JP3370677B2

JP3370677B2 - トランスジェニック植物における雄性不稔のための可逆的核遺伝システム

Info

Publication number: JP3370677B2
Application number: JP51762796A
Authority: JP
Inventors: アンドリューエム．シグナン; マークシー．アルバートソン
Original assignee: パイオニアハイ−ブレッドインターナシヨナルインク．
Priority date: 1994-12-08
Filing date: 1995-12-07
Publication date: 2003-01-27
Anticipated expiration: 2015-12-07
Also published as: US6399856B1; NZ297303A; HUT77110A; DE69535040D1; PT797675E; EP1273662A3; MX9704270A; EP1273662B1; US5837851A; US6281348B1; AU4243696A; JPH10510983A; HU226920B1; EP1731614A1; HU0301904D0; ATE329040T1; EP0797675B1; US5795753A; EP1273662A2; AU698286B2

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景本発明により、カスケード的に作用して植物の表現型
に可逆的な効果を及ぼすことができる調節因子および構
造遺伝子を含む遺伝的構築物によって植物に形質転換を
施すことにより、植物の発生を変更させることができ
る。これに適した構築物には、組織特異適プロモータ
ー、ドミナントネガティブ遺伝子、および一つのDNA結
合タンパク質と結合した転写アクチベーターをコードす
るヌクレオチド配列が含まれる。特に、本発明は、ドミ
ナントネガティブ遺伝子としてのDAMメチラーゼ遺伝
子、および可逆的に雄性不稔であるトランスジェニック
植物を産生するための葯特異的プロモーターの使用に関
する。

雄性不稔の植物を産生するための可逆的遺伝システム
に対して需要があり、特に自殖性植物に対して需要があ
る。市場販売のための雑種種子の産生は、大規模かつ重
要な産業である。雑種種子から成長した雑種植物は、２
つの遺伝的に異なる育成系統の交配による雑種強勢効果
の利益を受ける。雑種子孫の産業的に望ましい農学的な
達成とは、典型的には生長力、収量、および均一性にお
いて、双方の親よりも優れていることである。放任受粉
した品種と比べて雑種種子の品種の方がより良い達成が
得られるため、農業家が栽培するためには雑種種子の方
がより魅力的であり、したがって市場においても高値が
付けられる。

自己種子の混入のない雑種種子を産生するためには、
他家受粉を確実に行わせ、自家受粉から防御するため
に、受粉制御の方法を実施しなければならない。受粉制
御の機序には、機械的、化学的、および遺伝的な手段が
含まれる。

雑種種子を産生する機械的な手段は、関心のある植物
の雄花と雌花とが空間的に離れている、または雄性植物
の雌性植物とが別々である場合に用いることができる。
例えば、トウモロコシ植物は、植物体の茎頂にある花部
に花粉を産生する雄花があり、茎に沿った葉の葉腋にお
いて雌花を付ける。トウモロコシの外部交配は、自家受
精を予防するために雌性親の房を機械的に取り除くこと
によって確実になる。トウモロコシなどの植物の雑種種
子の産生には房の除去が現在は行われているが、この過
程は、実際に房の除去に要する費用および雌性親の房を
除去する結果としての収量の減少の両方の面で、大きな
労働力および経費を要する。

しかし、目的の主要な農作植物の大部分は、同じ花の
内部に機能的な雄性器官および雌性器官の両方を有して
おり、したがって、除雄は簡単な手続きではない。花粉
が放出される前に花粉形成性の器官を徒手的に除去する
ことは可能ではあるが、この形式の雑種産生は極めて多
くの労働力および費用を要する。この方式において種子
は、回収される種子の価値および量が労力に見合うこと
が補償される場合のみに産生される。

雑種種子を産生する第２の一般的手段は、化学物質を
要いることにより、生育中の花粉形成を抑制または阻害
することである。花粉発育破壊剤と呼ばれるこれらの化
学物質は、一時的に雄性不稔を引き起こすために用いら
れる。花粉発育破壊剤の使用による雑種種子の商業的産
生は、その化学物質の価格および有用性、ならびに適用
の信頼性および作用の長さによって制限される。花粉発
育破壊剤の深刻な限界はそれが光毒性作用を持つことで
あり、その程度は遺伝子型に依存する。その他の限界に
は、これらの化学物質が、開花期間が長い農作物に対し
ては、新たに産生された花には影響を及ぼさない可能性
があるため、有効でない可能性があることが含まれる。
その結果として、化学物質の反復適用が必要になる。

