JPH07507680A - 外部誘導性プロモーター配列を用いる雄性稔性の制御 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 外部誘導性プロモーター配列を用いる雄性稔性の制御見旦塀立二回五 本願はさきに出願され同時係属出願中の米国特許出願第５３７、１８３号（１９ ９０年６月１２日出願）の一部係属出願である。

交ｎ公団 本発明はハイブリッド種子を生産するための小胞子形成（ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｏ ｇｅｎｅｓｉｓ）遺伝子および誘導プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　ｐｒｏ ｍｏｔｅｒ）の使用に関する。より特定すれば本発明はフラボノールの生産に影 響する核酸配列を制御することによってハイブリッド種子の雄性不稔性を調節す ることに関する。

ｌ見艮歪 植物育種の目的は、親系統の種々の望ましい形質を、単一の変種／ハイブリッド に組合わせることである。農作物の場合、ごれらの形質としては、疾病および昆 虫に対する抵抗性、熱および干ばつに対する耐性、作物成熟期間の短縮、多収、 および農業的な品質向上がある。多（の作物が機械で収穫されるので、発芽およ び林立本数の定着、生長速度、成熟度、および果実の大きさのような植物特性が 均一であることは重要である。

農作物は、植物の受粉手段を利用する技法によって育種される。植物は、一つの 花からの花粉が同じ植物体の同じ花かまたは他の花に転移される場合は自家受粉 される。そして花粉が、異なる植物体の花から到達する場合は他家受粉される。

自家受粉を行って、多くの世代でタイプによって選抜された植物は、大部分の遺 伝子座が同型接合となり、線種の育種後代の均一な集団を生産する。二つの同型 接合系間の交雑によって、多くの遺伝子座について異型接合であるハイブリッド 植物の均一な集団が生産される。いくつかの遺伝子座が各々異型接合である二つ の植物の交雑によって、遺伝子が異なり一様でないハイブリッド植物の集団が生 産される。

トウモロコシ植物（ジー・ノイズ・エル（Ｚｅａ　駐■Ｌ、　）　）は、自家受 粉法と他家受粉法の両方で育種され得る。トウモロコンは、雄花が雄穂に位置し 、雌花が同じ植物体の雄穂に位置している。トウモロコシの場合、風によって、 雄穂からの花粉が、初期雄穂の頂部から突出している絹糸状の毛に吹き付けられ ると自然受粉が起こる。

トウモロコシハイブリッドの開発には、同型接合の同型繁殖系統の開発、これら の系の交雑、および得られた交雑種の評価が必要である。系統育種および循環選 抜は、集団から同型繁殖系統を発生させるのに用いられる二つの育種法である。

育種プログラムによって、二つ又はそれ以上の同型繁殖系統または種々の広範囲 の起源由来の望ましい形質を育種のプールに組み入れ、０殖および望ましい表現 型の選抜によって、上記プールから新しい同型繁殖系統が開発される。得られた 新しい同型繁殖系統は他の同型繁殖系統と交雑させ、これらの交雑からのハイブ リッドが評価され、どれに商業上の可能性があるかを決定する。

系統育種は二つの遺伝子型の交雑から始まり、その遺伝子型は各々、他方には欠 けている一種またはそれ以上の望ましい特性をもっているかまたは他方を補足し ている。上記二つの元の親が望ましい特性のすべてを提供しない場合は、その他 の起源を育種個体群に含めてもよい。系統育種法では、優れた植物を自殖させ連 続した世代で選抜する。連続世代において、異型接合の状態は、自家受粉と選抜 を行うことによって同型系統にとって代えられる。一般に系統育種法では、５世 代以上の自殖と選抜が実施される。例えば、Ｆ、→Ｆ２；　Ｆ２→Ｆ　３　；　 Ｆ　３→Ｆ４：Ｆａ→Ｆ５である。

ハイブリッドトウモロコシの品種は２種の同型繁殖系統の交雑種であり、その交 雑種は各々、他方に欠けている一つ以上の望ましい特性を持っているかまたは他 方を補足している。

第一世代のハイブリッド後代はＦｌと呼称する。ノ＼イブリ・ｌドの開発におい ては、Ｆ、ハイブリッド植物のみめられる。Ｆ、ハイブリッドは、その同型繁殖 系統の親より活力が高（為。この雑種強勢すなわちヘテロシスは、栄養生長の増 大および収量の増大を含む多くの点で示される。

ハイブリッドトウモロコシ品種の開発には以下の３工程力Ｃ包含される＝（１） 種々の生殖質のプールから優れた植物を選抜する；（２）該優れた植物を数世代 にわたって自殖させて一連の同型繁殖系統を生産する。（これらの同型繁殖系統 は互いに異なっているが各々先祖の形質を維持し高度に均一である）；および（ ３）選抜された同型繁殖系統を非類縁の同型繁殖系統と交雑させてハイブリッド 後代（Ｆｌ）を生産する。自殖の過程でその系統の勢いは減少する。勢力は、二 つの非類縁の同型繁殖系統を交雑させてハイブリッド後代（Ｆｌ）を生産された 場合に回復する。同型繁殖系統の同型接合性と均一性の重要な価値は、任意の二 つの同型繁殖系統間でのハイブリッドが常に同一であるということである。最良 のハイブリッドを提供する同型繁殖系統が同定されると、そのハイブリッド種子 は、同型繁殖系統の親の均一性が維持されている限り、無限に再生産し得る。

一回の交雑によるハイブリッドは、二つの同型繁殖系統を交雑させてＦ、後代を 生産する場合に生産される。二回の交雑によるハイブリッドは、四つの同型繁殖 系統をベアで交雑させ（ＡＸＢおよびＣＸＤ）、次にその二つのＦ１ハイブリッ ドを再び交雑させて生産する（　（ＡｘＢ）ｘ　（ＣｘＤ））。Ｆ、ハイブリッ ドが示す雑種強勢の多くは次の世代（Ｆ２）では失われる。その結果、ハイブリ ッド品種由来の種子は植裁苗用には用いられない。同様に、ハイブリッド種子の 生産には、自家受粉、および最終ユーザの為の同型交配種子の製造および販売を 回避することが非常に重要である。

トウモロコシのハイブリッド種子は手作業の雄穂除去によって生産され得る。ト ウモロコシの２種の同型繁殖系統の品種を交互に一つ置きのすしで、圃場に植え 、次いで花粉を生成する雄穂は、上記同型繁殖系統のうちの一方から除去する（ 雌親法）。異種トウモロコシの花粉源から充分隔離されているならば、雄穂を除 去された同型繁殖系統の雄穂は他方の同型繁殖系統（雌親法）からの花粉だけで 受精されるので、得られる種子はハイブリッドでありハイブリッド植物を形成す る。残念ながら、上記手作業による雄穂除去法は完全に確実なものではない。時 には雌株の植物は嵐によって吹き倒されて雄穂の除去をまぬがれることがある。

または雄穂を除去する人が植物の雄穂を完全には除去しない場合もあり得る。

上記いずれの場合も、雌株の植物は花粉を放出するのに成功し、いくらかの雌株 植物は自家受粉される。その結果、上記雌株の同型繁殖系統の種子が、正常に生 産される７％イブリ・ノド種子とともに収穫されることになる。

一方、上記雌株同型繁殖系統は機械で雄穂を除去し得る。

機械による雄穂除去は、手作業による雄穂除去と比べて信頼性は同等であるが迅 速で経費が安い。しかしながら大部分の雄穂除去機械は、手作業による雄穂除去 に比べ、多くの損傷を植物に与える。したがって、現在、いずれの形態の雄穂除 去法も完全に満足すべきものではないので、ノ＼イブリッド種子の生産において 、さらに生産コストを下げ、自家受粉をなくす代替物に対する要望は依然存在す る。

労力を要する雄穂除去法は、細胞質雄性不稔性（ＣＭＳ）同型繁殖系統を使用す ることによって回避し得る。ＣＭＳ同型繁殖系統の植物は、核ゲノムとは異なり 細胞質ゲノムからもたらされる細胞質因子類が原因で雄性不稔性である。したが って、雌だけが受精された種子に細胞質を提供する為、この特性は雌親を通じて 、もっばら受け継がれている。ＣＭＳ植物は、雄性不稔性でない他の同型繁殖系 統からの花粉で受精される。第二の同型繁殖系統からの花粉は、ハイブリッド・ 植物を雄性稔性にする遺伝子を与えることもあり、与えないこともある。雄穂を 除去された正常なトウモロコシから得た種子およびＣＭＳが生じた上記と同じハ イブリッドの種子は、そのハイブリッド植物が生長した場合に適切な花粉量が受 精に対して供給できるように混合しなければならない。

ＣＭＳには別の欠点があり得る。欠点の一つは、歴史的に観察されている、ある 種の作物病にかかり易いＣＭＳの特定の変種の群集である。この問題のため、ハ イブリッドトウモロコシの生産において、ＣＭＳ変種の使用は事実上断念された 。さらに、ＣＭＳは、特に稈の品質、早まき活力（ｅａｒｌｙｓｅｅｄｌｉｎｇ 　ｖｉｇｏｒ）および収量の分野で、農業的性能に対して負の関連がある。さら に、ＣＭＳは特定の環境下で不稔性が崩壊する場合があり、そのためＣＭＳ系統 はハイブリッド種子の生産に関して信頼できない。

他の形態の不稔性、すなわち遺伝子雄性不稔性は、Ｂｒａｒらの米国特許第４． ６５４．４６５号および第４．７２７．２１９号に開示されている。しかし、こ の形態の遺伝子雄性不稔性は、ゲノム内の離れた位置に多数の変異遺伝子を維持 する必要があり、そして遺伝子を追跡し、その系を便利に使用するために、複雑 なマーカーンステムが必要である。

大豆および綿のような自家受粉される種では、雄性器官および雌性器官は解剖学 的に近接している。目然受粉中、所定の花の雄性生殖器官からの花粉が、同じ花 の雌性生殖器官に受粉する。このことは、他家受粉される種（例えばトウモロコ シ）の場合、一つの植物体の雄穂からの花粉は一般に風による分散によって、池 の植物体の毛に受粉するのと異なっている。この現象は、雄性および雌性の生殖 器官が離れて存在するため容易に起こり得る。自家受粉がなされる作物のノ＼イ ブリッド生産は、雄性および雌性の生殖器官が近接して共生している為、困難で ある。自家受粉作物の、ノ・イブリッド生産に及ぼす物理的困難性に加えて、ノ ＼イブリ・ノドが示すヘテロシスの程度が低すぎるので、ノ・イブ１ルノド種子 を生産するのに要する追加経費が妥当でない場合が多０゜信頼性力ｆ高も）形態 の雄性不稔性によって、これらの種のノ＼イブリ・ノド植物の育種が改善され、 そして収量が増大する機会が提供される。

科学者達は、トウモロコシおよび他の植物の花粉の発育および受精の過程を解明 するよう鋭意努力している。受精１よ、柱頭面上で成熟花粉が発芽し、モして花 柱組織を貫通する花粉管が生成することによって始まる。被子植物の場合、生長 する花粉管は、二つの精細胞を胚のうに運ぶ導管であり、胚のうにおいて、二つ の精細胞はそれぞれ卵および中央細胞と結合して、接合体および胚乳を形成する （　Ｅ、　Ａｒｎｏｌｄ編、「植物解剖学二実験法および説明（そのｌ）Ｊ、ロ ンドン、Ａｄｄｉｓｏｎ　Ｗｅｓｌｅｙ社（１９７８年）の第６章におけるＥ、 　Ｇ、Ｃｕｔｔｅｒの論文）。

花粉の発育は朽の中で起こり、成熟時には、各穀粒は、多細胞胞子であり、朽壁 の内層（タペータム組織）から起こる、胞子体遺伝子発現と、各穀粒内の栄養細 胞から起こる半数体遺伝子発現との産物を含有するＣＪ、Ｐ、Ｍａｓｃａｒｅｎ ｈａｓｓ　Ａｎｎｕ。

Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ　５ｉｏ１．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、 、４１巻、３１７頁、１９９０年；　Ｊ、　Ｐ、　Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓｓ　 Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、　１巻、６５７頁、１９８９年）。

