DE10048214A1

DE10048214A1 - Pflanzen mit maskierter Fruchtbarkeit

Info

Publication number: DE10048214A1
Application number: DE2000148214
Authority: DE
Inventors: Sabine Steiner-Lange; Anna Sorensen; Teresa Mozo
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2000-09-28
Filing date: 2000-09-28
Publication date: 2002-04-11
Also published as: DE10194113D2; AU2002210374A1; WO2002027001A3; WO2002027001A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit maskierter Fruchtbarkeit, wobei die maskierte Fruchtbarkeit durch eine veränderte Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog oder durch die Veränderung der biologischen Aktivität des durch die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 oder deren Homolog kodierten Genprodukts hervorgerufen wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die regulatorische Nukleinsäuresequenz, die natürlicherweise in Arabidopsis thaliana die Expression des MYB26-Gens steuert. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit maskierter Fruchtbarkeit, wobei die maskierte Fruchtbarkeit durch eine veränderte Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog, oder durch die Veränderung der biologischen Aktivität des durch die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog kodierten Genprodukts hervorgerufen wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die regulatorische Nukleinsäuresequenz, die natürlicherweise in Arabidopsis thaliana die Expression des MYB26- Gens steuert. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen.

Proteine vom MYB-Typus bilden eine Superfamilie von strukturell ähnlichen Transkriptionsfaktoren. MYB-Proteine kommen sowohl in pflanzlichen als auch in tierischen Organismen vor und beeinflussen eine Vielzahl unterschiedlicher Stoffwechselwege. Das gemeinsame Strukturmotiv dieser Proteinfamilie ist die MYB-Domäne, die an eine spezifische DNA-Sequenz binden kann. Die klassische MYB-Domäne besteht aus zwei oder drei untereinander sehr ähnlichen Sequenzwiederholungen (Repeats: R1, R2, R3) von 50-53 AS Länge. Die meisten pflanzlichen MYB-Proteine besitzen nur zwei Sequenz-Repeats (R2, R3). In Arabidopsis wurden bereits 97 verschiedene Proteine vom R2R3-Typ nachgewiesen. Damit bildet diese Gruppe die größte bislang in Pflanzen bekannte regulatorische Genfamilie. Von den wenigen bislang funktionell charakterisierten MYB-Genen ist bekannt, daß sie u. a. den Phenylpropanoid-Metabolismus regulieren, die Zellform- und Differenzierung beeinflussen, an der Hormonantwort beteiligt sind oder im Laufe von pflanzlichen Abwehrreaktionen eingeschaltet werden. Zusammenfassende Informationen zur MYB-Familie finden sich in u. a. in Romero et al.: More than 80 R2R3-MYB regulatory genes in the genome of Arabidopsis thaliana. Plant. J. 14, 273-284 (1998), Kranz et al. Towards functional characterisation of the members of the R2R3-MYB gene family from Arabidopsis thaliana. Plant J. 16, 263-276 (1998) sowie Martin und Paz-Ares: MYB transcription factors in plants. Trends in Genetics 13, 67-73 (1997).

Zur vorstehend beschriebenen MYB-Familie zählt das MYB26-Gen. Von diesem MYB26-Gen ist ein cDNA-Klon aus Arabidopsis thaliana (Genbank Accession Nummer 175997 verfügbar, jedoch war bislang nicht bekannt, in welche konkreten Stoffwechselwege dieses Gen eingreift bzw. in welchen Geweben es exprimiert wird. Ein genomischer Klon (MDC16) ist unter der Genbank Accession Nummer AB019229 registriert.

Populationen männlich steriler Pflanzen können durch unterschiedliche Verfahrensweisen produziert werden. Im einfachsten Fall werden die männlichen Blütenorgane durch Eintüten vom Rest der Pflanze isoliert oder kurzerhand abgeschnitten. Diese Prozeduren sind jedoch sehr zeit-, personal- und kostenintensiv. Zudem finden sich bei einer großen Zahl der Nutzpflanzen männliche und weibliche Organe innerhalb derselben Blüte, was diese Verfahren noch weiter erschwert.

Auch mit Hilfe von pollenabtötenden oder die Pollenbildung blockierenden Chemikalien (Gametoziden) lassen sich männlich sterile Pflanzen erzeugen. Der Vorteil dieser chemischen Verfahren ist, daß nur eine vorübergehende Sterilität eintritt, die lediglich für die Dauer der Behandlung bestehenbleibt. Allerdings zeigen die meisten dieser Gametozide zusätzliche phytotoxische Eigenschaften. Des weiteren muß die Behandlung bei Pflanzen mit einer langen Blühphase mehrfach wiederholt werden.

In jüngerer Zeit werden mehrere genetische Verfahren zur Hervorbringung männlich steriler Pflanzen diskutiert und angewendet. In der Patentschrift US 5,955,653 wird eine spezifisch in Tapetumzellen exprimierte beta-1,3-Glucanase zur Induzierung der Sterilität eingesetzt. US 5,962,769 erreicht dasselbe Ziel durch eine Erhöhung der endogenen Avidin-Konzentrationen. WO 9008830 beschreibt die Expression von Proteininhibitorgenen oder von sogenannten Killergenen in den männlichen Infloreszenzen, die das Absterben der Antheren und assoziierten Gewebe bewirken sollen. In WO 90/08831 wird ein ähnlicher Effekt durch die Expression von Disruptor-Genen angestrebt, die die mitochondriale Zellatmung verhindern. WO 89/10396 schlägt sehr allgemein vor, das pflanzliche Genom mit exogenen sogenannten "Male Sterility DNAs" (z. B. kodierend für Rnasen, Dnasen, Proteasen, Lipasen etc.) zu transformieren, die bei Expression in Zellen der Staubblätter den Metabolismus, die Funktion oder die Entwicklung dieser Zelle stören. In EP 0329308 werden Antisense-DNAs zur Beeinflussung der Pollenproduktion verwendet.

Die Grundversorgung der rasch anwachsenden Weltbevölkerung mit Nahrungsmitteln und pflanzlichen Rohstoffen stellt hohe Anforderungen an die moderne Agrarwirtschaft. Bemühungen zur Verbesserung des pflanzlichen Ertrages stoßen mittlerweile an die Grenzen der traditionellen Züchtung und sind zudem sehr Zeit- und arbeitsintensiv. Einen Ausweg zeigt die moderne Gentechnik auf. Diese erlaubt eine gezielte Modifikation bestimmter Stoffwechselwege durch die Einführung neuer Gensequenzen oder Manipulation von bereits im Organismus vorhandenen Genen. Da bei den gentechnologischen Verfahren die Veränderungen im Erbgut in der Regel genau bekannt sind, lassen sich diese Methoden zudem meist auf weitere Pflanzenarten übertragen. Für entsprechende übertragbare Techniken besteht demnach erhöhter Bedarf, insbesondere wenn dadurch klassische Züchtungsverfahren sinnvoll ergänzt werden können. So zeigt die Nachkommenschaft von Pflanzen, die mit Pollen genetisch divergenter Varietäten derselben Spezies fremdbestäubt wurde, im Vergleich zur Nachkommenschaft von selbstbestäubten Pflanzen oftmals verbesserte Eigenschaften. Die Hybride zeichnen sich häufig durch Uniformität, verstärktes Wachstum, höheren Ertrag oder eine vermehrte Widerstandskraft gegenüber Pathogenen aus. Dieser als Heterosis bekannte Effekt ist von hohem kommerziellen Interesse für landwirtschaftliche Betriebe bzw. Pflanzenzüchter und verlangt gezielte Kreuzungen. Männlich sterile Pflanzen erleichtern diese Kreuzungstechniken, da von Ihnen leichter hybride Nachkommen zu erhalten sind. Bei entsprechenden Kreuzungen werden männlich sterile und männlich fertile Pflanzen nebeneinander in einem Feld angepflanzt. Die männlich sterilen Pflanzen können nur durch Pollen der männlich fertilen Pflanzen befruchtet werden und bringen dementsprechend ausschließlich hybride Samen hervor. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Sterilität nicht wie bei den meisten bekannten sterilen Mutanten permanent, sondern reversibel ist, wodurch z. B. kontrollierte Selbstbefruchtungsversuche im Rahmen späterer Selektions- und Charakterisierungsprozesse möglich werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, neuartige männlich sterile Pflanzen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung bereitzustellen.

Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.

Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren erläutert.

Fig. 1 zeigt die Promotorregion des MYB26-Gens von Arabidopsis thaliana. Das Start-ATG ist fett hervorgehoben.

Fig. 2 zeigt die genomische Nukleinsäuresequenz des MYB26-Gens von Arabidopsis thaliana. Start-ATG und Stop-Codon sind fett hervorgehoben. Unterstrichene Regionen stellen Introns dar. Die Numerierung setzt die Numerierung aus Fig. 1 fort.

Fig. 3 zeigt die aus dem offenen Leserahmen gemäß Fig. 1 abgeleitete Aminosäuresequenz von MYB26.

Fig. 4 zeigt eine Southernanalyse von Individuen der Linie 7AAB12. DNA von 14 F2 Nachkommen von 7AAB12 [fünf Pflanzen, die kein mutantes Allel für and1 tragen (1-5), vier heterozygote Pflanzen für and (6-9) und fünf sterile Pflanzen (10-14)] wurde mit EcoRI gespalten, auf einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nylonmembran übertragen. Das linke Foto zeigt die Hybridisierung mit dem linken Ende des Transposons. Jedes Individuum zeigt 6-10 Banden, von denen jedoch nur eine mit einer Größe von 3,8 kb ausschließlich in Pflanzen mit zumindest einem mutierten Allel von andl auftritt, wohingegen sie in den Pflanzen fehlt, die homozygot das Wildtypallel dieses Locus tragen. Die entsprechende Bande ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Das rechte Foto zeigt die Hybridisierung derselben Membran mit einer MYB26-spezifischen Sonde (ohne MYB-Domäne). Die 3,8 kb Bande, die gekoppelt mit der Mutation in andl auftritt, hybridisiert auch mit AtMYB26. Pflanzen, die homozygot das and1-Wildtypallel tragen (1-5) zeigen hingegen eine Bande von 6,3 kb, die dem Wildtyplocus von AtMYB26 entspricht. Beide Banden treten in and1-heterozygoten Pflanzen (6-9) mit etwa gleicher Intensität auf. Ein schwaches Signal auf Höhe der Wildtyp-Bande in sterilen Pflanzen kann durch das Herausspringen des Transposons in einigen Zellen der Pflanze (somatische Sektoren) erklärt werden.

Fig. 5 zeigt die ursprüngliche Sequenz des N-Terminus des MYB26-Proteins im Vergleich zur entsprechenden Sequenz einer stabilen Mutante. In der ersten Zeile ist der N-Terminus des MYB26-Proteins dargestellr. Die ursprüngliche En-Insertionsselle ist gekennzeichnet. In der zweiten Zeile ist der N-Terminus des MYB26-Proteins nach ungenauem Herausspringen des Transposons gezeigt. Drei Aminosäuren wurden deletiert.

Fig. 6 zeigt eine mikroskopische Ansicht eines Querschnittes durch Antheren-Gewebe in MYB26-Mutanten (links), und Wildtyp (rechts). Während im Wildtyp radiale Zellwand verdickungen (Pfeil) zu sehen sind, fehlen diese in der MYB26-Mutante.

Fig. 7 zeigt eine männlich sterile Pflanze der Art Arabidopsis thaliana mit Gendefekt im MYB26-Gen im Vergleich mit der Wildtyppflanze.

Der hier verwendete Ausdruck "maskierte Fruchtbarkeit" bezeichnet eine Nichtfreisetzung der Pollen aus den Pollensäcken infolge einer morphologischen und zellulären Veränderung des Pollensackgewebes, wodurch die betroffenen Pflanzen männlich steril sind.

Die hier verwendeten Ausdrücke "Homologe" oder "homologe Sequenzen" bezeichnen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen mit signifikanter Ähnlichkeit zur Vergleichssequenz oder Teilen davon. Als homologe Sequenzen gelten somit Nukleinsäuresequenzen, die mit den Vergleichssequenzen oder Teilen dieser Sequenzen unter stringenten oder wenig stringenten Bedingungen hybridisieren (zu stringenten und wenig stringenten Bedingungen siehe Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory (1989), ISBN 0-87969-309-6). Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 × SSC bei 65°C (alternativ in 50% Formamid und 4 × SSC bei 42°C), gefolgt von mehreren Waschschritten in 0,1 × SSC bei 65°C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 × SSC bei 37°C, gefolgt von mehreren Waschritten in 1 × SSC bei Raumtemperatur. Als homologe Sequenzen sollen des weiteren Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen oder Teile davon gelten, die unter Zuhilfenahme des Similaritätsalgorithmus BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul et al., Journal of Molecular Biology 215, 403-410 (1990) eine signifikante Ähnlichkeit mit Vergleichssequenzen aufweisen. Als signifikant ähnlich werden, wie hier verwendet, Sequenzen bezeichnet, die z. B. unter Verwendung von Standardparametern im BLAST-Service des NCBI ein Signifikanzniveau (E-Value oder Probability) von P < 10^-5 aufweisen, wenn sie mit den Vergleichssequenzen verglichen werden.

Der hier verwendete Ausdruck "Derivate" bezeichnet Nukleinsäuresequenzen, die gegenüber der Vergleichssequenz Modifikationen in Form von einer oder mehreren Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen aufweisen. Als Derivate sind auch Introns beinhaltende genomische Äquivalente von EST- bzw. cDNA-Sequenzen anzusehen. Derivat bedeutet ferner, daß eine Nukleinsäuresequenz zusammengesetzt ist aus einem oder mehreren Nukleinsäurefragmenten eines Gens und einem oder mehreren Nukleinsäurefragmenten eines oder mehrerer anderer Gene. Die einzelnen Domänen können dabei sowohl unmodifiziert als auch modifiziert sein.

