JPH11514233A

JPH11514233A - ハイブリッド植物の生産方法

Info

Publication number: JPH11514233A
Application number: JP9515277A
Authority: JP
Inventors: ホッジズ，トーマス，ケー．; リズニック，レゼック，エー．; ヴィンセント，ジェフリー; コノノウィック−ホッジズ，ハリナ; フク，エナムル; リー，ジャン−ヨン
Original assignee: Purdue Research Foundation
Current assignee: Purdue Research Foundation
Priority date: 1995-10-13
Filing date: 1996-10-11
Publication date: 1999-12-07
Also published as: NZ322673A; US5677175A; EP0876094A1; WO1997013401A1; AU716781B2; CA2234557A1; US5929307A; EP0876094A4; AU7662896A; CA2234557C

Abstract

(57)【要約】本発明は、部位特異的組替え配列によってフランキングされた自滅遺伝子を含む組替え発現ベクター、及び、ハイブリッド植物の生産を容易ならしめるトランスジェニック植物を作出するためのそれら発現ベクターの使用に関する。本発明によって生産されるトランスジェニック植物は、新規な雄性不稔／回復システムを有し、雄性不稔植物と回復植物とを他家受精させることによってハイブリッド植物を生産する。

Description

【発明の詳細な説明】ハイブリッド植物の生産方法発明の技術分野本発明はハイブリッド植物の生産方法に関する。更に詳細には、本発明は新規組替え発現ベクターを用いて、ハイブリッド植物の生産を容易にせしめる新規雄性不稔性／回復システムを包含するトランスジェニック植物を生産することに関する。本システムは部位特異的リコンビナーゼを用いて雄性不稔性を除去するものである。背景ハイブリッド植物は収量と成長力とに関して近交系より優れることが証明されている。ハイブリッド種子の大規模生産が興味をそそられる理由は、多くの作物においては同一苗（単一花中又は別々の花中に）中に、雌雄両生殖器官（雌ずい及び雄ずい）が存在するためである。この配置は、高度の自家受粉を引き起こし、また近交系間の大規模的交配の達成を困難にしている。育種家はハイブリッド種子の生産において確実に異系交配が起きるようにするために、手作業や機械で親系統個体から雄ずいを除去したり、花粉発生を途絶する雄性不稔性突然変異を利用したりしてきた。手作業による除雄は、小さな両性花を有する植物にとっては集約的で非現実的な労働である。イネ、トウモロコシ、小麦等の重要作物は自家受粉性植物であるので、Ｆ１ハイブリッドの生産を補助する受粉制御システムを開発する必要がある。現在得られているすべてのシステムは、親植物に雄性不稔性を導入し、さらに稔性回復遺伝子を導入して交配受粉により稔性ハイブリッド植物を生産することに基づいている。植物の開花における雄性生殖過程は葯で行われる。この器官は数種の組織と細胞型とから構成され、精子細胞を含有する花粉粒生産に関与している。特殊化した葯の組織がタペータムであり、花粉生成に重要な役割を果たしている。タペータムは葯の発生の初期には花粉嚢を取り囲み、発生後期中は縮退し成熟した葯に形成された組織として存在しない。タペータムは、花粉の発生を助けたりあるいは花粉外壁の成分になったりする数多くのタンパク質及び他の物質を生産する。雄性不稔性突然変異の多くは、タペータム細胞の分化及び／又は機能と干渉し合うことが知られている。このように、タペータムの組織は機能的花粉粒の生産に重要であると思われている。現在利用可能な雄性不稔性に基づく授粉システムは満足できるものではない。多くの場合、気候条件が異なると雄性不稔性が不安定となり（Fan 及びStefanss on、1986）、また雄性不稔性植物の部分的雌性不稔性及び／又は雄性不稔性植物の稔性への復帰も観察されている。更に雄性不稔性系の稔性回復に用いられる回復遺伝子も不安定であることが見出されている。あるケースにおいては、雄性不稔性花において顕著な形態学的変化が確認されている（Denis等、1993）。稔性制御の別なアプローチは細胞質雄性不稔性システムの利用に基づくものである。例えば、米国特許第3,861,079号参照。しかしながら、すべての雄性不稔性植物の生産のために単一の細胞質雄性不稔性システムに頼るのは、望ましくない。なぜなら全体を植物病原体に弱いハイブリッド系としてしまうからである。例えば、トウモロコシのある細胞タイプ（cmsT）の広範な使用で1970年代前半に Southern Corn Leaf Bliqhtが突然発生した。従って、単一の雄性不稔性システムしか得られていない植物種における雄性不稔性系生産の代替方法を開発することが重要である。本発明は新規雄性不稔性／回復システムを用いるハイブリッド植物の新規生産方法に関する。本方法は一植物系（系Ａ）に表現型の特徴（除草剤耐性、種皮の色、種子の肉付き等）に関連した雄性不稔性システム（自滅遺伝子を働かせる葯特異性プロモーター）を組み入れるものである。この表現型の特徴によって雄性不稔性の後代を同定し維持することができる。更に雄性不稔性システムは部位特異的リコンビナーゼの標的部位（組替え配列）によって、雄性不稔性システムがリコンビナーゼ活性の導入によって除去されて雄性不稔性植物の後代に稔性を回復させるようにフランキングされる。植物系Ｂは構成プロモーター（例えば、ユビキチン、CaMV35S等）又は細胞特異的プロモーター（例えば、葯、タペータム、接合子、胚芽等）の制御下、部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を組み入れることにより作出される。部位特異的リコンビナーゼは系Ａに存在する部位特異的組替え配列を認識し、それに対し相互作用する。系Ａ及び系Ｂを増殖させた後、二つの植物系を交配する。接合子又は初期の胚芽細胞中の部位特異的リコンビナーゼの発現により標的部位間のＤＮＡ全部を除去するリコンビナーゼ酵素がもたらされる。一態様においては、この不稔性システム及びこれにリンクしたマーカーシステムが除かれ、ハイブリッド種子を生じる稔性植物が創出される。本発明方法は一般に、授粉制御システムが未だ確立されていない、あるいはハイブリッドの生産が効率的でない植物に適用することができる。従って、本発明は組替え発現ベクター、更にＦ１ハイブリッド植物本体を生産するのに用いる雄性不稔性及び稔性回復植物系の生産方法を提供するものである。発明の概要本発明はリコンビナント発現ベクター、及びハイブリッド植物の生産を容易にせしめる雄性不稔性／回復システムを開発するためのこれらのベクターの利用に関するものである。本システムは、他家受精によってハイブリッド植物本体を生産する二種のトランスジェニック親植物から構成される。第一の親植物は雄性不稔性植物であって、葯特異性プロモーターと不稔性誘導遺伝子とが一対の部位特異的リコンビナーゼ部位によってフランキングされている不稔性誘導遺伝子からなるＤＮＡ配列を有する。第二の親植物は雄性稔性回復植物であって、雄性不稔性植物中に存在する部位特異的リコンビナーゼ部位に相互作用する部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子からなるＤＮＡ配列を有する。図面の簡単な説明図１ａ、図１ｂ、図１ｃ及び図１ｄは雄性不稔性トランスジェニック植物生産に有用な種々のＤＮＡ配列を図式的に表示したものである。自滅遺伝子（suicid e qene）(14)は葯特異性プロモーター（12）に作動的にリンクしている。第一の部位特異的リコンビナーゼ遺伝子（18）に結合する第一の部位特異的組替え配列（10）は誘導プロモーター（16）に作動的にリンクし、自滅遺伝子（14）又は回復遺伝子（20）を除去する一態様において用いられる。第二の部位特異的組替え配列（22）は介在配列を除去する図１ｄの構成要素に用いられる。図２はハイブリッド植物の調製方法を模式的に表示したものである。図３はハイブリッド植物の調製方法を模式的に表示したものである。図４はハイブリッド植物の調製方法を模式的に表示したものである。図５ａ及び図５ｂはＦ１ｐ発現ベクター及びＦＲＴ含有発現ベクターをそれぞれ図式的に表示したものである。これらのベクターはトランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物におけるＦＬＰ媒介ゲノムＤＮＡ除去試験に用いられる。発明の詳細な説明定義プロモーターとは構造遺伝子の転写を指令するＤＮＡ配列である。プロモーターは通常構造遺伝子の転写開始部位の近傍の遺伝子の５’領域に位置する。プロモーターが誘導プロモーターであれば、転写速度は誘導剤に応じて増加する。これに対しプロモーターが構成プロモーターであれば、転写速度は誘導剤では制御されない。葯特異性調節要素とは植物の他の組織と比較して葯組織に関連する遺伝子のより高度な転写を指令するＤＮＡ配列である。タペータム特異性調節要素とは植物の他の組織と比較してタペータム組織に関連する遺伝子のより高度な転写を指令するＤＮＡ配列である。これらの調節要素はコアプロモーターとリンクでき、組織にコアプロモーターに対する特異的活性を与える。エンハンサーとは、転写開始部位に関連するエンハンサーの距離と方向に関係なく転写効率を増加できるＤＮＡ調節要素である。「発現」という用語は遺伝子生成物の生合成のことをさす。「発現」は例えば構造遺伝子の場合、構造遺伝子のメッセンジャーＲＮＡへの転写およびメッセンジャーＲＮＡの一個以上のポリペプチドへの転写を含む。発現ベクターとは宿主細胞中に発現する遺伝子からなるＤＮＡ分子である。遺伝子発現は通常、構成又は誘導プロモーター、組織特異性調節要素及びエンハンサー要素を包含するある調節要素の支配下に置かれている。このような遺伝子は調節要素に「作動的にリンク」していると呼ばれる。発現ベクターは通常、発現ベクターを含有する菌体の選択を許容する真核性及び／又は細菌選択マーカーを含んでいる。外在性ＤＮＡ配列とは、外部のソースから宿主細胞中に導入されたＤＮＡ配列である。トランスジェニック植物とは、外在性ＤＮＡ配列を含有する一個以上の植物細胞を有する植物である。「安定に形質転換された」という用語は、後代に外在性ＤＮＡ配列を伝達する能力を有する形質転換細胞及び植物をさす。リボザイムとは触媒中心を含有するＲＮＡ分子である。この用語は、ＲＮＡ酵素、自己スプライシングＲＮＡ酵素及び自己切断ＲＮＡ酵素を包含する。リボザイムをコードするＤＮＡ配列は「リボザイム遺伝子」と称される。外部ガイド配列とは、内因性リボザイムＲＮアーゼＰに細胞内メッセンジャーＲＮＡの特殊な種に対しＲＮアーゼＰによるメッセンジャーＲＮＡの切断を引き起こす指令を下すＲＮＡ分子のことである。外部ガイド配列をコードするＤＮＡ配列は「外部ガイド配列遺伝子」と称される。可視性マーカーは、本明細書では宿主細胞又は生物に発現的性質を付与する生成物をコードする任意の遺伝子を含有すると定義される。自滅遺伝子という語は、本明細書ではこの自滅遺伝子を発現する細胞に致命的な生成物を発現する任意の遺伝子と定義される。回復遺伝子は、本明細書では自滅遺伝子（自滅遺伝子を除外するかその遺伝子の転写又は翻訳を妨害する生成物を含む）の発現を妨害、もしくは自滅遺伝子生成物の活性を妨害する生成物を発現する任意の遺伝子と定義される用語である。コアプロモーターはＴＡＴＡボックス及び転写開始を含むプロモーター機能のために不可欠なヌクレオチド配列を含有する。この定義によれば、コアプロモーターは活性を向上又は組織特異性活性を与えるような特異的配列の存在なしに検出可能な活性を有していてもいなくてもよいことになる。選択可能マーカーは、本明細書では細胞への導入後に選択される任意の核酸配列又は遺伝子生成物を含有すると定義される。選択可能マーカーは形質転換体の認識を容易にする。本発明は雄性稔性ハイブリッド植物を作出するためのシステムに関するものである。このシステムは雄性不稔性植物と稔性回復植物とからなり、雄性不稔性植物と稔性回復植物との他家受精から雄性稔性ハイブリッド植物を生産するものである。本発明において、雄性不稔性植物は、不稔性誘導遺伝子に作動的にリンクした葯特異性プロモーターを含むＤＮＡ配列を有し、少なくとも葯特異性プロモーターの一部分と不稔性誘導遺伝子とが一対の部位特異的組替え部位によってフランキングされている。これらの雄性不稔性植物の後代の稔性は、部位特異的リコンビナーゼ活性を後代植物の細胞に対し、発生初期段階（即ち接合子段階から植物の苗の段階）において導入することによって反転することができる。