小胞子形成の過程は組織学的には充分報告されているが、分散後の花粉の機能に 関与している分子および生化学的因子についてはほとんど知られていない。

フラボノイド類は、一般に１５個の炭素からなる骨格構造を有する小分子量（〜 ３００）の植物に特異的な代謝産物群である。

上記基本構造を修飾することによって、多くの配列の化合物が得られ、これらの 化合物はその酸化状態および種々の環の置換パターンによって分類される。いく つかのクラスは色素であるが（例えばアントシアニン類、カルコン類、ならびに 特定のフラボノール類およびフラボン類）、他のクラスは、無色の紫外吸収化合 物である。アンドシアニン類、特定すればベラルゴニン、シアニジンおよびデル フィニジンは赤、青および紫の色に関与している。他の色素フラボノイド類、カ ルコン類、ならびにいくつかのフラボノール類およびフラボン類は黄色であり、 黄色、アイポリ−色およびクリーム色の花に大きく関与している。花粉のフラボ ノイド類はいくつもの種において同定されており、これらの種でフラボノイド類 は、花粉に独特の黄色を与え、花粉の乾燥重量の大きな割合を占めている（２％ 〜５％）　（Ｒ，Ｚｅｒｂａｋ％Ｍ、　Ｂｏｋｅｌ、Ｈ，ＧｅｉｇｅｒＳＤ、　 Ｈｅ５ｓ、　Ｐｈ　ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　２８巻、８９７頁、１９８９年 ；ＲｌＷｉｅｒｉｎａｎｎおよびに、　Ｖｉｅｔｈ、　Ｐｒｏｔｏ　ｌａｓｍａ 、１１８巻、２３０頁、１９８３年）。いくつもの植物種は、花粉中に独特のタ イプのフラボノイド類を有しているので、花粉粒はフラボノイドを生合成し、お よび／または蓄積するための特別の環境であるという証拠が存在する（０．　Ｃ ｅ５ｋａおよびＥ、　Ｄ、　５ｔｙｌｅｓ、　ハム匹閃１ｕＨ，２３巻、１８２ ２頁、１９８４年）。

改変されたフラボノイド着色を有する植物は、すでに文献に報告されている。例 えば、黄色の花粉ではなく、無機能性の白色花粉を生産するトウモロコシ変異体 がすでに単離され、特性が決定されている（Ｃｏｅ　Ｅ、　Ｈ，、ＭｃＣｏｒ＋ ａｉｋ　Ｓ、　Ｍ、およびＭｏｄｅｎａ　Ｓ、　Ａ、、［トウモロコシの白色花 粉Ｊ　、Ｊ　Ｈｅｒａｄ、　７２巻、３１８〜３２０頁、１９８１年）。この白 色の花粉変異体は、絹糸状毛止で発芽する通常量の非着色花粉を放出するが、大 量の受粉後でも種子は全く形成されない。この条件は、トウモロコシの二つのカ ルコンシンターゼ（ＣＨ３）遺伝子、Ｃ２および］−における安定な劣性突然変 異の発現によって胞子体として、決定される。近年、ＣＨ３導入遺伝子を、着色 した同型繁殖系統のペチュニア株にアプロ、＜クテリウム属細菌を仲介し導入す ると、内生のＣＦ−Ｉｓ遺伝子の発現が抑制されて、フラボノイドによる着色が 完全に欠除した花冠が生成されることが報告されている（Ｎａｐｏｌｉ　Ｃ，、 Ｌｅｍｉｅｕｘ　Ｃ，およびＪｏｒｇｅｎｓｅｎ　Ｒ，％　ｒキメラカルコンシ ンターゼ遺伝子のペチュニアへの導入により、トランスに存在する相同遺伝子の 可逆釣具抑制が生じるｊ　、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｋ　２巻、２７９〜２８９頁、 １９９０年）。

ＣＨ３導入遺伝子はまた、これら植物内で抑制され、これらの現像を説明するの に、共抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）という用語が用いられている（Ｊ ｏｒｇｅｎｓｅｎ　Ｒ，、［改変された遺伝子の植物中ての発現性、相同遺伝子 間のトランスでの相互作用に基づ＜　Ｊ　、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、　 ８巻、３４０−３４４頁、１９９０年）。組み込まれた導入遺伝子は内生ＣＨ８ 遺伝子の同一連鎖群に属さない優性のインヒビターのように作用し、花弁のみな らず生殖器官における可視フラボノイド色素の生産に対する完全な障害になる。

ＣＨ３遺伝子発現が妨害されると、フラボノイドによる着色が不完全になるだけ でなく、植物体が不稔となる（　Ｃｏｅら、１９８１年ＨＴａｙｌｏｒら、１９ ９２年、［カルコンシンターゼ欠失ペチュニアの条件的雄性不稔Ｊ　、Ｊ、　Ｈ ｅｒｅｄ、二８３巻、１１〜１７頁）。

植物を所望どおり有効に、雄性不稔または雄性稔性にする方法で稔性を制御でき ることが非常に所望されている。

良匪旦斐豆 本発明は、雄性の受精に関して決定的な遺伝子の発現を調節する誘導プロモータ ーを用いて、植物を制御し得る状態で雄性不稔にすることに関する。上記遺伝子 は、通常は「オフ（ｏｆｆ）　Ｊであり、その結果、植物は不稔性である。上記 プロモーターが誘導されると、植物は稔性になる。より特定すれば、本発明は、 植物内でのフラボノール生産に影響する遺伝子の制御に関する。

フラボノール欠失を起こす程度まで、フラボノン−３−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３ Ｈ）活性が減じた植物は、条件的雄性稔性（Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ　ｍａ ｌｅ　ｆｅｒｔｉｌｅ）　（ＣＭ　Ｆ　）であり、そしてその雄性稔性は、その 植物の花粉が稔性を回復させるフラボノールに接触する条件を提供することによ って、救助される、すなわち回復することが発見された。Ｆ３Ｈ活性は直接また は間接的に減じられ得る。例えば、植物内でＦ３Ｈの生産がブロックされるか、 植物が天然に生産するＦ３Ｈが不活化されるか、または、フラボノールの生合成 経路においてカルコンシンターゼ（ＣＢＳ）のような前駆酵素の活性が減じられ ることによって、Ｆ３Ｈ活性が減じられる。生存花粉はＦ３Ｈ欠失植物において も生産されるが、花粉の発芽および花粉管の生長は、インビボとインビトロの両 方で著しく低下し、自家不稔の植物となる。しかしながら、上記植物の花粉が、 稔性を回復するフラボノールと接触し得る条件を与えることによって、充分に花 粉が発芽し、花粉管が生長する機能を回復させ得る。適切な稔性回復条件には、 例えば、Ｆ３Ｈ減損条件の除去、植物内でのＦ３Ｈ生産の回復などを包含する、 所望されるフラボノールを植物の花粉が利用できるようにする、いかなる条件も 包含される。あるいは、植物の稔性は、花粉を、花粉の発芽および／または花粉 管の生長を促進するのに有効な量の稔性回復フラボノールと接触させることによ って、救助もしくは回復させ得る。有用な稔性回復フラボノール類は、次式： （ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、およびＲ♂はそれぞれ水素、 ヒドロキシルまたは１〜３個の炭素原子を有するアルコキシである）で表される 化合物を包含する。特に好ましいフラボノール類は、ガランギン、ケンペロール 、イ・ノーラムネチン、ケルセチンおよびモリンを包含する。

図面の簡単な説明 本発明は、添付図面とともに以下の詳細な説明を参照することによって、よく理 解され、本発明の上記態様および多くの利点が容易に理解される。

図１は、カルコンシンターゼ（Ｃ）（Ｓ）異型接合植物の発育中の小胞子に対す る胞子体の作用（斜線）の概略説明図である。胞子体中でのＣＨＳ機能の欠如は 白色の７＜・ツクグランドで示しく図ＩＡ）、ＣＨ８機能の存在は黒色のバッグ ランドで示す（図ＩＢ）。

図２Ａおよび２Ｂは、同系繁殖系ペチュニアＶ２６（図２Ａ）およびＣＨ５欠失 植物０２４２５．１由来の花粉のインビトロでの発芽中の写真である。この場合 、新たに裂開した朽から得た花粉を液体媒体中に懸濁し、次いで室温で６時間生 長させた後、写真撮影を行った。図２Ａ中のバー印は２５μｍを示す。図２Ｂ中 の矢印は発芽不全の花粉管を示す。

図３は、同系繁殖系ペチュニアｖ２６（左欄）およびＣＨ８欠失植物０２５４２ ５．１　（右欄）由来の同程度に発育した朽の断面写真である。これらの朽は、 実施例３に記載のように、採取し、固定し、包埋し、横断して切断し、そしてト ルイジンブルーで染色した。図３Ａは裂開する直前の朽の全断面図であるが、こ の時のＣ）（Ｓ欠失朽は淡褐色で萎縮している。図３Ａのバー印は２００μｍを 示す。図３Ｂは裂開する４８時間前の朽の断面図であるが、この時の形質転換さ れた朽は丸くふくらみ、白色である。図３Ｃは、図３Ｂの図の倍率で図３Ａを拡 大した朽の断面図を示す。図３Ｂのバー印は５０μｍを示す。

図３Ｄは裂開時の成熟花粉を示す。図３において、Ｐは花粉を示し、Ｅは内被を 示し、Ｓは口辺細胞、およびＣはクチクラを示す。

図４は、稔性を回復させるフラボノール、ケンペロールによって、ペチュニアの ＣＨ５欠失花粉の、発芽および花粉管の生長の回復を示す写真である。花粉は、 条件的雄性稔性朽から採取し、発芽培地中に懸濁させ、次いでケンペロール（Ｋ ＋、図４Ｃ）またはＤＭＳＯ（Ｋ−１図４Ｂ）を最終濃度１μＭまで添加した。

４時間インキュベートした後、花粉の代表的な視域を撮影した。ケンペロールで 回復したＣＭＦ花粉（図４Ｃ）に見られる花粉発芽および花粉管の生長は、ＤＭ ＳＯだけを加えた野生型Ｖ２６の対照（Ｃ，図４Ａ）と区別できない。補充され なかったＣＭＦ花粉（図４Ｂ）は、いくつかの花粉粒の発芽孔に膨潤がみとめら れるが花粉管は全く突出ていない。

図５は、野生型Ｖ２６の柱頭（図５Ａ）およびＣＭＦの柱頭（図５Ｂ）のメタノ ール抽出物のＨＰＬＣプロフィルを示す。１５０個の柱頭から調製し、次いで、 逆相Ｃ１６カラムでメタノール−水勾配液を用いて分画した抽出液の一部１００ μｌの３６０ｒ＋ｎ＋の波長光の吸収を示す。図５Ａの挿入図は、３３．１７分 におけるピークのＵＶ光／可視光のスペクトルであるが、基準のケンペロール標 準物が提供するものと同一である。酸加水分解したＶ２６の柱頭抽出物のＨＰＬ ＣプロフィルおよびＵＶ／可視光スペクトルは、保持時間７．４３．１０．１０ ．１３．４６および１６．６５における主要ピークがケンペロールおよびケルセ チンのグリコシドであることを示す。

図６は、フラボノールアグリコンの増大する濃度の関数として示す花粉発芽頻度 のグラフである。ケンベロール（白丸印）、モリン（黒丸印）、ミリセチン（０ 三角印）および３−ヒドロキシフラボン（黒三角印）を表示した最終濃度で発芽 培地（ＧＭ）に添加し、４時間インキュベートした後、発芽率を測定した。３回 の別個の実験で測定した発芽頻度の斗均値を、該平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を 付してプロ、トシた。

■、はり小さいＳＥＭは図示していない。野生型である対照のＶ２６花粉の発芽 頻度は一般に７５％であり、回復しないＤＭＳＯ処理ＣＭＦ花粉の発芽率は１〜 ２％である。

及豆皇皿丞 引用した文献はすべて本願に援用する。

植物育種および種子生産を行う場合に、本発明は、誘導プロモーターを用いて、 小胞子形成すなわち花粉の生産に関して決定的であることが知られている遺伝子 の発現を調節する点において、雄性不稔性を得る従来の方法と異なっている。

従って、本発明を実施する際の第一ステップは、小胞子形成が依存する遺伝子の 選択である。小胞子形成に関して決定的であることが認められる遺伝子タイプの 一つは、フラボノール生産に影響する遺伝子である。

選択された遺伝子をクローン化し、その元のプロモーターを使用可能にし、そし て改変遺伝子を、外部からの制御に対して応答する誘導プロモーターとともに発 現配列中に挿入する。上記プロモーターとしては、特定の非植物毒性化学薬剤の 植物への添加に応答するプロモーターが好ましい。

形質転換および遺伝子置換を用いて、上記決定遺伝子は、植物のゲノム内で不活 性化され、次いで、誘導プロモーターを有する発現配列に組み込まれた、遺伝子 工学で処理されたＶ　遺伝子で置換される。

本発明は、不稔性ではなく、稔性を誘導するために銹導プＪ　ロモーターを使用 する点において、独特である。本発明にお凸　いて、選択された遺伝子のプロモ ーター配列は除去され、その結果、該遺伝子は転写されず、植物は雄性不稔にな る。雄性不稔植物の増大が所望される場合、雄性稔性を上記遺伝子の発現を誘導 することにより、回復させる。好ましい実施態様では、生長中の雄性不稔植物を 特定の非植物毒性化学薬剤で処理することによって達成される。

雄性不稔性は、「決定的な遺伝子」が「オフ」の場合に提供され得、そして発現 させるために化学薬剤を要するが、または決定的な遺伝子が「オン」で提供され 、そして不稔性を与えるため化学薬剤による処理が必要である。後者の方法は、 ＭａｒｉａｎｉらノＰＣＴ国際公開第ＷＯ３９／１０３９６号（国際特許出願第 ｐｃＴ／ＥＰ８９１００４９５号に基づく）に記載されている。なおこの文献は 本願に援用する。