野外農作物に関する現在の商業的な雑種種子産生シス
テムの多くは、受粉管理の遺伝的な手段に依存してい
る。花粉の形成ができない、花粉の放出ができない、ま
たは自己受精を生化学的に行うことができない花粉を産
生する植物が、雌として用いられる。自己受精を行うこ
とができない植物は、「自家不和合」（SI）であると呼
ばれる。自家不和合性システムの使用に伴う困難には、
自己不和合性の雌性系統の有用性および繁殖、ならびに
自己不和合性の安定性が含まれる。場合によっては、自
己不和合性は化学的に克服することができ、また、花粉
を阻害する生化学的な機序が活性化される前に未成熟の
つぼみに徒手的に授粉することもできる。不活性化する
ことができる自己不和合性システムは、自家受粉の生化
学的な阻害の有効生を遮断したり、または減少させたり
するストレスの強い気候条件に対してしばしば非常に脆
弱である。

商業的な種子産生のためにより広範な関心をひくもの
は、雄性不稔を引き起こす、花粉制御に基づく遺伝的機
序のシステムである。これらのシステムには、２種類の
一般的なタイプがある。（ａ）遺伝子雄性不稔。これは
一つまたはそれ以上の核遺伝子に起因する花粉形成の不
全である。（ｂ）細胞質遺伝的雄性不稔。通常、「細胞
質雄性不稔」（CMS）と呼ばれる。この場合には、細胞
質内オルガネラ、一般的にはミトコンドリアにおける変
化によって、花粉形成が阻害または発育不全を受ける。

CMSの使用を含む交雑計画は作られているが、その商
業的な価値には限界がある。CMSシステムの一例は、適
切な核のバックグランドにおいて、細胞質内に位置する
ミトコンドリアで成熟花粉形成の不全を引き起こすこと
ができる特異的な変異である。場合によっては、核のバ
ックグランドが細胞質の変異を補うことができ、正常な
花粉形成が起こることがある。特異的な核の「回復遺伝
子」は、CMSミトコンドリアを持つ植物の花粉形成を可
能にする。一般的に、商業的種子産生のためのCMSの利
用には、３種類の育成系統、すなわち、雄性不稔系統
（雌生親）、雄性不稔系統と遺伝子同型であるが完全に
機能的にミトコンドリアを含む維持系統（maitainer li
ne）、および雄性親系統の使用が含まれる。雄性親系統
は、特異的な回復遺伝子を運んでいる可能性があり、こ
のため通常は「回復系統」と呼ばれ、雑種種子に対して
受精能を与える。

雑種からの種子の回復が重要でない植物生農作物につ
いては、回復を行わずにCMSシステムを用いることがで
きる。雑種の果実または種子が商業的産物である農作物
については、雑種種子の受精能を雄性親における特異的
な回復遺伝子によって回復させるか、または雄性不稔の
雑種に授粉しなければならない。非回復性の雑種の受粉
は、受粉を果たすために、雑種に少ない割合の雄性捻性
の植物を含ませることによって達成することができる。
大部分の種においては、すべての細胞質内オルガネラは
卵細胞のみから遺伝するため、CMSの特性は母系遺伝
し、このことによってこのシステムの利用は限定され
る。

CMSシステムには、これを雄性不稔の植物の産生のた
めの唯一の解決策とすることを妨げる限界がある。例え
ば、トウモロコシにおける一つの特定のCMSの種類（Ｔ
−細胞質）は、ある特定の菌類の感染によって産生され
る毒素に対する感受性を付与する。現在も多数の農作物
に用いられてはいるが、CMSシステムは特定の環境条件
において崩壊する可能性がある。

核の（遺伝子の）不稔は、優性であることも劣性であ
ることもある。優性不稔は、雌性系統の繁殖が可能であ
る場合の雑種種子の形成のためのみに用いることができ
る（例えば、インビトロにおけるクローン性繁殖による
場合）。劣性不稔は、捻性および不稔性の植物を容易に
区別することができる場合に用いることができる。しか
し、遺伝子不稔システムの商業的有用性は、クローン性
繁殖および自己繁殖性の植物の雌性列の間引きに要する
費用によって限定される。

植物の発生を変更しうる遺伝子の発見は、房の除去、
CMS、およびSIを含むその他の今日の使用可能な方法に
は欠点があるため、雄性不稔を誘導する遺伝的な方法を
開発するために特に有用であると考えられる。