植物細胞へのリコンビナーゼ活性の導入は、構成プロモーターの制御下リコンビナーゼ遺伝子を植物細胞に導入する（例えば雄性不稔性植物とリコンビナーゼ遺伝子をコードする稔性回復植物との他家授粉）、あるいはすでに植物細胞に存在するリコンビナーゼ遺伝子の発現を誘導することにより行うことができる。本発明においては、トランスジェニック不稔性植物及び稔性回復植物はそれぞれの不稔性誘導遺伝子又は回復遺伝子をコードする発現ベクターを植物細胞に導入することで生産される。ＤＮＡ構築物植物細胞に導入する方法は当業者にはよく知られている。これらの方法で生産されたトランスジェニック植物は通常、生物の植物細胞のすべて又は大部分のゲノムに挿入された発現ベクターを有している。しかしながら自滅遺伝子の発現は、その遺伝子の発現を駆動するプロモーターの特異性に基づく特定の細胞タイプ又は組織タイプに限定されるであろう。一態様においては、雄性不稔性植物は自滅遺伝子を含み、その自滅遺伝子生成物は葯特異性組織にのみ発現する。更に好ましくはこの遺伝子生成物は花粉細胞の発生に直接関連する組織にのみ発現し、一態様においてはこの遺伝子生成物はタペータム細胞にのみ発現する。図１ａに図式的に示すように、一態様においては、植物細胞をこのＤＮＡ配列からなる発現ベクターを用いて形質転換することにより雄性不稔性植物を創出する。この発現ベクターは葯特異性プロモーターに作動的にリンクする自滅遺伝子からなり、葯特異性プロモーター及び自滅遺伝子をコードする配列が一対の同方向反復部位特異的組替え配列によりフランキングされている。この発現ベクターを含有するトランスジェニック植物は葯組織中における自滅遺伝子生成物の発現のため雄性不稔性になるであろう。しかし、その植物の雌部分は影響を受けないままで、雄性不稔性植物は別の植物からの花粉により受精できてＦ１後代を生産する。しかしながら、雄性不稔性植物が回復遺伝子を含有する植物と他家受精しなければ、他家受精後代も雄性不稔性になるであろう。このように本システムは非回復性植物との同胞受粉により雄性不稔性植物系の繁殖を可能にするものである。一態様においては、図１に示されるＤＮＡ配列は更に選択可能マーカー遺伝子又は可視性マーカー遺伝子を含有する。選択可能マーカー遺伝子又は可視性マーカー遺伝子の存在は、発現ベクターを用いて形質転換した植物本体の選択／確認を可能にする。このように選択可能マーカー遺伝子／可視性マーカー遺伝子は自滅遺伝子及び後代植物の不稔性の確認に用いることができる。稔性Ｆ１ハイブリッドは、図１のＤＮＡ配列からなる雄性不稔性植物を回復遺伝子を含有する植物で他家受精して有利に発生させることができる。一態様においては回復性植物は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子コードするＤＮＡ配列を有し、発現した部位特異的リコンビナーゼは、Ｆ１ハイブリッドのゲノムから自滅遺伝子の除外をもたらす自滅遺伝子をフランキングする部位特異的組替え配列と相互作用する。この態様では、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は構成プロモーター又は組織特異的プロモーターに作動的にリンクしている。本発明における自滅遺伝子は、機能性花粉細胞の生産を中断できるタンパク質をコードする。葯細胞機能を中断できるタンパク質には、細胞機能に不可欠な高子の合成を阻害するタンパク質、細胞機能に不可欠な高分子を低分子化する酵素、植物ホルモンの生合成又は代謝を変更するタンパク質及び葯／タペータム細胞の特異的機能又は発生を阻害するタンパク質が挙げられる。例えば、植物のタペータム細胞中におけるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＲＮアーゼ-ＴＩ又は「バルナーゼ(barnase)」という称されるＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのＲＮアーゼの発現がタペータム細胞の崩壊を誘起し雄性不稔性をもたらすことが、マリアーニ等、Ｎａｔｕｒｅ、３４７：７３７、（19 90）に報告されている。雄性稔性植物発生のためのバルナーゼの代替品として、葯特異性β−１，３−グルカナーゼ（ハード等、ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ、４：１０２３−１０３３、1993）又はアールツ等、Ｎａｔｕｒｅ、３６３：７１５−７１７、1993記載の雄性不稔性遺伝子等の他の遺伝子を使用することができる。あるいは、雄性不稔性はアンチセンスＲＮＡの発現によっても導入しうる。アンチセンスメッセンジャーＲＮＡ分子を標的メッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）に結合させると、翻訳がハイブリッド阻止される。このように、適切なアンチセンス分子はタペータム細胞の機能や花粉合成に不可欠なタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ種の配列と相補的な配列を有していてもよい。通常このアンチセンス遺伝子は葯特異性プロモーターに作動的にリンクし、花粉生産に相当する細胞に対するアンチセンスＲＮＡの発現を制限する。一態様においては、発現ベクターは、ＲＴＳ２（配列番号１）遺伝子生成物の発現を妨害するアンチセンスＲＮＡを発現するという当業者に知られている技術を用いて調製される。あるいは、ＰｅｔｕｎｉａｉｎｆｌａｔａからのＰＲＫＩ（花粉発現受容体様キナーゼ）のアンチセンス（ムー等、ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ、６：７０９−７２１、1994）又はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＢｃｐ１雄性稔性遺伝子のアンチセンス（シュー等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：２１０６−２１１０、1995）がアンチセンス自滅遺伝子として使用できる。自滅遺伝子はリボザイムもコードできる。リボザイムはメッセンジャーＲＮＡ分子中のある標的配列を制御するエンドヌクレアーゼ活性を発現するものと言える。例えば、シュタイネッケ等はタバコのプロトプラスト中のリボザイムによってネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子の１００％に達する発現阻害を達成した（ＥＭＢＯＪ．，１１：１５２５、（1992））。自滅遺伝子は、ＲＮアーゼＰに媒介される目的とするメッセンジャーＲＮＡ分子の切断をプロモートできるＲＮＡ分子もコードできる。このアプローチに従えば、外部ガイド配列を、細胞性リボソームによって切断される細胞内メッセンジャーＲＮＡの特定種に対して外在性リボザイムであるＲＮアーゼＰを制御するために構築することができる。アルトマン等、米国特許第５，１６８，０５３号及びユアン等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６３：１２６９、（1994）参照。葯特異性プロモーター及び葯特異性遺伝子は当業界で知られている。例えば、マコーミックら、「葯特異性遺伝子：トランスジェニック植物における分子キャラクタリゼーションとプロモーター分析」、「植物繁殖：花誘導から受粉まで」ロードら（編者）及びスコットらＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ４：２５３、（ 1992）を参照。しかしながら、葯特異性遺伝子の発現をもたらす一般に受け入れられるコンセンサス配列は存在しない。従って、コンセンサス配列をスクリーニングして植物ゲノムライブラリーから直接葯特異性調節要素を単離することは不可能である。本発明においてはこれらの葯特異性プロモーターは自滅遺伝子に作動的にリンクでき、雄性不稔性植物生産に用いられる部位特異的リコンビナーゼ配列にフランキングされ得る。一態様においてタペータム特異性プロモーターは自滅遺伝子の発現の駆動に用いられ、特に本発明において有用なタペータム特異性プロモーターの一つは配列番号２のタペータム特異性プロモーターである。雄性不稔性系の生産に用いられるＤＮＡ構築物の自滅遺伝子は、部位特異的リコンビナーゼシステムの利用によって自滅遺伝子の除去を可能にする部位特異的組替え部位にフランキングされる。一般に部位特異的リコンビナーゼシステムは二要素から構成され、一つは一対のＤＮＡ配列（部位特異的組替え配列）で、もう一つは一定の酵素（部位特異的リコンビナーゼ）である。この部位特異的リコンビナーゼは二個の部位特異的組替え配列間のみの組替え反応の触媒になるであろう。部位特異的組替え配列の方向に依存して、部位特異的リコンビナーゼの存在下で介在配列が除外又は反転される。部位特異的組替え配列が互いに反対方向をとれば（即ち反方向反復配列）どの介在配列もゲノム中の他の配列に対し反転されるであろう。したがって部位特異的組替え配列の反方向反復配列が、細胞中に導入されたＤＮＡの両端に存在すれば、二つの反復配列間に位置する配列が部位特異的リコンビナーゼと部位特異的組替え配列との相互作用により引き続き反転（１８０°回転）され得る。しかし部位特異的組替え配列が互いに同一方向をとれば（即ち同方向反復配列）どの介在配列も部位特異的リコンビナーゼとの相互作用により欠失されるであろう。本発明においては、多くの部位特異的リコンビナーゼシステムを用いることができ、その例としては、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘシステム、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴシステム、ファージＭｕのＧｉｎリコンビナーゼ、大腸菌のＰｉｎリコンビナーゼ及びｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳシステムが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい部位特異的リコンビナーゼシステムはバクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘシステム及び酵母のＦＬＰ／ＦＲＴシステムの二種である。これらのシステムにおいてリコンビナーゼ（Ｃｅｒ又はＦＬＰ）はそれぞれの部位特異的組替え配列（ｌｏｘ又はＦＲＴ）と特異的に相互作用し介在配列を反転又は除外する。これら二システムの各々の配列は比較的短いものである（３４ｂｐ、ｌｏｘ及び３４−３７ｂｐ、ＦＲＴ）。部位特異的リコンビナーゼシステムは米国特許第５，５２７，６９５号に記載されており、この開示を明示的に本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。自滅遺伝子は部位特異的組替え配列部位の同方向反復配列によってフランキングされ、続くリコンビナーゼ活性導入により自滅遺伝子が除外され稔性が回復する。あるいは、自滅遺伝子のプロモーター又は部位特異的リコンビナーゼシステムの非同方向反復配列間の自滅遺伝子のコード領域の少なくとも一部のいずれかにより、続く部位特異的リコンビナーゼ導入の結果配列が反転して遺伝子を不活性化する。この組替え反応は可逆であり、介在配列は二度反転できて、遺伝子生成物の発現を可能にする遺伝子に対する機能を回復する。ＦＬＰ／ＦＲＴリコンビナーゼシステムは植物細胞において効果的に機能することが示されている。トウモロコシ及びイネ両方のプロトプラストにおけるＦＬＰ／ＦＲＴシステムの機能実験からＦＬＰ部位構造及び存在するＦＬＰタンパク質の量がリコンビナーゼ活性に影響を及ぼしていることが示される。一般に、短い不完全なＦＲＴ部位は完全な全長ＦＲＴ部位よりも高い頻度で除外現象をもたらす。この組替え反応は可逆であるが、部位特異的組替え配列の構造を変更すると反応の可逆性を変更できる。部位特異的組替え配列は、組替え反応の生成物がもはや逆反応の基質として認識されなくなり反転又は除外現象が安定化する方式により突然変異される。部位特異的組替え配列は反転されるＤＮＡ配列の末端に結合している必要があるが、部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子はどこに存在していてもよい。例えば、リコンビナーゼ遺伝子は、標準的な形質転換方法又は既にリコンビナーゼ遺伝子を含有する植物との他家受粉により細胞に直接導入することができる。あるいは、リコンビナーゼ遺伝子は植物ＤＮＡ中に既に存在していてもよく、誘導プロモーターに作動的にリンクしていてもよい。誘導プロモーターには、与えられた遺伝子によってインデューサーへの照射に応じて生産される遺伝子産物量を増加することができる任意のプロモーターが挙げられる。誘導プロモーターは当業者には知られており、おそらくリコンビナーゼ遺伝子の発現を駆動するのに用いることができるような種類が存在する。