ES2893454T3 - Crecimiento controlado de microorganismo - Google Patents

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Abstract

Una primera célula microbiana que comprende un ácido nucleico que codifica una bacteriocina secretada que controla el crecimiento de una segunda célula microbiana y un ácido nucleico que codifica un modulador de inmunidad que confiere resistencia a dicha bacteriocina secretada, en donde dicha primera célula microbiana se ha diseñado por ingeniería genética para permitir que la expresión o actividad de dicho modulador de inmunidad que confiere resistencia a dicha bacteriocina disminuya, en donde la bacteriocina secretada se produce por la maquinaria de traducción de la primera célula microbiana, y en donde cuando la primera célula microbiana no es deseada, la expresión o actividad de la primera célula microbiana del modulador de inmunidad se reduce, y la primera célula microbiana y clones de esta secretan la bacteriocina, descartando de esta manera selectivamente la primera célula microbiana, en donde opcionalmente dicha segunda célula microbiana es de la misma especie o cepa que la primera célula microbiana, o es de una cepa, especie, o género diferente a dicha primera célula microbiana, y en donde opcionalmente dicha bacteriocina comprende una bacteriocina de origen natural o una bacteriocina sintética.

Description

DESCRIPCIÓN
Crecimiento controlado de microorganismo
Solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional US- 61/867.510, presentada el 19 de agosto de 2013.
Antecedentes
Los seres humanos han usado organismos microbianos para generar productos desde el comienzo de la historia humana, por ejemplo, en el procesamiento de alimentos tales como queso, cerveza y vino. Durante siglos, se han realizado estudios y solicitado cambios de escala sobre los procesos mediados por organismos microbianos, frecuentemente, mediante el control de las condiciones de fermentación o la identificación de las características fenotípicas de los organismos microbianos.
Actualmente, muchos productos se producen mediante el uso de un proceso en el que participan organismos microbianos. En laboratorios, y en algunos procesos de fabricación farmacéutica, los organismos microbianos, incluidos los organismos microbianos diseñados por ingeniería genética, pueden cultivarse en ambientes estériles controlados. Por otra parte, las materias primas usadas para varios procesos industriales en la que participan microorganismos no son estériles y pueden contener una variedad de cepas y especies de microorganismos. Como tal, los microorganismos diseñados por ingeniería genética para procesos de laboratorio y farmacéuticos no son necesariamente adecuados para procesos, tales como procesos industriales, que implican el uso de materias primas o que se exponen a otros microorganismos en el ambiente que podrían contaminar potencialmente el cultivo y que pueden implicar además un cambio en las condiciones ambientales. En la presente descripción se describen microorganismos diseñados por ingeniería genética para controlar su propio crecimiento y el crecimiento de otros microorganismos y/o para responder a cambios en su ambiente. Tales microorganismos son adecuados para crecer en materias primas no estériles, controladas menos rígidamente. Tales microorganismos pueden ser útiles para la producción sólida y uniforme de un producto deseado a través de una variedad de materias primas y ambientes diferentes.
La patente US-6.528.285, otorgada a Biet et al., describe un plásmido que tiene un modo de replicación que no es del tipo RCR y es capaz de transferirse de forma estable a bacterias de ácido láctico huésped.
La publicación PCT WO 99/02555, otorgada a Stiles, et al. describe cepas de Leuconostoc gelidum capaces de proteger productos alimenticios y métodos para usar L. gelidum para la conservación de productos alimenticios y sus propiedades sensoriales.
McAuliffe et al., Microbiology 2000 146: págs. 129-138, describe la identificación de Itnl como un gen que confiere inmunidad al lantibiótico lacticina de dos componentes 3147.
Pag et al., Applied and Environmental Microbiology 1999, págs. 591-598, describe el análisis molecular de la expresión del fenotipo de la inmunidad al lantibiótico pep5.
Sector de la técnica
Las realizaciones de la presente descripción se refieren generalmente al control del crecimiento de microorganismos como se expone en las reivindicaciones 1 -11. Más particularmente, algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas se refieren a microorganismos diseñados por ingeniería genética para regular el crecimiento en respuesta a otros microorganismos y/o condiciones del ambiente de cultivo, y a métodos para elaborar y usar tales microorganismos modificados por ingeniería genética.
Resumen
La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.
Una realización descrita según las reivindicaciones 1-8 adjuntas incluye una primera célula microbiana que comprende un ácido nucleico que codifica una bacteriocina secretada que controla el crecimiento de una segunda célula microbiana, y se proporciona un ácido nucleico que confiere resistencia a la bacteriocina secretada, en donde la primera célula microbiana se ha diseñado por ingeniería genética para permitir que se regule la expresión o la actividad del ácido nucleico que confiere resistencia a la bacteriocina. Según algunos aspectos de esta realización según las reivindicaciones adjuntas, la expresión o actividad del ácido nucleico que confiere resistencia a la bacteriocina se reduce a un nivel que provoca que la bacteriocina neutralice la primera célula microbiana si la primera célula microbiana se segrega de un ambiente de crecimiento deseado. Según algunos aspectos de esta realización según las reivindicaciones adjuntas, la primera célula microbiana se ha diseñado por ingeniería genética para elaborar un producto deseado. Según algunos aspectos de esta realización según las reivindicaciones adjuntas, la bacteriocina secretada se ha seleccionado además para mantener al menos una condición dentro de un cultivo en el que la primera célula microbiana produce el producto deseado. Según algunos aspectos de esta realización según las reivindicaciones adjuntas, el cultivo comprende al menos un organismo microbiano invasor. Según algunos aspectos de esta realización según las reivindicaciones adjuntas, la al menos una condición del cultivo comprende controlar el crecimiento de la segunda célula microbiana, en donde la segunda célula microbiana es un contaminante común del cultivo. Según algunos aspectos de esta realización según las reivindicaciones adjuntas, la segunda célula microbiana es una cepa, especie o género diferente de la primera célula microbiana. Según algunos aspectos de esta realización según las reivindicaciones adjuntas, la célula microbiana comprende, además, un ácido nucleico que codifica una segunda bacteriocina secretada que controla el crecimiento de una tercera célula microbiana y un ácido nucleico que confiere resistencia a la segunda bacteriocina secretada, y además la primera célula microbiana se ha diseñado por ingeniería genética para permitir que se regule la expresión o actividad del ácido nucleico que confiere resistencia a la bacteriocina. Según algunos aspectos de esta realización según las reivindicaciones adjuntas, la bacteriocina mata a la segunda célula microbiana. Según algunos aspectos de esta realización, la bacteriocina reduce la velocidad de crecimiento de la segunda célula microbiana. Según algunos aspectos de esta realización, la bacteriocina detiene el crecimiento de la segunda célula microbiana. Según algunos aspectos de esta realización, la transcripción del ácido nucleico que confiere resistencia a la bacteriocina es controlada por un promotor regulable. Según algunos aspectos de esta realización, la actividad de un polipéptido codificado por el ácido nucleico que confiere resistencia a la bacteriocina es regulable. Según algunos aspectos de esta realización, el ácido nucleico que codifica la bacteriocina se encuentra en un cromosoma de la célula microbiana. Según algunos aspectos de esta realización, el ácido nucleico que confiere resistencia a la bacteriocina se encuentra en un plásmido. Según algunos aspectos de esta realización, el ácido nucleico que codifica la bacteriocina se encuentra en un cromosoma de la célula microbiana y el ácido nucleico que confiere resistencia a la bacteriocina se encuentra en un plásmido. Según algunos aspectos de esta realización, el ácido nucleico que codifica la bacteriocina y el ácido nucleico que confiere resistencia a la bacteriocina se encuentran en uno o más plásmidos. Según algunos aspectos de esta realización, la primera célula microbiana se selecciona del grupo que consiste en bacterias, levaduras y algas, por ejemplo, microalgas fotosintéticas.
Otra realización descrita según las reivindicaciones 10-11 adjuntas incluye un método para controlar el crecimiento de una segunda célula microbiana en un medio de cultivo, en el que el método incluye que comprende cultivar una primera célula microbiana según las reivindicaciones 1-9 en un medio de cultivo que comprende la segunda célula microbiana bajo condiciones en las cuales la primera célula microbiana produce una bacteriocina a un nivel suficiente para controlar el crecimiento de la segunda célula microbiana. Según algunos aspectos de esta realización, el cultivo se mantiene continuamente durante al menos 30 días, por ejemplo, al menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500 días. Según algunos aspectos de esta realización, el método incluye además detectar al menos un cambio en el medio de cultivo, comprendiendo el cambio una presencia o aumento en los niveles o la actividad de una tercera célula microbiana, y rediseñar por ingeniería genética la primera célula microbiana en respuesta al cambio para producir una segunda bacteriocina a un nivel suficiente para controlar el crecimiento de la tercera célula microbiana.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama de flujo que representa opciones para configurar una célula microbiana para controlar el crecimiento de una segunda célula microbiana según algunas de las realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas.
La Figura 2A es un diagrama esquemático que ilustra una primera célula microbiana que controla el crecimiento de otras células microbianas según algunas de las realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas. La Figura 2B es un diagrama esquemático que ilustra el control del crecimiento de una primera célula microbiana cuando la primera célula microbiana ya no está en un ambiente de crecimiento deseado según algunas de las realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas.
La Figura 3 es un diagrama esquemático que ilustra una primera célula microbiana que controla el crecimiento de una segunda célula microbiana y que neutraliza una célula invasora en un ambiente deseado según algunas de las realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas.
La Figura 4 es un diagrama esquemático que ilustra una primera célula microbiana que neutraliza una primera célula invasora con una primera bacteriocina y segundas células invasoras con una segunda bacteriocina en un ambiente deseado según algunas de las realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas.
La Figura 5 es un diagrama de flujo que ilustra métodos para controlar el crecimiento de al menos una segunda célula microbiana en cultivo según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas.
La Figura 6 es un diagrama esquemático que ilustra un sistema que comprende una protección genética según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas.
La Figura 7 es un diagrama esquemático que ilustra un sistema de protección genética que puede ser útil para la producción fotosintética según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas.
La Figura 8 es un diagrama de flujo que ilustra métodos para producir y usar bacteriocinas según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas.
Descripción detallada
Según algunas de las realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se proporcionan organismos microbianos diseñados por ingeniería genética. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, los organismos microbianos se diseñan por ingeniería genética para controlar el crecimiento de la población microbiana en un ambiente tal como aquellos que usan una materia prima. Como se usa en la presente descripción, la actividad de “ neutralización” (y variaciones de la misma palabra raíz) de bacteriocinas pueden referirse a la detención de la reproducción microbiana o citotoxicidad. Los organismos microbianos pueden diseñarse por ingeniería genética para producir bacteriocinas, que son polipéptidos secretados que pueden neutralizar microorganismos. Sin embargo, los organismos microbianos que producen moduladores de inmunidad a las bacteriocinas pueden resistir ciertas bacteriocinas. Por lo tanto, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un primer organismo microbiano se diseña por ingeniería genética para secretar bacteriocinas. En algunas realizaciones, las bacteriocinas particulares se seleccionan sobre la base del tipo de célula microbiana, los tipos de células microbianas que se regulan, la composición del medio de cultivo, o la ubicación geográfica (por ejemplo, para dirigirse a organismos microbianos contaminantes particulares asociados a un tipo particular de medio de cultivo y/o ubicación geográfica). Otros organismos microbianos que poseen características deseadas para un ambiente particular pueden producir moduladores de inmunidad a las bacteriocinas (y así sobrevivir en presencia de bacteriocinas), mientras que otros organismos microbianos no deseados (por ejemplo, contaminantes, organismos microbianos que han perdido una característica u organismos deseados que participan en un proceso industrial pero cuyo crecimiento o producción de un producto particular no se desea bajo las condiciones predominantes) no logran producir moduladores de inmunidad a las bacteriocinas y, por lo tanto, son neutralizados por las bacteriocinas.
Organismos microbianos
Según algunos aspectos, se proporcionan microorganismos diseñados por ingeniería genética según las reivindicaciones adjuntas. Como se usa en la presente descripción, “organismo microbiano” , “ microorganismo” y variaciones de estos términos raíces (tales como pluralizaciones y similares) diseñados por ingeniería genética abarcan la modificación genética de cualquier especie de origen natural u organismo unicelular procariota o eucariota totalmente sintético, así como las especies Archae. Así, esta expresión puede referirse a células de especies bacterianas, especies fúngicas y algas.
Los microorganismos ilustrativos que pueden usarse según las realizaciones según las reivindicaciones adjuntas incluyen, aunque no de forma limitativa, bacterias, levaduras y algas, por ejemplo, microalgas fotosintéticas. Además, los genomas de microorganismos completamente sintéticos pueden sintetizarse y trasplantarse a células microbianas individuales, para producir microorganismos sintéticos capaces de autorreplicarse contínuamente (véase Gibson et al. (2010), “Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome” , Science 329: 52-56). Como tal, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el microorganismo es completamente sintético. Una combinación deseada de elementos genéticos, que incluyen elementos que regulan la expresión génica y elementos que codifican productos génicos (p. ej., bacteriocinas, moduladores de inmunidad, veneno, antídoto y moléculas industrialmente útiles) puede ensamblarse en una estructura deseada en un microorganismo parcial o totalmente sintético. La descripción de organismos microbianos diseñados por ingeniería genética para aplicaciones industriales puede encontrarse además en Wright, et al. (2013) “ Building-in biosafety for synthetic biology” Microbiology 159: 1221 -1235.
Puede usarse una variedad de especies y cepas bacterianas según las realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, y pueden proporcionarse variantes modificadas genéticamente o bacterias sintéticas basadas en una “estructura” de una especie conocida. Bacterias ilustrativas con características aplicables industrialmente, que pueden usarse según realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas incluyen, pero no se limitan a, especies de Bacillus (por ejemplo, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis), especies de Paenibacillus, especies de Streptomyces, especies de Micrococcus, especies de Corynebacterium, especies de Acetobacter, especies de Cyanobacteria, especies de Salmonella, especies de Rhodococcus, especies de Pseudomonas, especies de Lactobacillus, especies de Enterococcus, especies de Alcaligenes, especies de Klebsiella, especies de Paenibacillus, especies de Arthrobacter, especies de Corynebacterium, especies de Brevibacterium, Thermus aquaticus, Pseudomonas stutzeri, Clostridium thermocellus y Escherichia coli.
Puede usarse una variedad de especies y cepas de levadura según las realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, y pueden proporcionarse variantes modificadas genéticamente o levadura sintéticas basadas en una “estructura” de una especie conocida. Las levaduras ilustrativas con características industrialmente aplicables, que puede usarse según las realizaciones en la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas incluyen, aunque no de forma limitativa, especies de Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces boulardii), especies de Candida (por ejemplo, Candida utilis, Candida krusei), especies de Schizosaccharomyces (por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces japonicas), especies de Pichia o Hansenula (por ejemplo, Pichia pastoris o Hansenula polymorpha) y especies de Brettanomyces (por ejemplo, Brettanomyces claussenii).
Se puede usar una variedad de especies y cepas de algas según realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, y se pueden crear variantes genéticamente modificadas, o algas sintéticas basadas en una “estructura” de una especie conocida. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las algas comprenden microalgas fotosintéticas. Las especies de algas ilustrativas que pueden ser útiles para biocombustibles, y que pueden usarse según realizaciones de la presente invención según las reivindicaciones adjuntas, incluyen Botryococcus braunii, especies de Chlorella, Dunaliella tertiolecta, especies de Gracilaria, Pleurochrysis carterae y especies de Sargassum. Además, muchas algas pueden ser útiles para productos alimenticios, productos fertilizantes, neutralización de residuos, recuperación ambiental y fabricación de carbohidratos (por ejemplo, biocombustibles).