誘導プロモーターの化学薬剤処理による誘導は、化学薬剤処理自体に付随する種 々の因子および処理する際の環境条件に依存する。上記決定遺伝子が正常に「オ ン」になっていて、化学薬剤による処理によって不活化される場合、処理に失敗 すると、自家受粉が行われ、ハイブリッド種子ではなく、同系繁殖系統の種子が 生産され販売される。ハイブリッド種子の販売を律する種子に関する法律は、種 子の高い純度を要求し、ハイブリッドの仕様に適合しない種子の割合は極めて低 く維持しなければならないとしている。トウモロコシの一つの植物体は、６００ 万個を上まわる花粉粒を生産し得るので、わずかな処理の失敗でも高い割合の自 家受粉の原因になり得る。

これらの理由のため、本発明は、上記遺伝子が通常「オフ」であり、関連する形 質が発現されない方式で実施し、その結果、正常な条件下で自家受粉は起り得な い。さらに、通常「オフ」である上記決定的な遺伝子を有することにより、バイ ブ’Ｊ　ノド種子の大規模生産において、化学薬剤処理が不要になり、その結果 、薬剤使用量（これに伴う費用）が縮小され、そして、処理の失敗が起こる危険 性は、慎重に制御された限られた規模の自家受粉が必要な親種子の生産の場合に しか存在しない。上記のケースで処理に失敗すれば、花粉の生産不足を起たすが 、花粉は通常、はるかに余裕をもって過剰生産されるので、親種子の生産におけ る本発明の工程は、７０％〜８０％もの高い処理失敗率でさえも、親種子の収穫 に対する影響は少ない。

産業上の利用可能性 雄　、　に　して′定的な伝　の石室 雄性不稔遺伝子を同定し、クローン化する手法は、他の遺伝子をクローン化する のに利用される当該技術分野で公知の手法と同じである。トウモロコシの遺伝子 雄性不稔性の大部分の例は劣性遺伝子の突然変異の結果であるため、トランスボ ／ン（転位性因子）タソギングが好ましい方法である。雄性不稔遺伝子の翻訳産 物であるタンパク質の配列の知識を必要とするクローン化技法は、雄性不稔遺伝 子の遺伝子産物が未知なので現時点では使用し得ない。

転位性因子でトウモロコシ遺伝子をタノギングする方法は公知であり、Ｈ，Ｐ、 　Ｄｏｒｉｎｇの文献「トウモロコシの転位性因子による遺伝子タッキング（概 観）　Ｊ　、Ｍａｙｄｉｃａ、　３４巻、７３〜８８頁、１９８９年に概説され ている。さらにＦｅｄｅｒｏｆｆの米国特許第４、７３２．８５６号（「転位性 因子およびそれを使用する方法」）に記載されている。なおこれらの文献の開示 事項はすべて本願に援用するものである。

上記方法を実施する一つの方法は、活性な転位性因子および小胞子形成に関与す る標的遺伝子の優性対立遺伝子を有するトウモロコシ系統と、転位性因子をもっ ていない通常のトウモロコシ系統とを交雑させることである。特定の遺伝子タノ ギング効率は、好ましくは、転位性因子を標的遺伝子座の近くに配置することに よって増大し得る。上記交雑による後代を自家受粉させ、次いで最も有用な突然 変異についてスクリーニングする。好ましい表現型は、朽を突出させない植物お よび花粉を生産しない植物である。最も好ましいのは、朽を突出させない表現型 である。この表現型は、受粉前の大ざっばな観察によって、視覚で容易にスクリ ーニングされ得る。

これらの雄性不稔植物は、転位性因子がその元の位置から除去され、花粉の発達 に必須な遺伝子を有する遺伝子座に転位したと推定される例示である。転位性因 子が上記遺伝子座に転位するとその遺伝子は不活化される。次いでそれは劣性遺 伝子として挙動し、雄性不稔になる。これらの突然変異植物は、転位性因子に関 する検定系統と交雑させることにより、該因子の存在を確認し得る。

所望の転位性因子が標的遺伝子に転位したことが確認されれば、その転位性因子 とハイブリダイズするゲノムクローンが構築され得る。次いで、そのクローンの 上記因子に隣接する配列は、変異体の対立遺伝子、復帰変異体の対立遺伝子およ び野生型の対立遺伝子を有する系統由来のゲノムＤＮＡとサザーンハイプリダイ ゼーシヲンを実施する際のプローブとして用いられる。予想されるサイズの差（ 転位性因子が存在しているか存在していないかを反映する）を示すｒＤＮＡは、 所望の修飾された標的遺伝子を保持する。

実際には、ある遺伝子座に関して、転位性因子の標的にされ得る頻度は通常１０ −５〜１０−６の範囲で変化する。しかしながら、１００．０００本のトウモロ コン植物体は、１０ニーカーより小さい面積で容易に栽培され得る。さらに、特 定の環境下では、上記因子で誘導される突然変異の頻度は増大され得る。例えば 遺伝子タッキング法に用いられる特定の転位性因子は、該因子によってタッキン グされる遺伝子に連結され得る。二つの異なる転位性因子系、ＡＣおよびＳｐ＋ ａ／Ｅｎの場合、これらの因子の転位は、該因子が転位前に位置していた染色体 の部位に優先的に起こる。あるいは、異なる転位性因子は変異体誘導の頻度が異 なる。例えば、ミューチーター（Ｍｕ）と呼ばれる転位性因子は、対照植物より ３０〜５０倍高い頻度で新たに突然変異を誘導し得る。さらに、突然変異誘導率 は上記因子を有する親株の性別に影響され得る。相互交雑のいずれが高い突然変 異率を与えるかは予測できないが、トランスポゾンタッギングは容易に実施し得 る。

これまでに少なくとも７種の異なるトウモロコシ転位性因子がクローン化された 。これらはＡＣ，５ｐＩｌ／Ｅｎ、　Ｍｕ、　Ｔｚ８６、Ｂｓ１、ｒＤｔ、およ びＭｐｉｌである。これらのいずれも、転位性因子が保持される遺伝子のクロー ン化に使用され得る。

当業者は、上記手段が上記遺伝子を配置する一例に過ぎず、他の方法も公知であ ることを理解している。

突然変異遺伝子の一つのコレクションがすでに知られており、Ａｌｂｅｒｔｓｅ ｎら、「トウモロコシの１３種の遺伝子雄性不稔に関する発達細胞学Ｊ　、Ｃａ ｎ、　Ｊ、　Ｇｅｎｅｔ、　Ｃｙｔｏｌ、　２３巻、１９５〜２０８頁、１９８ １年に記載されている。この文献は本願に援用するものである。これらの遺伝子 は雄性不稔（ｍｓ）遺伝子として知られ、花粉の発達にしか作用せず、雌性器官 の発達には全く作用しない。これらの遺伝子は、花粉発達の特徴的な段階で小胞 子形成を阻止し、その植物を雄性不稔にする。

上記起源のいずれかから、突然変異遺伝子がクローン化されれば、野生型対立遺 伝子をクローン化するためのプローブとして使用される。上記突然変異遺伝子は 野生型の対立遺伝子に非常によく類似するため、野生型対立遺伝子とハイブリダ イズし得る。正常遺伝子が同定されてクローン化されれば、その遺伝子のプロモ ーター領域が同定される。この領域はその遺伝子の転写開始に関与する。

花粉の発達に必須の遺伝子はまた、突然変異を中間で使用せずに、花粉が発達し ている間に特異に存在するｍＲＮＡを単離することによって、そして対応する遺 伝子に対するゲノムライブラリーをプローブするのに用いられ得るｃＤＮＡを構 築することによって同定することができる。

驚くべき発見がさらになされた。すなわち、フラボノール、特にある種のフラボ ノール類が花粉の機能に関して決定的であり、そのフラボノールの生産または欠 除によって、植物の稔性および不稔性が制御され得る。

フラボノイド欠失、条件的雄性稔性（ＣＭ　Ｆ　’）植物における稔性は、該植 物の花粉の発芽を促進するのに有効な稔性回復性フラボノールを、花粉に接触さ せることによって回復する。

一つの例示として、上記植物の花粉の発芽および花粉管の発育を促進するのに有 効な量の稔性回復性フラボノールを、花粉に接触させることによって、適切な条 件が得られる。本明細書で用いられる用語［フラボノイド欠失で、条件的雄性稔 性（またはＣＭＦ）植物」は、カルコンシンターゼ（ＣＨ３）またはフラボノン −３−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３Ｈ）活性が、自然にまたは遺伝子導入によって減 損され、その植物内のフラボメイドの自然生産が阻止された植物を包含する。従 って、フラボノイド欠失で条件的雄性稔性植物は、一般に色素の欠失により白色 または淡色になり、そして一般に自家不稔性である。本発明は、以後、ＣＭＦで あるペチュニアおよびトウモロコシに関連して詳細に説明するが、本発明の実施 において他のＣＭＦ植物も同様に使用され得る。

天然のフラボノール生合成経路において、カルコンシンターゼ（ＣＨ３）は、３ 分子のマロニル−ＣｏＡおよび１分子のｐ−フマロイルを縮合してカルコノンア リンゲニン（ｃｈａ　１ｅｏｎｏｎａｒ　ｉｎｇｅｎｉｎ）を生成し、カルコノ ンアリンゲニンは自然に（低速度で）、およびカルコン−フラバノンイソメラー ゼ（ＣＨＩ）の作用によって、ナリンゲニンに変換される。この経路の次のステ ップで、Ｆ３）Ｉが、Ｃ環の３位の炭素へのヒドロキシル基の付加反応を触媒し て、フラボノールが生産される。上記フラボノールは、本発明による稔性回復性 を得る為に必要である。その一般経路を以下に示す。

（以下余白） Ｆ３Ｈは、フラボノール生産反応における律速酵素であり、すでにアンチリナム ・マジュス（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ　１旦）がらクローン化されているＣＭａ ｒｔｉｎ、Ｃ，Ｐｒｅｓｃｏｔｔ、Ａ、　、Ｍａｃｋａｙ、Ｓ、、Ｂａｒｔｌｅ ｔｔ、　Ｊ、およびＶｒｉｊａｎｄｔ、　Ｅ、、ｒＡｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ　ｕ 士胆の孔中の生合成の制御Ｊ　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊ、、１巻、３７〜３９頁 、１９９１年）。

フラボノールアグリコン化合物は本明細書中に記載のように雄性稔性を得るのに 必要であり、本発明の実施において、Ｆ３Ｈのヒドロキシル化活性を制御する誘 導プロモーターが使用され得る。

ＣＨ３，ＣＨＩまたはＦ３Ｈの活性の欠失によるフラボノイド類欠失植物の雄性 機能の減損は、裂開の直前までは花粉の発達に大きな異常をもたらさないが、裂 開時において、朽の形態は、色、形およびサイズが正常とは異なる。開裂時の花 粉は、朽内で凝集したままであり、顕微鏡下では、朽内の花粉粒のかなりの部分 が正常なものより萎縮しているように見える。生存花粉が産出され放出されるが 、花粉の発芽および花粉管の生長はインビボおよびインビトロの両方で大きく損 なわれている。機能的雄性不稔性に加えて、フラボノール欠失植物は、花粉が野 生型植物の柱頭によって一部救助できるがフラボノール欠失植物の柱頭によって は救助されないという事実によっても明らかなように、自家不和合性のいくつか の様相を示す。雄性不稔性および自家不和合性の両者の要素は明らかであるが、 フラボノール欠失植物由来の花粉が示す特徴は、本明細書中で条件的雄性稔性（ ＣＭＦ）と呼称する特異な状態を明確に示している。

（以下余白） ＣＨ３が欠如している植物（フラボノイドが欠失している）は、次の二つの特徴 ：　（１）フラボノイドによる着色を欠いていること、および（２）機能するた めに野生雌ずい（柱頭＋花柱）に完全に依存する不完全花粉を生産することを除 いて正常に見える。

ＣＨ３欠失植物はフラボノイド着色の欠失および花粉機能の減損を有するが、植 物種間で幾らかの相違点が認められる。

トウモロコンの白色花粉は絹糸状の毛玉で発芽し、生長が花柱て停止する花粉管 を生産する。さらに、トウモロコン変異体の花粉はインビトロで発芽し、野性型 花粉とほぼ同じ長さの花粉管を生産する。対照的に、ＣＨ３欠失ペチュニア由来 の花粉は柱頭に侵入することもなく、インビボまたはインビ）・口のいずれにお いても花粉管を生産しない。トウモロコシとペチュニアとの間のこの違いは三細 胞性花粉（トウモロコン）と二細胞性花粉（ペチュニア）との間の生理学的差異 によって説明し得る。二細胞性花粉は放出時の呼吸速度が遅く、放出後、柱頭上 で発芽の数時間前に第二精細胞を形成するが、その初期花粉管生長速度は遅いと 考えられる。対照的に、三細胞性花粉は開花期前に２回目の有糸分裂を受け、放 出時の呼吸速度は高く、柱頭表面に接触した後、数分以内に発芽し、その生長速 度は速い。三細胞性花粉は、放出後、急速に生長するように保たれているため、 トウモロコシの白色花粉管生長を停止する何らかの機構が有効になる前に、かな りの長さまで生長する。