Der hier verwendete Ausdruck "Fragmente" bezeichnet Teile von Aminosäuresequenzen oder deren Erbinformation in Form von Nukleinsäuren, sofern sie über zumindest einen funktionell wichtigen Bereich (Domäne, Sequenz- oder Strukturmotiv) der Vergleichssequenz verfügen, wie z. B. katalytische Zentren oder mit Proteinen wechselwirkende Motive, ferner Elemente der DNA-Bindung wie z. B. eine MYB DNA-binding domain repeat signature 1 (Prosite Accession Nummer PS00037) MYB_1 mit der Konsensussequenz W-[ST]-x(2)-E-[DE]-x(2)-[LIV] oder eine MYB DNA-binding domain repeat signature 2 (Prosite Accession Nummer PS00334) MYB_2 mit der Konsensussequenz W-x(2)-[LI]-[SAG]-x(4,5)-R-x(8)-[YW]-x(3)-[LIVM]. Die entsprechenden Datenbankeinträge stammen aus der PROSITE-Datenbank (Hofmann et al.: The PROSITE database, its status in 1999. Nucleic Acids Res. 27: 215-219 (1999)) und können online unter http:/ /www.expasy.ch/prosite/ abgefragt werden.

Der hier verwendete Ausdruck "funktionell verbunden" bedeutet, daß eine regulatorische Sequenz wie ein Promotor die Expression eines Gens oder einer anderen funktionellen Nukleinsäure steuert oder das eine Nukleinsäuresequenz von dem Promotor ausgehend exprimiert wird.

Der hier verwendete Ausdruck "funktionelle Nukleinsäure" oder "funktionelle Nukleinsäuresequenz" bedeutet eine Nukleinsäuresequenz, die nicht ein natürlicherweise vorkommendes Genprodukt kodiert, z. B. ein Ribozym, eine Antisense-DNA oder RNA oder eine aus verschiedenen Exons zusammengesetzte Sequenz.

Der hier verwendete Ausdruck "Vektor" bezeichnet natürlich vorkommende oder künstlich erschaffene Konstrukte zur Aufnahme, Vermehrung, Expression oder Übertragung von Nukleinsäuren, z. B. Plasmide, Phagemide, Cosmide, künstliche Chromosomen, Bakteriophagen, Viren, Retroviren.

Der hier verwendete Ausdruck "transgene Pflanze" betrifft Pflanzen, die mittels rekombinanter Gentechnik und/oder mikrobiologischen Verfahren und nicht mittels herkömmlicher Züchtungsverfahren hergestellt wurden.

Der hier verwendete Ausdruck "Expressionssystem" bezeichnet jedwede Kombination von Vektoren, Restriktionsenzymen, Transformationsmethoden, Zellextrakten, lebenden Zellen z. B. prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder Organismen mit dem Zweck der endogenen oder exogenen Expression von Genen.

Es wurde anhand genetischer Veränderungen am Modellorganismus Arabidopsis thaliana überraschenderweise gefunden, daß die Manipulation einer für einen MYB26- Transkriptionsfaktor kodierenden endogenen Nukleinsäuresequenz zu einer strukturellen Veränderung des pflanzlichen Pollensackgewebes führt. Aufgrund des Fehlens von funktionellen Zellwandverdickungen kann der Pollensack den Pollen nicht mehr freisetzen, wodurch die betroffenen Pflanzen in den männlichen Organen steril sind. Im engeren Sinne liegt keine echte Sterilität, sondern lediglich eine Pseudosterilität bzw. eine maskierte Fruchtbarkeit vor. Diese Pseudosterilität läßt sich jedoch durch manuelle Öffnung der Pollensäcke aufheben. Die erfindungsgemäßen männlichen sterilen Pflanzen mit manipuliertem MYB26-Gen weisen eine Strukturveränderung des Pollensackgewebes auf.

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen mit maskierter Fruchtbarkeit, wobei die maskierte Fruchtbarkeit durch eine gegenüber Wildtyppflanzen veränderte Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog, oder durch die Veränderung der biologischen Aktivität des durch die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog kodierten Genprodukts hervorgerufen wird. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen.

Im Sinne der Erfindung bedeutet veränderte Expression hierbei, daß die Expression verstärkt, verringert oder komplett ausgeschaltet sein kann.

Eine verstärkte Expression kann z. B. durch Kombination der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog mit einem starken Promotor erreicht werden. Beispiele für geeignete Promotoren, die zu einer verstärkten konstitutiven Expression des MYB26-Gens oder dessen Homolog führen können, sind der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik- Virus sowie der Ubiquitin-Promotor aus Mais. Dazu kann entweder der endogene Promotor, der die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog steuert, durch den starken Promotor ersetzt werden, oder es kann eine zusätzliche Kopie der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog in das Genom integriert werden, wobei die zusätzliche Kopie mit dem starken Promotor funktionell verbunden ist.

Eine verstärkte Expression kann ferner erreicht werden, indem mehr als eine zusätzliche Kopie der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog, insbesondere zwei, drei, vier, fünf oder mehr Kopien, in das Genom integriert werden. Diese Kopien können einzeln oder zusammenhängend integriert werden. Ferner sind die Kopien mit einem Promotor funktionell verbunden, der ein starker Promotor, ein endogener oder ein exogener, die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog steuernder, Promotor, oder ein gewebespezifischer oder induzierbarer Promotor sein kann.

Konstrukte umfassend einen entsprechenden Promotor und eine mit diesem funktionell verbundenen Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog können durch übliche Methoden zur Transformation von Pflanzenzellen und nachfolgend zur Regeneration von kompletten Pflanzen verwendet werden. Die Einbringung von Nukleinsäuresequenzen in pflanzliche Organismen und Zellen ist Stand der Technik und, beispielsweise unter Verwendung von T-DNA-Vektoren, leicht durchzuführen. Durch die verstärkte Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog wird entsprechend ein Vielfaches an durch diese Nukleinsäuresequenzen codierten Proteinen gebildet.

Eine verstärkte Genexpression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog kann ferner durch die Veränderung oder das Hinzufügen funktioneller Komponenten des natürlicherweise die Expression des MYB26-Gens regulierenden Promotors erreicht werden. Beispiele für entsprechende funktionelle Komponenten sind TATA-Box, CAAT-Box, GC-Box, Enhancer oder Bindestellen für weitere Transkriptionsfaktoren. Geeignete Verfahren zur Veränderung der Nukleinsäuresequenz des natürlicherweise die Expression des MYB26-Gens regulierenden Promotors sind dem Fachmann bekannt. Bekannte Mutagenesetechniken sind beispielsweise die Erzeugung von Deletionsmutanten oder die Einführung von Punktmutationen durch "Site Directed Mutagenesis". Bevorzugte Verfahren zur Mutagenese bzw. zur Veränderung der Expression sind weiterhin chimäre RNA/DNA-Oligonukleotide, homologe Rekombination oder RNA-Interferenz (RNAi).

Transgene Pflanzen, die aufgrund einer verstärkten Genexpression oder durch zusätzliche MYB26-Genkopien eine gegenüber dem Wildtyp gesteigerte Menge an MYB26-Transkripten oder deren Homologen produzieren, besitzen eine schwer gestörte MYB26-Genbalance. Durch den derart veränderten Gewebsstoffwechsel im Pollensack ist die Funktion der Antheren nicht mehr sichergestellt, so daß es zu einer maskierten Fruchtbarkeit kommt.

