BG99101A - Метод за контролиране на мъжка фертилност чрез използване на външно индуцирана промоторна секвенция - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до метод, по който се използва индуциращ се промотор, за да се регулира експресията на ген, за който е известно, че е критичен за мъжката фертилност. Избраните генни секвенциисе модифицират така, че нормално генът е "изключен" и в резултат растенията са мъжки и стерилни. Когато се цели възпроизвеждането на мъжките стерилни растения, мъжката фертилност се възстановява чрезтретиране на растенията с химическо вещество, коетоне е фитотоксично и индуцира експресията на критичния ген. Критичният ген засяга продуцирането на флавонол, по-специално на съединение с формула в която r1, r2, r4, r5, r7, r8 са водород, хидроксилили алкоксигрупи, притежаващи от 1 до 4 въглеродни атома. Предпочитани флавоноли са галангин, кемпферол, изорамнетин, кверцетин и морин.

Description

Настоящото изобретение се отнася до употреба на микроспорогенезни гени и индуциращи се промотори за производство на хибридни семена. По-специално изобретението се отнася до регулиране на мъжка стерилност в такива семена чрез контролиране на секвенциите от нуклеинови киселини засягащи продуцирането на флавонол.

Предшествуващо състояние на техниката

Целта на селекциониране на растения е в един вариетет/хибрид да се комбинират различни желани характерни черти на родителските линии. За полски култури, тези характерни черти могат да бъдат резистентност към заболявания и насекоми, издръжливост на топлина и суша, скъсяване на времето за узряване на културата, по-висок добив и по-добро агрономическо качество. При механичното събиране на реколтата, при много култури еднородността на растителните характеристики като покълване и изправяне, скорост на растеж, узряване и размер на плода е много важна.

Полските култури се селекционират посредством техники, които имат предимство пред метода на опрашване на растенията. Едно растение се самоопрашва ако полен от един цвят се пренесе до същия или до друг цвят на същото растение.Едно растение е кръстосано опрашено когато поленът идва от цвят на друго растение.

Растенията, които са били самоопрашени и отгледани за тип в продължение на много поколения стават хомозиготни при почти всички локуси на гените и произвеждат еднородна популация от истинско отгледано потомство. Кръстоска между две хомозиготни линии произвежда еднородна популация от хибридни растения всяко хетерозиготно в известен брой генни локуси. Кръстосването на две растения всяко хетерозиготно в известен брой от генни локуси дава популация от хибридни растения, които се различават генетически и няма да бъдат еднородни.

Царевичните растения (Zea mays L.) могат да се размножават както чрез самоопрашване така и чрез кръстосано опрашване. Царевицата има мъжки цветове, разположени в метлица и женски цветове разположени на кочана на същото растение. Естественото опрашване на царевицата настъпва, когато вятърът издуха полени от метлицата към копринката , която се измъква от върховете на приемащия кочан.

Развитието на царевичните хибриди изисква развитие на хомозиготно отглеждани линии, кръстосване на

У -у тези линии и оценка на кръстоските. Отглеждане на родословие и повтаряща се селекция са два от методите за отглеждане използвани за развиване на наследствени линии от популации. Програмите за отглеждане обединяват желани черти от две или повече наследствени линии или различни източници в отгледани пулове, от които се развиват нови наследствени линии чрез самоопрашване и селекция на желаните фенотипове. Новите наследствени линии се кръстосват с други наследствени линии и хибридите от тези г

I кръстоски се оценяват за да се определи кои имат търговски потенциал.

Отглеждането на родословие започва кръстосване на два генотипа, всеки от които може да има една или повече желани характеристики, които липсват у другата или допълват другата.Ако двата истински родитела не осигуряват всички желани характеристики, могат да се включат други източници в отглежданата популация. По родословния метод по-висшите растения се самоопрашват и се селекционират в последователни поколения. В следващите поколения хетерозиготните условия, отстъпват място на хомогенните линии като резултат на самоопрашване и селекция. По родословния метод на отглеждане обикновено се практикува самоопрашване и селекция на пет или повече поколения. Fi~>F2, F2->F3, F3~>F4, F4->F5 и т.н.

Хибридните царевичви вариетети са кръстоска между две наследствени линии, всяка от които може да има една или повече желани характеристики липсващи при другата или които допълвват другата. Хибридното потомство от първото поколение е означено с Fj. В развитието на

- A хибридите само хибридните растения се търсят. хибридът е по-силен отколкото неговите родители. Тази хибридна сила или хетерозис може да бъде изразена по много начини, включително засилен вегетативен растеж и повишен добив.

Развитието на един хибриден царевичен вариетет включва три етапа: 1) селекция на по-висши растения от различни пулове от зародишна плазма, 2) самоопрашване на по-висшите растения в продължение на няколко поколения, за да се получат серии от наследствени линии, които въпреки че се различават една от друга всяка наследява правилно и са високо еднородни и 3) кръстосване на избраните наследствени линии с неродствени наследствени линии, за да се получи хибридното потомство (Fj). В процеса на онаследяване силата на линиите намалява. Силата се възстановява, когато две неродствени наследствени линии се кръстосат, за да се получи хибридното потомство. (Fj). Важно следствие от хомозиготността и хомогенността на наследствените линии е, че хибридът между два кои да са наследника винаги ще бъде същият. Като се идентифицира веднъж наследникът, който дава найдобрия хибрид, хибридните семена могат да се репродуцират неопределено дълго докато се поддържа хомогенността на наследените родители.

Прост кръстосан хибрид се получава, когато две неследствени линии се кръстосат, за да се получи F^ потомството. Двоен кръстосан хибрид се получава от четири наследствени линии кръстосани по двойки (АхВ и CxD) и след това двата F^ хибрида се кръстосват отново (АхВ) х (CxD). Много от хибридната сила изразена от F^ хибридите се губи в следващото поколение (р£). Вследствие на това семена от хибридни вариетети не се използват като щок за посев. Също така, много е важно при производството на хибридни семена да се избягва самоопрашването и продукция и продажба на наследствени семена на крайни потребители.

Хибридни семена от царевица могат да се произведат чрез ръчно отстраняване на метлицата. В полета се засяват редуващи се ивици от два наследствени вариетета от царевица и носещите полени метлици се отстраняват от единия от отглежданите вариетети (женския). При условие че има достатъчна изолация от източниците на чужди царевични полени, кочаните на отглежданите растения с отстранена метлица, ще се оплодяват само с полена на другия отглеждан ред (мъжкия) и полученото в резултат семе е хибрид и ще образува хибридно растение. За жалост процесът на ръчно отстраняване на метлиците не е напълно надежден. Случайно женско растение може да бъде издухано от буря и да избегне отстраняването на метлицата. Или лицето, което премахва метлиците не отстрани напълно метлицата от растението. Във всеки случай женското растение ще разпръсне успешно прашец и някои женски растения ще бъдат самоопрашени. В резултат на това ще бъдат събрани семена от женските растения, наред с хибридните семена, които са норммално произведени.

Алтернативно, на женските растения могат да бъдат отстранени по механичен начин метлиците. Механичното отстраняване на метлиците е приблизително еднакво надеждно както ръчното, но е по-бързо и по-икономично. Обаче, повечето машини за отстраняване на метлиците причиняват повече увреждания на растенията, отколкото ръчното отстраняване. По такъв начин, понастоящем никоя

- 6 форма на отстраняване на метлиците не е напълно задоволителна и има постоянна нужда от алтернативи, които още повече да намалят производствените разходи и да елиминират самоопрашването при производството на хибридни семена.

Трудоемкият процес на отстраняване на метлиците може да се избегне като се използва цитоплазмено мъжко стерилно (CMS) потомство. Растенията от CMS са мъжко стерилно потомство, като резултат от цитоплазмени фактори получени от цитоплазмения, обратно на нуклеарния, геном. Така тези характеристики се онаследяват изключително чрез женския родител, тъй като само той осигурява цитоплазма на оплоденото семе. CMS растенията се оплождат с полен от друг потомък, който не е мъжки стерилен. Поленът от втория потомък може или не може да дава гени, които правят хибридните растения мъжки фертилни. Обикновено семената от нормална царевица от отстранена метлица и CMS произведено семе от същия хибрид могат да се смесят, за да се осигурят адекватни поленови товари да са достъпни за оплождане, когато се отглеждат хибридните растения.

Може да има и други недостатъци на CMS. Единият е исторически наблюдаваното свързване на специфичен вариетет от CMS с чувствителността към определена болест на културата. Този проблем е довел фактически до изоставяне използването на този CMS. В допълнение,, CMS понякога има негативна връзка с агрономическото изпълнение, поспециално в областта на качеството на стъблото, силата на ранния разсад и добивите. Накрая, CMS показва при случай възможност за прекъсване на стерилността в известна среда.

Така CMS линиите стават надежддни за производство на хибридни семена.

Друга форма на стерилност, генна мъжка стерилност е описана в САЩ патенти 4 654 465 и 4 727 219 от Вгаг и сътр. Все пак, тази форма на генетична мъжка стерилност изисква поддържане на многобройни мутантни гени на отдделни места в генома и изисква сложна маркерна система за проследяване на гените и удобно използване на системата.

При самоопрашващите се видове като соя и памук и мъжките и женските органи са близко един до друг. През време на естественото опрашване поленът от мъжките репродуктивни органи на даден цвят опрашва женските репродуктивни органи на същи цвят. Това е противоположно на кръстосано опрашващите се видове като царевицата, където прашецът от метлицата на едно растение обикновено опрашва косата на друго, чрез разпръскване от вятъра. Това може да стане лесно благодарение на разделението на мъжките и женските репродуктивни органи. Хибридното производство между самоопрашващите се културни растения може да се затрудни поради близката връзка на мъжките и женските репроддуктивни органи. В допълнение към физическата трудност в осъществяването на производство на хибрид в самоопрашваща се култура, количеството на хетерозис показано в хибрида е често твърде ниско, за да оправдае изискващите се допълнителни разходи за получаване на хибридни семена. Надеждна форма на мъжка стерилност би предложила възможност за подобрено отглеждане на растителни хибриди и увеличени добиви в тези видове.

Учените са се опитали да разберат развитието на полена и процеса на оплождане при царевицата и други растения.Оплождането започва с пораждането на зрял полен върху повърхността на царевичната коса и образуването на тръба, която прониква в плодниковата тъкан. В покритосеменните растения нарастващата поленова тръба е проводник за транспортиране на двете спермални клетки към зародишната тръбичка, където те се сливат с яйцето и централните клетки, за да се образува зиготата и ендоспермата съответно (E.G. Cutterq 1978, Plant Anatomy, part 1 .Experimentation and Interpretation, E.Arnold, Eds., Addison Wesley, London, Chap.

6). Развитието на полена настъпва вътре в антера и при зрялост всяко зърно е многоклетъчна спора съдържаща продукти както на спорофитна генна експресия, възникваща от вътрешния слой антерната стена, така и на хаплоидната генна експресия от вегетативните клетки във всяко зърно (J.P. Mascarenhas, 1990, Annu.Rev. Plant Phisiol. Plant Mol Biol. 41:317, J.P. Mascarenhas, 1989, Plant Cell 1:657). Въпреки че процесът на микроспорогенеза е добре документиран хистологично, малко е известно за молекулния и биохимичния фактори, коцто са включени в поленовата функция след разпръскването му.