世代交代を伴う顕花植物の場合、二倍体胞子体は、生長して有糸分裂し、配偶体 を生産する半数体胞子を生産する。配偶体のライフサイクルの一部は、発達中の 花粉胞子が周囲の胞子体組織と直接接触している間に起こる。この配置は二倍体 −半数体相互作用の可能性を有する。異型接合植物の場合、図１に示すように、 この相互作用は２種の配偶体間の半数体−半数体コミュニケーションを含む。本 明細書中に記載のペチュニアのフラボノイド欠失雄性不稔性は遺伝学的に優性で あるが、トウモロコシの白色雄性不稔性は遺伝学的に劣性であるという事実は、 配偶体もしくは胞子体のいずれかが、上記効果の原因であるという点に関して興 味深い結論に結びっ（。トウモロコシの場合、雄性不稔性はＣ２およびｕの両Ｃ Ｈ３遺伝子について同型接合劣性植物のみに発現する。

Ｃ２または児１且のどちらかの単機能コピーを有する異型接合体はｌＯＯ％黄色 の稔性花粉粒を産する（Ｃｏｅら、１９８１年）。

したがって、異型接合体の場合、ＣＨ３陽性胞子体または５０％ＣＨ３陽性配偶 体のいずれかが、ＣＨ３陰性配偶体における稔性の発現に影響を及ぼす。形質転 換ペチュニアの場合、雄性不稔性は優性形質に関連し、異型接合体植物により生 産される花粉は１００％雄性不稔性である。この場合、不稔性はＣＨＳ抑制配偶 体によるＣＨ３陽性配偶体の阻害または形質転換胞子体のＣＨ８欠失のいずれか に起因する（図１）。

雄性不稔性を引き起こすＣＨ３欠失の生理学的根拠は、トウモロコシとペチュニ アで同じであると考えられ、両種ともに、不稔性表現型を引き起こすものは、配 偶体よりむしろ胞子体である。したがって、トウモロコシおよびペチュニアニオ ケるＣＨ５欠失関連の条件的雄性稔性には共通の生理学的根拠がある。

条件的不稔性花粉生産をＣＨ３欠失植物から開発し、インビトロ花粉救助検定（ ｒｅｓｃｕｅ　ａｓｓａｙ）の基盤を作ることができることが確認されていると いう事実により、フラボノール生産の調節により稔性が制御されることは明白で ある。精製フラボノイドもしくは植物抽出物を補充した発芽溶液中で形質転換花 粉をインキュベートし、発芽頻度の上昇および花粉管生長の増進を分析すること により、花粉機能に必要な特定の化合物が同定され得る。この手法により、多く の種類のフラボノイド化合物は一般にＣＭＦ植物の稔性回復に対して、等しく有 効ではなく、むしろ特定のグループの稔性回復フラボノールアグリコン類が、こ の目的に有効であることが決定された。

ＣＭＦ植物の花粉発芽促進に有効な、いかなるフラボ／−ルも、本発明の実施に 使用され得る。しかし、比較的大きなファミリーのフラボノイド類の大部分がこ の目的に対して無効であることが確認されている。特に有効な稔性回復フラボノ ール類は同定され得、ＣＭＦ自家不稔状態にある植物の稔性の回復に使用され得 る。本発明の好ましい実施態様では、稔性回復フラボノールは次式を有する化合 物である：ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７およびＲ８はそれぞれ 水素、ヒドロキシルまたは１〜３個の炭素原子を有するアルコキシである。さら に好ましいのは、Ｒ２−Ｒ５のうちのいづれか１つまたは２つがヒドロキシルま たはメトキシであって、残りのＲ１−Ｒ５は水素であり、Ｒ７およびＲ８は水素 、ヒドロキシルまたはメトキシである。特に好ましい、本発明の代表的稔性回復 フラボノール化合物は、上記一般化学構造および以下の置換基を有するガランギ ン、ケンベロール、イソ−ラムネチン、ケルセチンおよびモリンである。

（以下余白） 本発明の実施に有用な他のフラボノール類は、本明細書中に記載のインビトロ花 粉レスキューアッセイを使用して容易に決定され得る。

上記の内容は、以下の実施例により、さらによく理解され得るが、これら実施例 は、限定するものではなく、例示の目的で示されている。

犬立勇上 カルコンシンターゼ　ペチュニアの、 形質転換した同系繁殖系Ｖ２６ペチユニアを、強度３００〜６００マイクロモル ／、２秒のハロゲン金属光を補充した温室内で１６／８時間光周期で維持した。

同系繁殖系Ｖ２６は、花粉、朽およびフィラメント、ならびに雌ずい（柱頭＋花 柱）を含む、はとんどの植物組織中でフラボノイドを生産し得るペチュニアハイ ブリノドの着色系統であり、そして完全に自家相合性である。解析した形質転換 物質は、２つの独立した形質転換再生体、２１８．３８および２１８．４１　（ Ｎａｐｏｌｉ　Ｃ，、Ｌｅｍｉｅｕｘ　Ｃ，およびＪｏｒｇｅｎｓｅｎ　Ｒ，、 ｒキメラカルコンシンターゼ遺伝子のペチュニアへの導入により、トランスに存 在する、相同遺伝子の可逆釣具抑制が生じるＪ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　２巻、 ２７９〜２ｇ９頁、１９９０年）ならびに戻し交雑第二式（ＢＣ２）がらＶ２６ 親系統までの個体から成る（集団番号２４２５がら２４３５）。これら形質転換 体におけるＴ−ＤＮＡ挿入部は、選択マーカーとしてネオマイシン・ホスホトラ ンスフェラーゼ■１遺伝子に連結したウィルスプロモーターに融合したＣＨ３ｃ ＤＮＡ配列を含む（Ｎａｐｏｌｉら、１９９０年）。花粉を塗布する２４時間前 に花を除雄することにより、交雑を実施した。交雑に使用した全ての形質転換花 は、目視可能な着色の様子を何も示さなかった。花粉ドナーは、２〜３の裂開し た朽を有する植物がら選抜するが、注意深く観察し、裂開前のふくらんだ朽がら 切開して用いた。

形質転換ペチュニア植物２１８．３８および２１８．４１は、ＣＨ３遺伝子の付 加コピーを導入した後、純粋な白色の花を有する。

形質転換花弁のＣＨ３発現を試験すると、非形質転換Ｖ２６親株もしくは体細胞 復帰突然変異体と比べ、内在性ＣＨ３遺伝子と誘導されたＣＨ３遺伝子との、ｍ ＲＮＡが５０倍高く誘導されることが検出された。Ｖ２６同系繁殖系統は、葉、 茎、小柄、花柱および朽フィラメントに紫色のアンドシアニン着色を生じ、発達 中の朽に黄色のカルコン類を生じる。対照的に、形質転換植物は、これらの組織 のいずれにも、識別できるフラボノイド着色を示さない。目視可能な着色の欠如 は、実施例６に記載されている、メタノール抽出物のＨＰＬＣ分析により確認さ れている。通常、放出の直前に、成熟花粉で充満したペチュニアの朽は乾燥され る。裂開時に、朽鞘が口辺細胞に沿って縦に破裂すると、脱水された状態の組織 は、朽突出部の両端が互いに反り返って花粉粒を露出することになる。

非着色形質転換植物を精密に調査すると、朽は裂開の４８時間前に、その長さが 平均で４０％萎縮し、色がクリーム系白色から黄褐色に変化することがわかる。

対照的に、非形質転換親系統Ｖ２６の杓は約１５％萎縮するだけで、色の変化は 受けず、この期間を通じて黄色のままである。朽の裂開頻度の幅広い変化は０〜 １００％の範囲で発生し、相対湿度の低下と関連して高頻度になる。裂開はＶ２ ６親系に比して僅かに遅いこともあるが、ＣＨＳ欠失朽は開き通常量の花粉を露 出するが、その花粉は、Ｖ２６はど軽くて砕けやすいとは認められず、モして朽 鞘内で凝集したまま残存する。

（ｉ）萎縮した、黄褐色の裂開性由来の花粉、朽、または、（ｉｔ）白色の、ふ くらんだ、裂開前の朽から切開した花粉（表２．５欄参照、「形質転換自家交雑 」：種子Ｏ個／莢）のどちらかを使用して、２１８．４１のフラボノイド欠失後 代の自家受粉を数多く試みた結果、種子は得られなかった。Ｖ２６親系統の自家 交雑は、莢当たり平均２２５個の種子を生産する。これは、自家交雑を試みた７ ５個体の形質転換ペチュニアについて換算すると、約１７，０００個の種子に相 当する。表２に掲載した植物は全て、同系繁殖系統Ｖ２６の花粉を柱頭に授粉す ることによって、雌性捻挫を試験した。全てのケースで、正常な数の種子を有す る莢が生産され、ＣＨ３欠失植物は雌性捻挫であることを示した。Ｖ２６柱頭上 に形質転換フラボノイド欠失花粉を授粉した相互交雑は、表２に示すように、様 々な量の種子を生産した。　（以下余白）釦２ ヂ４′シり鳴（日；、云、）ｊ畦−ｔｐＦＡ　γ−１）ζ≧ユニーヒキニーｌ− よ；１１４：５−６）生シ鋤り一０２４２５．１ｍ　０　２　０　Ｂ Ｑ２４３０．５　０　５　３　６ ０２４３０．６　２　１　０　６ ０２４３５．１　０　１　Ｌ　６ Ｊ２４２Ｓ、１＊　Ｏｌ　ｏ　１ ＊この植物の他の枝の花は、花冠に紫色の一部着色を示した。

ａ列挙した各植物の少なくとも４つの花にＶ２６花粉を授粉すると、全てぎっし り詰まった種子莢をつけた。

平均数は莢当たり２２５である。

（以下余白） 雄の親株として１ｏの異なる形質転換植物を含めた３７の交雑法のうち、１１株 は莢を生産せず、２０株は莢当たり１５０未満の種子が入った莢を生産し、６株 は莢当たり１５０以上の種子が入った莢を生産した。これを平均すると莢当たり 約６０個の種子、すなわち、配置される種子の７０％減少であった。これらの結 果はフラボノイド欠失植物の花粉はフラボノイド欠失柱頭上では非機能的である が、野性型柱頭上では部分的に機能的である、本明細書中で条件的雄性稔性（Ｃ ＭＦ）と呼称する状態であることを示している。これらの異型交配における授粉 当たり配置される種子数の幅広い変化は、環境上および／または発育上の因子が 原因であり得る。

２つの独立した形質転換体、２１８．３８および２１８．４１は、いずれもフラ ボノイド着色の完全欠如および同一の優性な雄性不稔性表現型という同じ特徴を 示すため、ＣＭＦが雄性稔性に必要な遺伝子へのＴ−ＤＮＡ挿入に起因すること はあり得ない。この結論に関する、さらなる証拠は、形質転換再生体がしばしば 体細胞的に赤く着色した植物に逆戻りすることがあるが、形質転換遺伝子は保持 しており、形質転換遺伝子が存在するだけで内在性ＣＨ３発現が抑制されるので はないことを報告した１ａｐｏｌｉら（１９９０年）の観察である。

トウモロコシの白色花粉と類似しているとすれば、ペチュニアのＣＭＦが、ＣＨ ８もしくはＦ３Ｈ遺伝子の抑制によって生じるように、フラボノイド類の欠失に よって生じると考えられる。

犬１■引ｌ 花粉の発　および花　管の生長 インビトロでの発芽は、Ｍｕｌｃａｈｙ　ＧＢおよびＭｕｌｃａｈｙ　ＤＬの「 三核性および三核性花粉のインビトロでの生長における、補給培地の効果」、Ｐ ｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ、　５５巻、２１３〜２１６頁、１９８８年に記載さ れている簡素化したＢｒｅｖｂａｋｅｒｓ培地（本明細書中では、「発芽培地」 またはｒＧＭＪと呼称する場合もある）中で新たに採取した花粉を用いて実施し た。一つの朽に由来する花粉を培地５０μｌを含むマイクロタイターウェルに入 れ、室諷で６〜８時間揺り動かし、Ｋｏｄａｋテクニカルパンフィルムで撮影し た。

Ｈｅｒｒｅｒｏ　Ｍ、　およびＤｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｈ，Ｇ、の「ハイブリッド ペチュニアの花粉−雌ずい不和合性：和合性および不和合性の同一種内交雑に伴 う雌ずいの変化Ｊ　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｓｅｔ、、３６巻、１〜１８頁、１９７９年 に記載されるように、受粉後４８時間で、インビボでの花粉管生長を測定した。

　Ｌｅｉｔｚ　Ａｒ１５ｔｏｐｌａｎからの３５５〜４２５ｎｍ（Ｄキューブ） および抑制波長４６０ｒｖ＋ｌこおける励起で発生スるエビフルオレセンスでカ ロースプラグを可視化した。