Eine verringerte Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog kann durch die Veränderung oder das Entfernen wesentlicher funktioneller Komponenten des natürlicherweise die Expression des MYB26-Gens regulierenden Promotors erreicht werden. Beispiele für entsprechende Komponenten sind TATA-Box, CAAT-Box, GC-Box, Enhancer oder Bindestellen für weitere Transkriptionsfaktoren. Geeignete Verfahren hierfür sind dem Fachmann bekannt. Bekannte Mutagenesetechniken sind beispielsweise die Erzeugung von Deletionsmutanten oder die Einführung von Punktmutationen durch "Site Directed Mutagenesis". Bevorzugte Verfahren sind weiterhin chimäre RNA/DNA-Oligonukleotide, homologe Rekombination oder RNA-Interferenz (RNAi). Transgene Pflanzen mit einer verringerten MYB26-Genexpression produzieren nur noch geringe Mengen des für die Bildung von sekundären Zellwandverdickungen in den Antheren notwendigen Transkripitonsfaktors. Durch die Reduktion entsprechender Lignifizierungen können sich die Antheren nicht mehr öffnen, so daß es zu einer maskierten Fruchtbarkeit kommt.

Eine vollständiges Ausschalten der Genexpression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog kann durch Einführen von neuen Start- oder Stop-Codons oder durch Verschiebung des Leserasters erreicht werden. Infolge der veränderten Nukleinsäuresequenz werden funktionell inaktive Proteine synthetisiert. Bevorzugte Verfahren für einen gezielten Gen-Knockout des MYB26-Gens sind die Einführung von Punktmutationen durch "Site Directed Mutagenesis". Bevorzugte Verfahren zur Mutagenese bzw. zur Veränderung der Expression sind weiterhin chimäre RNA/DNA-Oligonukleotide, homologe Rekombination oder RNA- Interferenz (RNAi). Transgene Pflanzen mit MYB26-Gen-Knockout besitzen Antheren ohne Lignifizierungen der endothelialen Zellwand, wie sie für den Wildtyp charakteristisch sind. Nach der Pollenreifung weichen die Antherenwände nicht zurück, so daß eine maskierte Fruchtbarkeit die Folge ist.

Soll die Expression des MYB26-Gens verringert oder komplett ausgeschaltet werden, können auch Antisense-Kopien der MYB26-Nukleinsäuresequenz sowie deren Fragmente, Homologe oder Derivate stabil in das Genom integriert werden. Aufgrund der reversen Orientierung der Antisense-Nukleinsäuresequenz relativ zum Promotor werden bei der Transkription Antisense- RNA's gebildet, die mit den natürlicherweise gebildeten MYB26-mRNA's Duplexmoleküle formen und somit die Translation verhindern. Die entsprechende Technik ist etabliert und z. B. in Izant und Weintraub: Inhibition of thymidine kinase gene expression by antisense RNA: a molecular approach to genetic Analysis. Cell 36, 1007-1015 (1984) nachzulesen. Dabei kann das Antisense-Gen oder dessen Fragment, Homolog oder Derivat z. B. unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt werden, wodurch die Produktion von Antisense-RNA reguliert werden kann.

Eine Veränderung der biologischen Aktivität des durch die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog kodierten Genprodukts ist durch die Einführung von Modifikationen in Genabschnitten, die für funktionelle Proteindomänen wie z. B. Rezeptorbindungsstellen, Phosphorylierungsdomänen oder DNA-Bindestellen kodieren, zu erreichen. Insbesondere Modifikationen in der MYB-DNA-Bindedomäne haben einen erheblichen Einfluß auf die Eigenschaften des Proteins. Auf diese Weise können Proteine gebildet werden, die z. B. inaktiv sind, eine veränderte Substratspezifität oder einen veränderten Km-Wert besitzen oder nicht mehr den normalerweise in der Zelle vorliegenden Regulationsmechanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen. Entsprechend veränderte MYB26- Proteine sind nicht mehr in der Lage, die physiologischen Funktionen des MYB26- Wildtypproteins auszuüben. Geeignete Verfahren zur Veränderung der Sequenz des MYB26- Gens sind dem Fachmann bekannt. Bekannte Mutagenesetechniken sind beispielsweise die Erzeugung von Deletionsmutanten oder die Einführung von Punktmutationen durch "Site Directed Mutagenesis". Bevorzugte Verfahren zur Mutagenese bzw. zur Veränderung der Expression sind weiterhin chimäre RNA/DNA-Oligonukleotide, homologe Rekombination oder RNA-Interferenz (RNAi). Transgene Pflanzen mit derart modifizierten MYB26-Genen weisen ein verändertes Pollensackgewebe auf, wodurch es zu einer maskierten Fruchtbarkeit kommt.

Bei den in das Genom eingeführten MYB26-Genen kann es sich um die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat handeln, beispielsweise um jede beliebige MYB26-Sequenz aus anderen Pflanzen. Die verwendeten Nukleinsäuren können natürlichen Ursprungs sein oder künstlich hergestellt worden sein. Die Nukleinsäuresequenzen können sowohl in Sense- als auch in Antisense-Orientierung vorliegen.

Die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat funktional verbundene regulatorische DNA-Sequenz, z. B. ein Promotor, kann sowohl die mit der Nukleinsäuresequenz endogen vorliegende regulatorische DNA-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 als auch jede andere regulatorische DNA-Sequenz sein. Die regulatorische DNA- Sequenz kann sowohl ein endogener Promotor des zu transformierenden Organismus oder ein exogener Promotor sein, der sich z. B. auf dem verwendeten Vektor befindet. Als Promotor ist dabei grundsätzlich jede regulatorische Sequenz geeignet, die die Expression von Fremdgenen in Organsimen, z. B. Pflanzen, steuern kann, z. B. der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl- Mosaik-Virus; vgl. Franck et al., Cell 21, 285-294 (1980) oder der Ubiquitin-Promotor aus Mais. Die Expression der Nukleinsäuresequenzen kann auch durch einen chemisch induzierbaren Promotor erreicht werden. Beispiele für chemisch induzierbare Promotoren sind der PRPI- Promotor (Ward et al., Plant Molecular Biology 22, 361-366 (1993)), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid induzierbarer Promotor (EP-A 388186), ein durch Tetrazyklin induzierbarer Promotor (Gatz et al., Plant Journal 2, 397-404 (1992)), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor (EP-A 335528) oder ein durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbarer Promotor (WO 93/21334). Es können auch Promotoren verwendet werden, die z. B. in bestimmten Pflanzengeweben oder Pflanzenteilen aktiv sind. Beispiele für entsprechende Promotoren sind der Phaseolin-Promotor (US 5504200), der Isoflavon-Reduktase-Promotor (US 5750399), ein samenspezifischer Promotor, z. B. aus Tabak (US 5824863) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., (1989), EMBO J 8, 2445-2452).

Die verwendeten Nukleinsäuresequenzen können endogene oder exogene Nukleinsäuresequenzen oder deren Fragmente oder Derivate oder Homologe sein. Endogen bedeutet, daß die Nukleinsäuresequenz aus dem gleichen Organismus stammt, in den sie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren integriert wird, z. B. ein MYB26-Gen aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in Arabidopsis thaliana integriert. Exogen bedeutet, daß die Nukleinsäuresequenz aus einem anderen Organismus stammt, z. B. ein MYB26-Gen aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in z. B. Weizen integriert. Nach der stabilen Integration der transformierten Nukleinsäuresequenz liegen dann zwei oder mehr MYB26-Gene im Genom vor, so daß eine gesteigerte Menge an entsprechenden Genprodukten zu erwarten ist. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Nukleinsäuresequenzen gegenüber den natürlich vorkommenden Nukleinsäuresequenzen Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen auf.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine transformierte Zelle, insbesondere eine transformierte Pflanzenzelle oder ein transformiertes Pflanzengewebe, in der eine regulatorische Nukleinsäuresequenz, z. B. die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, und die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate, stabil integriert sind. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine mit der regulatorischen Nukleinsäuresequenz, z. B. der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, und der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragmenten oder Homologen oder Derivaten, transformierte Pflanzenzelle oder ein transformiertes Pflanzengewebe, die oder das zu einer samenproduzierenden Pflanze regenerierbar ist. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Pflanze, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Saatgut, das von Pflanzen erhalten wird, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden. Die Erfindung betrifft ferner die von den Pflanzen produzierten Früchte, Samen, Blätter, Sprosse und Speicherorgane, z. B. Obst, Beeren, Trauben, Getreide und Kartoffeln.