本発明に従って用いるのに好適な誘導プロモーターには、熱衝撃プロモーター、グルココルティコイドシステム及び任意の化学物質（テトラサイクリン、Ｃｕ等）誘導プロモーターが挙げられる。熱衝撃によって制御されるプロモーターは、例えば通常７０−ｋＤａ熱衝撃タンパク質をコードする遺伝子を伴ったプロモーターで、昇温まで照射した後の発現を数倍増加することができる。この熱衝撃プロモーターはリコンビナーゼ遺伝子の転写を制御するための環境誘導プロモーターとして用いることができる。グルココルティコイドシステムは遺伝子の発現のトリガーにあたってもよく機能する。このシステムは、ステロイドホルモンの存在下ホルモンとのコンプレックスを生成するグルココルティコイド受容体タンパク質（ＧＲ）をコードする遺伝子から構成される。このコンプレックスは続いてグルココルティコイド応答要素（ＧＲＥ）と称される短いヌクレオチド配列（２６ｂｐ）と結合し、この結合によって結合遺伝子の発現が活性化する。グルココルティコイド誘導プロモーターシステムはトランスジェニックタバコにおける機能を示し（メット等、1993）、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の発現を制御するのにも用いることができる。一態様においては、雄性不稔性植物は図１Ｂに模式的に表示したＤＮＡ配列からなる発現ベクターを用いて植物細胞を形質転換することにより生産される。この配列は葯特異性プロモーターに作動的にリンクした自滅遺伝子及び部位特異的組替え部位と特異的に相互作用する部位特異的リコンビナーゼを発現する遺伝子とを含む。部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は誘導プロモーターに作動的にリンクしている。葯特異性プロモーター及び自滅遺伝子をコードする配列は一対の同方向反復部位特異的リコンビナーゼ配列によってフランキングされる。更にこの構成は選択可能マーカー又は可視性マーカー遺伝子を包含することができる。この発現ベクターの別の態様においては、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子をコードする配列も同方向反復部位特異的組替え配列間に位置して、自己除外をもたらす。別の態様に従えば、雄性不稔性植物は図１Ｃに模式的に表示したＤＮＡ配列からなる発現ベクターを用いて植物細胞を形質転換することにより創出される。この配列は自滅遺伝子、回復遺伝子、及び回復遺伝子をコードするＤＮＡ配列をフランキングする一対の同方向反復部位特異的リコンビナーゼ部位を含み、自滅遺伝子及び回復遺伝子は葯特異性調節要素に制御されている。有利なことに、この発現ベクターを用いた形質転換植物は最初は雄性不稔性でない。このことは、初期形質転換植物が自家受粉して多数の後代を生産することを可能にしている。雄性不稔性は、部位特異的リコンビナーゼ活性を植物細胞に導入してこれらの植物の任意のものへ誘導可能である。部位特異的リコンビナーゼ活性は回復遺伝子を除去し、雄性不稔性を誘導する活性自滅遺伝子生成物をもたらす。この雄性不稔性植物を、構成プロモーター又葯特異性プロモーター存在下に発現した回復遺伝子を含有する植物と他家受精して、稔性ハイブリッド植物を続いて発生することができる。図１Ｄに模式的に表示するように、発現ベクターを生産するために図１Ｃの発現ベクターに第二の部位特異的組替えシステムを付加することができる。この発現ベクターは、自滅遺伝子及び回復遺伝子をコードする多機能ＤＮＡ配列で、自滅遺伝子及び回復遺伝子の発現は葯特異性調節要素に制御されている。この発現ベクターは更に、回復遺伝子をコードするＤＮＡ配列をフランキングする第一の一対の部位特異的組替え部位及び誘導プロモーターに作動的にリンクする第一の部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子からなる。この発現ベクターは更に、多機能ＤＮＡ配列をフランキングする第二の一対の同方向反復部位特異的リコンビナーゼ部位からなる。発現ベクター１Ｄを用いて形質転換された植物細胞は雄性不稔性ではないであろう。しかし誘導プロモーターに第一の部位特異的リコンビナーゼを導入すると、回復遺伝子植物ゲノムから除去されて雄性不稔性植物になるであろう。この雄性不稔性植物を、自滅遺伝子の除去をもたらす発現ベクター１Ｄ上の第二部位特異的組替え部位と相互作用するの第二の部位特異的リコンビナーゼを発現するＤＮＡ配列を有する植物へ交配して稔性ハイブリッド植物を続いて発生することができる。形質転換生物体の表現型を変更するために組替えＤＮＡ技術を利用して異質のＤＮＡ配列をその生物体のゲノムに挿入することができる。これらの遺伝子配列は通常すべての細胞に存在するであろう。しかしながら、遺伝子生成物の発現は遺伝子の発現を駆動するプロモーターの特異性に基づき特定の細胞タイプ又は組織タイプに限定されるであろう。本発明の一態様に従えば、葯特異性組織にのみＤＮＡ配列を発現するプロモーターの制御下でそのＤＮＡを用いて植物細胞を形質転換する。更に好ましくは、遺伝子生成物は花粉細胞、更に好ましくはタペータム細胞の発生に直接関連する組織にのみ発現する。本発明の一態様に従えば、植物細胞に対し細胞毒性を有するタンパク質生成物を発現する、あるいは通常の花粉発生を妨げる（即ちアンチセンスｍＲＮＡの利用）自滅遺伝子（葯特異性プロモーターに作動的にリンク）を用いて植物を形質転換する。遺伝子産物が植物細胞に対し毒性でありさえすれば自滅遺伝子の選択は重大ではない。植物細胞に毒性である生成物を発現するのに好適な遺伝子は当業者に知られている。本発明のＤＮＡ構築物は当業者に知られている組替えＤＮＡ技術を用いて構築される。組替え遺伝子構築物は、商業的に入手可能な発現ベクターに挿入可能で、形質転換細胞中で遺伝子産物を発現する。形質転換細胞の創出には、ＤＮＡが宿主細胞内に物理的に存在する必要がある。ＤＮＡは当業者に知られている種々の技術を用いて細胞に導入される。例えば形質転換の一形態において、ＤＮＡはマイクロピペットを用いて直接細胞にマイクロインジェクションされる。あるいは、微少なＤＮＡ会合粒子を細胞に進入させるため高速発射特性を用いることができる。別の形態においては、ポリエチレングリコールの存在により細胞を浸透可能にし、拡散によりＤＮＡが細胞に進入できるようにする。又、プロトプラストを調製し、調製されたプロトプラストを他のＤＮＡ含有する単位と融合することによってもＤＮＡを細胞へ導入することができる。これらの例としては、ミニ細胞、細胞、リソゾーム、他のプロトプラスト又は他の融合可能な脂質表面を有する材料が挙げられる。ＤＮＡを細胞に導入するためのエレクトロポレーションも一般に受け入れられている方法である。この技術では、生体膜を可逆的に透過可能にする高強度の電場の電気インパルスに細胞を付し、これによって外在性ＤＮＡ配列を進入可能にする。これらの「直接的」形質転換技術に加え、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓを用いた細菌感染を経由して形質転換することができる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細菌株は、プラスミド（ＴｉまたはＲｉと呼ばれる）を含有し、その一部分（転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）と称される）はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに感染した後に植物細胞に伝達され、また植物細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。このシステムは文献に広範囲に記述されており、異種遺伝子及びＤＮＡ配列を植物細胞に導入するために改変することができる。形質転換細胞（宿主細胞ＤＮＡに挿入されたＤＮＡを含有する）は、導入されたＤＮＡ配列の一部として含まれる選択可能マーカーの使用によって未転換細胞から選択される。形質転換細胞／植物体は、導入ＤＮＡ配列の一部として含有される可視性マーカーの発現によっても確認できる。可視性マーカーは種子の色（即ち黄、紫又は白色遺伝子）又は種子形状（即ち、縮れ又は丸型遺伝子）等の可視的表現型性質を付与する遺伝子を含有する。選択可能マーカーは抗菌剤耐性又は除草剤耐性をもたらす遺伝子を含有する。選択可能マーカー遺伝子を含有する細胞は、形質転換されていない細胞を死滅させる抗菌剤濃度又は除草剤濃度において生存可能である。選択可能マーカー遺伝子の例としては、除草剤バスタ（Ｂａｓｔａ）に対する耐性をもたらすｂａｒ遺伝子、カナマイシン耐性をもたらすｎｐｔＩＩ遺伝子及びハイグロマイシン耐性をもたらすｈｐｔ遺伝子が挙げられる。当業者に知られた細胞培養技術によって一個の形質転換植物細胞から完全植物体を創出することができる。ハイブリッド植物生産一態様においては、ハイブリッド植物生産に用いる雄性不稔性系統は当業者に知られた技術を用いて稔性植物種Ａから、植物細胞を不稔性誘導ＤＮＡ構築物で形質転換して不稔性種Ａ（ｔ）を生産することにより作出可能である。不稔性誘導ＤＮＡ構築物は自滅遺伝子に作動的にリンクした葯特異性（タペータム特異性）プロモーター、マーカー遺伝子（例えば種色又は種形状に影響を及ぼす可視性マーカー遺伝子又は抗菌剤耐性遺伝子等の選択可能マーカー遺伝子）及び一対の同方向反復部位特異的組替え配列（例えばＦＬＰ／ＦＲＴリコンビナーゼシステム中のＦＲＴ組替え配列）を有する。（図２参照）。マーカー遺伝子と自滅遺伝子とは一対の部位特異的組替え配列によりフランキングされる。このＤＮＡ構築物によって形質転換された植物細胞はマーカー遺伝子の存在に基づいて確認される。一態様においては、このマーカー遺伝子は、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターに作動的にリンクするｂａｒ遺伝子のような選択可能マーカーである。このｂａｒ遺伝子は除草剤バスタに対する耐性を有する生成物をコードする。図２に示すＤＮＡ構築物を有する植物は、自滅遺伝子産物がタペータム細胞内に発現された結果、雄性不稔性となっている。雄性不稔性トランスジェニック品種Ａ（ｔ）は、元の植物品種Ａから採った花粉を受粉させることにより維持できる。次に除草剤バスタを噴霧することにより後代をスクリーニングするが、当該ＤＮＡ構築物を有する植物のみが生き残る。前記ＤＮＡ構築物を維持するこれら植物は、雄性不稔性である。ＤＮＡ構築物の単一の遺伝子座がトランスジェニック品種Ａ（ｔ）内に存在すると仮定すると、品種Ａ（ｔ）を品種Ａと交配させれば、雄性不稔性植物と雄性稔性植物が１対１の割合で発生するはずである。雄性稔性系統は、品種Ａと反復交配してハイブリッド生産用の雄性稔性種子を多数生産することができる。不稔性誘導ＤＮＡ構築物中に存在する部位特異的組替え配列の同方向反復は、爾後の自滅遺伝子の除去及び細胞に対する部位特異的リコンビナーゼの活性導入時に稔性の回復を可能にする。従って、一態様においては、トランスジェニック品種Ａ（ｔ）を雄性稔性回復品種Ｂ（ｔ）と交配させ、所望のハイブリッドを生産することができる。回復植物品種Ｂ（ｔ）は、構成プロモーターと作動的にリンクしたリコンビナーゼ遺伝子（例えばＦＬＰ／ＦＲＴリコンビナーゼシステム中のＦＬＰリコンビナーゼ遺伝子）を含むＤＮＡ構築物によって品種Ｂを形質転換することにより生産される。トランスジェニック品種Ｂ（ｔ）は、トランスジェニック品種Ａ（ｔ）と交配させて、稔性ハイブリッド株を生産することができる。ハイブリッド株内のリコンビナーゼ遺伝子の発現は、親品種Ａ（ｔ）から発生した部位特異的組替え配列間に位置するＤＮＡ配列（自滅遺伝子をコードする）を除去する結果となる。従って、ハイブリッド種子は、ただ一種の部位特異的組替え配列とリコンビナーゼ遺伝子とを有する。ハイブリッド種子から生産した植物は稔性となる。他の態様においては、図３に示す不稔性誘導ＤＮＡ構築物を用いることにより雄性不稔性植物を生産できる。この態様によれば、第一の部位特異的組替え配列（例えばＦＬＰ／ＦＲＴリコンビナーゼシステム中のＦＲＴ組替え配列）の一対の逆方向反復配列によってフランキングされた自滅遺伝子を有する多機能配列を含む不稔性誘導ＤＮＡ構築物を用いて植物品種Ａが形質転換される。自滅遺伝子はタペータム特異性プロモーター（第１の部位特異的組替え配列によってフランキングされた、配列外に位置するプロモーター）の近傍に位置するが、自滅遺伝子が転写されないように当該プロモーターに対して反転される。前記多機能配列は、第一の部位特異的リコンビナーゼ遺伝子（例えばＦＬＰ／ＦＲＴリコンビナーゼシステム中のＦＬＰリコンビナーゼ遺伝子）と作動的にリンクした誘導プロモーターを更に含み、一対の第二の部位特異的組替え配列（例えばｃｒｅ／ｌｏｘリコンビナーゼシステム中のｌｏｘ組替え配列）の同方向反復配列によってフランキングされる。