Bacteriocinas
Como se usa en la presente descripción, “bacteriocina” y variaciones de este término raíz se refieren a un polipéptido que es secretado por una célula huésped y puede neutralizar al menos una célula distinta de la célula huésped individual en la cual se elabora el polipéptido, incluidas células relacionadas por clonación con la célula huésped y otras células microbianas. Como se usa en la presente descripción, “bacteriocina” abarca además una versión extracelular o sintetizada químicamente de dicho polipéptido. Una célula que expresa un “ modulador de inmunidad” particular (explicado en mayor detalle en la presente descripción) es inmune a los efectos neutralizantes de una bacteriocina particular o grupo de bacteriocinas. Como tales, las bacteriocinas pueden neutralizar una célula que produzca la bacteriocina y/u otras células microbianas, siempre que estas células no produzcan un modulador de inmunidad adecuado. Como tal, una célula huésped puede ejercer efectos citotóxicos o inhibidores del crecimiento en una pluralidad de otros organismos microbianos al secretar bacteriocinas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una bacteriocina se produce por medio de la maquinaria de traducción (p. ej., un ribosoma, etc.) de una célula microbiana. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una bacteriocina se sintetiza químicamente. Algunas bacteriocinas pueden derivarse de un precursor de polipéptidos. El precursor de polipéptidos puede experimentar escisión (por ejemplo procesamiento por una proteasa) para producir el polipéptido de la propia bacteriocina. Como tal, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se produce una bacteriocina a partir de un polipéptido precursor. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una bacteriocina comprende un polipéptido que ha experimentado modificaciones postraduccionales, por ejemplo, escisión, o la adición de uno o más grupos funcionales.
«Antibiótico» y variaciones de este término raíz se refieren a un metabolito o un producto intermedio de una vía metabólica que puede matar o detener el crecimiento de al menos una célula microbiana. Algunos antibióticos pueden producirse por células microbianas, por ejemplo bacterias. Algunos antibióticos pueden sintetizarse químicamente. Se entiende que las bacteriocinas son distintas de los antibióticos, al menos en que las bacteriocinas se refieren a productos génicos (que, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, experimentan un procesamiento adicional postraduccional) o análogos sintéticos de estos, mientras que los antibióticos se refieren a productos intermedios o productos de vías metabólicas o análogos sintéticos de estos.
La actividad neutralizante de las bacteriocinas puede incluir la detención de la reproducción microbiana o citotoxicidad. Algunas bacteriocinas tienen actividad citotóxica (p. ej. efectos “ bactericidas” ) y, por lo tanto, pueden matar organismos microbianos, por ejemplo bacterias, levaduras, algas, microorganismos sintéticos, y similares. Algunas bacteriocinas pueden inhibir la reproducción de organismos microbianos (p. ej. efectos “bacteriostáticos” ), por ejemplo bacterias, levaduras, algas, microorganismos sintéticos y similares, por ejemplo deteniendo el ciclo celular.
Cabe señalar que se han propuesto enfoques que no usan bacteriocina para actuar selectivamente sobre diversos organismos microbianos. Por ejemplo, se ha propuesto el producto químico KAMORAN™ para actuar selectivamente sobre bacterias de la familia de Lactic Acid Bacteria (bacterias de ácido láctico - LAB) (véase Union Nationale des Groupments de Distillateurs D 'Alcool, (2005) “ Kamoran” ). Cabe señalar que también se ha propuesto un bacteriófago para actuar selectivamente sobre bacterias de la familia LAB (véase la publicación de patente US-2010/0330041). Cabe señalar que se han propuesto pesticidas para actuar selectivamente sobre varios organismos microbianos contaminantes (véase McBride et al., “ Contamination Management in Low Cost Open Algae Ponds for Biofuels Production” Industrial Biotechnology 10: 221-227 (2014)). Sin embargo, las bacteriocinas pueden proporcionar numerosas ventajas sobre los productos químicos, los pesticidas o los bacteriófagos. Por ejemplo, las bacteriocinas pueden evitar vertidos o subproductos potencialmente tóxicos en una materia prima. Por ejemplo, las bacteriocinas pueden tener una mayor eficacia contra organismos microbianos no deseados particulares que los bacteriófagos, productos químicos o pesticidas. Por ejemplo, las bacteriocinas pueden producirse por organismos microbianos que experimentan un crecimiento logarítmico y, por lo tanto, pueden aumentarse o disminuirse fácilmente, mientras que la escalabilidad de bacteriófagos o sistemas químicos/pesticidas puede ser más limitada. Por ejemplo, las bacteriocinas pueden permitir un control preciso sobre qué organismos neutralizar y cuales no, por ejemplo para evitar la neutralización de organismos microbianos industrialmente útiles en el medio de cultivo. Por ejemplo, los bacteriófagos pueden ser difíciles de producir a escala industrial y, además, pueden ser difíciles de controlar, ya que los bacteriófagos pueden ser infecciosos, pueden plantear cuestiones de control génico y la conservación de bacteriófagos puede ser difícil. Por otra parte, las bacteriocinas según algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas pueden comprender parte de un proceso industrial y, por lo tanto, pueden participar en la contención génica y/o el control de un proceso de fermentación a través de la actividad bacteriostática. Además, la susceptibilidad de los organismos microbianos que participan en el proceso industrial puede ajustarse mediante el control de inmunidad. Además, las bacteriocinas tienen, típicamente, un bajo nivel de toxicidad para aplicaciones industriales, tales como alimentos para humanos o animales, y se contempla que las bacteriocinas, según algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, son adecuadas para usar como conservante de alimentos, tal como un aditivo.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una actividad neutralizante particular (p. ej., citoxicidad o detención de la reproducción microbiana) se selecciona en función del tipo de regulación microbiana que se desee. Como tal, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las células microbianas se diseñan por ingeniería genética para expresar bacteriocinas particulares o una combinación de bacteriocinas. Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las células microbianas se diseñan por ingeniería genética para expresar bacteriocinas particulares en base a las células que se regulan. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, por ejemplo si las células contaminantes deben destruirse al menos se proporciona una bacteriocina citotóxica. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se selecciona una bacteriocina o combinación de bacteriocinas que es eficaz contra contaminantes que se producen comúnmente en un cultivo particular. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, por ejemplo realizaciones en las que se desea la regulación reversible de las relaciones de células microbianas, se proporciona una bacteriocina que inhibe la reproducción microbiana. Sin limitaciones teóricas de ningún tipo, muchas bacteriocinas pueden tener actividad neutralizante contra organismos microbianos que ocupen, típicamente, el mismo nicho ecológico que la especie que produce la bacteriocina. Como tal, en algunas realizaciones, cuando se desea un espectro particular de actividad bacteriocina, se selecciona una bacteriocina de una especie huésped que ocupe el mismo (o similar) nicho ecológico que el organismo microbiano u organismos sobre los que actuará selectivamente la bacteriocina.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una o más actividades bacteriocina se seleccionan antes del crecimiento del cultivo, y uno o más organismos microbianos se diseñan por ingeniería genética para generar un ambiente de cultivo deseado. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las bacteriocinas pueden seleccionarse en base a su capacidad para neutralizar uno o más organismos invasores que probablemente intenten crecer en un cultivo particular. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una o más actividades bacteriocina se seleccionan sobre la base de una o más condiciones de un ambiente de cultivo existente. Por ejemplo, si se identifican invasores particulares en un ambiente de cultivo, los microorganismos “ neutralizantes” pueden diseñarse por ingeniería genética para producir bacteriocinas para neutralizar a los invasores identificados. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las células diseñadas por ingeniería genética que producen bacteriocinas se añaden a un cultivo existente para volver a equilibrar el cultivo, por ejemplo, si un crecimiento de un tipo de célula microbiana particular en el cultivo de célula microbiana es demasiado alto.
Se han identificado varias bacteriocinas con actividad antifúngica. Por ejemplo, se ha demostrado que las bacteriocinas de Bacillus tienen actividad neutralizante contra cepas de levadura (véase Adetunji y Olaoye (2013) Malaysian Journal of Microbiology 9: 130-13, an Enterococcus faecalis peptide (WLPPAGLLGRCGRWFRPWLLWLQ SGAQY KWLGNLFGLGPK, SEQ ID NO: 1); se ha demostrado que tiene actividad neutralizante contra especies de Candida (véase Shekh y Roy (2012) BMC Microbiology 12: 132 y se ha demostrado que las bacteriocinas de Pseudomonas tienen actividad neutralizante contra hongos, tales como Curvularia lunata, especies de Fusarium, especies de Helminthosporium y especies de Biopolaris (Shalani y Srivastava (2008) The Internet Journal of Microbiology. Volumen 5 Número 2. DOI: 10.5580/27dd - accesible en internet en archive.ispub.com/journal/the-internet-journal-of-microbiology/volume-5-number-2/screening-forantifungal-activity-of-pseudomonas-fluorescens-against-phytopathogenicfungi.html#sthash.d0Ys03UO.1 DKuT 1 US.dpuf). A manera de ejemplo, la botricidina AJ1316 (véase Zuber, P et al. (1993) Peptide Antibiotics. En Bacillus subtilis and Other Gram-Positive Bacteria: Biochemistry, Physiology, and Molecular Genetics ed Sonenshein et al., págs. 897- 916, American Society for Microbiology, incorporada en la presente descripción como referencia en su totalidad) y la alirina B1 (véase Shenin et al. (1995) Antibiot Khimioter 50: 3-7) de B. subtilis han demostrado tener actividades antifúngicas. Como tal, si se desea la neutralización de un organismo microbiano fúngico, una bacteriocina comprende al menos una botricidina AJ1316 o alirina B1.
Se han identificado agrupaciones de polipéptidos de bacteriocina conservados en una amplia variedad de especies de cianobacterias. Por ejemplo, se han identificado al menos 145 agrupaciones génicas putativas de bacteriocina en al menos 43 especies de cianobacterias, como se indica en Wang et al. (2011), Genome Mining Demonstrates the Widespread Occurrence of Gene Clusters Encoding Bacteriocins in Cyanobacteria. PLoS ONE 6(7): e22384. Las bacteriocinas de cianobacterias ilustrativas se muestran en la Tabla 1.2, como Id. de sec. n.° 420, 422, 424, 426, 428, 30, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448 y 450.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la célula huésped en sí es una célula microbiana. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las bacteriocinas neutralizan células de una especie o cepa diferente a la célula huésped. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las bacteriocinas neutralizan células de la misma especie o cepa que la célula huésped si estas células carecen de un modulador de inmunidad adecuado. Dado que las bacteriocinas pueden mediar tanto la neutralización de organismos huéspedes como no huéspedes microbianos, el experto en la materia apreciará fácilmente que una bacteriocina es distinta de los sistemas veneno-antídoto (descritos con mayor detalle en la presente descripción), que implican un mecanismo endógeno por el cual un microorganismo huésped puede neutralizarse solo por sí mismo. En otras palabras, las bacteriocinas pueden neutralizar células distintas de la célula en la que se producen (por ejemplo, las bacteriocinas pueden seleccionarse y/o diseñarse por ingeniería genética para actuar como un protector del nicho ecológico), mientras que las moléculas veneno matan solo la célula individual en la que se producen (por ejemplo, para actuar como sistemas suicidas).
Se han identificado y caracterizado varias bacteriocinas. Sin limitaciones teóricas de ningún tipo, las bacteriocinas ilustrativas pueden clasificarse como bacteriocinas de “clase I” que, típicamente, experimentan modificación postraduccional, y bacteriocinas de “clase II” que, típicamente, no están modificadas. Además, las bacteriocinas ilustrativas en cada clase pueden clasificarse en varios subgrupos, como se resume en la Tabla 1.1, que está adaptada de Cotter, P.D. et al. “ Bacteriocins- a viable alternative to antibiotics” Nature Reviews Microbiology 11: 95­ 105.
Sin limitaciones teóricas de ningún tipo, las bacteriocinas pueden efectuar la neutralización de una célula microbiana objetivo de diversas maneras. Por ejemplo, una bacteriocina puede permeabilizar una pared celular y, por lo tanto despolarizar la pared celular e interferir en la respiración.
Tabla 1.1: Clasificación de bacteriocinas ilustrativas
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Varias bacteriocinas pueden usarse según las realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas. Las bacteriocinas ilustrativas se muestran en la Tabla 1.2. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se proporciona al menos una bacteriocina que comprende una secuencia de polipéptidos de la Tabla 1.2. Como se muestra en la Tabla 1.2, algunas bacteriocinas funcionan como pares de moléculas. Como tal, se entenderá que, a menos que se indique de otra manera, cuando se hable en la presente descripción de una “bacteriocina” o “que proporciona una bacteriocina” funcional o similar, se incluyen pares de bacteriocinas funcionales junto con bacteriocinas que funcionan individualmente. Con referencia a la Tabla 1.2, los “organismos de origen” enumerados entre paréntesis indican información sobre nombres y/o cepas alternativos para organismos conocidos por producir la bacteriocina indicada.
Las realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas incluyen además péptidos y proteínas con identidad con las bacteriocinas descritas en la Tabla 1.2. El término “ identidad” pretende incluir homología de secuencias de ácidos nucleicos o proteínas u homología tridimensional. Existen varias técnicas para determinar la homología de la secuencia de ácidos nucleicos o polipéptidos y/o la homología tridimensional con los polipéptidos. Estos métodos se usan rutinariamente para descubrir el alcance de identidad que una secuencia, dominio o modelo tiene con una secuencia, dominio o modelo objetivo. Una amplia variedad de bacteriocinas funcionales puede incorporar las características de las bacteriocinas explicadas en la presente descripción, lo que proporciona, por lo tanto un amplio grado de identidad con las bacteriocinas de la Tabla 1.2. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una bacteriocina tiene al menos aproximadamente 50 % de identidad, por ejemplo, al menos aproximadamente 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % de identidad con uno cualquiera de los polipéptidos de la Tabla 1.2. El porcentaje de identidad puede determinarse mediante el uso del software BLAST (Altschul, S.F., et al. (1990) “Basic local alignment search tool” . J. Mol. Biol. 215: 403-410, accesible en Internet en blast.ncbi.nlm.nih.gov) con los parámetros predeterminados.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se proporciona un polinucleótido que codifica una bacteriocina como se describe en la presente descripción. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el polinucleótido está comprendido dentro de un vector de expresión. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el polinucleótido o vector de expresión está en una célula microbiana. Las secuencias de polinucleótidos ilustrativas que codifican los polipéptidos de la Tabla 1.2 se indican en la Tabla 1.2. Las Id. de sec. n.°: 341 a 419 (Id. de sec. con números impares) representan polinucleótidos ilustrativos basados en la traducción inversa del polipéptido respectivo. El experto en la materia comprenderá fácilmente que más de un polinucleótido puede codificar un polipéptido particular. Por ejemplo, el código genético es degenerado y además el uso de codones puede variar sobre la base del organismo particular en el que se exprese el producto génico. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un polinucleótido que codifica una bacteriocina se selecciona sobre la base del uso de codones del organismo que expresa la bacteriocina. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un polinucleótido que codifica una bacteriocina se optimiza por codones sobre la base del organismo particular que expresa la bacteriocina.
Si bien las bacteriocinas de la Tabla 1.2 son de origen natural, el experto en la materia apreciará que se pueden usar variantes de las bacteriocinas de la Tabla 1.2, bacteriocinas de origen natural distintas a las bacteriocinas de la Tabla 1.2 o sus variantes o bacteriocinas sintéticas según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, tales variantes tienen niveles aumentados o disminuidos de actividad citotóxica o inhibidora del crecimiento en el mismo o diferente microorganismo o especie de microorganismo con respecto a la proteína natural. Se han reconocido varios motivos como característicos de las bacteriocinas. Por ejemplo, el motivo YGXGV (Id. de sec. n.°: 2), en donde X es cualquier residuo de aminoácido, es una secuencia consenso con aminoterminal característica de las bacteriocinas de clase IIa. En consecuencia, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una bacteriocina sintética comprende una secuencia aminoterminal con al menos aproximadamente 50 % de identidad con la Id. de sec. n.°: 2, por ejemplo, al menos aproximadamente 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la Id. de sec. n.°: 2. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una bacteriocina sintética comprende una secuencia aminoterminal que comprende la Id. de sec. n.°: 2. Además, algunas bacteriocinas de clase IIb comprenden un motivo GxxxG. Sin limitaciones teóricas de ningún tipo, se cree que el motivo GxxxG puede mediar en la asociación entre proteínas helicoidales en la membrana celular, por ejemplo, para facilitar la neutralización mediada por bacteriocinas a través de interacciones con la membrana celular. Como tal, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la bacteriocina comprende un motivo que facilita las interacciones con la membrana celular. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la bacteriocina comprende un motivo GxxxG. Opcionalmente, la bacteriocina que comprende un motivo GxxxG puede comprender una estructura helicoidal. Además de las estructuras descritas en la presente descripción, “bacteriocina” , como se usa en la presente descripción, abarca además estructuras que tienen sustancialmente el mismo efecto sobre las células microbianas que cualquiera de las bacteriocinas proporcionadas explícitamente en la presente descripción.
