CN109161508A - 一种微生物培养基及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种微生物培养基及其制备方法与应用,所述微生物培养基按重量份计包括以下组分:棉籽饼粉3.5~5.5份,酵母粉0.8~1.4份,葡萄糖4.5~8.5份,蛋白胨4~5份,磷酸二氢钠0.05~0.1份,磷酸氢二钠0.05~0.1份,乙酰辅酶A 0.02~0.04份,硝酸盐0.001~0.02份;本发明所提供的微生物培养基能够促进微生物自身对于营养物质的吸收以及相关代谢过程进行,有利于微生物的稳定生长和繁殖,是一种优良的、适用性广泛的微生物培养基。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域,涉及一种微生物培养基及其制备方法与应用。
背景技术
我国的生物制药蓬勃发展,在工业化、规模化生产过程中,对培养基的要求越来越高。发酵培养基的营养成分对菌种生长、繁殖和合成产物的速率有重要的影响。它既要使种子接种后能迅速生长,达到一定的菌丝浓度,又要使长好的菌体能迅速合成目标产物。因此,要求发酵培养基的组成合理,营养均衡,并且还要有菌体生长所需的生长因子和产物合成需要的特定元素、前体和促进剂。发酵前期为生长阶段,这一阶段以快速繁殖菌体为目的,当细胞繁殖达到一定数量、底物消耗和代谢产物到一定水平后,发酵过程逐渐迁移到以产物形成为主的生产阶段,细胞生长处于维持状态,产物以稳定的速率生成,直到底物和产物或某些发酵参数成为限制因素而结束发酵。发酵培养基的设计和生长需要考虑尽可能满足菌体快速生长繁殖要求;尽可能保持整个发酵过程中工艺参数的平稳性,延长生长期。不同类型的微生物对营养的需求差异很大,应根据菌种对各营养要素的不同要求进行配置。一个适当的培养基配方,对发酵产品的产量和质量有着极大的影响。
CN102732571A公开了一种生产骨化三醇的发酵培养基以及发酵转化方法和用途,该发酵培养基包括碳源和氮源,其中,按所述发酵培养基的总体积计,所述碳源的含量为5-80g/L;所述氮源的含量为2-80g/L;所述碳源选自葡萄糖、麦芽糊精和可溶性淀粉中的一种或多种,所述氮源选自黄豆饼粉、棉籽饼粉、蛋白胨、酵母浸膏和酵母浸粉中的一种或多种;此发酵培养基特异性较高,应用范围较为局限。
CN106591402A公开了一种泰乐菌素发酵配方,按重量百分比,该配方主要包括以下组分:玉米粉0.8~2.0,丝素粉0.5~1.8,麸质粉0.5~1.5,棉籽饼粉0.1~1.0,氯化钾0.05~0.15,甜菜碱盐酸盐0.02~0.08,磷酸氢二铵0.01~0.07,氯化钴0.0001~0.0008,硫酸镍0.0001~0.0008,轻质碳酸钙0.1~0.6,豆油1~4,其余为水。此配方用成本较低的丝素粉替代鱼粉,有效的降低了生产成本;并且新配方不含鱼粉,减少了鱼粉质量对发酵液质量和发酵效果的影响,提高了生产的稳定性。此配方也仅仅针对泰乐菌素的发酵生产才有良好的效果,应用同样比较局限。
CN103233052A公开了一种用于红霉素发酵的复合有机氮源及培养基,有机氮源由黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、玉米浆干粉和玉米蛋白粉混合而成,得到的混合物即为复合有机氮源。此发明提供的复合有机氮源,由于在保证总氮平衡的基础上充分搭配了各种氨基酸的含量尤其是在红霉素发酵过程中起重要作用的蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的含量,可以有效地提高红霉素发酵水平,改善发酵组分,同时也大大降低了发酵氮源成本,具有很好的经济效益。
因此,如何开发一种能够菌体稳定、快速生长的培养基,对于微生物的培养以及下游产品生产,具有重要的价值。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种微生物培养基及其制备方法与应用,以达到能够快速、稳定培养微生物的效果,进一步促进生化工艺生产。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种微生物培养基,所述微生物培养基按重量份计包括以下组分:
本发明提供的微生物培养基,通过在培养基中添加棉籽饼粉,为微生物生长提供了丰富的氮源,并且通过使用乙酰辅酶A和硝酸盐的配合,能够促进微生物自身对于营养物质的吸收以及相关代谢过程进行,有利于微生物的稳定生长和繁殖,是一种优良的、适用性广泛的微生物培养基。
在本发明中,所述棉籽饼粉的重量份为3.5~5.5份,例如可以是3.5份、3.8份、4份、4.2份、4.5份、4.9份、5份、5.3份或5.5份等。