遺伝的な方法の利用によって植物における発生を変更
する方法の探索により、本発明のメチラーゼ遺伝子に到
達した。特異的な遺伝子またはプロモーターのDNAのメ
チル化パターンの変化は、遺伝子発現の変化の原因とな
る。DNAのメチル化は、植物および動物の両方の発生過
程における遺伝子の調節に関与する因子である。

メチル化のパターンは、メチル感受性のCpG含有プロ
モーター（遺伝子）の利用などの方法によって確定され
る。一般的に、高い活性で転写される配列はメチル化さ
れている。動物においては、メチル化の部位はCpGの部
位（残基）で修飾されている。アデニン（ａ）およびシ
トシン（ｃ）（DNA内に存在するヌクレオチド）のメチ
ル化の遺伝的制御は、細菌および哺乳類の種において
は、遺伝子による影響を受ける。しかし、植物において
は、メチル基の部分は配列CXGに存在する。ここでＸは
Ａ、Ｃ、またはＴであることができ、Ｃはメチル化残基
である。その他の系においては特にGATCの部位における
メチル化が知られているが、Ａのメチル化による不活性
化は植物においては知られていない。

トランスジェニック植物において希望する目的を達成
するために、組織に特異的な、またはその他のメチル化
が誘導される可能性については、当分野では何ら示唆は
得られていないが、当業者には、プロモーターのメチル
化が遺伝子の活性化を引き起こし、トランスジェニック
生物体の表現型を変えることができることが知られてい
た。

例えば雄性不稔を引き起こすなど、植物の発生を制御
するために、標的志向的なメチル化をその手段の想定す
ることは、例えば、GATCを標的とする大腸菌DNAのアデ
ニンメチラーゼ（DAM）のようなメチラーゼ遺伝子とい
った、遍在する標的に対する普遍的な不活性化作用を持
つ遺伝子の発現を、それがなければ植物に有害な影響を
及ぼす特異的な発生の段階を制御するための手段として
用いることに伴う困難が障害となるであろう。DAMの標
的は多くのプロモーターに存在しており、したがって、
細胞の生存能のために不可欠なプロモーターおよび／ま
たは遺伝子を不活性化することからの、植物の生存能の
維持という問題が推測される。外来ベクターにより宿主
系に導入されるメチル化を「区分化」するための方法が
なければ、遺伝的な手段によって雄性不稔を産生するた
めの手法としてのメチル化の成功を期待することはでき
ないであろう。

本発明は、植物発生における変化を引き起こすDAMの
ような遺伝子の区分化および該遺伝子の操作のための方
法および組成物を提供する。

発明の概要本発明は、そのDNA分子が組み替えDNA構築物の一部で
ある場合に、葯組織において一つのDNA配列の発現を調
節することができるヌクレオチド配列を含む、単離DNA
分子に関する。

この単離された分子は、DP5055のSca−Nco I断片のヌ
クレオチド配列、図１の第1488ヌクレオチドに位置する
開始コドンから相対的に上流に少なくとも503塩基対の
長さで伸びたヌクレオチド配列、図１の第1488位のヌク
レオチドに位置する開始コドンから相対的に上流に第−
503位から第−１位まで伸びたヌクレオチド配列、図１
の第1488位のヌクレオチドに位置する開始コドンから相
対的に上流に第−587位から第−１位まで伸びたヌクレ
オチド配列、図１の第1488位のヌクレオチドに位置する
開始コドンから相対的に上流に第−890位から第−１位
まで伸びたヌクレオチド配列、または図１の第1488位の
ヌクレオチドに位置する開始コドンから相対的に上流に
第−503位から第−134位まで伸びたヌクレオチド配列を
含むことができる。

本発明はさらに、発現した場合に花粉の形成または機
能を抑制する遺伝子産物をコードするDNA配列、DNA配列
の発現を制御することができるオペレーター、オペレー
ターと結合することができ、該ドミナントネガティブ遺
伝子の転写を活性化することができるDNA結合タンパク
質をコードする遺伝子、およびDNA配列と機能的に連結
することができる組織特異的なプロモーター、を含む組
換えDNA構築物に関する。

本発明の組換えDNA構築物は、植物において発現した
場合に花粉の形成または機能を抑制する遺伝子産物をコ
ードするDNA配列、該DNA配列の発現を制御することがで
きるオペレーター、および遺伝子産物をコードする該DN
A配列と結合し、花粉形成または機能に不可欠である細
胞に対して特異的なプロモーターを含むこともできる。
さらに他の態様において、この組換えDNA構築物はさら
に、選択マーカー遺伝子、DNA結合領域をコードするDNA
配列、または活性化ドメインをコードするDNA配列を含
むことができる。