Se ha demostrado que los polipéptidos de fusión que comprenden dos o más bacteriocinas o partes de estas pueden tener actividad neutralizante contra un intervalo más amplio de organismos microbianos que cualquier bacteriocina individual. Por ejemplo, se ha demostrado que un híbrido de bacteriocina, Ent35-MccV (GKYYGNGVSCNKKGCSVDWGRAIGIIGNAINANLATGGAAGWKSGGGASGRDIAMAIGTLSGQFVAGGIGAAAGGV AGGAIYDYASTHKPNPAMSPSGLGGTIKQKPEGIPSEAWNYAAGRLWSPNLSDVCL, Id. de sec. n.°: 3) exhibe actividad antimicrobiana contra las bacterias gram positivas y gram negativas patógenas (Acuña et al. (2012), FEBS Open Bio, 2: 12-19). Se destaca que la bacteriocina de fusión Ent35-MccV comprende, desde el aminoterminal hasta el carboxiterminal, una glicina con aminoterminal, enterocina CRL35, un conector que comprende tres glicinas y una microcina V con carboxiterminal. En la presente descripción, se contempla que las bacteriocinas pueden comprender fusiones de dos o más polipéptidos que tengan actividad bacteriocina. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se proporciona un polipéptido de fusión de dos o más bacteriocinas. En algunas realizaciones, según las reivindicaciones adjuntas, las dos o más bacteriocinas comprenden polipéptidos de la Tabla 1.2 o modificaciones de estos. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el polipéptido de fusión que comprende dos o más bacteriocinas tiene un espectro de actividad más amplio que cualquier bacteriocina individual, por ejemplo, teniendo actividad neutralizante contra más organismos microbianos, actividad neutralizante en un intervalo más amplio de condiciones ambientales y/o una eficacia de actividad neutralizante superior. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se proporciona una fusión de dos o más bacteriocinas, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez bacteriocinas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, dos o más polipéptidos de bacteriocina se fusionan entre sí a través de un enlace covalente, por ejemplo, un enlace peptídico. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un conector se ubica entre los dos polipéptidos de bacteriocina. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el conector comprende una o más glicinas, por ejemplo, aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 glicinas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el conector se escinde dentro de la célula para producir las bacteriocinas individuales incluidas en la proteína de fusión. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una bacteriocina, como se proporciona en la presente descripción, se modifica para proporcionar un espectro de actividad deseado con respecto a la bacteriocina no modificada. Por ejemplo, la bacteriocina modificada puede tener una actividad mejorada o disminuida contra los mismos organismos que la bacteriocina no modificada. Alternativamente, la bacteriocina modificada puede tener actividad mejorada contra un organismo contra el cual la bacteriocina no modificada tiene menos actividad o no tiene actividad.
Tabla 1.2: Bacteriocinas ilustrativas
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Como se usa en la presente descripción, “ polinucleótido de bacteriocina” se refiere a un polinucleótido que codifica una bacteriocina. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la célula huésped comprende al menos una bacteriocina.
Moduladores de inmunidad a las bacteriocinas
Los moduladores de inmunidad a las bacteriocinas ilustrativos se muestran en la Tabla 2. Si bien los moduladores de inmunidad en la Tabla 2 son de origen natural, el experto en la materia apreciará que se pueden usar variantes de los moduladores de inmunidad de la Tabla 2, moduladores de inmunidad de origen natural distintos a los moduladores de inmunidad de la Tabla 2 o moduladores de inmunidad sintéticos según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un modulador de inmunidad particular o una combinación particular de moduladores de inmunidad confiere inmunidad a una bacteriocina particular, clase o categoría particular de bacteriocinas, o combinación particular de bacteriocinas. Las bacteriocinas ilustrativas frente a las cuales los moduladores de inmunidad pueden conferir inmunidad se identifican en la Tabla 2. Si bien la Tabla 2 identifica un “organismo de origen” para moduladores de inmunidad ilustrativos, estos moduladores de inmunidad pueden expresarse fácilmente en otros microorganismos de origen natural, modificados genéticamente o sintéticos, para proporcionar una actividad inmunitaria deseada frente a las bacteriocinas según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas. Como tal, como se usa en la presente descripción, “ modulador de inmunidad” se refiere no solo a estructuras expresamente proporcionadas en la presente descripción, sino también a estructuras que tienen sustancialmente el mismo efecto que las estructuras de “ modulador de inmunidad” descritas en la presente descripción, incluidos moduladores de inmunidad completamente sintéticos, y moduladores de inmunidad que proporcionan inmunidad a las bacteriocinas que son funcionalmente equivalentes a las bacteriocinas descritas en la presente descripción.
Las secuencias de polinucleótidos ilustrativas que codifican los polipéptidos de la Tabla 2 se indican en la Tabla 2. El experto en la materia comprenderá fácilmente que el código genético es degenerado y, además, el uso de codones puede variar sobre la base del organismo particular en el cual se expresa el producto génico y, como tal, un polipéptido particular puede codificarse por más de un polinucleótido. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un polinucleótido que codifica un modulador de inmunidad a las bacteriocinas se selecciona sobre la base del uso de codones del organismo que expresa el modulador de inmunidad a las bacteriocinas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un polinucleótido que codifica un modulador de inmunidad a las bacteriocinas se optimiza por codones sobre la base del organismo particular que expresa el modulador de inmunidad a las bacteriocinas. Una amplia variedad de moduladores de inmunidad funcionales puede incorporar características de los moduladores de inmunidad descritos en la presente descripción, lo que proporciona, por lo tanto, un amplio grado de identidad con los moduladores de inmunidad de la Tabla 2. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un modulador de inmunidad tiene al menos aproximadamente 50 % de identidad, por ejemplo, al menos aproximadamente 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con uno cualquiera de los polipéptidos de la Tabla 2.
Tabla 2: Moduladores de inmunidad a las bacteriocina ilustrativos
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Sistemas de veneno-antídoto
Puede ser deseable contener una célula microbiana particular dentro de un ambiente deseado, por ejemplo, matando o deteniendo el crecimiento de la célula microbiana si ya no está en el ambiente deseado. Los sistemas de veneno-antídoto, que son distintos de las bacteriocinas, pueden ser útiles para lograr tal contención, o para otro crecimiento selectivo de células microbianas. Los sistemas de veneno-antídoto ilustrativos se describen en las patentes US- 5.910.438, US6.180.407, US-7.176.029 y US-7.183.097. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un sistema de veneno-antídoto comprende un polipéptido citotóxico (veneno), y un polipéptido antitoxina correspondiente (antídoto) en una sola célula. Como se usa en la presente descripción, un “polinucleótido veneno” se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido veneno, y un “polinucleótido antídoto” se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido antídoto.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el polipéptido veneno se expresa constitutivamente, mientras que el polipéptido antídoto se expresa únicamente en las condiciones deseadas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el polipéptido veneno se expresa únicamente en condiciones no deseadas, mientras que el polipéptido antídoto se expresa únicamente en condiciones deseadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un sistema de veneno/antídoto se configura de manera que la célula microbiana sobreviva bajo condiciones ambientales deseadas, pero muera bajo condiciones ambientales no deseadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un sistema de venenoantídoto se configura de manera que la célula microbiana se destruya si escapa del ambiente en el que se usa en un proceso industrial. En otras realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un sistema de veneno-antídoto se configura de manera que la célula microbiana sobreviva cuando un vector (p. ej., un plásmido) que codifica un polipéptido antídoto esté presente, pero muera cuando el vector esté ausente. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el polipéptido veneno es codificado por un polinucleótido veneno en el genoma huésped, mientras que el polipéptido antídoto es codificado por un polinucleótido antídoto en un vector (tal como un plásmido o matriz extracromosómica o episoma o minicromosoma) y, como tal, se expresa únicamente cuando el vector está presente en la célula huésped. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el polipéptido veneno es codificado por un polinucleótido veneno en un primer vector, mientras que el polipéptido antídoto es codificado por un polinucleótido antídoto en un segundo vector, y como tal se expresa únicamente cuando el segundo vector está presente. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la presencia del polinucleótido antídoto (y, por lo tanto, la presencia del polipéptido antídoto) depende de la presencia o ausencia de un evento de recombinación, por ejemplo, la integración de una secuencia de polinucleótidos que codifique el polinucleótido antídoto en el genoma huésped. Debe apreciarse que, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas en las que la expresión del polipéptido antídoto depende de la presencia o ausencia de un vector o evento de recombinación, el polipéptido veneno y antídoto pueden expresarse, cada uno, constitutivamente. Opcionalmente, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas en las que la expresión del polipéptido antídoto depende de la presencia o ausencia de un vector o un evento de recombinación, la expresión del polipéptido veneno y/o polipéptido antídoto es condicional, por ejemplo, de manera que el veneno se exprese solamente en condiciones en las que no se desee la célula microbiana, y/o el polipéptido antídoto se exprese solamente en condiciones en las que se desee la célula microbiana.
Los pares de polipéptido tóxico/polipéptido antitóxico microbianos ilustrativos (denominados, además, pares “veneno/antídoto” ) que pueden usarse en sistemas de veneno-antídoto junto con algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas incluyen, aunque no de forma limitativa, RelE/RelB, CcdB/CcdA, Kis/Kid, SoK/HoK, PasB (o PasC)/PasA, PemK/PemI, Doc/Phd, MazE/MazF y ParE/ParD. Sin limitaciones teóricas de ningún tipo, muchos polipéptidos veneno, por ejemplo, RelE, se conservan muy bien en bacterias Gram positivas y Gram negativas y arqueas, y como tal, pueden tener actividad citotóxica en una amplia variedad de células microbianas de origen natural, genéticamente modificadas y completamente sintéticas. Además, sin limitaciones teóricas de ningún tipo, se contempla que un polipéptido antídoto puede inhibir, generalmente, la actividad de su pareja de polipéptido veneno en una variedad de ambientes huésped, y como tal, los pares de veneno/antídoto, como los descritos en la presente descripción, pueden usarse fácilmente en una amplia variedad de células microbianas de origen natural, genéticamente modificadas y completamente sintéticas.
Se observa que un sistema de veneno-antídoto es distinto de un sistema de bacteriocina al menos en que un sistema de veneno-antídoto proporciona un sistema endógeno mediante el cual una célula microbiana puede matar o detenerse a sí misma, mientras que un sistema de bacteriocina proporciona un sistema exógeno mediante el cual una célula microbiana puede matar o detener a otras células. Sin embargo, se destaca, además, que, si bien un sistema de veneno-antídoto no puede usarse para matar o detener células distintas de la célula individual en la cual se produce el veneno, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se puede usar un sistema de veneno-antídoto junto con un sistema bacteriocina como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un sistema bacteriocina, como se describe en la presente descripción, puede usarse para matar o detener el crecimiento de células distintas a la célula productora de bacteriocinas en un cultivo, mientras que el sistema de veneno-antídoto puede usarse para matar o detener el crecimiento de la célula productora de bacteriocinas, si esta escapara de su ambiente deseado. Un sistema de veneno-antídoto puede usarse además para seleccionar células productoras de bacteriocinas que se han diseñado por ingeniería genética para expresar una molécula útil en un proceso industrial (una “molécula industrialmente útil” ). Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la expresión de un antídoto se puede asociar a la expresión de una molécula industrialmente útil o bacteriocina poniendo los polinucleótidos que codifiquen la bacteriocina y la molécula industrialmente útil o polinucleótidos que codifiquen la bacteriocina y el antídoto bajo el control de un solo promotor. En consecuencia, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula microbiana que codifique una bacteriocina o un modulador de inmunidad a las bacteriocinas comprende además un sistema de veneno-antídoto. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el sistema bacteriocina es útil para regular el crecimiento de la célula microbiana u otras células microbianas dentro de un ambiente particular, mientras que el sistema de veneno-antídoto es útil para contener la célula microbiana dentro de un ambiente particular.
Promotores
Los promotores son muy conocidos en la técnica. Se puede usar un promotor para dirigir la transcripción de uno o más genes. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un promotor dirige la expresión de un polinucleótido que codifica un producto génico deseado, tal como se describe en la presente descripción. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un promotor dirige la expresión de un polinucleótido de bacteriocina como se describe en la presente descripción. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un promotor dirige la expresión de un polinucleótido modulador de inmunidad como se describe en la presente descripción.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un promotor dirige la expresión de un nucleótido de bacteriocina y un polinucleótido de modulador de inmunidad. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un promotor dirige la expresión de polinucleótidos que codifican al menos uno de una bacteriocina, un modulador de inmunidad, una molécula industrialmente útil, una molécula veneno o una molécula antídoto. Algunos promotores pueden dirigir la transcripción en todo momento (“promotores constitutivos” ). Algunos promotores pueden dirigir la transcripción solamente bajo circunstancias seleccionadas (“promotores condicionales” ), por ejemplo, dependiendo de la presencia o ausencia de una condición ambiental, compuesto químico, producto génico, etapa del ciclo celular, o similares.
El experto en la materia apreciará que, dependiendo de la actividad de expresión deseada, puede seleccionarse un promotor adecuado, y colocarse en cis con una secuencia que expresar. Los promotores ilustrativos con actividades ilustrativas se proporcionan en la Tabla 3.1-3.11 en la presente descripción. El experto en la materia apreciará que algunos promotores son compatibles con la maquinaria transcripcional particular (p. ej. ARN polimerasas, factores de transcripción generales, y similares). Como tal, si bien se identifican “especies” compatibles para algunos promotores descritos en la presente descripción, se contempla que, según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas, estos promotores puedan funcionar fácilmente en microorganismos distintos a las especies identificadas, por ejemplo, en especies con maquinaria transcripcional endógena compatible, especies modificadas genéticamente que comprendan maquinaria transcripcional compatible u organismos microbianos totalmente sintéticos que comprendan maquinaria transcripcional compatible.
Los promotores de las Tablas 3.1-3.11 de la presente invención están disponibles para el público en la fundación Biobricks. La fundación Biobricks promueve el uso de estos promotores según el BioBrick™ Public Agreement (Acuerdo público BioBrick™ - BPA).
Debe apreciarse que cualquiera de los polinucleótidos “codificantes” descritos en la presente descripción (por ejemplo un polinucleótido de bacteriocina, un polinucleótido de inmunidad, un polinucleótido veneno, un polinucleótido antídoto o un polinucleótido de producto) es generalmente susceptible de expresarse bajo el control de un promotor deseado. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un solo polinucleótido “codificante” está bajo el control de un solo promotor. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, dos o más polinucleótidos “codificantes” están bajo el control de un solo promotor, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez polinucleótidos. Como tal, en algunas realizaciones, un “cóctel” de diferentes bacteriocinas puede producirse por un solo organismo microbiano. En algunas realizaciones, un polinucleótido de bacteriocina está bajo el control de un promotor. En algunas realizaciones, un modulador de inmunidad está bajo el control de un promotor. En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifique un producto génico deseado está bajo el control de un promotor. En algunas realizaciones, el polinucleótido de bacteriocina y el polinucleótido que codifica un producto génico deseado están bajo el control del mismo promotor. En algunas realizaciones, un polinucleótido de bacteriocina y el polinucleótido que codifica un producto génico deseado están controlados por promotores diferentes. En algunas realizaciones, el polinucleótido modulador de inmunidad y el polinucleótido que codifica un producto génico deseado están bajo el control del mismo promotor. En algunas realizaciones, el polinucleótido de bacteriocina y el polinucleótido de modulador de inmunidad están bajo el control de promotores diferentes.
