CN105658070A - 微生物的受控生长 - Google Patents

Abstract

调节微生物细胞的生长是有用的。本文的一些实施方案提供能够产生细菌素以控制微生物细胞生长的基因工程微生物细胞。在一些实施方案中，微生物细胞包含于期望的环境中。在一些实施方案中，污染性微生物细胞被中和。在一些实施方案中，第一微生物细胞类型调节第二微生物细胞类型的生长，以维持两种细胞类型的期望比例。

Description

微生物的受控生长

相关申请

本申请要求于2013年8月19日提交的美国临时申请序号61/867,510的权益，在此将其以引用的方式整体并入。

序列表参考

本申请与电子格式的序列表一同提交。所述序列表以创建的最后在2014年7月30日保存的名为20140814SGU-001-PCTSEQLIST.TXT的文档提交，其大小为380,083字节。将电子形式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。

背景

从人类历史的开端起，人类已经使用微生物有机体来产生产品，例如在加工食物如乳酪、啤酒和葡萄酒中使用微生物有机体。在过去的几个世纪里，通常通过控制发酵条件或鉴定微生物有机体的表型特征，对微生物有机体介导的生产过程进行了研究并进行放大。

目前，许多产品都是利用涉及微生物有机体的生产过程生产的。在实验室，以及在一些药物制造过程中，可以在无菌、受控的环境中培养微生物有机体，包括基因工程化的微生物有机体。另一方面，用于涉及微生物的多种工业生产过程的给料不是无菌的，并且可能含有多种微生物菌株和物种。由此，用于实验室和制药过程的基因工程化的微生物不一定适用于如工业生产过程的生产过程，所述工业生产过程涉及利用给料或者在可能污染培养物的环境中被暴露于其它微生物，以及还可能涉及改变环境条件。本文描述了这样的微生物，其被工程化以控制它们自身的生长和其它微生物的生长和/或以响应它们环境中的改变。此类微生物适合在未经灭菌的、较不严格的受控给料中生长。此类微生物可用于在一系列不同的给料和环境中，稳定、一致地产生期望的产品。

领域

本文的实施方案一般地涉及微生物生长的控制。更具体而言，本文的一些实施方案涉及被工程化以用于响应培养环境中其它微生物和/或条件的可调节生长的微生物以及制备和利用此类工程化的微生物的方法。

概述

提供的本文公开的一个实施方案包括第一微生物细胞，其包含编码控制第二微生物细胞生长的分泌的细菌素的核酸，以及赋予抗所述分泌的细菌素抗性的核酸，其中将所述第一微生物细胞已被基因工程化以允许调节赋予抗细菌素抗性的核酸的表达或活性。根据该实施方案的一些方面，将赋予抗细菌素抗性的核酸的表达或活性降低至引起所述第一微生物细胞被所述细菌素中和的水平，如果第一微生物细胞从期望的生长环境中释放的话。根据该实施方案的一些方面，将所述第一微生物细胞基因工程化以生产期望的产物。根据该实施方案的一些方面，进一步选择分泌的细菌素以维持其中第一微生物细胞产生所期望的产物的培养中的至少一项条件。根据该实施方案的一些方面，所述培养包含至少一种入侵的微生物有机体。根据该实施方案的一些方面，所述培养的至少一项条件包括控制第二微生物细胞的生长，其中所述第二微生物细胞是所述培养的常见污染。根据该实施方案的一些方面，第二微生物细胞是与第一微生物细胞不同的菌株、物种或属。根据该实施方案的一些方面，微生物细胞还包含编码控制第三微生物细胞生长的第二分泌的细菌素的核酸以及赋予抗分泌的第二细菌素抗性的核酸，并且所述第一微生物细胞还已被基因工程化以允许调节赋予抗细菌素的抗性的核酸的表达或活性。根据该实施方案的一些方面，所述细菌素杀死第二微生物细胞。根据该实施方案的一些方面，所述细菌素降低了第二微生物细胞的生长速率。根据该实施方案的一些方面，所述细菌素阻止了第二微生物细胞的生长。根据该实施方案的一些方面，赋予抗细菌素抗性的核酸的转录受可调节的启动子的控制。根据该实施方案的一些方面，由赋予抗细菌素抗性的核酸编码的多肽的活性是可调节的。根据该实施方案的一些方面，编码细菌素的核酸位于微生物细胞的染色体上。根据该实施方案的一些方面，赋予抗细菌素抗性的核酸位于质粒上。根据该实施方案的一些方面，编码细菌素的核酸位于微生物细胞的染色体上，并且赋予抗细菌素抗性的核酸位于质粒上。根据该实施方案的一些方面，编码细菌素的核酸和赋予抗细菌素抗性的核酸位于一个或多个质粒上。根据该实施方案的一些方面，第一微生物细胞选自：细菌、酵母和藻类，例如光合微藻。

本文描述的另一实施方案包括控制培养基中的第二微生物细胞生长的方法，其中所述方法包括在第一微生物细胞产生足以控制第二微生物细胞生长的水平的细菌素的条件下，在包含第二微生物细胞的培养基中培养如本文所述的第一微生物细胞。根据该实施方案的一些方面，将所述培养连续维持至少30天，例如至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450或500天。根据该实施方案的一些方面，所述方法还包括检测培养基中的至少一种变化，以及响应所述变化而将第一微生物细胞再工程化，从而产生足以控制第三微生物细胞生长的水平的第二细菌素，所述变化包括第三微生物细胞的水平或活性的存在或增加。

提供的本文公开的另一实施方案包括检测培养物中的分子的存在、不存在或其量的方法。所述方法可以包括在受遗传上可调控的启动子控制的条件下，培养包含细菌素的第一基因工程化微生物细胞。在一些实施方案中，所述可调节的启动子受上述分子调节，以使(a)所述可调节的启动子在所述分子存在的情况下驱动转录，而在不存在所述分子的情况下不驱动转录；或(b)所述可调节的启动子在所述分子不存在的情况下驱动转录，而在所述分子存在的情况下不驱动转录。所述方法可以包括从培养物中分离一定量的第一微生物细胞的基因组核酸。所述方法可以包括由所述一定量的基因组核酸检测第一微生物细胞特有的核酸序列的存在、不存在或其量。根据该实施方案的一些方面，所述方法还包括将第一微生物细胞特有的核酸序列的量与参考核酸序列的量进行比较。

本文公开的另一实施方案包括基因工程载体，所述载体包含赋予针对细菌素的抗性的核酸，其中所述核酸的表达或活性被配置为响应给料中组分的存在、水平或不存在而改变。根据该实施方案的一些方面，所述载体还包含编码细菌素的核酸。根据该实施方案的一些方面，所述载体还包含编码期望的产物的核酸。

本文公开的另一实施方案包括试剂盒，其可以包含多种基因工程化微生物有机体菌株，其中每一菌株已被基因工程化以允许调节赋予针对不同的细菌素的抗性的核酸的表达或活性。

本文公开的另一实施方案包括鉴定调节工业培养基中的至少一种微生物细胞生长的至少一种细菌素的方法，其中所述方法包括将所述工业培养基与含有所述至少一种细菌素的培养基或组合物接触；以及确定所述至少一种细菌素对至少一种微生物细胞的生长是否有期望的作用。根据该实施方案的一些方面，所述方法包括将所述工业培养基与由如本文所述的第一微生物细胞产生的至少一种细菌素接触。根据该实施方案的一些方面，所述由第一微生物细胞产生的至少一种细菌素存在于从包含第一微生物细胞的培养物中获得的上清液中。根据该实施方案的一些方面，所述方法还包括构建基因工程化微生物细胞以产生已被确定对至少一种微生物细胞的生长具有期望的作用的至少一种细菌素。根据该实施方案的一些方面，所述至少一种微生物细胞是为工业培养基的常见入侵者的有机体。根据该实施方案的一些方面，所述至少一种微生物细胞是新近入侵已有工业培养物的有机体。

本文公开的另一实施方案包括用于中和培养基中的非期望的微生物有机体的系统。所述系统可以包含含有培养基的第一环境以及含有分泌两种或更多种不同的细菌素的第二微生物有机体的第二环境，其中所述第二微生物有机体含有针对所述两种或更多种不同的细菌素中每一种的免疫调节剂，其中所述第二环境与所述第一环境流体连通，其中所述第二环境与所述第一环境物理上分离以使所述第二微生物有机体不能从第二环境移动至第一环境，以及其中所述分泌的两种或更多种不同的细菌素进入第一环境的培养基中。根据该实施方案的一些方面，所述系统在培养基中还包含第一微生物有机体，其中所述第一微生物有机体不分泌所述两种或更多种不同的细菌素，以及其中所述第一微生物有机体未被两种或更多种不同的细菌素中任一者所中和。根据该实施方案的一些方面，所述第一微生物有机体是非-GMO。根据该实施方案的一些方面，所述第一微生物有机体使培养基中的组分进行发酵。根据该实施方案的一些方面，所述第一微生物有机体消除培养基的污染。根据该实施方案的一些方面，所述第一微生物有机体进行光合作用，并且所述光合作用包含包含在所述培养基的底物。根据该实施方案的一些方面，所述第二环境与所述第一环境通过可透过两种或更多种不同的细菌素而不可透过第二微生物有机体的下述中的至少一种分离：膜、网、过滤器或者瓣膜。根据该实施方案的一些方面，所述第二微生物有机体分泌至少3种细菌素，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种细菌素。根据该实施方案的一些方面，所述第二环境包含不同于所述第二微生物有机体且也分泌细菌素的至少第三微生物有机体。根据该实施方案的一些方面，所述第三微生物有机体分泌至少2种细菌素，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种细菌素。本文公开的另一实施方案包括储存给料的方法。所述方法可以包括提供给料，提供第一微生物有机体，将所述给料与所述细菌素接触，以及将所述给料储存所需的时间段，其中所述第一微生物有机体分泌两种或更多种不同的细菌素。根据该实施方案的一些方面，将给料与细菌素接触包括将给料与微生物有机体接触。根据该实施方案的一些方面，将给料与细菌素接触包括将微生物有机体置于与所述给料的流体连通中，同时维持微生物有机体与给料的物理性分离，以使细菌素与给料接触，但所述微生物有机体不与给料直接接触。根据该实施方案的一些方面，通过可透过两种或更多种不同的细菌素而不可透过第一微生物有机体的下述中的至少一种或多种维持分离：膜、网、过滤器或者两种或更多种不同的细菌素可透过而第一微生物有机体不可透过的瓣膜。根据该实施方案的一些方面，所述方法还包括在将给料与细菌素接触之前或者同时，用第二微生物有机体发酵给料。根据该实施方案的一些方面，所述发酵包括在给料中产生期望的组分或者从给料中移除非期望的组分中的至少一项。根据该实施方案的一些方面，所述所需的时间包括至少1个月，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。根据该实施方案的一些方面，所述所需的时间包括至少6个月，例如6、7、8、9、10、11或12个月。根据该实施方案的一些方面，所述第一微生物有机体分泌至少3种细菌素，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种细菌素。

附图简要说明

图1为描述根据本文的一些实施方案，配置微生物细胞以控制第二微生物细胞生长的选项的流程图。

图2A为阐明根据本文的一些实施方案，第一微生物细胞控制其它微生物细胞的生长的示意图。图2B为阐明根据本文的一些实施方案，当第一微生物细胞不再处于期望的生长环境时，控制第一微生物细胞的生长的示意图。

图3为阐明根据本文的一些实施方案，第一微生物细胞控制第二微生物细胞的生长并中和期望的环境中的入侵细胞的示意图。

图4为阐明根据本文的一些实施方案，在期望的环境中，第一微生物细胞用第一抗菌素中和第一入侵细胞并用第二细菌素中和第二入侵细胞的示意图。

图5为阐明根据本文的一些实施方案，控制培养物中的至少第二微生物细胞生长的方法的流程图。

图6为阐明根据本文的一些实施方案的包含遗传防护者的系统的示意图。

图7为阐明根据本文的一些实施方案的可以用于光合生产的遗传防护系统的示意图。

图8为阐明根据本文的一些实施方案产生并利用细菌素的方法的流程图。

详细描述

根据本文的一些实施方案，提供了基因工程化的微生物有机体。在一些实施方案中，将微生物有机体工程化以控制环境中微生物群体(如利用给料的那些)的生长。如本文所使用的，细菌素的“中和”活性(和同一根词的变体)可以指微生物繁殖的阻止或细胞毒性。可将微生物有机体工程化以产生细菌素，所述细菌素是能够中和微生物的分泌的多肽。然而，产生细菌素免疫调节剂的微生物有机体能够抵抗某些细菌素。因此，在一些实施方案中，将第一微生物有机体进行工程化以分泌细菌素。在一些实施方案中，基于下述选择特定的细菌素：微生物细胞的类型、被调节的微生物细胞的类型、培养基的组成或者地理位置(例如，以靶向与特定类型的培养基和/或地理位置相关的特定污染性微生物有机体)。具有针对特定环境的期望特性的其它微生物有机体能够产生细菌素免疫调节剂(因此在细菌素存在的情况下存活)，而非期望的其它微生物有机体(例如污染物、丧失了期望的特性的微生物有机体或者参与工业生产过程但是在主导条件下其生长或特定产物的生产是非期望的有机体)不能产生细菌素免疫调节剂，并因此被所述细菌素中和。

微生物有机体

根据一些方面，提供了基因工程化微生物。本文使用的基因工程化“微生物有机体”、“微生物”以及这些根词的变体(如其复数等)包含任何天然存在的物种或完全合成的原核或真核单细胞生物以及古菌物种的遗传修饰。因此，该表述可以指细菌物种、真菌物种以及藻类的细胞。

根据本文的实施方方案，可以使用的示例性微生物包括但不限于：细菌、酵母和藻类，例如光合微藻。此外，可以合成完全合成的微生物基因组，并将其移植进单个的微生物细胞内，从而产生能够连续自我复制的合成微生物(参见Gibsonetal.(2010),“CreationofaBacterialCellControlledbyaChemicallySynthesizedGenome,”Science329:52-56，在此以引用的方式将其整体并入)。由此，在一些实施方案中，微生物是完全合成的。可以在期望的框架上，将遗传组件(包括调节基因表达的组件和编码基因产物(例如细菌素、免疫调节剂、毒物、解毒剂以及工业上使用的分子)的组件)的期望组合组装进部分或完全合成的微生物中。用于工业应用的基因工程化微生物有机体的描述还可以在Wright,etal.(2013)“Building-inbiosafetyforsyntheticbiology”Microbiology159:1221-1235中找到。

根据本文的实施方案，可以使用多种细菌菌种和菌株，以及可以提供遗传修饰的变体或基于已知菌种框架的合成的细菌。根据本文的实施方案，可以使用的具有工业应用特性的示例性的细菌包括但不限于：芽孢杆菌属菌种(例如凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis))、类芽孢杆菌属菌种、链霉菌属菌种、微球菌属菌种、棒状杆菌属菌种、醋杆菌属菌种、蓝藻属、沙门氏菌属菌种、红球菌属菌种、假单胞菌属菌种、乳杆菌属菌种、肠球菌属菌种、产碱菌属菌种、克雷伯氏菌属菌种,类芽孢杆菌属菌种、节杆菌属菌种、棒状杆菌属菌种、短杆菌属菌种、水生栖热菌(Thermusaquaticus)、施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)、热纤梭菌(Clostridiumthermocellus)以及大肠杆菌(Escherichiacoli)。