棉籽饼是棉籽榨油后的副产物,目前主要应用作为饲料使用。
在本发明中,所述酵母粉的重量份为0.8~1.4份,例如可以是0.8份、0.9份、1份、1.1份、1.2份、1.3份或1.4份等。
在本发明中,所述葡萄糖的重量份为4.5~8.5份,例如可以是4.5份、5份、5.5份、6份、6.5份、7份、7.5份、8份或8.5份等。
在本发明中,所述蛋白胨的重量份为4~5份,例如可以是4份、4.1份、4.2份、4.3份、4.4份、4.5份、4.6份、4.7份、4.8份、4.9份或5份等。
在本发明中,所述磷酸二氢钠的重量份为0.05~0.1份,例如可以是0.05份、0.06份、0.07份、0.08份、0.09份或1份等。
在本发明中,所述磷酸氢二钠的重量份为0.05~0.1份,例如可以是0.05份、0.06份、0.07份、0.08份、0.09份或1份等。
在本发明中,磷酸二氢钠和磷酸氢二钠主要起到缓冲的作用,能够调节培养基的pH值。
在本发明中,所述乙酰辅酶A的重量份为0.02~0.04份,例如可以是0.02份、0.025份、0.03份、0.035份或0.04份等。
乙酰辅酶A是辅酶A的乙酰化形式,它是脂肪酸的β-氧化及糖酵解后产生的丙酮酸氧化脱羧的产物。在许多代谢过程中起着关键的作用。它是脂酸合成,胆固醇合成和酮体生成的碳来源。三大营养物质的彻底氧化殊途同归,都会生成乙酰辅酶A以进入TCA循环。
在本发明中,所述硝酸盐的重量份为0.001~0.02份,例如可以是0.001份、0.005份、0.008份、0.01份、0.012份、0.015份、0.017份或0.02份等。
优选地,所述硝酸盐包括硝酸铈、硝酸镨、硝酸镧或硝酸铷中的任意一种或至少两种的组合。
硝酸盐的种类较多,如本发明所使用的硝酸铈在分析化学中用作分析试剂,也用于制药工业;硝酸镨主要用于轻工,催化领域;硝酸镧用于生产光学玻璃,汽灯纱罩及荧光粉、防腐剂;硝酸铷在有机合成中用作催化剂、螯合剂等。
本发明意外地发现,通过上述类型的硝酸盐与乙酰辅酶A的配合使用,可以大大提升微生物的生长能力,并且趋于稳定;这可能是由于硝酸盐不仅为培养基中提供了丰富的氮源,同时所含有的金属离子与乙酰辅酶A产生良好的生化促进作用,促进了微生物自身的代谢调控,使得微生物能够呈现良好的生长态势;而且在应用于下游产品生产时,能够使得微生物具备良好的发酵生产能力。
优选地,所述微生物培养基还包括重量份为0.03~0.05份(例如可以是0.03份、0.035份、0.04份、0.042份、0.045份、0.049份或0.05份等)的吐温80。
吐温80为聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯,简称聚山梨酯-80。一般用作混悬剂的润湿剂、非离子型表面活性剂等。而在本发明的培养基中,添加一定量的吐温80后,培养基混合更加均匀,整体性更强,有利于微生物的均匀生长。
优选地,所述棉籽饼粉的蛋白质含量为40%~50%,例如可以是40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%或50%等。
优选地,所述蛋白胨的蛋白质含量为80%~90%,例如可以是80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或90%等。
优选地,所述酵母粉的蛋白质含量为40%~50%,例如可以是40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%或50%等。
在本发明中,棉籽饼粉、蛋白胨和酵母粉的蛋白质含量,会对微生物的生长产生影响,控制蛋白质含量,可以保证微生物摄取足够的能量以达到生长要求。
第二方面,本发明提供了一种如第一方面所述的微生物培养基的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(1)将棉籽饼粉、酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠按比例混合搅拌均匀得到混合物;
(2)将乙酰辅酶A、硝酸盐和任选地吐温80分别溶于水中得到溶液后,加入到步骤(1)得到的混合物中,干燥得到微粉,进一步混匀后得到所述微生物培养基。
优选地,步骤(1)中所述混合的温度为30~50℃,例如可以是30℃、32℃、35℃、38℃、40℃、45℃或50℃等。
优选地,所述步骤(1)中所述混合的时间为10~60min,例如可以是10min、20min、30min、40min、50min或60min等。
优选地,步骤(2)中所述干燥的温度为60~80℃,例如可以是60℃、62℃、65℃、68℃、70℃、75℃或80℃等。
