HU221518B - Hímfertilitást közvetítő nukleotidszekvenciák és eljárások azok alkalmazására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát növényekben hímfertilitást közvetítőnukleotidszekvenciák, a nukleotidszekvenciák által kódoltaminosavszekvenciák, a nukleotidszekvenciákat tartalmazó expresszióskazetták, a nukleotidszekvenciákat tartalmazó plazmidvektorok, anukleotidszekvenciákkal transzformált növények és növényi sejtekképezik, valamint eljárások, növényben hímfertilitás közvetítésére ésörökletes, külső szabályozás alatt álló hímsterilitás előidézésére,továbbá a találmány szerinti eljárással előállított növények éseljárások ilyen növények reprodukálására és hibridmagok előállítására.A találmány szerinti megoldás alkalmas növénynemesítés soránhímfertilitás előidézésére és szabályozására, valamint hibridmagokelőállítására. ŕ

Description

A találmány tárgyát növényekben hímfertilitást közvetítő nukleotidszekvenciák, a nukleotidszekvenciák által kódolt aminosavszekvenciák, a nukleotidszekvenciákat tartalmazó expressziós kazetták, a nukleotidszekvenciákat tartalmazó plazmidvektorok, a nukleotidszekvenciákkal transzformált növények és növényi sejtek képezik, valamint eljárások, növényben hímfertilitás közvetítésére és örökletes, külső szabályozás alatt álló hímsterilitás előidézésére, továbbá a találmány szerinti eljárással előállított növények és eljárások ilyen növények reprodukálására és hibridmagok előállítására.

A találmány szerinti megoldás alkalmas növénynemesítés során hímfertilitás előidézésére és szabályozására, valamint hibridmagok előállítására.

A növénynemesítés célja az, hogy a szülői vonalak különböző előnyös tulajdonságait egyetlen változatban vagy hibridben egyesítsük. Szántóföldi növények esetében, ezek a tulajdonságok lehetnek betegségekkel és rovarokkal szemben tanúsított ellenálló képesség, hőmérséklet- és szárazságtűrés, a tenyészidő rövidülése, magasabb terméshozam és jobb termésminöség. A gépesített betakarítás igényeihez igazodva lényeges, hogy egyöntetűek legyenek az olyan növényi jellemzők, mint például a csírázási és megdőlési hajlam, a növekedés üteme, a beérés időpontja és a termés mérete.

A szántóföldi növények termesztésénél alkalmazott eljárások a adott növényfaj megporzási tulajdonságait használják ki. Egy növény önmegporzó, ha egy adott virágából származó pollen (virágpor) ugyanazon növény ugyanazon virágját vagy annak másik virágját termékenyíti meg. Egy növény idegenmegporzású, ha a pollennek egy másik növény virágjából kell származnia.

A Brassica nemhez tartozó növények normális esetben önsterilek és csak idegenmegporzással szaporíthatok. Az önmegporzó fajok esetében, mint például a szójabab vagy a gyapot, a hím- és nőivarú szaporítószervek anatómiailag egymás mellett helyezkednek el. Természetes úton történő megporzás során, adott növény hímivarszervei termékenyítik meg ugyanazon növény ugyanazon virágának nőivarú szerveit.

A kukoricanövények fZea mays L.) esetében, annyiban áll elő különleges helyzet, hogy azok egyaránt termeszthetők önmegporzási és idegenmegporzási technikákkal. A kukoricának vannak hímivarú virágai (porzós virágai), amelyek a címeren helyezkednek el, és vannak nőivarú virágai (termős virágai), amelyek a csövön helyezkednek el, egyazon a növényen. A kukorica önmegporzásra vagy idegenmegporzásra is képes. A kukorica természetes megporzása úgy történik, hogy a szél pollent juttat a címerről a befogadó termők hegyéből kitüremkedő kukoricahajra.

Növényekben, a hímfertilitás szabályozását szolgáló megbízható eljárás előrelépést jelentene a növénynemesítés terén. Ez különösen érvényes a kukoricahibridek fejlesztésére, amely egyfajta hímsterilitási rendszeren alapul.

A kukoricahibridek fejlesztéséhez homozigóta beltenyésztett vonalak kialakítására, ezen vonalak keresztezésére és a keresztezéssel kapott növények minősítésére van szükség. Adott populációból származó beltenyésztett vonalak kifejlesztésére alkalmazható nemesítést eljárások például az egyedkiválogatáson alapuló eljárás (pedigrétenyésztés) és a reciprok (rekurrens) szelekciós eljárás (megismételt szelekció). A nemesítési programok két vagy több beltenyésztett vonal vagy különböző egyéb források előnyös tulajdonságainak nemesítési állományokban történő egyesítésére irányulnak, amelyekből öntermékenyítéssel és a kívánt fenotípusra történő szelekcióval új beltenyésztett vonalak fejleszthetők ki. Egy kukoricahibrid-változat két olyan beltenyésztett vonal keresztezésének eredménye, amelyek mindegyike egy vagy több, a másik vonalból hiányzó vagy a másikat kiegészítő előnyös tulajdonsággal rendelkezik. Az új beltenyésztett vonalakat más beltenyésztett vonalakkal keresztezzük, és az említett keresztezésekből származó hibrideket arra nézve értékeljük, hogy melyek kereskedelmi jelentőséggel bíró vonalak. Az első generációba tartozó hibrid utódokat Flnemzedéknek nevezzük. Hibridek kifejlesztésénél csak az Fl-generációhoz tartozó hibrid növények keresettek. Az Fl-hibridek sokkal életképesebbek, mint azok beltenyésztett szülői. A hibridekre jellemző életképesség,. más néven heterózis, számos területen megnyilvánulhat, például fokozott vegetatív növekedőképességben és megnövekedett hozamban.

Hibrid kukoricamagokat tipikusan, kézi módszerrel végzett lecímerezést magában foglaló hímsterilitási rendszer alkalmazásával állítunk elő. Kukorica két beltenyésztett változatát váltakozó sávokban ültetjük^ és pollent tartalmazó címereket az egyik beltenyésztett* vonalról (női vonal) eltávolítjuk. Feltéve, hogy a növé-= nyék idegen kukoricapollent tartalmazó fonástól megfelelő izoláltságban találhatók, a címerezett beltenyésztett törzsek csöveit csak a másik beltenyésztett vonalból (hímvonalból) származó pollen fogja megtermékenyíteni, ezáltal az így kapott magok hibrid magok lesznek, és azokból hibrid növények fejlődnek. A kézi cimerezési módszer sajnos nem teljesen megbízható. Esetenként egy női növényt a vihar ledönti, és az elkerüli a címerezést. A növények fejlődésében megfigyelhető természetes variációk következtében, egyes növények hozhatnak címert a kézi cimerezés befejezését követően is. Előfordulhat az is, hogy cimerező nem távolítja el teljes egészében a növényen található címert. Bármely esetben a női növény sikeresen teijesztheti pollenjét, és egyes női növényeknél önmegporzás következik be. Ennek az lesz a következménye, hogy a normális esetben képződő hibridmagokkal együtt a női beltenyésztett törzs magjait is betakarítjuk.

Más eljárás szerint a női beltenyésztett vonal cimerezése mechanikus úton is történhet. A mechanikus úton végzett cimerezés megbízhatósága körülbelül megegyezik a kézi cimerezés megbízhatóságával, de az gyorsabb és kevésbé költséges. A legtöbb címerezőgép azonban több kárt tesz a növényekben, mint a kézi címerezés. Tehát a cimerezés egyik módszere sem teljesen kielégítő, és továbbra is igény van olyan egyéb eljárásokra, amelyek alkalmazásával, a hibridmagok előállítása során tovább csökkenthetők a termelést költségek és kiküszöbölhető az önmegporzás.

HU 221 518 Bl

A munkaigényes címerezési folyamat elkerülhető citoplazmás hímsteril („cytoplasmic male-sterile”, CMS) beltenyésztett vonalak alkalmazásával. A CMS típusú beltenyésztett vonalakhoz tartozó növények hímsterilitását a citoplazmából származó faktorok eredményezik, szemben a nukleáris, vagy genomi eredetű hímsterilitással. Ez a sajátság tehát kizárólag a női növényen keresztül öröklődik a kukoricanövényekbe, mivel csak a női növény szolgáltat citoplazmát a megtermékenyített mag számára. CMS növények fertilizációja egy másik, nem hímsteril beltenyésztett növényből származó pollennel történik. A második beltenyésztett növény pollenje tartalmaz vagy nem tartalmaz a hibrid növényekben hímsterilitást eredményező géneket. Rendszerint címerezett normális kukoricából származó magokat és ugyanazon hibridhez tartozó CMS növények által termelt magokat kell összekevernünk ahhoz, hogy a hibrid növények fejlődésekor a fertílizációhoz elegendő mennyiségű pollen álljon rendelkezésre.

A CMS-eljárásnak más hátrányai is vannak. Az egyik régen megfigyelt jelenség szerint meghatározott CMS változatokhoz bizonyos növényi betegségekkel szembeni fogékonyság kapcsolódik. Ez a probléma vezetett ahhoz, hogy hibrid kukoricák előállítása során a CMS változatokat gyakorlatilag nem alkalmazzák.

A sterilitás másik formája a gének által meghatározott himsterilitás, amelyet például a 4 654 465 és 4 727 219 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások ismertetnek (Brar és munkatársai). A gének által meghatározott hímsterilitás eme formája azonban a genomban több, különböző helyen található mutáns gén fenntartását és olyan összetett markerrendszer kidolgozását teszi szükségessé, amely lehetővé teszi a gének nyomon követését, valamint a rendszer egyszerű alkalmazását. Patterson és munkatársai szintén, kromoszomális transzlokációkon alapuló, gének által meghatározott rendszert ismertetnek, amely hatékony ugyan, de bonyolult. (Lásd, a 3 861 709 számú és a 3 710 511 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat).

Számos további kísérlet irányult az említett hátrányok kiküszöbölésére. Például, Fabijansky és munkatársai több, növényekben hímsterilitás létrehozására alkalmazható eljárást dolgoztak ki (lásd, EPO 89/3010153.8, közzétételi szám: 329 308; valamint PCT/CA90/00037 számú PCT bejelentés, WO/90/08828 számú nemzetközi közzétételi irat). Eljárhatunk úgy, hogy a növénybe, hím szövetspecifikus promoterrel kapcsoltan, citotoxikus anyagot kódoló gént juttatunk. Alkalmazhatunk továbbá antiszensz rendszert, amely szerint a fertilitás szempontjából kulcsfontosságú gént azonosítunk, és az adott génnel szemben antiszensz molekulákat juttatunk a növénybe. Mariani és munkatársai több, citotoxint kódoló génszekvenciát, valamint hím szövetspecifikus promotert azonosítottak, és említést tesznek egy antiszensz rendszer alkalmazásáról is (lásd, az EP 98/401 194 számú európai szabadalmi leírást). Egy további rendszerben ,/epresszor” géneket alkalmaznak, amelyek más, a hímsterilitás szempontjából kulcsfontosságú gén expresszálódását gátolják. (Lásd, PCT/GB90/00102 bejelentés, közzétételi szám: WO 90/08829.)

Amint azt említettük, a legtöbb, hímsterilitási rendszerrel kapcsolatos, folyamatban levő kutatás elsősorban hímsterilitást érintő gének azonosítására irányul.

Ilyen gének különböző rendszerekben alkalmazhatók, hímsterilitás szabályozására. A korábbiakban, hímsterilitásért felelő gént azonosítottak Arabidopis thalianában, és annak alkalmazásával hímsteril növényt állítottak elő [Aarts és munkatársai: „Transposan Tagging of a Male Sterility Gene in Arabidopsis”, Natúré 363, 715 (1993, június 24.)]. A leírásban olyan, új DNSmolekulákat, valamint a fenti DNS-molekulák által kódolt aminosavszekvenciákat ismertetünk, amelyek növényekben, a hímfertilitás fenntartásában kulcsfontosságú szerepet töltenek be.

Ezenfelül, hímsterilitás szabályozására szolgáló eljárások egy olyan egyedi változatát tárjuk fel, amely szerint a növény - hímsterilitást előidéző DNS-molekulával történő - transzformációját követően a fertilitás, és nem a sterilitás válik indukálhatóvá.

A találmány tárgyát képezik tehát nukleinsavszekvenciák, amelyek expresszálódása növényekben a hímfertilitás szempontjából kulcsfontosságú.

A találmány tárgyát képezik továbbá, aminosavszekvenciát kódoló DNS-molekulák, amelyek expresszáló^ dása növényekben a hímfertilitás szempontjából kulcsfontosságú.

A találmány tárgyát képezik ezenfelül eljárások az ilyen DNS-molekulák alkalmazására, növényekben hímfertilitás közvetítésére.

A találmány tárgyát képezik továbbá, növényekben hímfertilitás közvetítésére alkalmazható eljárások, amelyek szerint növényben a természetben előforduló? DNS-molekulák expresszálódását szabályozzuk.

A találmány tárgyához tartoznak ezenfelül növényekben hímfertilitás közvetítésére alkalmazható eljárások, amelyek szerint a DNS-molekulák növényekbe történő bejuttatását oly módon végezzük, hogy a DNSmolekulák expressziója szabályozható legyen.

A találmány tárgyát képezik továbbá növények, amelyek a fenti DNS-molekulák közvetítésével alakíthatók hímfertilis formákká.

A találmány tárgyához tartozik ezenfelül a DNSmolekulák által közvetített hímfertilitással rendelkező növények alkalmazása növénynemesítési rendszerekben.

A találmány további célkitűzései nyilvánvalóak lesznek a leírás és az azt követő igénypontok alapján.

Az alábbiakban összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást

A találmány tárgyát képezik himsterilitás szempontjából kulcsfontosságú nukleinsavszekvenciák, közelebbről, DNS-molekulák, és a DNS-molekulák által kódolt aminosavszekvenciák. A találmány tárgyához tartozik ezenfelül az ilyen DNS-molekulák alkalmazása növényekben hímfertilitás közvetítésére. Egy ilyen eljárás szerint a növényt a DNS-molekula expresszálódását szabályozó indukálható promoter alkalmazásával, szabályozható módon tesszük hímsterillé, úgy, hogy a gén normális esetben „kikapcsolt állapotban van”, ezáltal a

HU 221 518 Bl növény steril. A promoter indukálásával a növény újból fertílissé válik.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leírásokhoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábrán az Mc-transzpozon restrikciós térképét ábrázoltuk.