一つの態様において、本発明の組換えDNA構築物のDNA
配列によってコードされる遺伝子産物は細胞毒であるこ
とができる。他の態様において、プロモーターは葯特異
的なプロモーターであることができ、構築物は構築物DP
5814、DP6509、PHP8036、PHP8037、またはPHP6520を含
むことができる。さらに他の態様において、オペレータ
ーはlexAオペレーターであることができる。さらに他の
態様において、組換えDNA構築物はさらに選択マーカー
遺伝子を含むことができる。

本発明の他の態様において、この組換えDNA構築物
は、上記に定義した組換えDNA構築物のオペレーターと
結合することができるDNA結合タンパク質をコードするD
NA配列、および該DNA配列の発現を制御するプロモータ
ーを含む。この組換えDNA構築物は、さらに選択的マー
カー遺伝子を含むことができる。一つの態様において、
この組換えDNA構築物のDNA結合タンパク質はlexAタンパ
ク質であることができる。他の態様において、プロモー
ターは花粉の形成または機能に不可欠である細胞に特異
的であることができる。さらに他の態様において、この
プロモーターは、以前に定義した、単離DNA分子を含む
葯特異的プロモーターであることができる。このさらに
他の態様において、この構築物のプロモーターは誘導性
のプロモーターまたは構成的プロモーターであることが
でき、構成的プロモーターとしてはトウモロコシ・ユビ
キチンプロモーターを用いることができる。組換えDNA
構築物は、PHP6522またはPHP6555であることができる。

本発明が関するそのほかの面は、上記に定義した、単
離DNA分子を含む発現ベクターである。この発現ベクタ
ーはさらに、そのDNA配列がプロモーターと機能的に連
結した。遺伝子産物をコードするDNA配列を含むことが
できる。一つの態様において、発現ベクターの遺伝子産
物は、花粉の機能または形成に障害を及ぼす。さらに他
の態様において、発現ベクターのDNA配列は、プロモー
ターに関して非相同的である。また、本発明は、発現ベ
クターを含むトランスジェニック植物にも関する。

本発明の他の態様には、遺伝子産物をコードするDNA
配列の発現を調節する能力を発揮するプロモーター5126
fのヌクレオチド配列を含む、葯特異的なプロモーター
が含まれる。本発明の一つの態様において、この遺伝子
産物は花粉の機能または形成に関与する。他の態様にお
いて、遺伝子産物はサイトキシンを含む。

本発明のさらに他の態様は、植物において可逆的な雄
性不稔を産生するための方法に関する。この方法には以
下の段階が含まれる。（ａ）第１の植物に対して、植物
に雄性不稔を発現させるような組換えDNA構築物による
形質転換を施す。この際、構築物は（ｉ）花粉の機能ま
たは形成を抑制する遺伝子産物をコードするDNA配列の
発現を制御し、このDNA配列と機能的に連結した組織特
異的なプロモーターに埋め込まれているlexAオペレータ
ー、および（ii）lexAリプレッサーをコードし、誘導性
のプロモーターと機能的に連結したDNA配列、を含む。
（ｂ）構築物の雄性不稔性の効果を打ち消すために、こ
の植物を誘導物質にさらす。他の態様において、この組
織特異的なプロモーターは、葯特異的なプロモーターで
あることができる。本発明の他の態様において、葯特異
的プロモーターには、遺伝子産物をコードするDNA配列
の発現を制御できるプロモーター5126のヌクレオチド配
列が含まれる。さらに他の態様において、遺伝子産物は
ドミナントネガティブ遺伝子であることができ、それは
DAMメチラーゼであってもよい。

また、本発明は雄性不稔の植物、ならびに雄性不稔の
植物を産生するための以下の段階を含む方法に関する。
（ａ）遺伝的な形質転換が可能な花粉産生性の植物のゲ
ノムに対する、（ｉ）植物において発現した場合に花粉
の形成または機能を抑制する遺伝子産物をコードするDN
A配列、（ii）そのDNA配列の発現を制御するオペレータ
ー、および（iii）花粉の形成または機能に不可欠であ
る細胞に特異的であり、遺伝子産物をコードするDNA配
列と機能的に連結したプロモーター、を含む組換えDNA
分子の導入。（ｂ）DNA配列の発現の結果として雄性不
稔が達成されるような条件下における花粉産生性の植物
の育成。本発明のこの面の他の態様において、この遺伝
子産物はサイトトキシンであることができる。さらに他
の態様において、本発明のプロモーターは葯特異的なプ
ロモーターであることができる。さらに他の態様におい
て、この葯特異的なプロモーターは、遺伝子産物をコー
ドするDNA配列の発現を調節する能力を発揮するプロモ
ーター5126のヌクレオチド配列を含むことができる。ま
たさらに他の態様において、オペレーターはlexAオペレ
ーターであることができる。雄性不稔の植物を産生する
方法にはさらに、選択マーカー遺伝子を含めることがで
きる。