根据本文的实施方案，可以使用多种酵母菌种和菌株，并且可以提供遗传修饰的变体或基于已知菌种框架的合成的酵母。根据本文的实施方案可以使用的具有工业应用特性的示例性的酵母包括但不限于：酵母属菌种(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、贝酵母(Saccharomycesbayanus)、鲍氏酵母菌(Saccharomycesboulardii))、假丝酵母属菌种(例如产朊假丝酵母(Candidautilis)、克鲁斯假丝酵母(Candidakrusei))、裂殖酵母属菌种(例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、日本裂殖酵母(Schizosaccharomycesjaponicas))、毕赤酵母属或汉逊酵母属菌种(例如毕赤酵母(Pichiapastoris)或多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha))以及酒香酵母属菌种(例如克劳森酒香酵母(Brettanomycesclaussenii))。

根据本文的实施方案，可以使用多种藻类菌种和菌株，并且可以产生遗传修饰的变体或基于已知菌种框架合成的藻类。在一些实施方案中，所述藻类包括光合微藻。可以用于生物燃料并且根据本文的实施方案可以使用的示例性的藻类菌种包括：布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)、小球藻属菌种、特氏杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)、江蓠属菌种、颗石藻(Pleurochrysiscarterae)以及马尾藻属菌种。此外，许多藻类可以用于食物产品、肥料产品、废物中和、环境修复和碳水化合物的生产(例如，生物燃料)。

细菌素

本文使用的“细菌素”及该根词的变体指这样的多肽：其由宿主细胞分泌并且能够中和除产生所述多肽的个体宿主细胞之外的至少一种细胞，所述至少一种细胞包括与宿主细胞同源关联的细胞和其它微生物细胞。本文使用的“细菌素”还包含无细胞或化学合成形式的此种多肽。表达特定的“免疫调节剂”的细胞(本文更加详细地进行了讨论)对于特定细菌素或一类细菌素的中和作用是免疫的。由此，细菌素能够中和产生细菌素的细胞和/或其它微生物细胞，只要这些细胞不产生适当的免疫调节剂。由此，宿主细胞可以通过分泌细菌素而对多种其它微生物有机体发挥细胞毒性或生长抑制作用。在一些实施方案中，微生物细胞通过翻译机构(例如核糖体等)产生细菌素。在一些实施方案中，通过化学方法合成细菌素。一些细菌素可以来源于多肽前体。所述多肽前体可以经历剪切(例如蛋白酶处理)以获得细菌素自身多肽。由此，在一些实施方案中，细菌素由前体多肽产生。在一些实施方案中，细菌素包含经历翻译后修饰(例如剪切或添加一个或多个官能团)的多肽。

“抗生素”及该根词的变体指能够杀死至少一种微生物细胞或者阻止至少一种微生物细胞的生长的代谢途径的代谢物或中间体。一些抗生素可由微生物细胞产生，例如细菌。一些抗生素可以化学合成。应当理解，细菌素与抗生素的区别至少在于细菌素指基因产物(在一些实施方案中，其经历另外的翻译后加工)或其合成类似物，而抗生素指代谢途径的中间体或产物或者其合成的类似物。

细菌素的中和活性可以包括阻止微生物繁殖或细胞毒性。一些细菌素具有细胞毒活性(例如“杀菌剂”效应)，因此能够杀死微生物有机体，例如细菌、酵母、藻类、合成的微生物等。一些细菌素能够例如通过阻止细胞周期抑制微生物有机体的繁殖(例如“抑菌”效应)，例如细菌、酵母、藻类、合成的微生物等。

应当注意，已经提议将非细菌素方法靶向不同的微生物有机体。例如，已经提议将KAMORAN^TM化学制品靶向乳酸菌(LAB)家族的细菌(参见UnionNationaledesGroupementsdeDistillateursD’Alcool,(2005)“Kamoran”)。应当注意，还提议将噬菌体靶向LAB家族的细菌(参见美国公开号2010/0330041)。应当注意，已经提议将杀虫剂靶向不同的污染性微生物有机体(参见McBrideetal.,“ContaminationManagementinLowCostOpenAlgaePondsforBiofuelsProduction”IndustrialBiotechnology10:221-227(2014))。然而，相对于化学制品、杀虫剂或噬菌体，细菌素可以提供多种优势。例如，细菌素可以避免给料中可能的毒性径流或副产品。例如，针对特定非期望的微生物有机体，细菌素可以具有比噬菌体、化学制品或杀虫剂更高的效力。例如，细菌素可以由经历对数生长的微生物有机体产生，因此能够容易地按比例增加或按比例降低，而噬菌体或化学制品/杀虫剂系统的增减性更加受限。例如，细菌素可以允许精确控制哪些有机体被中和，哪些不被中和，例如以避免培养基中的工业上可用的微生物有机体的中和。例如，噬菌体难于以工业规模生产，并且也难于控制，因为噬菌体具有传染性，能够引起基因调控的问题，以及因为噬菌体的保存很难。另一方面，根据本文的一些实施方案的细菌素可以组成工业过程的一部分，因此能够参与基因遏制和/或通过抑菌活性控制发酵过程。此外，可以通过免疫控制调整参与工业过程的微生物有机体的敏感性。此外，对于工业应用(如人或动物食品)而言，细菌素通常具有低水平的毒性，并且考虑根据本文的一些实施方案的细菌素适合用作食品防腐剂，如添加剂。

在一些实施方案中，基于期望的微生物调节的类型选择具体的中和活性(例如细胞毒性或阻止微生物繁殖)。由此，在一些实施方案中，将微生物细胞工程化以表达特定的细菌素或细菌素的组合。例如，在一些实施方案中，基于被调节的细胞，将微生物细胞工程化以表达特定的细菌素。在一些实施方案中，例如如果要杀死污染性细胞，则提供至少一种细胞毒性细菌素。在一些实施方案中，选择这样的细菌素或细菌素的组合：其对于通常存在于特定的培养物中或特定的地理位置，或者生长于特定的地理位置的特定类型的培养物中的污染物是有效的。在一些实施方案中，例如在其中微生物细胞比例的可逆调节是期望的实施方案中，提供抑制微生物繁殖的细菌素。在不受任何具体的理论限制的情况下，许多细菌素可以具有针对微生物有机体的中和活性，所述微生物有机体通常占据与产生所述细菌素的物种相同的生态位。由此，在一些实施方案中，当期望特定的细菌素活性范围时，从与所述细菌素靶向的一种或多种微生物有机体占据相同(或类似)的生态位的宿主物种中选择细菌素。

在一些实施方案中，在培养生长之前选择一种或多种细菌素活性，并且将一种或多种微生物有机体工程化以产生期望的培养环境。在一些实施方案中，可以基于它们中和可能试图在特定的培养物中生长的一种或多种入侵生物的能力来选择细菌素。在另一实施方案中，在菌株A产生中间体A，且菌株B将中间体A转化为中间体B的工业环境中，可将菌株A和B工程化，从而使得大量的中间体A通过产生使菌株A的生长在这些条件下被抑制或阻止的细菌素活性特性而将平衡移向利于菌株B，，而缺乏中间体A则将通过产生使菌株B的生长被抑制或阻止的细菌素活性特性将平衡移向利于菌株A。在一些实施方案中，基于现有的培养环境的一项或多项条件选择一种或多种细菌素活性。例如，如果在培养环境中鉴定出特定的入侵物，则可将“中和剂”微生物工程化以产生细菌素，从而中和鉴定的入侵物。在一些实施方案中，例如如果微生物细胞培养物中特定微生物细胞类型的生长太高，向现有的培养物中添加产生细菌素的基因工程细胞以使培养物重新平衡。在一些实施方案中，向现有的培养物中添加产生细菌素的基因工程细胞以中和培养物中的全部或基本全部微生物细胞，例如以消除培养环境中的工业培养物，从而可向培养环境中引入新的工业培养物。

例如，在一些实施方案中，抗真菌活性(如抗酵母活性)是期望的。已经鉴定了多种具有抗真菌活性的细菌素。例如，来自芽孢杆菌属的细菌素已经显示具有针对酵母菌株的中和活性(参见AdetunjiandOlaoye(2013)MalaysianJournalofMicrobiology9:130-13，在此以引用的方式将其整体并入)，粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)肽(WLPPAGLLGRCGRWFRPWLLWLQSGAQYKWLGNLFGLGPK,SEQIDNO:1)已经显示具有针对假丝酵母菌种的中和活性(参见ShekhandRoy(2012)BMCMicrobiology12:132，在此以引用的方式将其整体并入)，以及来自假单胞菌属的细菌素已经显示具有针对如下述真菌的中和活性：新月弯孢(Curvularialunata)、镰刀菌属(Fusarium)菌种、长蠕孢霉属(Helminthosporium)菌种以及双极霉属(Biopolaris)菌种(ShalaniandSrivastava(2008)TheInternetJournalofMicrobiology.Volume5Number2.DOI:10.5580/27dd–可在万维网archive.ispub.com/journal/the-internet-journal-of-microbiology/volume-5-number-2/screening-for-antifungal-activity-of-pseudomonas-fluorescens-against-phytopathogenic-fungi.html#sthash.d0Ys03UO.1DKuT1US.dpuf获得，在此以引用的方式将其整体并入)。以示例的方式，来自枯草芽孢杆菌的杀葡孢菌素AJ1316(参见Zuber,Petal.(1993)PeptideAntibiotics.InBacillussubtilisandOtherGram-PositiveBacteria:Biochemistry,Physiology,andMolecularGeneticsedSonensheinetal.,pp.897-916,AmericanSocietyforMicrobiology，在此以引用的方式将其整体并入)和alirinB1(参见Sheninetal.(1995)AntibiotKhimioter50:3-7，在此以引用的方式将其整体并入)已经显示具有抗真菌活性。由此，在一些实施方案中，例如在其中中和真菌微生物有机体是期望的实施方案中，细菌素包括杀葡孢菌素AJ1316或alirinB1中的至少一种。

例如，在一些实施方案中，蓝细菌培养物中的细菌素活性是理想的。在一些实施方案中，提供细菌素以中和蓝细菌。在一些实施方案中，提供细菌素以中和通常在蓝细菌培养环境中发现的入侵的微生物有机体。已经在多种蓝细菌菌种中鉴定了保守的细菌素多肽簇。例如，如Wangetal.(2011),GenomeMiningDemonstratestheWidespreadOccurrenceofGeneClustersEncodingBacteriocinsinCyanobacteria.PLoSONE6(7):e22384中所报道的(在此以引用的方式将其整体并入)，已经在至少43种蓝细菌菌种中鉴定了至少145种推定的细菌素基因簇。示例性的蓝细菌细菌素显示于表1.2中，如SEQIDNO420、422、424、426、428、30、432、434、436、438、440、442、444、446、448以及450。

在一些实施方案中，宿主细胞自身为微生物细胞。在一些实施方案中，细菌素中和不同于宿主细胞的菌种或菌株的细胞。在一些实施方案中，如果与宿主细胞相同的菌种或菌株的细胞缺乏合适的免疫调节剂，则细菌素中和这些细胞。由于细菌素能够介导宿主微生物有机体和非宿主微生物有机体这两种有机体的中和，技术人员将容易地理解细菌素不同于涉及宿主微生物仅可中和自身的内源性机制的毒物-解毒剂系统(本文更加详细地进行了描述)。换言之，细菌素能够中和除其产生细胞之外的细胞(例如，细菌素可被选择和/或工程化以作为生态位保护者发挥作用)，而毒物分子仅杀死产生它们的个体细胞(例如，作为自杀系统发挥作用)。

已经鉴定并表征了多种细菌素。在不受任何具体理论限制的情况下，可将示例性的细菌素分类为通常经历翻译后修饰的“I类”细菌素，和通常未修饰的“II类”细菌素。此外，各类中的示例性细菌素可以被分类为各种亚群，如表1.1中所总结的，其源自Cotter,P.D.etal.“Bacteriocins-aviablealternativetoantibiotics”NatureReviewsMicrobiology11:95-105，在此以引用的方式将其整体并入。

在不受任何具体理论限制的情况下，细菌素可以以多种方式影响靶标微生物细胞的中和。例如，细菌素可以将细胞壁通透，因而将细胞壁去极化并干扰呼吸。

表1.1：示例性细菌素的分类

根据本文的实施方案，可以使用多种细菌素。示例性的细菌素显示于表1.2中。在一些实施方案中，提供了包含表1.2的多肽序列的至少一种细菌素。如表1.2中所示，一些细菌素作为分子对发挥功能。由此，应当理解，除非另外明确声明，当本文讨论功能性的“细菌素”或“提供细菌素”等时，包括功能性的细菌素对以及单独发挥功能的细菌素。关于表1.2，括号中列出的“来源有机体”指示已知产生标明的细菌素的有机体的别称和/或菌株信息。

本文的实施方案还包括与表1.2中所述的细菌素具有同一性的肽和蛋白。术语“同一性””意为包括核酸或蛋白序列同源性或三维同源性。存在一些确定核酸或多肽序列同源性和/或与多肽的三维同源性的技术。这些方法被常规使用以发现一条序列、结构域或模型具有的与靶序列、结构域或模型的同一性程度。大范围的功能性细菌素可以包含本文公开的细菌素的特征，因而提供了与表1.2中的细菌素的很大程度的同一性。在一些实施方案中，细菌素与表1.2中的任何一种多肽具有至少约50％的同一性，例如，至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。可以利用BLAST软件(Altschul,S.F.,etal.(1990)"Basiclocalalignmentsearchtool."J.Mol.Biol.215:403-410，可在万维网blast.ncbi.nlm.nih.gov获得)和缺省参数来确定同一性百分比。

在一些实施方案中，提供了编码如本文所述的细菌素的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含于表达载体中。在一些实施方案中，所述多核苷酸或表达载体在微生物细胞内。编码表1.2中的多肽的示例性的多核苷酸序列显示于1.2中。SEQIDNO：341至419(奇数序列标识号)代表基于各自多肽的逆向翻译的示例性多核苷酸。技术人员将会容易地理解，多种多核苷酸可以编码特定的多肽。例如，遗传密码简并，此外密码子的使用也可以根据其中基因产物被表达的特定有机体发生变化。在一些实施方案中，基于表达细菌素的有机体的密码子的使用来选择编码细菌素的多核苷酸。在一些实施方案中，编码细菌素的多核苷酸为基于表达所述细菌素的特定的有机体进行优化的密码子。