Ｅｋｔｒａｃｈｒｏｍｅ　Ｔ　１６０フイルムで標本を撮影し、中間ネガからプ リントを作製した。

花粉の生存力は、新たに裂開した花粉を、発芽培地中、酢酸カルボキシフルオレ セイン（１ｍＭ）溶液中でインキュベートすることにより、蛍光クロマト法（Ｆ ＣＲ）で測定した（　Ｈｅ５ｌａｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ　Ｊ、およびＨｅ５ｌｏ ｐ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ　Ｙ、　、ｒ酵素的に誘導される蛍光による、花粉生存能 力の評価：フルオレセインジアセテートの細胞内加水分解Ｊ　、５ｔａｉｎ　Ｔ ｅｃｈｎｏ＋、、４５巻、１１５〜１２０頁、１９７０年）。エビフルオレセン スは、上記のようにして可視化した。

Ｌ三ニジ生産 ペチュニア花粉管は通常、発芽後約１時間で柱頭に侵入しく　Ｈｅｒｒｅｒｏお よびＤｉｃｋｉｎｓｏｎ　１９８０年）、花柱組織を通って下方に生長し、胚嚢 中に２個の精細胞を挿入する。力ロースはβ（１−３）グリコシド結合で結合し た多糖類ポリマーであり、本物質のプラグは通常、生長中の花粉管の下に規則的 な間隔で沈積される。力ロースは、脱色アニリンブルーによる染色後、特有の蛍 光により可視化される（Ｃｕｒｒｉｅｒ　１９５？年、Ｅｓｅｈｒ　ｉｃｈおよ びＣｕｒｒｉｅｒ、　１９６４年）。ＣＨ８欠失花の自家交雑種およびその植物 とＶ２６花粉との戻し交雑種の花粉管の発芽および生長を試験した。受粉後４８ 時間で雌ずいを採取し、脱色アニリンブルーで染色後、蛍光顕微鏡で調べた。一 定のパターンの力ロース沈積がＶ２６により、受粉したフラボノイド欠失雌ずい の押し出し物（ｓｑｕａｓｈｅｓ）中の花柱のずっと下に観察された。一方、た とえ柱頭上に多量の花粉が存在していてモ、自家受粉したペチュニアの雌ずいに は、力ロースは認められなかった。

の≦６．および 実施例１のフラボノイド欠失植物から新たに放出された花粉の検鏡試験を実施し たが、著しい異常は認められなかった。

ペチュニア花粉は容易に発芽し、単純液体培地中でインキュベートすると花粉管 を生じる。上記ＢＣ２ファミリー（２４２５〜２４３５）の各々からＶ２６まで の、発芽した花粉をインビトロで比較した。典型的な標本を図２に示す。図に見 られるように、生長６時間後に、多（の変異体花粉粒が、一つの発芽孔の周囲の 顕著な膨張によって確認されるように、発芽を試みている（図２の矢印）が、ど のような長さであれ、花粉管を生産したのは、ＣＨ９欠失植物由来の花粉粒のせ いぜい２％に過ぎなかった。測定可能な花粉管を生じた花粉粒の長さは、同一条 件下で生長したＶ２６花粉管の長さの２０％未満であった。

フラボノイド欠失植物により生産および放出された花粉が生存可能であるかどう か、すなわち発芽および花粉管生長が可能であるかどうかを決定するため、新た に放出した形質転換花粉およびＶ２６花粉の生存能力について蛍光クロマト分析 （ＦＣＲ）を実施した。この試験はフルオレセインジアセテート化合物の花粉粒 内取り込み、およびその後の細胞内酵素によるフルオレセインへの変換に依存す る。フルオレセインは極性が高く、植物細胞の細胞質中に封鎖されたままであり 、蛍光顕微鏡で可視化される。同系繁殖系統Ｖ２６花粉は、異常に小さく、いず れの内存的特徴も完全に欠如しているＦＣＲ陰性花粉粒子が高比率で存在する（ ４０％まで）。このタイプの粒は、写真中央の２個を含め、図２Ａにおいて幾つ か観察され得る。この集団は決して発芽しないため、おそらく発育不全の粒子で ある。残りの粒（６０％）は、そのほとんど全てがＦＲＣ試験で陽性を示し、正 常な原形質膜および活性を有する細胞質エステラーゼが存在することがわかる。

突然変異体朽由来の花粉は萎縮した、発育不全の粒を高比率で保持する。残りの 外観が正常な粒のうち、９０％以上はＦＣＲ陽性であった。フラボノイド欠失植 物によって生産された花粉のほとんどが生存可能で代謝的に活性であるという事 実は、フラボノイド活性が、正常な花粉発芽および花粉管生長について必要とさ れることを示している。

小胞子形成中のフラボノイド活性欠如によって発達中の花粉粒もしくは朽組織の 細胞構造が変化するか否かを決定するため、Ｖ２６およびフラボノイド欠失植物 ０２４２５．１での花粉の発達を比較した。連続した発達段階にある、長さが０ ．１〜６ｃｍの範囲のペチュニアの蕾から朽を採取し、Ｐｉｐｅｓ中２％１＜ラ ホルムアルデヒドおよび、１．２５％ゲルタールアルデヒド（ｐＨ７，２）で固 定し、５ｐｕｒｒＳ樹脂に包埋した後、１μ箇切片をトルイジンブルーで染色し た。Ｋｏｄａｋテクニカルノ寸ンフイルムで光学顕微鏡写真を作製した。組織学 的には、これは、胞原細胞の組織分化の最初の形跡から成熟花粉が充満した裂開 前杓までの、小胞子形成の全段階を示す。タペータム組織が花粉フラボノイドの 起源であると考えられるため、タベータム組織の発達およびその後の分裂に細か く注意を払った。全段階で、形質転換した朽および発達中の小胞子をＶ２６のも のと比較したが、顕著な組織学的差異は認めらなかった。更に、ふくらんだ白色 から、萎縮した黄褐色への変化中のフラボノイド欠失朽から切片を採取し、Ｖ２ ６の同様の段階と比較したく図３）。裂開前には、内皮層の細胞は、通常、放射 状に膨張し、肥厚し、さらに朽破裂のメカニズムに関与していると考えられる物 質を沈積する（Ｃｕｔｔｅｒ、　Ｅ、Ｇ、、「植物解剖学：実験法および説明（ その１　）　Ｊ　Ｃｅ１ｌｓ　ａｎｄ　Ｔｉ５ｓｕｅｓ　２ｎｄ　Ｅｄ、、　Ｌ ａｎｄｏｎＳＡｒｎｏｒｄ、１９７８年）。この層は連続しておらず、口辺細胞 を囲む領域には存在しない。萎縮した黄褐色の朽切片は、内皮層、口辺細胞また は朽を囲むクチクラまで、顕著な異常を何も示さなかった。しかしながら、Ｖ２ ６花粉と比較すると（図３、Ｖ２６の欄）、萎縮した、内部に特徴のない粒状物 が形質転換植物の朽室内に高比率で存在し、比較的大きな粒子については、サイ ズ、形状、および染色反応が一層不均一のようであった（図３０および３Ｄ）。

通常、図３Ｃおよび３Ｄに示されている不均一性は、通常、花粉は高度に脱水さ れた状態で放出され、柱頭上で急速に再給水されるという事実によって説明され る。フラボノイド欠失花粉は、通常よりはるかに脱水された状態で放出され得、 これを液体発芽培地に入れると、正常な状態にまで再給水されるようである。

叉１１シ± ペチュニアのフラボノイド ペチュニア花粉抽出物の分析で、主要なフラボノイドが、ケルセチンおよびケン ペロールの３−〇−６［体、４．ｚ゛、４°。

６°−テトラヒドロキシカルコン、ならびにジヒドロフラボノール、タキシホリ ンであることが同定された（Ｚｅｒｂａｃｋ、　Ｒ，、Ｂｏｋｅｌ、　Ｍ、、Ｇ ｉｅｇｅｒ、　Ｈおよび　Ｈｅ５ｓ、　Ｄ、、Ｐｈ　ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　ｓ ２８巻、８９７〜８９９頁、１９８９年；　Ｚｅｒｂａｃｋ、　Ｒ，、Ｄｒｅｓ ｓ　ｌｅｒ、におよびＨｅ５ｓ、　Ｄ、、　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ　６２ 巻、８３〜９１頁、１９８９年；ＤｅＶｌａ＋ａｉｎｇ、　ＰおよびＫｏｈ、　 Ｋ、Ｆ、Ｆ、、Ｐｈ　ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ、１５巻、３４８〜３４９頁、１９ ７６年）。トウモロコシ花粉は、少なくとも１０種のケンペロール配糖体、ケル セチンおよびイソラムネチンを含有する（　Ｃｅ５ｋａ、　Ｏ，および５ｔｙｌ ｅｓ、　Ｅ、Ｄ、、Ｐｈ　ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　。

２３巻、１８２２〜１８２３頁）。野性型および同系繁殖ペチュニア系統Ｖ２６ の両者の水性抽出物は柱頭をピンセットで解離するか、または以下ＧＭと呼称す るＰＥ０４０００培地（Ｗ、　Ｊａｈｎｅｎ、　Ｗ、Ｍ、　Ｌｕ５ｈ、　Ａ、Ｅ 、　Ｃｌａｒｋｅ％Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ旦、１巻、５０１頁、１９８９年）中で花 粉懸濁液をポルテックス撹拌し、微量遠沈機で５分間遠心分離し、その上澄の一 部を９６ウエルマイクロタイタープレートのＧＭ中のＣＭＦ花粉懸濁液に直接適 用することにより作製した。メタノール抽出は、抽出物を真空条件下で乾燥し、 と同じプロトコールに従った。最初の救助実験は、１０個のＶ２６往頭から調製 した水性抽出物２０μｍ、（全量の５分の１）を使用して３３％の発芽率を導き 出した。対照として、同様の手順でＣＭＦ植物の柱頭および花粉から抽出物を調 製した。

花粉発芽検定において、Ｖ２６柱頭および花粉からの抽出物のみが、フラボノイ ド欠失花粉の発芽および花粉管生長を回復し得た。

野性型およびＣＭＦ植物の花粉および柱頭抽出物を以下のように分析した。柱頭 または花粉を、最初、５０％メタノールで、次に１００％メタノールで抽出し、 それら抽出物をプールして濃縮した。酸加水分解によりアグリコン類を生成した 。抽出物を４Ｎ塩酸と１：１　（Ｖ／Ｖ）で混合し、２ｍｌアンプル容器に密閉 して沸騰水中で４０分間加水分解した。二回くり返したサンプルを逆相Ｃ１８カ ラム（ＰｈｅｎｏＩｌｅｎｅｘ　５ｐｈｅｒｉｓｏｒｂ　５０ＤＳ２２５０ｘ　 ４．６ｍｍ）に注入した。溶媒Ａは５％酢酸、そして溶媒Ｂは８０％アセトニト リル中５％酢酸から成る。各流出時間は、６分間の無勾配（２０％Ｂ）、続いて ９０％Ｂに至るまでの２０分間の直線勾配、そして１４分間の９５％Ｂである無 勾配で終結した。溶媒流速は、室温で０．５Ｉｌｌ／分であった。検出は、Ｈｅ ｖｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　１０４０Ａ型フオトダイオードアレイ検出器を用 いて、３６０ｒｖで行った。野性型柱頭抽出物中に柱頭あたり６０ｎｇのケンベ ロールが検出されたが、ケルセチンは実質的にそれより低濃度であった。１５０ のＣＭＦ柱頭ブールもしくは５００のＣＭＦ朽からの同等の抽出物は、典型的な フラボノールスペクトルのピークを生じなかった。

野性型柱頭抽出物の蛋白消化酵素、熱および分子サイズ膜通過処理は、活性化合 物が小さい、非蛋白性分子であることを示した。活性化合物の分子量は、抽出物 を３０００ダルトン分子量カットオフフィルター（Ａｍｉｃｏｎ、　Ｃｅｎｔｒ ｉｃｏｎ−３０フイルター）を通過させることにより推定し、花粉救助活性がフ ィルターを通過したことで実証された。Ｖ２６柱頭および花粉の水性抽出物を反 応量１００μｌで３７℃３０分間、０．０２５単位のパパインで処理した。酵素 活性は、同一条件下でＢ　Ｓ　Ａ　（０，５＋ａｇ／ｍｌ）を処理し、ＳＤＳポ リアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）で消化産物を試験することにより 確認した。プロテアーゼ処理および加熱処理（１００”Ｃ１５分）のいずれも、 抽出物のＣＭＦ花粉発芽および花粉管生長を救助する力を消失させなかった。

総じて、これらの結果は、野性型花粉に存在するフラボノイド類は花粉発芽に寄 与しており、野性型柱頭はＣＭＦ花粉におけるフラボノイドの欠如を代償するこ とができる類似化合物を含有することを示している。

実施例１のフラボノイド欠失花粉の生化学的補足は、発芽培地（ＧＭ）でのＣＭ Ｆ花粉懸濁液に低濃度（１μＭ）のケンペロール（１種のフラボノールアグリコ ン）を加えることによって完遂される。図４に示すように、１２時間の生長期間 を通して行った同時比較で、フラボノール補給を何も受けない野性型Ｖ２６花粉 （Ｃ）に比べ、救助されたＣＭＦ花粉（Ｋ＋）は、発芽が同時に開始され、同一 速度で同程度まで花粉管生長が進行することが確認された。救助はほぼ完全であ った：上記フラボノイド補給花粉はＶ２６花粉と比較して、８０％の発芽９Ｊ度 を示した。ＤＭＳＯ溶媒のみを加えたＣＭＦ花粉（Ｋ−）は、顕著な発芽を示さ ず（１〜２％）、発芽した場合であっても、花粉管が花粉粒度径の２倍以上には ならなかった。