A 2. ábrán sterilitásra nézve szegregálódó Ac-családból származó, Pvull-enzimmel emésztett, és Ac-transzpozonból származó, 1,6 kb, belső HindlII-fragmenssel hibridizáltatott DNS Southemblot-analízise látható.

A 3. ábrán az inverz polimeráz-láncreakció menetét szemléltettük vázlatosan.

A 4. ábrán látható grafikonon az 1,4 kb DNSizolátumot és a közbülső szekvenciákat (intronokat) ábrázoltuk.

Az 5. ábrán sterilitásra nézve szegregálódó Accsaládból származó, Pvull-enzimmel emésztett, és az 1,4 kb DNS-izolátummal hibridizáltatott DNS Southemblot-analízisét ábrázoltuk.

A 6. ábrán MS45 jelű hímsterilitási génnel hibridizáltatott gél Northem-blot-analizisét mutatjuk be.

A 7. ábrán Mc-transzpoziciót követően létrejött fertilis, revertáns növényből származó DNS nukleotid- és aminosavszekvenciáját ábrázoltuk.

A 8. ábrán a 9. kromoszóma RFLP-térképét mutatjuk be, az MS45 jelű hímfertilitási gén helyének jelölésével.

Az alábbiakban ismertetjük a találmány szerinti megoldást

Valamennyi említett hivatkozás teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi.

Hacsak kifejezetten másképp nem kötjük ki, a leírásban szereplő valamennyi technikai és tudományos kifejezést szakember számára ismert értelemben használunk. Az alkalmazott vagy javasolt technikák - kivéve, ha kifejezetten másképp kötjük ki - szakember számára jól ismert eljárások. A leírásban ismertetett anyagok, módszerek és példák csak a szemléltetést szolgálják, anélkül, hogy igényünket azokra korlátoznánk.

Himfertilitást közvetítő DNS-molekulák

A gének által meghatározott hímsterilitás a mikrosporogenezis - a pollenképződés teljes folyamatának megjelölésére használt kifejezés - meghatározott lépéséért felelős gének egyikében létrejött mutáció eredménye. Ezeket a géneket összefoglalóan hímfertilitási géneknek nevezzük. A teljes folyamat számos olyan lépésből áll, amelyek valamelyikét érintő mutáció hímsterilitáshoz vezethet. Ezt támasztja alá kukorica esetében a gének által meghatározott hímsterilitás előfordulásának gyakorisága. Elit beltenyésztett törzsektől nem adaptált populációkig terjed azoknak az növényeknek a köre, amelyekben újabb, himsterilitást előidéző allétokat mutattak ki. Egészen napjainkig a gének által meghatározott hímsterilitásra vonatkozó kutatások elsősorban leíró jellegűek voltak. Több kísérlet irányult a sterilitás fenti mechanizmusának létrehozására kukoricában, de ezek közül kevés bizonyult sikeresnek Ez nem meglepő, számításba véve a hímsterilitásért felelős azonosított gének nagy számát. Nem valószínű, hogy egyetlen mechanizmus érvényesülne valamennyi mutáció esetében.

A találmány tárgyát képezik egyrészt növényi hímfertilitási gének. Pollenfejlődésre és címerfejlődésre (címerhányásra) specifikus cDNS-eket számos közleményben ismertetnek. Egészen mostanáig egyik sem vezetett olyan gén klónozásához, amelyet pollenfejlődést befolyásoló génnek lehetett volna nevezni.

A találmány szerinti megoldást a továbbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.

Címkézés („tagging”)

Az Ac-transzpozon („Activator”, aktivátor) jól ismert transzponábilis elem, amelyet 1954-ben, Barbara McClintock írt le [McClintock B.: „Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi.”, 21, 197-216 (1956); McClintock B.: „Camegie Inst. Wash. Yrbook”, 53, 254 (1954); lásd továbbá, Federoff: 4 732 856 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (bejelentés napja: 1988, március 22.); valamint Dooner: 5 013 658 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (bejelentés napja: 1991, május 8.)]. Az Ac-elemet alkalmaztuk a találmány szerinti DNSmolekula klónozására. Az általunk alkalmazott Acéléin restrikciós térképét az 1. ábrán mutatjuk be. Az Ac-transzpozon restrikciós hasítási helyei szakember számára jól ismertek. Összefoglalva, az Ac-transzpozon az 1. kromoszóma P-vv-lokuszáról a 9. kromoszómára került át. A 9. kromoszómán található egyetlen, nemrégiben leírt himsterilitási gén az ms2-gén, amelyet eddig nem klónoztak és nem szekvenálták. [Lásd, Albertsen M. és Phillips R. L.: „Developmental cytology of 13 genetic male sterilé loci in maize”, Canadian Jnl. of Genetics and Cytology 23, 195 (1981, január).] Az egyetlen klónozott fertilitási gén az említett Arabidopsis-gén [Aarts és munkatársai: lásd fent]. Tesztkeresztezéssel kapott utódok vizsgálata szerint a gének nem allélikusak.

Az alkalmazott növények

Három kukoricavonalat alkalmaztunk; valamennyi, kukoricagenetikával foglalkozó szakember számára széles körben hozzáférhető és szakember által általánosan alkalmazott vonal [azok leírását lásd, Chen és munkatársai: „Transposition of Ac from the P locus of maize intő unreplicated chromosomal sites”, Genetics 117, 109 (1987, szeptember)]. Ilyen vonalak hozzáférhetők például az alábbi forrásokból:

a fenti közlemény szerzőitől, a „Pioner Hi-Bred International, Inc.” cégtől; valamint számos, mindenki által hozzáférhető forrásból, például a „Maize Genetics Stock Cooperation Center” intézetből („University of Illinois”, Urbana/Champagne, „Department of Agronomy S-123 Tumer Hall”, 1102 „South Goodwin Avenue”, Urbana, Illinois, 61801).

HU 221 518 Bl

Az első alkalmazott vonal a W23P-w-vonal. A P-wallél az Ac jelű mobilis elem P-lokuszba történő inszerciója révén jött létre [Emerson R. „The inheritance of a recuiring somatic variation in varegated ears of maize”, Am. Nat 48, 87 (1914); Brink R. és Nilan R.: „The relation between light variegated árul médium variegated pericarp in maize”, Genetics 37, 519 (1952); valamint Barclay P. és Brink R.: „The relation between modulátor and Activator in maize” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 40, 1118 (1954)]. A P-gén a technika állása szerint alaposan jellemzett és részletesen leírt kukoricagén. A P-gén váltja ki kukoricában a perikarpium (magburok) pigmentációját. Ennek során flavanon phlobaphenessTh redukálódik, amely utóbbi hozza létre a perikarpium pigmentálódását. A P-gén részletes leírását tartalmazó, szakember számára hozzáférhető szakirodalmi helyek például a következők: Lechelt és munkatársai: „Isolating and molecular analysis of the maize P locus”, Mól. Gén. Génét. 219, 225 (1989); valamint Chen és munkatársai: ,Molecular Analysis of Ac transposition and DNA replication” Genetics. Ez a gén kiváló markergén, mivel a perikarpium színének szabályozásában és vörösen csíkozott perikarpium létrehozásában vesz részt. A vörös csíkozottság arra utal, hogy az Ac-transzpozon kihasítódott a P-génből, visszaállítva a gén működését, amely vörös perikarpium keletkezését eredményezi.

A P-gén (P-w) ugyanazon kromoszómán található, mint a korábbiakban térképezett, genetikai hímsterilitásért felelős gének, azaz az 1. kromoszómán. Kimutatták, hogy az Ac-transzpozon az esetek 67%-ában ugyanazon kromoszómán belül helyeződik át [Van Schaik N. V. és Brink R. A.: „Transpositions of modulátor, a component of the variegate pericarp alléié in maize”, Genetics 44, 725 (1959)]. Ebben az esetben azonban nem ez történt, hiszen az Ac-transzpozon a 9. kromoszómára került át A P-w-gén önmagában nagymértékben elősegíti a transzpozoncímkézést, mivel szemmel megfigyelhető, ha az Ac-transzpozon a P-génből transzpozíció révén kivált és a genomban máshová helyeződött át. A 4C063 jelű vonal egy,fehér” beltenyésztett vonal, amely a W23P-w-vonallal jól kombinálódik, a két vonal keresztezése könnyen értékelhető magokkal rendelkező, jó hibrid növényeket eredményez. A W22rsc:m3 jelű vonal a Ds-elemet tartalmazza az R-lokuszban. A növény az antocianin-reakcióútban szereplő valamennyi génre (Al, A2, Bzl, Bz2, Cl, C2, Pr, R) nézve domináns. Mivel a Ds-elem az R-gént működésképtelenné teszi, a magokban nem képződik antocianin (a növény színét adó festékanyag).

Ezt kapcsoltuk össze W22r-sc: m3 jelű törzsek alkalmazásával, amelyekben a Ds-elem az R-génbe integrálódott. A Ds-elem oly módon reagál az Ac-transzpozon jelenlétére, hogy a genomban máshová helyeződik át. A Ds-elem valójában egy defektív Ac-transzpozon. Az Ac-transzpozon önmagában képes egy génbe beépülni és onnan kiválni, míg a Ds-elem nem képes mobilizálódni, hacsak nincs jelen Ac-transzpozon valahol a genomban. Az R-gén a kukoricában alaposan tanulmányozott gén. Ismert, hogy az antocianin pigmentek szintéziséhez szükséges enzimeket kódol. Az R-gén részletes leírása, valamint a gén szekvenciájának ismertetése megtalálható például a következő szakirodalmi helyeken: Dellaporta és munkatársai: „Stadler Symposium” 18, 263 (1988); valamint Ludwig és munkatársai: „Le, a member of the maize R gene family responsible fór tissue-specific anthocyanin production, encodes a protein similar to transcriptional activators and contains the myc-homology region”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86. 7092 (1989, szeptember); a gén vizuális markerként történő alkalmazását ismertetik Bowen és munkatársai [,,R Genes as visual markersfor com transformation”, kivonat, szerk.: Gallagher, .Academic Press” (1989, október)], valamint Ludwig és munkatársai [,A regulatory gene as növel visible marker fór maize transformation”, Science 247, 449 (1990, január 26.)].

A W22-r-sc:m3-törzsben valamennyi, a mag antocianintartalmáért felelős gén domináns. A mag színe mégis sárga, mivel a Ds-elem megszakítja az R-gén működését. Ac-transzpozon jelenlétében azonban, a Ds-elem képes áthelyeződni, rózsaszínnel pöttyözött magok keletkezését eredményezve. A fenti rendszer alkalmazásával lehetségessé vált tehát: 1) vizuális úton meghatározni, hogy az Ac-transzpozon áthelyeződött-e a P-génből (pirosán csíkozott vagy teljesen vörös perikarpium megjelenése); 2) annak meghatározása, hogy az Ac-transzpozon még aktív-e (rózsaszín foltok* az aleuronban). Teljesen vörös magokra vagy az embrión vörös perikarpium-csíkozottsággal és egyidejűleg, az aleuronban rózsaszín pöttyözöttséggel rendelkező magokra történő szelekcióval nagymértékben dúsítható volt az olyan esetek aránya, ahol egy aktív Ac-transzpozon a genomban más helyre helyeződött át. Az ezekből a magokból keletkező növények öntermékenyítésével („selfing”, „self-fertilization’5, az utódcsaládok bármely, a címerfejlődést vagy portokfejlődést érintő mutációra nézve szűrhetők. Ebben az esetben, hímsteril növényekre történő szegregációs vizsgálat (hasadás) céljára állítottunk elő öntermékenyített családokat.

Koszegregációs analízis

Meghatározott gén címkézésére („tagging”) irányuló koszegregációs analízis és klónozás, szigorúan molekuláris megközelítési módok alkalmazásával, gyakran munka- és időigényes folyamat Az Ac-transzpozonrendszer azonban, igen alkalmas koszegregációs analízisre, szántóföldi növényekkel kapcsolatos genetikai vizsgálatok szintjén. Az R-génben (r-sc:ms3), aktív Ac-transzpozon és a Ds-elem közt létrejövő kölcsönhatás előnyösen kihasználható. Ac-transzpozont hordozó törzzsel keresztezett növényeket öntermékenyítettünk, tenyésztettünk, majd azonosítottuk azokat a családokat, amelyek szegregációja hímsteril növényeket eredményezett. Miután olyan családot sikerült azonosítanunk, amelynek szegregációja során hímsteril növények keletkeztek, további magokat ültettünk el, hogy az így előállított növényeket koszegregációs analízis céljából rsc: m3-törzzsel keresztezzük. Valamennyi növényt (fertilis és steril növényeket) r-sc:m3-törzzsel kereszteztünk, mindegyik csövön megfigyeltük a magok színének szegregációját, és azt összefiíggésbe hoztuk a növény hímfertilis vagy hímsteril sajátságával.

HU 221 518 Bl

Egy olyan családot találtunk, amelynél a növények többsége húnsterilnek bizonyult, a címeren csupán néhány rendellenes, kiálló, szétszórtan elhelyezkedő portok volt megfigyelhető. Az esetek többségében, ezekben a rendellenes portokokban nem volt pollen. Amikor a fenti családból származó valamennyi növényt rsc:m3-törzzsel kereszteztük, azt találtuk, hogy az Actranszpozon a hímsteril fenotípussal együtt szegregálódott, amint az az alábbi táblázatból látható.

1. táblázat

Az r:m3-törzzsel keresztezett trhn-90-40-törzs szegregációja

Növény fenotfpusa	Cső fenotípusa	Megfigyelés szerint az adott csoportba tartozó növények száma	Várakozás szerint az adott csoportba tartozó növények szám»
steril	valamennyi mag rózsaszínnel pöttyözött	8	8,25
fertilis	a magok fele rózsaszínnel pöttyözött, a magok másik fele nem pöttyözött	16	16,50
fertilis	egyik mag sem volt pöttyözött	9	8,25

A hímsteril növényeken mindig olyan csövek fejlődtek, amelyeken valamennyi mag rózsaszínnel pöttyözött volt A fertilis növények kétharmada olyan csövekkel rendelkezett, amelyeken a magok 50%-ban pöttyö- 25 zőtt, 50%-ban sárga magokká szegregálódtak. A fertilis növények egyharmadán olyan csövek fejlődtek, amelyeken valamennyi mag sárga volt. A fenti eredmények alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy az Actranszpozon egy, hímfertilitásért felelős génbe helyező- 30 dött át és annak működését megszakította. A gén recesszív jellegű, és homozigóta növényekben hímsterilitást eredményez. A fenti szegregációs vizsgálat eredményét további csiráztatási vizsgálatokkal megerősítettük. 35

Molekuláris analízis

Southem-analízist végeztünk, az Ac-transzpozon és a hímsterilitás közti kapcsolat megerősítése céljából.