Флавоноидите са обширен клас с малко молекулно тегло (-300) специфични за растението метаболити, които имат структура с 15 въглеродни атоми. Модификацията на основната структура осигурява обширна област от съединения, които се класират по степента на окисленост и видовете заместители в различните пръстени. Някои класове са пигменти (напр. антоцианини, халкони и по-специално флавоноли и флавони), докато други класове са безцветни абсорбиращи ултравиолетова светлина съединения. Антоцианините, по-специално пеларгонин, цианидин и делфинидин са отговорни за червения, синия и виолетовия растителни цветове. Други оцветени флавоноиди, халконите и някои флавоноли и флавони са жълти и съдействуват значително за обагрените в жълто цветове, в слонова кост и кремаво. В полена са идентифицирани няколко вида флавоноиди, които придават изразен жълт цвят на полена и могат да бъдат значителен процент (2%-5%) от сухото тегло (R.Zerbak, M.Bokel, Н.Geiger, D.Hess, Phytochemistry 28:897,

R. Wierinann and K.Vieth, 1983 Prootoplasma 118:230). Съществува доказателство, че поленовото зърно е специфична среда за биосинтезата и/или натрупването на флавоноидите, тъй като няколко растителни вида имат уникални типове флавоноиди в техните полени (O.Ceska and Е.D.Styles, 1984, Phytochemistry 23:1822).

В литературата по-рано е съобщено за растения, които имат модифицирана флавоноидна пигментация. Например, един царевичен мутант, който произвежда нефунк.«· ционален по-скоро бял отколкото жълт полен е бил изолиран и охарактеризиран (Coe Е.Н., McCormick S.M. and Modena

S. A., 1981, ” White Pollen in Maize, J. Hered 72:318-320). Белият поленов метант разпръсква нормални количества от непигментиран полен, който пониква, но не се образуват семена след опрашването. Условието е спорофитно определено чрез експресията на стабилни възвратни мутации при двата халконсинтазни (CHS) гена в царевицата С2 и Whp. Напоследък е съобщено че интродукция с посредник Agrobacterium на CHS трансген в пигментирани семена-поколение от петуния подтиска експресията на ендогенни CHS гени, което има за резултат цветове с напълно липсваща пигментация на венчетата (Napoli С., Lemieux С. and Jorgensen R., 1990, Introduction of a Chimeric Chaicone Syntase Into Petunia Results in Reversible Corpression of Homologous Genes in Trans, Plant Cell 2:279-289). CHS трансгенът е също потиснат в тези растения и за да се опише това явление се използва понятието косупресия (Jorgensen R., 1990, Altered Gene Expression in Plants Due to Trans Interactions Between Homologous Genes, Trends. Biotech. 8:340-344). Интегрираният трансген действува подобно на несвързан доминантен инхи битор на ендогенния CHS ген(и) и води до пълно блокиране на продуцирането на видими флавоноидни пигменти не само във венчелистчетата, но също и репродуктивните органи.

Блокирането на CHS генната експресия води не само до липса на флавоноидна пигментация, но и до растения, които не са плодоносни (Сое и сътр. 1981, Taylor и сътр.1992,

Conditional Male Fertility in

Chaicone

Synthase Deficient

Petunia”, J. Hered., 83:11-17).

Особено желателно е да може да се контролира фертилността по такъв начин, че растенията да могат ефективно да се правят мъжки стерилни или фертилни по желание.

Резюме на изобретението

Настоящото изобретение се отнася до метод за контролирано придаване на растенията на мъжка стерилност като се използва индуциращ се промотор за регулиране на екстресията на гена, критичен за мъжката фертилност, по начин, щото генът нормално е изключен и затова растението е стерилно. Когато промоторът се индуцира,

- 1 1 растението става плодоносно. В частност изобретението се отнася до контролиране на гена, засягащ продукцията на флавоноли в растението.

Сега е намерено, че растения, в които флавонон-3хидроксилазната (F3H) активност е била повредена така, че се предизвиква флавонолов дефицит са условно мъжки фертилни (CMF) и че мъжката фертилност може да бъде премахната или възстановена чрез осигуряване на условия, * при които поленът на растението може да контактува с възстановяващи фертилността флавоноли. F3H активността може да бъде увредена директно или индиректно, например чрез блокиране на F3H продукцията в растенията, чрез инактивиране естествено продуцираната F3H от растението или чрез увреждане на активността на ензима-предшественик като халкон синтаза (CHS) във флавоноловия биосинтезен път на развитие. Въпреки че при растения с F3H дефицит се произвежда жизнеспособен полен, поникването и растежът на тръбичката са силно редуцирани както in vivo, така и in vitro, * което води до растения, които са самостерилни. Все пак, чрез създаване на условия, при които поленът на растението може да контактува с възстановяващи фертилността флавоноли, пълното поникване на полена и растежа на тръбичката могат да бъдат възстановени. Подходящите условия за възстановяване на фертилността са всякакви условия, при които изискуемите флавоноли се осигуряват на достъп за полена на растението, включително например чрез отстраняване на условията за увреждане на F3H, възстановяване на F3H продукцията в растението и подобни. Алтернативно, фертилността на растенията може да се отстрани или възстанови чрез поставяне на полена на растението в контакт с количество феноли възстановяващо фертилността, ефективно да засили поникването и/или растежа на тръбичката на полена. Полезни възстановяващи фертилността флавоноли са съединения с обща формула *2

където Rp R₂, R3, R4, R5, R7 и Rg означават водород, хидроксилна или алкокси група с 1 до 3 въглеродни атоми. Особено предпочитаните флавоноли са галангин, кемпферол, изорамнетин, кверцетин и морин.

Кратко описание на чертежите

Горепосочените аспекти и много от постигнатите предимства на настоящото изобретение могат лесно да се оценят и да станат по-добре разбираеми при справка със следващото подробно описание като се имат предвид и придружаващите го фигури:

фигура 1 е схематично представяне на спорофитното влияние (диагонални линии) върху развитието на микроспори в халкон синтазни (CHS) хетерозиготни растения. Липсата на CHS функция в спорофита е посочена с бял фон (фиг.1А), а наличието на CHS функция е представена с чер фон (фиг.1В).

Фигурите 2А и 2В са фотографско представяне на in vitro поникването на полена от онаследена петуния V26 (фиг.2А) и дефицитно на CHS растение 02425.1, където поленът от прясно разпукани прашникови тръбички се суспендира в течна среда и се фотографира след растеж при стайна температура в пордължение на 6 часа. Правата черта на фиг.2А представлява 25 pm. Стрелките на фиг.2В показват поленови тръбички стремящи се да поникнат.

Фиг.З е фотографско хпедставяне на напречно сечение на идентични по развитието си прашникови тръбички от наследствена линия V26 от петуния (лява колона) и от дефицитно на CHS растение 02425.1 (дясна колона), които са събрани, фиксирани, закрепени, срязани напречно и оцветени с толуидиново синьо, както е описано в пример 3. Фиг.ЗА показва целите срезове и прашниците непосредствено преди разпукването, когато дефицитните на CHS прашникови торбички са жълтокафяви и свити. Правата черта на фиг.ЗА представлява 200 pm. Фиг.ЗВ показва пререз на прашникови торбички 48 часа преди разпукването, когато трансгенните прашници са издути и бели. Фиг. ЗС показва пререз на прашници както фиг. ЗА с увеличението както,..на фиг.ЗВ. Правата черта на фиг.ЗВ представя 50 pm. Фиг. 3D показва зрял полен в разпукване. На фиг.З, Р представлява полен, Е означава ендотеций, S означава стомиум и С означава кутикула.

Фигура 4 е фотографско представяне на възстановяването на поникването на полена и нарастването на тръбицата на дефицитния на CHS полен от петуния от възстановяващия фертилността флавонол кемпферол. Поленът се събира от условно мъжки фертилни прашници, суспендира се в среда за поникване и се прибавя кемпферол (К⁺'фиг.4С) или DMSO (К‘, фиг.4В) до крайна концентрация μΜ. Представителни поленови полета са нарисувани след 4 часа инкубация. Поникването и нарастването на тръбицата наблюдавани при CMF полени възстановени с кемпферол (фиг.4С) са неразличими от диворастящия тип V26 контрола (С, фиг.4А), която получава само DMSO. Недопълненият CMF полен (фиг.4В) показва набъбване в пората на поникването у някои зърна, но никакви тръбици не са изтеглени.

Фигура 5 е HPLC профил на метанолните екстракти от царевични коси от див тип V26 (фиг.5А) и CMF коси (фиг.5В). Абсорбцията при 360 nm на 100 μΐ аликвотни части от екстракти приготвени от 150 близълца и фракционирани в метанолно-воден градиент на колона Cjg с обърната фаза. Притурката на фиг.5А е UV спектър във видимата област на пика при 33,17 min и е идентичен на този получен от автентичен стандарт кемпферол. HPLC профилът и спектърът в UV/видима област на хидролизиран с киселина екстракт от близълца от V26 сочи, че главните пикове с време на задържане 7,43, 10,10, 13,46 и 1.6,65 са гликозиди на кемпферол и кверцетин.

Фигура 6 е графично представяне на честотата на поникване на полените като функция от нарастващите концентрации на флавонолов агликон, при които към средата на поникване (GM) се прибавят кемпферол (празни кръгчета), морин (запълнени кръгчета), мирицетин (празни триъгълници) и 3-хидроксифлавон (запълнени триъгълници) в посочените крайни концентрации и поникването се отчита след 4 часа инкубация. Средната честота на поникване измерена в три

	отделни експеримента се начертава със средна стандартна грешка (SEM). SEM стойностите < 1,4 не се виждат. Честотата на поникване на дивия тип контролен V26 полей типично е 75%, а на невъзстановения, третиран с DMSO CMF полен е между 1-2%. Описание на изобретението Включената тук литература е посочена за справка. Настоящото изобретение се отличава от обичайните
	подходи към мъжкия стерилитет при селекция на растения и производство на семена по това, че се използва индуциран промотор, за да се регулира експресията на ген, за който е известно, че е критичен за микроспорогенезата, т.е. образуването на полена.Първата стъпка в осъществяването на настоящото изобретение следователно е селекцията на ген, от който микроспорогенезата е зависима. Един от типовете гени, за който е намерено, че са критични за микроспорогенезата е този, засягащ продукцията на флавонол. Избраният ген се клонира, дава се възможност да действува нативният му промотор и измененият ген се
	включва в експериментална последователност с индуцируем промотор отговарящ на външен контрол. За предпочитане промоторът е такъв, че да отговаря при прилагане към растението на специфично, нефитотоксично химично вещество. Като се използва трансформация и генно заменяне, критичният ген се инактивира в генома на растението и се замества от гена получен с генно инженерство, включен в експресионната последователност с индуцициращ се промотор.

Изобретението е уникално с това, че индуцираният промотор се използва да възбуди фертилността, а не стерилността. Съгласно изобретението, избраните генни промоторни последователности са отстранени по такъв начин, че генът не се транскрибира и растението е мъжки стерилно. Когато се желае увеличение на мъжки стерилните растения, мъжката фертилност се възстановява като се индуцира експресия на критичния ген. В предпочитания вариант на ^w изпълнение това се постига чрез третиране на растящите мъжки стерилни растения със специфично нефитотоксично химическо средство.

Ще бъде оценено, че мъжки стерилитет може да се придаде по начин, когато критичният ген е изключен и е необходимо химическо средство за експресията, или по начин, когато критичният ген е включен и е необходимо химическо третиране, за да се придаде стерилност. Последният метод е описан в РСТ публикация WO89/0396 от Mariani и сътр. (базирана на Intl.Appl.№PCT/EP89/00495) включена тук за справка.

