CN105462888A - 一种高效培养基及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效培养基及其制备方法和应用,主要通过培养基成分优化和工艺改进,制备高效培养基。培养基主要原料是酵母粉、棉籽蛋白肽、豆饼粉、淀粉、磷酸二氢钠、溴化钠、乙酰辅酶A、稀土元素等物质,将其充分混合均匀、微粉制备高效培养基。该产品含有菌体生长所必需的营养物质、微量元素,以及特定的前体和促进剂,能有效促进目标产物的生产和抑制副产物生成,尤其适用于四环素类发酵,发酵产品的产量高、纯度高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种高效培养基及其制备方法和应用。
背景技术
我国是世界主要医药原料药生产国家,抗生素、氨基酸、维生素等产品在世界市场占有重要地位。我国抗生素类原料药年生产总量约为5万吨,这些抗生素原料药的生产大都采用工业发酵生产,所需培养基总需求量大于20万吨。我国三大发酵制品的产量约100万吨,酶制剂如淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、糖化酶等发酵生产均需大量的培养基。氨基酸产能不断扩大,对培养基的需求也增长迅速。
发酵培养基的营养成分对菌种生长、繁殖和合成产物速率有重要影响。它既要使种子接种后能迅速生长,达到一定的菌丝浓度,又要使长好的菌体能迅速合成目标产物。因此,要求发酵培养基的组成合理,并且还要有菌体生长所需的生长因子和产物合成所需要的特定元素、前体和促进剂等。发酵前期为生长阶段,这一阶段以快速繁殖菌体为目的,当细胞繁殖达到一定数量、底物消耗和代谢产物到一定水平后,发酵过程逐渐迁移到以产物形成为主的生产阶段,细胞生长处于维持状态,产物以稳定的速率生成,直到底物或产物或其他某些发酵参数成为限制因素而结束发酵。发酵培养基的设计和生长需要考虑尽可能满足菌体快速生长繁殖要求;尽可能保持整个发酵过程中工艺参数的平稳性,延长生产期,最终达到提高发酵产量的目的。不同类型的微生物对营养的需求差异很大,应根据菌种对各营养要素的不同要求进行配制。营养物配比应恰当,浓度太低,不能满足微生物生长的需要;浓度太高,会抑制微生物生长。一个适当的培养基配方,对发酵产品的产量和质量有着极大的影响。
四环素类抗生素作为重要的抗生素种类,多为经发酵法生产出来的抗菌物质,对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体、滤过性病毒、螺旋体属乃至原虫类都有很好的抑制作用,是一种广谱抗菌素。四环素在抗生素类药物中属于相对较老的品种,但近年来其国际采购逐渐回温。过去10年间,我国四环素生产呈恢复性增长态势,这与四环素被用作动物生长促进剂的用途有关;更值得关注的是,四环素老药新用也是促成该药“重回江湖”的重要因素,此外,四环素也是一种重要的饲料添加剂,拥有广阔的市场前景。自2006年以后,国际四环素市场开始转暖,当年我国出口四环素碱与盐合计数量1.8万吨;2008~2009年期间虽然遭受国际经济危机冲击,但出口继续保持良好势头;近两年产品销售情况增长态势依然良好。国内产量和生产规模较大的有宁夏启元药业、华北制药集团、四川制药厂和西安利君药业等。经过对现有技术的检索发现,国内现有技术方案和本发明有实质性区别。中国专利文献号CN103602714A,公开日2014-02-26,公开了一种金色链霉菌发酵生产四环素的方法,包括金色链霉菌的斜面孢子培养、种子培养和发酵培养,其特征在于所述发酵培养采用的发酵培养基组成为:淀粉30~40g/L,糊精5~10g/L,豆粉6~10g/L,玉米浆15~30g/L,硫酸铵2~6g/L,轻质碳酸钙3.5~5g/L,溴化钠0.5~1.5g/L,磷酸二氢钾0.05~0.1g/L,淀粉酶0.1g/L。该发明提供一种提高利用原料中的营养成分利用率,降低发酵过程中培养基的浓度,改善溶氧条件,提高发酵单位的金色链霉菌发酵生产四环素的培养基。专利文献号CN102864202A,公开日2013-01-09,公开了一种发酵生产四环素的方法,该方法包括在发酵过程中向发酵培养基中添加溴化钠水溶液。该发明所述方法能够增大发酵培养基的KLa,提高四环素的产率。上述两个发明的培养基缺乏特定元素、前体和促进剂等,对于发酵效价提高有限,有较大改进空间。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足,提出一种高效培养基及其制备方法,其通过引入微量元素、前体和促进剂,能够促进菌体生长,提高发酵产物产量,抑制副产物的生成,同时能够在稳定发酵生产的基础上促进菌体繁殖,提高细胞生长速率,增加生长期的生物产量,从而提高目标产物产量和质量。
本发明是通过以下技术方案实现的。一种高效培养基,其由下列组分组成:豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠、溴化钠、乙酰辅酶A、稀土硝酸盐。
优化的,所述稀土硝酸盐采用硝酸铈、硝酸镨、硝酸镧或硝酸钕中的一种或多种。