Generalmente, el inicio de la traducción para un transcrito particular está regulado por secuencias particulares en o 5 'del extremo 5' de la secuencia codificante de un transcrito. Por ejemplo, una secuencia codificante puede comenzar con un codón de iniciación configurado para emparejarse con un ARNt iniciador. Si bien los sistemas de traducción de origen natural usan, típicamente, Met (AUG) como codón de iniciación, se apreciará fácilmente que un ARNt iniciador puede diseñarse por ingeniería genética para unirlo a cualquier triplete o tripletes deseados y, en consecuencia, tripletes distintos de AUG pueden funcionar además como codones de iniciación en ciertas realizaciones. Además, las secuencias cerca del codón de iniciación pueden facilitar el ensamblaje ribosómico, por ejemplo, una secuencia de Kozak ((gcc)gccRccAUGG, Id. de sec. n.°: 542, en la cual R representa “A” o “G” ) o Internal Ribosome Entry Site (sitio de entrada del ribosoma interno - IRES) en sistemas de traducción eucariótica típicos, o una secuencia de Shine-Delgarno (GGAGGU, Id. de sec. n.°: 543) en sistemas de traducción procariota típicos. Como tal, en algunas realizaciones, un transcrito que comprende una secuencia de polinucleótidos “codificante” , por ejemplo, un polinucleótido de bacteriocina o polinucleótido modulador de inmunidad, o polinucleótido que codifica un producto industrial deseado, comprende un codón de iniciación y una secuencia de iniciación de traducción adecuados. En algunas realizaciones, por ejemplo, si dos o más secuencias de polinucleótidos “codificantes” se colocan en cis en un transcrito, cada secuencia de polinucleótidos comprende un codón de iniciación y secuencia(s) de iniciación de la traducción adecuados. En algunas realizaciones, por ejemplo, si dos o más secuencias de polinucleótidos “codificantes” se ubican en cis en un transcrito, las dos secuencias están bajo control de una única secuencia de iniciación de la traducción y, o bien proporcionan un solo polipéptido que puede funcionar con ambos polipéptidos codificados en cis, o proporcionan un medio para separar dos polipéptidos codificados en cis, por ejemplo, una secuencia 2A o similar. En algunas realizaciones, un ARNt iniciador de traducción es regulable, para regular el inicio de la traducción de una bacteriocina, un modulador de inmunidad, una molécula veneno, una molécula antídoto o una molécula industrialmente útil.
Tabla 3.1: Promotores metalosensibles ilustrativos
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Tabla 3.2: Promotores sensibles a la señalización celular ilustrativos
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________________________________________ Tabla 3.3: Promotores constitutivos ilustrativos para E. coli o70
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Tabla 3.4: Promotores constitutivos ilustrativos para E. coli o8
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Tabla 3.5: Promotores constitutivos ilustrativos para E. coli o32
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Tabla 3.6: Promotores constitutivos ilustrativos para B. subtilis oA
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Tabla 3.7: Promotores constitutivos ilustrativos para B. subtilis oB
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Tabla 3.8: Promotores constitutivos ilustrativos de un misceláneo de procariotas
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Tabla 3.9: Promotores constitutivos ilustrativos de bacteriófago T7
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Tabla 3.10: Promotores constitutivos ilustrativos de levadura
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Tabla 3.11: Promotores constitutivos ilustrativos de un misceláneo de eucariotas
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Los promotores mencionados anteriormente se proporcionan únicamente en forma de ejemplo no limitativo. El experto en la materia reconocerá fácilmente que muchas variantes de los promotores mencionados anteriormente y muchos otros promotores (incluidos promotores aislados de organismos existentes naturalmente, variaciones de estos y promotores totalmente sintéticos) pueden usarse fácilmente según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas.
Regulación de la actividad génica
La actividad génica puede regularse para aumentar o disminuir la actividad del producto génico. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el producto génico para el cual se regula la actividad comprende una bacteriocina, un modulador de inmunidad, una molécula industrialmente útil, una molécula veneno o una molécula antídoto. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, dos o más de estos productos génicos se regulan bajo un solo sistema de regulación génica. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la actividad génica se regula a nivel de expresión génica. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la actividad génica se regula a nivel transcripcional, por ejemplo, al activar o reprimir un promotor. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la actividad génica se regula a nivel postranscripcional, por ejemplo, a través de la regulación de la estabilidad del ARN. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la actividad génica se regula a nivel traduccional, por ejemplo, a través de la regulación del inicio de la traducción. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la actividad génica se regula a nivel postraduccional, por ejemplo, a través de la regulación de la estabilidad del polipéptido, las modificaciones posteriores a la traducción del polipéptido o la unión de un inhibidor al polipéptido.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la actividad génica se reduce. Conceptualmente, la actividad génica se puede reducir al inhibir directamente la actividad génica o al disminuir la actividad de un activador de actividad génica. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la actividad génica se reduce, pero permanece algún nivel de actividad. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la actividad génica se inhibe completamente. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la actividad génica se reduce por al menos uno de los siguientes: inhibición de la actividad promotora, activación de un represor transcripcional, disminución de la estabilidad del ARN, activación de un inhibidor postranscripcional (por ejemplo, la expresión de una ribocima u oligonucleótido antisentido), la inhibición de la traducción (por ejemplo, a través de un ARNt regulable), no consecución de una modificación posterior a la traducción requerida, inactivación de un polipéptido (por ejemplo, al unir un inhibidor o a través de una proteasa específica del polipéptido) o no localización adecuada de un polipéptido (p. ej., no secreta una bacteriocina). En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la actividad génica se reduce al eliminar un gen de una ubicación deseada, por ejemplo, al escindir un gen con el uso de un casete FLP-FRT o cre-lox o a través de la pérdida o degradación de un plásmido. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un producto génico (p. ej., un polipéptido) o un producto producido por un producto génico (p. ej., el producto de una reacción enzimática) inhibe la actividad génica adicional (p. ej., un bucle de retroalimentación negativa).
Modificación genética de organismos microbianos
Las técnicas para modificar genéticamente microorganismos son muy conocidas en la técnica. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un microorganismo se modifica genéticamente para comprender una secuencia de ácidos nucleicos que regule la expresión de, y codifique, al menos uno de bacteriocinas, moduladores de inmunidad, moléculas industrialmente útiles, moléculas veneno, o moléculas antídoto. Los polinucleótidos pueden suministrarse a microorganismos, y pueden integrarse establemente en los cromosomas de estos microorganismos, o pueden existir libres del genoma, por ejemplo, en un plásmido, una matriz extracromosómica, un episoma, un minicromosoma, o similares.
Los vectores ilustrativos para la modificación genética de células microbianas incluyen, aunque no de forma limitativa, plásmidos, virus (incluidos bacteriófagos) y elementos transponibles. De forma adicional, se apreciará que los genomas microbianos completos que comprenden las secuencias deseadas pueden sintetizarse y ensamblarse en una célula (véase, p. ej. Gibson et al. (2010), Science 329: 52-56). Como tal, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un genoma microbiano (o parte de este) se sintetiza con características deseadas, tales como polinucleótido(s) de bacteriocina, y se introduce en una célula microbiana.
Puede ser útil modificar genéticamente de manera flexible una célula microbiana, por ejemplo, diseñar o rediseñar por ingeniería genética una célula microbiana para que tenga un tipo y/o espectro deseado de bacteriocina o actividad moduladora de inmunidad. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se proporciona un casete para insertar uno o más polinucleótidos moduladores de inmunidad y/o bacteriocinas deseados en una secuencia de polinucleótidos. Los casetes ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, un casete Cre/lox o casete FLP/FRT. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el casete se coloca en un plásmido, de manera que un plásmido con la combinación deseada de bacteriocina y/o moduladores de inmunidad pueda introducirse fácilmente en la célula microbiana. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el casete se coloca en el genoma de la célula microbiana, de manera que un casete con la combinación deseada de bacteriocina y/o moduladores de inmunidad pueda introducirse en la ubicación deseada.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se puede usar una conjugación de plásmidos para introducir un plásmido deseado de una célula microbiana “donante” a una célula microbiana receptora. Goni-Moreno, et al. (2013) Multicellular Computing Using Conjugation for Wiring. PLoS ONE 8(6): e65986. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la conjugación de plásmidos puede modificar genéticamente una célula microbiana receptora al introducir un plásmido de conjugación de una célula microbiana donante a una célula microbiana receptora. Sin limitaciones teóricas de ningún tipo, los plásmidos de conjugación que comprenden el mismo o funcionalmente el mismo conjunto de genes de replicación, típicamente, no pueden coexistir en la misma célula microbiana. Como tal, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la conjugación de plásmidos “ reprograma” una célula microbiana receptora al introducir un nuevo plásmido de conjugación para suplantar a otro plásmido de conjugación que estaba presente en la célula receptora. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la conjugación de plásmidos se usa para diseñar (o rediseñar) por ingeniería genética una célula microbiana con una combinación particular de una o más bacteriocinas y/o moduladores de inmunidad. Según algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se proporciona una variedad de plásmidos de conjugación que comprende diferentes combinaciones de bacteriocinas y/o moduladores de inmunidad. Los plásmidos pueden comprender elementos genéticos adicionales como se describe en la presente descripción, por ejemplo, promotores, sitios de iniciación de traducción, y similares. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la variedad de plásmidos de conjugación se proporciona en una colección de células donantes, de manera que pueda seleccionarse una célula donante que comprenda el plásmido deseado para la conjugación de plásmidos. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se selecciona una combinación particular de bacteriocinas y/o moduladores de inmunidad, y una célula donante adecuada se conjuga con una célula microbiana de interés para introducir un plásmido de conjugación que comprenda esa combinación en una célula receptora. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la célula receptora es una célula “ recientemente diseñada por ingeniería genética” , por ejemplo, para introducirse en o para iniciar un cultivo. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la célula receptora es una «célula rediseñada por ingeniería genética» por ejemplo, para introducir una actividad nueva de bacteriocina (y, opcionalmente, moduladora de inmunidad) a un cultivo existente que ha encontrado un nuevo tipo de célula invasora y/o para eliminar una actividad de bacteriocina que ya no se desee en el cultivo.
Medio de cultivo
Los ambientes de cultivo microbiano pueden comprender una amplia variedad de medios de cultivo, por ejemplo, materias primas. La selección de un medio de cultivo particular puede depender de la aplicación deseada. Las condiciones de un medio de cultivo incluyen no solo composición química sino también la temperatura, las cantidades de luz, el pH, los niveles de CO2, y similares.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un microorganismo diseñado por ingeniería genética, como se describe en la presente descripción, se añade a un medio de cultivo que comprende otros microorganismos y al menos una materia prima. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el medio de cultivo comprende un compuesto que induce la actividad o expresión de una bacteriocina y/o un modulador de inmunidad.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el medio de cultivo comprende un compuesto que reprime la actividad o expresión de una bacteriocina y/o un modulador de inmunidad. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un compuesto que induce la actividad de la bacteriocina está presente fuera de la materia prima, pero no en la materia prima. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un compuesto que reprime la actividad del modulador de inmunidad está presente fuera de la materia prima, pero no en la materia prima.
El término “ materia prima” se usa en la presente descripción en un sentido amplio para abarcar material que puede ser consumido, fermentado, purificado, modificado o procesado de cualquier otra forma por organismos microbianos, por ejemplo, en el contexto de procesos industriales. Como tal, la “ materia prima” no se limita a alimentos o productos alimenticios. Como se usa en la presente descripción, una “ materia prima” es una categoría de medio de cultivo. En consecuencia, como se usa en la presente descripción, “ medio de cultivo” incluye, pero no se limita a, materia prima. Como tal, siempre que se haga referencia a un “ medio de cultivo” en la presente descripción, se contemplan expresamente además materias primas.
Células microbianas diseñadas por ingeniería genética
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se proporcionan células microbianas modificadas genéticamente. Las células microbianas modificadas genéticamente pueden configurarse para una amplia variedad de propósitos. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las células microbianas comprenden modificaciones genéticas para regular la expresión de al menos uno de bacteriocinas, moduladores de inmunidad, moléculas industrialmente útiles, moléculas veneno, o moléculas antídoto. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las células microbianas comprenden modificaciones genéticas para regular la expresión de bacteriocinas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las células microbianas comprenden modificaciones genéticas para regular la expresión de moduladores de inmunidad.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las células microbianas modificadas genéticamente se modifican para producir un producto. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el producto es un producto génico, por ejemplo, un polipéptido o ARN. Como tal, la secuencia de polinucleótidos “codificante” , como se menciona en la presente descripción, puede referirse a una secuencia que codifique un polipéptido o un ARN. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las células microbianas pueden configurarse para producir uno o más productos génicos que contribuyan a la síntesis de un producto deseado, por ejemplo, un carbohidrato, biocombustible, lípido, molécula pequeña, o metal. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el producto se sintetiza a través de la actividad de uno o más productos génicos de la célula microbiana. Opcionalmente, la síntesis del producto puede implicar, además, la actividad de uno o más productos génicos de una o más de otras células microbianas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las células microbianas pueden configurarse para descontaminar o descomponer una o más sustancias en un medio de cultivo, por ejemplo, una materia prima. La descontaminación puede estar mediada, total o parcialmente, por uno o más productos génicos de las células microbianas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las células microbianas pueden configurarse para depurar un material, por ejemplo, un metal tal como hierro o un metal de tierras raras.
Control del crecimiento de células microbianas
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las células microbianas modificadas genéticamente se modifican para regular el crecimiento de otras células microbianas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las células microbianas regulan el crecimiento de otras células microbianas de la misma especie o cepa, por ejemplo, sus propios clones. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las células microbianas regulan el crecimiento de células microbianas de una especie o cepa diferente, por ejemplo, invasoras. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula microbiana secreta una bacteriocina para regular otras células microbianas. La regulación de cada una de las otras células microbianas puede depender de su expresión (o falta de esta) de un modulador de inmunidad que tiene efectos protectores contra la bacteriocina particular secretada.
Como se usa en la presente descripción, “célula deseada” y similares se refieren a una célula microbiana con al menos una característica para la que se desea la supervivencia, el crecimiento, y/o la proliferación de la célula microbiana, o se desea al menos una ausencia de control negativo del crecimiento de la célula. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula deseada se encuentra en un ambiente adecuado, por ejemplo, su materia prima industrialmente aplicable. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula deseada es una célula que se selecciona positivamente, por ejemplo, una célula que ha experimentado un evento de recombinación particular, o que expresa altos niveles de un producto génico útil. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula deseada es una célula configurada para neutralizar células contaminantes, por ejemplo, células patógenas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula deseada se selecciona positivamente por su expresión de un modulador de inmunidad correspondiente a, al menos, una bacteriocina que puede estar presente en el ambiente. Sin limitaciones teóricas de ningún tipo, se contempla que una célula microbiana capaz de neutralizar otras células microbianas que carezcan de una función de neutralización similar tendrá una ventaja competitiva. Como tal, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula deseada se selecciona por su capacidad para neutralizar otras células. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula deseada se selecciona positivamente mediante la expresión de tanto una bacteriocina como un modulador de inmunidad correspondiente.
Como se usa en la presente descripción, “célula no deseada” y similares se refieren a una célula microbiana con al menos una característica que hace no deseable su supervivencia, crecimiento o proliferación. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la célula no deseada es una célula microbiana invasora, por ejemplo, una célula contaminante que ha entrado en un ambiente de cultivo. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula no deseada ha escapado de un medio de cultivo adecuado, por ejemplo, su materia prima industrialmente aplicable. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula no deseada ha perdido un plásmido particular o no ha logrado experimentar un evento de recombinación particular. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula no deseada no produce o produce niveles bajos del producto génico deseado. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se descarta una célula no deseada. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula no deseada se descarta a través de la reducción de la expresión o actividad de la célula de un modulador de inmunidad que protege contra una bacteriocina en el ambiente. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula no deseada se descarta a través de la reducción de la expresión o actividad de la célula de un modulador de inmunidad que protege contra una bacteriocina secretada por la célula y clones de esta. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula no deseada se descarta selectivamente reduciendo la expresión celular de una bacteriocina y, de esta manera, poniendo a la célula en desventaja competitiva contra otras células microbianas.