优选地,步骤(2)中所述加入到步骤(1)得到的混合物的方法为:通过独立喷头,分别将溶液射入到步骤(1)的混合物中。
优选地,步骤(2)中所述干燥的方式为气流干燥。
在本发明中,使用气流干燥的方式,能够避免培养基中的营养物质流失。
优选地,步骤(2)中所述干燥的温度为50~70℃,例如可以是50℃、52℃、55℃、58℃、60℃、65℃、67℃、68℃或70℃等。
优选地,步骤(2)中所述微粉的细度为100~200目,例如可以是100目、120目、140目、150目、180目或200目等。
在本发明中,将制备好的培养基制作成为微粉,有利于后续的溶解使用。
优选地,所述制备方法包括如下步骤:
(1)将棉籽饼粉、酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠按比例在30~50℃下,经过10~60min混合搅拌均匀得到混合物;
(2)将乙酰辅酶A、硝酸盐和任选地吐温80分别溶于水中得到溶液后,通过独立喷头,分别将溶液射入到步骤(1)的混合物中,在50~70℃下,经过气流干燥得到细度为100~200目微粉,进一步混匀后得到所述微生物培养基。
第三方面,本发明提供了一种如第一方面所述的微生物培养基在培养大肠杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母中的应用。
本发明提供的微生物培养基,对于上述4种菌种的培养具有更好的效果,能够使得菌体生长稳定,代谢循环良好。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
本发明提供的微生物培养基,通过使用乙酰辅酶A和硝酸盐的配合,能够促进微生物自身对于营养物质的吸收以及相关代谢过程的进行,有利于刺激微生物的稳定生长和繁殖,同时棉籽饼粉为微生物生长提供了丰富的氮源,保证了微生物足够的能量摄取;综合来看,本发明提供的微生物培养基能够促进各种菌种的良好生长,相比于目前常用的微生物培养基的应用环境单一,本发明的微生物应用范围更加广泛,具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种微生物培养基,按重量份计包括以下组分:
其中,棉籽饼粉的蛋白质含量为45%,蛋白胨的蛋白质含量为85%,酵母粉的蛋白质含量为45%;
制备方法:(1)将棉籽饼粉、酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠按比例在40℃下,经过30min混合搅拌均匀得到混合物;
(2)将乙酰辅酶A、硝酸盐和吐温80分别溶于水中得到溶液后,通过三个独立喷头,分别将溶液射入到步骤(1)的混合物中,在60℃下,经过气流干燥得到细度为200目微粉,进一步混匀后得到微生物培养基。
实施例2
本实施例提供一种微生物培养基,按重量份计包括以下组分:
其中,棉籽饼粉的蛋白质含量为40%,蛋白胨的蛋白质含量为80%,酵母粉的蛋白质含量为40%;
制备方法:(1)将棉籽饼粉、酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠按比例在30℃下,经过10min混合搅拌均匀得到混合物;
(2)将乙酰辅酶A、硝酸镧和吐温80分别溶于水中得到溶液后,通过三个独立喷头,分别将溶液射入到步骤(1)的混合物中,在50℃下,经过气流干燥得到细度为100目微粉,进一步混匀后得到微生物培养基。
实施例3
本实施例提供一种微生物培养基,按重量份计包括以下组分:
其中,棉籽饼粉的蛋白质含量为50%,蛋白胨的蛋白质含量为90%,酵母粉的蛋白质含量为50%;
制备方法:(1)将棉籽饼粉、酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠按比例在50℃下,经过60min混合搅拌均匀得到混合物;
(2)将乙酰辅酶A、硝酸铷和吐温80分别溶于水中得到溶液后,通过三个独立喷头,分别将溶液射入到步骤(1)的混合物中,在70℃下,经过气流干燥得到细度为200目微粉,进一步混匀后得到微生物培养基。
实施例4
其中,棉籽饼粉的蛋白质含量为43%,蛋白胨的蛋白质含量为85%,酵母粉的蛋白质含量为47%;
制备方法:(1)将棉籽饼粉、酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠按比例在42℃下,经过25min混合搅拌均匀得到混合物;
(2)将乙酰辅酶A、硝酸镨和硝酸镧分别溶于水中得到溶液后,通过两个独立喷头,分别将溶液射入到步骤(1)的混合物中,在60℃下,经过气流干燥得到细度为100目微粉,进一步混匀后得到微生物培养基。
对比例1
本对比例与实施例1的区别仅在于,本对比例不包括乙酰辅酶A,其余均与实施例1相同,制备得到培养基。