このＤＮＡ構築物により形質転換された植物は稔性となるが（従って種子の生産を容易にする）、誘導プロモーターの誘導時に、第一の部位特異的リコンビナーゼ活性が細胞に導入され、リコンビナーゼは第一の部位特異的組替え配列と相互作用し自滅遺伝子を反転させる。自滅遺伝子の反転は、タペータム特異性プロモーターを自滅遺伝子と作動的にリンクさせ、自滅遺伝子産物の発現と植物の雄性不稔性をもたらす。不稔性誘導ＤＮＡ構築物は可視マーカー遺伝子又は選択可能マーカー遺伝子を更に含むことができ、これによって不稔性誘導ＤＮＡ構築物を含む植物の確認・同定を可能にする。図３に示すように、不稔性誘導ＤＮＡ構築物に存在する第二の部位特異的組替え配列の同方向反復配列は、爾後の多機能ＤＮＡ配列の除去及び第二の部位特異的リコンビナーゼ活性の細胞（例えばｃｒｅ／ｌｏｘリコンビナーゼシステム中のｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子）への導入時における稔性の回復を可能にする。従って、雄性不稔性品種Ａは，雄性稔性回復品種Ｂと異系交配させて、所望の雄性稔性ハイブリッドを生産することができる。他の態様においては、図４に示す不稔性誘導ＤＮＡ構築物を用いることにより、雄性不稔性植物を生産できる。この態様によれば、植物品種Ａは、タペータム特異性プロモーターと作動的にリンクした自滅遺伝子、タペータム特異性プロモーターと作動的にリンクした回復遺伝子および部位特異的リコンビナーゼ遺伝子（例えばＦＬＰ／ＦＲＴリコンビナーゼシステム中のＦＬＰリコンビナーゼ遺伝子）含む多機能性配列から成る不稔性誘導ＤＮＡ構築物を用いて形質転換され、当該回復遺伝子は部位特異的組替え配列（例えばＦＬＰ／ＦＲＴリコンビナーゼシステム中のＦＲＴ組替え配列）の一対の同方向反復配列によってフランキングされている。一態様においては、回復遺伝子は、自滅遺伝子の発現を妨害するアンチセンス遺伝子を含む。このＤＮＡ構築物により形質転換された植物は、回復遺伝子（例えばバースター（Ｂarster）遺伝子産物）が自滅遺伝子（例えばバルナーゼ（Ｂarnase）遺伝子産物）を妨害して自滅遺伝子の効果を消去するため、稔性となる。しかし、誘導プロモーターの誘導時に、部位特異的リコンビナーゼ活性は細胞内に導入され、当該リコンビナーゼは、回復遺伝子をフランキングする部位特異的組替え配列と相互作用し回復遺伝子を除去する。回復遺伝子の除去後、自滅遺伝子が発現され活性となり、雄性不稔性をもたらす。不稔性誘導ＤＮＡ構築物は、不稔性誘導ＤＮＡ構築物を有する植物の確認を可能にするため、可視マーカー若しくは遺伝子又は選択可能マーカーを更に含んでもよい。他の態様においては、図４に示す構成と同様の構成を利用して、雄性不稔性植物を作出する。唯一の違いは、部位特異的組替え配列の位置と方向である。この態様では、回復遺伝子が、一対の部位特異的組替え配列の反転反復によってフランキングされる。また、回復遺伝子の発現を駆動するタペータム特異性プロモーターが、部位特異的組替え配列の反転反復配列によってフランキングされる配列の外に位置する。この構築物によって形質転換された植物は、回復遺伝子産物が自滅遺伝子産物を無効にするため、雄性稔性となる。しかし、リコンビナーゼ活性の導入により、回復遺伝子が反転し、回復遺伝子の発現が防止されて雄性稔性へと導かれる。図４に示すように、雄性不稔性植物は、回復遺伝子及び選択可能マーカーを含む植物種と交配受粉させることができる。選択可能マーカーを有する後代植物を選択することにより雄性稔性が得られる。実施例１イネ細胞の形質転換バイナリー・ベクターｐＴＯＫ２３３を保持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株ＬＢＡ４４０４。このｐＴＯＫ２３３はＴｉ−プラスミドｐＴｉＢｏ５４２［Ｈｉｅｉら、ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ６：２７１−１８２（１９９４）］由来のｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、及びｖｉｒＧ遺伝子を有し、且つＴ−ＤＮＡ中にｎｐｔ、ｈｐｔ、及びイントロンｇｕｓＡ遺伝子を有する。イネのカルス及び植物体を安定に形質転換できるかどうかについてＬＢＡ４４０４（ｐＴＯＫ２３３）の能力を試験した。ジャポニカ種とインディカ種の各品種のイネを形質転換した。若い胚を２６℃の暗室にて３日間ＬＢＡ４４０４（ｐＴＯＫ２３３）と共に培養し、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリンと１００ｍｇ／ｌのセフォタキシム中で３週間育成した。得られたカルスを１〜２ｍｍの長さにカットして植え付け、抗生物質による選択に付した（２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリン、１００ｍｇ／ｌのセフォタキシム及び３０ｍｇ／ｌのハイグロマイシン中で３週間）。次いで植物を選択したカルスから再生させ、推定トランスジェニック植物として育成した。アグロバクテリウム(Agrobacterium)による形質転換による、異なる品種のトランスジェニック・イネ植物の生産効率を表１に示す（表中、Ｙ．Ｅ．は若い胚、Ｇ⁺はＧｕｓ陽性を示す）。ジャポニカ品種のラドンについては、効率は平均で約２７％であり、これは即ち、ハイグロマイシン耐性及びＧＵＳ活性の発現から判断して、処理に付された当初の胚の２７％が形質転換植物を産したことを示す［表中、「（Ｇ⁺を有する植物をもたらすＹ．Ｅ．の数）／（植付けた胚）（％）」と表記した欄を参照］。推定形質転換体が形質転換されたものであるか否かはサザン分析によって確認した。今日まで得られている確認済形質転換体は全て稔性を有し、シードセットは、種から育成した植物から得られたシードセットとほぼ等価であった。アグロバクテリウム(Agrobacterium)を用いて行った双子葉類の形質転換の場合と同様、イネ・ゲノムへのトランスジーンの組み込みパターンは恐らくランダムであると考えられるが、挿入されたコピーの数と遺伝子の転位頻度は直接ＤＮＡ摂取法(direct DNA uptake methods)で観察された結果より少ない。予備的分離研究の結果、ＧＵＳについては３：１の分離比となり、これは一遺伝子の場合のメンデルの遺伝を示している。後者の結果はまた、アグロバクテリウム(Agrobacterium)による汚染（あるいはその生息）が結果に寄与している可能性を消し去るものである。実施例２花粉の発生の初期段階において機能的なイネからのプロモーター／遺伝子の単離本発明は、配列番号１で表されるタペータム特異性遺伝子をコードする、実質的に純粋な核酸配列を提供する。加えて、配列番号２で表される、そのような遺伝子のタペータム特異性プロモーターをも提供する。そのような遺伝子（クローンＲＳＴ２を、次の方法に従ってイネから単離した。イネＩＲ５４の円錐花序を用いてｐｏｌｙ（Ａ⁺）ＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーを調製した。円錐花序は、第一葉と第二葉の耳葉間の距離がゼロ、即ちそれらが同位置にある段階で収穫した。この段階は通常、花粉母細胞が最も活発に減数分裂する段階と考えられている。このｃＤＮＡライブラリーを、葉のｃＤＮＡ及び花序のｃＤＮＡを指標として、分化によって篩い分け、３８個の推定花序特異性ｃＤＮＡクローンを得た。これらの３８個の内、３６個を更に葯特異性を指標として、花序の各種部位（即ち、花軸、小穂の上半分及び小穂の下半分。なお、葯は、サンプルが収穫された発生上の段階においては、小穂の下部に位置している）から得たｃＤＮＡを用いて篩い分けした。異なるストリンジェンシーの洗浄によって、２つのクローンを可能性ある候補として選択し、それらの組織特異性をさらに試験した。イネの葉、未熟な種、及びｃＤＮＡクローンの発生と同一の発生学的ステージにおいてその早期または後期に採取した花序から、全ＲＮＡを単離した。得られた各種ＲＮＡを、前記２つの予想されたタペータム特異性ｃＤＮＡクローンとハイブリダイズさせた。ノーザンブロット分析の結果、遺伝子は花序に特異的に発現しており、発生学上の調節を受けていることが判明した。ｃＤＮＡクローンＲＴＳ１をプローブとして用いたｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果、葯内の減数分裂胞子細胞を囲む葯壁最内層を構成するタペータムにおいて、強いハイブリダイゼーション信号が発生した。ＢＳＡでコーティングする前に、ＲＮアーゼＡを用いて組織をスライド上でｉｎｓｉｔｕで処理すると、組織に対するプローブのハイブリダイゼーションは完全に失われた。葉はバックグラウンドレベルを超えるハイブリダイゼーションを示さなかった。ＲＴＳ１ｃＤＮＡクローンのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメント（０．６ｋｂ）をプローブとして、ＩＲ５４ゲノムライブラリーをスクリーニングに付し、３個の陽性ゲノムＤＮＡクローンを得た。制限酵素を用いてこれらのクローンの地図を作成し、ＲＴＳ１ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズした４．３ｋｂのＳａｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（ＲＴＳ２）をベクターｐＧＥＭ−３Ｚｆ（−）にサブクローニングした。クローニングされたｃＤＮＡ（ＲＴＳ１）及びこれに対応する、翻訳開始部位の上流に１．２ｋｂのヌクレオチドを含むゲノムクローン（ＲＴＳ２）の配列を決定した。タペータム特異性ＲＴＳ２遺伝子のプロモーター配列（配列番号２）および全ＲＴＳ２遺伝子配列（配列番号１）をそれぞれ、配列番号１と配列番号２として示す。ｃＤＮＡクローンとゲノムクローンの配列を比較すると、この遺伝子にはイントロンを有さず、連続した２８５塩基対のオープンリーディングフレーム９４個のアミノ酸（８．６２Ｋｄ）をコードしている。プライマー伸長実験から、２つのプライマー伸長産物が同定されたが、この２つは一個のヌクレオチドによって分離されていた（地図上で、推定ＡＴＧ翻訳開始コドンの上流の位置７６及び７８）。これらのプライマー伸長産物は、花序のＲＮＡを用た時にのみ（葉のＲＮＡでなく）同定された。第一の推定転写開始部位の３３塩基上流に、ボックス配列ＴＡＴＡが存在する。５’−未翻訳配列はｐｏｌｙ（ｄＡ）領域を１つ有するが、これは、比較的高いデオキシアデニレート含量（４４．９％、７８分の３５）のリーダー配列に寄与している。ポリアデニル化信号配列（ＡＡＴＡＡＡ）は推定翻訳停止コドンの３７塩基下流に存在し、３’−未翻訳領域の長さは２０８塩基長と予想された。ＢＬＡＳＴネットワークサービスを利用してＮＣＢＩによって行った既存データベースの調査の結果、この遺伝子のコード領域と他の遺伝子群のコード領域の間には、塩基配列についても推定アミノ酸配列についても、明確な類似性は認められなかった。サザン分析の結果、ＲＴＳ２遺伝子は品種ＩＲ５４中に単コピー遺伝子として存在し、また、次の各品種のイネにおいては２コピー遺伝子として存在することが示唆された：インディカ種ＩＲ５２及びＩＲ５７；２種のジャポニカ種（カルロース及びミルヤング１５号）；インディカ×ジャポニカ種一種（ミルヤング２３号）。但し、タバコには何らのコピーも検出されなかった（ｃｖ．ウイスコンシン）。実施例３メイズ（トウモロコシ）細胞における組替えＦＬＰ／ＦＲＴ系イーストとＣｒｅ／ｌｏｘ系バクテリオファージＰ１は、高等真核生物の遺伝学的研究に用いるための主要な候補である。それらは単純な２成分組替えシステム（リコンビナーゼとその標的部位）を体現しており、組込み組替活性と切出し組替活性が区別されていない。Ｃｒｅリコンビナーゼを用いることによって、植物細胞またはマウス細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた遺伝子を成功裏に活性化若しくは不活化することができた。Ｃｒｅ／ｌｏｘ系で仲介された種子特異性の遺伝子活性化もまた、トランスジェニック・タバコにおいて確認された。以下の実験は、ＦＬＰ／ＦＲＴ系イーストの部位特異的組替えシステムによってゲノム組替えが誘発されるか否かをメイズ細胞において調べたものである。材料と方法プラスミドの構築及び形質転換手続ｐＵｂｉＦＬＰベクターの構築については、米国特許第５５２７６９５号に記載されており、その開示を本明細書の一部を構成するものとしてここに明示的に援用する。完全長の修飾ＦＲＴ部位を境界とするｎｅｏ遺伝子とプロモーターの無いｇｕｓＡ遺伝子（組替えマーカー）とを有するベクターｐＵＦＮｅｏＦｍｇを構築した。