优化的,培养基中豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠的质量比为(3~4):(1~1.5):(1~2):(5-8):(0.05~0.1)。
优化的,培养基中溴化钠的重量含量为0.02%-0.1%,乙酰辅酶A的重量含量为0.02%-0.06%,稀土硝酸盐的重量含量为0.001%-0.03%。
优化的,豆饼粉的蛋白含量为40-55%,酵母粉的蛋白含量为45-55%,棉籽蛋白肽的蛋白含量为55-70%。
优化的,棉籽蛋白肽采用酶解法生产,酶解采用的酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶中的一种或多种酶的组合。
上述任意一种高效培养基的制备方法,其步骤如下:步骤1,将豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠按照重量比混合搅拌均匀,制得半成品;步骤2,将溴化钠、乙酰辅酶A、稀土硝酸盐分别溶解于水中后加入半成品中,干燥;步骤3,将干燥后的物料进行微粉;步骤4,将微粉后的物料再次进行搅拌混匀。
优化的,步骤2将溴化钠、乙酰辅酶A、稀土硝酸盐分别溶解于水中后加入半成品中的方式为:通过三个独立喷头分别将三种溶液喷射入半成品中;干燥的方式为进行气流干燥。
优化的,步骤三中微粉后的细度为60~300目。
本发明提供的高效培养基在四环素生产中的应用,非常适用。
如无特殊说明,本发明的比例均为质量比,本发明的度量衡采用质量。
本发明的有益效果为:
1、以豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽为主要原料,加入特定的微量元素、前体和促进剂,然后混合复配,生产适用于高效发酵培养基,能够提高目标产物产量,并抑制副产物的生成。
2、微量元素可抑制副产物的生产;乙酰辅酶A作为特殊营养因子参与发酵次级代谢过程,促进菌株的生长繁殖和抗生素的产生;溴化钠作为促进剂在发酵过程中能够减少由于菌株浓度增大产生的泡沫和滞留液膜,降低发酵培养基的粘度,从而提高其流变特性、溶氧水平,进而有利于菌株的发酵。
3、本发明通过特定元素、前体和促进剂的添加,促使发酵反应朝目标产物的方向进行,同时抑制了副产物的生成,产量增加且质量得到提升。产品在四环素厂家进行应用,可提高四环素类抗生素发酵效价提高15%以上,经济效益显著。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步具体说明本发明。
采用下述实施例1-3和对比例1-2制得的培养基制备某抗生素,其中某抗生素种液的制备方法为:(1)取金色链霉菌(Streptomycesaureus)菌株(中国普通微生物保藏管理中心,编号4.769)再无菌条件下接种于固体斜面培养基上,在35℃下恒温培养5天。(2)将斜面培养后的菌株在无菌条件下接种到种子培养基中,在33℃、300r/min的条件下培养22-25h,得到种液。(3)将种液在无菌条件下接种到下述实施例1-3和对比例1-2制得的发酵培养基中,在30℃,搅拌转速200r/min的条件下进行发酵,发酵开始后180h,停止发酵,测定某抗生素的产率和效价。
实施例1
本实施例提供的高效培养基,其由下列组分组成:豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠、溴化钠、乙酰辅酶A、稀土硝酸盐。
其中,所述稀土硝酸盐采用硝酸铈。
其中,培养基中豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠的质量比为3.5:1.5:1.5:5:0.05。
其中,培养基中溴化钠的重量含量为0.08%,乙酰辅酶A的重量含量为0.06%,稀土硝酸盐的重量含量为0.03%。
其中,豆饼粉的蛋白含量为40-55%,酵母粉的蛋白含量为45-55%,棉籽蛋白肽的蛋白含量为55-70%。
其中,棉籽蛋白肽采用酶解法生产,酶解采用的酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶中的一种或多种酶的组合。
上述高效培养基的制备方法,其步骤如下:步骤1,将豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠按照重量比混合搅拌均匀,制得半成品;步骤2,将溴化钠、乙酰辅酶A、稀土硝酸盐分别溶解于水中后,通过三个独立喷头分别将三种溶液喷射入半成品中,进行气流干燥;步骤3,将干燥后的物料进行微粉,微粉后的细度为60~300目;步骤4,将微粉后的物料再次进行搅拌混匀。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于:(1)所述稀土硝酸盐采用硝酸镨。(2)培养基中豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠的质量比为3:1.5:1.5:5:0.05。(3),培养基中溴化钠的重量含量为0.02%,乙酰辅酶A的重量含量为0.02%,稀土硝酸盐的重量含量为0.03%。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于:(1)所述稀土硝酸盐采用硝酸钕。(2)培养基中豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠的质量比为4:1.5:1.5:5:0.05。(3)培养基中溴化钠的重量含量为0.1%,乙酰辅酶A的重量含量为0.06%,稀土硝酸盐的重量含量为0.03%。