Възбуждането на индуциращия се промотор чрез химическо третиране ще зависи от различни фактори свързани със самото химическо третиране. Ако критичният ген е нормално включен, при инактивирането му с химическо третиране, третирането може да е неуспешно и резултатът е самоопрашване и произвеждане и продажба на по-скоро наследствени отколкото хибридни семена. Законите за семената, които управляват продажбата на хибридни семена изискват висока степен на чистота, такава, че процентът на семена, които не отговарят на хибридната спецификация трябва да се държи много нисък. Понеже едно царевично растение може да продуцира много повече от шест милиона поленови зърна, дори един ограничен неуспех в третирането може да има за резултат висок процент на самоопрашване. Поради тези основания настоящото изобретение се използва по такъв начин, че генът е нормално изключен и съответната характерна черта не се експресира, така че при нормални условия самоопрашване не може да настъпи. В допълнение, когато критичният ген е нормално изключен, химическото третиране не е необходимо при широкомащабна продукция на хибридни семена, така че химическото използване (и свързаните с него разходи) се свеждат до минимум и рискът от неуспех при третиране е налице само в грижливо контролирано мащабно лимитирано производство от родителски семена, където се желае самоопрашване. Тъй като неуспехът в третирането в такъв случай води до по-ниска продукция на полен и тъй като поленът нормално се свръхпродуцира в широки граници, методът съгласно настоящото изобретение може да повиши степента на неуспешно третиране от 70% до 80% с минимален ефект върху добива на наследствени семена.

Промишлена приложимост

Идентифициране на гени критични за мъжката фертилност

Процедурите за идентифициране и клониране на мъжки стерилен ген са същите като тези известни на специалистите, използвани за клониране на други гени. Предпочитан метод е свързване с транспозон (преносим елемент), тъй като повечето от примерите за генетична мъжка

- 18 стерилност при царевицата са резултат от възвратни генни мутации. Техниките на клониране, които изискват познаване на протеиновите последователности на продукта от транслацията на мъжки стерилен ген не могат да се използват понастоящем, тъй като генният продукт на мъжки стерилните гени не е известен.

Методът на свързване на царевични гени с преносими елементи е известен от обзора на H.P.Doring, Tagging Genes with Maize Transposable Elements, An OverviewMaydica 34, 1989; 73-88 и описан в САЩ патент № 4 732 856 на Fedoroff (Transposable Elements and Process for Using Same), описанието на които е включено тук изцяло.

Един от методите, по които се извършва това е чрез вътрешно кръстосване на царевичен щам носещ активни преносими елементи и доминантен алел на гена мишена включен в микроспорогенезата, с нормален щам, който не носи преносими елементи. Ефикасността на специфичното генно свързване може да бъде и за предпочитане се увеличава чрез поставяне на преносимия елемент в близост до локуса на гена мишена. Потомствата от вътрешните кръстоски се самоопрашват и след това се отсяват за най-полезни мутации. Предпочитаните фенотипове са растения, които не развиват прашници и тези, които не образуват полен. Най-предпочитани са фенотипове, които не развиват прашници, защото такъв фенотип лесно може да бъде отсят визуално непосредствено преди времето на опрашване при общо наблюдение. Тези мъжки стерилни растения представляват предполагаеми примери, при които преносим елемент е изрязан от неговото първоначално положение и е пренесен в локус носещ ген,

- 19 който е съществен за развитието на полена. След като преносимият елемент е преместен в такъв локус, генът се инактивира. Тогава той се държи като възвратен ген и в резултат се получава мъжка стерилност. Тези мутантни растения могат да се кръстосат с тестов щок за преносими елементи, за да се потвърди, че елементът е все още наличен.

След като се потвърди, че желаният преносим ** елемент е преместен в гена мишена, се конструират геномни клонове, които хибридизират с преносимия елемент. След това последователностите от клоновете съседни на елемента се използват като проби за хибридизация по Sauthern с геномна ДНК от щамове носещи мутантния алел, ревертивния алел и алела от дивия тип. Желаният видоизменен ген мишена се носи от гДНК, която разкрива очакваните разлики в размера (отразяващи присъствието или отсъствието на преносимия елемент).

На практика честотата, с която може да бъде нацелен специфичен локус с преносим елемент обикновено варира от 10$ до 10θ. Все пак 100 000 царевични растения лесно могат да бъдат отгледани на площ по-малко от 10 акра. Освен това при известни обстоятелства честотата на индуцирани с преносимия елемент мутации може да бъде увеличена. Например, специфичният преносим елемент, който ще се използва за генно свързване, може да бъде свързан с гена, предназначен за свързване с елемента. За две различни преносими елементни системи Ас и Spm/En, преместването на тези елементи настъпва с предпочитане в местата върху хромозома, където елементът е бил разположен преди

- 20 пренасянето. Алтернативно, различни преносими елементи имат различни честоти на възбуждане на мутация. Например, преносимият елемент наречен мутатор (Ми) е способен да индуцира нови мутации с честота 30 до 50 пъти по-висока отколкото честотата в контролните растения. Допълнително, скоростта на индуциране та мутация може да бъде повлияна от пола на носещия елемента родител. Докато не може да се предскаже коя от взаимните кръстоски ще даде по-висока ^w скорост на мутация, свързването на транспозона може лесно да бъде осъществено.

Досега са клонирани най-малко седем различни преносими елементи от чаревица. Те са Ac, Spm/En, Mu, Tz86, Bsl, Rdt и Mpil. Всеки един от тях може да бъде използван да се клонират гени, в които се намира преносимият елемент.

Специалистите от областта ще преценят, че това е само един пример за начи да се локализират такива гени и че са познати и други методи.

Една колекция от мутантни гени е вече добре известна и е описана от Albertsen и сътр., Developmental Cyt ology of 13 Genetic Male Sterile Loci in Maize, Can.J. Genet.Cytol., 23:195-208, 1981, включени тук за справка. Те са познати като мъжки стерилни (ms) гени. Тези гени засягат само развитието на полена и нямат ефект върху развитието на женския орган.

Тези гени прекъсват микроспорогенезата характерни стадии на поленовото развитие, като правят растението мъжки стерилно.

След като мутантен ген от някой от гореспоменатите източници е вече клониран, той се използва като проба за

- 21 клониране на див тип алел. Това е мъзможно, тъй като мутиралият ген е много близко подобен на алела от див тип и като такъв хибридизира с алела от дивия тип. След като нормалният ген се идентифицира и клонира, се идентифицира участъкът от гена познат като промоторен участък. Този участък се включва в началото на транскрипцията на този ген.

Гените, които са съществени за развитието на полена, също могат да бъдат идентифицирани, без междинно '·*» използване на мутации, посредством изолиране на тРНК-е, които се намират единствено докато се развива поленът, и конструиране с ДНК, която може да се използва да се създаде геномна банка за съответния ген.

Освен това, изненадващо е установено, че флавонол и по-специално някои флавоноли са критични за функцията на полена и че тяхното образуване или липсата им може да контролира фертилността и стерилността.

Растителната фертилност в дефицитните на флавоноиди, условно мъжки фертилни (CMF), растения се възстановява чрез поставяне на полена в контакт с ** възстановяващи фертилността флавоноли, ефективни да засилят поникването на полена на растението. В илюстриращ пример, подходящи условия могат да се получат чрез поставяне полена на растението в допир с количество от от възстановяващ фертилността флавонол, ефективно да засили поникването и растежа на тръбицата на полена в растението. Както се използват тук в описанието, изразите дефицитни на флавоноид, условно мъжки фертилно или CMF растение са предназначени за растения, в които халкон синтазната (CHS) или флавонон-3-хидроксилазната (F3H) активност е била увредена естествено или трансгенетично, така че да се прекъсне естественото продуциране на флавоноиди в растението. Съгласно това, дефицитните на флавоноиди, условно мъжки фертилни, растения ще бъдат типично пигментно-дефицитни, което води до бяло или бледо оцветяване и типично ще бъдат стерилни при самоопрашване. Въпреки че изобретението по-нататък се описва подробно във връзка с CMF петуния и царевица, по подобен начин други CMF растения могат да се използват за осъществяване на изобретението.

В естествения биосинтезен път за флавоноли, халкон синтазата (CHS) кондензира три молекули малонил-СоА и една молекула р-кумароил като се образува халкононарингенин, който се превръща в нарингенин спонтанно (с ниска скорост) и под действието на халкон флавонон изомераза (CHI). В следващия стадий на биосинтезата, F3H катализира присъединяването на хидроксилна група при въглерода на 3-то място в С-пръстена като се получава флавонол, който се изисква за възстановяващото фертилността действие-съгласно настоящото изобретение. Общият биосинтезен път може да се представи както следва:

СООН

I сн₂

I

CSCoA

I o

F3H е ограничаващ скоростта ензим при получаването на флавоноли и е клониран по-рано от Antirrhinum majus (Martin С., Prescott, A., Mackay, S.,Bartlett, J. and Vrijlandt, E., 1991, Control of Biosynthesis in Flowers of Antirrhinum majus, The Plant J., 1:37-39). Тъй като за мъжка фертилност се изискват флавонолови агликони, както е описано тук, при осъществяване н.а изобретението може да се използва индуциращ се промотор контролиращ активността на F3H хидроксилирането.

Увреждането на мъжката функция в растения, в които липсват флавоноиди като резултат на дефицит в CHS, CHI или F3H активностите не води до големи отклонения от нормата в развитието на полена непосредствено преди разпукването, когато морфологията на прашниците се отклонява от нормалната по цвета, формата и размера. При разпукването поленът остава на бучки в прашника и когато се

гледа под микроскоп значителна част от зърната в локуса изглеждат по-стеснени от нормалните. Въпреки че се произвежда жив полен и се разпръсква, поникването и нарастването на тръбицата на полена са силно увредени както in vivo така и in vitro. В допълнение, към функционалната мъжка стерилност, дефицитните на флавоноли растения показват някои аспекти на несъвместимост към самите себе си, както се доказва от факта, че поленът може да бъде частично възстановен от близълцата на див тип растения, но не и от близълцата на дефицитните на флавоноли растения.

Въпреки че елементите и на мъжка стерилност, и на самонесъвместимост са очевидни, характерните черти показвани от полена на дефицитните на флавонол растения ясно очертават уникалното състояние, което тук е наричано условно мъжка фертилност (CMF).

Растения, на които липсва CHS (и поради това им липсват флавоноиди)изглеждат нормални с изключение на две характеристики: 1) липса флавоноидно пигментиране и 2)произвеждане на увреден полен, който е изцяло зависим от диви пестици (близълце + плодник) с оглед на функцията.

Докато на CHS дефицитните растения липсва флавоноидна пигментация и увреждане на поленовата функция, между растителните видове са очевидни някои различия. Царевичният бял полен пониква върху копринката и образува поленова тръбица, чийто растеж спира в плодника. В допълнение, царевичният мутантен полен пониква in vitro и образува тръбица дълга приблизително колкото полена от дивия тип. Обратно, поленът CHF дефицитна петуния не прониква в близълцето и не образува тръбица както in vivo, така и in vitro. Тази разлика между царевицата и петунията може да бъде обяснена с физиологични различия между триклетъчния (царевица) и двуклетъчния (петуния) полен. Двукллетъчният полен има малка скорост на дишане когато се разпръсне, образува втората спермена клетка след разпръскването, може би върху близълцето, няколко часа преди поникването и има ниска скорост на растеж на поленовата тръбица. Триклетъчният полен, за сравнение, се подлага на второ митотично деление преди антезата, има висока дихателна скорост когато се разпръсква, пониква в продължение на на минути след допира с повърхността на близълцето и притежава висока първоначална скорост на нарастване. Понеже триклетъчният полен е устроен да се развива бързо след разпръскването, царевичният бял полен нараства до значителна дължина преди да задействува механизмът, който спира растежа на тръбицата.