对比例2
本对比例与实施例1的区别仅在于,本对比例不包括硝酸镨,其余均与实施例1相同,制备得到培养基。
对比例3
本对比例与实施例1的区别仅在于,本对比例不包括乙酰辅酶A和硝酸镨,其余均与实施例1相同,制备得到培养基。
对比例4
本对比例与实施例1的区别仅在于,本对比例不包括棉籽饼粉,其余均与实施例1相同,制备得到培养基。
对比例5
本对比例使用LB培养基。
对比例6
本对比例使用牛肉膏蛋白胨培养基。
将上述实施例1-4与对比例1-6得到的培养基,10种培养基均取10g溶于500mL无菌水中,配制成为液体培养基,分别进行培养大肠杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母,记录菌种生长情况(分别于5h和10h测定菌液的OD600值),具体结果如下表1所示:
表1
通过实施例1-4与对比例1-6的对比可知,当培养基中缺少了乙酰辅酶A和/或硝酸镨时,对于几种模式生物的培养不利,说明了乙酰辅酶A与硝酸盐,能够促进微生物的生产;而当培养基中缺少了棉籽饼粉时,同样使得微生物生长情况下降;当使用常见的LB培养基或者牛肉膏蛋白胨培养基时,微生物的生长均较差。综上,本发明提供的微生物培养基对于常见的模式生物培养效果更为突出。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的微生物培养基及其制备方法与应用,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种微生物培养基,其特征在于,所述微生物培养基按重量份计包括以下组分:
2.根据权利要求1所述的微生物培养基,其特征在于,所述微生物培养基还包括重量份为0.03~0.05份的吐温80。
3.根据权利要求1或2所述的微生物培养基,其特征在于,所述硝酸盐包括硝酸铈、硝酸镨、硝酸镧或硝酸铷中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的微生物培养基,其特征在于,所述棉籽饼粉的蛋白质含量为40%~50%;
优选地,所述蛋白胨的蛋白质含量为80%~90%;
优选地,所述酵母粉的蛋白质含量为40%~50%。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的微生物培养基的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
(1)将棉籽饼粉、酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠按比例混合搅拌均匀得到混合物;
(2)将乙酰辅酶A、硝酸盐和任选地吐温80分别溶于水中得到溶液后,加入到步骤(1)得到的混合物中,干燥得到微粉,进一步混匀后得到所述微生物培养基。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述混合的温度为30~50℃;
优选地,所述步骤(1)中所述混合的时间为10~60min。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述干燥的温度为60~80℃。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述加入到步骤(1)得到的混合物的方法为:通过独立喷头,分别将溶液射入到步骤(1)的混合物中;
优选地,步骤(2)中所述干燥的方式为气流干燥;
优选地,步骤(2)中所述干燥的温度为50~70℃;
优选地,步骤(2)中所述微粉的细度为100~200目。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
(1)将棉籽饼粉、酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠按比例在30~50℃下,经过10~60min混合搅拌均匀得到混合物;
(2)将乙酰辅酶A、硝酸盐和任选地吐温80分别溶于水中得到溶液后,通过独立喷头,分别将溶液射入到步骤(1)的混合物中,在50~70℃下,经过气流干燥得到细度为100~200目微粉,进一步混匀后得到所述微生物培养基。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的微生物培养基在培养大肠杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母中的应用。
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