この構築に当たっては、ｐＵＦＲＴＧを用い、ｇｕｓＡコード配列（ＳｍａＩ−ＳａｃＩフラグメント）をｎｅｏコード配列（ｐＴＯ７７のＢａｍＨＩフラグメント）で置換してｐＵＦＲＴＮｅｏベクターを得た。プロモーターの無いｇｕｓＡ遺伝子を含有するｐＵ２ＦＲＴｍＧのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント、メイズＵｂｉ−１遺伝子の第一のイントロン、及び修飾ＦＲＴ部位を、ｐＵＦＲＴＮｅｏベクターのＥｃｏＲＩ部位に末端を平滑化して連続的に連結し、ｐＵＦＮｅｏＦｍＧを形成した。メイズＡ１８８ｘＢＭＳプロトプラストの単離、形質転換、培養、及び選択に用いた手続の詳細は、当業者には良く知られており、メイズ・ハンドブック（フリーリング及びワルボット編、スプリンガー−バーラグ、ニューヨーク、６０３ −６０９頁）に詳述されている。即ち、１ｍｌの形質転換培地［１００ｍＭＭＥＳ（ｐＨ５．５）、０．２Ｍマンニトール、８０ｍＭ塩化カルシウム］に加えたプロトプラスト（１×１０⁷個）を、５０μｌのプラスミドＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）及び１ｍｌの５０％ＰＥＧ含有Ｆ−溶液（ＰＥＧの分子量：８０００、シグマ・ケミカルＣｏ．、ミズーリ州セントルイス）と混合した。室温で３０分インキュベート後、ＰＥＧ希釈、及びプロトプラスト培地中でのプロトプラスト洗浄を行い、形質転換されたプロトプラスト（０．２ｍｌのプロトプラスト懸濁液、１ｍｌ中生存可能なプロトプラスト数は１×１０⁶個）を支持細胞を覆うミリポアフィルター（ポアサイズ：０．８ｇ）にプレーティングした。１週間後、ミリポアフィルターを１００μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシン含有の新鮮支持細胞プレートに移し、トランスジェニックカルスを選択した。さらに１週間後、２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に１００μｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを補充したムラシゲ−スクーグ培地に微小カルスを移し、更なる選択に付した。サザンブロット分析、ＰＣＲ、及びＤＮＡ配列決定５ｍｌのＤＮＡ抽出バッファー中で約５００ｍｇのカルス組織を磨砕することによって、ゲノムＤＮＡをカルス組織から単離した。６０℃で１５分間インキュベート後、当量のフェノールを加え、ホモジネートを遠心分離に付して水性層及び有機層に分離させた。当量のイソプロパノールを添加して水性層からＤＮＡを沈殿させ、遠心分離後、ＤＮＡ沈殿物（ペレット）をＴＥバッファーに溶解した。ＣｓＣｌ濃度勾配遠心分離を段階を踏んで順次行った。ゲノムＤＮＡ（５μｇ）を消化分解し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動を行った。ハイボンド− Ｎメンブラン（アマーシャム社、イリノイ州アーリントンハイツ）への真空移動、紫外線によるメンブラン照射、及び放射活性ｇｕｓＡコード配列プローブへのハイブリダイゼーションを用いて、標準法によってサザンブロット分析を行った。組替え産物のＰＣＲによる検出にあたっては、ユビキチンプロモーター（５’ −ＣＣＣＣＡＡＣＣＴＣＧＴＧＴＴＧ−３’、配列番号３）の３’末端とｇｕｓＡコード配列（５’−ＣＧＣＧＡＴＣＣＡＧＡＣＴＧＡＡＴＧＣ−３’、配列番号４）とに対応する各プライマーを用いた。増幅されたフラグメントの長さは、精製物及び組替え反応における基質のそれぞれについて１．２ｋｂ及び２．８ｋｂとなる。１００ｍｇ〜２００ｍｇのＤＮＡを、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１ｎＭの各プライマー、及び１．２５ユニットの未変性(native)ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・エルマー社、コネチカット州ノーフォーク）を含有するＰＣＲバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓバッファー、ｐＨ８．４、５０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ゼラチン、パーキン・エルマー社）中で、１サイクル３段階（９４℃×１分、６０℃×１分、７２℃×２分）の増幅手続３０サイクルに付した。ＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルを用いたゲル濾過によって分析した。ＤＮＡ配列決定に関しては、１．２ｋｂのＰＣＲ増幅済フラグメントをＴ４ＤＮＡキナーゼ（ニューイングランド・バイオラボ、マサチューセッツ州ベバリー）でリン酸化し、次いでｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）ベクター（プロメガ社、ウィスコンシン州マジソン）のＳｍａｌ部位に平滑化末端連結した。ＧＵＳ及びＮＰＴＩＩ活性アッセイトランスジェニックカルス試料を０.１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＧＵＳ抽出バッファー中で５−１０秒間超音波処理した。遠心分離（５分間、１６, ０００×ｇ）した後の上清を直接ＧＵＳ活性及びタンパク質アッセイに使用した。ＧＵＳ活性のアッセイは蛍光源基質（ＭＵＧ；４−メチル−ウンベリフェリルｂ−Ｄ−グルクロニド）及びパーキンエルマー社のＬＳ５０Ｂフルオロメーターを用いて行った。設定された時間間隔で反応を止め、各時点のデータから導いた線の傾きからＧＵＳ活性を計算し、タンパク質濃度に対して正規化した。ＮＰＴＩＩ活性のアッセイはドットブロット法により行った。カルス抽出物（ＧＵＳ活性のアッセイ用として調製）は、３３５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.１）、２１０ｍＭＭｇＣｌ₂、２ＭＮＨ₄Ｃｌ、０.００１ｍＭＡＴＰ、０.０３ｍＭネオマイシン、１０ｍＭＮａＦ及び１−２ｍＣｉ／ｍｌ³²Ｐ−ＡＴＰを含有する反応バッファー中でインキュベートした。反応液の試料をワットマンＰ８１紙ヘブロットした。ブロットを１０ＭＭリン酸バッファー（ｐＨ７.５）で洗浄し、乾燥し又もう一度同様のバッファーで８０℃で１０ −１５分間洗浄した。このＰ８１紙を１時間から数時間（曝露時間はＮＰＴＩＩ活性に依存）室温でＸ線フィルムに曝露した。組替えテストベクターのメイズゲノムＤＮＡへの組込み。ベクターｐＵＦＮｅｏＦｍＧをメイズ細胞におけるＦＬＰ活性のアッセイに用いた。このベクターは、安定な形質転換細胞を選択するための十分に機能的なｎｅｏ遺伝子及び後続する活性化がＦＬＰ媒介によるｎｅｏ遺伝子の除去を示唆するプロモーターを有さないｇｕｓＡ遺伝子を提供する。ｎｅｏ遺伝子の除去によりｕｂｉプロモーターをｇｕｓＡ遺伝子にリンクさせｇｕｓＡを発現させる。ｎｅｏ遺伝子にフランキングする二個のＦＲＴ部位は異なる。修飾ＦＲＴ部位（ＦＲＴｍ）は二個の対称要素しか有さない。後述のように、二個の構造的に異なるＦＲＴ部位は部位特異的組替え生成物と他のゲノムＤＮＡ修飾により発生する可能性のある人為的結果物とを明確に区別する手段を提供する。単純なベクター組み込みパターンとＧＵＳ活性のためにカナマイシン耐性トランスジェニックメイズカルスをスクリーニングし、ＮＰＴＩＩ＋ＧＵＳ表現型を確認する。ｇｕｓＡへハイブリダイズする一個の５.５ｋｂゲノムフラグメントを含有するカルス系＃５６を選択した。メイズ細胞へのＦＬＰリコンビナーゼの導入。＃５６系統の懸濁培養物を作成した。この系統のプロトプラストを、当モル量のｐＵｂｉＦＬＰ及びｐＨｙｇ（３５ＳＣａＭＶプロモーターに駆動されるｈｐｔ遺伝子含有するベクター）により再度形質転換した。１９０のハイグロマイシン耐性カルスを選択し、スクリーニングして活性化されたＧＵＳ発現をえた。大部分のハイグロマイシン耐性再形質転換カルスは０.０６３±０.００３ｎｍｏｌＭＵ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質レベル（バックグラウンドＧＵＳ活性は０. ０１６±０.００６ｎｍｏｌＭＵ／ｍｉｎ／ｍｇタンパク質）のＧＵＳ活性を示した一方で、５８個のカルスは０.１蛍光単位を超すＧＵＳ活性を示した。ｇｕｓＡ遺伝子発現の活性化はＦＬＰタンパク質の除去活性を当然示唆している。これらのカルス系はＦＬＰタンパク質の存在に対してスクリーニングされないので、約５０％のハイグロマイシン耐性カルスのみがＦＬＰを発現すると期待された。これは本システムの平均再形質転換効率である。ＧＵＳ陽性クローンの分析数種のＧＵＳ陽性クローンを選択してＦＬＰ媒介による除去プロセスを分析した。これらのクローンからのゲノムＤＮＡのＸｈｏＩ−ＳａｃＩを用いた消化において、ｇｕｓＡプローブへハイブリダイズする期待される３.２ｋｂフラグメント（除去により生成）が検出された。＃１２２（＃５６系統から誘導される）と呼ばれるカルス系はｇｕｓＡへハイブリダイズするわずか３.２ｋｂのバンドを示し、又ｎｅｏプローブにハイブリダイズするＤＮＡ配列を示さない。＃１２２系におけるＤＮＡ除去反応によりＮＰＴＩＩ−ＧＵＳ⁺表現型がもたらされた。＃１２２系のプロトプラストは更にｎｅｏ発現ベクターで再形質転換しＮＰＴＩＩ活性を再度得たが、これは＃１２２系におけるＮＰＴＩＩ活性の不在がこれらの細胞の生理的状態の変化に関連していないことを示唆している。ＰＣＲ分析で更に＃１２２系のゲノムＤＮＡにおける組替え生成物の存在を確認した。ＦＬＰ媒介組替え反応の確認。ｎｅｏコーディング配列がユビキチンのｎｅｏ反復介在配列５’及びｇｕｓＡコーディング配列を伴う自発的組替えプロセスによって除去される可能性がかなり低いながらも存在する。分子内染色体相同組替えにより、部位特異的組替え反応生成物に類似した生成物が得られる可能性がある。しかしながらこれが事実ならば、組替え生成物はユビキチン介在配列の前面に位置する元のＦＲＴ部位をが含有しているであろうし、ＦＬＰ触媒による部位特異的組替え反応の生成物はＦＲＴ部位とＦＲＴｍ部位との組替えから発生するキメラ的ＦＲＴを含有しているであろう。ＰＣＲ反応で増幅されたゲノムＤＮＡフラグメントは＃１２２系におけるｇｕｓＡ遺伝子の５’末翻訳配列からなるものであるが、このフラグメントをｐＧＥＭ７（ｚ）ベクターにサブクローンし、ＦＲＴ部位を含むその末端の配列を決定した。組み込まれたＦＲＴ部位の構造はまさしくキメラ性で、ＦＬＰ媒介部位特異的組替え反応から期待される構造そのものであった。選択可能マーカーの除去ＦＬＰ遺伝子の過渡的発現は、クロマチン構造に予め組み込まれたＦＲＴ部位を組替えるのに十分なＦＬＰタンパク質を提供するであろう。従って、ｐＵＦＮｅｏＦｍＧ安定形質転換系から単離されるプロトプラストをＦＬＰ発現ベクター（ｐＵｂｉＦＬＰ）によって再び形質転換し、ＧＵＳ活性のアッセイを再形質転換の一日後に行った。再形質転換プロトプラストからの抽出物のＧＵＳ活性の存在は、組替え反応が起きたことを示唆している。この観察は又、過渡的形質転換効率が十分高いとすれば再形質転換材料の更なる選択なしに組替え事象を単離できることも示唆している。これを調べるために選択手続を行わずにプロトプラストを生育させ、ミニカルスでＧＵＳ活性発現を分析した。ＧＵＳ発現のＦＬＰ媒介による活性化が３−４％の頻度で観察された。この実験におけるＧＵＳ発現の活性化はｎｅｏ遺伝子及びｇｕｓＡ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントの転位とも相関があった。検討実験結果は、イーストＦＬＰ／ＦＲＴ部位特異的組替え系を適用してメイズ細胞に効率良くゲノム組替えを誘導できることを示している。ＦＬＰ遺伝子が安定に組み込まれてメイズ細胞に発現した場合と、及びＦＬＰ遺伝子の発現が過渡的でしかもたらされない条件の場合の双方の場合にこのような誘導が起こる。ＦＬＰ発現ベクターによる再形質転換を利用して、メイズ細胞における部位特異的ゲノム組替え現象の分子的証拠を得た。四個のハイグロマイシン耐性カルスのうち一個が部位特異的組替えプロセスを暗示するＧＵＳ活性を示した。部位特異的組替えのＤＮＡ生成物はテストした全てのＧＵＳ陽性メイズ細胞で確認された。実施例４トランスジェニックアラビドプシス・サリアーナ（Arabidopsis thaliana）の他家受粉によってもたらされる、植物ゲノムＤＮＡフラグメントのＦＬＰ触媒による除去に関する試験ＦＬＰ／ＦＲＴ系によるモデル植物系（Arabidopsis thaliana）中のトランスジーン除去可能性を試験するために本実験を行った。実験結果は、効果的他家受粉によって二親植物の交配で発生するハイブリッド植物における部位特異的組替えが誘導されたことを示している。