尽管表1.2中的细菌素是天然存在的，但是技术人员会理解，根据本文的一些实施方案可以使用表1.2中的细菌素的变体、除表1.2中的细菌素之外的天然存在的细菌素或其变体，或者合成的细菌素。在一些实施方案中，此类变体相对于野生型蛋白对相同或不同的微生物或微生物物种具有增加的或降低的细胞毒性或生长抑制活性水平。一些基序被认为是细菌素的特征。例如，基序YGXGV(SEQIDNO:2)是IIa类细菌素特有的N-端共有序列，其中X是任意氨基酸残基。因此，在一些实施方案中，合成的细菌素包含与SEQIDNO:2具有至少50％的同一性的N-端序列，例如与SEQIDNO:2具有至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，合成的细菌素含有包含SEQIDNO:2的N-端序列。此外，一些IIb类细菌素含有GxxxG基序。在不受任何具体理论限制的情况下，GxxxG基序被认为能够介导细胞膜中螺旋蛋白之间的关联，例如通过细胞膜相互作用促进细菌素介导的中和作用。由此，在一些实施方案中，细菌素含有促进与细胞膜的相互作用的基序。在一些实施方案中，细菌素含有GxxxG基序。任选地，含有GxxxG基序的细菌素可以包含螺旋结构。除本文所述的结构外，本文使用的“细菌素”还包含对微生物细胞具有与本文明确提供的任何细菌素基本相同的作用的结构。

已经显示，与任一单独的细菌素相比，含有两种或更多种细菌素或其部分的融合多肽可以具有针对更宽范围的微生物有机体的中和活性。例如，已经显示杂种细菌素Ent35–MccV(GKYYGNGVSCNKKGCSVDWGRAIGIIGNNSAANLATGGAAGWKSGGGASGRDIAMAIGTLSGQFVAGGIGAAAGGVAGGAIYDYASTHKPNPAMSPSGLGGTIKQKPEGIPSEAWNYAAGRLCNWSPNNLSDVCL，SEQIDNO:3)显示出针对病原性革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的抗微生物活性(etal.(2012),FEBSOpenBio,2:12-19)。应当注意，该Ent35-MccV融合细菌素从N-端至C-端包含N-端甘氨酸、肠道菌素CRL35、含有三个甘氨酸的连接子以及C-端小菌素V。本文考虑包含具有细菌素活性的两种或更多种多肽的融合的细菌素。在一些实施方案中，提供了两种或更多种细菌素的融合多肽。在一些实施方案中，所述两种或更多种细菌素包含来自表1.2的多肽或其修饰。在一些实施方案中，包含两种或更多种细菌素的融合多肽比任一种单独的细菌素具有更宽范围的活性，例如具有针对更多微生物有机体的中和活性、更宽范围的环境条件下的中和活性，和/或更高效的中和活性。在一些实施方案中，提供了两种或更多种细菌素的融合物，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种细菌素。在一些实施方案中，将两种或更多种细菌素多肽通过共价键(例如肽键)互相融合。在一些实施方案中，连接子位于两种细菌素多肽之间。在一些实施方案中，连接子包含一个或多个甘氨酸，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个甘氨酸。在一些实施方案中，连接子在细胞内被剪切以产生融合蛋白中含有的单独的细菌素。在一些实施方案中，将本文提供的细菌素修饰以提供相对于未修饰的细菌素的期望的活性谱。例如，修饰的细菌素可以具有与未修饰的细菌素相同的针对有机体的增强或降低的活性。可选地，修饰的细菌素可以具有针对有机体的增强的活性，其中未修饰的细菌素对所述有机体具有较低活性或无活性。

表1.2：示例性细菌素

本文使用的“细菌素多核苷酸”指编码细菌素的多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞含有至少一种细菌素。

细菌素免疫调节剂

示例性的细菌素免疫调节剂显示于表2中。尽管表2中的免疫调节剂是天然存在的，技术人员会理解，根据本文的一些实施方案可以使用表2中的免疫调节剂的变体、除表2中的免疫调节剂之外的天然存在的免疫调节剂或者合成的免疫调节剂。

在一些实施方案中，特定的免疫调节剂或免疫调节剂的特定组合赋予针对特定的细菌素、细菌素的特定种类或分类或者细菌素的特定组合的免疫性。表2中鉴定了免疫调节剂能够赋予针对其的免疫性的示例性细菌素。尽管表2鉴定了示例性免疫调节剂的“来源有机体”，但是根据本文的一些实施方案，这些免疫调节剂可以在其它天然存在的微生物、遗传修饰的微生物或合成的微生物中容易地表达，从而提供期望的细菌素免疫活性。由此，本文使用的“免疫调节剂”不仅指本文明确提供的结构，还指与本文所述的“免疫调节剂”结构具有基本相同的作用的结构，包括完全合成的免疫调节剂，以及提供针对与本文公开的细菌素功能等同的细菌素的免疫性的免疫调节剂。

编码表2中的多肽的示例性的多核苷酸序列显示于表2中。技术人员会容易地理解，遗传密码是简并的，此外密码子的使用可以根据其中基因产物被表达的特定有机体而改变，由此，特定的多肽可以由多种多核苷酸编码。在一些实施方案中，基于表达细菌素免疫调节剂的有机体的密码子的使用来选择编码细菌素免疫调节剂的多核苷酸。在一些实施方案中，根据表达细菌素免疫调节剂的特定有机体对编码细菌素免疫调节剂的多核苷酸的密码子进行优化。大范围的功能性免疫调节剂可以包含本文所述的免疫调节剂的特征，因而提供与表2中的免疫调节剂很大程度的同一性。在一些实施方案中，免疫调节剂与表2中的任何一种多肽具有至少约50％的同一性，例如至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

表2：示例性细菌素免疫调节剂

毒物-解毒剂系统

在期望的环境中牵制特定的微生物细胞是理想的，例如通过杀死微生物细胞或阻止微生物细胞的生长，如果其不再处于期望的环境中。可以将不同于细菌素的毒物-解毒剂系统用于实现此类牵制，或者用于微生物细胞的其它选择性生长。示例性的毒物解毒剂系统描述于美国专利号5,910,438、6,180,407、7,176,029和7,183,097中，在此将其各自以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，毒物-解毒剂系统包含细胞毒性(毒物)多肽以及单个细胞中相应的抗毒素(解毒剂)多肽。本文使用的“毒物多核苷酸”指编码毒物多肽的多核苷酸，以及“解毒剂多核苷酸”指编码解毒剂多肽的多核苷酸。

在一些实施方案中，毒物多肽被组成型表达，而解毒剂多肽仅在期望的条件下表达。在一些实施方案中，毒物多肽仅在期望的条件下表达，而解毒剂多肽仅在期望的条件下表达。例如，在一些实施方案中，配置毒物/解毒剂系统，以使微生物细胞在期望的环境条件下存活，而在非期望的环境条件下死亡。例如，在一些实施方案中，配置毒物解毒剂系统，从而如果微生物细胞从应用其的工业过程的环境逃逸，则杀死微生物细胞。在其它实施方案中，配置毒物解毒剂，从而使微生物细胞当存在编码解毒剂多肽的载体(例如质粒)时存活，而当所述载体不存在时死亡。在一些实施方案中，毒物多肽由宿主基因组中的毒物多核苷酸编码，而解毒剂多肽由载体(如质粒或染色体外阵列或附加体或微型染色体)上的解毒剂多核苷酸编码，由此，所述解毒剂多肽仅在宿主细胞中存在所述载体的情况下表达。在一些实施方案中，毒物多肽由第一载体上的毒物多核苷酸编码，而解毒剂多肽由第二载体上的解毒剂多核苷酸编码，由此所述解毒剂多肽仅在存在所述第二载体时表达。在一些实施方案中，解毒剂多核苷酸的存在(由此存在解毒剂多肽)取决于重组事件的存在或不存在，例如编码解毒剂多核苷酸的多核苷酸序列整合进宿主基因组。应当理解，在解毒剂多肽的表达依赖于载体或重组事件的存在或不存在的一些实施方案中，毒物和解毒剂多肽各自都可以组成型表达。任选地，在解毒剂多肽的表达依赖于载体或重组事件的存在或不存在的一些实施方案中，毒物多肽和/或解毒剂多肽的表达是条件性的，例如以使毒物仅在不需要微生物细胞的条件下表达，和/或解毒剂多肽仅在需要微生物细胞的条件下表达。

结合本文的一些实施方案，可以用于毒物解毒剂系统的示例性的微生物毒素多肽/抗毒素多肽对(也被称为“毒物/解毒剂”对)包括但不限于：RelE/RelB、CcdB/CcdA、Kis/Kid、SoK/HoK、PasB(或PasC)/PasA、PemK/PemI、Doc/Phd、MazE/MazF以及ParE/ParD。在不受任何具体理论限制的情况下，许多毒物多肽(例如RelE)在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及古细菌中是高度保守的，由此，其可以在广泛的天然存在的微生物细胞、遗传修饰的微生物细胞以及完全合成的微生物细胞中具有细胞毒活性。此外，在不受任何具体理论限制的情况下，考虑解毒剂多肽通常能够在多种宿主环境中抑制其毒物多肽伴侣的活性，由此，能够容易地将毒物/解毒剂对(如本文描述的那些)用于广泛的天然存在的微生物细胞、遗传修饰的微生物细胞以及完全合成的微生物细胞中。

应当注意，毒物-解毒剂系统与细菌素系统的区别至少在于毒物-解毒剂系统提供了微生物细胞能够杀死或阻止自身的内源性系统，而细菌素系统提供了微生物细胞能够杀死或阻止其它细胞的外源性系统。然而还注意到，尽管毒物-解毒剂系统不能用于杀死或阻止除其中毒物被产生的单独细胞之外的细胞，但是在一些实施方案中，可以将毒物-解毒剂系统与如本文所述的细菌素系统一同使用。例如，在一些实施方案中，可将如本文所述的细菌素系统用于杀死培养物中除细菌素产生细胞之外的细胞或阻止其生长，而可将毒物-解毒剂系统用于杀死细菌素产生细胞或阻止其生长，如果所述细胞从其期望环境中逃逸的话。还可将毒物-解毒剂系统用于筛选已被基因工程化以表达可用于工业过程的分子(“工业上可用的分子”)的细菌素产生细胞。例如，在一些实施方案中，可通过将编码细菌素和工业上可用的分子的多核苷酸或者编码细菌素和解毒剂的多核苷酸置于单个启动子的控制之下，而将解毒剂的表达与工业上可用的分子或细菌素的表达绑定。因此，在一些实施方案中，编码细菌素或细菌素免疫调节剂的微生物细胞还包含毒物解毒剂系统。在一些实施方案中，细菌素系统可用于调节微生物细胞或特定环境中的其它微生物细胞的生长，而毒物-解毒剂系统可用于牵制特定环境中的微生物细胞。

启动子

启动子在本领域是众所周知的。启动子可被用于驱动一个或多个基因的转录。在一些实施方案中，启动子驱动编码如本文所述的期望的基因产物的多核苷酸的表达。在一些实施方案中，启动子驱动如本文所述的细菌素多核苷酸的表达。在一些实施方案中，启动子驱动如本文所述的免疫调节剂多核苷酸的表达。在一些实施方案中，启动子驱动细菌素核苷酸和免疫调节剂多核苷酸的表达。在一些实施方案中，启动子驱动编码下述中的至少一种的多核苷酸的表达：细菌素、免疫调节剂、工业上可用的分子、毒物分子或解毒剂分子。一些启动子在任何时间都能够驱动转录(“组成型启动子”)。一些启动子仅在选择的情况下驱动转录(“条件性启动子”)，例如依赖于环境条件、化合物、基因产物、细胞周期的阶段等的存在或不存在。

技术人员会理解，可以根据期望的表达活性选择合适的启动子，并将其顺式置于待表达的序列内。本文的表3.1-3.11中提供了具有示例性活性的示例性启动子。技术人员会理解，一些启动子可与特定的转录机构(例如RNA聚合酶、通用转录因子等)兼容。由此，尽管鉴定了对于本文所述的一些启动子可兼容的“物种”，考虑根据本文的一些实施方案，这些启动子能够在除所鉴定的物种之外的微生物中容易地发挥功能，例如在具有兼容的内源性转录机构的物种、包含兼容的转录机构遗传修饰的物种或者包含兼容的转录机构的完全合成的微生物有机体。

本文表3.1-3.11中的启动子可从生物砖基金会公开获得。根据生物砖基金会，鼓励按照BioBrick^TM公共协议(BPA)使用这些启动子。

应当理解，任何本文所述的“编码”多核苷酸(例如细菌素多核苷酸、免疫多核苷酸、毒物多核苷酸、解毒剂多核苷酸或产物多核苷酸)通常可在期望的启动子的控制下表达。在一些实施方案中，单个“编码”多核苷酸受单个启动子的控制。在一些实施方案中，两个或更多个“编码”多核苷酸受单个启动子的控制，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个多核苷酸。由此，在一些实施方案中，不同细菌素的“混合物”可由单个微生物有机体产生。在一些实施方案中，细菌素多核苷酸受启动子的控制。在一些实施方案中，免疫调节剂受启动子的控制。在一些实施方案中，编码期望的基因产物的多核苷酸受启动子的控制。在一些实施方案中，细菌素多核苷酸和编码期望的基因产物的多核苷酸受相同启动子的控制。在一些实施方案中，细菌素多核苷酸和编码期望的基因产物的多核苷酸受不同的启动子的控制。在一些实施方案中，免疫调节剂多核苷酸和编码期望的基因产物的多核苷酸受相同启动子的控制。在一些实施方案中，细菌素多核苷酸和免疫调节剂多核苷酸受不同的启动子的控制。

通常，特定转录本的翻译起始受位于转录本编码序列的5’端的特定序列的调节。例如，编码序列可从配置以与起始tRNA配对的起始密码子开始。尽管天然存在的翻译系统通常使用Met(AUG)作为起始密码子，但是将会容易地理解，可将起始tRNA工程化以与任何期望的一个或多个三联体结合，因此在某些实施方案中，除AUG之外的三联体也可作为起始密码子发挥功能。此外，邻近起始密码子的序列能够促进核糖体的组装，例如典型的真核生物翻译系统中的Kozak序列((gcc)gccRccAUGG,SEQIDNO:542，其中R代表“A”或“G”)或者内部核糖体进入位点(IRES)，或者典型的原核生物翻译系统中的Shine-Delgarno序列(GGAGGU,SEQIDNO:543)。由此，在一些实施方案中，含有“编码多核苷酸序列，例如细菌素多核苷酸或免疫调节剂多核苷酸或者编码期望的工业产物的多核苷酸的转录本包含起始密码子和翻译起始序列。在一些实施方案中，例如如果两条或更多条“编码”多核苷酸序列顺式位于转录本上，则各多核苷酸序列包含合适的起始密码子和翻译起始序列。在一些实施方案中，例如如果两条或更多条“编码”多核苷酸序列顺式位于转录本上，则所述两条序列受单个翻译起始序列的控制，并且提供可以与两条顺式编码的多肽都发挥功能的单条多肽，或者提供用于分离两条顺式编码的多肽的手段，例如2A序列等。在一些实施方案中，翻译起始tRNA是可调节的，从而调节细菌素、免疫调节剂、毒物分子、解毒剂分子或工业上可用的分子的翻译的起始。