A Southem-analízis szakember számára jól ismert technika. A fenti ismert eljárás szerint növényi DNS-t izolá- 40 lünk, azt restrikciós endonukleázokkal hasítjuk, a hasított DNS-t agarózgélen frakcionáljuk, majd nitrocellulóz membránokra visszük át, hogy a DNS-t molekulatömeg szerint szétválasszuk. Ezt követően a nitrocellulóz membránokat P32-izotóppal radioaktívan jelölt hibridi- 45 zációs próbafragmenssel hibridizáltattuk, majd SDS-oldatban mostuk [Southern E.: „Detection of a specific seqences among DNS-fragments by gél elektroforesis”,

J. Mól. Bioi. 98, 503 (1975)].

Keresztezéssel kapott steril utódokból és kereszté- 50 zéssel kapott fertilis utódból DNS-t izoláltunk, a rózsaszínnel pöttyözött magokból származó magoncokat a sárga magból származó magoncoktól elkülönítve tartva. Egy hónapos növények felső két leveléből DNS-t izoláltunk, Dellaporta és munkatársai által leírt urea- 55 eljárás alkalmazásával [„A plánt DNA minipreparation: version Π”, Plánt Mól. Bio. Rep. 1, 19 (1983)].

Az izolált DNS-t PvuII-enzimmel emésztettük, a restrikciós térkép szerint csupán az Ac-transzpozon jelenlétével kapcsolatos, 2,5 kb nagyságú fragmens kimu- 60 tatása céljából (1. ábra). Körülbelül 8 pg DNS-t emésztettünk a megfelelő enzimmel, a gyártó utasításai szerint (Promega). Az emésztett DNS-t 0,75%-os „Sea Kern GTG”-agarózgélen elektroforetizáltuk, kapillárisblot-eljárással „Duralon-UV” nejlonmembránra vittük át, majd 1 órán át, 85 °C-on végzett hőkezeléssel a membránra fixáltuk. A Southem-blot-analízisnél hibridizációs próbaként az Ac-transzpozonból származó, 1,6 kb HindlII-fragmenst alkalmaztuk.

Az eredményeket a 2. ábrán látható gélen mutatjuk be. A 2. ábrán, a 3-10 csíkok felelnek meg a hímsteril magoncoknak. A 2. csíkon heterozigóta, fertilis növényből származó DNS-t, az 1. csíkon vad típusú növényből származó DNS-t futtattunk. A gél szerint egy 2,5 kb fragmens látható valamennyi steril (rózsaszínnel pöttyözött magból származó) növény esetében, de ez a fragmens egyik fertilis (sárga magból származó) növény esetében sem figyelhető meg. Ez megerősíti azt, hogy az Ac-transzpozon a hímfertilitási lokusszal közeli kapcsolatban található vagy az említett lokuszba inszertálva található, gátolva a gén működését, és hímsteril fenotipust eredményezve.

Klónozás

Az Ac-transzpozon ismert szekvenciájának szomszédságában található DNS-t klónoztuk, és annak alapján a teljes gént meghatároztuk.

Összefoglalva, a hímfertilis növényből származó DNS-t és a hímsteril növényből származó DNS-t PstI, EagI, Sáli, SacI és Xbal restrikciós endonuklázokkal emésztettük, hogy egy, az Ac-transzpozonnal együtt vándorló esik helyét meghatározzuk. A fragmenseket elektroforetizáltuk, Southem-blot céljára membránra vittük át, majd az Ac-transzpozon HindlII-fragmensével hibridizáltattuk. Egy, 6 kb Pstl-fragmenst azonosítottunk, amely a hunsterilitásért felelős elemmel együtt szegregálódott. Az Ac-transzpozonnal kapcsolódó DNS izolálását Baker és munkatársai által ismertetett inverz PCR-eljárás szerint végeztük [Earp D. J., Lowe B. és Baker B.: „Amplification of genomic sequences

HU 221 518 Β1 flanking transposable elements in hőst and heterologous plamts: a tool fór transposon tagging and genomic and genomic characterisatíon”, Nucleic Acids Research 18, 3271 (1990)]

A 3. ábrán a jól ismert inverz polimeráz láncreakciós eljárás vázlatát láthatjuk. A 6 kb fragmens kinyerését kővetően, annak végeit újból ligáltuk. Az A és B jelű láncindító oligonukleotidok tervezése egyszerű volt, az Ac-transzpozon ismert szekvenciája alapján. Az 5’- és 3’-végi oligonukleotidokat azonosítottuk, és azok alkalmazásával, inverz PCR-technikával a közbülső szekvenciát amplifikáltuk. Az A és B jelű láncindító oligonukleotidokat az ismételten ligáit, kör alakú DNS, Ac-transzpozont közrefogó két vége felől növeltük. Ezáltal, az Ac-transzpozon két vége által közrefogott DNS-t amplifikáltuk, és egy 1,3 kb nagyságú DNSszegmenst izoláltunk. Az ismert, 4,8 kb Ac-fragmens, valamint az amplifikált, 1,3 kb IPCR-termék együttes mérete csaknem megegyezett a korábbiakban izolált, 6,0 kb Pstl-fiagmens méretével.

A fent összefoglalt eljárást az alábbiakban részletesen ismertetjük. Genomi DNS-t izoláltunk, a fenti ismertetettek szerint. Húsz (20) pg DNS-t 20 egység Pstlenzimmel emésztettünk, a gyártó utasításai szerint (Promega). Az emésztett DNS-t preparatív fésű alkalmazásával, a fentiek szerint elektroforetizáltuk. Egy, körülbelül 5,5-6,5 kb közti molekulatömegnek megfelelő DNS-eket tartalmazó gélfragmenst a gélből kivágtunk. A DNS-t az agarózból, 0,4 ml steril vizet tartalmazó „Spectra/Por membráné #2, MWCO 12-14 000” (Spectrum Medical Industries, Inc.) alkalmazásával, és 1 xTris-acetát-pufferrel (TAE) (pH=8,0) szemben végzett elektroforetizálással elektroeluáltuk. Az izolált DNS-t fenol és kloroform, Tris-pufferrel (pH=7,0) ekvilibrált elegyével (1:1), majd kloroformmal extraháltuk, végül etanollal precipitáltuk, szárítottuk, és steril vízben szuszpendáltuk. A ligálásokat a gyártó utasításai szerint végeztük (Betbesda Research Laboratories), a Pstl-enzimmel emésztett, genomi eredetű DNS-t 20 ng/μΐ végkoncentrációban alkalmazva. A ligálásokat 18 órán át, 14 °C-on végeztük.

Láncindító oligonukleotidokat .Applied Biosystems model 394 DNA/RNA synthesizer” DNS/RNSszintetizáló készülék alkalmazásával állítottunk elő. A B5 jelű láncinditó oligonukleotid lényegében megegyezett az Earp és munkatársai által leírt oligonukleotiddal (lásd, fent), azzal az eltéréssel, hogy annak 5’végén, egy további EcoRI-helyet hoztunk létre, és a 3’végéhez pedig még két bázist adtunk. Az Ac inverz PCR-reakcióban alkalmazott két láncindító oligonukleotid szekvenciája a következő volt:

A5: 5’-GATAGAATTCGGTACGGGATTTTCCCATCCTACTT-3’

B5: 5’-GGTAGAATTCGTTTTCGTTTCCGTCCCGCAAGTT-3’.

A PCR-reakciót 25 ng, cirkularizált (kör alakúvá alakított) genomi eredetű templát-DNS alkalmazásával végeztük, a reakcióelegy a gyártó által mellékelt 1 xreakciópufferben a következőket tartalmazta: az egyes láncinditó oligonukleotidokat, 2 pmol/l koncentrációban; az egyes dNTP-ket, 0,24 pmol/l koncentrációban; valamint 3 egység „Hot Tub” polimerázt (Amersham). Az amplifikációt ,JvfJ Research Inc. model PCT-100-96” típusú termociklusos készülékben végeztük, Earp és munkatársai által leírt körülményekkel megegyező körülmények alkalmazása mellett (lásd fent). A reakció termékeit 1%-os LMP (,4ow melting point”, alacsony olvadásponté) agarózgélen elektroforetizáltuk (Bethesda Research Laboratories). Az amplifikáció termékét a gélből „Magic PCR”-reagenskészlet (Promega) alkalmazásával izoláltuk, és az amplifikációt a fentivel megegyező körülmények alkalmazása mellett megismételtük.

cDNS izolálása cDNS-génkönyvtárak szűrésére alkalmazható módszerek szakember számára jól ismertek; ilyen eljárásokat ismertetnek például Maniatis T. és munkatársai („Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, „Cold Spring Harbor Laboratory”, „Cold Spring Harbor”, New York). Génkönyvtárakat az alábbiak szerint állítottunk elő. Z. zways-címerekből RNS-t izoláltunk, guanidin-tiocianát-eljárás alkalmazásával, majd cézium-klorid-gradiensben a megfelelő réteg szétválasztásával. Poli(A)-RNS-t oligo(dT)-cellulóz-oszlop alkalmazásával nyertünk. Két cDNS-génkönyvtárat állítottunk elő,. pCDNAII-vektorban (Invitrogen), valamint Uni-ZapXR-vektorban (Stratagene), 5-5 pg mRNS felhasználásával, a gyártó utasításai szerint eljárva.

Az inverz PCR-reakció 1,3 kb nagyságú termékét hibridizációs próbaként használtuk, körülbelül l(M)0; sorba rendezett kiónt tartalmazó, címereredetű cDNSgénkönyvtár szűrésére, és abból egyetlen homológ, körülbelül 1,4 kb méretű inszertet tartalmazó kiónt nyertünk. Az inszert 1550 bázispárból állt; azt a 4. ábrán grafikusan ábrázoltuk. A genomi eredetű rész, természetesen attól a növényi háttértől függően változik, amelyből azt izoláltuk, és abban az intronok jelen lehetnek, vagy azok hiányozhatnak is. A fenti módszerrel kimutatható azonban, hogy az Ac-elem hogy jelenik meg az adott izolátumban.

Az 1,4 kb fragmenst a PvuII-enzimmel emésztett DNS-t tartalmazó szegregációs membránnal hibridizáltattuk, annak bizonyítása céljából, hogy az inverz PCRtermék alkalmazásával kimutatott 3,4 kb koszegregálódó csík új genomi eredetű régió, és nem a fragmens végein található, kis Ac-DNS-részleteknek felel meg. Az eredményeket az 5. ábrán mutattuk be. Amint az látható, a génkönyvtárból származó 1,4 kb fragmens ugyanazzal a 3,4 kb ffagmenssel hibridizálódott, amely steril növényekben a hímsteril fenotípus kialakulásával, fertilis heterozigóták esetén pedig rózsaszínnel pöttyözött magvú növények megjelenésével koszegregálódott.

Ezt követően az 1,4 kb fragmenst egy második, címereredetű cDNS-génkönyvtár szűrésére alkalmaztuk, és teljes hosszúságú cDNS-t nyertünk, amelyet MS45nek neveztünk.

Northem-analízis

Steril és fertilis növények címeréből, csövéből és leveleiből az előbbiekben ismertetettek szerint szöveteket izoláltunk, és az extraktumokat Northem-blot-analí7

HU 221 518 Bl zisnek vetettük alá. A Northem-blot-analízis szakember számára ugyancsak jól ismert technika, amely hasonlít a Southem-analízishez, azzal az eltéréssel, hogy RNS-t izolálunk, és futtatunk agarózgélen. Ezt követően az RNS-t jelölt próbával hibridizáltatjuk [Potter E. és munkatársai: „Thyrotropin releasing hormoné exerts rapid nuclear effects to increase production of the primary prolactin mRNA transcript”, Proc. Nad. Acad. Sci. USA 78, 6662 (1981); Lechelt és munkatársai: (lásd fent)]. Össz-RNS-t izoláltunk 1) körülbelül 2 hónapos növények leveleiből; 2) körülbelül középvakuolás stádiumban levő címerekből; valamint 3) 4,5-5,0 cm hosszú, éretlen csövekből. A szöveteket folyékony nitrogénben roncsoltuk, detergenssel extraháltuk, majd differenciáló LiCl-precipitációt, végül etanolprecipitációt végeztünk. A gélt, a fent ismertetettek szerint izolált MS45-cDNS-sel hibridizáltattuk. Amint az a 6. ábrán látható, a cDNS csak a fertilis címerekből származó DNS-ekkel hibridizálódott.

Revertánsok

Annak további bizonyítása céljából, hogy az általunk izolált gén kulcsfontosságú szerepet játszik a hímfertilitás szempontjából, revertánsokat azonosítottunk. Mivel normális esetben, nem lehet a fertilis növényeket megkülönböztetni a revertánsoktól, olyan növényeket választottunk, amelyek sterilnek látszottak, de valamennyi pollent hullattak. Ezeket kereszteztük hímivarú szülőkként más vonalakkal; ez a keresztezés nem eredményezett hímsteril növényeket. Az MS45-cDNS-t kinyertük, és analizáltuk; azt találtuk, hogy az Actranszpozon a génből kiválva, hat visszamaradt bázispár formájában hátrahagyta nyomát, a szekvencia eredeti leolvasási fázisának megtartása mellett. A 7. ábra szerint ez két aminosav hozzáadását eredményezte a szekvenciához, de a leolvasási fázis nem csúszott el.

RFLP-térképezés

Az IPCR-fragmens pozícióját, egy B73 xMoll7 F2populációban, RFLP-térképezéssel meghatároztuk. A térképezés szerint az a 9L-kromoszómán található, a és a Burr 7,21 próbák pozíciója között [lásd, Maize Genetetics Cooperation Newsletter 67, 165 (1990, március 15.)], amint azt a 8. ábrán ábrázoltuk.

Szekvenálás

Az MS45-klón szekvenálását Sanger és munkatársai által leírt, didezoxi-láncterminációs eljárással végeztük [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)].

Az MS45-DNS vonatkozásában nyilvánvaló, hogy azon az alábbiakban ismertetett DNS-szekvenciával rendelkező DNS-szekvenciát értünk, amely ugyancsak az alábbiakban leírt aminosavszekvencia keletkezését eredményezi. Szakember számára világos, hogy adott aminosavat több, hárombetűs kódon kódolhat.

