자
    를 포함하는 발현 카세트
  18. 제17항에 있어서, 복구유전자가 수분 생성을 복구할 수 있는 산물을 암호화하는 발현 카세트.
  19. 제17항에 있어서, 복구유전자가 융모조직 세포내 화분 생성을 복구할 수 있는 산물을 암호화하는 발현 카세트.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 유전자 촉진유전자 서열이 Alc A 촉진유전자 서열 또는 GST-27 촉진유전자 서열인 발현 카세트.
  21. 반접합성 모 식물을 생성시키는 제1 식물에 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 합체시키고 반접합성 부 식물을 생성시키는 제2 식물에 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 합체시키는 단계;
    형질전환체에 외인성 화학 유도자를 가하여 부모가 자가-수분되게 하는 단계;
    얻어지는 종자로부터 식물을 생장시키는 단계;
    자웅 동형접합 식물을 선별하는 단계;
    선별된 자웅 식물을 교배시키는 단계; 및
    잡종 종자를 얻는 단계
    를 포함하는 잡종 종자 생산 방법.
  22. 제21항에 있어서, 부 식물이 웅성 수정성을 복구하는 동형접합 우성 유전자를 포함하는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 모 식물이 자성 수정성을 복구하는 동형접합 우성 유전자를 포함하는 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 생성되는 F1 잡종 종자가, 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트의 제1 유전자 촉진유전자 서열이 포자체 촉진유전자 서열일 경우, 약 50%의 생존 화분을 생성하는 꽃밥을 가지는 식물로 생장하는 방법.
  25. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 생성되는 F1 잡종 종자가, 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트의 제1 촉진유전자 서열이 포자체 촉진유전자 서열일 경우, 모두 완전히 수정성인 식물로 생장하는 방법.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, F2 잡종 종자가 상당수가 자성 불임성으로 불임성이 나뉘는 식물로 생장하는 방법.
  27. 제21항에 있어서, 자웅 동형접합 식물이 식물에 외인성 화학 유도자를 가하여 식물이 자가-수분할 수 있게 함으로써 배가 및 유지될 수 있는 방법.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 식물이 밀, 쌀, 옥수수, 토마토, 해바라기, 사탕무우, 캐놀라, 목화, 대두 및 기타 식물인 방법.
  29. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항의 하나 이상의 발현 카세트로 형질전환시킨 식물 조직 또는 이의 부분 및 상기 형질전환된 식물 조직에서 유도된 물질.
  30. 제29항의 조직 또는 물질을 포함하는 수정성 전체 식물.
  31. 전기한 항의 식물 자손, 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항의 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 자손 또는 이의 게놈에 합체된, 바람직하게는 안정하게 합체된 이의 부분 및 이러한 식물 및 자손의 종자.
  32. 게놈이 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 식물.
  33. 게놈이 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 발현 카세트를 포함하는 식물.
  34. 제32항의 식물을 제33항의 식물과 교배하고 이로부터 생성되는 잡종 종자를 얻어 생산하는 잡종 종자.
  35. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법을 잡종 종자를 생산하는데 사용하는 용도.
  36. 파괴유전자가 타겟 조직에서 효과적이도록 제3 유전자 촉진유전자 서열에 작동 연결된 복구유전자가 타겟 조직내에서 유도적으로 발현되나 하나 이상의 다른 조직에서 근본적으로 발현될 수 있는 제13항 내지 제16항 또는 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 식물 발현 카세트를 게놈에 합체시키는 것을 포함하는 식물을 형질전환시키는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 복구유전자가 칼루스 조직내에서 근본적으로 발현되는 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 복구유전자가 자웅 꽃 구조에서 유도적으로 발현되는 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 유전자 촉진유전자 서열이 GST-27 촉진유전자 서열인 방법.
  40. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 유전자 촉진유전자 서열이 Alc A 촉진유전자 서열인 방법.
  41. 도 2, 6 및 7중 어느 하나를 참조로 본원에서 앞서 기술한 바와 같이 실질적으로 잡종 종자를 생산하는 방법.
  42. 실질적으로 도 1 및 3-5 중 어느 하나를 참조로 본원에서 앞서 기술한 바와 같은 발현 카세트.
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