При цъфтящите растения с алтернативни поколения, диплоидният спорофит образува хаплоидни спори, които нарастват и се делят митотично като образуват гаметофита. Част от жизнения цикъл на гаметофита се осъществява когато развиващата се поленова спора се намира в интимен контакт със заобикалящата я спорофитна тъкан. Това устройство притежава потенциала за диплоидно-хаплоидните взаимодействия. У хетерозиготните растения това взаимодействие включва също хаплоидно-хаплоидна комуникация между двата типа гаметофити както е представено на фиг.1. Фактът, че мъжката флавоноид-дефицитна стерилност у петунията описана тук е генетически доминантна, докато мъжката стерилност на царевичния бял полен е генетически възвратима води до интересно заключение относно това дали гаметофитът или спорофитът е отговорен за ефекта. При царевицата мъжката стерилност се изразява само в растения хомозиготно възвратими за двата CHS гени с2 и Whp. Хетерозиготите както с единично функционално копие на с2 или Whp образуват 100% жълти фертилни поленови зърна (Сое и сътр., 1981). Така в хетерозиготата или CHS позитивния спорофит или 50% CHS позитивните гаметофити повлияват ^w експресията на фертилността в CHS негативните гаметофити.

В трансгенната петуния, мъжката стерилност е свързана с доминантна характерна черта и поленът образуван от хетерозиготните растения е 100% мъжки стерилен. В този случай стерилността се причинява или от инхибиране на CHS позитивни гаметофити чрез CHS потиснати гаметофити или чрез CHS дефицит в трансгенния спорофит (фиг. 1). Физиологичната основа за CHS дефицитите причиняващи мъжката стерилност изглежда е същата и в царевицата и в петунията и в двата вида спорофитът е по-скоро този, който причинява стерилния фенотип, отколкото гаметофита. Следователно условната мъжка фертилност свързана с CHS дефицит при царевицата и петунията има обща физиологична основа.

Контролирането на фертилността посредством регулиране на образуването на флавонол е очевидно поради факта, че е намерена възможност да се използва получаването на условно стерилен полен от CHS дефицитни растения, за да се образува базата за опита in vitro да се възстанови поленът. Чрез инкубиране на трансгенен полен в разтвор за поникване допълнен с пречистени флавоноиди или растителни екстракти и анализиране за повишена честота на поникване и нарастване на поленовата тръбица, могат да се идентифицират специфични съединения за поленовата функция. По този начин е определено, че голямото семейство на флавоноидните съединения като цяло не е еднакво ефективно за възстановяване на фертилността при CMF растения, но поскоро специфична група възстановяващи фертилността флавонолови агликони е ефективна за такава цел.

Всеки флавонол, който е ефективен за възбуждане на поникването на полена в CMF растение може да бъде използван при осъществяване на изобретението. Намерено е обаче, че повечето от членовете на тази относително голяма фамилия флавоноиди са неефективни за тази цел. Особено ефективните възстановяващи фертилността флавоноли могат да бъдат идентифицирани и използвани за възстановяване на растителната фертилност при условията на CMF стерилност при самоопрашване. В едно предпочитано изпълнение на изобретението, флавонолът възстановяващ фертилността е съединение с формула

/* където Rp R₂, R3, R4, R5, R7 и Rg означават водород, хидроксилна или алкокси група с 1 до 3 въглеродни атоми. Особено предпочитани са, когато не повече от два R1-R5 са хидроксилна или метокси група и от R1-R5 са водород и Ry и Rg са водород, хидроксилна или метокси група. Понастоящем особено предпочитани представители възстановяващи фертилността флавонолови съединения съгласно изобретението са галангин, кемпферол, изорамнетин, кверцетин и морин, които притежават общата химическа структура дадена по-горе, със следните заместители:

ТАБЛИЦА 1

Флавонол	*1	*2	*3	r4	R5	R6
галангин	н	н	н	н	н	он	н
кемпферол	н	н	он	н	н	он	н
изорамнетин	н	оснз	он	н	н	он	н
кверцетин	н	он	он	н	н	он	н
морин	он	н	он	н	н	он	н

Други флавоноли полезни за осъщствяване на изобретението могат лесно да се определят като се използват методите за анализ in vitro възстановяване на полена изложени тук по-долу.

По-горе описаното може да се разбере по-добре като се имат предвид следващите примери, които са представени с цел илюстрация, а не за ограничение.

ПРИМЕР 1

Фертилност на дефицитна на халкон синтаза петуния Трансгенна и селекционирана V26 петуния се държат при 16/8 часов фотопериод в оранжерия снабдена с металхалидни лампи при интензитет 300-600 pmol m'^sec¹.

Поколението V26 е пигментирана линия от хибриди от Petunia, която може да продуцира флавоноиди в повечето растителни тъкани, включително полена, прашниците и филаментите и пестиците (близълца + плодник) и е напълно самосъвместима. Анализираният трансгенен материал се състои от двата независимо трансформирани регенеранти ** 218.38 и 218.41 (Napoli С., Lemieux С. and Jorgensen R., 1990,

S'

Introduction of a Chimeric Chaicone Synthase Gene Into

Petunia Results in Reversible Corepression of Homologous Genes In Trans, Plant Cell 2:279-289) и индивиди от вторите обратно кръстосани поколения (ВС2) спрямо родителската V26 линия (номера на популациите 2425 до 2435). Т-ДНК включването в тези трансформанти съдържа CHS сДНК секвенции сляти с вирусен промотор линкиран с неомицин фосфотрансфераза II ген като избираем маркер (Napoli и сътр.). Кръстосването се извършва чрез обезсилване на мъжките цветове 24 часа преди _? прилагането на полена. Всички трансгенни цветове използвани за кръстосване не показват видими признаци на пигмент.

Донорите на полен се селекционират от растения, които имат до 3 разпукващи се прашника или разрязани от закръглената част прашници преди разпукване, както е отбелязано.

Трансгенните петуниеви растения 218.38 и 218.41 са с чисто бели цветове след въвеждане на допълнително копие от CHS ген. Когато се изследва CHS експресията в трансгенните венчелистчета се открива 50-кратно индуциране в тРНК в сравнение с нетрансформирания V26 родител или соматични ревертанти при двата ендогенен и интродуциран CHS гени. V26 селекционираната линия произвежда пурпурни антоцианинови пигменти в листата, стъблата, стъбълцата, плодниците и нишките на плодниците и жълти халкони в развиващите се прашници. При сравнение, трансформираните растения нямат различими флавоноидни пигменти в никоя от тези тъкани. Липсата на видими пигменти се потвърждава чрез HPLC анализ на метанолните екстракти както е описано в пример б. Нормално, точно преди разпространението г

прашниците на петунията напълнени със зрели полени се подлагат на изсушаване. При разпукване, когато прашникът образува надлъжни разкъсвания по дължината на стомиума, обезводненото състояние на тъканта води до образуване на два ръба в прашниковата мека част, които се свързват един върху друг като показват поленовите зърна.

Непосредственото наблюдаване на непигментираните трансгенни растения показва, че в 48-те часа предхождащи разпукването прашниците се свиват средно с 40% по дължина и се променят от кремавобяло в жълтокафяво. При сравнение, прашниците на нетрансформираната родителска линия V26 се свива само 15% и не показва промяна в цвета, като остава жълта през целия този период. Широкото вариране на честотата, с която се разпукват прашниците настъпва в порядъка от 0 до 100% с по-висока честота свързана с понижена относителна влажност. Въпреки че разпукването може да бъде леко отложено, спрямо V26 родителя, CHS дефицитните прашници се отварят като излагат нормални количества полен, който не е така светъл и ронлив както V26 поленът и остава на бучки вътре в кутийката на прашника.

Не се получават никакви семена от многобройните опити за самоопрашване на дефицитното на флавоноиди поколение на 218.41 като се използва или: 1) полен от свити, жълтокафяви, разпукани прашници или 2)полен от разрязани от бели, закръглени прашници преди разпукване (виж таблица 2, колона 2, колона 5 трансгенни самокръстоски: 0 семена/семенник, Самокръстоски от V26 родителската линия дават средно 225 семена от семенник. Това представлява приблизително 17 000 възможни семена в 75-те трансгенни петуниеви самокръстоски, които са опитвани. Всички растения изброени в таблица 2 се изпитват за женска фертилност чрез опрашване на близълцата с полен от селекционираната линия V26. Във всички случаи семенниците се получават с нормално попълване със семена, което показва, че CHS-дефицитните растения са женски фертилни. Реципрочните кръстосвания, трансгенен, дефицитен на флавоноиди полен върху близълца от V26 води до продукция на различни количества от семена както е поксазано на таблица 2.

W tv*

ТАБЛИЦА 2

Продукция на семена от трансгенни поленови кръстоски

Брой на опрашванията

	V26	X трансгенен полен	Трансгенни
Полен	0	1-150	>1-150	самокръстоски
Родител	семена/	семена/	семена/	0 семена/
	семенник	семенник	семенник	семенник
02415.1*	0	2	0	8
02420.5	0	5	3	6
02430.6	2	1	0	6
02430.8	ND	ND	ND	6
02432.2	ND	ND	ND	6
02435.1	0	1	1	6
02435.2	1	4	1	8
02435.3	0	1	1	7
J2425.1*	0	1	0	1
J2428.1	ND	ND	ND	6
J2431.2	2	3	0	6
J2432.3*	3	0	0	7
J2430.5*	3	2	0	2

‘Цветовете върху друго разклонение на същото растение имат пурпурен пигмент на венчето.

* Най-малко 4 цвята от всяко от изброените растения са опрашени с V26 полен и всички дават пълни със семена семенници.

Среден брой /семенник = 225.

От 37 кръстоски, включващи 10 разбични трансгенни растения, 11 не дават никакви семена, 20 образуват

- 33 семенници с по-малко от 150 семена/семенник и 6 образуват семенници с повече от 150 семена за семенник. Това дава средно приблизително 60 семена за семенник или 70% намаляване на образуването на семена. Тези резултати показват, че докато поленът от дефицитните на флавоноиди растения е нефункционален, върху дефицитни на фловоноиди близълца от див тип, състояние, което тук се дефинира като условна мъжка фертилност (CMF) . Голямото вариране в броя на семената образувани за едно опрашване при тези външни кръстоски е възможно благодарение на фактори от околната среда и/или развитието.

Не е вероятно CMF да се дължи на вмъкване на ТДНК в гена изискващ се за мъжка фертилност, тъй като две независими трансформанти, 218.38 и 218.41, и двете показват еднакви характеристики: пълно отсъствие на флавоноидна пигментация и идентични доминантни мъжки стерилни фенотипове. Допълнително доказателство за това заключение идва от наблюденията на Napoli и сътр. (1990), че трансформираните регенерати понякога се връщат соматично до силно оцветени растения, но запазват трансгена, което показва, че присъствието само на трансген, не подтиска ендогенната CHS експресия.

Като се използва подобието с белия полен при царевицата, CMF при петунията изглеждда се причинява от дефицит на флавоноидите такъв както е причинен от потискането на CHS или F3H гената експресия.

ПРИМЕР 2

Поникване на полена и нарастване на тръбицата In vitro поникване се извършва с прясно събран полен в опростена среда на Brewbakers, както е описано в Mulcahy GB и Mulcahy DL, 1988, The Effect of Supplemented Media on the Growth in vitro of Bi- and Trinucleate Pollen, Plant Science 55:213-216 (тук понякога наричана среда за поникване или GM). Полен от един прашник се поставя в микротитърни ямки с 50 μΐ среда, разклаща се при стайна температура в продължение на 6 до 8 часа и се фотографира с Kodak technical рап филм.