Eljárások hímfertilitás szabályozására,

MS45-DNS alkalmazásával

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti DNS számos különböző eljárásban alkalmazható növényekben hímfertilitás szabályozására. Az alábbiakat csupán ilyen lehetséges eljárások szemléltetése céljából közöljük, anélkül, hogy a találmány szerinti DNS-molekulák alkalmazási lehetőségeit, vagy a találmány tárgykörét az alábbiakra korlátoznánk.

Miután olyan DNS-molekulát sikerült azonosítanunk, amely növényekben kulcsfontosságú a hímfertilitás fenntartása szempontjából, előállíthatunk az adott DNS-szekvencia normális, 5'-3'-orientációjához képest fordított (inverz) orientációval rendelkező szekvenciákat. A fenti antiszensz molekulák - növényekbe történő bejuttatásukat követően - megakadályozzák a hímfertilitás fenntartásában részt vevő szekvencia normális expresszálódását. Feltételezzük, hogy az antiszensz DNS átíródása során olyan RNS-molekula keletkezik, amely a hímfertilitási gén által termelt mRNS-sel komplementer, és azzal hibridizálódni képes, ezáltal megakadályozza annak transzlációját. Az mRNS által kódolt protein nem termelődik, és nem tudja szerepét betölteni a hímfertilitás fenntartásában. A találmány szerinti hímfertilitási gén alkalmazásával, az MS45-DNS-t tartalmazó növénybe olyan konstrukciót juttatunk amely konstrukció transzkripciós promoterszegmenst, transzkripciós terminátorszegmenst, valamint az MS45-DNS ribonukleotidszekvenciájával komplementer ribonukleotidszekvencia keletkezését eredményező DNS-szegmenst tartalmaz.

Antiszensz szekvenciák alkalmazása adott gén expressziójának gátlására vagy szabályozására szakember számára jól ismert; ilyen eljárást ismertetnek például Inouye és munkatársai [5 190 931 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1993, március 2.)]. A fenti leírásban, a feltalálók többek között olyan megoldást ismertetnek, amely szerint a DNS-t restrikciós endonukleázokkal hasítják, majd olyan visszazárt plazmidot nyernek, amelyben két restrikciós hely közti fragmens hiányzik, és amelybe más DNS-fragmens inszertálható. A normális DNS-t emésztjük, tisztítjuk és egy fragmenst fordított orientációban inszertálunk. Ilyen konstrukciók alkalmazásával, baktériumokban gátolták a Ipp-, OmpAés OmpC-gének expresszálódását, és elérték az SPcolifág fejlődésének szabályozását. Az OmpA-RNS 5’végi vezetőrégiójával komplementer, de a ShineDalgarno-féle szekvenciát nem tartalmazó antiszensz RNS kevésbé volt hatékony, mint a riboszómakötőhelyet és kezdőkodont átfedő transzkriptum. Az antiszensz szabályozás átfogó áttekintése található az alábbi szakirodalmi helyen: Jean-Jacques Toulme: „Specific regulation of gene expression by antisense, sense and antigéné nucleic acids”, (összefoglaló), Biochemica et Biophysica Acta, 99-125 (1990).

Az antiszensz megközelítési mód és antiszensz molekulák génműködés gátlására vagy szabályozására történő alkalmazásának további példája szerint antiszensz konstrukciókat a portokban a flavonoidbioszintézis enzimjeit kódoló gének gátlására alkalmaztak, hímsterilitás előidézése céljából [Vander Meer és munkatársai: .Antisense inhibition of flavonoid biosynthesis in petúnia anthers results in male sterility”, The Plánt Cell 4, 253 (1992, március)]. Portokokban expresszálódó további génekkel homológiát mutató szekvenciákkal rendelkező antiszensz chalcon (benzal-acetofenon) szinté8

HU 221 518 Β1 zis gének, valamint CaMV355-promoter alkalmazása hímsteril, fehér pollen keletkezéséhez vezet. Látható, hogy a génexpresszió szabályozása antiszensz molekulák alkalmazásával, jól ismert. [Lásd továbbá, Bourque June E. és Főik William R.: „Supression of gene expression in plánt cells utilizing antisense sequences transcribed by RNA polymerase II”, Plánt Molecular Biology 19, 641 (1992); Weintrab és munkatársai; Trends Gén. 1, 22 (1985)].

A génexpresszió szabályozását elérhetjük továbbá a transzkripciós aktivátorok módosításával. A génexpresszió során, a kettős szálú DNS megfelelő, egyszálú hírvivő RNS-sé (mRNS-sé) íródik át. A szensz szál elválik annak antiszensz partnerétől, és enzimek működése által, az antiszensz szálon található szekvenciával komplementer RNS-molekula jön létre. Az mRNS riboszómákhoz vándorol, amelyek a kódolt információt leolvassák, hogy a megfelelő aminosavak beépítése megtörténhessen.

Eukarióta gének transzkripcióját különböző elemek befolyásolják, például transzkripciós szabályozóproteinek, amelyek szekvenciaspecifikus módon kötődnek a DNS-hez. Ezeket a transzkripciós aktivátorokat úgy módosíthatjuk, hogy azok kötődjenek a DNS-hez, de normális aktivátor funkciójukat ne legyenek képesek betölteni. A transzkripciós aktivátorok két doménból állnak, a kötő doménból és az aktiváló doménból. Egy adott gén transzkripciós aktivátor proteinjei aminosavszekvenciájának megváltoztatásával, az azt kódoló DNS-szekvencia előállításával és a fenti DNS növénybe történő bejuttatásával, a célzott gén expresszálódását megakadályozhatjuk. [Lásd, Goff S. A. és munkatársai: „Transactivation of the Anthocyanin pathway structural genes with wild-type and altered cl proteins”, Maize Genetics Cooperation Newsletter 64 6 (1990, március).]

A fenti eljárás egy további változata szerint domináns, negatív mutáns proteineket kódoló génszupresszor elemeket vagy gátló, antiszensz RNS-t izolálunk, véletlenszerű DNS-fragmentálással, és a célzott gén szuppressziójával kapcsolatos fenotípusra történő funkcionális szelekcióval. Ilyen eljárást ismertetnek Holzmayer és munkatársai [,.Isolation of dominant negative mutants and inhibitory antisense RNA sequences by expression selection of random DNA fragments”, Nucleic Acids Research 20/4, 711 (1991, december 3.)]. A fenti közlemény szerzői lambda-bakteriofág-DNS-t fragmentáltak véletlenszerűen, hogy E. coli sejtek lambdafág által kiváltott lizálódását megakadályozzák. Több, proteint vagy antiszensz RNS-fragmenseket kódoló génszupresszor elemet izoláltak.

Megfigyelték a normális génexpresszió gátlásának jelenségét is, amely szerint egy endogén gén további expresszálódásáról vagy túlzottan nagymértékű expresszálódásáról mutatták ki, hogy az génszupresszor hatású. Ez az úgynevezett „szensz” gátlás amelyet esetenként „koszuppressziónak” is neveznek -, a szakirodalomban jól ismert. [Lásd például, Brussian és munkatársai: „An Arabidopsis mutant with reduced level of cab 140 RNA is a result of cosupression” The Plánt Cell 5, 667 (1993, június);

Vander Krol és munkatársai: „Flavonoid genes in

Petúnia: addition of a limited member of gene capus may lead to supression of gene expression” The Plánt

Cell 2, 291 (1990, április)].

Negatív szabályozást érhetünk el továbbá, a géntranszkripció represszálásával. Ilyen rendszerekben olyan faktorokat alkalmazunk, amelyek tartalmazzák a transzkripciós aktivátor DNS-kötő doménját, de amelyekből a működőképes aktiváló dómén hiányzik; ezek egyazon helyekért versengenek az aktivátorokkal, ezáltal gátolják az aktivációt. Más faktorok heterodimereket képeznek az aktivátorokkal, csökkentve azok DNSkötő affinitását vagy transzkripciót aktiváló képességét. További represszorok akkor lépnek kölcsönhatásba az aktivátor faktorokkal, amikor azok már DNS-hez kötődtek, és gátolják azok transzaktiváló funkcióját, A negatív szabályozók további csoportjába olyan gátló proteinek tartoznak, amelyek az aktivátorral zárt komplexet képeznek, ezáltal az nem képes DNS-hez kötődni. [Lásd, Jackson Μ. E.: J. Cell Sci. 100, 1 (1991); Jones N.: Curr. Bioi. 1, 224 (1991); Mitchell P. J. és Tjian R.: Science 245, 371 (1989).]

Magában, az endogén génben létrejövő közvetlen mutáció szintén hímsterilitási génné változtathatja a hímfertilitási gént. A besugárzás a kromoszómák törését és átrendeződését, valamint az egyes gének összetételének módosulását eredményezheti. A röntgenbesugárzással létrehozott génmutáció régóta alkalmazott eljárás. [Lásd például, Stadler L. J.: „On the genetic natúré of induced mutations in plants”, (utánnyomás), „Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics” 1, 274 (1932).] További technikák szerint kémiai mutagéneket alkalmazhatunk, például etil-metánszulfonátot és N-metil-N-nitro-N-nitrozo-guanidint, amint azt Neuffer M. G., valamint Coe Jr., Ε. H. alkalmazták pollenszemcsék kezelésére, egykori munkájuk során [„Paraffin oil technique fór treating mature com pollen with Chemical mutagens”, Maydica ΧΧΙΠ, 21-28. oldal, (1978)] lásd továbbá: Thurling N. & Depittayanan: ,JEMS induction of early flowering mutants in spring Rape” (Brassica napus) ”, Plánt Breeding 108,177 (1992). További eljárás szerint nátrium-azidos kezelést alkalmazunk [Rao Β.: ,Λ case of genic male sterility induced by sodium azide in Pearl Millet”, Bioi. Zentralbl. 104, 579 (1985); Conger Β. V. és Carabia J. V.: „Mutagenic effectiveness and efficiency of sodium azide versus ethyl methansulfonate in maize: induction of somatic mutations at the yg₂ locus by treatment of seeds differing in metabolic State and cell population”, Mutation Research 46, 285 (1977), vagy gammasugárral történő kezelést alkalmazunk [Filippetti A. és DePace C.: .Jmprovement of seed yield in Vica falsa L. by using experimental mutagenesis II comparisons of gamma radiation and ethyl-methansulfonate (EMS) in production of morphological mutants” Euphytica 35,49 (1986)].

Szakember számára nyilvánvaló tehát, hogy egy himsterilitási gén azonosítását követően különböző eljárásokban alkalmazható növényekben hímfertilitás köz9

HU 221 518 Bl vetítésére. A továbbiakban csupán néhány olyan eljárást ismertetünk a szemléltetés kedvéért, amelyekben az új himfertilitási gének alkalmazhatók. Ezenfelül, az alábbiakban egy általunk kidolgozott új eljárást is ismertetünk.

Konstitutív hímsterilitást létrehozó eljárások

A találmány szerinti megoldás abban tér el a növénynemesítés és vetőmagtermelés során hímsterilitás létrehozására irányuló ismert megközelítési módoktól, hogy indukálható promotert alkalmazunk egy olyan gén expressziójának szabályozására, amelyről ismert, hogy a növény hímfertilitásának fenntartása szempontjából kulcsfontosságú. A találmány gyakorlati megvalósítása során, először olyan gént kell találnunk, amely fertilitás szempontjából lényeges. Ilyen típusú DNSmolekulák például a fent említett MS45 jelű DNSmolekulák.

A kiválasztott gént klónozzuk, annak natív promoterét működésképtelenné tesszük, és a módosított gént, külső szabályozás alatt álló, indukálható promoterrel együtt, expressziós szekvenciába inszertáljuk. Előnyösen, a növény egy meghatározott, nem fitotoxikus vegyülettel történő kezelésére reagáló promotert alkalmazunk.

Transzformáció és génszubsztítúció alkalmazásával, a növény genomjában található gént inaktiváljuk, és azt az expressziós szekvenciába beépített, géntechnikai eljárással módosított, indukálható promoterrel rendelkező génnel helyettesítjük.

A találmány szerinti megoldás abban egyedülálló, hogy az eljárás szerint az indukálható promotert fertilitás kiváltására alkalmazzuk, és nem sterilitás előidézésére. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a kiválasztott gén promoterszekvenciáit eltávolítjuk, úgy, hogy a gén nem képes átíródni, és a növény hímsterillé válik. Ha a hímsteril növényt szaporítani kívánjuk, a hímfertilitást a kérdéses gén expressziójának indukálásával helyreállítjuk. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint ezt úgy érjük el, hogy a növekvő hímsteril növényt meghatározott, nem fitotoxikus vegyülettel kezeljük.

Az indukálható promoter vegyszeres kezeléssel történő indukálása különböző, magával a vegyszeres kezeléssel, valamint a kezelés idején fennálló különböző környezeti feltételekkel kapcsolatos faktoroktól függ. Amennyiben a kérdéses gén normális esetben „bekapcsolt” állapotban van, annak vegyszeres kezeléssel történő inaktiválása - a kezelés sikertelensége esetén önmegporzáshoz és hibrid helyett beltenyésztett magok előállításához és eladásához vezetne. A hibridmagok kereskedelmét szabályozó törvények a magok nagyfokú tisztaságát követelik meg, tehát a szabványban megadott leírásának nem megfelelő hibridmagok százalékos arányát nagyon alacsonyan kell tartanunk. Mivel egyetlen kukoricanövény több mint hatmillió pollenszemcsét képes termelni, a kezelés legkisebb sikertelensége is nagy százalékban előforduló önmegporzást eredményezhet. Ezért a találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítása úgy történik, hogy a gén normális esetben „kikapcsolt” állapotban van, és a megfelelő jelleg nem expresszálódik, tehát normális körülmények mellett önmegporzás nem fordulhat elő. Ezenfelül, mivel a kérdéses gén normális esetben „kikapcsolt” állapotban van, hibridmagok nagy mennyiségben történő előállítása során nincs szükség vegyszeres kezelésre, úgy, hogy a vegyszer alkalmazási köre (és az azzal kapcsolatos költségek) minimalizálhatók, és a kezelés sikertelenségének kockázatával csak a szülői magok gondosan szabályozott, korlátozott mennyiségben történő előállítása során kell számolnunk, amikor önmegporzást kívánunk elérni. Mivel ilyen esetekben, a kezelés sikertelensége a pollen kisebb mennyiségben történő termelődését eredményezi, és mivel a pollen normális esetben feleslegben termelődik, a találmány szerinti eljárás szülői magok előállítására történő alkalmazása során, a kezelés eredménye 70-80%-os sikertelenség estén is a tűréshatáron belül marad, és minimális hatással van a szülői magok hozamára.