表3.1：示例性的金属敏感性启动子

表3.2：示例性的细胞信号响应性启动子

表3.3:示例性的组成型大肠杆菌σ ⁷⁰ 启动子

表3.4：示例性的组成型大肠杆菌σ ^s 启动子

表3.5：示例性的组成型大肠杆菌σ ³² 启动子

表3.6：示例性的组成型枯草芽孢杆菌σ ^A 启动子

表3.7：示例性的组成型枯草芽孢杆菌σ ^B 启动子

表3.8：来自其它原核生物的示例性的组成型启动子

表3.9：来自噬菌体T7的示例性的组成型启动子

表3.10：来自酵母的示例性的组成型启动子

表3.11：来自其它真核生物的示例性的组成型启动子

上文提及的启动子仅以非限制性实例的方式提供。技术人员会容易地想到，根据本文的一些实施方案，可以容易地使用上述提及的启动子的多种变体以及多种其它启动子(包括从天然存在的有机体中分离的启动子、其变体以及完全合成的启动子)。

基因活性的调节

可以调节基因活性以增加或降低基因产物的活性。在一些实施方案中，其活性被调节的基因产物包括细菌素、免疫调节剂、工业上可用的分子、毒物分子或解毒剂分子。在一些实施方案中，此类基因产物中的两种或更多种受单基因调节系统的调节。在一些实施方案中，在基因表达水平调节基因活性。在一些实施方案中，在转录水平调节基因活性，例如通过激活或抑制启动子。在一些实施方案中，在转录后水平调节基因活性，例如通过调节RNA的稳定性。在一些实施方案中，在翻译水平调节基因活性，例如通过调节翻译的起始。在一些实施方案中，在翻译后水平调节基因活性，例如通过调节多肽的稳定性、对多肽进行翻译后修饰或者将所述多肽与抑制剂结合。

在一些实施方案中，基因活性增强。在一些实施方案中，增强细菌素、免疫调节剂、工业上可用的分子、毒物分子或解毒剂分子中至少一种的活性。从概念上讲，可以通过直接激活基因活性或者通过降低基因活性的抑制剂的活性而增强基因活性。在一些实施方案中，通过下述中的至少一种激活基因活性：诱导启动子活性，抑制转录阻遏子，增强RNA稳定性，抑制转录后抑制剂(例如，抑制核酶或反义寡核苷酸)，诱导翻译(例如，通过可调节的tRNA)，进行期望的翻译后修饰，或抑制翻译后抑制剂(例如靶向所述基因编码的多肽的蛋白酶)。在一些实施方案中，存在于期望的环境中的混合物诱导启动子。例如，培养基中铁的存在能够通过如本文所述的铁敏感性启动子诱导转录。在一些实施方案中，存在于期望的培养基中的化合物抑制转录阻遏子。例如，环境中四环素的存在能够抑制tet阻遏子，因而允许来自tetO启动子的活性。在一些实施方案中，仅在期望的培养基外发现的化合物诱导转录。

在一些实施方案中，降低基因活性。从概念上将，可以通过直接抑制基因活性或通过降低基因活性的激活子的活性来降低基因活性。在一些实施方案中，基因活性降低，但是仍保留某些水平的活性。在一些实施方案中，基因活性被完全抑制。在一些实施方案中，通过下述中的至少一种降低基因活性：抑制启动子活性，激活转录阻遏子，激活，降低RNA稳定性，激活转录后抑制因子(例如，表达核酶或反义寡核苷酸)，抑制翻译(例如，通过可调节的tRNA)，未能进行需要的翻译后修饰，使多肽失活(例如通过结合抑制剂或者通过多肽特异的蛋白酶)，或者未能正确地定位多肽(例如未能分泌细菌素)。在一些实施方案中，通过移除来自期望位点的基因来降低基因活性，例如通过利用FLP-FRT或cre-lox盒切割基因或者通过质粒丢失或降解。在一些实施方案中，基因产物(例如多肽)或由基因产物产生的产物(例如酶反应的产物)抑制另外的基因活性(例如负反馈环)。

微生物有机体的遗传修饰

对微生物进行遗传修饰的技术在本领域是众所周知的。在一些实施方案中，对微生物进行遗传修饰，从而使其包含调节细菌素、免疫调节剂、工业上可用的分子、毒物分子或解毒剂分子中至少一种的表达并编码其中的至少一种的核酸序列。多核苷酸可被递送至微生物，并能够稳定整合进这些微生物的染色体内，或者能够游离于基因组而存在，例如在质粒、染色体外阵列、附加体、微型染色体等中存在。

微生物细胞遗传修饰的示例性载体包括但不限于：质粒、病毒(包括噬菌体)和转座子元件。此外，将会理解，可以在细胞中合成并组装包含期望序列的整个微生物基因组(参见，例如Gibsonetal.(2010),Science329:52-56)。由此，在一些实施方案中，合成具有期望特征(如细菌素多核苷酸)的微生物基因组(或其部分)，并引入微生物细胞内。

对微生物细胞灵活地进行基因修饰可以是有用的，例如以将微生物细胞工程化或再工程化，从而使之具有期望的细菌素或者免疫调节剂活性类型和/或活性谱。在一些实施方案中，提供用于将一种或多种期望的细菌素和/或免疫调节剂多核苷酸插入多核苷酸序列内的盒。示例性的盒包括但不限于：Cre/lox盒或FLP/FRT盒。在一些实施方案中，所述盒位于质粒，以使具有期望的细菌素和/或免疫调节剂组合的质粒能够容易地导入微生物细胞内。在一些实施方案中，所述盒位于微生物细胞基因组内，以使具有期望的细菌素和/或免疫调节剂组合的盒能够导入期望的位点。

在一些实施方案中，可将质粒接合用于将来自“供体”微生物细胞的期望的质粒导入至受体微生物细胞内。-Moreno,etal.(2013)MulticellularComputingUsingConjugationforWiring.PLoSONE8(6):e65986，在此以引用的方式将其整体并入。在一些实施方案中，质粒接合可以通过将来自供体微生物细胞的接合质粒导入受体微生物细胞内而对受体微生物细胞进行遗传修饰。在不受任何具体理论限制的情况下，含有一组相同或功能相同的复制基因的接合质粒通常不能在同一微生物细胞中共存。由此，在一些实施方案中，质粒接合通过引入新的接合质粒以取代受体细胞中存在的另一接合质粒而将受体微生物细胞“重编程”。在一些实施方案中，使用质粒接合以将具有一种或多种细菌素和/或免疫调节剂的特定组合的微生物细胞工程化(或再工程化)。根据一些实施方案，提供含有细菌素和/或免疫调节剂的不同组合的多种接合质粒。质粒可以包含如本文所述的其它遗传组件，例如启动子、翻译起始位点等。在一些实施方案中，在一批供体细胞中提供多种接合质粒，以使可以选择含有期望质粒的供体细胞用于质粒接合。在一些实施方案中，选择细菌素和/或免疫调节剂的特定组合，并将合适的供体细胞与目标微生物细胞连接，从而将含有所述组合的接合质粒导入受体细胞。在一些实施方案中，受体细胞是“新近工程化的”细胞，例如以被导入或用于起始培养。在一些实施方案中，受体细胞是“再工程化的细胞”，例如以将新的细菌素(以及任选地免疫调节剂)活性导入遭遇新类型的入侵细胞的存在的培养物中，和/或以培养物中不再需要的细菌素活性。

培养基

微生物培养环境可以包含多种培养基，例如给料。具体培养基的选自可以取决于期望的应用。培养基的条件不仅包括化学组成，还包括温度、光的量、pH、CO2水平等。

在一些实施方案中，向含有其它微生物和至少一种给料的培养基中添加如本文所述的基因工程微生物。在一些实施方案中，培养基包含诱导细菌素和/或免疫调节剂的活性或其表达的化合物。在一些实施方案中，培养基包含抑制细菌素和/或免疫调节剂的活性或其表达的化合物。在一些实施方案中，诱导细菌素活性的化合物存在于给料外，而非给料中。在一些实施方案中，抑制免疫调节剂活性的化合存在于给料外，而非给料中。

本文使用的术语“给料”从广义上来说包含例如在工业方法的背景下可被微生物有机体耗尽、发酵、纯化、改良或以其它方式加工的材料。由此，“给料”不限于食物或食物产品。本文使用的“给料”是一类培养基。因此本文使用的“培养基”包括但不限于给料。由此，本文不论何时提及“培养基”，给料也被明确考虑在内。

基因工程微生物细胞

在一些实施方案中，提供遗传修饰的微生物细胞。可将遗传修饰的微生物细胞配置为用于多种目的。在一些实施方案中，微生物细胞包含遗传修饰，以调节细菌素、免疫调节剂、工业上可用的分子、毒物分子或解毒剂分子中至少一种的表达。在一些实施方案中，微生物细胞包含遗传修饰，以调节细菌素的表达。在一些实施方案中，微生物细胞包含遗传修饰，以调节免疫调节剂的表达。

在一些实施方案中，对遗传修饰的微生物细胞进行修饰以产生产物。在一些实施方案中，所述产物为基因产物，例如多肽或RNA。由此，本文提及的多核苷酸“编码”序列可以指编码多肽或RNA的序列。在一些实施方案中，微生物细胞可以被配置为产生有助于合成期望产物的一种或多种基因产物，例如碳水化合物、生物燃料、脂质、小分子或金属。在一些实施方案中，通过微生物细胞的一种或多种基因产物的活性合成产物。任选地，产物的合成还可涉及一种或多种其它微生物细胞的一种或多种基因产物的活性。在一些实施方案中，微生物细胞可以被配置为将培养基(例如给料)中的一种或多种物质去污或分解。去污可由微生物细胞的一种或多种基因产物完全或部分介导。在一些实施方案中，可以配置微生物细胞以清除材料，例如金属，如铁或稀土金属。

控制微生物细胞的生长

在一些实施方案中，对遗传修饰的微生物细胞进行修饰以调节其它微生物细胞的生长。在一些实施方案中，微生物细胞调节相同物种或菌株的其它微生物细胞(例如它们自身的克隆)的生长。在一些实施方案中，微生物细胞调节不同物种或菌株的微生物细胞(例如入侵物)的生长。在一些实施方案中，微生物细胞分泌细菌素以调节其它微生物细胞。上述其它微生物细胞每一种的调节可以依赖于具有针对特定分泌的细菌素的保护作用的免疫调节剂的表达(或其缺乏)。

本文使用的“期望的细胞”等指这样的微生物细胞：其具有对于微生物细胞的存活、生长和/或增殖是期望的，或者至少不存在细胞生长的负调控是期望的至少一种特性。在一些实施方案中，期望的细胞处于适当的环境中，例如其工业上可用的给料中。在一些实施方案中，期望的细胞是阳性选择的细胞，例如经受了特定的重组事件或表达高水平的可用的基因产物的细胞。在一些实施方案中，期望的细胞是被配置为中和污染性细胞(例如病原性细胞)的细胞。在一些实施方案中，期望的细胞是通过对应于可以存在于环境中的至少一种细菌素的免疫调节剂的表达阳性选择的细胞。在不受任何具体理论限制的情况下，考虑能够中和缺乏类似的中和功能的其它微生物细胞的微生物细胞将会具有竞争性优势。由此，在一些实施方案中，通过其中和其它细胞的能力选择期望的细胞。在一些实施方案中，通过表达细菌素和相应的免疫调节剂来阳向选择期望的细胞。

本文使用的“非期望的细胞”等指具有使存活、生长或增殖不理想的至少一种特性的微生物细胞。在一些实施方案中，非期望的细胞是入侵的微生物细胞，例如进入培养环境的污染性的细胞。在一些实施方案中，非期望的细胞从合适的培养基(例如其工业上可应用的给料)中逃逸，。在一些实施方案中，非期望的细胞丢失了特定的质粒，或者未能经历特定的重组事件。在一些实施方案中，非期望的细胞未能产生或者产生低水平的期望的基因产物。在一些实施方案中，选择非期望的细胞。在一些实施方案中，针对通过降低细胞中抵抗环境中的细菌素的免疫调节剂的表达或其活性来选择非期望的细胞。在一些实施方案中，针对通过降低细胞中抵抗由所述细胞或其克隆分泌的细菌素的免疫调节剂的表达或其活性来选择非期望的细胞。在一些实施方案中，针对下述选择非期望的细胞：通过降低细胞中细菌素的表达，因而将所述细胞置于针对其它微生物细胞的竞争性劣势中。

图1为描述根据本文的一些实施方案，配置微生物细胞以控制第二微生物细胞的生长的选项的流程图。在一些实施方案中，提供第一微生物细胞。在一些实施方案中，第一微生物细胞分泌活性细菌素100。在一些实施方案中，第一微生物细胞不是期望的102。例如，在一些实施方案中，下述中的一项或多项能够使得第一微生物细胞在特定的环境在特定的时间是不理想的：第一微生物细胞位于其工业环境之外、不存在第一微生物细胞的期望的环境条件、第一微生物细胞已经产生了足够的产物，或者第一微生物细胞缺乏重组事件或载体112。由此，当第一微生物细胞是非期望的时，其免疫调节剂(与细菌素对应)可以失活122。例如，下述中的一项或多项：免疫调节剂启动子可以失活，免疫调节剂转录阻遏子可以具有活性，可以发生转录后沉默(例如通过核酶或反义)，可调节的tRNA不能被诱导，可以发生转录后沉默(例如，通过位点特异的蛋白酶，或者沉默的翻译后修饰)，或者编码免疫调节剂的载体可以不存在132。在一些实施方案中，当第一细胞不具有活化的免疫调节剂时，所述第一细胞被由培养物中的其它细胞产生的细菌素142中和。在一些实施方案中，作为第一细胞被中和的结果，第二微生物细胞继续生长192。

在一些实施方案中，第一微生物细胞是期望的106。例如，下述中的一项或多项可以使得微生物细胞在特定的环境在特定的时间是理想的：第一微生物细胞位于其工业环境内，存在第一微生物细胞的期望的环境条件，第一微生物细胞还未产生足够的产物，或者第一微生物细胞经历了重组事件或含有特定的载体116。由此，当第一微生物细胞是期望的时，其可以产生活性免疫调节剂126。例如，在一些实施方案中，可以配置第一微生物细胞以使其具有以下的一种或多种：免疫调节剂多核苷酸的组成型启动子、免疫调节剂多核苷酸的激活的(而不一定是组成型的)启动子、免疫调节剂转录的失活的阻遏子、诱导以促进免疫调节剂产生的可调节的tRNA、不存在免疫调节剂的翻译后和转录后沉默、或者存在编码免疫调节剂的载体136。由此，第一微生物细胞能够在由第一微生物细胞分泌的细菌素存在的情况下存活146。作为由第一微生物细胞分泌的细菌素的结果，第二微生物细胞可以生长192或被中和196，这取决于第二微生物细胞是否具有免疫调节剂活性172或者不具有免疫调节剂活性176。