植物成長全体に影響を及ぼすことなくリコンビナーゼ活性を植物生体に構成的に発現でき、その発現レベルはリコンビナーゼ遺伝子が他家受粉技術によって他の植物に転移される時に１００％に近い除去効率を保証するのに十分高いものである。手続きベクター二種のｐＳＢ１１に基づくＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍバイナリーベクター（コマリ（Komari）ら、１９９６年）を合成し、キメラＦＬＰ遺伝子及びＦＲＴ含有構築物（それぞれ図５ａ及び図５ｂ参照）を用いてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓを形質転換した。ｂａｒ遺伝子を選択マーカー（ｐＳＢｂａｒＢ）として含有するＦＬＰ発現ベクターを合成するため、ｂａｒ遺伝子カセットを含むｐ３５ＳＢａｒＢ（ラトーレ（Rathore）ら、１９９３年）から得たＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＳＢ１１バイナリーベクターの各部位にクローニングした。この連結により、爾後のＦＬＰ遺伝子挿入のためのｐＳＢ１１のＨｉｎｄＩＩＩ部位又はＦＲＴ含有不活性ｇｕｓＡ遺伝子が保存された。植物試料ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＴｈａｌｉａｎａエコタイプコロンビア植物を、形質転換実験のために使用した。メトロミックス３６０混合土壌を加えたプラスチックポット（３１/４ × ３１/４インチ）に種子を蒔いた。４℃で２日間培養した後、植物を育成チャンバで２４℃、１６時間照光／８時間暗光周期、相対湿度６０〜８０％で生育させた。この条件で３週間後には、植物の真空浸潤形質転換手続き（ベクトルド（Bechtold）ら、１９９３年）の用意が完了した。形質転換形質転換の２日前に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株含有ＬＢ培地の１リットル培養液を接種した。培養液を回転下降させ、菌細胞を１リットルの浸潤培地（ＭＳ塩２.２ｇ、蔗糖５０ｇ、１ｘＢ５ビタミン、ＭＥＳ０.５ｇ、ベンジルアミノプリン０.０４４μＭ、シルウェットＬ-７７２００μｌ、ｐＨ５.７）の中で再懸濁させた。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物を細菌懸濁液中にサブマージし、真空度を４００ｍｍＨｇとした。植物を５分間この真空下に置いた。真空を急激に開放した後、浸潤された植物をプラスチックのラップで覆い、育成チャンバ内で生育させた。更に３週間後、種子を採取した。組込まれたｂａｒ遺伝子を含有するい一次形質転換体（Ｔ１植物）をプラスチックポットの中で発芽させ、０.５％のバスタ溶液を噴霧した。除草処理を生き延びた緑植物をサザン・ブロット分析に付し単純組込み事象を同定すると共に、トランスジェニック植物の後代におけるｂａｒ遺伝子発現の遺伝分析を行った。ＤＮＡ及びＲＮＡ分析１〜２枚の葉（新鮮組織湿重量約２００ｍｍｇ）から得たゲノムＤＮＡ調製物についてサザンブロット分析を行った。組織を液体窒素で粉砕し、緩衝液ＡＴＬ３６０μｌ（QIAGEN Inc.、カリフォルニア州キャッツワース）中で再懸濁させた。これに続くＤＮＡ単離手続きのステップは、ＱＩＡａｍｐ組織キットに説明されているとおりである。ゲノムＤＮＡ２５μｇを、ＸｈｏＩ、ＡｐａＩ及びＳａｃＩ制限酵素を用いてそれぞれ標準的な分子生物学的技術によって消化し、得られたフラグメントをアガロースゲル上で分離し、ブロッティングし、ｇｕｓＡ又はＦＬＰプローブでハイブリダイズした。前記プローブは、ｇｕｓＡ及びＦＬＰ遺伝子の各コード配列を含んでいた。ゲノムに組込まれたＦＬＰコード配列を含み陽性として同定されたトランスジェニック植物の葉組織から得た全ＤＮＡを、ＦＬＰｍＲＮＡ蓄積の評価のため単離した（ＲＮｅａｓｙ植物全ＲＮＡキット、QIAGEN Inc.、カリフォルニア州キャッツワース）。全ＲＮＡ１０μｇをノーザンブロット分析に付し、アガロースゲル上で未変性条件下（７.５％ホルムアルデヒド）で分画した。他花受粉雄ずいの高さが雌ずいの約半分に達した時に、がく片及び花弁で覆われた雌ずいを含む花を授粉用に選択し、その花を花粉ふるいによらず緑葯を用いて手で受粉した。ＦＬＰ形質転換植物を花粉源として使用し、花の授粉を手で行った。同一の花序上の全ての下部長角を除去した。授粉３週間後に、種子を採集し雑種後代の苗を育成した。ＧＵＳ活性のための染色交配授粉実験で得られた後代の苗におけるＧＵＳ活性を、Jefferson PlantMol Biol Rep 5:387-405（１９８７年）に記載されたように、５−ブロモ −４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）１ｍＭを用いてアッセイした。全ての苗を、Ｘ−ｇｌｕｃ含有反応バッファ１００μｌの中に入れ、３７℃で一晩培養した。写真撮影に先立ち、苗の汚れを７０％エタノールの中で除いた。結果の概要一次形質転換体の内、１１個をＦＬＰ発現植物として、１３個をＦＲＴ発現植物としてそれぞれ選択した。バスタ噴霧による選別を生き延びた植物を自家受粉し、同型接合のトランスジェニックＦＬＰ発現植物及び同型接合のトランスジェニックＦＲＴ発現植物を得た。ほとんどのトランスジェニック植物は、自家受粉後代におけるバスタ耐性に関しメンデルの分離率（３：１）を示し、Ｔ−ＤＮＡセグメントの単一遺伝子座組込みが我々の形質転換システムにおいて頻発することを示唆した。バスタ耐性を有する植物の一つのＴ２世代の自家受粉により、バスタ耐性に関して分離しないＴ３植物の個体群を生産され、このことが同型接合のＴ３植物が得られたことを示唆した。同定された同型接合のＴ３植物から単離されたゲノムＤＮＡに関するサザンブロット分析により、単純ベクター組み込みパターン及び単一遺伝子の組み込みが可能であることが証明された。従って、単一のＦＬＰ遺伝子組み込みによってＦＬＰ同型接合植物を選択した。得られた植物を他家受粉し、後代の苗におけるゲノム除去効率を試験した。ＦＬＰタンパクで触媒されたＦＲＰ−フランキングＤＮＡセグメントの除去を、後代におけるｇｕｓＡ発現の活性を利用してモニターした。ｎｅｏ遺伝子の除去はｕｂｉプロモーターを当該遺伝子と作動的にリンクさせる（図５ａ及び５ｂ参照）。これは関連の研究において報告されている部位特異的組替えタンパクの活性の試験に利用できる、便利で信頼できるモニターシステムであった。ＦＬＰとＦＲＰ−含有の親の間の交配から得られた後代の苗全部はＧＵＳ活性を示し、ゲノム除去がｇｕｓＡ遺伝子の活性化につながることを証明した。これはＸ−ｇｌｕｃ基質の加水分解の結果植物組織中に青い色が生じることによって示された。対照的に、自己増殖させた親Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の後代においては、ＧＵＳ陰性の苗のみが観察された。結論この報告に記載された観察は、植物組織において発現されたＦＬＰリコンビナーゼがゲノムＤＮＡに組み込まれたＦＲＴ部位を確実に見出し、それらの間に位置するＤＮＡフラグメントの切断除去を触媒することを明確に示している。ＦＲＴ部位がゲノムの単一遺伝子座に組み込まれた時、後代におけるＦＬＰリコンビナーゼ媒介による除去率は１００％にも達した。加えて、これらの結果は、植物にリコンビナーゼ活性を導入することで一対の同方向反復組替え配列でフランキングされた配列を除去するにあたっては、他家受粉が効果的な方法であることを示している。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年７月２日【補正内容】明細書ハイブリッド植物の生産方法政府権利本発明は米政府農業部門許可 91-37301-6375 号支援で成され、米政府は所定の権利を有する。発明の技術分野本発明はハイブリッド植物の生産方法に関する。更に詳細には、本発明は新規組替え発現ベクターを用いて、ハイブリッド植物の生産を容易にせしめる新規雄性不稔性／回復システムを包含するトランスジェニック植物を生産することに関する。本システムは部位特異的リコンビナーゼを用いて雄性不稔性を除去するものである。背景ハイブリッド植物は収量と成長力とに関して近交系より優れることが証明されている。ハイブリッド種子の大規模生産が興味をそそられる理由は、多くの作物においては同一苗（単一花中又は別々の花中に）中に、雌雄両生殖器官（雌ずい及び雄ずい）が存在するためである。この配置は、高度の自家受粉を引き起こし、また近交系間の大規模的交配の達成を困難にしている。育種家はハイブリッド種子の生産において確実に異系交配が起きるようにするために、手作業や機械で親系統個体から雄ずいを除去したり、花粉発生を途絶する雄性不稔性突然変異を利用したりしてきた。手作業による除雄は、小さな両性花を有する植物にとっては集約的で非現実的な労働である。イネ、トウモロコシ、小麦等の重要作物は自家受粉性植物であるので、Ｆ１ハイブリッドの生産を補助する受粉制御システムを開発する必要がある。現在得られているすべてのシステムは、親植物に雄性不稔性を導入し、さらに稔性回復遺伝子を導入して交配受粉により稔性ハイブリッド植物を生産することに基づいている。植物の開花における雄性生殖過程は葯で行われる。この器官は数種の組織と細胞型とから構成され、精子細胞を含有する花粉粒生産に関与している。特殊化した葯の組織がタペータムであり、花粉生成に重要な役割を果たしている。タペー請求の範囲１．配列番号１に記載の配列を含む実質的に純粋な核酸配列。２．配列番号２に記載の配列を含む実質的に純粋な核酸配列。３．配列番号２に記載の配列の連続する２０塩基対部分と同一の２０塩基対ヌクレオチド部分を含むポリヌクレオチド配列。４．配列番号２のタペータム特異性調節要素と、コアプロモーターと、構造遺伝子とを含む植物発現ベクターであって、構造遺伝子の発現が、タペータム特異性調節要素によって調節されるものである、植物発現ベクター。５．請求項４に記載の発現ベクターであって、構造遺伝子がタペータム細胞の機能を破壊する産物をコードするものである、発現ベクター。６．請求項５に記載の発現ベクターであって、構造遺伝子をコードする核酸配列が同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされたものである、発現ベクター。７．さらに、前記同方向に反復された部位特異的組替え配列と相互作用する部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を有すると共に、遺伝子の発現が誘導プロモーターによって制御されるものである、請求項６に記載の発現ベクター。８．部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子が、前記同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされたものである、請求項７に記載の発現ベクター。９．さらに、真核性の選択可能マーカーをコードする遺伝子を有すると共に、前記真核性の選択可能マーカー遺伝子が前記同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされたものである、請求項６に記載の発現ベクター。１０．さらに、細菌宿主中において発現ベクターの複製を可能ならしめる核酸配列と、細菌性の選択可能マーカーをコードする遺伝子とを含むものである、請求項６に記載の発現ベクター。１１．基本的に、請求項４に記載のＤＮＡ配列をインビトロで植物細胞内に導入して生産した植物、種子若しくは植物細胞からなる植物体またはその後代。１２．多機能性ＤＮＡ配列及び該多機能性ＤＮＡ配列にフランキングする同方向に反復された一対の第一の部位特異的リコンビナーゼ部位含む植物発現ベクターであって、前記多機能性ＤＮＡ配列は、自滅遺伝子と、回復遺伝子と、前記回復遺伝子をコードするＤＮＡ配列にフランキングする、同方向に反復された一対の第二の部位特異的組替え部位と、前記同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列と相互作用する第二の部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子とを含み、前記自滅遺伝子及び前記回復遺伝子の発現は葯特異性調節要素によって制御され、前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の発現は誘導プロモーターによって制御されるものである、植物発現ベクター。１３．基本的に、ＤＮＡ構築物をインビトロで植物細胞内に導入して生産した植物、種子若しくは植物細胞からなる植物体またはその後代であって、前記ＤＮＡ構築物が第一の部位特異的組替え配列の同方向反復によってフランキングされた多機能性ＤＮＡ配列を含み、前記多機能ＤＮＡ配列が自滅遺伝子及び回復遺伝子を含み、前記自滅遺伝子及び前記回復遺伝子が葯特異性プロモーターに各々作動的に連結され、かつ、前記回復遺伝子が第二の部位特異的組替え配列の同方向反復配列によってフランキングされるものである、植物体またはその後代。