Általánosságban, a találmány szerinti megoldással összhangban, a találmány szerinti DNS-molekulát megfelelő, indukálható promoterrel együtt a növénybe juttatjuk. Az így kapott növény steril lesz, mivel a DNSmolekula nem expresszálódik; ha azonban a promotert indukáljuk, a növény fertilissé válik. A DNS-molekulaterméket termelő natív gén egy eredetileg fertilis növényből származik, amit az alábbiakban ismertetett eljárások valamelyikének alkalmazásával inaktiválhatunk, például visszakeresztezéssel vagy homológ rekombinációval.

Indukálható promoterek

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint egy, a hímfertílitásért felelős, klónozott gén promoterrégióját eltávolítjuk, és azt meghatározott külső stimulusra reagáló promoterrel helyettesítjük. A gén tehát nem íródik át, kivéve, ha azt a külső stimulus hatásának tesszük ki. Amíg a gén nem íródik át, annak génterméke - amelynek jelenlétére szükség van a pollenfejlődés végbemeneteléhez - nem termelődik. Ez a pollenfejlődés során lezajló biokémiai/fiziológiai folyamatokban szereplő reakcióutak egyikének vagy azok közül többnek a megszakadását okozza, ezáltal hímsterilitást eredményez. A növény csak meghatározott, a kiválasztott promotert aktiváló stimulus hatására válik fertilissé.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint alkalmazható válaszképes promoterrendszer például kukoricában a glutation-S-transzferáz- (GST-) rendszer. A GST-k olyan enzimcsaládot képeznek, amelynek tagjai számos hidrofób elektrofil vegyület detoxikálására képesek, és amelyeket gyakran herbicidekkel történő kezelést megelőzően, előkezelésre alkalmazunk [Wiegand és munkatársai: „Messenger RNA Encoding a Glutathione-S-Transferase Responsible fór Herbicide Tolerance in Maize is Induced in Response to Safener Treatment”, Plánt Molecular Biology 7, 235 (1986)]. Kimutatták, hogy kukoricamagok GST-kkel történő kezelése fokozza a kukorica herbicidekkel szemben mutatott toleranciáját. Vizsgálatok szerint a GST-k közvetlen szerepet játszanak a tolerancia fokozásában. Ez a hatás elsősorban egy meghatározott, 1,1 kb

HU 221 518 BI nagyságú mRNS transzkripciós termék közvetítésével jön létre. Röviden, a kukoricában található egy, a természetben előforduló „csendes” gén, amely GST-kkel szemben válaszkészséget mutat, és amely indukálása géntermék keletkezését eredményezi. Ezt a gént azonosították és klónozták. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint tehát, a GST-válaszkészséget mutató gén promoteiét eltávolítjuk, és azt a himfertilitásért felelős génhez kapcsoljuk, amelynek natív promoterét előzőleg eltávolítottuk. Ez a géntechnológiai úton módosított gén, egy, külső kémiai stimulusra reagáló promoter és egy, fertilis pollen sikeres képződéséért felelős gén kombinációja.

A gének bejuttatása

A technika állása szerint klónozott DNS kukoricába történő bejuttatására több ismert eljárás alkalmazható. Ilyen eljárások például a következők: kukorícaprotoplasztok DNS-felvételének elektroporációval történő elősegítése [Rhodes és munkatársai: „Genetically Transformed Maize Plants from Protoplasts”, Science 240, (1988, április 8.)]; kukorica-protoplasztok polietilénglikollal történő kezelése [Lyznik és munkatársai: „Stabilé Co-Transformation of Maize Protoplasts with Gus A and Neo Genes”, Plánt Molecular Biology 13, 151 (1989)]; valamint kukoricasejtek bombázása DNSsel töltött mikrolövedékekkel [Klein és munkatársai: „Genetic Transformation of Maize Cells by Partiele Bombanfanent”, Plánt Physiol. 91, 440 (1989); valamint Klein és munkatársai: „Factors Influencing Gene Delivery intő Zea Mays Cells By High-Velocity Microprojectiles”, Bio/Technology 6, (1988, május 6.)].

Valamennyi fenti technikának vannak előnyei és hátrányai. Valamennyi eljárás szerint plazmid-DNS-t géntechnológiai eljárással úgy módosítunk, hogy az ne csupán a kérdéses gént tartalmazza, hanem szelekciót és szűrést lehetővé tevő markergéneket is tartalmazzon. A szelekciót lehetővé tevő markergéneket olyan sejtek szelektálására alkalmazzuk, amelyekbe a plazmid példányai beépültek (a konstrukció felépítése olyan, hogy az adott gént, valamint a szelektálható és szülhető géneket egy egységként juttatjuk be). A szűrést lehetővé tevő gén további ellenőrzési lehetőséget teremt, csupán a kívánt géneket hordozó sejtek sikeres tenyésztéséhez. Általánosan alkalmazott, szelekciót lehetővé tevő markergén a neomycin-foszfotranszferáz II gén (NPT II). Ez a gén rezisztenciát hoz létre kanamycinnel szemben, amely vegyület közvetlenül a táptalajhoz adható, amelyen a sejteket tenyésztjük. A növényi sejtek általában érzékenyek kanamycinre, az tehát elpusztítja őket. Az ΝΡΤΠ-gén jelenléte ellensúlyozza a kanamycin hatását, és a kérdéses gént tartalmazó sejtek életben maradnak. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint szelekciót lehetővé tevő markergénként alkalmazhatjuk a glufosinate herbiciddel (Basta) szemben rezisztenciát létrehozó gént Szűrést lehetővé tevő génként általánosan alkalmazott gén a β-glukuronidáz (GUS) gén. Ennek a génnek a jelenléte olyan hisztokémiai reakció alkalmazásával mutatható ki, amely szerint feltételezetten transzformált sejtekből álló mintát GUS vizsgálati reagens oldattal kezelünk. Megfelelő inkubációs időt követően a GUS-gént tartalmazó sejtek kék színűvé válnak Szűrést lehetővé tevő további gén az antocianin-bioszintézis transzkripciós aktívátora, amelyet Bowen és munkatársai [,,R genes as visual markers fór com transformation”, (kivonat), szerk.: Gallagher, Academic Press, (1989, október)], valamint Ludwig és munkatársai [,Λ regulatory gene as növel visible marker fór maize transformation, Science 247, 449 (1990, január 26.)] írtak le. Ez a gén az antocianin nevű pigment termelődését eredményezi. A fenti gént tartalmazó plazmiddal transzformált sejtek vörös színűvé válnak. Előnyösen, a plazmid szelekciót és szűrést lehetővé tevő markergéneket is tartalmaz.

A fenti gének egyikét vagy azok közül többet tartalmazó plazmidot kukorica-protoplasztokba vagy hegszövet (kallusz)-sejtekbe juttatjuk, a fent említett technikák valamelyikének alkalmazásával. Amennyiben a markergén-szelekciót lehetővé tevő gén, a megfelelő, fítotoxikus hatóanyaggal végzett szelekció mellett csak azok a sejtek maradnak életben, amelyekbe a bejuttatott DNS beépült. Miután a megfelelő sejteket azonosítottuk és felszaporítottuk, a növényeket regeneráljuk. A transzformált növények utódait tesztelnünk kell arra nézve, hogy a bejuttatott DNS sikeresen beépült-e a növény genomjába.

A natív gén inaktiválása

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a natív gén számos különböző ismert eljárással inaktiválható. Szakember számára jól ismert ilyen eljárás a homológ rekombinációs eljárás, amellyel natív gén működésképtelenné tehető. Amennyiben tehát a géntechnológiai eljárással módosított gént homológ rekombinációval a növénybe juttatjuk, a natív gén működésképtelenné válik. A fenti módszer alapos áttekintését találjuk a következő szakirodalmi helyen: Yoder J. I. és Kmic Eric: „Progress Toward Gene Targeting in Plants”, „Genetic Engineering, 13, Plenum Press, New York, (1991). A fenti szakirodalmi hivatkozás 265. oldalán a szerzők azt írják: „a célzott génhelyettesítés alkalmazható endogén gének „néma” (nem működő) génekké történő alakítására vagy géntechnológiai eljárással módosított alléllel történő helyettesítésére; úgy, hogy a módosított gén által meghatározott vagy annak szabályozó szekvenciái által közvetített fenotípus in planta értékelhető legyen”. Megemlítendő, hogy a genetikai rekombináció DNS-szálak törése és újraegyesítése révén jön létre, és újraegyesitési mechanizmus párosítja össze a komplementer DNS-szekvenciákat (lásd fent).

Növényekben végbemenő intrakromoszomális homológ rekombináció további példáját ismertetik Peterhans A, Schlupmann H., Basse C. és Paszkowski J. [„Intrachromosomal Recombination in Plants”, The EMBO Journal 9/11, 3437 (1990)].

A fenti, meghatározott példákon felül különböző eljárások állnak szakember rendelkezésére. További ilyen eljárás a visszakeresztezés, általánosan elfogadott növénynemesítési technikák alkalmazásával, amely során a natív gént gyakorlatilag „deletáljuk”. A visszakeresztezést gyakran alkalmazzák növénynemesités so11

HU 221 518 Bl rán, hogy egy beltenyésztett törzsből vagy más forrásból meghatározott, előnyös tulajdonságot juttassunk egy, az adott sajátsággal nem rendelkező beltenyésztett vonalba. Ezt elérhetjük például úgy, hogy a több előnyös tulajdonsággal rendelkező („superior”) belte- 5 nyésztett törzset (A) (rekurrens szülő) donor beltenyésztett törzzsel (nem rekurrens törzzsel) keresztezzük, amely utóbbi hordozza a kérdéses tulajdonságért felelős gént (géneket). A fenti keresztezésből származó utódokat ezután visszakeresztezzük a rekurrens szülő- 10 vei (A), majd a kapott utódokat a nem rekurrens szülőből átvinni kívánt előnyös tulajdonságra nézve szelektáljuk. öt, vagy ennél is több visszakeresztezéssel kapott, a kívánt tulajdonságra nézve szelektált generáció előállítását követően az utódok az átvinni szándékozott 15 sajátságot meghatározó lokuszokra nézve heterozigóták lesznek, de valamennyi egyéb vagy csaknem valamennyi egyéb génre nézve, a több előnyös tulajdonsággal rendelkező (rekurrens) szülőhöz hasonlítanak. Az utoljára kapott visszakeresztezett generációt 20 öntermékenyítjük, hogy az átvinni szándékozott génre (génekre) nézve tiszta, tenyésztésre alkalmas utódokat kapjunk. Valamennyi visszakeresztezési módszer azt eredményezi, hogy a „natív” gént a kívánt génnel helyettesítjük. 25

Egy, a maga nemében egyedi eljárást ismertettek a „Science” magazinban, 1991-ben, amelyben a korábbiakban leírt, úgynevezett „transzgenikus ollók” alkalmazására utalnak. A fenti közleményben leírt eljárás szerint növényben a kívánt tulajdonságért felelős gén- 30 hez kapcsolt markergén eltávolítható. Az említett eljárásban az „ollók” szerepét egy, a „Cre” néven ismert bakteriális vírusból izolált enzim tölti be, amely rövidítés a rekombináció szabályozására utal („contioll of recombination”). [Science, 1457. oldal (1991, decem- 35 bér 6.)]. Az enzim bármely DNS-fragmens kihasítására képes, amely a 34 bázisból álló, úgynevezett „lox” („locus fór Crossing over”) szekvenciapár között helyezkedik el. Ezt az eljárást ismerteti részletesebben a „DuPont” cég által bejelentett közzétételi irat (WO 40 91/09957).

A növények sterilitásra történő szelekciója és a fertilitás helyreállítása

Miután a gént növénybe juttattuk, a megfelelő növénytípusokat, azaz a hímsteril növényeket kiválaszt- 45 juk. Ezek a növények azért hímsterilek, mert azokban az izolált és klónozott hímfertilitási gén saját promotere hiányzik, és az említett gén által kódolt, a sikeres pollenképződés szempontjából kulcsfontosságú géntennék nem termelődik. Ezáltal, a géntechnológiai eljárással 50 módosított gén az adott gén recesszív mutáns almijaként működik. Az ismert növény-biotechnológiai eljárások szerint, miután transzformációt és regenerációt követően a kívánt genotípust azonosítottuk, a növényeket öntermékenyítjük, az adott genotípus kinyerése cél- 55 jából. A találmány szerinti megoldás gyakorlati megvalósítása során azonban, a kívánt genotípus esetében, az első generációban nem lehet öntermékenyítést alkalmazni, mivel azt hímsteril növények alkotják. Hogy utódokat állíthassunk elő, a fertilitást helyre kell állíta- 60 nunk; ez úgy történik, hogy a növényeket, a módosított promoter aktiválásán keresztül a gén transzkripcióját eredményező vegyülettel permetezzük be. A GST-promoterek esetében, ez a vegyület előnyösen, egy GSTindukáló vegyület, például N,N,-diallil-2-2-dikloroacetanide. A hímfertilitási génhez kapcsolt promoter a fenti vegyület jelenlétére reagál, és megindítja a gén transzkripcióját Ennek megtörténtét követően a gén alapján t normális géntennék képződik, és a hímfertilitás bizonyos fokban helyreáll. Ezt követően az ilyen növényből ,¹ szánnazó pollent az eredeti, szelektált genotípus megporzására alkalmazzuk.

Miután a kívánt genotípus első izolációja és felszaporítása megtörtént, a további eljárás sokkal nyilvánvalóbb. Csak, a hibrid keresztezés során nőivarú szülőkként alkalmazott beltenyésztett törzseket alakítunk hímsteril variánsokká. Átalakításukat követően a hímsteril/női-fertilis magokat fel kell szaporítanunk. Ezt úgy végezzük, hogy egy izolált területet (más kukoricapollentől távol) beültetünk, és a promoter működését indukáló vegyszerrel permetezünk. A permetezés aktiválja a promotert, ezáltal megindítja az ahhoz kapcsolt gén transzkripcióját. Ez bizonyos fokú fertilitást vált ki. A fenti rendszer előnye abban rejlik más, például Mariani és munkatársai által leírt és a t

WO 89/10396 számú PCT bejelentésben ismertetett; rendszerekhez képest (amely a PCT/EP89/00495 számú nemzetközi közzétételi iraton alapul) - amely utób- í biak szerint a növényekben sterilitás létrejöttét indukál- í ják -, hogy a kezelésnek nem kell 100%-os hatékony- j ságúnak lennie, mivel normális esetben, egy kukorica- j növény sokkal több pollent termel, mint amennyi vala- \ mennyi rendelkezésre álló kukoricahaj fertílizációjá- s hoz valójában szükséges. Ezért a fertilitás alacsony j fokú helyreállítása is a magok megfelelő szintű felsza- j poritását eredményezi. Ugyanakkor, a hibridmagok I előállítás során nem történik önmegporzás, mivel a ta- ' lálmány szerinti növények normális esetben hímsterilek, és a fertilitás helyreállításához azokat kezelni kell. Olyan rendszerekben, ahol sterilitás indukciója történik, a sterilitást kiváltó kezelésnek 100%-os hatékonyságúnak kell lennie ahhoz, hogy a hibridmagok előállítása során az őnmegporzást elkerüljük.