在一些实施方案中，第二微生物细胞是期望的152。例如，下述中的一项或几项可以使得第二微生物细胞是理想的162：第二微生物细胞中发生期望的重组事件，第二微生物细胞中存在期望的载体，第二微生物细胞产生产物，所述产物被期望产生更多(例如正反馈环)，或者当合适水平的期望产物被转录时免疫基因座和期望的产物处于相同的转录控制下。当第二微生物细胞是期望的时，其可以提供免疫调节剂活性，以防御特定的由第一微生物细胞产生的细菌素172。例如，在一些实施方案中，可以改造第二微生物细胞，以使免疫调节剂启动子是活化的(例如，组成型启动子)，免疫调节剂转录阻遏子是失活的，缺乏转录后沉默，可以存在被诱导以促进免疫调节剂表达的可调节的tRNA、缺乏免疫调节剂的翻译后沉默(例如通过位点特异的蛋白酶)或可以存在编码免疫调节剂的载体182。由此，在一些实施方案中，当提供免疫调节剂活性时，第二微生物细胞可以存活192。

在一些实施方案中，第二微生物细胞是非期望的156。例如，下述中的一项或多项可以使得第二微生物细胞是不理想的：第二微生物细胞为入侵物(例如污染性细胞)，第二微生物细胞的非期望的环境条件(例如存在非期望的化合物或条件的，或者期望的化合物或条件不存在)，第二微生物细胞产生产物但是不期望更多的产物(例如负反馈环)，或者免疫调节剂基因座和期望的产物基因座处于相同的转录控制下，以及转录本的水平非期望的低(例如指示不能产生期望的产物)166。由此，在一些实施方案中，可能不存在免疫调节剂活性或者免疫调节剂的量不足以防御第二微生物细胞中的细菌素的作用176。例如，以下中的一项或多项：免疫调节剂启动子可以是失活的，免疫调节剂转录阻遏子可以是活化的，可以发生免疫调节剂的转录后沉默(例如通过核酶或反义寡核苷酸)，可调节的tRNA不能被诱导(以使不能促进免疫调节剂的表达)，可以发生免疫调节剂的转录后沉默(例如通过位点特异的蛋白酶，或者沉默翻译后修饰)，或者可以不存在编码免疫调节剂的载体186。在一些实施方案中，第一微生物细胞提供分泌的细菌素活性100。由此，在一些实施方案中，第二微生物细胞可被细菌素杀死196。

本领域技术人员会理解，对于本文公开的此种和其它功能、结构和方法，可以以不同的顺序或序列实施或进行所述的功能、结构和步骤。此外，概述的功能和结构进作为实例提供，以及在不脱离公开的实施方案的实质的情况下，这些功能和结构中的一些可以是任选的，组合为更少的功能和结构，或者扩展为其它功能和结构。

对于多种遗传修饰的微生物细胞，控制培养物中的其它微生物细胞的生长可以是有用的。在一些实施方案中，微生物细胞控制培养物中其它微生物细胞的生长。根据本文的一些实施方案，第一微生物细胞能够控制一种或多种其它微生物细胞的生长的示例性功能和配置描述于表4中。

表4：根据本文的一些实施方案，细菌素系统在遗传修饰的微生物细胞中的示例性 用途

图2是描述根据本文的一些实施方案，基因工程微生物细胞控制至少一种其它微生物细胞的生长的示意图。第一微生物细胞200可以包含细菌素多核苷酸和相应的免疫调节剂多核苷酸。所述细菌素多核苷酸可以任选地被整合进所述细胞的基因组中，而所述免疫调节剂多核苷酸可以任选地被整合进所述细胞中存在的质粒内。在一些实施方案中，细胞的非期望的克隆210(“不表达的克隆”)可以缺乏免疫调节剂活性，并且任选地可以缺乏细菌素活性。第一微生物细胞200的细菌素活性能够中和不表达的克隆210。在一些实施方案中，细胞的非期望的克隆220可以丢失包含免疫调节剂多核苷酸的质粒。第一微生物细胞200的细菌素活性可以中和非期望的克隆220。在一些实施方案中，微生物细胞230可以从期望的环境中逃逸，引起克隆丧失免疫调节剂活性。来自逃逸的细胞230的细菌素活性和/或逃逸的细胞的克隆能够中和逃逸的细胞230。在一些实施方案中，逃逸的细胞230还包含毒物-解毒剂系统，以促进在逃逸的细胞逃逸时将其杀死。

图3为根据本文的一些实施方案，第一基因工程微生物细胞300控制期望的环境中的第二基因工程微生物细胞310和入侵细胞320的生长的示意图。第一基因工程微生物细胞300可以包含第一细菌素多核苷酸。第二基因工程微生物细胞310可以包含第二细菌素多核苷酸。第一和第二基因工程微生物细胞(300和310)各自可以包含编码针对第一细菌素的抗性的第一免疫调节剂多核苷酸和编码针对第二细菌素的抗性的第二免疫调节剂多核苷酸。如果第二基因工程微生物细胞310变为非期望的，它可以通过本文所讨论的任何机制丢失第一免疫调节剂活性，由此受来自第一基因工程微生物细胞300的第一细菌素活性的控制。如果入侵细胞320进入期望的环境，则来自第一基因工程微生物细胞300的第一细菌素以及来自第二基因工程微生物细胞310的第二细菌素可以中和入侵的细胞。

图4是根据本文的一些实施方案，第一基因工程微生物细胞400控制期望环境中的第一入侵细胞410和第二入侵细胞420的生长的示意图。第一基因工程细胞400可以至少包含编码第一细菌素的第一细菌素多核苷酸，和至少包含编码第二细菌素的第二细菌素多核苷酸。第一基因工程细胞400可以产生第一细菌素以中和第一入侵细胞410。第一基因工程细胞410可以产生第二细菌素以中和第二入侵细胞420。在一些实施方案中，所述第一入侵细胞是来自与第二入侵细胞不同的菌株或菌种。在一些实施方案中，第一入侵细胞与第二入侵细胞响应不同的细菌素活性谱。在一些实施方案中，第一入侵细胞与第二入侵细胞通常占据不同的生态位。

图5是阐明根据根据本文的一些实施方案，控制培养物中至少第二微生物细胞的生长的方法的流程图。该方法可以包括在第一微生物细胞产生足以控制第二微生物细胞的生长的水平的细菌素的条件下，在包含第二微生物细胞的培养基中培养第一微生物细胞510。第一微生物细胞的培养可以任选地连续维持一段时间520。在一些实施方案中，第一微生物细胞的培养连续维持至少3天，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450或500天，包括任何两个列出的值之间的范围。可以检测包括第三微生物细胞水平或活性存在或增加的培养基中的变化530。可以响应上述变化再工程化第一微生物细胞，以产生足以控制第三微生物细胞生长的水平的第二细菌素540。可在第一微生物细胞产生足以控制第三微生物细胞生长的水平的细菌素的条件下，在培养物中培养再工程化的第一微生物细胞550。可将再工程化的微生物细胞的培养连续重复一段时间560。在一些实施方案中，将再工程化微生物细胞的培养连续维持至少3天，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450或500天，包括任何两个列出的值之间的范围。

在一些实施方案中，第一微生物细胞可以控制第二微生物细胞的生长。在一些实施方案中，第一微生物细胞可以控制与第一微生物细胞相同菌株的第二微生物细胞的生长。各菌株细胞可以包含细菌素多核苷酸和免疫调节剂多核苷酸，以使如果表达，则所述免疫调节剂防御所述细菌素。由此，如果菌株克隆丧失免疫调节剂的表达，其将被来自相同菌株的细菌素活性中和。在一些实施方案中，免疫调节剂多核苷酸与细菌素多核苷酸是顺式的。由此，即使细菌素多核苷酸和免疫调节剂多核苷酸都被清除(例如，如果质粒丢失，或者FLP-FRT盒被剪切)，来自其它细胞的细菌素活性仍可以中和细胞。在一些实施方案中，免疫调节剂多核苷酸与细菌素多核苷酸是反式的。当微生物细胞是非期望的时(例如，如果质粒丢失，或者如果特定的环境条件诱导了免疫调节剂活性的丧失)，可以失去免疫调节剂活性。因此，来自这两种微生物细胞以及菌株的其它细胞的细菌素活性可以诱导微生物细胞的中和。

在一些实施方案中，控制两种或更多种微生物物种或菌株的比例。图3(参见细胞300和310)中显示了对比例的示例性控制。在一些实施方案中，当与产生细菌素的第二菌株或物种相比，第一微生物菌株或物种是较不期望的时，第一微生物菌株或物种通过本文所讨论的任何机制丧失免疫调节剂活性，从而增加第二菌株或物种对第一菌株或物种的比例。在控制第一和第二菌株或物种的比例的一些实施方案中，选择一种或多种抑菌性细菌素(而不是bacteriocitic细菌素)，以使对生长的控制可以容易地可逆，和/或以将清除菌株或物种的风险最小化。在一些实施方案中，在由目标化合物或物质(例如中间体或产物如工业上可用的分子)的存在所激活的启动子的控制下，第一微生物菌株或物种产生第一细菌素。由此，细菌素的水平随目标化合物水平的增加而增加。在一些实施方案中，第二微生物菌株或物种产生(或催化产生)目标化合物或物质，但是对于细菌素不具有免疫调节剂活性。随着目标化合物或物质的水平的增加，细菌素的水平也增加，因而中和了第二菌株(其缺乏合适的免疫调节剂或者其不具有足够量的合适的免疫调节剂以防御细菌素的作用)。由此，与第二菌株相比，第一菌株的相对水平增加。在一些实施方案中，第一微生物菌株产生第一产物和第一细菌素活性，以及第二微生物菌株产生第二产物和第二细菌素活性。在一些实施方案中，第一产物和第二产物是同一生物合成途径中的中间体。第一微生物菌株可以提供第一和第二免疫调节剂活性，其中所述第二免疫调节剂活性可以防御第二细菌素，并由第一产物的累积负调节(例如，第二免疫调节剂的表达被第一产物的存在所抑制)，以及所述第一免疫调节剂活性可以防御第一细菌素。第二微生物菌株也可以提供第一和第二免疫调节剂活性，除了第一免疫调节剂活性由第二产物的累积负调控(例如，第一免疫调节剂的表达被第二产物的存在所抑制)外。由此，当累积了相对大量的第一产物时，第一微生物菌株中的第二免疫调节剂失活，并且第一菌株的微生物细胞被第二细菌素中和，因而增加第二菌株对第一菌株的比例，并增加第二产物对第一产物的相对量。当累积了相对大量的第二产物时，第二微生物菌株中的第一免疫调节剂失活，并且第二菌株的微生物细胞被第一细菌素中和，第一菌株对第二菌株的比例增加，第一产物对第二产物的相对量增加。由此，可以调整第一菌株对第二菌株的比例，这取决于产物的相对水平。在一些实施方案中，维持第一菌株对第二菌株比例的平衡。在一些实施方案中，维持第一产物对第二产物比例的平衡。在一些实施方案中，第一微生物菌株的第二免疫调节剂响应第一环境条件或化合物，并且以其它方式如上文所述的控制第一和第二微生物菌株之间的比例。在一些实施方案中，第二微生物菌株的第一免疫调节剂响应第二环境条件或化合物，并且以其它方式如上文所述的控制第一和第二微生物菌株之间的比例。

在一些实施方案中，期望的是，微生物细胞被包含于特定环境中，例如以使第一微生物细胞仅可在特定培养基如工业给料中存活。在一些实施方案中，微生物细胞包含细菌素多核苷酸和免疫调节剂多核苷酸，以使免疫调节剂与细菌素对应。在一些实施方案中，当微生物细胞处于期望的环境中时，所述微生物细胞产生活化的细菌素和对应的免疫调节剂，但是当微生物细胞从期望的环境中逃逸时，所述微生物细胞产生活化的细菌素而非活化的免疫调节剂。因此，微生物细胞可以在期望的环境中生长，但是当其逃逸时，其被自身细菌素中和。例如，在一些实施方案中，由细菌素多核苷酸编码的细菌素组成型表达，而免疫调节剂仅在当微生物细胞处于期望的环境中时才表达。例如，在一些实施方案中，由细菌素多核苷酸编码的细菌素组成型表达，而免疫调节剂仅在当微生物细胞处于某一环境中时才表达。例如，在一些实施方案中，免疫调节剂的转录激活剂仅存在于期望的环境中。例如，在一些实施方案中，由细菌素多核苷酸编码的细菌素和免疫调节剂组成型表达，但是如果微生物细胞逃逸，则免疫调节剂缺失(例如通过FLP-FRT系统)。在不受任何具体理论限制的情况下，如果用于中和逃逸的微生物细胞的遗传系统未被用于培养物自身中，则维持培养物内的系统可能存在较小或不存在选择性压力，因此突变可以累积，这降低或清除了所述遗传系统的功能的发挥。由此，如果微生物细胞能够从培养物中逃逸，则存在遗传系统将不再发挥功能的可能性。相比之下，本文理解如果细菌素/免疫调节剂系统既可用于培养物中(例如，以控制培养物中其它基因工程细胞的生长和/或以中和入侵的微生物细胞)，又可用于培养物之外(例如，以中和从培养物中逃逸的微生物细胞)，则其在培养物中的使用可以提供针对细菌素系统的选择性压力以继续发挥功能。根据本文的一些实施方案，此类选择性压力可将遗传漂变最小化。根据本文的一些实施方案，此类选择性压力可以帮助确保如果微生物细胞从期望的培养环境中逃逸，则细菌素/免疫调节剂系统将会发挥功能以适当地中和逃逸的细胞。由此，在一些实施方案中，单个基因工程化线路，例如细菌素/免疫调节剂系统既可用于中和期望的培养环境中的其它微生物细胞，并当从期望的培养环境中逃逸时还中和微生物细胞和/或它的克隆。根据本文的一些实施方案，考虑可以调整本文公开的细菌素的任何或全部配置，以使当从期望的培养环境中逃逸时，逃逸的微生物有机体将被其自身细菌素(和/或其直接或间接后代的细菌素，和/或其它逃逸细胞和/或其直接或间接后代的细菌素)中和。

在一些实施方案中，微生物细胞可以以两种或多种方式控制生长。在一些实施方案中，微生物细胞可以执行表4中所述的两种或更多种功能。在一些实施方案中，微生物细胞使用相同细菌素/免疫调节剂对发挥两种或更多种不同的功能。在一些实施方案中，微生物细胞使用第一细菌素/免疫调节剂对用于第一功能，以及第二细菌素/免疫调节剂对用于第二功能。例如，在一些实施方案中，微生物细胞可以表达限制期望环境中丧失免疫调节剂活性的“不表达的”克隆的生长的细菌素，以及如果微生物细胞位于期望环境之外，则可以通过不表达其自身免疫调节剂(而仍表达细菌素)提供期望环境内的牵制。这两种形式的生长调节的示意图显示于图2中。例如，在一些实施方案中，第一微生物细胞可以表达限制第二微生物细胞的生长的细菌素，并且还能够中和入侵的细胞。这两种形式的生长调节的示意图显示于图3中。在一些实施方案中，利用相同的细菌素-免疫调节剂对，提供了两种或更多种形式的生长控制。在一些实施方案中，利用不同的细菌素免疫调节剂对，提供了每种形式的生长控制。例如，第一免疫基因座可以存在于质粒上，所述质粒还包含编码期望产物的多核苷酸。丢失所述质粒的克隆将会被对应的第一细菌素中和。第二免疫调节剂多核苷酸(对应于第二免疫调节剂)可被整合进微生物细胞的基因组内，并且当微生物细胞从其期望的环境中逃逸时可以被沉默(例如，第二免疫调节剂多肽可以位于当逸时被切除的FLP-FRT盒内)。由此，当逸时，微生物细胞可被第二细菌素中和。