In einer weiteren Ausführungsform wird eine Nukleinsäuresequenz verwendet, die aus Nukleinsäurefragmenten verschiedener MYB26-Gene zusammengesetzt ist. Diese zusammengesetzte Nukleinsäuresequenz kann ferner ebenfalls Modifikationen wie Deletionen, Additionen oder Substitutionen enthalten. Die Verfahren zur Herstellung solcher Nukleinsäuresequenzen sind Stand der Technik und vom Fachmann leicht durchzuführen.

Das vorliegende Erfindung läßt sich auf alle beliebigen pflanzlichen Organismen anwenden. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung männliche sterile mono- und dikotyle Pflanzen bereit. Besonders bevorzugte Pflanzen sind dabei Kulturpflanzen z. B. Soja, Baumwolle, Flachs, Hanf, Sonnenblume, Kartoffel, Tabak, Tomate, Zucchini, Aubergine, Gurke, Sommerraps, Winterraps, Alfalfa, Salat, Chicorée, Spargel, Schwarzwurzel, Erbse, Bohne, Linsen, Karotte, Zwiebel, Lauch, Olive, Rettich, Radieschen, Rote Beete, Steckrübe, Kohlrabi, Zuckerrübe, Futterrübe, Zuckerrohr, Spinat, Mangold, die verschiedenen Baum, Nuß- und Weinspezies, die verschiedenen Kohlsorten wie Rosenkohl, Blumenkohl, Broccoli, Weißkohl, Rotkohl, Wirsing, Chinakohl, ferner Getreide z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Reis, Futtergräser, ferner Obstsorten z. B. Mango, Apfel, Birne, Pfirsich, Pflaume, Himbeere, Brombeere, Stachelbeere, Erdbeere, Kirsche, Johannisbeere, Guave, Banane, Melone, Kürbis und Zitrusfrüchte z. B. Zitrone, Apfelsine, Pampelmuse oder Mandarine. Die mit der Nukleinsäuresequenz transformierten Pflanzen können unmodifizierte Wildtyppflanzen oder durch Züchtung erhaltene Pflanzen oder modifizierte Pflanzen z. B. transgene Pflanzen sein. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner auch in Pflanzengeweben und in Pflanzenzellen, z. B. in einer Zellkultur oder in Expressionssystemen, zur Veränderung der Expressionsmuster von MYB26-Genen oder Fragmenten oder Derivaten oder Homologen dieser Gene verwendet werden.

Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren zur temporären Sterilisation geeignet, indem der MYB26-spezifische Promotor gegen einen induzierbaren Promotor ausgetauscht wird. Durch eine gezielte Induktion der Fertilität kann z. B. auf besondere Umweltbedingungen reagiert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Vektoren, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog und eine regulatorische DNA- Sequenz.

Geeignete Vektoren zur Aufnahme und Überführung der Nukleinsäuresequenzen können die Vermehrung und/oder die Expression der aufgenommenen Nukleinsäuren in Einzellern wie z. B. Escherichia coli oder Agrobacterium tumefaciens oder in Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzen gewährleisten. Entsprechende Vektoren können natürlich vorkommen oder aber künstlich hergestellt sein. Die Vektoren können Selektionsmarker, Terminatorsequenzen, Polylinker, Promotorelemente, Enhancer, Polyadenylierungsstellen und andere genetische Elemente umfassen. Zur Klonierung geeignete Vektoren sind z. B. Plasmide der pBluescript- Serie, Plasmide der pUC-Serie, Plasmide der pGEM-Reihe oder auf dem Bakteriophagen λ basierende Vektoren. Ein zur Verwendung in Agrobacterium benutzter Plasmidvektor ist z. B. pBin19; vgl. Bevan et al., (1984), Nucleic Acids Research 12, 8711-8721. Zur Transformation und Expression in Pflanzen stellen auf dem Ti-Plasmid von Agrobacterium-Arten oder auf Pflanzenviren aufbauende Konstrukte verwendungsfähige Vektoren dar und sind dem Fachmann bekannt. Des weiteren werden bei bestimmten Transformationsmethoden wie z. B. Mikroinjektion, Protoplasten-Transformation und Einschießen (microprojectile bombardment) anstelle von Ti-Plasmiden auch obengenannte Klonierungsvektoren oder linearisierte DNA eingesetzt. Eine zusammenfassende Beschreibung bislang benutzter Vektoren findet sich in Guerineau und Mullineaux, Plant Transformation and Expression Vectors, in: Plant Molecular Biology Labfax, herausgegeben von Croy, Oxford, BIOS Scientific Publishers, 121-148 (1993).

Einige der in handelsüblichen Transformations- und Expressionssystemen angewendeten Transformationsmethoden zur Übertragung von Fremdgenen (Transformation) in das Genom von Pflanzen werden im folgenden vorgestellt. Die Wahl der Methode zur Einbringung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz und der mit ihr funktional verbundenen für ein Genprodukt kodierenden Nukleinsäuresequenzen in pflanzliche Zellen ist jedoch nicht auf diese Liste beschränkt. Bislang eingesetzte Transformationsverfahren bei Pflanzen sind z. B. der Gentransfer mittels Agrobacterium tumefaciens (z. B. durch Baden von Samen, Infloreszenzen oder Blattstückchen in einer Agrobakterienlösung), mittels pflanzlicher Viren, durch Elektroporation, durch Einschießen (microprojectile bombardment) oder Einspritzen (Mikroinjektion) sowie die Inkubation von trockenen Embryonen in DNA-haltigen Flüssigkeiten und die Transformation von Protoplasten unter Zuhilfenahme von Polyethylenglykol. Genauere Beschreibungen der angesprochenen Verfahren finden sich z. B. in Jens et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von Kung und Wu, Academic Press 128-143 (1993).

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die regulatorische Nukleinsäuresequenz (im folgenden auch als Promotor bezeichnet), die natürlicherweise in Arabidopsis thaliana die Expression des MYB26-Gens steuert. Diese erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz ist in SEQ ID NO: 1 aufgeführt. Ferner betrifft die Erfindung Fragmente oder Homologe oder Derivate der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, die die biologische Funktion eines Promotors besitzen, vorzugsweise eines in den männlichen Blütenorganen aktiven Promotors. Ferner betrifft die Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisieren und die biologische Form eines Promotors besitzen, vorzugsweise eines in den männlichen Blütenorganen aktiven Promotors. Bevorzugt sind Nukleinsäuresequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisieren und die biologische Form eines Promotors besitzen, vorzugsweise eines in den männlichen Blütenorganen aktiven Promotors.