Valamennyi betakarított mag továbbra is homozigóta és steril, mivel a fertilitás csak egyetlen szülői generációban állt helyre, a fertilitást előidéző vegyszerrel történő kezelés által. Ezt követően ezeket a magokat használjuk a hibridek előállítására szolgáló szántóföldön, ahol azokat női szülőkként alkalmazzuk. Mivel a nővé- nyék hímsterilek, nem kell azokat lecímerezni. Az ilyen magokból előállított valamennyi hibrid növény himfertilis, mivel a kapott utódok egy módosított gént örökölnek a női szülőtől, és egy normális gént a hím szülőtől. Az ilyen növényekben normális pollentermelődés jön létre.

Miután a találmány szerinti megoldást teljes egészé- \ ben ismertettük, szakember számára nyilvánvaló, hogy !

a találmány tárgya kiterjed különböző változtatásokra is anélkül, hogy a találmány szellemétől vagy tárgykö- ‘ rétől eltávolodnánk.

HU 221 518 BI

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI :

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1419 bázispár

TÍPUSA: nukleotid

HÁNY SZÁLÚ: kettős

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUSA: cDNS

LEÍRÁSA: MS45-cDNS-klón Zea mays-ból

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

FRAGMENSTÍPUS:

EREDETI FORRÁS:

ÉLŐLÉNY:

AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAATTCGGCA CGAGGTCCAC CAGCATGGAG GAGAAGAGGA AGCTGCAGTG 50

GCGGCGAGGG CGTGATGGCA TCGTGCAGTA CCCTCACCTG TTCTTCGCGG 100

CCCTGGCCCT GGCCCTCCTA GTCGCGGACC CGTTCGGCCT CAGTCCGCTG 150

GCCGAGGTCG ACTACCGGCC GGTGAAGCAC GAGCTCGCGC CGTACGGGGA 200

GGTCATGGGC AGCTGGCCCA GAGACAATGC CAGCCGGCTC AGGCGCGGGA 250

GGCTGGAGTT CGTCGGCGAG GTGTTCGGGC CGGAGTCCAT CGAGTTCGAT 300

CTCCAGGGCC GCGGGCCGTA CGCCGGCCTC GCCGACGGCC GCGTCGTGCG 350

GTGGATGGGC GAGGAGGCCG GGTGGGAGAC GTTCGCCGTC ATGAATCCTG 400

ACTGGTCAGA AGAAGTCTGT GCCAATGGAG TGAACTCAAC GACGAGGAAG 450

CAGCACGAGA AGGAGGAGTT CTGCGGCCGG CCGCTCGGCC TGAGGTTCCA 500

CGGGGAGACC GGCGAGCTCT ACGTCGCCGA CGCGTACTAC GGTCTCATGG 550

TCGTTGGCCA GAGCGGCGGC GTGGCGTCCT CCGTCGCGAG GGAAGCCGAC 600

GGGGACCCCA TCCGGTTCGC GAACGACCTC GATGTGCACA GGAATGGATC 650

CGTATTCTTC ACTGACACGA GCATGAGATA CAGCAGAAAG GACCATCTGA 700

ACATCCTGTT AGAAGGAGAA GGCACCGGGA GGCTGCTCAG GTACGATCCA 750

GAAACAAGTG CTGTCCATGT CGTGCTCAAG GGACTGGTGT TCCCAAACGG 800

CGTGCAGATC TCAGAAGACC ATCAGTTTCT TCTCTTCTCC GAGACAACAA 850

ACTGCAGGAT AATGAGGTAC TGGCTGGAAG GCCCAAGAGC GAGCGAGGTA 900

GAGGTGTTCG CGAACCTGCC GGGCTTCCCC GACAACGTGC GCTCCAACGG 950

CAGGGGCCAG TTCTGGGTGG CGATCGACTG CTGCCGGACG CCAGCGCAGG 1000

AGGTGTTCGC CAAGAGGCCG TGGCTCCGGA CCCTGTACTT CAAGTTCCCG 1050

CTGTCGCTCA AGGTGCTCAC TTGGAAGGCC GCCAGGAGGA TGCACACGGT 1100

GCTCGCGCTC CTCGACGGCG AAGGGCGCGT CGTGGAGGTG CTCGAGGACC 1150

GGGGCCACGA GGTGATGAAG CTGGTGAGCG AGGTGCGGGA GGTGGGCAGC 1200

AAGCTGTGGA TCGGAACCGT GGCGCACAAC CACATCGCCA CCATCCCCTA 1250

CCCTTTAGAG GACTAACCAT GATCTATGCT GTTTCAATGC CTCCTAATCT 1300

GTGTACCTCT ATAAATGTCT AATGCAGTCA CTGGTTGTAA TCTTGTTTGT 1350

GTTTGGCAAA TTGGCATAAT AATGGACAGA TTCAATGGGC AAAAAAAAAA 1400

AAAAAAAAAA AAACTCGAG 1419

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI :

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 473 bázispár

TÍPUSA: aminosav

HÁNY SZÁLÚ:

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATÍPUSA: aminosav

LEÍRÁSA:

HIPOTETIKUS: nem

ANTISZENSZ: nem

FRAGMENSTÍPUS:

EREDETI FORRÁS:

ÉLŐLÉNY: Zea mays

HU 221 518 Bl

A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Glu

Phe

Gly

Thr

Arg 5

Ser

Thr

Ser

Me t

Glu 10

Glu

Lys

Arg

Lys

Leu 15

Gin

Trp

Arg

Arg

Gly 20

Arg

Asp

Gly

Ile

Val 25

Gin

Tyr

Pro

Hi s

Leu 30

Phe

Phe

Al a

Ala

Leu 35

Ala

Leu

Al a

Leu

Leu 40

Val

Al a

Asp

Pro

Phe 45

Gly

Leu

Ser

Pro

Leu 50

Al a

Glu

Val

Asp

Tyr 55

Arg

Pro

Val

Lys

Hi s 60

Glu

Leu

Al a

Pro

Tyr 65

Gly

Glu

Val

Met

Gly 70

Ser

Trp

Pro

Arg

Asp 75

Asn

Al a

Ser

Arg

Leu 80

Arg

Arg

Gly

Arg

Leu 85

Glu

Phe

Val

Gly

Glu 90

Val

Phe

Gly

Pro

Glu 95

Ser

Ile

Glu

Phe

Asp 100

Leu

Gin

Gly

Arg

Gly 105

Pro

Tyr

Al a

Gly

Leu 110

Al a

Asp

Gly

Arg

Val 115

Val

Arg

Trp

Met

Gly 120

Glu

Glu

Al a

Gly

Trp 125

Glu

Thr

Phe

Al a

Val 130

Met

Asn

Pro

Asp

Trp 135

Ser

Glu

Glu

Val

Cys 140

Al a

Asn

Gly

Val

Asn 145

Ser

Thr

Thr

Arg

Lys 150

Gin

Hi s

Glu

Lys

Glu 155

Glu

Phe

Cys

Gly

Arg 160

Pro

Leu

Gly

Leu

Arg 165

Phe

His

Gly

Glu

Thr 170

Gly

Glu

Leu

Tyr

Val 175

Ala

Asp

Al a

Tyr

Tyr 180

Gly

Leu

Met

Val

Val 185

Gly

Gin

Ser

Gly

Gly 190

Val

Al a

Ser

Ser

Val 195

Ala

Arg

Glu

Al a

Asp 200

Gly

Asp

Pro

Ile

Arg 205

Phe

Al a

Asn

Asp

Leu 210

Asp

Val

His

Arg

Asn 215

Gly

Ser

Val

Phe

Phe 220

Thr

Asp

Thr

Ser

Met 225

Arg

Tyr

Ser

Arg

Lys 230

Asp

His

Leu

Asn

Ile 235

Leu

Leu

Glu

Gly

Glu 240

Gly

Thr

Gly

Arg

Leu 245

Leu

Arg

Tyr

Asp

Pro 250

Glu

Thr

Ser

Al a

Val 255

Hi s

Val

Val

Leu

Lys 260

Gly

Leu

Val

Phe

Pro 265

Asn

Gly

Val

Gin

Ile 270

Ser

Glu

Asp

Hi s

Gin 275

Phe

Leu

Leu

Phe

Ser 280

Glu

Thr

Thr

Asn

Cys 285

Arg

Ile

Met

Arg

Tyr 290

Trp

Leu

Glu

Gly

Pro 295

Arg

Ala

Ser

Glu

Val 300

Glu

Val

Phe

Al a

Asn 305

Leu

Pro

Gly

Phe

Pro 310

Asp

Asn

Val

Arg

Ser 315

Asn

Gly

Arg

Gly

Gin 320

Phe

Trp

Val

Al a

Ile 325

Asp

Cys

Cys

Arg

Thr 330

Pro

Al a

Gin

Glu

Val 335

Phe

Al a

Lys

Arg

Pro 340

Trp

Leu

Arg

Thr

Leu 345

Tyr

Phe

Lys

Phe

Pro 350

Leu

Ser

Leu

Lys

Val 355

Leu

Thr

Trp

Lys

Ala 360

Ala

Arg

Arg

Met

His 365

Thr

Val

Leu

Al a

Leu 370

Leu

Asp

Gly

Glu

Gly 375

Arg

Val

Val

Glu

Val 380

Leu

Glu

Asp

Arg

Gly 385

His

Glu

Val

Me t

Lys 390

Leu

Val

Ser

Glu

Val 395

Arg

Glu

Val

Gly

Ser 400

Lys

Leu

Trp

Ile

Gly 405

Thr

Val

Al a

His

Asn 410

His

Ile

Al a

Thr

Ile 415

Pro

Tyr

Pro

Leu

Glu 420

Asp

Xaa

Pro

Xaa

Ser 425

Met

Leu

Phe

Gin

Cys 430

Leu

Leu

Ile

Cys

Val 435

Arg

Leu

Xaa

Met

Ser

Asn

Al a

Val

Thr

Gly

Cys

Asn

Leu

Val

Cys

HU 221 518 Bl

440 445 450

Val Trp Gin Ile Gly Ile Ile Met Asp Arg Phe Asn Gly Gin Lys

455 460 465

Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Glu

470 473

Claims (25)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált polinukleotid molekula, melynek szekvenciája a következő (2. azonosító számú) aminosavszekvenciát kódoló szekvenciát tartalmazza:

   Glu Phe Gly Thr Arg 5 Ser Thr Ser Me t Glu 10 Glu Lys Arg Lys Leu 15 Gin Trp Arg Arg Gly 20 Arg Asp Gly Ile Val 25 Gin Tyr Pro Hi s Leu 30 Phe Phe Al a Al a Leu 35 Al a Leu Al a Leu Leu 40 Val Al a Asp Pro Phe 45 Gly Leu Ser Pro Leu 50 Al a Glu Val Asp Tyr 55 Arg Pro Val Lys His 60 Glu Leu Al a Pro Tyr 65 Gly Glu Val Met Gly 70 Ser Trp Pro Arg Asp 75 Asn Al a Ser Arg Leu 80 Arg Arg Gly Arg Leu 85 Glu Phe Val Gly Glu 90 Val Phe Gly Pro Glu 95 Ser Ile Glu Phe Asp 100 Leu Gin Gly Arg Gly 105 Pro Tyr Al a Gly Leu 110 Al a Asp Gly Arg Val 115 Val Arg Trp Met Gly 120 G1 u Glu Al a Gly Trp 125 Glu Thr Phe Al a Val 130 Met Asn Pro Asp Trp 135 Se r Glu Glu Val Cys 140 Al a Asn Gly Val Asn 145 Ser Thr Thr Arg Lys 150 Gin Hi s Glu Lys Glu 155 Glu Phe Cys G1 y Arg 160 Pro Leu Gly Leu Arg 165 Phe Hi s Gly Glu Thr 170 Gly Glu Leu Tyr Val 175 Al a Asp Al a Tyr Tyr 180 Gly Leu Me t Val Val 185 Gly Gin Ser Gly Gly 190 Val Al a Ser Se r Val 195 Al a Arg Glu Al a Asp 200 Gly Asp Pro Ile Arg 205 Phe Alá Asn Asp Leu 210 Asp Val His Arg Asn 215 Gly Ser Val Phe Phe 220 Thr Asp Thr Ser Met 225 Arg Tyr Ser Arg Lys 230 Asp His Leu Asn Ile 235 Leu Leu Glu Gly Glu 240 Gly Thr Gly Arg Leu 245 Leu Arg Tyr Asp Pro 250 Glu Thr Ser Al a Val 255 Hi s Val Val Leu Lys 260 Gly Leu Val Phe Pro 265 Asn Gly Val Gin Ile 270 Ser Glu Asp His Gin 275 Phe Leu Leu Phe Ser 280 Glu Thr Thr Asn Cys 285 Arg Ile Me t Arg Tyr 290 Trp Leu Glu Gly Pro 295 Arg Alá Ser Glu Val 300 Glu Val Phe Alá Asn 305 Leu Pro Gly Phe Pro 310 Asp Asn Val Arg Ser 315 Asn Gly Arg Gly Gin 320 Phe Trp Val Al a Ile 325 Asp Cys Cys Arg Thr 330 Pro Al a Gin Glu Val 335 Phe Alá Lys Arg Pro 340 Trp Leu Arg Thr Leu 345