In vitro растежът на поленовата тръбица се измерва 48 часа след опрашването както е описано от Herrero М. и Dickinson H.G.q 1979, Pollen-pistil Incompatibility in Petunia Hybrids: Changes in the Pistile Following Compatible and Incompatible Intranspecific Crosses, J.Cell Sci., 36:1-18. Калозни струпвания се откриват посредством епифлуоресценция породена от възбуждане при 355-425 nm (D кювета) и потискане дължината на вълната при 460 nm от Leitz Aristoplan. Образците се фотографират с Ektrachrome Т 160 филм и снимките се правят от вътрешен негатив.

Изменяемостта на полена се определя с флуорохроматична процедура (FCR) (Heslop-Harrison J. и Heslop-Harrison Υ. 1970, Evaluation of Pollen Viability by Enzymatically Induced Fluorescence, Intracelular Hydrolysis of Fluorescein Diacetate, Stain Technol 45:115-120) посредством инкубиране на прясно разпукан полен в разтвор откарбоксифлуоресцеин ацетат (1 тМ) в среда за поникване.

Епифлуоресценцията се проявява както е описано по-горе.

Образуване на калоза

Поленовите тръбици от

Petunia нормално поникват в близълцето около един час след проникването (Herrero и

Dickinson 1980) инарастват надолу през тъканта на плодника, за да оставят двете спермени клетки в ембрионалната тръбичка. Калозата е полизахарид полимерно свързан в β(1,3) гликозидни връзки и бучки от този материал нормално се отлагат на равни интервали по дължината на нарастващата поленова тръбица. Калозата се визуализира посредством нейната отличителна флуоресценция след оцветяване с обезцветено анилиново синьо (Currier 1957, Eschrich and Currier 1964). Поникването и растежът на поленовите тръбици се изследват при самокръстоски на CHS дефицитни цветове и обратно кръстосване на същите растения с V26 полен. Пестиците се събират 48 часа след опрашването, оцветяват се с обезцветено анилиново синьо и се изследват чрез флуоресцентна микроскопия. Правилни образци от калозни отложения се наблюдават по целия път надолу по стълбчето, в пестици дефицитни на флавоноиди, опрашени с V26. От друга страна, в пестиците на самоопрашена петуния не се вижда никаква калоза, въпреки че изобилни количества полен се намират в близълцата.

Морфология на полена и поникване

Извършва се микроскопско изследване на прясно разпръснат полен от растения^дефицитни на флавоноиди съгласно пример 1₇и не се откриват груби отклонения от нормата. Поленът на петунията лесно пониква и образува тръбица, когато се инкубира в проста течна среда. Покълналият полен от всяка от ВС2 фамилиите (2425 до 2435) се сравнява с полен V26 in vivo. Типичен представител е показан на фиг.2. Както се вижда, след 6 часа растеж много мутантни поленови зърна са се опитали да поникнат?както е отбелязано от изразеното набъбване около една от порите на поникване (стрелките, фиг.2), но най-много 2% от поленовите зърна от дефицитните на CHS растения образуват тръбица от всяка дължина. От поленовите зърна, които образуват измерими тръбици, дължината е по-малка от 20% от дължината на V26 поленовите тръбици^отгледани при идентични условия.

За да се определи дали поленът?продуциран и разпръснат от дефицитните на флавоноиди растения^е жизнеспособен и следователно способен за поникване и нарастване на поленовата тръбица, се провежда флуорохроматичен анализ (FCR) за жизненост върху прясно разпръснат трансгенен и V26 полен. Този тест зависи от поглъщането на флуоресцеин диацетат от поленовото зърно с последващо превръщане във флуоресцеин от вътрешноклетъчни ензими е високополярен и остава отделен, най-вероятно във вегетативната клетъчна цитоплазма, където се прави видим посредством флуоресцентна микроскопия. Селекционираният V26 полен се състои от голяма част (до 40%) от ненормално малки FCR негативни зърна, на които изцяло им липсват всякакви вътрешни характеристики. Няколко зърна от този тип могат да се видят на фиг.2А, включително две = центъра на снимката. Тази популация никога не пониква и най-вероятно са безплодни зърна. От останалите зърна (60%) почти всички показват положителен FCR тест^псказващ наличието на интактни плазмени мембрани и активни цитоплазмени естерази.

Поленът от мутантните прашници задържа голямата част от свити безплодни зърна. От останалите нормално изглеждащи зърна повече от 90% са FCR позитивни. Фактът, че повечето

е жизнеспособен и метаболитно активен, показваме се изисква известна флавоноидна активност за нормално поникване на полена и растежа на поленовата тръбица.

ПРИМЕР 3 .

Микроскопски наблюдения на развитието на прашниците

За да се определи дали липсата на флавоноидна активност през време на микроспорогенезата променя клетъчното устройство на развиващите се поленови зърна или прашниковите тъкани, се сравняват развитието на полена в V26 идефицитно на флавоноиди растение 02425.1. Прашници от серии пъпки от петуния,подредени по стадии на развитие в дължина от порядъка на 0,1 до 6 cm,се събират, фиксират се в 2% параформалдехид, 1,25% глутералдехид в тръбички, pH 7,2, обвити в смолана Spurr и 1цт прерези се оцветяват с толуидиново синьо. Снимките се правят Kodak technical pan филм. Хистологически това представлява всички етапи на микроспорогенеза, от най-ранното доказване на археспориалната тъканна диференциация до прашници пред разпукване^изпълнени със зрял полен. Особено внимание се отделя на развитието и последващото разпадане на тапетума, тъй като тази тъкан се счита, че е източника на поленовите флавоноиди. Във всички стадии трансгенният прашник и развиващите се микроорганизми не показват груби хистологични различия, когато се сравняват с V26. Допълнителни прерези се правят от дефицитни на флавоноиди прашници при преминаване през стадиите на плътни, бели до свити жълтокафяви и се сравняват с подобните стадии при V26 (фиг. 3). Преди разпукването клетките на ендотелния слой нормално се разширяват радиално, задебеляват и отделят материал, за който се счита, че участвува в механизма на разкъсването на прашника (Cutter, E.G., 1978”Plant Anatomy: Experimentation and Interpretation, Part I, Cells and Tissues, 2nd Ed., London: Arnold). Този слой не е непрекъснат, отсъствува в областта^ заобикаляща стомиума. Пререзите на свитите, жълтокафяви прашници не показва груби отклонения от нормалното в ендотелния слой, стомиума или кутикулата^заобикаляща прашника. Все пак, когато се сравнят с V26 полен (фиг. 3, колона V26”), по-голяма част от свити зърна^лишени от вътрешни характеристиките откриват в локулите на трансгенните растения и големите зърна изглеждат по-хетерогенни по размер, форма и реакция на оцветяване (фиг.ЗС и 3D). Хетерогенността*показана на фигурите ЗС и Зй^може да бъде обяснена с факта, че поленът нормално се разпръсква във високо дехидратирано състояние и претърпява бързо повторна хидратация върху близълцето. Дефицитният на флавоноиди полен може да се разпръсне в по-дехидратирано състояние от нормалния и когато се постави в течна среда за поникване изглеждаме се хидратира повторно до нормалния си вид.

ПРИМЕР 4,

Флавоноидни екстракти от петуния

При анализ на екстракти от полен на петуния са идентифицирани главните флавоноиди като З-О-гликозиди на кверцетин и кемпферол, 4,2',4',6'-тетрахидроксихалкон и един дихидрофлавонол, таксифолин (Zerback, R.,Bokel,M.,Gieger,H. and Hess.D., 1989, Phytochemistry 28:897-899; Zerback,R., Dressier,K. and Hess,D. 1989, Plant Science 62:83-91; De Vlaming.P. and Kooh.K.F.F., 1976, Phytochemistry 15:348-349).

Царевичният полен съдържа най-малко 10 гликозида на кемпферола, кверцетина и изорамнетина (Ceska.O. and Styles,Е.D., Phytochemistry 23:1822-1823). Водни екстракти както от дивия тип, така и от селекционираната линия от петуния V26 се приготвят чрез мацериране на близълца с пинцета и завихряне на поленовата суспензия в среда от PEG 4000 (W.Jahnen,W.M. Lush,А.Е.Clarke, 1989, Plant Cell 1:501), наричана тук GM, центрофугиране 5 минути в микроцентрофуга и прилагане на аликвотни части от супернатантата директно към CMF поленова суспензия в GM в микротитърно блюдо с 96 ямки. Метанолната екстракция следва същия протокол с изключение на това, че екстрактът се изсушава под вакуум и отново се суспендира в GM преди прибавянето към поленовата суспензия. Първоначалният спасителен експеримент предизвиква 33% степен на поникване, като се използва 20μ1 (една пета от общия обем) воден екстракт приготвен от Len V26 близълца. За контролните проби екстрактите се приготвят по подобен начин от близълца и полен от CMF растения. При опитите за поникване на полена само екстрактите от V26 близълца и полен са способнигда възстановят поникването и растежа на тръбицата при дефицитния на флавоноиди полен.

Екстрактите от дивия тип CMF полен и близълца се анализират както следва Близълцата и поленът се екстрахират първо с 50% метанол и след това с 100% метанол и екстрактите се обединяват и концентрират. Агликоните се получават чрез киселинна хидролиза: екстрактът се смесва об/об с 4N НС1, заварява се в 2 ml ампула и се хидролизира в кипяща водна баня в продължение на 40 минути. Дублирани проби се инжектират в колона Cjg с обърнати фази (Phenomenex Spherioorb S ODS 2 250 x 4,6 mm). Разтворителят А е 5%-на оцетна киселина, а разтворителят В се състои от 5%-на оцетна киселина в 80% ацетонитрил. Всяко пускане в действие се състои от 6 минути изократен градиент (20% В) и след това 20 минути линеен градиент до 90% В и завършва изократно при 95% В за 14 минути. Скоростта на изтичане на разтворителя е 0,5 ml/минута при стайна температура. Проявяването е при 360 nm с детектор Helwett Packard Moodel 1040А фотодиодна система. Кемпферол се открива в екстракти от близълца от дивия тип при 60 ng близълца, а кверцетин при при съществено по-ниска концентрация. Идентични екстракти от обединените фракции от 150 CMF близълца или от 500 CMF прашници не дава пикове характерни за типичен флавонолов спектър.

Обработването на екстракт от близълца от див тип с ензими за смилане на протеин, нагряване и пропускане през мембрани за определяне на молекулния размер посочва, че активното съединение е малка непротеинова молекула. Молекулното тегло на активното съединение се определя чрез прекарване на екстракта през филтър за молекулно тегло до 3000 далтона-. Водните екстракти от V26 близълца и полен се обработват с 0,025 единици папаин в продължение на 30 минути при 37°С в реакционене обем 100μ1. Ензимната активност се проверява чрез обработване на BSA (0,5 mg/ml) при същите условия и чрез изследване на продуктите от смилането чрез електрофореза SDS-полиакриламиден гел (PAGE). Нито протезата, нито топлинното третиране (100°С, 5 минути) елиминират способността на екстрактите да възста41 (

новят поникването на CMF и нарастването на тръбицата.

Заедно, тези резултати показват, че флавоноидите намиращи се в полена от дивия тип играят роля за поникването на полена и че близълцата от дивия тип съдържат подобни съединения, които могат да компенсират липсата на флавоноиди в CMF полена.