Die erfindungsgemäße regulatorische Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat eignet sich z. B. zur Identifizierung und Isolierung von zum MYB26-Gen homologen Genen in anderen Organismen und/oder von zur SEQ ID NO: 1 verwandten regulatorischen Sequenzen in z. B. Arabidopsis thaliana oder anderen Organismen mit Hilfe spezieller Hybridisierungs- oder Screening-Verfahren, z. B. als Sonde für das Screening in DNA-Bibliotheken mit Hilfe der Hybridisierung an einzelsträngige Nukleinsäuren ähnlicher Basenabfolge.

Die erfindungsgemäße regulatorische Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat eignet sich ferner zur spezifischen Steuerung der Expression von Genen oder anderen funktionellen Nukleinsäuren in Organismen oder Zellen, infolge Ihrer Gewebespezifität bevorzugt zur spezifischen Steuerung von Genen in den männlichen Blütenorganen. Nach der stabilen Integration der transformierten Nukleinsäuresequenz liegen dann zwei oder mehr MYB26-Promotoren im Genom vor, so daß die nachgeschalteten Nukleinsäuresequenzen eine diesen Promotoren entsprechende Expressionsregulation aufweisen.

Die mit der erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat funktionell verbundenen Gene oder andere funktionellen Nukleinsäuren können endogene, exogene genomische DNA-Abschnitte oder cDNAs oder deren Fragmente oder Derivate oder synthetische oder semisynthetische Nukleinsäuren sein. Endogen bedeutet dabei, daß die Nukleinsäuresequenz aus dem gleichen Organismus stammt, in den sie mit dem erfindungsgemäßen Verfahren integriert wird, z. B. eine Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in Arabidopsis thaliana integriert. Exogen bedeutet, daß die Nukleinsäuresequenz aus einem anderen Organismus stammt, z. B. eine Nukleinsäuresequenz aus Arabidopsis thaliana wird mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in z. B. Weizen integriert. Die funktionell verbundenen Gene oder andere funktionellen Nukleinsäuresequenzen können gegenüber den natürlich vorkommenden Nukleinsäuresequenzen Deletionen, Substitutionen, Additionen, Insertionen und/oder Inversionen aufweisen.

Beispielsweise kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat für die Regulation der Expression des natürlicherweise mit ihr verbundenen MYB26-Gens verwendet werden, so daß Pflanzen mit gesteigerter, reduzierter oder vollkommen fehlender MYB26-Expression vorliegen, was zu einer Beeinflussung des MYB26-Stoffwechselweges und demzufolge zu einer Strukturveränderung des Pollensackgewebes sowie einer damit verbundenen maskierten Fruchtbarkeit führt.

Ferner eignet sich die erfindungsgemäße regulatorische Nukleinsäuresequenz auch für die Regulation der Expression anderer Gensequenzen. Dabei kann der Promotor in Kombination mit beliebigen Genen vorliegen, sowohl in einem Vektor als auch in transgenen Organismen. Insbesondere ist der Promotor für die Regulation der Expression von Genen in den Blütenorganen verwendbar, in besonderem Maße für die Regulation der Expression von Genen in den Antheren, speziell im Pollensackgewebe. Dabei können prinzipiell Gene aus sämtlichen pflanzlichen Stoffwechselwegen vom Promotor reguliert werden, z. B. Gene, kodierend für Komponenten des Fettstoffwechsels (z. B. Acyl-CoA-Synthase, Acetyl-CoA-Carboxylase etc.), Kohlenhydratstoffwechsels (z. B. Phosphofructokinase, Fructose-1,6-bisphosphatase, Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase etc.), Aminosäurestoffwechsels (z. B. Aminotransferasen, Desaminasen etc.), Hormonstoffwechsels (z. B. Gene für die Synthese von Auxinen, Gibberellinen, Abscisinsäure etc.), Photosynthese (z. B. Rieske-Protein, psaE etc.), Zellarchitektur (z. B. Tubulin, Aktin etc), Atmung (z. B. Cytochrom C, Cytochrom C-Oxidase etc.), Pathogenabwehr (Flavonoide, Terpene etc.) usw.. Besonders geeignete zu regulierende Gene beeinflussen z. B. Struktur, Größe oder Stoffwechsel des Pollensacks, so daß transgene Pflanzen mit veränderten männlichen Blütenorganen, z. B. größeren, stabileren oder formveränderten Pollensäcken, entstehen können. So können entsprechende Gene unter anderem am Aufbau von Pollensackstrukturen beteiligt sein, z. B. an der Synthese oder dem Einbau von Lignin oder Cellulose für sekundäre Zellwandverdickungen. Ein Beispiel für ein entsprechendes antherenspezifisches Gen ist das vermutlich an der Ligninsynthese beteiligte CHSLK-Gen (Genbank Accession Nummer Y14506), kodierend für eine putative Chalcon-Synthase. Auch Gene für die Zellwandstrukturen modifizierende oder abbauende Enzyme sind hier zu nennen, z. B. A6, ein Gen für eine antherenspezifische β-1,3-Glucanase (Genbank Accession Nummer X62716). Weitere Beispiele für antherenspezifische Gene mit teilweise noch unbekannter Funktion sind sf2 (Genbank Accession Nummer X62716), RA8 (Genbank Accession Nummer AF042275) ATA20 (Genbank Accession Nummer AF037362) und MZm3-3 (Genbank Accession Nummer AJ224355). Weiterhin besonders zur Regulation mit Hilfe des Promotors geeignet sind Gene, die bei spezifischer Expression in den männlichen Blütenorganen ebenfalls männliche Sterilität in Pflanzen erzeugen, z. B. infolge des Absterbens der betroffenen Zellen. Für diesen Zweck können verschiedenste Proteine exprimiert werden, die den normalen Stoffwechsel der Zelle erheblich stören. Besonders geeignet sind hierfür katabolische Enzyme wie Nucleasen, Proteasen, Lipasen oder Glucanasen.

Die erfindungsgemäßen regulatorischen Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate können natürlichen Ursprungs sein oder künstlich hergestellt worden sein. Die funktionell verbundenen Gene oder die anderen funktionellen Nukleinsäuresequenzen können sowohl in Sense- als auch in Antisense- Orientierung vorliegen.

Die erfindungsgemäße regulatorische Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Fragmente oder Homologe oder Derivate können in Vektoren, Expressionssystemen oder Pflanzen, Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen oder tierischen Zellen oder Mikroorganismen zur Veränderung der Expressionsmuster verschiedenster Genprodukte verwendet werden. Die Expression der Genprodukte kann dabei gegenüber Ihrer natürlichen Expression sowohl verstärkt als auch verringert sein.

Die vorliegende Erfindung betrifft demzufolge ferner Vektoren, umfassend eine regulatorische Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog.