应当注意，本文所述的一些实施方案可与毒物-解毒剂系统兼容。由此，在一些实施方案中，除细菌素和免疫调节剂之外，微生物细胞还包含被配置以当其不处于期望环境中时，杀死或阻止细胞的毒物-解毒剂系统。

控制两种或更多种不同类型的微生物细胞的生长是可用的。例如，环境可以包含或者可能包含两种或更多种不同类型的非期望的微生物有机体。由于不同的微生物有机体可以具有不同的针对细菌素的敏感性(例如，通过具有免疫调节剂的不同特性)，可以使用两种或更多种细菌素的组合(例如细菌素的“混合物”)用于控制两种或更多种微生物有机体的生长。在一些实施方案中，单一微生物细胞产生两种或更多种不同的细菌素，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50种不同的细菌素，包括任何两个列出的值之间的范围。在一些实施方案中，提供两种或更多种不同的产生细菌素的微生物细胞的混合物，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50种不同的产生细菌素的微生物细胞，包括任何两个列出的值之间的范围。任选地，产生细菌素的微生物细胞中的一种或多种可以产生两种或更多种不同的细菌素。

可将单一微生物细胞用于调节两种更多种不同类型的微生物细胞的生长。例如，可能的是，第一类型的入侵细胞具有针对第一类型的细菌素而非第二类型的细菌素的免疫力。由此，在一些实施方案中，微生物细胞包含两种或更多种细菌素多核苷酸，其中各细菌素多核苷酸编码不同的细菌素(参见，例如图4)。在一些实施方案中，微生物细胞包含编码至少三种不同的细菌素的多核苷酸，例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多种不同的细菌素，包括任何两个列出的值之间的范围。在一些实施方案中，两种或更多种细菌素多核苷酸受单一启动子的控制。在一些实施方案中，受单一启动子的控制的各细菌素多核苷酸包含其自身翻译起始位点。在一些实施方案中，各细菌素多核苷酸受不同启动子的控制。在一些实施方案中，两种不同的细菌素受两种不同的而非结构或功能相同的启动子的控制。

可将微生物细胞用于控制其工业环境中其它微生物细胞的生长，以有助于确保工业产物的一致性产生，不管培养环境的地理位置。在不受任何具体理论限制的情况下，通过微生物培养来制备的某些工业产物可以具有由与某些区域相关的地方性微生物菌群导致的某些特性(例如，Camembert干酪可以具有由法国Camembert的地方性微生物菌群导致的特定特征，或者酸面团面包(sourdoughbread)可以具有由加拿大SanFrancisco,的地方性微生物菌群导致的特定特征)。由此，理想的是控制具体给料中的微生物菌群，以使在不同地理位置可以产生一致的工业产品。在一些实施方案中，将微生物细胞工程化以产生细菌素，从而中和不同地理位置发现的入侵的微生物细胞，这可以确保不同位置产生的产品的更加一致的工业产物特征。例如，可将被设计以用于在特定工业进程和在第一地理位置生长的微生物细胞工程化，以表达有效针对通常在第一地理位置遇到的一种或多种入侵生物的一种或多种细菌素。可将被设计以用于相同工业进程并在第二地理位置生长的微生物细胞工程化，以表达有效针对通常在第二地理位置中遇到的一种或多种入侵生物的一种或多种细菌素。可选地，可将被设计以用于特定工业进程并在两个不同的地理位置生长的微生物细胞工程化，以表达有效针对通常在这两个地理位置中的每一个中遇到的一种或多种入侵生物的一种或多种细菌素。

通常在工业生物技术中，目标是在连续生产过程中发挥作用，并且考虑生产过程持续得越长，则污染的可能性更大。因此，抵抗污染物的能力可以用于连续的工业生产过程。实验室中设计的合成的微生物经常用于工业生产过程中。由此，可将这些实验室工程化的“优势微生物”用于对抗非期望的入侵微生物菌株(例如来自环境的野生型菌株和/或来自其它工业生产过程的交叉污染物)，以及用于控制它们可能的遗传漂变和环境中的逃逸。根据本文的一些实施方案，可以对抗入侵的微生物菌株，可将遗传漂变最小化，以及可以通过诱导基于自杀性的细菌素的基因回路而将逃逸最小化。

将微生物培养保持稳定，持续一段连续的时间可以是有用的，例如以确保在一段连续的时间的一致的工业产物特征。在一些实施方案中，至少部分通过细菌素介导的入侵微生物细胞的中和，稳定地维持培养物。在一些实施方案中，至少部分通过细菌素介导的培养物中两种或更多种类型的基因工程化微生物细胞的比例控制，稳定地维持培养物。在一些实施方案中，至少部分通过将培养物中已经存在的微生物细胞再工程化，稳定地维持培养物。在一些实施方案中，将微生物细胞再工程化，以添加至少一种其它细菌素活性(例如通过添加新的细菌素，或者扩增已经存在的细菌素的表达)，从而中和新型入侵微生物有机体。在一些实施方案中，将微生物细胞再工程化以移除不再需要的至少一种细菌素活性。根据本文的一些实施方案，维持稳定培养物的示例性方法显示于图5中。在一些实施方案中，稳定的培养物被维持至少约3天，例如约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450或500天，包括任何两个列出的值之间的范围。

用于测定微生物有机体比例的方法

根据本文的一些实施方案，可以控制两种或更多种微生物菌株或物种的比例，这取决于环境中产物和/或的化合物的相对量。因此，在一些实施方案中，两种或更多种微生物菌株或物种的比例可以指示环境中产物和/或化合物的相对量。在一些实施方案中，测定如本文所述的第一菌株或物种和第二菌株或物种的微生物的相对量，从而指示第一产物或化合物对第二产物或化合物的相对比例或相对量。可以用不同的方式测定各微生物菌株或物种的相对量。在一些实施方案中，各菌株或物种包含独特的寡核苷酸或多肽“条形码”序列，以帮助特异性检测。在一些实施方案中，各菌株或物种包含不同的细菌素(因此不同的细菌素多核苷酸)，其可以充当条形码。在一些实施方案中，实施定量PCR、寡核苷酸阵列分析、流式细胞术、免疫细胞化学、原位杂交、ELISA、免疫印迹、寡核苷酸斑点杂交等中的至少一种，以测定两种不同的微生物菌株或物种的相对量。

用于测定工业培养基中微生物有机体的生长调节的方法

在一些实施方案中，对工业培养基中微生物有机体的生长进行调节。在向现有的微生物细胞工业培养物中添加特定的基因工程化微生物细胞或基因工程化细胞的组合之前，测定细菌素对现有的工业培养物中的微生物细胞的生长的影响(如果有的话)可以是有用的。在一些实施方案中，对由基因工程化细胞产生的特定细菌素或细菌素的组合对微生物有机体的影响进行评估。可以提供如本文所述的包含由基因工程化微生物细胞产生的一种或多种细菌素的培养基或其它组合物。在一些实施方案中，所述培养基包含含有一种或多种细菌素的上清液。在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种富集的或纯化的细菌素。在一些实施方案中，所述上清液或组合物是热稳定的，例如以通过高温培养促进其中任何微生物的清除，同时仍保留其中任何细菌素的功能。在一些实施方案中，所述培养基或组合物包含含有细菌素的冻干材料。在一些实施方案中，所述培养基或组合物包含与细菌素结合的物质，例如凝胶、基质或珠子。可向现有的培养物中添加所述含有细菌素的培养基或组合物。在一些实施方案中，将所述培养基或组合物添加至工业培养环境中的培养物中。在一些实施方案中，将所述培养基或组合物与来自工业培养环境的培养物样品接触。可对工业培养物中的微生物有机体的生长或生长缺乏进行评估，例如以确定一种或多种细菌素是否有效针对培养物中出现的新的入侵有机体，或者以确定一种或多种细菌素对培养物中现有有机体的影响。

在产生基因工程化微生物细胞之前，模拟一种或多种细菌素对特定培养环境的影响可以是有用的。在一些实施方案中，对已知培养环境中的具有期望活性的特定细菌素或细菌素的组合进行鉴定，并构建微生物细胞以产生期望的细菌素或细菌素组合。在一些实施方案中，将候选细菌素或细菌素的组合与部分目标工业培养物接触，并鉴定一种或多种细菌素对培养物中的微生物有机体的影响。在一些实施方案中，提供了多种细菌素。在一些实施方案中，在试剂盒中提供了多种细菌素。在一些实施方案中，细菌素由微生物细胞产生。在一些实施方案中，细菌素位于来自如本文所述的一种或多种微生物细胞的上清液中。在一些实施方案中，细菌素是化学合成的。可以制备一种或多种候选细菌素或细菌素的混合物，并且可将其与部分工业培养环境接触。在一些实施方案中，将一种或多种细菌素添加至已经存在于培养物中的产生细菌素的基因工程化细胞的上清液中，例如以确定将所述细胞工程化以产生至少一种其它细菌素的影响。在一些实施方案中，将来自工业培养环境的样品与各候选细菌素或细菌素的混合物接触。在一些实施方案中，将各候选细菌素或细菌素的混合物添加至培养环境中。在一些实施方案中，观察各候选细菌素或细菌素的组合的影响，例如如对培养物中的至少一种期望的微生物细胞的生长的影响，和/或对培养物中的至少一种非期望的微生物细胞的生长的影响。

根据对期望的细菌素组合的鉴定，可以构建微生物细胞以产生细菌素的期望组合。在一些实施方案中，将工业培养物中现有的微生物细胞，例如产生期望产物或中间体的微生物细胞再工程化，以产生期望的细菌素的组合。在一些实施方案中，通过质粒接合将微生物细胞再工程化。在一些实施方案中，将新的细胞工程化，以产生细菌素的期望组合，并添加至工业培养物中。

遗传防护微生物有机体和系统

可将产生细菌素的微生物有机体用于保护其它微生物有机体不受非期望的微生物有机体的影响。因此，在一些实施方案中，提供了“遗传防护微生物有机体”(作为速记，其在本文也可被称为“遗传防护者”)。本文使用的“遗传防护者”指微生物有机体或微生物有机体集合，其产生一种或多种细菌素，从而保护对所述细菌素的中和作用有免疫性但其自身不产生所述细菌素的“受保护的”微生物有机体。“受保护的”微生物有机体可以实施期望的工业生产过程(例如发酵)，而本文使用的“遗传防护者”自身不实施所述期望的工业生产过程。遗传防护微生物有机体可以表达并分泌一种或多种细菌素。任选地，遗传防护微生物有机体能够组成型表达并分泌一种或多种细菌素。遗传防护微生物有机体对由遗传防护者产生的细菌素可以是不敏感的，例如通过产生针对由遗传防护者分泌的细菌素的免疫调节剂，和/或通过成为对由遗传防护者产生的细菌素不敏感的一类微生物有机体(例如，如果所述遗传防护者包括酵母，并分泌特异性中和特定细菌如乳酸菌的细菌素)。在一些实施方案中，受保护的微生物有机体产生针对由遗传防护者产生的细菌素的免疫调节剂。在一些实施方案中，受保护的微生物有机体不易受由遗传防护者产生的细菌素的影响(例如，如果受保护的微生物有机体包括酵母，并且所述遗传防护微生物有机体产生特异性中和特定细菌的细菌素)。在一些实施方案中，受保护的微生物有机体不是遗传修饰的(“非GMO”)。在一些实施方案中，受保护的微生物有机体是非GMO，但是来自选择的菌株以具有期望的特性，例如通过选择性压力和/或经典的诱变。考虑即使受保护的微生物有机体具有理想的工业特性，但是所述受保护的微生物有机体可能不足以抵抗一种或多种非期望的微生物有机体，例如入侵的地方菌群。因此，在本文的一些实施方案中，遗传防护者保护受保护的微生物有机体不受非期望的微生物有机体的影响。以示例的方式，非GMO微生物有机体可以用于多种过程，例如食品生产或纯化，如水纯化。在一些实施方案中，基于非GMO“受保护的”微生物有机体破坏一种或多种污染物(例如，已知的水污染物)的能力对其进行选择，并提供遗传防护者以保护受保护的微生物有机体不受已知的或潜在的入侵的非期望的微生物有机体的影响。在一些实施方案中，提供包含如本文所述的遗传防护者的系统。

维持不含有遗传修饰的有机体培养基是有用的，例如以实施特定的工业方法，和/或以遵守某些产品标准或规范。考虑根据本文的一些实施方案，可通过细菌素可透过而遗传防护微生物有机体不可透过的膜将遗传防护者与“受保护的”微生物有机体分离。由此，由遗传防护者产生的细菌素能够进入由受保护的微生物有机体所占据的培养基，因而保护受保护的有机体不受一种或多种非期望的微生物有机体的影响，同时所述遗传防护者仍与所述微生物有机体分离。

本文考虑特定的培养基可被多种非期望的微生物有机体入侵和/或受多种非期望的微生物有机体的影响，所述非期望的微生物有机体可以是对不同的细菌素或细菌素的组合敏感的。因此，在一些实施方案中，遗传防护微生物有机体产生两种或更多种不同的细菌素，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100种不同的细菌素，包括任何两个列出的值之间的范围，例如2至100、2至50、2至20、2至10、5至100、5至50、5至20、5至10、10至100、10至50、10至20、20至100、20至50或50至100种不同的细菌素。以示例的方式，在一些实施方案中，遗传防护者包括单一的大肠杆菌菌株，其产生20种不同的细菌素。在一些实施方案中，遗传防护者产生细菌素的混合物。在一些实施方案中，遗传防护者包括两种或更多种不同的产生细菌素的微生物有机体的混合，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2、30、35、40、45或50种不同的产生细菌素的微生物有机体，以提供细菌素的期望组合。以示例的方式，在一些实施方案中，遗传防护者包括4种不同的大肠杆菌菌株的组合，其中各菌株产生5种不同的细菌素(共20种不同的细菌素)。在一些实施方案中，遗传防护者产生靶向特定种类的微生物有机体(例如乳酸菌)的细菌素的混合物。

将遗传防护者与特定的环境或培养基分离是有用的，例如以维持工业培养环境或不含遗传修饰的有机体(GMO)的给料。在一些实施方案中，遗传防护者与受保护的微生物有机体物理分离。任选地，受保护的微生物有机体是非GMO。在一些实施方案中，遗传防护者与受保护的微生物有机体在时间上分离。任选地，受保护的微生物有机体是非GMO。例如，根据一些实施方案，在时间上分离可以包括：向培养基中添加遗传防护者以中和入侵生物，然后向所述培养基中添加所述受保护的微生物有机体。任选地，可在添加受保护的微生物有机体之前中和遗传防护者，例如通过如本文所述的细菌素或毒物-解毒剂系统。任选地，遗传防护者可被其自身细菌素中和，例如通过抑制遗传防护者中一种或多种相应的免疫调节剂的表达。例如，根据一些实施方案，在时间上分离可以包括：在培养基中培养受保护的微生物有机体，随后向所述培养基中添加遗传防护者。