La Figura 1 es un diagrama de flujo que representa opciones para configurar una célula microbiana para controlar el crecimiento de una segunda célula microbiana según algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se proporciona una primera célula microbiana. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la primera célula microbiana secreta una bacteriocina activa 100. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la primera célula microbiana es una no deseada 102. Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una o más de la primera célula microbiana que esté fuera de su entorno industrial, una condición ambiental deseada para la primera célula microbiana que esté ausente, la primera célula microbiana ha hecho suficiente producto, o la primera célula microbiana carece de un evento de recombinación o vector, puede hacer que la primera célula microbiana no sea deseable en un ambiente particular en un momento particular 112. Como tal, cuando la primera
célula microbiana no es deseada, su modulador de inmunidad (correspondiente a la bacteriocina) puede inactivarse 122. Por ejemplo, uno o más de un promotor modulador de inmunidad pueden estar inactivos, un represor transcripcional de modulador de inmunidad puede estar activo, puede ocurrir el silenciamiento postranscripcional (p. ej., mediante una ribocima o antisentido), un ARNt regulable no puede inducirse, puede ocurrir silenciamiento postranscripcional (p. ej., por una proteasa específica del sitio, o una modificación de silenciamiento postraduccional), o un vector que codifique un modulador de inmunidad puede estar ausente 132. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, cuando la primera célula no tiene un modulador de inmunidad activo, la primera célula se neutraliza por medio de la bacteriocina 142 producida por otras células en el cultivo. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una segunda célula microbiana sigue creciendo 192 como resultado de la neutralización de la primera célula.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la primera célula microbiana es deseada 106. Por ejemplo, una o más de la primera célula microbiana que esté dentro de su entorno industrial, una condición ambiental deseada para la primera célula microbiana que esté presente, la primera célula microbiana que aún no ha hecho suficiente producto, o la primera célula microbiana que ha experimentado un evento de recombinación o comprende un vector particular puede hacer que la primera célula microbiana sea deseable en un ambiente particular en un momento particular 116. Como tal, cuando la primera célula microbiana es deseada, esta puede producir un modulador 126 de inmunidad activo. Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la primera célula microbiana puede configurarse para tener uno o más de un promotor constitutivo para el polinucleótido de modulador de inmunidad, un promotor activado (pero no necesariamente constitutivo) para el polinucleótido de modulador de inmunidad, un represor inactivo de la transcripción del modulador de inmunidad, un ARNt regulable que se induce para facilitar la producción del modulador de inmunidad, una ausencia de silenciamiento postraduccional y de la postranscripción del modulador de inmunidad o la presencia 136 de un vector que codifique al modulador de inmunidad. Como tal, la primera célula microbiana puede sobrevivir 146 en presencia de bacteriocina secretada por la primera célula microbiana. Como resultado de la bacteriocina secretada por la primera célula microbiana, una segunda célula microbiana puede crecer 192 o neutralizarse 196, dependiendo de si la segunda célula microbiana tiene 172 o no tiene 176 actividad moduladora de inmunidad.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la segunda célula microbiana es deseada 152. Por ejemplo, uno o más de un evento de recombinación deseado que ha ocurrido en la segunda célula microbiana, un vector deseado presente en la segunda célula microbiana, la segunda célula microbiana que produce un producto del cual se desea más (p. ej., un bucle de retroalimentación positiva), o el locus de inmunidad y el producto deseado que estén bajo el mismo control transcripcional cuando se transcriben los niveles adecuados de producto deseado, pueden hacer que la segunda célula microbiana sea deseable 162. Cuando se desea la segunda célula microbiana, esta puede proporcionar actividad moduladora de inmunidad para proteger contra la bacteriocina particular (o bacterocinas) producida(s) por la primera célula microbiana 172. Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la segunda célula microbiana puede configurarse de tal manera que un promotor modulador de inmunidad esté activo (por ejemplo, un promotor constitutivo), un represor transcripcional modulador de inmunidad esté inactivo, exista una falta de silenciamiento postranscripcional, se induzca un ARNt regulable para facilitar la expresión del modulador de inmunidad, pueda presentarse una falta de silenciamiento postraduccional (p. ej., por una proteasa específica del sitio) del modulador de inmunidad, o pueda estar presente 182 un vector que codifique un modulador de inmunidad. Como tal, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, cuando se proporciona actividad moduladora de inmunidad, la segunda célula microbiana puede sobrevivir 192.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, no se desea 156 una segunda célula microbiana. Por ejemplo, que una o más de la segunda célula microbiana sea una invasora (p. ej., una célula contaminante), una condición ambiental no deseada para la segunda célula microbiana (p. ej., la presencia de un compuesto o condición no deseados, o la ausencia de un compuesto o condición deseados), que la segunda célula microbiana haya producido producto producido, pero no se desee más producto (p. ej., un circuito de retroalimentación negativo), o un locus modulador de inmunidad y locus del producto deseado que estén bajo el mismo control transcripcional y niveles de transcrito que sean indeseablemente bajos (p. ej., que indiquen una incapacidad para producir un producto deseado), pueden hacer que la segunda célula microbiana sea no deseable 166. Como tal, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, puede no haber actividad moduladora de inmunidad o una cantidad insuficiente de un modulador de inmunidad para proteger contra la acción de la bacteriocina en la segunda célula microbiana 176. Por ejemplo, uno o más de un promotor modulador de inmunidad pueden estar inactivos, un represor transcripcional de modulador de inmunidad puede estar activo, puede ocurrir el silenciamiento postranscripcional del modulador de inmunidad (p. ej., mediante una ribocima u oligonucleótido antisentido), un ARNt regulable no puede inducirse (de manera que la expresión del modulador de inmunidad no se facilite), puede ocurrir silenciamiento postranscripcional del modulador de inmunidad (p. ej., por una proteasa específica del sitio, o una modificación de silenciamiento postraduccional), o un vector que codifique un modulador de inmunidad puede estar ausente 186. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la primera célula microbiana proporciona actividad 100 bacteriocina secretada. Como tal, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la bacteriocina 196 puede matar la segunda célula microbiana.
Un experto en la materia apreciará que, para esta y otras funciones, estructuras y procesos descritos en la presente descripción, las funciones, estructuras y etapas pueden implementarse o realizarse en un orden o secuencia diferente. Además, las funciones y estructuras descritas solo se proporcionan como ejemplos, y algunas de estas funciones y estructuras pueden ser opcionales, combinarse en menos funciones y estructuras, o expandirse en funciones y estructuras adicionales sin perjudicar la esencia de las realizaciones descritas según las reivindicaciones adjuntas.
Para una gran variedad de células microbianas modificadas genéticamente, puede ser útil controlar el crecimiento de otras células microbianas en el cultivo. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula microbiana controla el crecimiento de otras células microbianas en el cultivo. Las funciones y configuraciones ilustrativas por las cuales una primera célula microbiana puede controlar el crecimiento de una o más de otras células microbianas según algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas en la presente descripción se describen en la Tabla 4.
Tabla 4: Usos ilustrativos de los sistemas de bacteriocina en células microbianas modificadas genéticamente según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas
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La Figura 2 es un diagrama esquemático que representa una célula microbiana diseñada por ingeniería genética que controla el crecimiento de al menos otra célula microbiana según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas. Una primera célula microbiana 200 puede comprender un polinucleótido de bacteriocina y un polinucleótido de modulador de inmunidad correspondiente. El polinucleótido de bacteriocina puede integrarse, opcionalmente, en el genoma de la célula, mientras que el polinucleótido de modulador de inmunidad puede integrarse, opcionalmente, en un plásmido presente en la célula. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un clon no deseado de la célula 210 (un “clon de no expresión” ) puede carecer de actividad moduladora de inmunidad y, opcionalmente, puede carecer de actividad bacteriocina. La actividad bacteriocina de la primera célula microbiana 200 puede neutralizar el clon 210 de no expresión. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un clon no deseado de la célula 220 puede perder un plásmido que comprenda el polinucleótido de modulador de inmunidad. La actividad bacteriocina de la primera célula microbiana 200 puede neutralizar el clon 220 no deseado. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la célula microbiana 230 puede escapar del ambiente deseado, lo que provoca que el clon carezca de actividad moduladora de inmunidad. La actividad bacteriocina de la célula escapada 230 y/o los clones de la célula escapada pueden neutralizar la célula escapada 230. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la célula escapada 230 comprende además un sistema de veneno-antídoto para facilitar la muerte de la célula escapada después de su escape.
La Figura 3 es un diagrama esquemático de una primera célula microbiana 300 diseñada por ingeniería genética que controla el crecimiento de una segunda célula microbiana 310 diseñada por ingeniería genética y una célula invasora 320 en un ambiente deseado según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas. La primera célula microbiana 300 diseñada por ingeniería genética puede comprender un primer polinucleótido de bacteriocina. La segunda célula microbiana 310 diseñada por ingeniería genética puede comprender un segundo polinucleótido de bacteriocina. Cada una de la primera y segunda células microbianas (300 y 310) diseñadas por ingeniería genética pueden comprender un primer polinucleótido de modulador de inmunidad que codifique la resistencia a la primera bacteriocina y un segundo polinucleótido de modulador de inmunidad que codifique la resistencia a la segunda bacteriocina. Si la segunda célula microbiana 310 diseñada por ingeniería genética se vuelve no deseada, puede perder la primera actividad moduladora de inmunidad a través de cualquiera de los mecanismos descritos en la presente descripción y, por lo tanto controlarse por la primera actividad bacteriocina de la primera célula microbiana 300 diseñada por ingeniería genética. Si una célula invasora 320 entra en el ambiente deseado, la primera bacteriocina de la primera célula microbiana 300 diseñada por ingeniería genética y la segunda bacteriocina de la segunda célula microbiana 310 diseñada por ingeniería genética pueden neutralizar la célula invasora.
La Figura 4 es un diagrama esquemático de una primera célula microbiana 400 diseñada por ingeniería genética que controla el crecimiento de una primera célula invasora 410 y una segunda célula invasora 420 en un ambiente deseado según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas. La primera célula 400 diseñada por ingeniería genética puede comprender al menos un primer polinucleótido de bacteriocina que codifique una primera bacteriocina y al menos un segundo polinucleótido de bacteriocina que codifique una segunda bacteriocina. La primera célula 400 diseñada por ingeniería genética puede producir la primera bacteriocina para neutralizar una primera célula invasora 410. La primera célula 410 diseñada por ingeniería genética puede producir la segunda bacteriocina para neutralizar una segunda célula invasora 420. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la primera célula invasora es de una cepa o especie diferente de la segunda célula invasora. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la primera célula invasora responde a un espectro diferente de actividad bacteriocina que la segunda célula invasora. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la primera célula invasora ocupa, típicamente, un nicho ecológico diferente que la segunda celda invasora.
La Figura 5 es un diagrama de flujo que ilustra métodos para controlar el crecimiento de al menos una segunda célula microbiana en cultivo según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas. El método puede comprender cultivar una primera célula microbiana en un medio de cultivo que comprenda una segunda célula microbiana en condiciones en las cuales la primera célula microbiana produzca una bacteriocina a un nivel suficiente para controlar el crecimiento de la segunda célula microbiana 510. El cultivo de la primera célula microbiana opcionalmente puede mantenerse continuamente durante un período de tiempo 520. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el cultivo de la primera célula microbiana se mantiene continuamente durante al menos 3 días, por ejemplo al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500 días, incluidos intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. Un cambio en el medio de cultivo que comprenda una presencia o aumento en los niveles o la actividad de una tercera célula microbiana puede detectarse 530. La primera célula microbiana puede rediseñarse por ingeniería genética en respuesta al cambio para producir una segunda bacteriocina a un nivel suficiente para controlar el crecimiento de la tercera célula microbiana 540. La primera célula microbiana rediseñada por ingeniería genética puede cultivarse en el cultivo bajo condiciones en las cuales la primera célula microbiana produzca una bacteriocina a un nivel suficiente para controlar el crecimiento de la tercera célula microbiana 550. El cultivo de la célula microbiana rediseñada por ingeniería genética puede repetirse continuamente durante un período de tiempo 560. En algunas realizaciones, el cultivo de la célula microbiana rediseñada por ingeniería genética se mantiene continuamente durante al menos 3 días, por ejemplo, al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35,40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500 días, incluidos los intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una primera célula microbiana puede controlar el crecimiento de una segunda célula microbiana. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una primera célula microbiana puede controlar el crecimiento de una segunda célula microbiana de la misma cepa que la primera célula microbiana. Cada célula de la cepa puede comprender un polinucleótido de bacteriocina y un polinucleótido de modulador de inmunidad, de tal manera que el modulador de inmunidad, si se expresa, proteja contra la bacteriocina. Como tal, si un clon de la cepa pierde la expresión del modulador de inmunidad, se neutralizará por la actividad bacteriocina de la misma cepa. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el polinucleótido de modulador de inmunidad está en cis con respecto al polinucleótido de bacteriocina. Como tal, incluso si el polinucleótido de bacteriocina y el polinucleótido de modulador de inmunidad se eliminan (p. ej., si se pierde un plásmido o se escinde un casete FLP-FRT), la actividad de bacteriocina de otras células aún puede neutralizar la célula. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el polinucleótido de modulador de inmunidad está en trans con respecto al polinucleótido de bacteriocina. La actividad moduladora de inmunidad puede perderse cuando la célula microbiana no es deseada (por ejemplo, si se pierde un plásmido, o si una condición ambiental particular induce una pérdida de actividad moduladora de inmunidad). En consecuencia, la actividad bacteriocina de tanto la célula microbiana como además de otras células de la cepa puede inducir la neutralización de la célula microbiana.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se controla una relación de dos o más especies microbianas o cepas. Un control ilustrativo de las relaciones se ilustra en la Figura 3 (véanse las células 300 y 310). En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una primera cepa o especie microbiana pierde una actividad moduladora de inmunidad a través de cualquiera de los mecanismos descritos en la presente descripción cuando se desea menos que una segunda cepa o especie productora de bacteriocinas, lo que aumenta la relación de la segunda cepa o especie con respecto a la primera cepa o especie.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas en las cuales se controla la relación de una primera y una segunda cepa o especie, se selecciona una bacteriocina o bacteriocinas bacteriostáticas (a diferencia de bacteriocinas bactericidas) de manera que el control del crecimiento pueda ser fácilmente reversible y/o minimizar el riesgo de eliminar cualquiera de las cepas o especies. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una primera cepa o especie microbiana produce una primera bacteriocina bajo el control de un promotor que se activa en presencia de un compuesto o sustancia de interés, por ejemplo, un producto intermedio o un producto tal como una molécula industrialmente útil. Como tales, los niveles de bacteriocina aumentan a medida que aumentan los niveles del compuesto de interés. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una segunda cepa o especie microbiana produce (o cataliza la producción de) el compuesto o la sustancia de interés, pero no tiene actividad moduladora de inmunidad para la bacteriocina. A medida que aumentan los niveles del compuesto o de la sustancia de interés, aumentan los niveles de bacteriocina, neutralizando así la segunda cepa (que carece de un modulador de inmunidad adecuado o que tiene una cantidad insuficiente de un modulador de inmunidad adecuado para proteger contra la acción de la bacteriocina). Como tal, los niveles relativos de la primera cepa aumentan en comparación con la segunda cepa. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una primera cepa microbiana produce un primer producto y una primera actividad bacteriocina, y una segunda cepa microbiana produce un segundo producto y una segunda actividad bacteriocina. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el primer producto y el segundo producto son productos intermedios en la misma ruta biosintética. La primera cepa microbiana puede proporcionar una primera y una segunda actividad moduladora de inmunidad, en las cuales la segunda actividad moduladora de inmunidad puede proteger contra la segunda bacteriocina y se regula negativamente por la acumulación del primer producto (p. ej., la expresión del segundo modulador de inmunidad se reprime por la presencia del primer producto), y la primera actividad moduladora de inmunidad puede proteger contra la primera bacteriocina. La segunda cepa microbiana también puede proporcionar una primera y una segunda actividad moduladora de inmunidad, excepto que la primera actividad moduladora de inmunidad se regula negativamente por la acumulación del segundo producto (p. ej., la expresión del primer modulador de inmunidad se reprime por la presencia del segundo producto). Como tal, cuando se acumula una cantidad relativamente alta del primer producto, el segundo modulador de inmunidad en la primera cepa microbiana se inactiva, y las células microbianas de la primera cepa se neutralizan por la segunda bacteriocina, aumentando así la relación de la segunda cepa a la primera cepa, y aumentando la cantidad relativa del segundo producto con respecto al primer producto. Cuando se acumula una cantidad relativamente alta del segundo producto, el primer modulador de inmunidad en la segunda cepa microbiana se inactiva, y las células microbianas de la segunda cepa se neutralizan por la primera bacteriocina, aumentando la relación de la primera cepa a la segunda cepa y aumentando la cantidad relativa del primer producto con respecto al segundo producto. Como tal, la relación de la primera cepa a la segunda cepa puede ajustarse, dependiendo de los niveles relativos de producto. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se mantiene un equilibrio de relaciones de la primera cepa a la segunda cepa. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se mantiene un equilibrio de relaciones del primer producto al segundo producto. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el segundo modulador de inmunidad de la primera cepa microbiana responde a una primera condición ambiental o compuesto, y la relación entre la primera y la segunda cepa microbiana se controla de cualquier otra manera como se describió anteriormente. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el primer modulador de inmunidad de la segunda cepa microbiana responde a una segunda condición ambiental o compuesto, y la relación entre la primera y la segunda cepa microbiana se controla de cualquier otra manera como se describió anteriormente.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se desea que una célula microbiana esté contenida dentro de un ambiente particular, por ejemplo, de manera que la primera célula microbiana solo pueda sobrevivir en un medio de cultivo particular, tal como materia prima industrial. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula microbiana comprende un polinucleótido de bacteriocina y un polinucleótido de modulador de inmunidad, de manera que el modulador de inmunidad corresponda a la bacteriocina. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, cuando la célula microbiana está en un ambiente deseado, la célula microbiana produce una bacteriocina activa y un modulador de inmunidad correspondiente, pero cuando la célula microbiana escapa del ambiente deseado, la célula microbiana produce la bacteriocina activa, pero ningún modulador de inmunidad activo. Como resultado, la célula microbiana puede crecer en el ambiente deseado, pero se neutraliza por su propia bacteriocina cuando escapa. Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la bacteriocina codificada por el polinucleótido de bacteriocina se expresa constitutivamente, mientras que el modulador de inmunidad se expresa solo cuando la célula microbiana está en un ambiente deseado. Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la bacteriocina codificada por el polinucleótido de bacteriocina se expresa constitutivamente, mientras que el modulador de inmunidad se expresa solo cuando la célula microbiana está en un ambiente. Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un activador transcripcional del modulador de inmunidad está presente solamente en el ambiente deseado. Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la bacteriocina codificada por el polinucleótido de bacteriocina y el modulador de inmunidad se expresan constitutivamente, pero si la célula microbiana escapa, el modulador de inmunidad se elimina (por ejemplo, a través del sistema FLP-FRT). Sin limitaciones teóricas de ningún tipo, si un sistema genético para neutralizar una célula microbiana escapada no se usa dentro del propio cultivo, puede haber poca o ninguna presión selectiva para mantener el sistema dentro del cultivo, de manera que puedan acumularse mutaciones, lo que reduce o elimina el funcionamiento de ese sistema genético. Como tal, si la célula microbiana escapa del cultivo, existe una posibilidad de que el sistema genético ya no funcione. Por el contrario, se aprecia en la presente descripción que si un sistema de bacteriocina/modulador de inmunidad es útil tanto dentro de un cultivo (por ejemplo, para controlar el crecimiento de otras células diseñadas por ingeniería genética en el cultivo, como/o para neutralizar las células microbianas invasoras), y además fuera de un cultivo (por ejemplo, para neutralizar una célula microbiana que se escape del cultivo), el uso dentro del cultivo puede proporcionar presión selectiva para que el sistema bacteriocina continúe funcionando. Esta presión selectiva según algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas en la presente descripción puede minimizar la deriva genética. Esta presión selectiva según algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas en la presente descripción puede ayudar a asegurar que si la célula microbiana escapa del ambiente de cultivo deseado, el sistema de bacteriocina/modulador de inmunidad funcionará para neutralizar adecuadamente la célula que escapa. Como tal, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un solo circuito diseñado por ingeniería genética, por ejemplo, un sistema de bacteriocina/modulador de inmunidad es útil tanto para neutralizar otras células microbianas dentro de un ambiente de cultivo deseado, como para neutralizar adicionalmente una célula microbiana y/o sus clones al escapar de un ambiente de cultivo deseado. Se contempla, según algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas en la presente descripción, que cualquiera o todas las configuraciones de bacteriocinas descritas en la presente descripción pueden ajustarse de manera que, después de escapar del ambiente de cultivo deseado, el organismo microbiano que escape se neutralice por sus propias bacteriocinas (y/o bacteriocinas de su progenie directa o indirecta, y/o bacteriocinas de otra célula que escape y/o su progenie directa o indirecta).