Die Erfindung betrifft ferner transgene Pflanzen mit einer stabil in das Genom integrierten regulatorischen Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Funktion eines Promotors, vorzugsweise eines in den männlichen Blütenorganen aktiven Promotors, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden oder einer anderen funktionellen Nukleinsäuresequenz entsprechend den vorstehend aufgeführten und beschriebenen Beispielen für solche codierenden oder anderen funktionellen Nukleinsäuresequenzen.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Pflanze mit veränderter Genexpression, umfassend das stabile Integrieren einer regulatorischen Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder deren Fragment oder Homolog oder Derivat mit der biologischen Funktion eines Promotors, vorzugsweise eines in den männlichen Blütenorganen aktiven Promotors, und einer mit dieser Sequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden oder einer anderen funktionellen Nukleinsäuresequenz in das Genom von Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben sowie Regeneration der erhaltenen Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben zu Pflanzen.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auf alle beliebigen pflanzlichen Organismen anwenden. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Veränderung der Genexpression von mono- und dikotylen Pflanzen einsetzbar. Besonders bevorzugte Pflanzen sind dabei Kulturpflanzen z. B. Soja, Baumwolle, Flachs, Hanf, Sonnenblume, Kartoffel, Tabak, Tomate, Zucchini, Aubergine, Gurke, Sommerraps, Winterraps, Alfalfa, Salat, Chicoree, Spargel, Schwarzwurzel, Erbse, Bohne, Linsen, Karotte, Zwiebel, Lauch, Olive, Rettich, Radieschen, Rote Beete, Steckrübe, Kohlrabi, Zuckerrübe, Futterrübe, Zuckerrohr, Spinat, Mangold, die verschiedenen Baum, Nuß- und Weinspezies, die verschiedenen Kohlsorten wie Rosenkohl, Blumenkohl, Broccoli, Weißkohl, Rotkohl, Wirsing, Chinakohl, ferner Getreide z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Reis, Futtergräser, ferner Obstsorten z. B. Mango, Apfel, Birne, Pfirsich, Pflaume, Himbeere, Brombeere, Stachelbeere, Erdbeere, Kirsche, Johannisbeere, Guave, Banane, Melone, Kürbis und Zitrusfrüchte z. B. Zitrone, Apfelsine, Pampelmuse oder Mandarine. Die mit der Nukleinsäuresequenz transformierten Pflanzen können unmodifizierte Wildtyppflanzen oder durch Züchtung erhaltene Pflanzen oder modifizierte Pflanzen z. B. transgene Pflanzen sein. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ferner auch in Pflanzengeweben und in Pflanzenzellen, z. B. in einer Zellkultur oder in Expressionssystemen, zur Veränderung der Expressionsmuster von MYB26-Genen oder Fragmenten oder Derivaten oder Homologen dieser Gene verwendet werden.

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:

BEISPIELE

Beispiel 1 Allgemeine Klonierungsverfahren

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von Nukleinsäurefragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Filtermaterialien, Transformation und Anzucht von Bakterienzellen u. s. w. wurden wie bei Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory (1989), ISBN 0-87969-309-6, durchgeführt.

Beispiel 2 Herstellung einer Knockout-Population von Arabidopsis thaliana

Die vorliegende Erfindung wurde durch das Screening einer mit dem Transposon En-1/Spm (Pereira et al. EMBO Journal S. 835-841 (1986)) mutagenisierten Knockout-Population von Pflanzen der Spezies Arabidopsis thaliana Ecotyp Columbia erhalten. Die Integration der transposablen Elemente in Gene der Mutterpflanze führt häufig zum Ausfall der entsprechenden Genfunktion und in vielen Fällen zu einem vom Wildtyp unterscheidbaren Erscheinungsbild der betroffenen Pflanze. Zum Aufbau der Knockout-Population wurde das autonome En-1 Element aus Zea mays mittels Agrobacterium tumefaciens in Arabidopsis übertragen. Das entsprechende Transposon tagging System ist in Cardon et al., Plant Molecular Biology 23, 157-178 (1993) beschrieben. Das verwendete Ti-Plasmid, pGV3850HPT::pkEn2, beinhaltete das komplette En-1 Element als Integrat. Zur Selektion von Hygromycin resistenten Transformanten trägt dieser Vektor das HPT-Gen unter der Kontrolle des viralen CaMV 35S Promotors. Samen einer Transformante mit einer einzelnen T-DNA-Insertion wurden auf Hygromycin-haltigem Medium ausgesät. Samen der so entstandenen, gegen Hygromycin resistenten Pflanzen (T₂-Generation) wurden anschließend auf Kanamycin-haltigem Medium ausgesät. Bei den auf diese Weise selektionierten Pflanzen (T₃-Generation) war das En1-Element aus der T-DNA heraus transponiert. Mittels PCR wurde diejenigen Pflanzen der T₄-Generation identifiziert, die ein oder mehrere transponierte En-1 Elemente, jedoch keine En-1 Elemente mehr in der T-DNA trugen. Diese Pflanzen beeinhalteten jedoch noch die T-DNAs ohne integrierte En-1 Elemente. Zur Erzeugung von En-1 positiven, T-DNA negativen Pflanzen wurde die T₄-Generation mit dem Wildtyp Arabidopis thaliana Ecotyp Columbia gekreuzt und En-1 positive, T-DNA negative Pflanzen (S₀-Generation) durch PCR identifiziert. Samen jeder dieser Pflanzen wurden über 6-12 Generationen (bis zur S₆- bzw. S₁₂-Generation) hinweg vermehrt, bis insgesamt 3000 Linien mit insgesamt 15 000 unabhängigen En-1 Insertionen zur Verfügung standen (Wisman et al., Plant Molecular Biology 37, 989-999 (1998), Baumann et al., Theoretical and Applied Genetics 97, 729-734 (1998)).

Beispiel 3 Screening nach sterilen Mutanten

Zur Identifizierung von phänotypisch auffälligen Mutanten der entstandenen En-1 Population wurden Familien der S₇-Generation (mit jeweils 18 Individuen) per Auge nach Auffälligkeiten durchmustert. Dabei konnte eine Linie (7AAB12) identifiziert werden, die für kleine, leere Schoten segregierte. Mikroskopische Analysen der Blüte steriler Individuen ergaben, daß sich in Mutanten die Pollensäcke nicht öffnen, wohingegen die Pollen normal erscheinen. Die Mutation wurde daher mit andl (anther non dehiscence) bezeichnet. Bei allen sterilen Pflanzen traten vereinzelt normale Schoten mit keimungsfähigen Samen auf. Diese stellen vermutlich somatische Reversionsereignisse dar, was auf die Integration eines intakten Transposons als Mutationsursache hindeutet.

Zur Klonierung des mutierten Gens wurde zunächst bestimmt, ob der mutante Phänotyp mit dem homozygoten Zustand einer bestimmten Integration der Transposons gekoppelt ist. Für diesen Zweck wurden 18 Schwesterpflanzen der En-Linie 7AAB12 analysiert. Sechs dieser Pflanzen wiesen Sterilität auf, was auf eine rezessive Mutation hindeutet. Phänotypische Analyse von je 18 Nachkommen der fertilen Individuen ergab, daß sieben der 18 Ausgangspflanzen auch sterile Nachkommen produzierten und somit heterozygot für and1 waren, wohingegen fünf Pflanzen keine sterilen Nachkommen zeigten und somit homozygot für das Wildtypallel waren. Mittels Southern Blot Analysen konnten in allen 18 Pflanzen durch Hybridisierung mit einer En-Sonde mehrere Kopien des Transposons nachgewiesen werden, wobei sich eine Kopie in allen sterilen Pflanzen sowie in den sieben für die Mutation heterozygoten fertilen Pflanzen fand nicht jedoch in den übrigen fünf Pflanzen, die homozygot für das Wildtypallel waren. Fig. 4 zeigt eine Southern Blot Analyse mit EcoRI gespaltener DNA von je einem Nachkommen von 14 der ursprünglich 18 analysierten Pflanzen. Als Sonde diente das 5'-Ende des Transposons. In den das Fehlen einer Integration in den Pflanzen, die homozygot das Wildtypallel tragen, ist deutlich sichtbar.