花粉発芽および花粉管生長を救助し得る野性型柱頭抽出物がケンペロールを含有 することを確認するため、ＨＰＬＣで非加水分解抽出物を分画し、ＵＶ／可視吸 収分光光度法で分析した。■２柱頭抽出物中に、１つの保持時間を有するピーク および典型的なフラボノールスペクトル（吸収最大が２６０および３６０ｎｍ付 近）が検出された（図５Ａおよび挿入図）。この推定ケンペロールピークを回収 し、乾燥するまで蒸発し、ＤＭＳＯに懸濁し、ＣＭＦ花粉から完全発芽および花 粉管生長を誘引したインビトロＧＭ培地にこれを加えた。この活性画分と認証済 ケンペロール標準との再クロマトグラフィーにより、その純度および同一性が確 認された。１５０個の柱頭を用いた上記分析から、Ｖ２６柱頭中のケンベロール の量はａｏｎｇ／柱頭であると算出された。柱頭容積を３４μｌと仮定すると（ 容積置換）、Ｖ２６柱頭中のフラボノール濃度は約６μＭであり、強力な発芽反 応を誘引し得るレベルである。１５０個のＣＭＦ柱頭プールもしくは５００個の ＣＭＦＭからの抽出物に対する同等の分析では、典型的なフラボノイドスペクト ルを示すピークを生じなかった（図５Ｂ参照）。Ｖ２６花粉および朽からの抽出 物は、図５に示されているものと類似したクロマトグラムを生じ、ケンベロール を示す、保持時間およびＵＶ／可視スペクトルを有する溶離ピークは、これをＧ Ｍ中のＣＭＦに加えると、花粉発芽を充分に刺激した。上記分析により、野性型 花粉および朽中にケンペロールが存在することが確認された。

活　に必　な　０的。

ペチュニア由来の、野性型花粉および柱頭の抽出物は、ケンベロールに加えて、 花粉発芽および花粉管生長を刺激し得る、他の化合物を含有する（図５Ａ参照） 。したがって、全ての主要クラスのフラボノイド類の代表的化合物、即ち、フラ ボン類、フラボノン類、フラボノール類、イソフラボノイド類、カルコン類、ア ントシアニン類、およびカテキン類の花粉救助活性を以下のように分析した。ペ チュニア花粉粒をＰＥ０４０００発芽培地（ＧＭ）中で、１〜２　Ｘ　１０’／ ｍｌの密度で懸濁し、その懸濁液の一部（１００μｌ）を９６ウエルマイクロタ イタープレートの各ウェルに入れ、Ｉｓｏｒｐｍで振盪しながら室温でインキュ ベートした。いかなる補給物も、花粉に加える前のＧＭに直接には加えなかった 。フラボノイドおよび他の化学物質の貯蔵溶液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭ ＳＯ）　中で直接Ｒ製し、そして下記の表４中に示される最終濃度になるまで、 各ウェルに加えた。ＤＭＳＯ濃度は各検定で１％に保つ。花粉管が花粉粒度径の 長さ以上になった場合の花粉を発芽したものとして記録した。実際には、発芽し た全ての粒子が花粉粒度径の５倍より長く生長しつづける。実施例１に記載のよ うに、ペチュニアＶ２６は、２つのタイプの成熟花粉を生産するが、粒子の約２ ５％は小さくて内部の特徴がなく、インビトロで決して発芽しない。したがって 、総花粉粒子の７５％が発芽した場合が、Ｖ２６における完全発芽である。実施 例１のＣＭＦペチュニア花粉は、上記と同様の比率を維持している。はとんどの 救助実験において、最大発芽頻度は生育可能孔粉粒の８９％であった。各検定と も４時間インキュベーション後の最小限１０００個の花粉粒を記録した。被験化 合物の発芽反応を得るために必要な最低濃度を下記の表３に記載するが、表中の ＮＲは無反応を示す。１００μＭで２０％未満の発芽を生じさせる化合物を〉１ ００μＭと表す。表３に記載した化合物に加えて、非フラボノイド類のｐ−クマ リン酸、サリチル酸、ヒドロキノン、クロロゲン酸、ジヒドロアスコルビン酸、 ナフチルフタルミン酸（ＮＰＡ）、１−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）　、インドー ル−３−酢酸（Ｉ　ＡＡ）およびジベレリン酸（ＧＡ３）を試験したが反応しな かった。

（以下余白） 久３ り＋ら弓Ｌリン　〉１００ （シ１、千ｆ、白） 表３から認識され得るように、アグリコンフラボノール類は、ＣＭＦ花粉の発芽 頻度および花粉管生長能を最大限までうまく回復させたが、その他のクラスのフ ラボノイド類の中では、密接に関連したジヒドロフラボノールである、タキシフ ォリンのみが１００μＭでわずかな反応（〜１８％）を生じた（図４）。さらに 、フェノール酸、抗酸化剤、および植物生長調節物質を含む、幾つかの部類の非 フラボノイド化合物を試験したが、いずれも花粉発芽を救助し得なかった。従っ て、生理学的に適正な濃度で花粉機能を救助する能力は上記フラボノール類に存 在すると考えられる。

試験したフラボノイドの範囲から、花粉発芽および花粉管生長のための５つの一 般構造的要件が同定された。３−炭素位における置換されていないヒドロキシル 基およびＣ環の４位におけるケト基は、絶対必要である。最大限の反応は、Ｃ環 の２位と３位との炭素間の不飽和結合ならびにＡおよびＢ環のヒドロキシル基置 換の程度に依存する。非常に興味深いことに、ペチュニアの花粉および柱頭を含 め、植物組織に見られる、最も豊富なタイプのフラボノール類であるにもかかわ らず、３位のヒドロキシル基を介してグリコジル化したフラボノール類は不活性 である。１００μＭまでの濃度のケルセチン−３−〇−グルコシドおよびルチン （ケルセチン−３−０−ラムノグルコシド）を試験した場合であっても、全く花 粉発芽しなかった。Ｃ環の４位のケト基の必要性は、カテキンはケト基を持たず 、活性が欠如しているという事実から示される。タキシフォリン（１００ｕＭで 〜１８％）トケルセチン（１０μＭで〜５０％）との相対効果の比較は、Ｃ環の ２位と３位との炭素間の二重結合が反応を約３０倍増強することを示している。

ケルセチンと、フィセチンまたは３−ヒドロキシフラボンとの比較は、Ａ環の５ 位または７位のいずれかに、付加されるヒドロキシル基が反応を約１０倍増強す ることを示している。この増強は主として、５位のヒドロキシル基と隣接するｃ 環のケト基との間の相互作用の安定化作用に依存している。結局、Ｂ環のヒドロ キシル基置換は十分な活性を得る為に必要ではなく、結局、置換基数が増加する と、実際には活性が低下する（ケンペロールをケルセチンおよびムリセチンと比 較されたい）。この違いは多数のヒドロキシル基を有するフラボノール類の増大 した有極性によって生じる不十分な取り込みまたは非特異的結合の増加に起因す ると考えられる。

非活性フラボノイド類は根粒菌マメ科植物系において根粒着生遺伝子の活性フラ ボノイドによる誘導を拮抗することが報告されている（Ｄｊｏｒｄｊｅｖｉｃ、 　Ｍ、Ａ、、Ｒｅｄｍｏｎｄ、　Ｊ、Ｗ、、Ｂａｔｌｅｙ、　Ｍ、およびＲｏｌ ｆｅ、　Ｂ、Ｇ、、囮、６巻、１１７３〜１１７９頁、１９８７年；　Ｐｅｔｅ ｒｓ、　Ｎ、に、およびＬｏｎｇ、　Ｓ、に、、Ｐｌａｎｔ　薊■包胆■、８８ 巻、３９６〜４００頁、１９８８年）。花粉機能の救助に対して非活性な化合物 のフラボノールアグリコン類の作用を拮抗する能力について下記のように試験し た。実施例１に記載のＣＭＦ花粉を、ＧＭ中でケンベロールをｌμＭになるよう に加える前に、濃度ｌおよび１０μＭの非活性化合物に３０分間さらした。非活 性物質およびケンペロールをｌ：１またはｌＯ：ｌの比率で花粉懸濁液に同時に 加える実験も実施した。４時間インキュベーシツンした後、花粉発芽頻度を記録 したが、試験したどの組合せでも拮抗作用は検出されなかった。以下の非活性化 合物を分析した：アビゲニン、カルコン、エリオシクチオール、フラボン、フラ バノン、ルテオリン、ナリンゲニン、カテキン、クロロゲン酸、ｐ−クマリン酸 、ヒドロキシン、およびサリチル酸。

Ｋ監興見 見茎菱来 部分的にフラボノイド類はそのＵＶ光吸収能のため、植物のＵ■保護剤として機 能することが想定される（　Ｗ、　Ｊ　ａｈｎｅｎおよびに、　）Ｉａｈｌｂｒ ｏｃｈ、・Ｐｌａｎｔａ　１７３巻、４５３頁、１９８８年およびその中の参考 文献）。フラボノイド欠失花粉の発芽不全が、ＵＶ効果によるものかどうかを決 定するため、暗闇での発芽実験を３つのバリエーションで行った。花粉を、（１ ）採集後、２４時間完全に暗闇で（水中に）保存した花、または、（２）新たに 採集した花、のいずれかから採取した。暗室の赤色安全光下、これら２つの起源 からの花粉懸濁液をフラボノール類含有および非含有ＧＭで調製した。三番目の バリエーションでは、新たに採取した花由来の花粉懸濁液を明所で調製し、暗所 でフラボノール溶液を加えた。全ての標本をホイルに包み、実施例５に記載のよ うにインキュベートした。フラボノール添加の有無にかかわらず、対照のＶ２６ また（よフラボ／イド欠失花粉のいずれの場合も、発芽頻度ζこおよｉｆす検出 可能なレベルの光の影響は存在しなかった。

ＵＶ光が自家受精に影響したかどうかを決定するため、Ｌ。

Ｐ、　ＴａｙｌｏｒおよびＷ、Ｒ，Ｂｒ１ｇｇ５．　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１２巻 、１１５頁、１９９０年に記載されるように、６１０ｎ＋ａフィルター下でペチ ニニア植物の成熟植物を数週間栽培した。ペチュニアの蕾は、形成され、成熟す るまでに約２週間を要するため、上記フィルターの下に植物を置いた後で形成さ れた蕾のみを試験し、モして６１０ｎ■より低波長の光にさらされていな％Ｎ蕾 は自家受精した。ごの交雑（９１０回の試行）のいずれでも種子の配置（よ生じ な力）つたが、同じ条件下で実施した全てのＶ２６対照Ｃヨ自家交雑し、種子が 充満した莢をつけた。

完全な発芽および最大限の花粉管生長に必要なフラボノイド曝露量を、発芽花粉 がフラボノール中１こ存在して（する時間を変えることにより、決定した。ケン ベロールを＋ｉ　ｉ！最大限の救助を与えるように計算された濃度（これ（よ洗 浄によって容易に除去される（最終０．５μＭ））となるように、フラボノイド 欠失花粉の懸濁液（ＧＭ中）を含む、６０ｘ１５■■のペトリ皿に添加し、得ら れた懸濁液を１５０ｒｐ＋ｏで連続的（こ回転した０表４に示した各時点で、上 記懸濁液の一部（４００μｌ）を取り出して、遠沈し、ＧＭｌｍｌで洗浄してケ ンペロールを除去し、再遠沈し、ＧＭ４００μｍに再懸濁した後、部分した。そ の一部（１００μｍ）は０５μＭケンペロールに再度加えた（対照区）が、残り の部分は、さらなるフラボノール曝露を行わず培養した（処理区）。元の懸濁液 の調製から総研要時間にして４時間、培養を続け、その後に処理区および対照区 の両者の発芽における発芽頻度および花粉管の長さを記録した。結果を表４に（ 以下余白） 舊≠ ユＱ　６．６　４−／−２，７２ｘ　５５．Ｓ　＋／−８．６６０　３８．９　 ＋７−２．９　３ｘ　４８．４　＋／−１，３１２０４７，３＋／−３，６＞５ ｘ　４７．７　＋／−２，２＊　平均±ＳＥＭ、ｎ＝３ ＊＊花粉粒直径との相対比率 表４に示されるように、無視できない発芽の増加が１ｏ分という短い曝露時間で 検出された（表１）。最大の発芽頻度および花粉管長を得るには、１〜２時間の 曝露時間が必要であった。