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula microbiana puede controlar el crecimiento en dos o más maneras. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula microbiana puede realizar dos o más de las funciones descritas en la Tabla 4. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la célula microbiana usa el mismo par bacteriocina/modulador de inmunidad para dos o más funciones diferentes. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la célula microbiana usa un primer par bacteriocina/modulador de inmunidad para una primera función, y un segundo par bacteriocina/modulador de inmunidad para una segunda función. Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula microbiana puede expresar una bacteriocina que limite el crecimiento de clones de “ no expresión” que hayan perdido actividad moduladora de inmunidad en un ambiente deseado, y puede proporcionar además contención dentro del ambiente deseado al no expresar su propio modulador de inmunidad (mientras aún expresa bacteriocina) si la célula microbiana está fuera de un ambiente deseado. Una ilustración esquemática de esas dos formas de regulación del crecimiento se ilustra en la Figura 2. Por ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una primera célula microbiana puede expresar una bacteriocina que limite el crecimiento de una segunda célula microbiana y puede neutralizar además la célula invasora. Una ilustración esquemática de esas dos formas de regulación del crecimiento se ilustra en la Figura 3. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se proporcionan dos o más formas de control del crecimiento mediante el uso del mismo par bacteriocina-modulador de inmunidad. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, cada forma de control del crecimiento se proporciona con el uso de un par bacteriocina-modulador de inmunidad diferente. Por ejemplo, un primer locus de inmunidad puede estar presente en un plásmido que también incluya un polinucleótido que codifique un producto deseado. Un clon que pierda el plásmido se neutralizará por una primera bacteriocina correspondiente. Un segundo polinucleótido de modulador de inmunidad (correspondiente a un segundo modulador de inmunidad) puede integrarse en el genoma de la célula microbiana y puede silenciarse cuando la célula microbiana escape de su ambiente deseado (por ejemplo, el segundo polipéptido de modulador de inmunidad puede estar en un casete FLP-FRT que se escinda después del escape). Como tal, después del escape, la célula microbiana puede neutralizarse por la segunda bacteriocina.
Cabe destacar que algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas descritas en la presente descripción son compatibles con sistemas de veneno-antídoto. Como tal, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula microbiana, además de una bacteriocina y un modulador de inmunidad comprende además un sistema de veneno-antídoto configurado para matar o detener la célula cuando no esté en un ambiente deseado.
Puede ser útil controlar el crecimiento de dos o más tipos diferentes de células microbianas. Por ejemplo, un ambiente puede comprender, o puede comprender potencialmente, dos o más tipos diferentes de organismos microbianos no deseados. Dado que los diferentes organismos microbianos pueden tener diferente sensibilidad a las bacteriocinas (por ejemplo, al poseer diferentes perfiles de moduladores de inmunidad), una combinación de dos o más bacteriocinas (por ejemplo, un “cóctel” de bacteriocinas) puede ser útil para controlar el crecimiento de dos o más organismos microbianos. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una sola célula microbiana produce dos o más bacteriocinas diferentes, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 bacteriocinas diferentes, incluidos intervalos entre cualesquiera de dos de los valores enumerados. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se proporciona una mezcla de dos o más células microbianas que producen bacteriocina diferentes, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 células microbianas que producen bacteriocina diferentes, incluidos intervalos entre cualesquiera de dos de los valores enumerados. Opcionalmente, una o más de las células microbianas que producen bacteriocinas pueden producir dos o más bacteriocinas diferentes.
Puede ser útil que una sola célula microbiana regule el crecimiento de dos o más tipos diferentes de células microbianas. Por ejemplo, puede ser posible que un primer tipo de célula invasora posea inmunidad a un primer tipo de bacteriocina, pero no a un segundo tipo de bacteriocina. Como tal, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula microbiana comprende dos o más polinucleótidos de bacteriocina, cada uno de los cuales codifica una bacteriocina diferente (véase, p. ej., Figura 4). En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la célula microbiana comprende polinucleótidos que codifiquen al menos tres bacteriocinas diferentes, por ejemplo, al menos tres, cuatro cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete, dieciocho, diecinueve, veinte, o más bacteriocinas diferentes, incluidos intervalos entre cualesquiera de dos de los valores enumerados. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, dos o más polinucleótidos de bacteriocina están bajo el control de un solo promotor. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, cada polinucleótido de bacteriocina controlado por un solo promotor comprende su propio sitio de iniciación de la traducción. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, cada polinucleótido de bacteriocina está bajo el control de un promotor diferente. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, dos bacteriocinas diferentes están bajo el control de dos promotores diferentes, pero estructuralmente o funcionalmente idénticos.
Puede ser útil que una célula microbiana controle el crecimiento de otras células microbianas en su ambiente industrial, para ayudar a asegurar la producción uniforme de un producto industrial, independientemente de la ubicación geográfica del ambiente de cultivo. Sin limitaciones teóricas de ningún tipo, ciertos productos industriales fabricados mediante cultivo microbiano pueden tener ciertas características producidas por la flora microbiana local asociada a una cierta región (por ejemplo, El queso Camembert puede tener características particulares producidas por la flora microbiana local en Camembert, Francia, o el pan de masa madre puede tener características particulares producidas por la flora microbiana local en San Francisco, CA). Como tal, puede ser deseable controlar la flora microbiana en una materia prima particular, de manera que se pueda producir un producto industrial uniforme en una variedad de lugares geográficos. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, una célula microbiana se diseña por ingeniería genética para producir bacteriocinas para neutralizar las células microbianas invasoras que se encuentran en una variedad de ubicaciones geográficas, que pueden asegurar características del producto industrial más uniformes para el producto producido en una variedad de ubicaciones. Por ejemplo, una célula microbiana diseñada para usarse en un proceso industrial particular y para cultivarse en una primera ubicación geográfica puede diseñarse por ingeniería genética para expresar una o más bacteriocinas eficaces contra uno o más organismos invasores que se encuentren comúnmente en la primera ubicación geográfica. Una célula microbiana diseñada para usarse en el mismo proceso industrial y para cultivarse en una segunda ubicación geográfica puede diseñarse por ingeniería genética para expresar una o más bacteriocinas eficaces contra uno o más organismos invasores que se encuentren comúnmente en la segunda ubicación geográfica. Alternativamente, una célula microbiana diseñada para usarse en un proceso industrial particular y para cultivarse en dos ubicaciones geográficas diferentes puede diseñarse por ingeniería genética para expresarse en una o más bacteriocinas eficaces contra uno o más organismos invasores que se encuentren comúnmente en cada una de las dos ubicaciones geográficas.
Frecuentemente, en biotecnología industrial, el objetivo es trabajar en un proceso continuo, y se contempla que cuanto más tiempo continúe el proceso, mayor es la probabilidad de contaminación. En consecuencia, la capacidad de luchar contra los contaminantes puede ser útil para un proceso industrial continuo. Los microorganismos sintéticos diseñados en laboratorios se usan frecuentemente en procesos industriales. Como tal, puede ser útil que estos “campeones” diseñados por ingeniería genética en laboratorio luchen contra cepas microbianas invasoras no deseadas (por ejemplo, cepas naturales del ambiente y/o contaminantes cruzados de otro proceso industrial) y también controlen su posible deriva genética y escape en el ambiente. Según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas, las cepas microbianas invasoras pueden combatirse, la deriva genética puede minimizarse y el escape puede minimizarse mediante la inducción de circuitos genéticos basados en bacteriocinas suicidas.
Puede ser útil que un cultivo microbiano permanezca estable durante un período continuo de tiempo, por ejemplo, para asegurar características uniformes del producto industrial durante un período continuo de tiempo. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un cultivo se mantiene establemente, al menos en parte, mediante la neutralización mediada por bacteriocinas de células microbianas invasoras. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un cultivo se mantiene establemente, al menos en parte, mediante el control mediado por bacteriocinas de las relaciones de dos o más tipos de células microbianas desarrolladas por ingeniería genética en el cultivo. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un cultivo se mantiene establemente, al menos en parte, mediante el rediseño por ingeniería genética de una célula microbiana ya presente en el cultivo. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la célula microbiana se rediseña por ingeniería genética para añadir al menos una actividad bacteriocina adicional (por ejemplo, mediante la adición de una nueva bacteriocina, o expandiendo la expresión de una bacteriocina ya presente) para neutralizar un nuevo tipo de organismo microbiano invasivo. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la célula microbiana se rediseña por ingeniería genética para eliminar al menos una actividad bacteriocina que ya no es necesaria. Los métodos ilustrativos para mantener un cultivo estable según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas se ilustran en la Figura 5. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un cultivo estable se mantiene durante al menos aproximadamente 3 días, por ejemplo, aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500 días, incluidos intervalos entre cualesquiera de los valores enumerados.
Método para la detección de relaciones de organismos microbianos
Según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas, las relaciones de dos o más cepas o especies microbianas pueden controlarse, dependiendo de las cantidades relativas de producto y/o compuestos en el ambiente. En consecuencia, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las relaciones de las dos o más cepas o especies microbianas pueden ser indicativas de cantidades relativas del producto y/o compuestos en el ambiente. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se detectan cantidades relativas de microbios de una primera cepa o especie y una segunda cepa o especie como se describe en la presente descripción, lo que indica relaciones o cantidades relativas de un primer producto o compuesto con respecto a un segundo producto o compuesto. Las cantidades relativas de cada cepa o especie microbiana pueden detectarse en una variedad de maneras. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, cada cepa o especie comprende una secuencia única de oligonucleótidos o polipéptidos “código de barras” para facilitar la detección específica. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, cada cepa o especie comprende una bacteriocina diferente (y, por lo tanto, un polinucleótido de bacteriocina diferente), que puede servir como código de barras. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se realiza al menos uno de PCR cuantitativa, análisis de matrices de oligonucleótidos, citometría de flujo, inmunocitoquímica, hibridación in situ, ELISA, inmunoelectrotransferencia, inmunotransferencia de oligonucleótidos, o similares para determinar cantidades relativas de las dos cepas o especies microbianas diferentes.
Organismos y sistemas microbianos de protección genética
Puede ser útil que un organismo microbiano productor de bacteriocinas proteja otros organismos microbianos de organismos microbianos no deseados. En consecuencia, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se proporciona un “organismo microbiano de protección genética” (que, como abreviatura, puede mencionarse además en la presente descripción como “protección genética” ). Como se usa en la presente descripción, una “protección genética” se refiere a un organismo microbiano o colección de organismos microbianos que producen una o más bacteriocinas para proteger un organismo microbiano “protegido” que es inmune a los efectos neutralizantes de las bacteriocinas, pero que no produce las bacteriocinas. El organismo microbiano “protegido” puede llevar a cabo un proceso industrial deseado (por ejemplo, fermentación), mientras que, como se usa en la presente descripción, la propia “protección genética” no lleva a cabo el proceso industrial deseado. El organismo microbiano de protección genética puede expresar y secretar una o más bacteriocinas. Opcionalmente, el organismo microbiano de protección genética puede expresar y secretar adecuadamente una o más de las bacteriocinas. El organismo microbiano de la protección genética puede ser no sensible a las bacteriocinas producidas por la protección genética, por ejemplo, mediante la producción de modulador(es) de inmunidad a la(s) bacteriocina(s) secretada(s) por la protección genética, y/o al ser un tipo de organismo microbiano que no es sensible a la(s) bacteriocina(s) producida(s) por la protección genética (p. ej., si la protección genética comprende una levadura y secreta bacteriocinas que neutralizan específicamente bacterias particulares, tales como bacterias de ácido láctico). En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el organismo microbiano protegido produce modulador(es) de inmunidad a la(s) bacteriocina(s) producida(s) por la protección genética. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el organismo microbiano protegido no es sensible a las bacteriocinas producidas por la protección genética (p. ej., si el organismo microbiano protegido comprende una levadura, y el organismo microbiano de protección genética produce bacteriocinas que neutralizan específicamente bacterias particulares). En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el organismo microbiano protegido no está modificado genéticamente (“ no OMG”). En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el organismo microbiano protegido no es OMG, pero es de una cepa seleccionada para tener propiedades deseadas, por ejemplo, mediante presión selectiva, y/o mutagénesis clásica. Se contempla que incluso si el organismo microbiano protegido tiene propiedades industriales deseables, el organismo microbiano protegido puede ser insuficiente para combatir uno o más organismos microbianos no deseados, por ejemplo, invasores de la flora local. En consecuencia, en algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas, una protección genética protege a un organismo microbiano protegido de organismos microbianos no deseados. A manera de ejemplo, los organismos microbianos no OMG pueden ser útiles en una serie de procesos, por ejemplo, producción de alimentos, o purificación tal como depuración de agua. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, los organismos microbianos “protegidos” no OMG se seleccionan sobre la base de su capacidad de destruir uno o más contaminantes (por ejemplo, contaminantes de agua conocidos), y se proporciona una protección genética para proteger los organismos microbianos protegidos de organismos microbianos invasores no deseados conocidos o potenciales. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se proporcionan sistemas que comprenden una protección genética como se describe en la presente descripción.