１４．請求項１３に記載の植物体であって、さらに前記多機能ＤＮＡ配列が第二の部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含み、かつ、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の発現は誘導プロモーターによって制御されるものである植物体。１５．請求項１３に記載のＤＮＡ構築物を植物細胞に導入して雄性稔性トランスジェニック植物を生産する段階と、前記雄性稔性トランスジェニック植物または前記雄性稔性トランスジェニック植物の後代を第二の部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を有する植物と交配することにより雄性不稔性植物を生産する段階と及び、前記雄性不稔性植物または前記雄性不稔性植物の後代を第一の部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を有する植物と交配することにより雄性稔性を回復する段階とを含むものである、稔性ハイブリッド植物の生産方法。１６．請求項１４に記載のＤＮＡ構築物を植物細胞に導入して雄性稔性トランスジェニック植物を生産する段階と、前記雄性稔性トランスジェニック植物または前記雄性稔性トランスジェニック植物の後代に第二の部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の発現を誘導することにより雄性不稔性植物を生産する段階と、前記雄性不稔性植物または前記雄性不稔性植物の後代を第一の部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を有する植物と交配することにより雄性稔性を回復する段階を含むものである、稔性ハイブリッド植物の生産方法。１７．雄性稔性ハイブリッド植物を作出するためのシステムであって、当該システムは、不稔性誘導遺伝子に作動的に連結された葯特異性プロモーターを含むＤＮＡ配列を有する雄性不稔性植物体と、ＦＬＰリコンビナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ配列を有する稔性回復植物体とを含み、前記葯特異性プロモーターと不稔性誘導遺伝子は同方向に反復された一対のＦＲＴ組替え配列によってフランキングされたものであり、かつ、雄性不稔性植物体を稔性回復植物体と他家受粉させて雄性稔性ハイブリッド植物を作出する、雄性稔性ハイブリッド植物作出システム。１８．稔性回復植物体のＦＬＰリコンビナーゼ活性の発現が誘導プロモーターの制御下にある、請求項１７に記載のシステム。１９．雄性不稔性植物体の葯特異性プロモーターが配列番号２に記載の配列の連続する２０塩基対部分と同一の２０塩基対ヌクレオチド部分を含むものである、請求項１７に記載のシステム。２０．請求項１７または１８に記載の稔性回復植物体を請求項１７または１９に記載の雄性不稔性植物体と交配することにより生産される雑種植物またはその後代。２１．自滅遺伝子に作動的に連結された葯特異性プロモーターを含むＤＮＡ配列で形質転換された植物細胞を含む植物体またはその後代であって、前記自滅遺伝子をコードする核酸配列は同方向に反復された一対のＦＲＴ組替え配列によってフランキングされるものである、植物体またはその後代。２２．基本的に、インビトロで植物細胞にＤＮＡ配列を導入して生産された植物若しくは植物細胞種子からなる植物体またはその後代であって、前記ＤＮＡ配列は配列番号２のタペータム特異性調節要素と、コアプロモーターと、構造遺伝子とを含み、前記構造遺伝子が同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされ、かつ、前記構造遺伝子の発現が、前記タペータム特異性調節要素によって調節されるものである、植物体またはその後代。２３．基本的に、インビトロで植物細胞にＤＮＡ配列を導入して生産された植物若しくは植物細胞種子からなる植物体またはその後代であって、前記ＤＮＡ配列は配列番号２のタペータム特異性調節要素と、コアプロモーターと、自滅遺伝子及び真核性の選択可能マーカーをコードする遺伝子とを含み、前記自滅遺伝子は同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされ、かつ、前記自滅遺伝子の発現が、前記タペータム特異性調節要素によって調節されるものである、植物体またはその後代。２４．さらに、前記ＤＮＡ配列が前記同方向に反復された部位特異的組替え配列と相互作用する部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、かつ、遺伝子の発現は誘導プロモーターによって制御されるものである、請求項２３に記載の植物体。２５．前記部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子が前記一対の同方向に反復された部位特異的組替え配列によってフランキングされるものである、請求項２４に記載の植物体。【手続補正書】【提出日】１９９８年４月１６日【補正内容】（１）請求の範囲を別紙の通り訂正する。（２）第１ｃ図及び第１ｄ図を別紙の通り（参照番号の誤記を）訂正する。請求の範囲１．配列番号１に記載の配列を含む実質的に純粋な核酸配列。２．配列番号２に記載の配列を含む実質的に純粋な核酸配列。３．配列番号２に記載の配列の連続する２０塩基対部分と同一の２０塩基対ヌクレオチド部分を含むポリヌクレオチド配列。４．配列番号２のタペータム特異性調節要素と、コアプロモーターと、構造遺伝子とを含む植物発現ベクターであって、構造遺伝子の発現が、タペータム特異性調節要素によって調節されるものである、植物発現ベクター。５．請求項４に記載の発現ベクターであって、構造遺伝子がタペータム細胞の機能を破壊する産物をコードするものである、発現ベクター。６．請求項５に記載の発現ベクターであって、構造遺伝子をコードする核酸配列が同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされたものである、発現ベクター。７．さらに、前記同方向に反復された部位特異的組替え配列と相互作用する部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を有すると共に、遺伝子の発現が誘導プロモーターによって制御されるものである、請求項６に記載の発現ベクター。８．部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子が、前記同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされたものである、請求項７に記載の発現ベクター。９．さらに、真核性の選択可能マーカーをコードする遺伝子を有すると共に、前記真核性の選択可能マーカー遺伝子が前記同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされたものである、請求項６に記載の発現ベクター。１０．さらに、細菌宿主中において発現ベクターの複製を可能ならしめる核酸配列と、細菌性の選択可能マーカーをコードする遺伝子とを含むものである、請求項６に記載の発現ベクター。１１．基本的に、請求項４に記載のＤＮＡ配列をインビトロで植物細胞内に導入して生産した植物、種子若しくは植物細胞からなる植物体またはその後代。１２．多機能性ＤＮＡ配列及び該多機能性ＤＮＡ配列にフランキングする同方向に反復された一対の第一の部位特異的リコンビナーゼ部位含む植物発現ベクターであって、前記多機能性ＤＮＡ配列は、自滅遺伝子と、回復遺伝子と、前記回復遺伝子をコードするＤＮＡ配列にフランキングする、同方向に反復された一対の第二の部位特異的組替え部位と、前記同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列と相互作用する第二の部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子とを含み、前記自滅遺伝子及び前記回復遺伝子の発現は葯特異性調節要素によって制御され、前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の発現は誘導プロモーターによって制御されるものである、植物発現ベクター。１３．基本的に、ＤＮＡ構築物をインビトロで植物細胞内に導入して生産した植物、種子若しくは植物細胞からなる植物体またはその後代であって、前記ＤＮＡ構築物が第一の部位特異的組替え配列の同方向反復によってフランキングされた多機能性ＤＮＡ配列を含み、前記多機能ＤＮＡ配列が自滅遺伝子及び回復遺伝子を含み、前記自滅遺伝子及び前記回復遺伝子が葯特異性プロモーターに各々作動的に連結され、かつ、前記回復遺伝子が第二の部位特異的組替え配列の同方向反復配列によってフランキングされるものである、植物体またはその後代。１４．請求項１３に記載の植物体であって、さらに前記多機能ＤＮＡ配列が第二の部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含み、かつ、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の発現は誘導プロモーターによって制御されるものである植物体。１５．同方向に反復された第一の部位特異的組替え配列によってフランキングされた多機能ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を植物細胞に導入して雄性稔性トランスジェニック植物を生産する段階を含み、尚、前記多機能ＤＮＡ配列は自滅遺伝子と回復遺伝子を含み、前記自滅遺伝子と前記回復遺伝子は葯特異性プロモーターに各々作動的に連結され、かつ、前記回復遺伝子は同方向に反復された第二の部位特異的組替え配列によってフランキングされるものであり、更に、前記雄性稔性トランスジェニック植物または前記雄性稔性トランスジェニック植物の後代を第二の部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を有する植物と交配することにより雄性不稔性植物を生産する段階と、前記雄性不稔性植物または前記雄性不稔性植物の後代を第一の部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を有する植物と交配することにより雄性稔性を回復する段階とを含む、稔性ハイブリッド植物の生産方法。１６．同方向に反復された第一の部位特異的組替え配列によってフランキングされる多機能ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を植物細胞に導入して雄性稔性トランスジェニック植物を生産する段階を含み、尚、前記多機能ＤＮＡ配列は自滅遺伝子、第二の部位特異的リコンビナーゼ遺伝子及び回復遺伝子を含み、前記自滅遺伝子と前記回復遺伝子は葯特異性プロモーターに各々作動的に連結され、前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は誘導プロモーターに制御され、かつ、前記回復遺伝子は同方向に反復された第二の部位特異的組替え配列によってフランキングされるものであり、更に、前記雄性稔性トランスジェニック植物または前記雄性稔性トランスジェニック植物の後代に第二の部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の発現を誘導することにより雄性不稔性植物を生産する段階と、前記雄性不稔性植物または前記雄性不稔性植物の後代を第一の部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を有する植物と交配することにより雄性稔性を回復する段階とを含む、稔性ハイブリッド植物の生産方法。１７．雄性稔性ハイブリッド植物を作出するためのシステムであって、当該システムは、不稔性誘導遺伝子に作動的に連結された葯特異性プロモーターを含むＤＮＡ配列を有する雄性不稔性植物体と、ＦＬＰリコンビナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ配列を有する稔性回復植物体とを含み、前記葯特異性プロモーターと不稔性誘導遺伝子は同方向に反復された一対のＦＲＴ組替え配列によってフランキングされたものであり、かつ、雄性不稔性植物体を稔性回復植物体と他家受粉させて雄性稔性ハイブリッド植物を作出する、雄性稔性ハイブリッド植物作出システム。１８．稔性回復植物体のＦＬＰリコンビナーゼ活性の発現が誘導プロモーターの制御下にある、請求項１７に記載のシステム。