对比例1
本对比例提供的高效培养基,其由下列组分组成:豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠、溴化钠、乙酰辅酶A。
其中,培养基中豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠的质量比为3.5:1.5:1.5:5:0.05。
其中,培养基中溴化钠的重量含量为0.08%,乙酰辅酶A的重量含量为0.06%。
对比例2
本对比例提供的高效培养基,其由下列组分组成:豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠。
其中,培养基中豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠的质量比为3.5:1.5:1.5:5:0.05。
下面将采用实施例1-3和对比例1-2发酵得到的某抗生素的产率和效价列在表1中。
表1
培养基 | 是否添加溴化钠 | 是否添加乙酰辅酶A | 是否添加稀土硝酸盐 | 产率 | 效价 | 副产物含量 |
实施例1 | 添加 | 添加 | 添加 | 82% | 57000U/mL | 6.5% |
实施例2 | 添加 | 添加 | 添加 | 80% | 56000U/mL | 6.8% |
实施例3 | 添加 | 添加 | 添加 | 84% | 59000U/mL | 6.4% |
对比例1 | 添加 | 添加 | 没有 | 67% | 47000U/mL | 8.3% |
对比例2 | 没有 | 没有 | 没有 | 60% | 42000U/mL | 8.9% |
通过上表的对比可知,本发明提供的实施例1-3的产率和效价均高于对比例1-2,因此通过加入特定的微量元素、前体和促进剂,与豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽等主要原料以科学比例混合复配,制得了高效发酵培养基,其用于某抗生素的发酵能够提高目标产物产量和质量,并抑制副产物的生成。
Claims (10)
1.一种高效培养基,其特征在于:其由下列组分组成:豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠、溴化钠、乙酰辅酶A、稀土硝酸盐。
2.根据权利要求1所述的一种高效培养基,其特征在于:所述稀土硝酸盐采用硝酸铈、硝酸镨、硝酸镧或硝酸钕中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的一种高效培养基,其特征在于:培养基中豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠的质量比为(3~4):(1~1.5):(1~2):(5-8):(0.05~0.1)。
4.根据权利要求3所述的一种高效培养基,其特征在于:培养基中溴化钠的重量含量为0.02%-0.1%,乙酰辅酶A的重量含量为0.02%-0.06%,稀土硝酸盐的重量含量为0.001%-0.03%。
5.根据权利要求4所述的一种高效培养基,其特征在于:豆饼粉的蛋白含量为40-55%,酵母粉的蛋白含量为45-55%,棉籽蛋白肽的蛋白含量为55-70%。
6.根据权利要求5所述的一种高效培养基,其特征在于:棉籽蛋白肽采用酶解法生产,酶解采用的酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶中的一种或多种酶的组合。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的一种高效培养基的制备方法,其特征在于:其步骤如下:步骤1,将豆饼粉、酵母粉、棉籽蛋白肽、淀粉、磷酸二氢钠按照重量比混合搅拌均匀,制得半成品;步骤2,将溴化钠、乙酰辅酶A、稀土硝酸盐分别溶解于水中后加入半成品中,干燥;步骤3,将干燥后的物料进行微粉;步骤4,将微粉后的物料再次进行搅拌混匀。
8.根据权利要求7所述的一种高效培养基的制备方法,其特征在于:步骤2将溴化钠、乙酰辅酶A、稀土硝酸盐分别溶解于水中后加入半成品中的方式为:通过三个独立喷头分别将三种溶液喷射入半成品中;干燥的方式为进行气流干燥。
9.根据权利要求8所述的一种高效培养基的制备方法,其特征在于:步骤三中微粉后的细度为60~300目。
10.根据权利要求1-6任意一项所述的一种高效培养基的应用,其特征在于:所述高效培养基在四环素生产中的应用。
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