ПРИМЕР 5

Възстановяване с флавоноли на CMF фертилността Биохимичното допълване на дефицитен на флавоноиди полен от пример 1 се постига като се прибави кемпферол с ниска концентрация ( ΙμΜ), флавонолов агликон, към суспензия от CMF полен в среда за поникване (GM). Както е показано на фиг.4 сравненията направени в продължение на 12 часа растежен период потвърждава, че поникването е иницирано едновременно и че нарастването на тръбицата протича със същата скорост и до същата степен във възстановения CMF полен (К + ) сравнен с дивия тип V26 полен, който не получава никаква прибавка на флавонол (С). Възстановяването е почти пълно. Поленът допълнен с флавоноид паказва 80% чес-тота на поникване относно V26 полен. CMF полен към който се прибавя само разтворител DMSO (К‘) не показва значимо поникване (1-2%) и поленовите тръбици ако изобщо са поникнали не нарастват повече от диаметъра на 2 поленови зърна.

За да се потвърди, че екстракти от див тип стълбчета и близълца, които са способни да възстановят поникването на полена и нарастването на тръбицата съдържат кемпферол, нехидролизиран екстракт се фракционира посредством HPLC и се анализира чрез абсорбционна спектроскопия в UV/видимата област. Открива се пик с време на задържане и спектри типични за флавонол (абсорбционни максимуми около 260 и 360 nm) в екстракта от V26 близълца (фиг.5А и притурката). Този предпобагаем кемпферолов пик се събира, изпарява до сухо, суспендира се отново в DMSO и се прибавя към in vitro GM среди, където той предизвиква пълно поникване и нарастване на тръбицата от CMF полен. Повторна хроматография на тази активна фракция с автентичен стандартен кемпферол потвържддава неговата чистота и идентичност. От този анализ на 150 близълца, количеството на кемпферола в V26 близълца се изчислява на 60 mg/близълце. Като се приеме че обемът на едно близълце е 34 μΐ (изместване на обем), концентрацията на флавонола в V26 близълца е около 6 μΜ, ниво, което е способно да предизвика силен отговор на поникване. Идентичен анализ на обединени 150 CMF близълца или от 500 CMF прашници не дават пикове типични за флавоноидните спектри (виж. фиг.5В). Екстракти от V26 полен и прашници дават хроматограми подобни на тази показана на фиг. 5 и елуиращ се пик с време на задържане и UV/видима област спектър, характерени за кемпферол и когато се прибавят към CMF в GM напълно стимулират поникването на полена. Този анализ потвърждава, че кемпферолът се намира в полен и прашници от див тип.

Структурни характеристики изисквани за възстановяване активността на полена

Екстракти от близълца и полен от див тип петуния съдържа други съединения освен кемпферол, които също могат да стимулират поникването на полена и нарастването на тръбицата (виж фиг.5А). Следователно изпитвани са представители от всички главни класове флавоноидни съединения: флавони, флавонони,флавоноли, изофлавоноиди, халкони, антоцианини и катехини, за възстановяване активността на полена както следва. Поленови зърна от петуния се среда за поникване (GM) при суспендират в PEG 4000 плътност 1-2 х 10^/ml и 100 μΐ аликвотни части от суспензията се поставят в ямките на микротитърно блюдо с 96 ямки и се инокулират при стайна температура, с разбъркване 150 об/мин. Всяка добавка се слага директно към GM преди прибавянето на полена. Серия разтвори на флавоноиди и други химични вещества се приготвят директно в диметилсулфоксид (DMSO) и се прибавят към всяка ямка до крайните концентрации посочени в следващата таблица 4. Концентрацията на DMSO се поддържа постоянна във всеки опит при 1%. Полинът се смята поникнал, когато тръбицата е дълга повече от диаметъра на 1 поленово зърно. Практически всички зърна, които поникват продължават да образуват тръбица по-дълга от диаметъра на 5 поленови зърна. Петуния

- V26 както е описано в пример 1, образува два типа зрял полен, около 25% от зърната са малки, без вътрешни характеристики и никога не поникват in vitro. Следователно, пълно поникване при V26 настъпва когато 75% от всички поленови зърна са поникнали. CMF поленът от петуния поддържа същото това съотношение. В повечето от експериментите за поникване максималната честота на поникване е 89% от жизнеспособните зърна. След 4 часа инкубация, минимум 1000 поленови зърна се отчитат при всеки опит. Най-ниската концентрация от изпитваните

Г съединения изисквана, за да се получи отговор на поникване е установена на следващата таблица 3, където NR е липса на отговор. Съединения, които причиняват <20% поникване при 100 μΜ се посочват като >100 μΜ. Допълнително изброените нефлаавоноидни съединения в таблица 3 , р-кумарова киселина, салицилова киселина, хидрохинон, хлорогенова киселина, дихидроаскорбинова киселина, нафтилфталамова киселина (NPA), 1-нафталеноцетна киселина (NAP), индол-3оцетна киселина (ΙΑΑ) и гиберилинова киселина (GA3), също са изпитвани, но не предизвикват никакъв отговор.

Съединение

Флавоноли

Галангин

Кемпферол

Изорамнетин Кверцетин ’’•w*

Морин

Мирицетин физетин

3-хидроксифлавон

Дихидрофлавоноли

Таксифолин

Флавони флавон

7-хидроксифлавон

Апигенин

ТАБЛИЦА 3

Концентрация за отговор (μΜ)

100

100 >100 >100

NR

NR

NR

	ТАБ ЛИЦА 3 (продължение)
Лутеолин	NR
Флавонони
Флавонон	NR
Нарингенин	NR
Ериодиктиол	NR

Както може да се види от таблица 3, агликононовите флавоноли успешно възстановяват максималната честота на поникване и способността на нарастване на тръбицата на CMF полен, но между класовете флавоноиди само близкородственият дихидрофлавонол, таксифолин, предизвиква скромен (—18%) отговор при ΙΟΟμΜ (фиг.4). Освен това са изпитани няколко класа нефлавоноидни съединения включително фенолни киселини, антиоксиданти и растителни растежни регулатори, но никой от тях не е способен да възстанови поникването на полена. Следователно, способността да възстановяват поленовата функция пр ифизиологично „ подходящи концентрации изглежда че принадлежи на флавонолите. От редицата изпитани флавоноиди са идентифицирани пет общи структурни изисквания за поникването на полена и нарастване на тръбицата. Абсолютни са изискванията за незаместена хидроксилна група при въглерода на 3то място и за кетогрупа в положение 4 в С пръстена. Максималният отговор зависи от ненаситената връзка между въглеродите 2 и 3 в С пръстена и степента на заместване с хиддроксилна група в пръстена А и В. По-интересно е, че флавоноли гликозилирани при хиддроксилната група на 3-то място са неактивни, макар че те положително са найг

- 46 изобилната форма на флавоноли намерени в растителни тъкани, включително полен и близълца от петуния. Не се получава никакво поникване на полена, когато се изпитват кверцетин-З-О-гликозид и рутин (кверцетин-З-О-рамногликозид) при концентрации до 100 μΜ. Изискването за кето група в положение 4 в пръстена С, произлиза от факта, че у катехина, който няма кето група липсва активност. Сравнение на относителната активност на таксифолин (—18% при ΙΟΟμΜ) и кверцетина (~50% при ΙΟμΜ) показват, че двойна връзка между въглеродите 2 и 3 в пръстена С увеличава отговора с около 30 пъти. Сравнение на кверцетин с физетин или 3хидроксифлавон показва, чевсяка допълнителна хидроксилна група било на 5 или 7 място на пръстена А увеличава отговора приблизително 10 пъти. Това увеличение може да зависи много от стабилизиращия ефект на взаимодействието между 5-хидроксилната група и съседната кетогрупа в пръстена С. Накрая, хидроксилните заместители в пръстена В не са необходими за пълна активност и фактически увеличението на броя на групите причинява намаление на * активността (сравни кемпферол с кверцетин и мирицетин). ...

Тази разлика може да се дължи на слабо поемане или увеличение на неспецифичното свързване причинено от пополярната природа на флавонолите с многобройни хидроксилни групи.

За някои неактивни флавоноиди е съобщено, че антагонизират активността на флавоноидната индукция на гените на възлообразуване в зеленчуковата система Rhizobium (Dj or ^dj evic, M.A.,Redmond, J.W., Batley,M. and Roolte.B.G·, 1987, EMBO 6:1 173-1179, Peters, N.K. and Long, S.K., 1988,

Г

Plant Physiology 88:396-400). Съединенията, които са неактивни за възстановяване на половата функция са изследвани за способността им да антагонизират действието на флавоноловите агликони както следва. CMF полен, както е описан в пример 1, в GM се излага на действието на неактивни съединения при концентрации от 1 до 10 μΜ в продължение на 30 минути преди прибавянето на кемпферол до 1 μΜ. Експериментът се извършва също при едновременно прибавяне към поленовата суспензия на неактивното съединение и на кемпферол в съотношение 1:1 или 10:1.

Честотата на поникване на полена се изчислява след 4 часа инкубация и не се открива никакво антагонизиращо действие в никоя от изпитваните комбинации. Анализирани са следните неактивни съединения: апигенин, халкон, ериодиктиол, флавон, флавонон, лутеолин, нарингенин, катехин, хлорогенова киселина, р-кумарова киселина, хидрохинон и салицилова киселина.

ПРИМЕР 6

УВ ефекти Отчасти поради способността им да абсорбират УВ светлина, за флавоноидите се допуска, че действуват като УВ протектори в растенията (W.Jahnen and K.Hahlbrooch, 1988, Planta 173:453 и рефератите). За да се прецени дали липсата на поникване при дефицитния на флавоноиди полен се дължи на УВ ефекти се провеждат експерименти за поникване на тъмно в три вариации. Събира се полен от (1) цветове, които са събирани и съхранявани (във вода) при пълна тъмнина в проддължение на 24 часа и (2) прясно набрани цветове. От тези два източника се приготвят поленови суспензии в GM с или без флавоноли, в тъмна стая ато се използва червена безопасна светлина. Третият вариант включва приготвяне на поленовата суспензия от прясно набраните цветове на светло, но като се прибавя флавоноловият разтвор на тъмно. Всички проби се обвиват в станиол и се инкубират както е описано в пример 5. Няма откриваем ефект на светлината върху честотата на поникване било за V26 контролата или за дефицитния на флавоноиди полен, със или без добавяне на флавоноли.

фь. ,|ί

За да се определи дали УВ светлината засяга самооплождането, зрели растения се отглеждат в продължение на няколко седмици под 610 nm филтър петуниеви растения както е описано от L.P. Tayloor and W.R. Bridds, 1990 Plant Cell 2:115. Оформянето и узряването на пъпките на петунията отнема 2 седмици и поради това само тези пъпки, които се образуват след като растенията се поставят под филтъра и по такъв начин не се излагат на светлина под 610 nm, се изследват за самооплождане. Никакви семена не се образуват в която и да е от кръстоските на 910 опита, но всички V26 ** самокръстосани контроли обработени при същите условия образуват пълни семенни гнезда.