在一些实施方案中，将遗传防护者置于第一环境中，并将受保护的微生物有机体置于第二环境中。可以通过由遗传防护者产生的细菌素可以透过而遗传防护者自身不能透过的膜将第一环境与第二环境分离。在一些实施方案中，所述膜对于受保护的微生物有机体是不通透的。在一些实施方案中，第一环境与第二环境流体连通。在不受任何理论限制的情况下，考虑由于细菌素通常包含可扩散的稳定的肽分子，因此在水性溶液中细菌素可以容易地从第一环境移动至第二环境。在一些实施方案中，所述第一环境包括第一室、槽或池，以及所述第二环境包括第二室、槽或池。在一些实施方案中，第二环境包括露天环境。任选地，工业生产过程例如发酵在第二环境中发生。在一些实施方案中，第一环境包括置于第二环境内部的容器。根据本文的实施方案，多种膜都适用于装置和系统，只要所述膜是细菌素可透过的但遗传防护者不可透过的。在一些实施方案中，所述膜包括下述中的至少一种：网孔、滤器(strainer)、过滤器(filter)、选择性阀、单向阀或多孔膜。在一些实施方案中，膜包含一个或多个具有直径小于遗传防护者的直径的孔。在一些实施方案中，细菌素通过所述膜扩散。在一些实施方案中，从第一环境至第二环境的流体运动驱动细菌素的移动。在一些实施方案中，基于培养基中已知的或可能非期望的微生物有机体选择遗传防护者。在一些实施方案中，一段时间之后改变遗传防护者。例如，响应入侵的非期望的微生物有机体的变化，可以调整遗传防护者，以添加其它细菌素和/或移除一些细菌素。

在一些实施方案中，在新的位置实施现有的微生物介导的工业方法，其特点为一种或多种可能的非期望的微生物有机体。由于现有的工业方法中的微生物有机体可能不产生针对新位置的非期望的微生物有机体中的一些或全部的细菌素，因此可向新位置的培养基中添加产生靶向非期望的微生物有机体的细菌素的遗传防护者。由此，遗传防护者的细菌素能够中和一种或多种非期望的微生物有机体，如果其存在于培养基中。

在一些实施方案中，遗传防护者产生细菌素的混合物。可以收集细菌素的混合物而不收集遗传防护者，并且可以将细菌素的混合物与目标培养基接触。由此，可以在培养基与遗传防护者之间维持分离。技术人员将会理解，多种方法都适用于将细菌素与遗传防护者分离，只要所述方法基本上不损害所述细菌素、使所述细菌素变性或者破坏所述细菌素。在一些实施方案中，通过滤出遗传防护者而收集细菌素的混合物。在一些实施方案中，通过离心将遗传防护者与细菌素分离而收集细菌素的混合物。在一些实施方案中，通过中和遗传防护者而收集细菌素的混合物。在一些实施方案中，在将混合物与培养基接触之前，储存所述混合物。

图6为显示根据本文的一些实施方案，包含遗传防护者的系统600的示意图。系统600可以包含第一环境610和第二环境620。任选地，所述第二环境620可以包含入口622和/或出口624。待处理的液体或培养基，例如污水或给料可以通过入口622进入626，并通过出口离开628。通过膜630可将第一环境610与第二环境620分离，所述膜可透过细菌素，但是不可透过遗传防护微生物有机体640。第一环境610可以包含遗传防护微生物有机体640，其产生能够在第一环境610与第二环境620之间移动的细菌素650。第二环境620可以包含受保护的微生物有机体660，其对由遗传防护者640所产生的细菌素的中和作用不敏感。任选地，受保护的微生物有机体660可以是非GMO。然而，如果存在非期望的微生物有机体670、675，则所述非期望的微生物有机体670、675可被所述细菌素中和。在一些实施方案中，系统600包含污水处理系统。在一些实施方案中，所述系统包含第二入口623，以使待处理的液体在进入第二环境620之前进入627第一环境610。任选地，所述系统可以包含第二入口623而非第一入口622。任选地，所述系统可以包含第二入口623以及第一入口622。由此，遗传防护微生物有机体640可以分泌细菌素以中和入侵的非期望的有机体670、675，同时维持遗传防护微生物有机体640与受保护的微生物有机体660之间的物理分离。

图7为显示根据本文的一些实施方案，可用于光合生产的遗传防护系统700的示意图。系统700可以包含第一环境710。任选地，第一环境710可以包含入口715。第一环境710和可选的入口715可以与第二环境720存在流体或气体连通。第一环境710可以通过细菌素和气体可以透过而遗传防护微生物有机体640不可透过的膜730与第二环境720分离。第一环境710可以包含遗传防护微生物有机体640，其产生可以在第一环境710与第二环境720之间移动的细菌素740。所述第二环境可以包含光合微生物有机体750，例如光合微藻。任选地，光合微生物有机体750是非GMO。光源760可以与第二环境720存在光通信。考虑光源760可以包括阳光和/或人工光。CO2770可以进入第二环境720，并且可以与来自光源760的光组合，用于光合微生物有机体750的光合生产。任选地，CO2770可以进入第一环境710的入口715，并通过膜730进入第二环境720。由遗传防护微生物有机体740产生的细菌素740可以通过膜730进入第二环境720，并且能够中和第二环境中的非期望的微生物有机体780、785。任选地，所述第二环境可以包含出口780，并且由光合微生物有机体760产生的生物质790能够通过出口790离开第二环境720。由此，遗传防护微生物有机体640能够分泌细菌素以中和入侵的非期望的有机体670、675，同时维持遗传防护微生物有机体640与光合微生物有机体750以及生物质790之间的物理分离。

给料的保存和/或储存

在未在给料中实施工业方法的情况下储存给料是有用的，例如以增加储备，以防后续需要额外输出，以暂时降低输出和/或以将给料运送至不同的位置。例如，当用于饲养动物的给料被用于饲养动物时，其可以在夏天收获，并储存直至冬天。例如，给料可以经受初轮发酵，以产生给料中期望的组分，或者以破坏或移除给料中的期望的组分，和/或以稳定给料用于储存，然后可以保存所述肥料直至其被耗尽。

本文考虑，储存期间，非期望的微生物有机体可能污染给料和/或消耗或破坏给料中的一种或多种组分。例如，可以选择微生物有机体或者将微生物有机体工程化以由给料中的纤维素产生葡萄糖。然而，在包含葡萄糖的给料中，非期望的微生物有机体可以将葡萄糖分解代谢。因此，在一些实施方案中，向给料中添加遗传防护者，以保护所述给料在储存期间不受一种或多种非期望的微生物有机体的影响。在一些实施方案中，给料经受初轮加工(例如发酵)以产生、移除或破坏至少一种组分(例如以稳定给料用于储存和/或以提供给料中期望的组分，如来自纤维素的葡萄糖)，然后遗传防护者保护给料不受后续非期望的微生物有机体的影响。在一些实施方案中，在发酵期间和/或储存期间，通过细菌素可透过的膜将遗传防护者与给料物理分离。考虑根据本文的一些实施方案，给料中细菌素介导的非期望的微生物有机体的中和能够允许给料稳定储存较长时间。在一些实施方案中，给料稳定储存至少一个月，例如至少一个月，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月。

在一些实施方案中，将遗传防护者与给料接触。在一些实施方案中，遗传防护者已经存在于给料中，并且在储存之前或储存期间诱导遗传防护者的增殖，以使所述遗传防护者产生细菌素，从而中和给料中非期望的微生物有机体。

制备和利用产生细菌素的微生物有机体的方法：

根据本文的一些实施方案，可以制备产生细菌素的微生物有机体，以用于工业方法中，所述工业方法易受非期望的微生物有机体的污染或干扰或者处于所述污染或干扰的风险中。在一些实施方案中，设计用于细菌素的期望产生的线路，将核酸序列工程化，并将所述线路组装并引入宿主微生物有机体中。

图8为显示制备和利用细菌素的方法的流程图。所述方法可以包括鉴定编码靶向非期望的微生物有机体的细菌素的一组基因810。根据本文的一些实施方案，鉴定基因的方法包括利用电子数据库鉴定细菌素基因，例如可在万维网网址bactibase.pfba-lab-tun.org/main.php处进入的bactibase。所述方法可以包括设计用于表达细菌素的构建体，包括整合基因集、启动子以及基因调控元件820。由此，可以设计构建体。根据本文的一些实施方案，用于设计合适的构建体的方法可以包括利用部件数据库，例如电子数据库，如生物砖(Biobricks)基金会部件数据库。本文考虑，根据一些实施方案，技术人员可以基于所鉴定的组件功能选择期望的组件(包括但不限于细菌素核苷酸、启动子和基因调控元件)，并基于鉴定的这些组件的功能，工程化具有期望功能的构建体。以示例的方式，可以在一个或多个数据库中找到不同的可能的元件的功能，如生物砖目录(Biobrickscatalog)。生物砖组件的目录可在万维网parts.igem.org处进入。所述方法可以包括用可兼容的整合位点将基因集工程化830，这可以允许基因以期望的方式组装和/或被适当地引入期望的宿主中。可以使用多种合适的整合位点，例如限制位点、用于酶重组反应的底物或用于同源重组的序列。在一些实施方案中，基因集是合成的。在一些实施方案中，包含所述基因集的核酸是合成的。在一些实施方案中，在一种或多种载体如质粒中提供基因集。所述方法可以包括组装线路840。所述线路可以包括一种或多种细菌素核酸和合适的启动子以及调节元件。多种线路配置都可以是适合的。在一些实施方案中，单个启动子驱动多种细菌素和可选的目标基因产物的表达。在一些实施方案中，不同的细菌素核酸受不同的启动子的控制。在一些实施方案中，单一构建体如质粒中包含线路。在一些实施方案中，在两种或更多种构建体如质粒中包含线路。在一些实施方案中，包含完整线路的核酸是合成的。在一些实施方案中，利用常规分子克隆技术或者核酸合成与分子克隆的组合来组装所述线路。分子克隆技术对技术人员是众所周知的。在GreenandSambrook“MolecularCloning:ALaboratoryManual”(2012)ColdSpringHarborLaboratoryPress；第四版中描述了许多合适的分子克隆技术，在此以引用的方式将其整体并入。所述方法可以包括将所述线路引入期望的宿主内850。合适的宿主包括但不限于天然存在的、基因工程化的以及完全合成的微生物有机体，包括但不限于本文所述的示例性的微生物有机体。任选地，所述方法包括实施表型表征860，例如菌株行为。例如，下述可能是有用的：选择期望的转化体或重组体，确定菌株产生期望的细菌素，和/或确定调节线路响应适当的刺激，如工业前体或产物。所述方法可以包括工业应用，所述工业应用包括在生产计划中使用产生的菌株870。例如，产生细菌素的菌株可被引入现有的培养基中，或者可被用作新培养基的起始培养物。

试剂盒

根据本文的一些实施方案，提供试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒含有如本文所述的细菌素、细菌素多核苷酸、免疫调节剂、免疫调节剂多核苷酸、其它遗传组件(如启动子、表达载体、接合质粒等)、基因工程化微生物细胞和/或培养基中的至少一种。在一些实施方案中，试剂盒还包含包装和/或使用其中的内含物的说明书。在一些实施方案中，试剂盒包含多种细菌素，例如用于确定候选细菌素或其组合对培养环境的影响。在一些实施方案中，试剂盒包含多种细菌素多核苷酸和免疫调节剂多核苷酸，例如用于构建具有期望特征的微生物细胞。在一些实施方案中，试剂盒包含多种供体微生物细胞，所述供体微生物细胞含有编码至少一种细菌素和/或至少一种免疫调节剂的多种组合的供体质粒。

实施例1：蓝细菌的保护和逃逸时的中和

提供含有脂质生物合成途径的蓝细菌。所述蓝细菌被基因工程化，以包含受具有组成型活性的第一启动子控制的细菌素多核苷酸。所述蓝细菌包含抵抗细菌素并受第二启动子控制的免疫调节剂的免疫调节剂多核苷酸，所述第二启动子仅在存在工业上有用的给料中发现的前体的情况下具有活性。将蓝细菌置于给料中。当蓝细菌在给料中产生脂质时，其还分泌活性细菌素，由此中和入侵的微生物。当从给料中逃逸时，所述蓝细菌不再具有免疫调节剂活性，但仍产生细菌素，并由此被所述细菌素中和。

实施例2：芽孢杆菌的保护、质粒的维持以及逃逸时的中和

提供基因工程化芽孢杆菌细胞，其包含整合进其染色体基因组的细菌素多核苷酸，以及含有抵抗细菌素的免疫调节剂的免疫调节剂多核苷酸和编码待被生产的多肽的多核苷酸的质粒。所述细菌素受组成型启动子的控制。所述免疫调节剂多核苷酸受这样的启动子的控制：其仅在存在工业上有用的给料中发现的前体的情况下具有活性。由此，当芽孢杆菌存在于给料中时，其产生细菌素，以杀死入侵的微生物细胞。此外，当芽孢杆菌克隆丢失质粒时，它们变为不理想的(由于它们不再能够产生待被生产的多肽)，并且作为也丢失免疫调节剂的结果，其被细菌素杀死。当从给料中逃逸时，芽孢杆菌细胞不再具有免疫调节剂活性，但仍产生细菌素，由此被其环境中的其它基因工程化芽孢杆菌细胞产生的细菌素所中和。

实施例3：酿酒酵母(S.cerevisiae)的两种伴侣菌株的水平的调节

提供第一酿酒酵母菌株。所述第一菌株包含受第一启动子控制的细菌素多核苷酸，所述第一启动子由代谢物的存在所诱导。由此，随着代谢物水平的增加，细菌素的表达更强。编码的细菌素阻止酿酒酵母的细胞周期，但是是抑菌性的而非溶菌性的。所述第一菌株还包含用于赋予针对第一细菌素的免疫性的免疫调节剂多核苷酸，所述细菌素受由仅在工业给料中存在的化合物所激活的启动子的控制。酿酒酵母的第二伴侣菌株包含编码产生代谢物的酶的多核苷酸，但是不包含相应的免疫调节剂活性。随着代谢物水平通过第二菌株的活性的增加，第一菌株产生越来越多的细菌素，由此阻止第二菌株的细胞周期，并降低可用的第二菌株细胞的相对量。同时，第一菌株继续增殖。因此，第一菌株对第二菌株的相对比例增加，并且代谢物的积累减少。

实施例4：大肠杆菌对嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(A.ferrooxidans)的调节