   HU 221 518 BI

   Tyr Phe Lys Phe Pro 350 Leu Ser Leu Lys Val 355 Leu Thr Trp Lys Al a 360 Al a Arg Arg Me t Hi s Thr Val Leu Al a Leu Le u Asp Gly Glu Gly 365 370 375 Arg Val Val Glu Val Leu Glu Asp Arg Gly Hi s Glu Val Me t Lys 380 385 390 Leu Val Ser Glu Val Arg Glu Val Gly Ser Lys Leu Trp Ile Gly 395 400 405 Thr Val Al a Hi s Asn His Ile Al a Thr Ile Pro Tyr Pro Leu Glu 410 415 420 Asp Xaa Pro Xaa Ser Met Leu Phe Gin Cys Leu Leu Ile Cys Val 425 430 435 Arg Leu Xaa Met Se r Asn Alá Val Thr Gly Cys Asn Leu Val Cys 440 445 450 Val Trp Gin Ile Gly Ile Ile Me t Asp Arg Phe Asn Gly Gin Lys 455 460 465 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Glu 470 473
2. 2. Izolált RNS-molekula, amely 1. igénypont sze- 20
3. 3. Izolált DNS-molekula, amely növényekben fertirinti szekvenciát tartalmaz. litást közvetít, és a következő (2. azonosító számú) aminosavszekvenciát kódoló szekvenciát tartalmazza:

   Glu Phe Gly Thr Arg 5 Ser Thr Ser Me t Glu 10 Glu Lys Arg Lys Leu 15 Gin Trp Arg Arg Gly 20 Arg Asp Gly Ile Val 25 Gin Tyr Pro His Leu 30 Phe Phe Alá Alá Leu 35 Alá Leu Al a Leu Leu 40 Val Alá Asp Pro Phe 45 Gly Leu Ser Pro Leu 50 Alá Glu Val Asp Tyr 55 Arg Pro Val Lys His 60 Glu Leu Alá Pro Tyr 65 Gly Glu Val Me t Gly 70 Ser Trp Pro Arg Asp 75 Asn Al a Ser Arg Leu 80 Arg Arg Gly Arg Leu 85 Glu Phe Val Gly Glu 90 Val Phe Gly Pro Glu 95 Ser Ile Glu Phe Asp 100 Leu Gin Gly Arg Gly 105 Pro Tyr Alá Gly Leu 110 Al a Asp Gly Arg Val 115 Val Arg Trp Me t Gly 120 Glu Glu Al a Gly Trp 125 Glu Thr Phe Alá Val 130 Me t Asn Pro Asp Trp 135 Ser Glu Glu Val Cys 140 Al a Asn Gly Val Asn 145 Ser Thr Thr Arg Lys 150 Gin Hi s Glu Lys Glu 155 Glu Phe Cys Gly Arg 160 Pro Leu Gly Leu Arg 165 Phe Hi s Gly Glu Thr 170 Gly Glu Leu Tyr Val 175 Al a Asp Al a Tyr Tyr 180 Gly Leu Me t Val Val 185 Gly Gin Ser Gly Gly 190 Val Al a Ser Ser Val 195 Al a Arg Glu Al a Asp 200 Gly Asp Pro Ile Arg 205 Phe Alá Asn Asp Leu 210 Asp Val His Arg Asn 215 Gly Ser Val Phe Phe 220 Thr Asp Thr Ser Me t 225 Arg Tyr Ser Arg Lys 230 Asp His Leu Asn Ile 235 Leu Leu Glu Gly Glu 240 Gly Thr Gly Arg Leu 245 Leu Arg Tyr Asp Pro 250 Glu Thr Ser Al a Val 255 His Val Val Leu Lys 260 Gly Leu Val Phe Pro 265 Asn Gly Val Gin Ile 270

   HU 221 518 Bl

   Ser Glu Asp His Gin 275 Phe Leu Leu Phe Ser 280 Glu Thr Thr Asn Cys 285 Arg Ile Me t Arg Tyr Trp Leu Glu Gly Pro Arg Al a Ser Glu Val 290 295 300 Glu Val Phe Al a Asn Leu Pro Gly Phe Pro Asp Asn Val Arg Ser 305 310 315 Asn Gly Arg Gly Gin Phe Trp Val Ala Ile Asp Cys Cys Arg Thr 320 325 330 Pro Al a Gin Glu Val Phe Al a Lys Arg Pro Trp Leu Arg Thr Leu 335 340 345 Tyr Phe Lys Phe Pro Leu Ser Leu Lys Val Leu Thr Trp Lys Al a 350 355 360 Ala Arg Arg Me t His Thr Val Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu Gly 365 370 375 Arg Val Val Glu Val Leu Glu Asp Arg Gly Hi s Glu Val Me t Lys 380 385 390 Leu Val Ser Glu Val Arg Glu Val Gly Ser Lys Leu Trp Ile Gly 395 400 405 Thr Val Al a Hi s Asn Hi s Ile Al a Thr Ile Pro Tyr Pro Leu Glu 410 415 420 Asp Xaa Pro Xaa Ser Met Leu Phe Gin Cys Leu Leu Ile Cys Val 425 430 435 Arg Leu Xaa Met Ser Asn Al a Val Thr Gly Cys Asn Leu Val Cys 440 445 450 Val Trp Gin Ile Gly Ile Ile Me t Asp Arg Phe Asn Gly Gin Lys 455 460 465 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Glu 470 473
4. 4. DNS-molekula, amely növényekben fertilitást 30 közvetít, és a következő (1. azonosító számú) szekvenciát tartalmazza:

   GAATTCGGCA CGAGGTCCAC CAGCATGGAG GAGAAGAGGA AGCTGCAGTG 50 GCGGCGAGGG CGTGATGGCA TCGTGCAGTA CCCTCACCTG TTCTTCGCGG 100 CCCTGGCCCT GGCCCTCCTA GTCGCGGACC CGTTCGGCCT CAGTCCGCTG 150 GCCGAGGTCG ACTACCGGCC GGTGAAGCAC GAGCTCGCGC CGTACGGGGA 200 GGTCATGGGC AGCTGGCCCA GAGACAATGC CAGCCGGCTC AGGCGCGGGA 250 GGCTGGAGTT CGTCGGCGAG GTGTTCGGGC CGGAGTCCAT CGAGTTCGAT 300 CTCCAGGGCC GCGGGCCGTA CGCCGGCCTC GCCGACGGCC GCGTCGTGCG 350 GTGGATGGGC GAGGAGGCCG GGTGGGAGAC GTTCGCCGTC ATGAATCCTG 400 ACTGGTCAGA AGAAGTCTGT GCCAATGGAG TGAACTCAAC GACGAGGAAG 450 CAGCACGAGA AGGAGGAGTT CTGCGGCCGG CCGCTCGGCC TGAGGTTCCA 500 CGGGGAGACC GGCGAGCTCT ACGTCGCCGA CGCGTACTAC GGTCTCATGG 550 TCGTTGGCCA GAGCGGCGGC GTGGCGTCCT CCGTCGCGAG GGAAGCCGAC 600 GGGGACCCCA TCCGGTTCGC GAACGACCTC GATGTGCACA GGAATGGATC 650 CGTATTCTTC ACTGACACGA GCATGAGATA CAGCAGAAAG GACCATCTGA 700 ACATCCTGTT AGAAGGAGAA GGCACCGGGA GGCTGCTCAG GTACGATCCA 750 GAAACAAGTG CTGTCCATGT CGTGCTCAAG GGACTGGTGT TCCCAAAGGG 800 CGTGCAGATC TCAGAAGACC ATCAGTTTCT TCTCTTCTCC GAGACAACAA 850 ACTGCAGGAT AATGAGGTAC TGGCTGGAAG GCCCAAGAGC GAGCGAGGTA 900 GAGGTGTTCG CGAACCTGCC GGGCTTCCCC GACAACGTGC GCTCCAACGG 950 CAGGGGCCAG TTCTGGGTGG CGATCGACTG CTGCCGGACG CCAGCGCAGG 1000 AGGTGTTCGC CAAGAGGCCG TGGCTCCGGA CCCTGTACTT CAAGTTCCCG 1050 CTGTCGCTCA AGGTGCTCAC TTGGAAGGCC GCCAGGAGGA TGCACACGGT 1100 GCTCGCGCTC CTCGACGGCG AAGGGCGCGT CGTGGAGGTG CTCGAGGACC 1150 GGGGCCACGA GGTGATGAAG CTGGTGAGCG AGGTGCGGGA GGTGGGCAGC 1200 AAGCTGTGGA TCGGAACCGT GGCGCACAAC CACATCGCCA CCATCCCCTA 1250 CCCTTTAGAG GACTAACCAT GATCTATGCT GTTTCAATGC CTCCTAATCT 1300 GTGTACGTCT ATAAATGTCT AATGCAGTCA CTGGTTGTAA TCTTGTTTGT 1350

   HU 221 518 Bl

   GTTTGGCAAA TTGGCATAAT AATGGACAGA TTCAATGGGC AAAAAAAAAA 1400

   AAAAAAAAAA AAACTCGAG 1419
5. 5. Plazmidvektor, amely 1. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz.
6. 6. Növény, amely 1. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz, transzformáció útján bejuttatva.
7. 7. Növényi sejt, amely 1. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát tartalmaz, transzformáció útján bejuttatva.
8. 8. A 6. igénypont szerinti növény, amely kukorica.
9. 9. A 7. igénypont szerinti növényi sejt, amely kuko5 ricasejt.
10. 10. Eljárás, növény fertilitásának szabályozására, azzaljellemezve, hogy a fertilitást a növényben a következő (2. azonosító számú) aminosavszekvenciát kódoló nukleotidszekvencia expressziójának szabályozása út10 ján szabályozzuk:

    Glu Phe Gly Thr Arg 5 Ser Thr Ser Me t Glu 10 Glu Lys Arg Lys Leu 15 Gin Trp Arg Arg Gly 20 Arg Asp Gly Ile Val 25 Gin Tyr Pro Hi s Leu 30 Phe Phe Al a Al a Leu 35 Al a Leu Alá Leu Leu 40 Val Alá Asp Pro Phe 45 Gly Leu Ser Pro Leu 50 Al a Glu Val Asp Tyr 55 Arg Pro Val Lys His 60 Glu Leu Al a Pro Tyr 65 Gly Glu Val Me t Gly 70 Ser Trp Pro Arg Asp 75 Asn Al a Ser Arg Leu 80 Arg Arg Gly Arg Leu 85 Glu Phe Val Gly Glu 90 Val Phe Gly Pro Glu 95 Ser Ile Glu Phe Asp 100 Leu Gin Gly Arg Gly 105 Pro Tyr Al a Gly Leu 110 Al a Asp Gly Arg Val 115 Val Arg Trp Me t Gly 120 Glu Glu Al a Gly Trp 125 Glu Thr Phe Al a Val 130 Me t Asn Pro Asp Trp 135 Ser Glu Glu Val Cys 140 Al a Asn Gly Val Asn 145 Ser Thr Thr Arg Lys 150 Gin His Glu Lys Glu 155 Glu Phe Cys Gly Arg 160 Pro Leu Gly Leu Arg 165 Phe His Gly Glu Thr 170 Gly Glu Leu Tyr Val 175 Al a Asp Al a Tyr Tyr 180 Gly Leu Met Val Val 185 Gly Gin Ser Gly G1 y 190 Val Alá Ser Ser Val 195 Alá Arg Glu Alá Asp 200 Gly Asp Pro Ile Arg 205 Phe Al a Asn Asp Leu 210 Asp Val His Arg Asn 215 Gly Ser Val Phe Phe 220 Thr Asp Thr Ser Me t 225 Arg Tyr Ser Arg Lys 230 Asp His Leu Asn Ile 235 Leu Leu Glu Gly Glu 240 Gly Thr Gly Arg Leu 245 Leu Arg Tyr Asp Pro 250 Glu Thr Ser Al a Val 255 His Val Val Leu Lys 260 Gly Leu Val Phe Pro 265 Asn Gly Val Gin Ile 270 Ser Glu Asp Hi s Gin 275 Phe Leu Leu Phe Ser 280 Glu Thr Thr Asn Cys 285 Arg Ile Met Arg Tyr 290 Trp Leu Glu Gly Pro 295 Arg Al a Ser Glu Val 300 Glu Val Phe Al a Asn 305 Leu Pro Gly Phe Pro 310 Asp Asn Val Arg Ser 315 Asn Gly Arg Gly Gin 320 Phe Trp Val Alá Ile 325 Asp Cys Cys Arg Thr 330 Pro Al a Gin Glu Val 335 Phe Al a Lys Arg Pro 340 Trp Leu Arg Thr Leu 345 Tyr Phe Lys Phe Pro 350 Leu Ser Leu Lys Val 355 Leu Thr Trp Lys Al a 360

    HU 221 518 Bl

    Ala Arg Arg Met His Thr Val Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu Gly 365 370 375

    Arg Val Val Glu Val Leu Glu Asp Arg Gly His Glu Val Met Lys 380 385 390

    Leu Val Ser Glu Val Arg Glu Val Gly Ser Lys Leu Trp Ile Gly 395 400 405

    Thr Val Ala His Asn His Ile Ala Thr Ile Pro Tyr Pro Leu Glu 410 415 420

    Asp Xaa Pro Xaa Ser Met Leu Phe Gin Cys Leu Leu Ile Cys Val 425 430 435

    Arg Leu Xaa Met Ser Asn Ala Val Thr Gly Cys Asn Leu Val Cys 440 445 450

    Val Trp Gin He Gly Ile Ile Met Asp Arg Phe Asn Gly Gin Lys 455

    Lys Lys Lys Lys Lys Lys Leu Glu 470 473
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez ve, hogy a fertilitást nukleotidszekvenciaként RNS molekula expressziójának szabályozása útján szabá lyozzuk.
12. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez ve, hogy a fertilitást nukleotidszekvenciaként DNS

    460 465 molekula expressziójának szabályozása útján szabályozzuk.