ПРИМЕР 7

Ефект на времето на излагане на въздействие на флавонол

Количеството на флавоноид необходимо за пълно поникване и максимален растеж на тръбицата се определя чрез вариране на времето за поникване на полена в присъствие на флавонол. Кемпферол с концентрация изчислена да осигурява възстановяване близо до максималното, все още лесно отстранима чрез промиване (0,5 μΜ , крайна), се прибавя към петриево блюдо с размери 60 х 15 mm съдържащо суспензия от дефицитен на флавоноид полен в GM и получената суспензия се върти продължително при 150 об/мин. Във времената, посочени в таблица 4 се вземат по 400 μΐ аликвотни части, центрофугират се, промиват се с 1 ml GM, за да се отстрани кемпферолът, центрофугират се отново, повторно се суспендират в 400 μΐ GM и се разделят на две части. Една 150 μΐ аликвотна част отново се допълва до 0,5 μΜ кемпферол (контрола), а другата част се оставя растежът да продължи без допълнително третиране с флавонол. Оставя се растежът да продължи до пълно изтичане на 4-те часа от приготвяне на първоначалната суспензия, след това се изчислява честотата на поникване и дължината на тръбицата и в третираните и в контролните пониквания. Резултатите са показани на следващата таблица 4.

ТАБЛИЦА 4

Третиран полен Контрола

Време на излагане	Растеж	Дължина	Растеж
на въздействие	(%)*	на тръби-	(%)*
(мин)		цата**
0	3,5+ 1,5	2х	48,3 + /-2,5
10	6,6 + /-2,7	2х	55,5 + /-8,6
20	15,7 + /-9,2	2-Зх	47,9 + /-7,0
30	13,8 + /-1,7	2-Зх	44,4 + /-3,7
60	38,9 + /-2,9	Зх	48,4 + / -1,3
120	47,3 + /-3,6	>5х	47,7 + /-2,2

* означава + /-SEM, η = 3 “спрямо диаметъра на поленовите зърна

Както се вижда от таблица 4, измеримо увеличение на поникването се открива при време на излагане на въздействие повече от 10 минути (таблица 1). Време на излагане на въздействие между 1 до 2 часа се изисква за максимална честота на поникване и дължина на тръбицата.

ПРИМЕР 8

In vivo възстановяване на фертилността Способността да се възстановява самооплождането при CMF петуния чрез прибавяне на флавоноловия агликон към полена по време на опрашването се изпитва чрез отчитане на успешните оплождания в резултат на самокръстоски от CMF петуния направени в присъствието на добавени флавоноли. Непосредствено преди опрашването флавоноловите аггликони се прилагат или (1) директно към близълцето или (2) смесени с прясно събран полен. Найуспешната техника, измерена по количеството на образуваните семена изисква прилагане на флавонола към близълцето 12-16 часа преди самоопрашването. 47 самокръстосвания се извършват с прибавени кемпферол или кверцетин и почти 60% (27 от 47) образуват семенници. Броят на семената в семенниците варира от 31 до 287 и в теста за поникване >90% от семената във всеки семенник са жизнеспособни. Всички самостоятелни кръстоски извършени без добавени флавоноли (>30 опита) не дават никакво семеобразуване.

Доминантната CMF характеристика показана от дефицитна на флавоноид петуния е тясно свързана с втори доминантен ген придаващ резистентност към канамицин (KAN) (Napoli, С., Lemieux, С. and Jorgensen, R., 1990,

Introduction to a Chimeric Chaicone Synthase Gene Into Petunia Results in Reversible Co-repression of Homologous Genes in Trans, Plant Cell 2:279-289). KAN маркерът се използва за тестуване сегрегацията на CMF характеристиките на семена образувани чрез самокръстосване на дефицитни на флавоноид растения в присъствие на прибавен флавонол. Прясно събрани семена се стерилизират повърхностно в 20% избелващ разтвор, промиват се със стерилна вода и се всмукват за 30 минути в 100 ppm GA3 разтвор преди да се нанесат на плаки за поникване (lxMS, 3mM MES [pH 5,6), 1хВ5 витаминна смес, 3% захароза и 0,2% втвърдяващо средство) съдържащи 100 pg/ml канамицин. След растеж при 23°С и след това 16/8 часа фотопериод, резистентността към канамицина се отчита чрез отсяване на семената чувствителни към канамицин. В следващата таблица 5 Рстойностите представляват наблюдаваното ниво на значения за една степен на свобода при тест chi-square goodnes-of-fit.

ТАБЛИЦА 5

Разходи

Семенник	Общо	ΚΑΝ	ΚΑΝ	Ρ (3:1)
1	75	58	17	0,74
2	65	50	15	0,83
3	81	59	22	0,75

Семена поникнали в присъствието на 100 pg/ml канамицин се отделят в съотношение 3:1 по ΚΑΝ резистентност: чувствителни както се очаква за хетерозиготно доминантна характеристика, както е посочено на таблица 5.

ПРИМЕР 9

Полски опит

Полски опит се провежда като се използва природно срещан дефицитен на флавоноид царевичен мутант, бял полен с дефектна флавоноидна активност, който произвежда бял, нефункционален полен и е стерилен при самоопрашване (Е.Н.Соое, S.M.McCormick,S. A.Moodena, 1981, J.Hered. 72:318). Направени са общо 45 самостоятелни кръстоски в присъствие на прибавени флавоноиди и всички от тях (100%) образуват пълни класове, докато самокръстоски (45 опита) направени без прибавени флавоноиди, показват образуване на семена по-малко от 1% от нормалното. Използваните царевични растения с бял полен имат стабилни рецесивни мутации при С2 и Whp. Растенията с бял полен (с2/с2 Whp/Whp) се поддържат чрез кръстосване с полен от изогенни растения носещи единично функционално копие от CHS (С2/С2 Whp/Whp).Растенията са мъжки стерилни при самостоятелни и родствени кръстоски и не произвеждат видими флавоноидни пигменти в никоя тъкан включително полена и семената.Използват се стандартни генетични полски практики да не се допусне онечистващ полен до копринките на растенията с бял полен. Освен това блокът с белия полен се заобикаля с вариетет с пигментирано ядро по такъв начин, че всички контаминиращи ядра да се разпознават веднага. Мутантен бял полен от 50-100 растения се събират от метлиците в торбичките и се разделя на две части. Едната част се използва такава каквато е за кръстоски, аь другата се смесва в съотвошеение приблизително 20:1 суха флавоноина субстанция (кверцетин или кемпферол или смес от двете).Приготвени копринки с бял полен се опрашват с нетретиран или с допълнен с флавоноиди бял полен и се пъхат незабавно в торбичките. Зрелитее класове се събират 45 дни следд опрашването. Кръстоските с бял полен обикновено образуват -200 ядра за клас и това число се получава рутинно в биохимически допълнените самокръстоски. Общо 45 самостоятелни кръстоски се извършват в присъствието на добавени флавоноли и всички те (100%) образуват изцяло напълнени кочани, докато самокръстоските (45 опита) направени без добавяне на флавоноли показват образувани семена по-малко от 1% от нормалното.

Горните еексперименти потвърждават, че флавоноидите се изискват за поленовата функция както следва: (1) метанолов и воден екстракти от див тип близълца и полен могат напълно да възстановят поникването и растежа на тръбицата при при дефицитен на флавоноид полен, (2) тези екстракти съдържат същите флавоноли, които показват активност при опити за възстановяване на фертилността in vitro описани тук, (3) способността да възстановяват поникването на полените и да възстановяваат пълното нарастване на тръбицатаа in vitro и пълните семена in vivo е ограничена до специфичните флавоноиди, флавоноидинте агликони, (4) ефективната концентрация на флавонола варира в зависимост от структурните характеристики, но няколко съединения показват изразен ефект при концентрации по-малки от ΙΟμΜ, което е в гграниците на физиологичните концентрации на тези растения.

wФлавоноидди се продуцират в действителност от всички класове радстения, от лишеи, мъхове и папрати до голосеменни и покритосеменни. При изследванията на флавоноиди в миналото често са използвани сухи листа или коренови тъкани от хербарии образци и поради това няма добри указания колко широко разпространено е наличието на флавоноиди в полените. Тяхното присъствие навсякъде в растителните тъкани и фактът, че в поленови екстракти са идентифицирани флавоноиди от няколко, силно различаващи се видове, говори че флавоноидите са универсална съставка на полена.. Повечето растителни флавоноли се намират в 3-0гликозилирани видове (J.B.Harbome and С.A.Williams, 1988, The Flavonoids, Advances in Research Since 1980, J.B.Harboome, Eds. (Chapman and Hail, London) chaps.7,8) и това е преобладаващата форма в полена на петунията (O.Ceska and Е.D.Styles, 1984, Phytoochemistry 23:1822). Само агликоновата форма може да възстановява поленовата функция, което подсказва, че или нормално се намират ниски неоткрити концентрации на агликона или е необходима гликозидазна активност, за да се получат агликоните, които са необходими за оплождането.

Поленът осигурява природната достъпна точка за манипулиране на процеса на оплождане. Загубата на флавоноидна експресия настъпваща в CMF растения действува като гаметостат, а не като гаметоцид. Пълната мъжка функция може да бъде възстановена чрез външно прилагане на флавоноли към дефицитния на флавоноид полен В допълнение към идентифицирането на фактор включен в опложданто на висши растения, значителна полза има за развитието на обратима мъжка стерилна система за продукция на хибридни семена.

Чрез свързване на гена засягащ произвеждането на флавонол, с индуциращ се промотор, съгласно тук описаното изобретение, стерилността може да бъде контролирана. Един такъв вече известен ген включва CHS гени, с2 и Whp описани от Сое и сътр., по-горе, включен тук за спраавка. Алтернативно, F3H генът може да бъде изолиран чрез създаване на хибридизационна проба като се използват PCR праймери ⁷ (виж. Saiki, R.K., 1990, по-горе) на база публикуваната

Antirrhinum F3H последователност.

По такъв начин, като се използва ген, който контролира продукцията на флавоноли както е описано тук, може дда се контролира стерилността.

Най-общо, съгласно изобретението описано тук, генът регулиращ продуцирането на флавонол може да се включи в растението заедно с необходимия промотор, който може да се индуцира. Растението е стерилно, когато критичният флавонол не се произвежда, а когато промоторът се индуцира, растението става фертилно. Нативният ген продуциращ флавонол нормално е фертилно растение, което може да се инактивира по който и да е от разнообразните методди описани по-долу като обратно кръстосване или хомоложна рекомбинация

Индуциращи се промотори

При прилагането на настоящото изобретение, промоторният участък се отделя от клонирания ген отговорен за мъжката фертилност и се замества с промотор, който единствено отговяра на специфично външно въздействие.Така генът не се транскрибира, с изключение на отговора спрямо външно въздействие. Доколкото генът не се транскрибира, неговият генен продукт, --който е необходим за завършване на поленовото развитие-- не се произвежда. Това причинява прекъсване в един или повече биохимично/физиологичните пътища на поленовото развитие, което води до мъжка стерилност. Растението може да стане фертилно само под действието на специфично въздествие, което активира избрания промотор.

Пример за отговаряща промоторна система, която може да се използва при прилагане на настоящото изобретение е глутатион-Б-трансферазна система ((GST) в царевицата. GST са фамилия ензими, които могат да детоксифицират много от хидрофобните електрофилни съединения, които често се използват като хибриди преди поникването (Wiegand и сътр., Messenger RNA Encoding a Glutathione-STransferase Responsible foor Herbicide Tolerance in Maize is Induced in Response to Sefener Treatment. Plant Molecular Biology 7:235-243, 1986). Намерено е, че третирането на царевични семена с GTS-и увеличава поносимостта на царевицата спрямо хербицидите. Изследванията са показали, че GTS-ите директно причиняват повишаване на поносимостта. С това действие преди всичко се постига специфичен 1,1 kb тРНК продукт на транскрипцията. Накратко, царевицата има прироно наличен латентен ген, който може да отговори на GST-ите и който може да се индуцира да произвежда генен продукт. Този ген вече е идентифициран и клониран. Така съгласно едно изпълнение на изобретението, промоторът се отстранява от отговарящия на GSF ген и се прикрепва към гена на мъжката фертилност, на който предварително е отстранен нативният промотор. Този инженерен ген е комбинация от промотор, който отговаря на външно химическо въздействие и ген отговорен за успешното развитие на плодоносен полен.