本発明はさらに、雑種種子、ならびに雄性不稔の植物
から雑種種子を産生するための以下の段階を含む方法に
関する。（ａ）遺伝的な形質転換が可能な花粉産生性の
植物のゲノムに対する、（ｉ）植物において発現した場
合に花粉の形成または機能を抑制する遺伝子産物をコー
ドするDNA配列、（ii）そのDNA配列の発現を制御するオ
ペレーター、および（iii）花粉の形成または機能に不
可欠である細胞に特異的であり、遺伝子産物をコードす
るDNA配列と機能的に連結したプロモーター、を含む組
換えDNA分子の導入。（ｂ）DNA配列の発現の結果として
雄性不稔が達成されるような条件下における花粉産生性
の該植物の育成。（ｃ）雄性不稔の系統に由来する花粉
による雄性不稔の植物の交雑。花粉は、そのゲノムの内
部に、DNA結合タンパク質をコードするDNA配列、および
そのDNA配列の発現を制御するプロモーターを含む組換
えDNA分子が組み込まれており、このタンパク質は雄性
不稔の植物の組換えDNAのオペレーターと結合すること
ができる。（ｄ）受精能を回復した雑種種子の収穫。本
発明のこの面の他の態様において、この遺伝子産物はサ
イトトキシンであることができる。他の態様において、
プロモーターは葯特異的なプロモーターであってもよ
い。本発明の他の態様において、この葯特異的なプロモ
ーターは、遺伝子産物をコードするDNA配列の発現を調
節する能力を発揮するプロモーター5126のヌクレオチド
配列を含むことができる。またさらに他の態様におい
て、オペレーターはlexAオペレーターであることができ
る。雄性不稔の植物を産生する方法にはさらに、選択マ
ーカー遺伝子を含めることができる。

また、本発明の一つの面は、以下の段階を含む植物に
おける可逆的な雄性不稔の産生方法である。（ａ）遺伝
的な形質転換が可能な花粉産生性の植物のゲノムに対す
る、（ｉ）植物において発現した場合に花粉の形成また
は機能を抑制する遺伝子産物をコードするDNA配列、（i
i）そのDNA配列の発現を制御するオペレーター、および
（iii）花粉の形成または機能に不可欠である細胞に特
異的であり、遺伝子産物をコードするDNA配列と機能的
に連結したプロモーター、を含む第１の組換えDNA分子
の導入。（ｂ）DNA配列の発現の結果として雄性不稔が
達成されるような条件下における花粉産生性の該植物の
育成。（ｃ）雄性捻性である雑種植物を作成するため
の、雄性不稔の系統に由来する花粉による雄性不稔の植
物の交雑。この際、この花粉は、そのゲノムの内部に、
DNA結合タンパク質をコードするDNA配列、およびそのDN
A配列の発現を制御するプロモーターを含む第２の組換
えDNA分子が組み込まれており、このタンパク質は雄性
不稔の植物の組換えDNAのオペレーターと結合すること
ができる。本発明のこの面の他の態様において、この遺
伝子産物はサイトトキシンであることができる。さらに
他の態様において、本発明のプロモーターは葯特異的な
プロモーターであることができる。本発明のさらに他の
態様において、この葯特異的なプロモーターは、遺伝子
産物をコードするDNA配列の発現を調節する能力を発揮
するプロモーター5126のヌクレオチド配列を含むことが
できる。またさらに他の態様において、オペレーターは
lexAオペレーターであることができる。一つの態様にお
いて、第１の組換え分子または第２の組換えDNA分子は
さらに選択マーカー遺伝子を含むことができる。本発明
の他の態様において、DNA結合タンパク質はlexAタンパ
ク質であることができる。また他の態様において、第２
の組換えDNA分子のプロモーターは、花粉の形成または
機能に不可欠である細胞に特異的なプロモーターであ
り、葯特異的なプロモーターであることもできる。この
葯特異的なプロモーターは、そのDNA分子が操作可能な
組換えDNA構築物の一部である場合に葯組織においてDNA
配列の発現を調節することができるヌクレオチド配列を
含む、単離DNA分子を含むことができる。第２の組換えD
NA分子のプロモーターは、誘導性のプロモーターまたは
構成的プロモーターであることができ、それはトウモロ
コシ・ユビキチンプロモーターであってもよい。