上記フラボノールアグリコンを受粉と同時に花粉に添加することによる、上記Ｃ ＭＦペチュニアの自家捻挫を回復させる能力を添加したフラボノールの存在下で 行った、該ＣＭＦペチュニアの自家交雑で受精が成功した数を計測することによ り調べた。自家受粉の前に、フラボノールアグリコン類を（ｉ）柱頭に直接、ま たは、（ｉｉ）新たに採取した花粉と混合して、のいずれかで塗布した。生じる 種子量で測定した場合に最も成功した技法は、自家受粉の１２〜１６時間前に、 フラボノールを柱頭に塗布する技法であった。ケンペロールまたはケルセチンを 添加した、４７回の自家交雑が実施され、はぼ６０％（４７中の２７）が種子莢 を生産した。莢当たりの種子数は３１から２８７まで様々で、いずれの莢の種子 も発芽試験において、その９０％以上が生存可能であった。フラボノールを添加 しないで実施した全ての自家交雑（３０回以上の試行）で、種子の産出は得られ なかった。

フラボノイド欠失ペチュニアが示した優性のＣＭＦ形質は、カナマイシン耐性（ ＫＡＮ）を与える第二の優性遺伝子に密接につながっている（Ｎａｐｏｌｉ、　 Ｃ，、Ｌｅｍｉｅｕｘ、　Ｃ，およびＪｏｒｇｅｎｓｅｎ、　Ｒ，、「キメラカ ルコンシンターゼ遺伝子のペチュニアへの導入により、トランスに存在する相同 遺伝子の可逆物共抑制が生じるＪ　、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、　２巻、２７９〜 ２８９頁、１９９０年）。

Ｋ　Ａ　Ｎマーカーを使用して、添加したフラボノールが存在する条件下でのフ ラボノイド欠失植物の自家交雑により生産された種子での、ＣＭＦ特性の分離を 試験した。新たに採取した種子を２０％漂白剤中で表面滅菌し、滅菌水で洗浄し た後、１１００ｐｐのＧＡ３溶液中で３０分間浸漬してから、１００μｇ／ｍｌ カナマイシンの発芽プレート（ＩＸＭＳ、３ｍＭ　ＭＥＳ　ＣｐＨ５６〕、ｌＸ Ｂ５　ビタミン混合、３％スクロースおよび０．２％凝固剤）に播種した。２３ °Ｃ１１６／８時間光周期で培養後、カナマイシンに感受性の実生苗によるスク リーニングで、カナマイシンに対する耐性を記録した。以下の表５中のＰ値は自 由度ｌのχ２適合度検定で認められた統計上の有意性を表す。

艮ｒ １７５　５８　１７　０．７４ ２　６５　５０　１５　０．８３ ３　８１　５９　２２　０．７５ 表５に示すように、１００μｇ／１１１カナマイシン存在下で発芽した種子は、 異型接合体での優性形質で予測されるように、ＫＡＮ耐性：感受性が３＝１の比 率で分離した。

天然のフラボノイド欠失トウモロコシ突然変異体（白色花粉、フラボノイド活性 の欠失）であって、白色の機能のない花粉を生産し、自家不稔性である変異体を 使用して圃場試験を行った（Ｅ、Ｈ，Ｃｏｅ、　Ｓ、Ｍ、　ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ 、　Ｓ、Ａ、Ｍｏｄｅｎａ、　Ｊ、Ｈｅｒｅｄ、、７２巻、３１８頁、１９８１ 年）。添加したフラボノイド類の存在下で合計４５回の自家交雑を実施し、その 全て（１００％）が完全に充満した雌穂を生産したが、フラボノイド類を添加せ ずに実施した自家交雑（４５回の試行）では、種子の生成は正常の１％未満であ った。使用した白色花粉トウモロコシ植物には、同系繁殖の基礎のＷ２３に遺伝 子移入されたＣ２およびＷｈｐに、安定した劣性突然変異を有した。上記白色花 粉植物（Ｃ２／　ｃ　２　ｗ　ｈ　ｐ　／　ｗ　ｈ　ｐ　）はＣＨＳのただ１つ の機能的コピーを持っている同質遺伝子植物（Ｃ２／ｃ２　ｗｈｐ／ｗｈｐ）由 来の花粉で交雑することにより維持した。上記植物は自家交雑および同胞種での 交雑では雄性不稔性であり、花粉および種子を含め、どの組織にも目視可能なフ ラボノイド着色は生じなかった。標準の遺伝学的圃場実習を用いて、混入してい る花粉が白色花粉植物の絹糸状の毛に到達しないようにした。さらに、白色花粉 のブロックは着色の粒品種で囲み、混入している粒であれば直ちに認識されるよ うにした。

５０〜１００の植物に由来する突然変異体である白色花粉を雄穂のうから採取し 、プールし、部分した。その一方は、現状のままで交雑に使用し、他方は約２０ ：１の比率で乾燥フラボノイド類（ケルセチン、ケンベロールのいずれか、また はそれらのｓｏ　：　ｓｏ混合物）と混合した。用意した白色花粉の絹糸状の毛 に未処理の白色花粉またはフラボノイド処理白色花粉のいずれかを授粉し、直ち に袋がけした。授粉後４５日目に成熟雌穂を採取した。白色花粉交雑は、通常、 雌穂当たり２００以上の粒をつけた。この数は、上記生化学的に相補された自家 交雑でルーチンに得られた。添加したフラボ／−ル類の存在下で、合計４５回の 自家交雑を実施し、それらの全て（１００％）が完全に充満した雌穂を生産した が、フラボ／−ル類を添加せずに実施した自家交雑（４５回の試行）では、生じ た種子は、正常の１％未満であった。

前述の実験で花粉機能にフラボノイド類が必要なことが確認された。それは以下 の通り：　（Ｉ）野性型柱頭および花粉のメタノール抽出物および水性抽出物は 、フラボノイド欠失の花粉発芽および花粉管の生長を回復させ得る；　（ｉｉ） これらの抽出物は、本明細書中に記載のインビトロ雄性救助検定法で活性を示す ものと同様のフラボノール類を含有する；（ｉｉｉ）花粉の発芽を救助し、イン ビトロにおける完全な花粉管生長、およびインビボにおける完全な種子を回復さ せる能力は、特定のクラスのフラボノイド、フラボノールアグリコンに限られる ；　（ｉｖ）フラボノールの有効濃度はその構造上の特徴により変化するが、幾 つかの化合物は、明らかにこれらの化合物の生理学的濃度内である、１０μＭ未 満の濃度で顕著な作用を示す。

フラボノイド類は、苔類、蘇類およびシダ類から裸子植物および被子植物まで、 事実止金てのクラスの植物により生産される。過去のフラボノイド調査は、乾燥 植物標本の乾燥葉または根の組織をしばしば使用した。従って、花粉フラボノイ ド類が広く存在していることの良い証拠を有していなかった。植物組織中での遍 在性および幾多の広く分岐する種からの花粉抽出物より、フラボノイド類が同定 されるという事実により、フラボノイドが花粉の普遍的な成分であることが実証 される。はとんどの植物の７ラボノール類は３−０−グリコジル化された種類で あり（Ｔｈｅ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ、　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ刊、Ｌｏｎｄ ｏｎ）　ｃｈａｐｓ、７．８中のＪ、　Ｂ、　Ｈａｒｂｏ＋ｉｅおよびＣ，Ａ、 ＷｉｌｌｉａｍＳの文献、１９８８年）、そしてこれはペチュニア花粉では優勢 型である（０．　Ｃｅ５ｋａおよびＥ、Ｄ、５ｔｙｌｅｓ、　Ｐｈ　ｔｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒ　、　２３巻、１８２２頁、１９８４年）。アグリコン形態のみが花 粉機能を救助し得ることから、検出されない程の低濃度のアグリコンが常に存在 するか、あるいは受精に必要なアグリコン類の生産にグリコシダーゼ活性が必要 であることが示唆される。

花粉は受精プロセスを操作するための、自然のアクセスポイントを提供する。結 果としてＣＭＦ植物を生じることになるフラボノイド発現の欠如は、殺配偶子剤 ではなく、天然の配偶子発育阻止剤として作用する。フラボノイド欠失花粉の完 全な雄性機能は、フラボノールの外部からの投与により回復させ得る。高等植物 の受精に関与する因子の同定に加えて、ハイブリッド種子生産のための可逆的雄 性不稔性系の開発は非常に有益である。

本明細書中に記載の発明に従って、フラボノール生産に影響する遺伝子を誘導プ ロモーターに接続すれば、不稔性が制御され得る。そのような既知の遺伝子には ＣＨＳ類、参考として本明細書中に援用された上記Ｃｏｅらの文献に記載のＣ２ およびＷｈｐなどがある。あるいは、公開されたＡｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍのＦ３ Ｈ配列に基づいたＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ハイブリダ イゼーションプローブを創出することにより、Ｆ３Ｈ遺伝子が単離され得る（上 記５ａｉｋｉ、　Ｒ，に、、１９９０年参照）。

このように、本明細書中に記載のフラボノール類の生産を制御する遺伝子を使用 することにより、不稔性を制御し得る。

一般に、本明細書中に記載の発明に従えば、フラボノール生産を調節する遺伝子 を誘導可能な所望されるプロモーターと共に、植物に組み込み得る。決定的なフ ラボノールが生産されないため植物は不稔性になるが、プロモーターが誘導され ると、植物は雄性になる。フラボノールを生産する本来の遺伝子は、戻し交雑や 相同的組み換え等、以下に記述する種々の方法のいずれかにより不活性化される 雄性植物に、普遍に存在する。

プロモータ一 本発明の実施では、雄性雄性の原因であるクローン化した遺伝子のプロモーター 領域を除去し、特定の外部刺激にのみ反応するプロモーターと置換する。したが って、上記遺伝子は外部の刺激に反応しなければ、転写されない。遺伝子が転写 されない限り、その遺伝子産物（花粉の発達の完成に必要である）は生産されな い。これは花粉発達の生化学的／生理学的経路の１つ又はそれ以上の破損を起こ し、その結果、雄性不稔性を生じる。この植物は、選択したプロモーターを活性 化する特定の刺激下で雄性になることができるにすぎない。

本発明の実施に使用できる反応性プロモーター系の一つの実施例は、トウモロコ シのグルタチオン−５−）ランスフェラーゼ（Ｇ　Ｓ　Ｔ）系である。ＧＳＴは 、発芽前除草剤とじてしばしば使用される、多くの疎水性親電子化合物を解毒し 得る酵素に属する（Ｗｉｅｇａｎｄら、［トウモロコンの除草剤耐性の原因であ るグルタチオン−３−）ランスフェラーゼのメツセンジャーＲＮＡは毒性緩和処 理に応じて誘導されるｊ　、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ証、 ７巻、２３５〜２４３頁、１９８６年）、ＧＳＴでトウモロコシ種子を処理する と除草剤に対するトウモロコンの耐性が増強することが確認されている。ＧＳＴ が上記耐性の増強に直接関与していることは、試験で明らかにされている。

この作用には、主として特定の１．１ｋｂのｍＲＮＡ転写物が介在している。簡 単に記述すると、トウモロコシは、ＧＳＴに反応し得、そして誘導されて遺伝子 産物を生産し得る、静止性の遺伝子を常に有する。この遺伝子は既に同定され、 クローン化されている。従って、本発明の１つの実施態様では、上記ＧＳＴ反応 性遺伝子からプロモーターを取り出し、本来のプロモーターが除去された雄性捻 挫遺伝子に連結する。この加工された遺伝子は外部の化学的刺激に反応するプロ モーターと、稔性花粉の充分な発達の原因となる遺伝子との組合せである。

濃葺Ｊジ」人 クローン化したＤＮＡをトウモロコシに移入する為の種々の方法は、当該分野で 周知である。上記方法は、トウモロコシプロトプラストへのＤＮＡ取り込みを促 進するエレクトロポレーション（Ｒｈｏｄｅｓら、「プロトプラスト由来の遺伝 学的に形質転換されたトウモロコシ植物Ｊ　、５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、　２ ４０（１９８８年４月８日））；トウモロコシプロトプラストのポリエチレング リコール処理（Ｌｙｚｎｉｋら、ｒ　ＧｕｓＡおよびＮｅｏ遺伝子による、トウ モロコシプロトプラストの安定な共−形質転換ＪＰｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ ｒ　Ｂｉｏｌｏ　１３巻、１５１〜１６１頁、１９８９年）；およびＤＮＡ含有 ミクロ放射物のトウモロコシ細胞への放射（Ｋｌｅｉｎら、［粒子放射によるト ウモロコシ細胞の遺伝学的な形質転換Ｊ　、Ｐｌａｎｔ上加１１す１．、（１９ ８９年）、９１巻、４４０〜４４４頁）オヨびＫｌｅｉｎら、「高速度微粒子放 射によるトウモロコシ細胞への遺伝子送達に影響する要素Ｊ　、Ｂｉｏ／Ｔｅｃ ｈｎｏ包鉦、Ｖｏｌ、６．１９８８年５月）を包含し、全て参考として援用され る。

これらの技法は、各々、長所および短所を有する。各々の技法では、プラスミド 由来のＤＮＡは遺伝子工学的に処理されているため、目的の遺伝子に加え、選択 可能なマーカー遺伝子およびスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含有する。