１９．雄性不稔性植物体の葯特異性プロモーターが配列番号２に記載の配列の連続する２０塩基対部分と同一の２０塩基対ヌクレオチド部分を含むものである、請求項１７に記載のシステム。２０．請求項１７または１８に記載の稔性回復植物体を請求項１７または１９に記載の雄性不稔性植物体と交配することにより生産される雑種植物またはその後代。２１．自滅遺伝子に作動的に連結された葯特異性プロモーターを含むＤＮＡ配列で形質転換された植物細胞を含む植物体またはその後代であって、前記自滅遺伝子をコードする核酸配列は同方向に反復された一対のＦＲＴ組替え配列によってフランキングされるものである、植物体またはその後代。２２．基本的に、インビトロで植物細胞にＤＮＡ配列を導入して生産された植物若しくは植物細胞種子からなる植物体またはその後代であって、前記ＤＮＡ配列は配列番号２のタペータム特異性調節要素と、コアプロモーターと、構造遺伝子とを含み、前記構造遺伝子が同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされ、かつ、前記構造遺伝子の発現が、前記タペータム特異性調節要素によって調節されるものである、植物体またはその後代。２３．基本的に、インビトロで植物細胞にＤＮＡ配列を導入して生産された植物若しくは植物細胞種子からなる植物体またはその後代であって、前記ＤＮＡ配列は配列番号２のタペータム特異性調節要素と、コアプロモーターと、自滅遺伝子及び真核性の選択可能マーカーをコードする遺伝子とを含み、前記自滅遺伝子は同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされ、かつ、前記自滅遺伝子の発現が、前記タペータム特異性調節要素によって調節されるものである、植物体またはその後代。２４．さらに、前記ＤＮＡ配列が前記同方向に反復された部位特異的組替え配列と相互作用する部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、かつ、遺伝子の発現は誘導プロモーターによって制御されるものである、請求項２３に記載の植物体。２５．前記部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子が前記一対の同方向に反復された部位特異的組替え配列によってフランキングされるものである、請求項２４に記載の植物体。２６．自滅遺伝子と回復遺伝子とを含む植物表現ベクターであって、前記自滅遺伝子と前記回復遺伝子は共に葯特異性プロモーターに作動的に連結され、前記回復遺伝子をコードする核酸配列の少なくとも一部分およびそのプロモーターは同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされるものである、植物表現ベクター。２７．基本的に、インビトロで植物細胞に請求項２６に記載の表現ベクターを導入して生産された植物、種子若しくは植物細胞からなる植物体。２８．雄性稔性ハイブリッド植物を作出するためのシステムであって、当該システムは、自滅遺伝子と回復遺伝子とを含む自己稔性植物体を含み、尚、前記自滅遺伝子と前記回復遺伝子は共に一つの葯特異性プロモーターに作動的に連結し、前記回復遺伝子をコードする核酸配列の少なくとも一部分およびそのプロモーターは同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされるものであり、更に、前記部位特異的組替え配列と相互作用する部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含む雄性不稔性誘導植物体と、１つの回復遺伝子を含む稔性回復植物体とを含む、雄性稔性ハイブリッド植物作出システム。【図１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者リズニック，レゼック，エー. アメリカ合衆国・インディアナ州 47906・ウェストラファイエット・トレース−ファイブ 527 (72)発明者ヴィンセント，ジェフリーアメリカ合衆国・インディアナ州 47906・ウェストラファイエット・ノースシャウンシー 906 (72)発明者コノノウィック−ホッジズ，ハリナアメリカ合衆国・インディアナ州 47906・ウェストラファイエット・ウェスト 75 エヌ．6038 (72)発明者フク，エナムルアメリカ合衆国・インディアナ州 47906・ウェストラファイエット・エアポートロード 209−７ (72)発明者リー，ジャン−ヨン大韓民国・スウェオン 441−340・グーンドン・サムファンアパートメント 14− 1203

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号１に記載の配列を含む実質的に純粋な核酸配列。２．配列番号２に記載の配列を含む実質的に純粋な核酸配列。３．配列番号２のタペータム特異性調節要素と、コアプロモーターと、構造遺伝子とを含む植物発現ベクターであって、構造遺伝子の発現が、タペータム特異性調節要素によって調節されるものである、植物発現ベクター。４．請求項３に記載の発現ベクターであって、構造遺伝子がタペータム細胞の機能を破壊する産物をコードするものである、発現ベクター。５．請求項４に記載の発現ベクターであって、構造遺伝子をコードする核酸配列が同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされたものである、発現ベクター。６．さらに、前記同方向に反復された部位特異的組替え配列と相互作用する部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を有すると共に、遺伝子の発現が誘導プロモーターによって制御されるものである、請求項５に記載の発現ベクター。７．部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子が、前記同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされたものである、請求項６に記載の発現ベクター。８．さらに、真核性の選択可能マーカーをコードする遺伝子を有すると共に、前記真核性の選択可能マーカー遺伝子が前記同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされたものである、請求項５に記載の発現ベクター。９．さらに、細菌宿主中において発現ベクターの複製を可能ならしめる核酸配列と、細菌性の選択可能マーカーをコードする遺伝子とを含むものである、請求項５に記載の発現ベクター。１０．基本的に植物細胞と、請求項３に記載のＤＮＡ配列をインビトロで植物細胞内に導入して生産した種子若しくは植物とからなる植物体。１１．自滅遺伝子と、回復遺伝子と、前記回復遺伝子をコードするＤＮＡ配列にフランキングする、同方向に反復された一対の部位特異的リコンビナーゼ部位と、前記同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列と相互作用する部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子と、をコードするＤＮＡ配列を含む植物発現ベクターであって、前記自滅遺伝子と前記回復遺伝子の発現は葯異性調節要素によって制御されると共に、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の発現は誘導プロモーターによって制御されるものである、植物発現ベクター。１２．請求項１１に記載の発現ベクターであって、部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子が前記同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列にフランキングされたものである、請求項１１に記載の発現ベクター。１３．自滅遺伝子と、回復遺伝子と、前記不稔性転換遺伝子をコードするＤＮＡ配列にフランキングする一対の第一の部位特異的組替え部位と、前記同方向に反復された第一の部位特異的組替え配列と相互作用する第一の部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子と、多機能性ＤＮＡ配列にフランキングする同方向に反復された一対の第二の部位特異的リコンビナーゼ部位と、をコードする多機能性ＤＮＡ配列を含む植物発現ベクターであって、前記不稔性誘導遺伝子と前記不稔性反転遺伝子の発現は、葯特異性調節要素によって制御されると共に、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子の発現は誘導プロモーターによって制御されるものである、植物発現ベクター。１４．一対の第一の部位特異的リコンビナーゼ部位が同方向反復配列である、請求項１３に記載の発現ベクター。１５．雄性不稔性植物を生産するための植物発現ベクターであって、当該ベクターは、自滅遺伝子に作動的に連結された葯特異性プロモーターを有すると共に、前記葯特異性プロモーターと自滅遺伝子をコードする核酸配列の少なくとも一部分は、同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされたものである、雄性不稔性植物を生産するための植物発現ベクター。１６．基本的に植物細胞と、請求項１５に記載のＤＮＡ配列をインビトロで植物細胞内に導入して生産した種子若しくは植物とからなる植物体。１７．雄性稔性ハイブリッド植物を作出するためのシステムであって、当該システムは、不稔性誘導遺伝子に作動的に連結された葯特異性プロモーターを含むＤＮＡ配列を有する雄性不稔性植物体と、前記部位特異的組替え配列と相互作用する部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ配列を有する稔性回復植物体と、を含み、前記葯特異性プロモーターと不稔性誘導遺伝子は同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされたものであり、かつ、雄性不稔性植物体を稔性回復植物体と他家受粉させて雄性稔性ハイブリッド植物を作出する、雄性稔性ハイブリッド植物作出システム。１８．自滅遺伝子に作動的に連結された葯特異性プロモーターを含む多機能性ＤＮＡ配列を有する雄性不稔性植物に稔性を回復させる方法であって、自滅遺伝子は一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされており、かつ、当該方法は、雄性不稔性植物の細胞に部位特異性リコンビナーゼ活性を導入する段階を含むものである方法。１９．部位特異性リコンビナーゼ活性が、雄性不稔性植物と、部位特異性リコンビナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を有する植物とを交配させることによって導入されるものである、請求項１８に記載の方法。２０．前記多機能性ＤＮＡ配列が更に、誘導プロモーターに作動的に連結された部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含み、部位特異的リコンビナーゼ活性が誘導プロモーターを誘導することによって導入されるものである、請求項１８に記載の方法。２１．稔性を有するトランスジェニック植物を生産する方法であって、部位特異的組替え配列の同方向反復配列によってフランキングされた多機能性ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を植物細胞中に導入して雄性不稔性植物を生産する段階と、前記雄性不稔性植物又は前記雄性不稔性植物の後代を稔性回復植物と交配する段階とを含み、前記多機能性ＤＮＡ配列は自滅遺伝子を含み、前記稔性回復植物は部位特異性リコンビナーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ配列を有し、前記部位特異性リコンビナーゼは前記部位特異的組替え配列と相互作用して、雄性不稔性植物と稔性回復植物とを交配して作出した後代の植物から自滅遺伝子を除去するものである、稔性を有するトランスジェニック植物を生産する方法。２２．自滅遺伝子に作動的に連結されたタペータム特異性プロモーターを含有する稔性誘導ＤＮＡ配列で形質転換された植物細胞を含む植物体であって、自滅遺伝子をコードする核酸配列は同方向に反復された一対の部位特異的組替え配列によってフランキングされたものである植物体。２３．基本的にインビトロで植物細胞にＤＮＡ配列を導入して生産される植物細胞種子または植物からなる植物体であって、前記ＤＮＡ配列は配列番号２のタペータム特異性調節要素と、コアプロモーターと、構造遺伝子とを含み、構造遺伝子の発現が、タペータム特異性調節要素によって調節されるものである、植物体。