Вкарване на ген

Известни са няколко метода за за пренасяне на клонирана ДНК в царевица. Те включват улеснено чрез електрополация поглъщане на ДНК в царевични протопласти (Rhodes и сътр..Genetically Transformed Maize Plants from Protoplasts, Science, Vol. 240 (08.04.1988)), третиране на царевични протопласти с полиетиленгликол (Lyznik и сътр., Stable Co- Transformation of Maize Protoplasts with Gus A and Neo Genes, Plant Molecular Biology 13:151-161, 1989) и бомбардиране на царевични клетки с натоварени с ДНК микроснаряди (Klein и сътр., Genetic Transformation of Maize Cells by Particle Boombardment, Plant Phisiol., 1989, 91, 440-444) и (Klein и сътр., Factors Influencing Gene DDelivery into Zea Mays Cells by High-Veloocity Microprojectiles, Bio/Techjrology, Vol. 6, May 1988) всички включени за справка.

Всяка от тези техники има предимства и недостатъци. Във всяка от техниките ДНК от плазмид е генно инженирана така, че съдържа не само гена представляващ интерес, но също и избрани и отсети маркерни гени. Избран маркерен ген се използва , за да се изберат само тези клетки, които са натрупали копия от плазмида (конструкцията е такава, че интересуващият ни ген, избраните и отсетите гени се пренасят като едно цяло). Отсетият ген

С осигурява друга проверка за успешно култивиране само на тези клетки носещи гените, които ни интересуват. Общоизползван избран маркерен ген е неомицин фосфотрансфераза II.Този ген пренася резистентност към неомицин, съединение, което може да бъде добавено към растежната среда, в която расте клетката. Растителните клетки нормално са чувствителни към канамицин и като резултат умират. Присъствието на NPT II ген преодолява действието на канамицина и всяка клетка с този ген остава ⁷ жизнеспособна. Друг избран маркерен ген, който може да се използва при прилагането на настоящото изобретение е генът, който придава резистентност към хербицида глуфозинат (Basta). Отсетият обичайно използван ген е βглюкуронидазния ген (GUS). Наличието на този ген се характеризира като се използва хистохимична реакция, в която проба от вероятно трансформираните клетки се третира с GUS разтвор за анализ. След подходящо инкубиране, клетките съдържащи GUS ген се оцветяват синьо.

Друг отсят ген е транскрипционен активатор за антоцианинова биосинтеза както е описано от Bowen и сътр., в заявка U.S.S.N. 387 739 от 01.08.1989. Този ген причинява синтезата на пигмента антоцианин. Клетки трансформирани с плазмид съдържащ този ген почервеняват. За предпочитане е плазмидът да съдържа и избрания и отсетия ген.

Плазмидът съдържащ един или повече от тези гени се въвежда или в царевични протопласти или в калусни клетки по някоя от описаните преди това техники. Ако маркерният ген е избран само тези клетки, които са включили ДНК пакета преживяват при селекция с подходящ фитотоксичен агент. Като се идентифицират веднъж подходящите клетки и се разпространят, растенията се регенерират. Потомство от трансформираните растения трябва да бъде тествано, за да се осигури успешно свързване на ДНК пакета с растителния геном.

Ясно е, че нативният ген на фертилността се улеснява от описания процес. Хомоложна рекомбинация измества нативния ген. Друг метод за инактивиране на *** нативния ген е чрез добре известните техники на обратно кръстосване, като пример за такава техника е описан в пример 9.

Като специфична алтернатива, генът кодиращ F3H, CHI или CHS в растенията може да бъде отстранен, блокиран или по друг начин повреден, за да се предотврати експресията на F3H ензим в растението. В допълнение към блокирането на F3H in vivo, очевидно е, че F3H активността може да бъде блокирана с части, които взаимодействуват директно с F3H, за да се инактивира или уврединеговата хидроксилазна активност. В допълнение, произвеждането на флавоноли може да бъде увредено чрез блокиране на CHI активността, все пак тази алтернатива е по-малко предпочитана, тъй като превръщането на халкононарингенина протича спонтанно с ниска скорост, в отсъствие на CHI. Това е само един вариант попадащ в обхвата на настоящото изобретение.

Селекциониране на стерилността и възстановяване на фертилността

След като генът е въведен в растението, се селекционират подходящи растителни типове, които са мъжки стерилни растения. Тези растения са мъжки стерилни понеже изолираният и клониран ген на мъжката фертилност не трябва да притежава своя нативен промотор и следователно не произвежда генен продукт, който е решаващ за успешното развитие на полена. Следователно, инженерният ген действува като рецесивен мутантен алел на този ген. В нормалната растителна биотехнология, след като веднъж желаният генотип е идентифициран като се следва трансформация и регенерация, растенията се самоопрашват, за да се събере този генотип. Все пак, при прилагането на настоящото изобретение, желаният генотип не може да се самооплоди в първото поколение, понеже то е мъжки стерилно. За да се получи потомство, фертилността трябва да бъде индуциране чрез напръскване на растенията със съединение, което индуцира транскрипцията на гена чрез активиране на променения промотор. В случая на GST промотори, съединението за предпочитане е GST-индуциращо съединение като М,Ь1-диалил-2,2-дихлороацетанид. Промоторът свързан с гена на мъжката фертилност отговаря на това химическо вещество и става причина да започне транскрипцията на гена. След като това стане, продуктът от нормалния ген се продуцира от гена и се индуцира известно ниво на мъжка фертилност. Поленът от това растение след това се използва. След като завърши началното изолиране и разпространение на желания генотип, процедурата става по-пряка. Само селекционирани женски родители използвани в хибридните кръстоски се трансформират в мъжки стерилни варианти. След като се трансформират, количеството на мъжки фертилни/женски стерилни семена може да бъде увеличено. Това се осъществява чрез засаждане в изолирана област

(далеч от друг царевичен полен) и напръскване с химично вещество на което промоторът отговаря.Напръскването индуцира промотора да започне транскрипцията на гена прикрепен към него. Това продуцира предизвиква степен на фертилност. Особено предимство на тази система в която стерилността се индуцира, в сравнение със системи като тези описани в РСТ публикация W090/10396 на Mariani и сътр., (на базата на интернационална заявка № РСТ/ЕР89/00495) е това, че третирането не трябва да е 100% ефективно, понеже нормално много повече полен се произвежда от царевично растение отколкото е действително необходимо за оплождането на всички достъпни копринки. Следователно възстановена дори ниска фертилност ще бъде ефективна за получаване на приемливо ниво на увеличение на семената. В същото време, самоопрашване не трябва да настъпи при производството на хибридни семена, понеже растенията съгласно настоящото изобретение са нормално мъжки стерилни и трябва да бъдат третирани, зя да станат фертилни. В системите, в които е индуцирана стерилност, индуцираната стерилност трябва да бъде 100% ефективна, за да се избегне самоопрашване, когато се произвеждат хибридни семена.

Всички събрани семена продължават да бъдат хомозиготни и стерилни, тъй като фертилността е възстановена само в единствено родителско поколение чрез третиране с химическо вещество индуциращо фертилността. Тези семена се използват след това в полето за продукция на хибриди, къддето се използват като женски родител. Понеже растенията са мъжки стерилни, не трябва да се премахват метлиците им. Всяко от хибридните растения получени от такива семена е мъжки фертилно, тъй като полученото потомство онаследява един модифициран ген от женския родител и един нормален ген от мъжкия родител. Осъществява се нормална продукция на полен.

Описаното по-горе илюстрира предпочитаното изпълнение на настоящото изобретение, но могат да се направят различни промени, без това да промени духа и обхвата на изобретението.

Claims (15)

1. Метод за осигуряване на наследствена външно контролируема мъжка стерилност у растения, характеризиращ се с това, че

а) се селекционира ген засягащ образуването на флавонол в растението,

б) клонира се избраният ген,

в) свързва се клонираният ген в експресионна секвенция отговаряща на външен контрол

г) вкарва се експресионната секвенция в ядрения геном на растението и

д) се инактивира геномът, който кодира генния продукт на клонирания ген от нативния ядрен геном на растението.

2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че флавонолът е съединение с формула където R_r R₂, R3, R4, R5, R7 и

Rg означават водород, хидроксилна или алкокси група с

1 до 3 въглеродни атоми.

3.Метод съгласно претенция 2,характеризиращ се с това, че не повече от два от заместителите Rj-R^ означават хидроксилна или метокси група, а останалите заместители RjR5 означават водород и R7 и Rg означват водород, хидроксилна или метокси група.

4. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че възстановяващият фертилността флавонол е галангин, кемпферол, изорамнетин, кверцетин или морин.

5. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че засягащият фертилността флавонон е флавонон-3хидроксилаза.

6. Метод за репродуциране на растение с наследствена външно контролируема мъжка стерилност, резултат от заместване на ген засягащ образуването на флавонол в растението с ген, кодиращ същия генен продукт, но който е свързан в експресионна секвенция с индуциращ се промотор отговарящ на външен контрол, характеризиращ се с това, че

а) се засяват семена от растението, за да се осигурят растящи мъжки стерилни растения,

б) индуцира се превръщането на растящите растения в мъжки фертилна форма чрез отглеждане на растенията в условия индуциращи промотора да експресира гена, причиняващ продуциране на флавонол в растенията,

в) отворено опрашване на растящите растения в изолация да продуцират семена,

г) събират се семената.

7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че флавонолът е съединение с формула «2 където Rp R2, R3, R4, R5, R7 и R3 означават водород, хидроксилна или алкокси група с 1 до 3 въглеродни атоми.

8. Метод съгласно претенция 7,характеризиращ се с това, че не повече от два от заместителите R1-R5 означават хидроксилна или метокси група, а останалите заместители RjR5 означават водород и Ry и Rg означват водород, хидроксилна или метокси група.

9. Метод съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че възстановяващият фертилността флавонол е галангин, кемпферол, изорамнетин, кверцетин или морин.

10. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се 'с това, че засягащият фертилността флавонон е флавонон-3хидроксилаза.

11. Метод за производство на хибридни семена, характеризиращ се с това, че

а) се засяват в разположени за кръстосано опрашване първо семена от селекционирана мъжки фертилна мъжка родителска линия и след това семена от селекционирана женска родителска линия с мъжка стерилност, резултат от заместване на ген засягащ флавоноловата продукция, свързан в експресионна секвенция с индуциращ се промотор отговарящ на външен контрол,

б) отглеждат се семена от зрели растения при условия, които не индуцират експресия на гена,

в) кръстосано се опрашват мъжки стерилни женски растения с полен от мъжки фертилното мъжко растение и

г) събират се хибридни семена от мъжки стерилно женско растение.

12. Метод съгласно претенция 11 характеризиращ се с това, че флавонолът е съединение с формула

ОН О където Rj, R.2, Rg, R^, R^, Ry и Rg означават водород, хидроксилна или алкокси група с 1 до 3 въглеродни атоми.

13. Метод съгласно претенция 12,характеризиращ се с това, че не повече от два от заместителите R^-R^ означават хидроксилна или метокси група, а останалите заместители RjR^ означават водород и Ry и Rg означват водород, хидроксилна или метокси група.

14. Метод съгласнно претенция 12, характеризиращ се с това, че възстановяващият фертилността флавонол е галангин, кемпферол, изорамнетин, кверцетин или морин.

15. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че засягащият фертилността флавонон е флавонон-3хидроксилаза.