Die flankierende DNA von acht verschiedenen En-Insertionen wurde durch "Transposon- Insertion-Display" (TID), vgl. Yephremov und Saedler, The Plant Journal 21, 495-505, 2000, gewonnen und in den pGemTeasy Vektor (Firma Promega) kloniert. Die Inserts der resultierenden Plasmide wurden sequenziert. Sequenzvergleiche mit Sequenzdatenbanken ergaben in fünf Fällen 100%ige Übereinstimmung mit genomischen Arabidopsis-Sequenzen. Die anhand der Sequenz berechneten Längen von Restriktionsfragmenten wurden mit den in Southern Blot Analysen erhaltenen Fragmenten verglichen. Eine Sequenz zeigt Übereinstimmung der errechneten Fragmentlängen mit den experimentell bestimmten Längen für die Bande, die gekoppelt mit der andl Mutation auftritt. Diese Sequenz des P1-Clons MDC16 trägt im Bereich der Transposonintegrationsstelle ein offenes Leseraster, das 100% Identität zur cDNA des putativen Transkriptionsfaktors AtMYB26 aufweist. Hybridisierungen unter Verwendung der AtMYB26 cDNA (ohne MYB-Domäne) zeigten, daß alle sterilen Pflanzen homozygot eine En-Insertion in AtMYB26 tragen, wohingegen alle Pflanzen, welche die Mutation nicht tragen, auch keine Insertion in AtMYB26 aufweisen.

Beispiel 6 Reversion der andl Mutation

Um zu überprüfen, ob die Sterilität in den untersuchten Pflanzen tatsächlich durch die En- Insertion in AtMYB26 hervorgerufen wird, wurden 12 Nachkommen einer sterilen Pflanze mit fertilen Sektoren (7AAB-14-3) auf Verlust der En-Insertion in AtMYB26 untersucht. Alle 11 fertilen Nachkommen zeigten Verlust der En-Insertion in einer Kopie von AtMYB26, wohingegen eine sterile Tochterpflanze noch immer homozygot die Insertion in AtMYB26 aufwies. Der Verlust der En-Insertion in mindestens einer Kopie von AtMYB26 führt somit zum Verlust des mutanten Phänotyps.

Beispiel 7 Selektion einer stabilen Mutante

Eine stabile Mutante wurde während Southern-Analysen von Nachkommen der Linie 7AAB12 gefunden. Einige Individuen zeigten trotz des Verlustes der Integration in AtMYB26 Sterilität. In diesen Pflanzen ergab die Sequenzanalyse des PCR-amplifizerten 5'-Bereichs von MYB26, daß drei Codons im Bereich der MYB-Domäne deletiert waren.

Beispiel 8 Mikroskopische Untersuchung von Antheren

Die fünftälteste noch geschlossenen Knospe von Wildtyp und MYB26-Mutante wurde in 2% Paraformaldehyd/0,25% Glutaraldehyd für 2 h fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Semidünnschnitte wurden mit Calcofluor White gefärbt, wie in Dawson et al., 1999 (New Phytologist 144: 213-222) beschrieben.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Transgene Pflanze mit maskierter Fruchtbarkeit, wobei die maskierte Fruchtbarkeit durch eine veränderte Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog, oder durch die Veränderung der biologischen Aktivität des durch die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog kodierten Genprodukts hervorgerufen wird.

2. Transgene Pflanze nach Anspruch 1, wobei die Expression verstärkt, verringert oder komplett ausgeschaltet ist.

3. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit einer verstärkten Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog, umfassend eine zur endogenen Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog zusätzlich stabil in das Genom integrierten Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Homolog, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen regulatorischen Nukleinsäuresequenz.

4. Transgene Pflanze nach Anspruch 3, umfassend mindestens zwei Kopien der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog.

5. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit einer verringerten oder komplett ausgeschalteten Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog, umfassend die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog, in Antisense-Orientierung.

6. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die regulatorische Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Promotoren CaMV 35S-Promotor, Ubiquitin-Promotor, PRPI-Promotor, Phaseolin-Promotor, Isoflavon-Reduktase Promotor, ST-LSI Promotor, durch Salizylsäure induzierbarer Promotor, durch Benzolsulfonamid induzierbarer Promotor, durch Tetrazyklin induzierbarer Promotor, durch Abscisinsäure induzierbarer Promotor, durch Ethanol oder Cyclohexanon induzierbarer Promotor, Promotor nach einem der Ansprüche 8 bis 10, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog mit der biologischen Funktion eines Promotors, oder ein samenspezifischer Promotor aus Tabak.

7. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 oder 2 mit einer komplett ausgeschalteten Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog, umfassend Deletionen, Substitutionen, Additionen oder Inversionen.

8. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Expression der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog durch Modifikation funktioneller Komponenten der regulatorischen Nukleinsäuresequenz verändert wird.

9. Transgene Pflanze nach Anspruch 8 wobei die funktionellen Komponenten TATA-Box, CAAT-Box, GC-Box, Enhancer oder Bindestellen für weitere Transkriptionsfaktoren umfassen.

10. Transgene Pflanze nach Anspruch 1 mit veränderter biologischer Aktivität, umfassend Modifikation der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder deren Homolog.

11. Transgene Pflanze nach Anspruch 10, wobei die Modifikationen Deletionen, Additionen oder Substitutionen umfassen.

12. Nukleinsäuresequenz nach SEQ ID NO: 1.

13. Fragment oder Derivat der Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 12 oder eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisiert und die biologische Aktivität eines für die männlichen Blütenorgane spezifischen Promotors besitzt.

14. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 13, wobei die hybridisierende Nukleinsäuresequenz unter stringenten Bedingungen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisiert.

15. Transgene Pflanze mit einer stabil in das Genom integrierten regulatorischen Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 14, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden oder einer anderen funktionellen Nukleinsäuresequenz.

16. Transgene Pflanze nach Anspruch 15, wobei für die für ein Genprodukt codierende oder für die andere funktionelle Nukleinsäuresequenz eine endogene oder exogene Nukleinsäuresequenz verwendet wird.

17. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 11, 15 oder 16, umfassend das stabile Integrieren einer regulatorischen Nukleinsäuresequenz, insbesondere einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 14, und einer mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden oder einer anderen funktionellen Nukleinsäuresequenz, insbesondere der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog, in das Genom von Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben und Regeneration der erhaltenen Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben zu Pflanzen.

18. Transformierte Pflanzenzelle oder transformiertes Pflanzengewebe mit einer stabil in das Genom integrierten regulatorischen Nukleinsäuresequenz, insbesondere einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 14 und eine mit dieser Nukleinsäuresequenz funktionell verbundenen für ein Genprodukt codierenden oder einer anderen funktionellen Nukleinsäuresequenz, insbesondere der Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, oder deren Fragment oder Derivat oder Homolog.

19. Pflanzenzelle oder Pflanzengewebe nach Anspruch 18, regenerierbar zu einer samenproduzierenden Pflanze.

20. Saatgut, erhalten von Pflanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 11, 15 oder 16.

21. Vektor, umfassend eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 14.