将嗜酸性氧化亚铁硫杆菌菌株工程化，以从给料中Fe(II)至Fe(III)的氧化中产生储存的能量，所述给料包含将Fe(II)扩散至给料中的铁源。将大肠杆菌菌株工程化以控制嗜酸性氧化亚铁硫杆菌第一菌株的生长。所述嗜酸性氧化亚铁硫杆菌包含受rus操纵子启动子(SEQIDNO:549)控制的编码大肠杆菌素-Ia(SEQIDNO:56)的核酸，以及受组成型启动子(枯草芽孢杆菌ctc启动子，SEQIDNO:663)控制的编码大肠杆菌素-Ia免疫调节剂(SEQIDNO:464)的核酸。然而，所述氧化亚铁菌株不产生任何大肠杆菌素-E1免疫调节剂。所述大肠杆菌菌株包含受整合进其基因组的组成型启动子(SEQIDNO:651)控制的编码大肠杆菌素-E1(SEQIDNO:54)和大肠杆菌素-E1免疫调节剂(SEQIDNO:465)的核酸。然而，所述大肠杆菌菌株不产生大肠杆菌素-Ia免疫调节剂(SEQIDNO:464)。随着嗜酸性氧化亚铁硫杆菌将Fe(II)氧化为Fe(III)，Fe(II)的水平降低。由此，rus启动子的活性降低，并且嗜酸性氧化亚铁硫杆菌产生更低水平的大肠杆菌素-Ia(SEQIDNO:54)。因此，大肠杆菌菌株的任何中和被最小化。大肠杆菌第二菌株增殖，产生更高水平的大肠杆菌素-E1(SEQIDNO:54)。大肠杆菌素-E1中和嗜酸性氧化亚铁硫杆菌，因此存在较少的嗜酸性氧化亚铁硫杆菌将Fe(II)氧化至Fe(III)。因此，Fe(II)的水平再次增加。随着Fe(II)累积，嗜酸性氧化亚铁硫杆菌产生更高水平的大肠杆菌素-Ia(SEQIDNO:56)，中和大肠杆菌第二菌株的有机体。因此，在产生大肠杆菌素-E1的最低限度的大肠杆菌的情况下，嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的中和也是最低限度。嗜酸性氧化亚铁硫杆菌增殖，将Fe(II)氧化至Fe(III)，并储存能量。

实施例5：用于非GMO微生物有机体合成乙醇的遗传防护者

根据本文的一些实施方案，将遗传防护者用于保护从给料中的葡萄糖产生乙醇的非GMO微生物有机体。所述遗传防护者包括包含并表达受单一组成型启动子控制的20种不同的细菌素核酸的大肠杆菌菌株，并由此产生合适的化学计量比的20种不同的细菌素。也考虑根据本文的一些实施方案，其它合适的选择是提供包含五种不同的大肠杆菌菌株的遗传防护者，其中每种都包含并表达五种不同的细菌素。将所述遗传防护者置于如图6中所示的系统的第一环境610中。细菌素通过多孔膜扩散以进入第二环境。多孔膜由多孔的聚四氟乙烯制成，其可透过细菌素和液体，但是不能透过所述遗传防护者。在第二环境中培养非GMO发酵酿酒酵母。所述非GMO发酵酿酒酵母从给料中的葡萄糖产生乙醇。来自遗传防护者的细菌素中和入侵的微生物有机体，防止通过入侵的微生物有机体的给料污染和乙醇消耗。多孔膜维持了基因工程化遗传防护者与非GMO发酵酵母之间的物理分离。由此，保护发酵酵母不受非期望的微生物有机体的影响，同时保持部分给料不含GMO。

实施例6：通过遗传防护者保护非GMO光合微藻

根据本文的一些实施方案，将遗传防护者用于保护产生生物质的非GMO光合微藻。生物质可以适用于多种下游应用，例如提取目标化合物、能量或动物饲料。遗传防护者包含50种不同的枯草芽孢杆菌菌株的混合物，其中每种产生不同的细菌素。将所述遗传防护者置于如图7中所示的系统的水性第一环境710中。所述系统还包含水性第二环境720，其含有非GMO光合微藻，产生生物质。通过0.5μm的玻璃纤维过滤器将第一环境与第二环境分离，从而允许气体、液体和细菌素在第一环境与第二环境之间传递，同时阻断细菌素从第一环境与第二环境之间的传递。CO₂通过第一环境中的入口进入系统，并通过第一环境和第二环境扩散。阳光进入第二环境，并驱动光合微藻产生生物质。因此，在第二环境中产生高葡萄糖的生物质。所述50种不同的细菌素也从第一环境扩散至第二环境。所述细菌素中和入侵的非期望的微生物有机体，由此阻止生物质的污染，并阻止非期望的微生物有机体干扰生物质的产生和/或将生物质分解代谢。通过出口从第二环境中收获生物质。由此，在基因工程化遗传防护者与非GMO光合微藻之间维持物理分离，同时中和第二环境中入侵的微生物。

实施例7：针对乳酸菌家族(LAB)的酿酒酵母的保护

将酿酒酵母工程化，以产生对乳酸菌(LAB)具有活性的多种细菌素。根据bactibase数据库，LeucococinC(SEQIDNO:368)和DiversinV41(SEQIDNO:74)显示对LAB细菌具有活性，所述数据库可在万维网bactibase.pfba-lab-tun.org/main.php处进入。考虑由于酿酒酵母对Leucococin或DiversinV41不敏感，不需要将相应的免疫基因座整合进酿酒酵母。由此，选择LeucococinC(SEQIDNO:368)和DiversinV41(SEQIDNO:74)，并提供编码LeucococinC(SEQIDNO:369)和DiversinV41(SEQIDNO:75)的多核苷酸。所述多核苷酸编码LeucococinC(SEQIDNO:368)和DiversinV41(SEQIDNO:74)，每一种都融合至来自酵母交配因子α的信号肽中，以促进酿酒酵母的分泌。将所述多核苷酸整合进受强组成型启动子PPGK1(3-磷酸甘油酸激酶)(SEQIDNO:692)控制的单一酿酒酵母菌株的基因组中。利用标准同源重组进行转化。本文考虑其它合适的强组成型启动子，包括但不限于PTEF1(翻译延伸因子)和PGAP(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)(组成型酵母启动子的列表可在万维网parts.igem.org/Promoters/Catalog/Yeast/Constitutive处获得)。通过对入侵生产计划的LAB培养物的抑制分析，测量由转化的酿酒酵母表达的细菌素的活性。随着入侵给料的非期望的微生物有机体的组成随时间的改变，可以生产产生额外的、更少和/或不同细菌素的酿酒酵母菌株，并将所述菌株引入工业给料中。

Claims (47)

1.第一微生物细胞，其包含编码控制第二微生物细胞生长的分泌的细菌素的核酸，以及赋予抗所述分泌的细菌素抗性的核酸，其中所述第一微生物细胞已被基因工程化，以允许调节赋予抗所述细菌素抗性的所述核酸的表达或活性。

2.如权利要求1所述的第一微生物细胞，其中如果所述第一微生物细胞从期望的生长环境中释放，则赋予抗所述细菌素抗性的所述核酸的表达或活性降低至导致所述第一微生物细胞被所述细菌素中和的水平。

3.如权利要求1或2中任一项所述的第一微生物细胞，其中所述第一微生物细胞已被基因工程化，以产生期望的产物。

4.如权利要求3所述的第一微生物细胞，其中所述分泌的细菌素还已被选择以维持培养物中的至少一种条件，其中所述第一微生物细胞产生所述期望的产物。

5.如权利要求1-4中任一项所述的第一微生物细胞，其中所述培养物包含至少一种入侵的微生物有机体。

6.如权利要求4-5中任一项所述的第一微生物细胞，其中所述培养物中的至少一种条件包括控制所述第二微生物细胞的生长，其中所述第二微生物细胞是所述培养物中的常见污染。

7.如权利要求1-6中任一项所述的第一微生物细胞，其中所述第二微生物细胞是与所述第一微生物细胞不同的菌株、物种或属。

8.如权利要求1-7中任一项所述的第一微生物细胞，其还包含编码第二分泌的细菌素的核酸，以及赋予抗所述分泌的第二细菌素抗性的核酸，所述第二分泌的细菌素控制第三微生物细胞的生长，其中所述第一微生物细胞已被基因工程化，以允许调节赋予抗所述细菌素抗性的所述核酸的表达或活性。

9.如权利要求1-8中任一项所述的第一微生物细胞，其中所述细菌素杀死所述第二微生物细胞。

10.如权利要求1-9中任一项所述的第一微生物细胞，其中所述细菌素降低所述第二微生物细胞的生长速率。

11.如权利要求1-9中任一项所述的第一微生物细胞，其中所述细菌素阻止所述第二微生物细胞的生长。

12.如权利要求1-11中任一项所述的第一微生物细胞，其中赋予抗所述细菌素抗性的所述核酸的转录受可调节的启动子的控制。

13.如权利要求1-11中任一项所述的第一微生物细胞，其中由赋予抗所述细菌素抗性的所述核酸所编码的多肽的活性是可调节的。

14.如权利要求1-13中任一项所述的第一微生物细胞，其中编码所述细菌素的所述核酸位于所述微生物细胞的染色体上。

15.如权利要求1-14中任一项所述的第一微生物细胞，其中赋予抗所述细菌素抗性的所述核酸位于质粒上。

16.如权利要求1-14中任一项所述的第一微生物细胞，其中编码所述细菌素的所述核酸和赋予抗所述细菌素抗性的所述核酸位于一个或多个质粒上。

17.如权利要求1-16中任一项所述的第一微生物细胞，其中所述第一微生物细胞选自细菌、酵母和藻类。

18.培养物，其包含权利要求1-16中任一项所述的第一微生物细胞，其中所述培养物还包含第二微生物细胞，所述第二微生物细胞在所述培养物中的存在是期望的，并且其生长速率受所述细菌素的控制。

19.控制培养基中第二微生物细胞生长的方法，所述方法包括在权利要求1-17任一项所述的第一微生物细胞产生足以控制所述第二微生物细胞生长的水平的细菌素的条件下，在包含所述第二微生物细胞的培养基中培养所述第一微生物细胞。

20.如权利要求19所述的方法，其中将所述培养连续维持至少30天。

21.如权利要求19或20中任一项所述的方法，其还包括：

检测所述培养基中的至少一种变化，所述变化包括第三微生物细胞的存在、或者其水平或活性的增加；和

响应所述变化将所述第一微生物细胞再工程化，以产生足以控制所述第三微生物细胞生长的水平的第二细菌素。

22.检测培养物中的分子的存在、不存在或其量的方法，所述方法包括：

在所述培养基中培养权利要求12所述的第一微生物细胞，其中所述可调节的启动子受所述分子调节，以使(a)所述可调节的启动子在所述分子存在的情况下驱动转录，而在所述分子不存在的情况下不驱动转录，或者(b)所述可调节的启动子在所述分子不存在的情况下驱动转录，而在所述分子存在的情况下不驱动转录；

从所述培养物中分离一定量的第一微生物细胞的基因组核酸；

由所述一定量的基因组核酸检测第一微生物细胞特有的核酸序列的存在、不存在或其量。

23.如权利要求22所述的方法，其还包括将所述第一微生物细胞特有的核酸序列的量与参考核酸序列的量进行比较。

24.基因工程载体，其包含赋予抗细菌素抗性的核酸，其中所述核酸的表达或活性被配置为响应给料中组分的存在、水平或不存在而改变。

25.如权利要求24中所述的载体，其还包含编码所述细菌素的核酸。

26.如权利要求24或25中任一项所述的载体，其还包含编码期望的产物的核酸。

27.试剂盒，其包含多种基因工程化微生物有机体菌株，其中各菌株都已被基因工程化，以允许调节赋予抗不同细菌素抗性的核酸的表达或活性。

28.鉴定至少一种细菌素的方法，所述细菌素调节工业培养基中至少一种微生物细胞的生长，所述方法包括：

将所述工业培养基与包含所述至少一种细菌素的培养基或组合物接触；和

确定所述至少一种细菌素是否对所述至少一种微生物细胞的生长具有期望的作用。

29.如权利要求28所述的方法，其还包括将所述工业培养基与由权利要求1至17中任一项所述的第一微生物细胞所产生的至少一种细菌素接触。

30.如权利要求29所述的方法，其中由权利要求1至17中任一项所述的第一微生物细胞所产生的所述至少一种细菌素位于从包含所述第一微生物细胞的培养物获得的上清液中。

31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其还包括构建基因工程化微生物细胞以产生至少一种细菌素，所述细菌素已被确定对所述至少一种微生物细胞的生长具有期望的作用。

32.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述至少一种微生物细胞是为所述工业培养基中常见入侵物的有机体。

33.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述至少一种微生物细胞是新近入侵已有的工业培养物的有机体。

34.用于中和培养基中的非期望的微生物有机体的系统，所述系统包括：

第一环境，其包含培养基；和

第二环境，其包含分泌两种或更多种不同的细菌素的第二微生物有机体，

其中所述第二微生物有机体包含针对两种或更多种不同的细菌素中的每一种的免疫调节剂，

其中所述第二环境与所述第一环境流体连通，

其中所述第二环境与所述第一环境物理分离，以使所述第二微生物有机体不能从所述第二环境移动至所述第一环境，并且

其中所述分泌的两种或更多种不同的细菌素进入所述第一环境的培养基中。

35.如权利要求34所述的系统，其还包含所述培养基中的第一微生物有机体，

其中所述第一微生物有机体不分泌两种或更多种不同的细菌素，并且

其中所述第一微生物有机体不被两种或更多种不同的细菌素中的任何一种中和。

36.如权利要求35所述的系统，其中所述第一微生物有机体是非-GMO。

37.如权利要求35-36中任一项所述的系统，其中所述第一微生物有机体使所述培养基中的组分发酵。

38.如权利要求35-37中任一项所述的系统，其中所述第一微生物有机体消除所述培养基的污染。

39.如权利要求35-38中任一项所述的系统，其中所述第一微生物有机体进行光合作用，并且所述光合作用包含底物，所述底物包含在所述培养基中。

40.如权利要求34-40中任一项所述的系统，其中通过可透过所述两种或更多种不同的细菌素而不可透过所述第二微生物有机体的下述中的至少一种将所述第二环境与所述第一环境分离：膜、网、过滤器或阀。

41.储存给料的方法，所述方法包括：

提供给料；

提供第一微生物有机体，其中所述第一微生物有机体分泌两种或更多种不同的细菌素；

将所述给料与所述细菌素接触；和

将所述给料储存所需的时间段。

42.如权利要求41所述的方法，其中将所述给料与所述细菌素接触包括将所述给料与所述微生物有机体接触。

43.如权利要求41-42中任一项所述的方法，其中将所述给料与所述细菌素接触包括将所述微生物有机体置于与所述给料的流体连通中，同时维持所述微生物有机体与所述给料之间的物理分离，以使所述细菌素与所述给料接触，而所述微生物有机体与所述给料不直接接触。

44.如权利要求41-43中任一项所述的方法，其还包括在将所述给料与所述细菌素接触之前或者同时，用第二微生物有机体发酵所述给料。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述发酵包括在所述给料中产生期望的组分或者从所述给料中去除非期望的组分中的至少一种。

46.如权利要求41-45中任一项所述的方法，其中所述所需的时间段包括至少一个月。

47.如权利要求41-45中任一项所述的方法，其中所述所需的时间段包括至少六个月。