    - 20
13. 13. Eljárás, növény fertilitásának szabályozására, azzaljellemezve, hogy a fertilitást a növényben a következő (1. azonosító számú) szekvenciájú DNS-molekula expressziójának szabályozása útján szabályozzuk:

    GAATTCGGCA CGAGGTCCAC CAGCATGGAG GAGAAGAGGA AGCTGCAGTG 50 GCGGCGAGGG CGTGATGGCA TCGTGCAGTA CCCTCACCTG TTCTTCGCGG 100 CCCTGGCCCT GGCCCTCCTA GTCGCGGACC CGTTCGGCCT CAGTCCGCTG 150 GCCGAGGTCG ACTACCGGCC GGTGAAGCAC GAGCTCGCGC CGTACGGGGA 200 GGTCATGGGC AGCTGGCCCA GAGACAATGC CAGCCGGCTC AGGCGCGGGA 250 GGCTGGAGTT CGTCGGCGAG GTGTTCGGGC CGGAGTCCAT CGAGTTCGAT 300 CTCCAGGGCC GCGGGCCGTA CGCCGGCCTC GCCGACGGCC GCGTCGTGCG 350 GTGGATGGGC GAGGAGGCCG GGTGGGAGAC GTTCGCCGTC ATGAATCCTG 400 ACTGGTCAGA AGAAGTCTGT GCCAATGGAG TGAACTCAAC GACGAGGAAG 450 CAGCACGAGA AGGAGGAGTT CTGCGGCCGG CCGCTCGGCC TGAGGTTCCA 500 CGGGGAGACC GGCGAGCTCT ACGTCGCCGA CGCGTACTAC GGTCTCATGG 550 TCGTTGGCCA GAGCGGCGGC GTGGCGTCCT CCGTCGCGAG GGAAGCCGAC 600 GGGGACCCCA TCCGGTTCGC GAACGACCTC GATGTGCACA GGAATGGATC 650 CGTATTCTTC ACTGACACGA GCATGAGATA CAGCAGAAAG GACCATCTGA 700 ACATCCTGTT AGAAGGAGAA GGCACCGGGA GGCTGCTCAG GTACGATCCA 750 GAAACAAGTG CTGTCCATGT CGTGCTCAAG GGACTGGTGT TCCCAAACGG 800 CGTGCAGATC TCAGAAGACC ATCAGTTTCT TCTCTTCTCC GAGACAACAA 850 ACTGCAGGAT AATGAGGTAC TGGCTGGAAG GCCCAAGAGC GAGCGAGGTA 900 GAGGTGTTCG CGAACCTGCC GGGCTTCCCC GACAACGTGC GCTCCAACGG 950 CAGGGGCCAG TTCTGGGTGG CGATCGACTG CTGCCGGACG CCAGCGCAGG 1000 AGGTGTTCGC CAAGAGGCCG TGGCTCCGGA CCCTGTACTT CAAGTTCCCG 1050 CTGTCGCTCA AGGTGCTCAC TTGGAAGGCC GCCAGGAGGA TGCACACGGT 1100 GCTCGCGCTC CTCGACGGCG AAGGGCGCGT CGTGGAGGTG CTCGAGGACC 1150 GGGGCCACGA GGTGATGAAG CTGGTGAGCG AGGTGCGGGA GGTGGGCAGC 1200 AAGCTGTGGA TCGGAACCGT GGCGCACAAC CACATCGCCA CCATCCCCTA 1250 CCCTTTAGAG GACTAACCAT GATCTATGCT GTTTCAATGC CTCCTAATCT 1300 GTGTACGTCT ATAAATGTCT AATGCAGTCA CTGGTTGTAA TCTTGTTTGT 1350 GTTTGGCAAA TTGGCATAAT AATGGACAGA TTCAATGGGC AAAAAAAAAA 1400 AAAAAAAAAA AAACTCGAG 1419
14. 14. Eljárás növényben hímfertilitás szabályozására, 55 mú) aminosavszekvenciát kódoló nukleotidszekvencia azzal jellemezve, hogy a következő (2. azonosító szá- expressziójának gátlása útján idézzük elő:

    Glu Phe Gly Thr Arg Ser Thr Ser Met Glu Glu Lys Arg Lys Leu 5 10 15

    HU 221 518 Β1

    Gin Trp Arg Arg Gly 20 Arg Asp Gly Ile Val 25 Gin Tyr Pro His Leu 30 Phe Phe Alá Al a Leu 35 Al a Leu Al a Leu Leu 40 Val Al a Asp Pr o Phe 45 Gly Leu Ser Pro Leu 50 Alá Glu Val Asp Tyr 55 Arg Pro Val Lys His 60 Glu Leu Alá Pro Tyr 65 Gly Glu Val Me t Gly 70 Ser Trp Pro Arg Asp 75 Asn Alá Ser Arg Leu 80 Arg Arg Gly Arg Leu 85 Glu Phe Val Gly Glu 90 Val Phe Gly Pro Glu 95 Ser Ile Glu Phe Asp 100 Leu Gin Gly Arg Gly 105 Pro Tyr Al a Gly Leu 110 Alá Asp Gly Arg Val 115 Val Arg Trp Me t Gly 120 Glu Glu Alá Gly Trp 125 Glu Thr Phe Al a Val 130 Me t Asn Pro Asp Trp 135 Ser Glu Glu Val Cys 140 Al a Asn Gly Val Asn 145 Ser Thr Thr Arg Lys 150 Gin Hi s Glu Lys Glu 155 Glu Phe Cys Gly Arg 160 Pro Leu Gly Leu Arg 165 Phe His Gly Glu Thr 170 Gly Glu Leu Tyr Val 175 Al a Asp Al a Tyr Tyr 180 Gly Leu Met Val Val 185 Gly Gin Ser Gly Gly 190 Val Alá Ser Ser Val 195 Al a Arg Glu Al a Asp 200 Gly Asp Pro Ile Arg 205 Phe Al a Asn Asp Leu 210 Asp Val His Arg Asn 215 Gly Ser Val Phe Phe 220 Thr Asp Thr Ser Me t 225 Arg Tyr Ser Arg Lys 230 Asp His Leu Asn Ile 235 Leu Leu Glu Gly Glu 240 Gly Thr Gly Arg Leu 245 Leu Arg Tyr Asp Pro 250 Glu Thr Ser Alá Val 255 His Val Val Leu Lys 260 Gly Leu Val Phe Pro 265 Asn Gly Val Gin Ile 270 Ser Glu Asp His Gin 275 Phe Leu Leu Phe Se r 280 Glu Thr Thr Asn Cys 285 Arg Ile Me t Arg Tyr 290 Trp Leu Glu Gly Pro 295 Arg Al a Ser Glu Val 300 Glu Val Phe Alá Asn 305 Leu Pro Gly Phe Pro 310 Asp Asn Val Arg Ser 315 Asn Gly Arg Gly Gin 320 Phe Trp Val Al a Ile 325 Asp Cys Cys Arg Thr 330 Pro Al a Gin Glu Val 335 Phe Al a Lys Arg Pro 340 Trp Leu Arg Thr Leu 345 Tyr Phe Lys Phe Pro 350 Leu Ser Leu Lys Val 355 Leu Thr Trp Lys Al a 360 Alá Arg Arg Me t His 365 Thr Val Leu Alá Leu 370 Leu Asp Gly Glu Gly 375 Arg Val Val Glu Val 380 Leu Glu Asp Arg Gly 385 His Glu Val Me t Lys 390 Leu Val Ser Glu Val 395 Arg Glu Val Gly Ser 400 Lys Leu Trp Ile Gly 405 Thr Val Al a His Asn 410 Hi s Ile Alá Thr Ile 415 Pro Tyr Pro Leu Glu 420 Asp Xaa Pro Xaa Ser 425 Me t Leu Phe Gin Cys 430 Leu Leu Ile Cys Val 435 Arg Leu Xaa Me t Ser 440 Asn Al a Val Thr Gly 445 Cys Asn Leu Val Cys 450

    HU 221 518 Bl

    Val Trp Gin Ile Gly Ile 455

    Lys Lys Lys Lys Lys Lys 470

    Ile Met Asp Arg Phe Asn Gly Gin Lys 460 465

    Leu Glu 473
15. 15. Eljárás növényben hímfertilitás szabályozására, azzal jellemezve, hogy a következő (1. azonosító számú) szekvenciájú DNS-molekula expressziójának gátlása útján idézzük elő:

    GAATTCGGCA CGAGGTCCAC CAGCATGGAG GAGAAGAGGA AGCTGCAGTG 50 GCGGCGAGGG CGTGATGGCA TCGTGCAGTA CCCTCACCTG TTCTTCGCGG 100 CCCTGGCCCT GGCCCTCCTA GTCGCGGACC CGTTCGGCCT CAGTCCGCTG 150 GCCGAGGTCG ACTACCGGCC GGTGAAGCAC GAGCTCGCGC CGTACGGGGA 200 GGTCATGGGC AGCTGGCCCA GAGACAATGC CAGCCGGCTC AGGCGCGGGA 250 GGCTGGAGTT CGTCGGCGAG GTGTTCGGGC CGGAGTCCAT CGAGTTCGAT 300 CTCCAGGGCC GCGGGCCGTA CGCCGGCCTC GCCGACGGCC GCGTCGTGCG 350 GTGGATGGGC GAGGAGGCCG GGTGGGAGAC GTTCGCCGTC ATGAATCCTG 400 ACTGGTCAGA AGAAGTCTGT GCCAATGGAG TGAACTCAAC GACGAGGAAG 450 CAGCACGAGA AGGAGGAGTT CTGCGGCCGG CCGCTCGGCC TGAGGTTCCA 500 CGGGGAGACC GGCGAGCTCT ACGTCGCCGA CGCGTACTAC GGTCTCATGG 550 TCGTTGGCCA GAGCGGCGGC GTGGCGTCCT CCGTCGCGAG GGAAGCCGAC 600 GGGGACCCCA TCCGGTTCGC GAACGACCTC GATGTGCACA GGAATGGATC 650 CGTATTCTTC ACTGACACGA GCATGAGATA CAGCAGAAAG GACCATCTGA 700 ACATCCTGTT AGAAGGAGAA GGCACCGGGA GGCTGCTCAG GTACGATCCA 750 GAAACAAGTG CTGTCCATGT CGTGCTCAAG GGACTGGTGT TCCCAAACGG 800 CGTGCAGATC TCAGAAGACC ATCAGTTTCT TCTCTTCTCC GAGACAACAA 850 ACTGCAGGAT AATGAGGTAC TGGCTGGAAG GCCCAAGAGC GAGCGAGGTA 900 GAGGTGTTCG CGAACCTGCC GGGCTTCCCC GACAACGTGC GCTCCAACGG 950 CAGGGGCCAG TTCTGGGTGG CGATCGACTG CTGCCGGACG CCAGCGCAGG 1000 AGGTGTTCGC CAAGAGGCCG TGGCTCCGGA CCCTGTACTT CAAGTTCCCG 1050 CTGTCGCTCA AGGTGCTCAC TTGGAAGGCC GCCAGGAGGA TGCACACGGT 1100 GCTCGCGCTC CTCGACGGCG AAGGGCGCGT CGTGGAGGTG CTCGAGGACC 1150 GGGGCCACGA GGTGATGAAG CTGGTGAGCG AGGTGCGGGA GGTGGGCAGC 1200 AAGCTGTGGA TCGGAACCGT GGCGCACAAC CACATCGCCA CCATCCCCTA 1250 CCCTTTAGAG GACTAACCAT GATCTATGCT GTTTCAATGC CTCCTAATCT 1300 GTGTACGTCT ATAAATGTCT AATGCAGTCA CTGGTTGTAA TCTTGTTTGT 1350 GTTTGGCAAA TTGGCATAAT AATGGACAGA TTCAATGGGC AAAAAAAAAA 1400 AAAAAAAAAA AAACTCGAG 1419
16. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvencia expressziójának gátlását a nukleotidszekvencia mutációja útján idézzük elő.
17. 17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvencia expressziójának gátlását egy, a növénybe bejuttatott második nukleotidszekvencia alkalmazásával idézzük elő.
18. 18. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleotidszekvencia expressziójának gátlását a DNS-molekula mutációja útján idézzük elő.
19. 19. A 15. igénypont szerinti eljárás, αζζα/ jellemezve, hogy a DNS-molekula expressziójának gátlását egy, a növénybe juttatott - a DNS-molekulához képest antiszensz orientációjú - második nukleotidszekvencia alkalmazásával idézzük elő.
20. 20. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekula expressziójának gátlását egy, a növénybe bejuttatott második DNS-molekula alkalmazásával idézzük elő.
21. 21. Eljárás örökletes, kívülről szabályozható hímsterilitás létrehozására növényben, azzal jellemezve, hogy:

    (i) a 3. igénypont szerinti DNS-molekulát egy, külső szabályozásra érzékeny, indukálható promoterrel expressziós szekvenciává kapcsoljuk össze;

    (ii) az expressziós szekvenciát növény genomjába juttatjuk; és (iii) a növény natív genomjában, a 3. igénypont szerinti DNS-molekula termékét kódoló DNS-molekulát inaktiváljuk.
22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 3. igénypont szerinti DNS-molekulaként 4. igénypont szerinti DNS-molekula által kódolt aminosavszekvenciát kódoló DNS-molekulát alkalmazunk.
23. 23. Eljárás örökletes, kívülről szabályozható hímsterilitású növény reprodukálására - mely hímsterilitás annak eredménye, hogy a növényben egy első natív, 3. igénypont szerinti DNS-molekula termékét kódoló DNS-molekulát egy indukálható promoterrel expressziós szekvenciává összekapcsolt második, 3. igénypont szerinti DNS-molekulával helyettesítünk azzal jellemezve, hogy:

    (i) a növény magjait elültetjük, és így növekvő, hímsteril palántákat állítunk elő;

    HU 221 518 Bl hímsterilitása egy első, natív, a 3. igénypontban ismertetett aminosavszekvenciát kódoló DNS-molekula egy olyan második, 3. igénypont szerinti DNS-molekulával történő helyettesítésének eredménye, amely expressziós 5 szekvenciaként külső szabályozás alatt álló, indukálható promoterrel van összekapcsolva;

    (ii) a magokból érett növényeket nevelünk, olyan körülmények mellett, amelyek nem indukálják a második DNS-molekula expresszióját;

    (iii) a hímsteril női növényeket keresztbe porozzuk a himfertilis növényből származó pollennel; és (iv) a hímsteril, női növények magjait összegyűjtjük.

    26. Expressziós kazetta, amely növényi sejtekben a nukleotidszekvencia expresszióját eredményező növényi szabályozószekvenciákkal funkcionálisan kapcsolt, 1. igénypont szerinti nukleotidszekvenciát tartalmazza.

    (ii) a promoter indukciója útján a második DNSmolekula expresszióját eredményező körülmények alkalmazásával kiváltjuk a növekvő palánták himfertilis formákká történő átalakulását;

    (iii) a növekvő palántákat - izoláltan - nyílt beporzással megporozzuk, és így magokat állítunk elő; majd (iv) a magokat összegyűjtjük.
24. 24. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 3. igénypont szerinti DNS-molekulaként 4. igénypont szerinti DNS-molekula által kódolt amino- 10 savszekvenciát kódoló DNS-molekulát alkalmazunk.
25. 25. Eljárás hibridmagok előállítására, azzal jellemezve, hogy:

    (i) egymás mellé, keresztmegporzást lehetővé tevő távolságban ültetünk kiválasztott, himfertilis szülői vo- 15 nalból származó magokat és egy második, női, hímsteril szülői vonalból származó magokat, amely utóbbi vonal