Puede ser útil mantener un medio de cultivo que no contenga organismos modificados genéticamente, por ejemplo, para realizar procesos industriales particulares y/o para cumplir con ciertos estándares o especificaciones de producción. Se contempla que según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas, las protecciones genéticas puedan separarse del organismo microbiano “protegido” por una membrana que sea permeable a las bacteriocinas, pero no a los organismos microbianos de protección genética. Como tales, las bacteriocinas producidas por la protección genética pueden entrar en un medio de cultivo ocupado por los organismos microbianos protegidos y, de esta manera, proteger los organismos protegidos de uno o más organismos microbianos no deseados mientras que la protección genética permanece separada del organismo microbiano.
En la presente descripción se contempla que un medio de cultivo particular puede invadirse por y/o someterse a una variedad de organismos microbianos no deseados, que pueden ser sensibles a diferentes bacteriocinas o combinaciones de bacteriocinas. En consecuencia, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el organismo microbiano de protección genética produce dos o más bacteriocinas diferentes, por ejemplo, 2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 2, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 bacteriocinas diferentes, incluidos los intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados, por ejemplo, 2 a 100, 2 a 50, 2 a 20, 2 a 10, 5 a 100, 5 a 50, 5 a 20, 5 a 10, 10 a 100, 10 a 50, 10 a 20, 20 a 100, 20 a 50 o 50 a 100 bacteriocinas diferentes. A modo de ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética comprende una sola cepa de E. coli que produce 20 bacteriocinas diferentes. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética produce un cóctel de bacteriocinas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética comprende una mezcla de dos o más organismos microbianos productores de bacteriocinas diferentes, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 2, 30, 35, 40, 45, o 50 organismos microbianos productores de bacteriocina diferentes, para proporcionar una combinación deseada de bacteriocinas. A manera de ejemplo, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética comprende una combinación de 4 cepas de E. coli diferentes, cada una de las cuales produce 5 bacteriocinas diferentes (para un total de 20 bacteriocinas diferentes). En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética produce un cóctel de bacteriocinas que actúan selectivamente sobre una categoría particular de organismo microbiano, por ejemplo, bacterias de ácido láctico.
Puede ser útil que la protección genética se separe de un ambiente particular o medio de cultivo, por ejemplo, para mantener un ambiente de cultivo industrial o materia prima libre de organismos modificados genéticamente (OMG). En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética se separa físicamente del organismo microbiano protegido. Opcionalmente, el organismo microbiano protegido no es OMG. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética se separa temporalmente del organismo microbiano protegido. Opcionalmente, el organismo microbiano protegido no es OMG. Por ejemplo, la separación temporal según algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas puede comprender añadir la protección genética a un medio de cultivo para neutralizar organismos invasores y, posteriormente, añadir el organismo microbiano protegido al medio de cultivo. Opcionalmente, la protección genética puede neutralizarse antes de añadir el organismo microbiano protegido, por ejemplo, a través de bacteriocinas o un sistema de veneno-antídoto como se describe en la presente descripción. Opcionalmente, la protección genética puede neutralizarse por sus propias bacteriocinas, por ejemplo, al reprimir la expresión del correspondiente modulador de inmunidad o moduladores de inmunidad en la protección genética. Por ejemplo, la separación temporal según algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas puede comprender cultivar el organismo microbiano protegido en un medio de cultivo y, posteriormente añadir la protección genética al medio de cultivo.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética se ubica en un primer ambiente, y el organismo o los organismos microbianos protegidos se ubican en un segundo ambiente. El primer ambiente puede separarse de un segundo ambiente por una membrana permeable a las bacteriocinas producidas por la protección genética, pero no por la protección genética en sí. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la membrana no es permeable al organismo microbiano protegido. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el primer ambiente está en comunicación de fluidos con el segundo ambiente. Sin limitaciones teóricas de ningún tipo, se contempla que, como las bacteriocinas típicamente comprenden moléculas peptídicas estables difusibles, las bacteriocinas pueden moverse fácilmente en solución acuosa del primer ambiente al segundo ambiente. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el primer ambiente comprende una primera cámara, tanque o estanque y el segundo ambiente comprende una segunda cámara, tanque o estanque. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el segundo ambiente comprende un ambiente al aire libre. Opcionalmente, un proceso industrial, por ejemplo, fermentación, se lleva a cabo en el segundo ambiente. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el primer ambiente comprende una cápsula ubicada dentro del segundo ambiente. Una variedad de membranas son adecuadas para las disposiciones y los sistemas según realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas, siempre que las membranas sean permeables a las bacteriocinas, pero no a protecciones genéticas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la membrana comprende al menos uno de una malla, tamiz, filtro, válvula selectiva, válvula unidireccional, o membrana porosa. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la membrana comprende uno o más poros que tienen un diámetro menor que el diámetro de la protección genética. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, las bacteriocinas se difunden a través de la membrana. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el movimiento fluídico del primer ambiente al segundo ambiente impulsa el movimiento de las bacteriocinas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética se selecciona sobre la base de organismos microbianos conocidos o probablemente no deseados en el medio de cultivo. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética cambia después de un período de tiempo. Por ejemplo, en respuesta a cambios en los organismos microbianos no deseados invasores, la protección genética puede ajustarse de manera que se añadan bacteriocinas adicionales, y/o se eliminen algunas bacteriocinas.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un proceso industrial mediado por microbios existente se realiza en un nuevo lugar, que se caracteriza por uno o más organismos microbianos no deseados potenciales. Dado que los organismos microbianos del proceso industrial existente pueden no producir bacteriocinas contra algunos o todos los organismos microbianos no deseados del nuevo lugar, una protección genética productora de bacteriocinas dirigidas a organismos microbianos no deseados puede añadirse al medio de cultivo en el nuevo lugar. Como tales, las bacteriocinas de la protección genética pueden neutralizar uno o más organismos microbianos no deseados, si están presentes en el medio de cultivo.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética produce un cóctel de bacteriocinas. El cóctel de bacteriocinas puede recogerse pero no así la protección genética, y el cóctel de bacteriocinas puede ponerse en contacto con un medio de cultivo de interés. Como tal, la separación puede mantenerse entre el medio de cultivo y la protección genética. El experto en la materia apreciará que varios métodos son adecuados para separar las bacteriocinas de la protección genética, siempre que los métodos no dañen, desnaturalicen o destruyan sustancialmente las bacteriocinas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el cóctel de bacteriocinas se recolecta por filtración de la protección genética. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el cóctel de bacteriocinas se recolecta por centrifugación para separar la protección genética de las bacteriocinas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el cóctel de bacteriocinas se recolecta neutralización la protección genética. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el cóctel se almacena antes del contacto con el medio de cultivo.
La Figura 6 es un diagrama esquemático que ilustra un sistema 600 que comprende una protección genética según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas. El sistema 600 puede comprender un primer ambiente 610 y un segundo ambiente 620. Opcionalmente, el segundo ambiente 620 puede comprender una entrada 622 y/o una salida 624. Un fluido o medio de cultivo que tratar, por ejemplo, agua contaminada o materia prima, puede entrar 626 a través de la entrada 622, y salir 628 a través de la salida. El primer ambiente 610 puede separarse del segundo ambiente 620 por una membrana 630 que sea permeable a las bacteriocinas, pero no sea permeable a los organismos 640 microbianos de protección genética. El primer ambiente 610 puede comprender organismos 640 microbianos de protección genética que produzcan bacteriocinas que pueden moverse 650 entre el primer ambiente 610 y el segundo ambiente 620. El segundo ambiente 620 puede comprender organismos 660 microbianos protegidos, que no sean sensibles a los efectos neutralizantes de las bacteriocinas producidas por la protección genética 640. Opcionalmente, los organismos 660 microbianos protegidos pueden no ser OMG. Sin embargo, si hay organismos 670, 675 microbianos no deseados, los organismos 670, 675 microbianos no deseados pueden neutralizarse por las bacteriocinas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el sistema 600 comprende un sistema de tratamiento para agua contaminada. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el sistema comprende una segunda entrada 623 para que el fluido que se va a tratar entre 627 en el primer ambiente 610 antes de entrar en el segundo ambiente 620. Opcionalmente, el sistema puede comprender la segunda entrada 623 pero no la primera entrada 622. Opcionalmente, el sistema puede comprender la segunda entrada 623 y la primera entrada 622. Como tales, los organismos 640 microbianos de protección genética pueden secretar bacteriocinas para neutralizar los organismos 670, 675 invasores no deseados, mientras se mantiene la separación física entre los organismos microbianos 640 de protección genética y los organismos 660 microbianos protegidos.
La Figura 7 es un diagrama esquemático que ilustra un sistema de protección genética 700 que puede ser útil para la producción fotosintética según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas. El sistema 700 puede comprender un primer ambiente 710. Opcionalmente, el primer ambiente 710 puede comprender una entrada 715. El primer ambiente 710 y la entrada opcional 715 pueden estar en comunicación de fluidos y gases con un segundo ambiente 720. El primer ambiente 710 puede separarse del segundo ambiente 720 por una membrana 730 que sea permeable a las bacteriocinas y el gas, pero no sea permeable a los organismos 640 microbianos de protección genética. El primer ambiente 710 puede comprender organismos 640 microbianos de protección genética que produzcan bacteriocinas 740 que pueden moverse entre el primer ambiente 710 y el segundo ambiente 720. El segundo ambiente puede comprender organismos 750 microbianos fotosintéticos, por ejemplo, microalgas fotosintéticas. Opcionalmente, los organismos 750 microbianos fotosintéticos no son OMG. Una fuente de luz 760 puede estar en comunicación óptica con el segundo ambiente 720. Se contempla que la fuente de luz 760 pueda comprender luz solar y/o luz artificial. CO2 770 puede entrar en el segundo ambiente 720, y puede usarse en combinación con luz de la fuente 760 de luz para la producción fotosintética por los organismos 750 microbianos fotosintéticos. Opcionalmente, el CO2770 puede entrar en la entrada 715 del primer ambiente 710, y entrar en el segundo ambiente 720 a través de la membrana 730. Las bacteriocinas 740 producidas por los organismos 740 microbianos de protección genética pueden entrar en el segundo ambiente 720 a través de la membrana 730, y pueden neutralizar los organismos 780, 785 microbianos no deseados en el segundo ambiente. Opcionalmente, el segundo ambiente puede comprender una salida 780 y la biomasa 790 producida por el organismo 760 microbiano fotosintético puede salir del segundo ambiente 720 a través de la salida 790. Como tales, los organismos 640 microbianos de protección genética pueden secretar bacteriocinas para neutralizar los organismos 670, 675 invasores no deseados, mientras se mantiene la separación física entre los organismos 640 microbianos de protección genética y los organismos 750 microbianos fotosintéticos y la biomasa 790.
Conservación y/o almacenamiento de la materia prima
Puede ser útil almacenar una materia prima sin realizar un proceso industrial en la materia prima, por ejemplo, para acumular una reserva en caso de que se necesite más adelante una producción adicional, para disminuir la producción por el momento y/o para transportar la materia prima a un lugar diferente. Por ejemplo, una materia prima para alimentar animales puede cosecharse en el verano, y almacenarse hasta el invierno, cuando se usa para alimentar animales. Por ejemplo, una materia prima puede someterse a un ciclo inicial de fermentación para producir un componente deseado en la materia prima o para destruir o eliminar un componente deseado en la materia prima y/o para estabilizar la materia prima para el almacenamiento y, después, la materia prima puede conservarse hasta que se consuma.
En la presente descripción se contempla que los organismos microbianos no deseados puedan contaminar una materia prima durante el almacenamiento, y/o consumir o destruir uno o más componentes de la materia prima. Por ejemplo, los organismos microbianos pueden seleccionarse o diseñarse por ingeniería genética para producir glucosa a partir de celulosa en una materia prima. Sin embargo, en una materia prima que comprenda glucosa, los organismos microbianos no deseados pueden catabolizar la glucosa. En consecuencia, en algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se añade una protección genética a una materia prima para proteger la materia prima de uno o más organismos microbianos no deseados durante el almacenamiento. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la materia prima se somete a un ciclo inicial de procesamiento (p. ej., fermentación) para producir, eliminar, o destruir al menos un componente (por ejemplo, para estabilizar la materia prima para el almacenamiento y/o para proporcionar un componente deseado en la materia prima, tal como glucosa de la celulosa) y, después, la protección genética protege la materia prima de organismos microbianos no deseados posteriores. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética se separa físicamente de la materia prima por una membrana permeable a las bacteriocinas durante la fermentación y/o durante el almacenamiento. Se contempla que la neutralización mediada por bacteriocinas de organismos microbianos no deseados en una materia prima según algunas realizaciones de la presente invención según las reivindicaciones adjuntas puede permitir que una materia prima se almacene de manera estable durante largos períodos de tiempo. En algunas realizaciones, la materia prima se almacena de manera estable durante al menos un mes, por ejemplo, al menos un mes, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 meses.
En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética se pone en contacto con la materia prima. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, la protección genética ya está presente en la materia prima, y la proliferación de la protección genética se induce antes de o durante el almacenamiento de manera que la protección genética produzca bacteriocinas para neutralizar organismos microbianos no deseados en la materia prima.
Métodos para preparar y usar organismos microbianos productores de bacteriocina:
Según algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, los organismos microbianos que producen bacteriocina pueden prepararse para usar en un proceso industrial que esté sujeto a, o en riesgo de contaminación o interferencia por organismos microbianos no deseados. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se diseña un circuito para la producción deseada de bacteriocinas, se diseñan por ingeniería genética secuencias de ácido nucleico, y el circuito se ensambla e introduce en un organismo microbiano huésped.
La Figura 8 es un diagrama de flujo que ilustra métodos para preparar y usar bacteriocina. El método descrito (no según las reivindicaciones adjuntas) puede comprender identificar un conjunto de genes que codifiquen bacteriocinas que actúen selectivamente sobre organismos 810 microbianos no deseados. Una técnica para identificar genes según algunas descripciones en la presente descripción comprende identificar genes de bacteriocina mediante el uso de una base de datos electrónica, por ejemplo, bactibase, accesible en Internet en bactibase.pfba-lab-tun.org/main.php. El método puede comprender diseñar un constructo para expresar una bacteriocina, comprendiendo el constructo integrar el conjunto génico, el (los) promotor(es) y los elementos 820 reguladores genéticos. Como tal, puede diseñarse un constructo. Las técnicas para diseñar un constructo apropiado según algunas descripciones en la presente descripción pueden comprender el uso de bases de datos de partes, por ejemplo, bases de datos electrónicas tales como la base de datos de partes de la fundación Biobricks. En la presente descripción se contempla que según algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el experto en la materia puede seleccionar los componentes deseados (incluidos, aunque no de forma limitativa, nucleótidos de bacteriocina, promotores y elementos reguladores genéticos) sobre la base de sus funciones identificadas y diseñar por ingeniería genética un constructo con una funcionalidad deseada sobre la base de la funcionalidad identificada de estos componentes. A modo de ejemplo, las funcionalidades de diferentes componentes posibles pueden encontrarse en una o más bases de datos, tales como el catálogo de Biobricks. Se puede acceder a un catálogo de componentes de Biobricks en Internet en parts.igem.org. El método puede comprender diseñar por ingeniería genética el conjunto de genes con sitios 830 de integración compatibles, lo que puede permitir que los genes se ensamblen de una manera deseada y/o se introduzcan adecuadamente en un huésped deseado. Puede usarse una gran variedad de sitios de integración adecuados, por ejemplo, sitios de restricción, sustratos para una reacción de recombinación enzimática o secuencias para recombinación homóloga. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se sintetiza el conjunto de genes. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se sintetiza un ácido nucleico que comprende el conjunto de genes. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el conjunto de genes se proporciona en uno o más vectores, tales como plásmidos. El método puede comprender ensamblar los circuitos 840. Los circuitos pueden incluir uno o más ácidos nucleicos de bacteriocina y uno o más promotores y elementos reguladores adecuados. Una variedad de configuraciones de circuitos pueden ser adecuadas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un solo promotor dirige la expresión de múltiples bacteriocinas y productos génicos opcionales de interés. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, diferentes ácidos nucleicos de bacteriocina están bajo el control de diferentes promotores. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un circuito está comprendido en un solo constructo, tal como un plásmido. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, un circuito está comprendido en dos o más constructos tales como plásmidos. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, se sintetiza un ácido nucleico que comprende el circuito completo. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, el circuito se ensambla mediante el uso de técnicas convencionales de clonación molecular, o una combinación de síntesis de ácidos nucleicos y clonación molecular. Las técnicas de clonación molecular son muy conocidas por los expertos en la materia. Muchas técnicas de clonación molecular adecuadas se describen en Green and Sambrook "Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press; 4a edición. El método puede comprender introducir los circuitos en el huésped deseado 850. Los huéspedes adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, organismos microbianos de origen natural, diseñados por ingeniería genética y completamente sintéticos, incluidos, aunque no de forma limitativa, los organismos microbianos ilustrativos descritos en la presente descripción. Opcionalmente, el método incluye realizar la caracterización fenotípica 860, por ejemplo, el comportamiento de una cepa. Por ejemplo, puede ser útil seleccionar los transformantes o recombinantes deseados, confirmar que una cepa esté produciendo las bacteriocinas deseadas y/o confirmar que un circuito regulador responda a un estímulo adecuado, tal como un precursor o producto industrial. El método puede comprender la aplicación industrial que comprenda usar la cepa producida en el plan 870 de producción. Por ejemplo, una cepa productora de bacteriocinas puede introducirse en un medio de cultivo existente o puede usarse como cultivo iniciador para un nuevo medio de cultivo.