選択可能なマーカー遺伝子は上記プラスミド（その構造は目的の遺伝子であり、 選択可能な遺伝子およびスクリーニング可能な遺伝子もユニットとして移入され る）の完全なコピーを有する細胞のみを選択するのに使用される。スクリーニン グ可能な遺伝子は、目的の遺伝子を保持する細胞のみを培養するための別の確認 手段を提供する。一般に使用される選択可能なマーカー遺伝子−はネオマイシン ホスホトランスフエラ−セｌｌ　（ＮＴＰｌｌ）である。この遺伝子は、カナマ イシンに対する耐性を伝達する。この化合物は細胞が成育する成育培地に直接加 えることができる。植物細胞は通常、カナマイシン感受性であるため、その結果 、死滅する。ＮＴＰＩ＋遺伝子が存在するとカナマイシンの影響を克服し、この 遺伝子を有する各細胞は生存できる。本発明の実施に使用し得る他の選択可能な マーカー遺伝子は、除草剤グルホシネート（Ｂａｓｔａ）に対して抵抗性を与え る遺伝子である。一般に使用されるスクリーニング可能な遺伝子はβ−グルクロ ニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である。この遺伝子の存在は、形質転換されたことが 推定される細胞のサンプルをＧＵＳ検定溶液で処理する、組織化学的反応を用い て特性化される。適切なインキユベーンコンの後、ＧＵＳ遺伝子を含有する細胞 は青色に変わる。

他のスクリーニング可能な遺伝子は、１９８９年８月１日に出願したＢｏｗｅｎ らの同時係属出願（Ｕ、Ｓ、ＳｙＮ、　３８７，７３９）に記載の、アンドシア ニン生合成の転写活性因子である。この遺伝子は色素アントシアニンの合成を引 き起こす。上記遺伝子を含有するプラスミドで形質転換された細胞は赤色に変わ る。好ましくは、上記プラスミドは、選択可能なマーカー遺伝子およびスクリー ニング可能なマーカー遺伝子の両者を含有する。

上記遺伝子を１つ又はそれ以上含有するプラスミドを、上記のいずれかの技法で トウモロコシのプロトプラストまたはカルス細胞に導入する。マーカー遺伝子が 選択可能な遺伝子であれば、上記ＤＮＡのひとまとめを組み込んだ細胞のみが、 適切な植物毒性剤による選択下で生存する。適切な細胞が同定され、増殖されれ ば、植物体を再生する。形質転換植物の後代は、上記ＤＮＡのひとまとめが該植 物のゲノムに充分に組み込まれていることを確認するために試験される。

記述されている処理により、本来の稔性遺伝子が機能することは、当業者には容 易に認められる。相同的組み換えで本来の遺伝子が置換される。本来の遺伝子を 不活性化する別の方法は、周知の戻し交雑によるもので、その−例は実施例９に ぎ己載されている。

あるいは一つの例示として、植物中のＦ３Ｈ酵素の発現を防止するために、植物 中のＦ　３　ＩＩ、ＣＨＩまたはＣＨＳをコードする遺伝子の除去、ブロック、 または発現の減損を行い得る。インビボにおけるＦ３１１合成のブロックに加え て、Ｆ３Ｈと直接作用して、そのヒドロキシラーゼ活性を不活性化もしくは減損 する分子でＦ３Ｈ活性をブロックしてもよいことは明白である。加えて、フラボ ノール類の生産をＣＨＩ活性のブロックによって減損してもよい。しかしながら 、上記代替法はＣＨＩが存在しない条件下でもカルコノナリンゲニン（ｃｈａｌ ｃｏｎｏｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）からナリンゲニンへの変換が徐々に自然に進行 するため、あまり好ましくない。上記は、本発明範囲に包含される種々の実施態 様の１つにすぎない。

飄稔性選抜および、性口復 上記遺伝子を植物に導入後、適切な植物の型、すなわち雄性不稔性植物を選抜す る。これらの植物は、単離し、そしてクローン化した雄性捻挫遺伝子が、その本 来のプロモーターを保持しておらず、したがって、充分な花粉の発達に関して決 定的な遺伝子産物を生産していないために１、雄性不稔性である。したがって、 上記遺伝子工学的に処理された遺伝子は、その遺伝子の劣性突然変異体対立遺伝 子として機能する。

通常の植物バイオテクノロジーでは、形質転換および再生に続いて望ましい遺伝 子型が同定されると、その植物を自家受粉してその遺伝子型を復元する。しかし ながら、本発明の実施に際しては、所望される遺伝子型が雄性不稔性であるため 、該遺伝子型を第一世代で自家受粉し得ない。後代を得るための雄性は、上記遺 伝子の転写を誘導する化合物を植物に噴霧し、置換されたプロモーターの活性化 により、誘導される。

ＧＳＴプロモーターの場合、上記化合物は、好ましくは、Ｎ。

Ｎ−ジアリル−２−２−ジクロロアセタニド等のＧＳＴ−誘導化合物である。雄 性雄性遺伝子に連結したプロモーターは、上記化学物質に反応して遺伝子の転写 を開始する。これが生じると、上記遺伝子の正常な遺伝子産物が生産され、ある レベルの雄性雄性が誘導される。次いでこの植物由来の花粉を使用して、元の選 抜された遺伝子型の受粉を効果的に実施する。

所望される遺伝子型の最初の単離および増殖が完了した場合、本手法はより単純 化される。ハイブリッド交雑で雌親として使用される同系繁殖体のみを雄性不稔 性変種に形質転換する。それらが形質転換された場合、雄性不稔性／雌性捻挫種 子の量は増加する。これは隔離された（他のトウモロコシ花粉から隔離）領域に 栽培し、プロモーターが反応する化学物質を噴霧することにより完成する。噴霧 により、プロモーターは連結した遺伝子の転写を開始し、ある程度の雄性が生じ る。ＭａｒｉａｎｉらのＰＣＴ国際公開第ｗ０８９／１０３９６号（国際出願第 ＰＣＴ／ＥＰ８９１００４９５号に基づく）に開示される系（不稔性が誘導され た）と比較して、水系の特に優れた有用性は、処理が１００％有効でな（でもよ いことであり、その場合であっても、用いられる全ての絹糸状の毛の受精に、実 際に必要な量よりはるかに多くの花粉がトウモロコシ植物により生産される。

従って、たとえ雄性の回復が低率であっても、許容できるレベルの種子の増加が 得られる。それと同時に、本発明の植物は通常、雄性不稔性であり、雄性にする には処理を必要とするため、ハイブリッド種子生産において、自家受粉は起こら ない。不稔性を誘導する系では、ハイブリッド種子を生産する場合、自家受粉を 回避するための不稔性の誘導は、１ｏ。

％成功させねばならない。

雄性を誘導する化学物質処理では、親株−世代のみが雄性を回復するにすぎない ため、収穫した全ての種子は、同型接合体であって不稔性であり続ける。この種 子は、ハイブリッド生産圃場で、雌親として使用される。この植物は雄性不稔性 であるため、除雄の必要はない。このような種子から生産されるハイブリッド植 物は、雌親から改変遺伝子１つと、雄親から正常遺伝子１つとを受け継ぐ結果、 全て雄性雄性である。従って、正常に花粉が生産される。

前述の例示は、本発明の好ましい実施態様であるが、本発明の精神および範囲か ら逸脱することなく、種々の変更が行われ得ることは理解される。

Ｆ工ＧＵＲＥ　ｉＡ　ＦＩＧＵＲＥ　ＩＢＶ２６　０２４２５．１ ０．０１　０．１　１　１０　１００ フラ上パノール Ｆ工ＧＵＲＥ　６ 、　−−、、　ＰＣＴ／ＬＩＳ　９３１０２１２７フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、　ＫＲ，ＫＺ、　Ｌ Ｋ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ、　Ｐ Ｔ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＳＥ。

ＳＫ、ＵＡ （７２）発明者　アルバートセン、マーク　シー。

アメリカ合衆国　アイオワ　５０２６５．　ウェスト　デモイン　ニス、６０テ イーエイチストリート　１９３０ （７２）発明者　ビーチ、ラリ− アメリカ合衆国　アイオワ　５０３０９　、デモイン、マコケタ　ドライブ　３ ９３９ （７２）発明者　ハワード、ジョン　エイ。

アメリカ合衆国　アイオワ　５０２６５．ウェスト　デモイン、バレイ　リッジ 　コート（７２）発明者　ハフマン、ギヤリー　エイ。

アメリカ合衆国　アイオワ　５０３１１．デモイン、４１エステイ−ストリート 　１４３１（７２）発明者　タイラー、ラブリン アメリカ合衆国　ワシントン　９９１６３．パルマン、ハイランド　ウェイ　ニ ス、イ＋、　５３０

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．遺伝性の、外部から制御し得る雄性不稔性を植物に提供する方法であって、 以下の工程； ａ）植物のフラボノール生産に影響する遺伝子を選択する工程； ｂ）該選択した遺伝子をクローン化する工程；ｃ）外部制御に反応する誘導プロ モーターを含む発現配列に、該クローン化遺伝子を連結する工程；ｄ）該発現配 列を植物の核ゲノムに挿入する工程；およびｅ）該植物の本来の核ゲノム由来で あり、該クローン化遺伝子の遺伝子産物をコードする遺伝子を不活化する工程； を、包含する方法。
2. ２．前記フラボノールが次式で表される化合物である、請求項１に記載の方法； ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７およびＲ８は、各々、水素、ヒド ロキシルまたは１〜３個の炭素原子を有するアルコキシである。
3. ３．前記Ｒ１〜Ｒ５のいずれか１つまたは２つがヒドロキシルまたはメトキシで あって、残りのＲ１〜Ｒ５は水素、ならびにＲ７およびＲ８は、各々、水素、ヒ ドロキシルまたはメトキシである、請求項２に記載の方法。
4. ４．稔性を回復するフラボノールが、ガランギン、ケンペロール、イソーラムネ チン、ケルセチンおよびモリンからなる群から選択される、請求項２に記載の方 法。
5. ５．稔性に影響するフラボノンが、フラボノン−３−ヒドロキシラーゼである、 請求項１に記載の方法。
6. ６．遺伝性の、外部から制御し得る雄性不稔性を有する植物であって、該植物の フラボノール生産に影響する遺伝子と、同じ遺伝子産物をコードし、外部制御に 反応する誘導プロモーターを含む発現配列に連結している遺伝子との置換によっ て該雄性不稔性が生じている植物を再生産する方法であって、以下の工程； ａ）生長した雄性不稔性植物を提供するために、該植物を播種する工程； ｂ）植物中でのフラボノール生産を引き起こす遺伝子を発現するために、該プロ モーターを誘導する条件下で栽培することにより、生長中の該植物の雄性受精能 力を有する形態への転換を誘導する工程； Ｃ）種子を生産するために、隔離した条件下で生長中の該植物を自然受粉する工 程；および ｄ）該種子を収穫する工程； を、包含する方法。
7. ７．前記フラボノールが次式で表される化合物である、請求項６に記載の方法； ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７およびＲ８は、各々、水素、ヒド ロキシルまたは１〜３個の炭素原子を有するアルコキシである。
8. ８．前記Ｒ１〜Ｒ５のいずれか１つまたは２つがヒドロキシルまたはメトキシで あって、残りのＲ１〜Ｒ５は水素、ならびにＲ７およびＲ８は、各々、水素、ヒ ドロキシルまたはメトキシである、請求項７に記載の方法。
9. ９．稔性を回復するフラボノールが、ガランギン、ケンペロール、イソーラムネ チン、ケルセチンおよびモリンからなる群から選択される、請求項７に記載の方 法。
10. １０．稔性に影響するフラボノンが、フラボノン−３−ヒドロキシラーゼである 、請求項６に記載の方法。
11. １１．ハイブリッド種子を生産する方法であって、以下の工程； ａ）選抜した雄性稔性の雄親系統由来の第一種子、およびフラボノール生産に影 響する遺伝子と、外部制御に反応する誘導プロモーターを含む発現配列に連結し ているフラボノール生産に影響する遺伝子との置換によって生じた雄性不稔性を 有する、選抜した雌親系統由来の第二種子を、交雑受粉するように並列して播種 する工程； ｂ）該遺伝子の発現を誘導しない条件下で、該種子を成熟植物になるまで栽培す る工程； ｃ）該雄性不稔性雌親植物を該雄性稔性雄親植物由来の花粉で交雑受粉する工程 ；および ｄ）該雄性不稔性雌親植物からのハイブリッド種子を収穫する工程； を、包含する方法。
12. １２．前記フラボノールが次式で表される化合物である、請求項１１に記載の方 法； ▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７およびＲ８は、各々、水素、ヒド ロキシルまたは１〜４個の炭素原子を有するアルコキシである。
13. １３．前記Ｒ１〜Ｒ５のいずれか１つまたは２つがヒドロキシルまたはメトキシ であって、残りのＲ１〜Ｒ５は水素、ならびにＲ７およびＲ８は、各々、水素、 ヒドロキシルまたはメトキシである、請求項１２に記載の方法。
14. １４．前記フラボノールが、ガランギン、ケンペロール、イソーラムネチン、ケ ルセチンおよびモリンからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
15. １５．前記フラボノンが、フラボノン−３−ヒドロキシラーゼである、請求項１ １に記載の方法。