Kits
Se proporcionan kits según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, los kits contienen al menos uno de bacteriocinas, polinucleótidos de bacteriocina, moduladores de inmunidad, polinucleótidos de moduladores de inmunidad, otros elementos genéticos (tales como promotores, vectores de expresión, plásmidos de conjugación, y similares), células microbianas diseñadas por ingeniería genética, y/o medio de cultivo como se describe en la presente descripción. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, los kits contienen además un envase y/o instrucciones para el uso de su contenido. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, los kits comprenden una variedad de bacteriocinas, por ejemplo, para usar en la determinación de los efectos de una bacteriocina candidata o combinación de estas en un ambiente de cultivo. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, los kits comprenden una variedad de polinucleótidos de bacteriocina y polinucleótidos de moduladores de inmunidad, por ejemplo, para construir una célula microbiana con características deseadas. En algunas realizaciones según las reivindicaciones adjuntas, los kits comprenden una variedad de células microbianas donantes que comprenden plásmidos donantes que codifican una variedad de combinaciones de al menos una bacteriocina y/o al menos un modulador de la inmunidad.
Ejemplo 1: Protección de cianobacteria y neutralización después de escapar
Se proporciona una cianobacteria que comprende una ruta biosintética para un lípido. La cianobacteria se ha diseñado por ingeniería genética para comprender un polinucleótido de bacteriocina bajo el control de un primer promotor constitutivamente activo. La cianobacteria comprende un polinucleótido de modulador de inmunidad para un modulador de inmunidad que protege contra la bacteriocina y que está bajo el control de un segundo promotor que solo es activo en presencia de un precursor que se encuentra en una materia prima industrialmente útil. La cianobacteria se coloca en la materia prima. Mientras está produciendo lípidos en la materia prima, la cianobacteria secreta además bacteriocina activa, neutralizando así los microorganismos invasores. Después del escape de la materia prima, la cianobacteria ya no posee actividad moduladora de inmunidad, pero aun produce bacteriocina y, por lo tanto, es neutralizada por la bacteriocina.
Ejemplo 2: Protección de Bacillus, mantenimiento de un plásmido y neutralización después de escapar
Se proporciona una célula de Bacillus diseñada por ingeniería genética, que comprende un polinucleótido de bacteriocina integrado en su genoma cromosómico y un plásmido que comprende un polinucleótido de modulador de inmunidad para un modulador de inmunidad que protege contra la bacteriocina, así como un polinucleótido que codifica un polipéptido que se va a fabricar. La bacteriocina está bajo el control de un promotor constitutivo. El polinucleótido de modulador de inmunidad está bajo el control de un promotor que solo es activo en presencia de un precursor que se encuentra en la materia prima industrialmente útil. Como tal, cuando el Bacillus está en la materia prima, produce la bacteriocina para matar las células microbianas invasoras. Además, cuando los clones de Bacillus pierden el plásmido, se vuelven no deseables (ya que ya no pueden producir el polipéptido que se va a fabricar) y, como resultado de la pérdida del modulador de inmunidad, se eliminan por la bacteriocina. Después del escape de la materia prima, la célula de Bacillus ya no posee actividad moduladora de inmunidad, pero aun produce bacteriocina y, por lo tanto, es neutralizada por la bacteriocina producida por las otras células de Bacillus diseñadas por ingeniería genética en su ambiente.
.
Se proporciona una primera cepa de S. cerevisiae. La primera cepa comprende un polinucleótido de bacteriocina controlado por un primer promotor inducido por la presencia de un metabolito. Como tal, la bacteriocina se expresa mucho más a medida que aumentan los niveles del metabolito. La bacteriocina codificada detiene el ciclo celular de S. cerevisiae, pero es bacteriostática, no bacteriolítica. La primera cepa comprende además un polinucleótido de modulador de inmunidad para conferir inmunidad a la primera bacteriocina bajo el control de un promotor que se activa por un compuesto presente solamente en la materia prima industrial. Una segunda cepa asociada de S. cerevisiae comprende un polinucleótido que codifica una enzima que produce el metabolito, pero no comprende una actividad moduladora de inmunidad correspondiente. A medida que los niveles del metabolito aumentan a través de la actividad de la segunda cepa, la primera cepa produce más y más bacteriocina y, por lo tanto, detiene el ciclo celular de la segunda cepa y reduce la cantidad relativa de células de la segunda cepa disponible. Mientras tanto, la primera cepa continúa proliferando. En consecuencia, se aumenta la relación relativa de la primera cepa con respecto a la segunda cepa y se reduce la acumulación del metabolito.
Ejemplo de referencia 4: Regulación de A. ferrooxidans por E. coli
Una cepa de Acidithiobacillus ferrooxidans se diseña por ingeniería genética para producir energía almacenada a partir de la oxidación de Fe(II) a Fe(III) en una materia prima que comprende una fuente de hierro que difunde Fe(II) en la materia prima. Una cepa de E. coli se diseña por ingeniería genética para controlar el crecimiento de la primera cepa de A. ferrooxidans. La cepa de A. ferroxidans comprende un ácido nucleico que codifica Colicina-Ia (Id. de sec. n.°: 56) bajo el control de un promotor del operón rus (Id. de sec. n.°: 549) Y un ácido nucleico que codifica un modulador de inmunidad a la Colicina-Ia (Id. de sec. n.°: 464) bajo el control de un promotor constitutivo (promotor de B. subtilis etc., Id. de sec. n.°: 663). Sin embargo, la cepa de A. ferroxidans no produce ningún modulador de inmunidad a la Colicina El. La cepa de E. coli comprende un ácido nucleico que codifica a la Colicina El (Id. de sec. n.°: 54) y un modulador de inmunidad a la Colicina El (Id. de sec. n.°: 465) bajo el control de un promotor constitutivo (Id. de sec. n.°: 651) integrado en su genoma. Sin embargo, la cepa de E. coli no produce un modulador de inmunidad a la Colicina Ia (Id. de sec. n.°: 464). A medida que la A. ferroxidans oxida Fe(II) a Fe(III), disminuyen los niveles de Fe(II). Como tal, la actividad del promotor del rus disminuye, y la A. ferroxidans produce niveles más bajos de Colicina Ia (Id. de sec. n.°: 54). En consecuencia, se minimiza cualquier neutralización de la cepa de E. coli. La segunda cepa de E. coli prolifera y produce niveles más altos de Colicina El (Id. de sec. n.°: 54). La Colicina El neutraliza a la A. ferroxidans, de manera que hay menos A. ferroxidans presente para oxidar Fe(II) en Fe(III). En consecuencia, los niveles de Fe(II) aumentan nuevamente. Cuando se acumula Fe(II), la A. ferroxidans produce niveles superiores de Colicina Ia (Id. de sec. n.°: 56), neutralizando los organismos a la segunda cepa de E. coli. En consecuencia, hay un mínimo de E. coli que produce Colicina El, y la neutralización de A. ferroxidans también es mínima. La A. ferroxidans proliferan, oxidando el Fe(II) en Fe(III) y almacenando energía.
Ejemplo 5: Protección genética para la síntesis de etanol por organismo microbiano no OMG
Se usa una protección genética según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas para proteger un organismo microbiano no OMG que produce etanol de la glucosa en una materia prima. La protección genética comprende una cepa de E. coli que comprende y que expresa 20 ácidos nucleicos de bacteriocina diferentes bajo el control de un solo promotor constitutivo y, como tal, produce 20 bacteriocinas diferentes en relaciones aproximadamente estequiométricas. Se contempla, además, que según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas, otra opción adecuada es proporcionar una protección genética que comprenda cinco cepas de E. coli diferentes, cada una de las cuales comprenda y exprese cinco bacteriocinas diferentes. La protección genética se dispone en el primer ambiente 610 de un sistema como se ilustra en la Figura 6. Las bacteriocinas se difunden a través de una membrana porosa para entrar en el segundo ambiente. La membrana porosa está hecha de politetrafluoroetileno poroso que es permeable a las bacteriocinas y los líquidos, pero no es permeable a la protección genética. La S. cerevisiae fermentadora no OMG se cultiva en el segundo ambiente. La S. cerevisiae fermentadora no OMG produce etanol a partir de glucosa en la materia prima. Las bacteriocinas de la protección genética neutralizan los organismos microbianos invasores, lo que evita la contaminación de la materia prima y el consumo del etanol por organismos microbianos invasores. La membrana porosa mantiene la separación física entre la protección genética diseñada por ingeniería genética y la levadura fermentadora no OMG. Como tal, la levadura fermentadora está protegida de organismos microbianos no deseados, mientras que una parte de la materia prima está libre de OMG.
Ejemplo 6: Protección de microalgas fotosintéticas no OMG por protección genética
Se usa una protección genética según algunas realizaciones de la presente descripción según las reivindicaciones adjuntas para proteger una microalga fotosintética no OMG que produce biomasa. La biomasa puede ser adecuada para una variedad de aplicaciones corriente abajo, por ejemplo, extraer compuestos de interés, energía o alimento para animales. La protección genética comprende una mezcla de 50 cepas diferentes de B. subtilis, cada una de las cuales produce una bacteriocina diferente. La protección genética se dispone en un primer ambiente 710 acuoso de un sistema como se ilustra en la Figura 7. El sistema comprende además un segundo ambiente 720 acuoso, que contiene microalgas fotosintéticas no OMG, que producen biomasa. El primer ambiente se separa del segundo ambiente por un filtro de fibra de vidrio de 0,5pm, para permitir que el gas, el líquido, y las bacteriocinas pasen entre el primer ambiente y el segundo ambiente, mientras que bloquea el paso de la protección genética entre el primer

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Una primera célula microbiana que comprende un ácido nucleico que codifica una bacteriocina secretada que controla el crecimiento de una segunda célula microbiana y un ácido nucleico que codifica un modulador de inmunidad que confiere resistencia a dicha bacteriocina secretada, en donde dicha primera célula microbiana se ha diseñado por ingeniería genética para permitir que la expresión o actividad de dicho modulador de inmunidad que confiere resistencia a dicha bacteriocina disminuya,
    en donde la bacteriocina secretada se produce por la maquinaria de traducción de la primera célula microbiana, y
    en donde cuando la primera célula microbiana no es deseada, la expresión o actividad de la primera célula microbiana del modulador de inmunidad se reduce, y la primera célula microbiana y clones de esta secretan la bacteriocina, descartando de esta manera selectivamente la primera célula microbiana,
    en donde opcionalmente dicha segunda célula microbiana es de la misma especie o cepa que la primera célula microbiana, o es de una cepa, especie, o género diferente a dicha primera célula microbiana, y
    en donde opcionalmente dicha bacteriocina comprende una bacteriocina de origen natural o una bacteriocina sintética.
  2. 2. La primera célula microbiana de la reivindicación 1, en donde la primera célula microbiana se configura para reducir la expresión o actividad de dicho ácido nucleico que codifica el modulador de inmunidad que confiere resistencia a un nivel que provoca que dicha primera célula microbiana sea neutralizada por dicha bacteriocina, si dicha primera célula microbiana se segrega de un ambiente de crecimiento deseado.
  3. 3. La primera célula microbiana de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la expresión o la actividad del modulador de inmunidad disminuye cuando no se desea la primera célula microbiana, y en donde la disminución se provoca al inhibir la actividad de un promotor, un represor transcripcional activo, silenciamiento postranscripcional, no inducción de un ARNt regulable, silenciamiento postraduccional, escisión del ácido nucleico que codifica al modulador de inmunidad o ausencia de un vector que codifique al modulador de inmunidad.
  4. 4. La primera célula microbiana de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde cuando la expresión o actividad del modulador de inmunidad se disminuye, la bacteriocina tiene al menos uno de los siguientes efectos:
    (a) matar dicha segunda célula microbiana; o
    (b) reducir el índice de crecimiento de dicha segunda célula microbiana.
  5. 5. La primera célula microbiana de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha primera célula microbiana se ha diseñado por ingeniería genética para hacer un producto deseado, y en donde dicha bacteriocina secretada se ha seleccionado además para mantener al menos una condición dentro de un cultivo en el que dicha primera célula microbiana está produciendo dicho producto deseado, opcionalmente en donde mantener la al menos una condición dentro de un cultivo comprende presión selectiva para minimizar la deriva genética.
  6. 6. La primera célula microbiana de la reivindicación 5, en donde mantener la al menos una condición dentro de un cultivo comprende controlar el crecimiento de la segunda célula microbiana, en donde la segunda célula microbiana es un contaminante común del cultivo.
  7. 7. La primera célula microbiana de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la primera célula microbiana comprende además un segundo ácido nucleico que codifica una segunda bacteriocina secretada que controla el crecimiento de una tercera célula microbiana y tercer un ácido nucleico que codifica un segundo modulador de inmunidad que confiere resistencia a dicha segunda bacteriocina secretada, en donde dicha primera célula microbiana se ha diseñado por ingeniería genética para permitir que la expresión o actividad de dicho segundo modulador de inmunidad que confiere resistencia a dicha segunda bacteriocina secretada disminuya.
  8. 8. La primera célula microbiana según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicha primera célula microbiana se selecciona del grupo que consiste en bacterias, levaduras, y arqueas, y en donde dicha primera célula microbiana es un organismo genéticamente modificado, o completamente sintético.
  9. 9. Un sistema que comprende la primera célula microbiana y la segunda célula microbiana de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, en donde primera célula microbiana está en un primer ambiente del sistema, y dicha segunda célula microbiana está en un segundo ambiente del sistema, en donde el segundo ambiente se separa del primer ambiente por al menos uno de una membrana, una malla, un filtro o una válvula que es permeable a la bacteriocina secretada y opcionalmente es permeable a la segunda bacteriocina secretada, pero no es permeable al segundo organismo microbiano.
  10. 10. Un método para controlar el crecimiento de una segunda célula microbiana en un medio de cultivo, comprendiendo el método cultivar dicha primera célula microbiana de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 en un medio de cultivo que comprende dicha segunda célula microbiana bajo condiciones en las cuales dicha primera célula microbiana produce la bacteriocina secretada a un nivel suficiente para controlar el crecimiento de dicha segunda célula microbiana, permitiendo de esta manera que dicha bacteriocina secretada inhiba o evite la reproducción de la segunda célula microbiana.
  11. 11. El método de la reivindicación 10, que comprende además:
    detectar al menos un cambio en el medio de cultivo, comprendiendo el cambio una presencia o aumento en los niveles o la actividad de una tercera célula microbiana; y
    rediseñar por ingeniería genética la primera célula microbiana en respuesta al cambio para producir una segunda bacteriocina a un nivel suficiente para controlar el crecimiento de la tercera célula microbiana.
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