本発明の他の面は、そのDNA分子が操作可能な組換えD
NA構築物の一部である場合に葯組織においてDNA配列の
発現を調節することができるヌクレオチド配列を含む単
離DNA分子を含む発現ベクターを含有する、形質転換し
た植物細胞、およびこのような植物細胞から再分化した
植物である。この発現ベクターはさらに、そのDNA配列
がプロモーターと機能的に連結した、遺伝子産物をコー
ドするDNA配列を含むことができる。また、本発明は、
雑種種子および本発明の方法によって産生される雄性不
稔の植物の作出にも関する。

本発明による、植物の発生に影響を与えるためのカス
ケード的機序を作成するための形質転換性の遺伝子構築
物において、２種類の遺伝的システムを併用した。第１
のシステムは、例えば転写アクチベーターの発現などの
遺伝子の発現を制御する組織特異的なプロモーターを重
点とする。第２のシステムは、花粉の形成または機能を
抑制する遺伝子産物をコードするDNA配列、例えば、そ
の発現産物が花粉の形成および機能に障害を及ぼすメチ
ラーゼ遺伝子のようなドミナントネガティブ遺伝子を含
む。

本発明の特有な成分は、これらの両方のシステムの要
素が組み込まれ、特異的な調節因子および存在する遺伝
子に依存して独特の表現型を引き起こすように相互作用
することができる調節性の要素および構造遺伝子を含
む、形質転換性の遺伝的構築物である。一つの親植物に
おいてこの構築物が存在することにより、本発明のいく
つかの利点が生じる。例えば、雄性不稔を達成するため
の一段階アプローチが実施されている。例えば、本発明
は、植物における可逆的な雄性不稔の産生において、組
織特異的なプロモーター、ドミナントネガティブ遺伝
子、およびドミナントネガティブ遺伝子を活性化するこ
とができる転写アクチベーターを包含する特異的なDNA
の区域を含む、遺伝的構築物の使用を企図している。し
たがって、一つの面における本発明は、雄性捻性を操作
するための新たな核となる基盤を提供する。

さらに明確には、本発明に適した遺伝的構築物は、ド
ミナントネガティブ遺伝子、ならびにドミナントネガテ
ィブ遺伝子の上流に位置した場合にDNA結合遺伝子およ
び発生における特異的な時点または複数の時点で発現を
調節するプロモーターと共同してドミナントネガティブ
遺伝子の発現を制御する特異的なDNAの区域を含む。

ドミナントネガティブ遺伝子は、発現した場合、植物
に優性表現型をもたらす。ハースコビッツ（Herskowit
z）（1987）は、「ドミナントネガティブ」の用語を、
過剰発現した場合に野生型の遺伝子の活性を失わせる変
異型のポリペプチドをコードする遺伝子という意味で用
いた。野生型の遺伝子とは、それに変異が由来する遺伝
子のことである。この記載において、「ドミナントネガ
ティブ遺伝子」という熟語は、この遺伝子を受け取る宿
主細胞の内因性の遺伝的過程を破壊すると同時に、単一
のコピーにおいて効果的であるか、または遺伝子産物の
産生量の増加もしくは遺伝子の複数のコピーの同時発現
のいずれかによる遺伝子の過剰発現によって効果を生み
出す可能性がある産物をコードする遺伝子に適用され
る。ドミナントネガティブ遺伝子の部類の具体例は、細
胞障害性遺伝子、メチラーゼ遺伝子、および成長抑制遺
伝子である。ドミナントネガティブ遺伝子には、ジフテ
リア毒素Ａ鎖遺伝子（Czako and An,1991），トウモロ
コシにおけるCDCなどの細胞分裂周期の変異（Colasant
i,et al.,1991）,WT遺伝子（Farmer,et al.,1994），お
よびP68（Chen,et al.,1991）が含まれる。本発明の遺
伝的構築物におけるドミナントネガティブ遺伝子の候補
遺伝子として、大腸菌から単離された遺伝子などのDAM
メチラーゼ遺伝子も例示される。候補遺伝子は、それが
由来する源に対して、有害であっても有害でなくともよ
い。実際に、候補遺伝子はその源において本質的な機能
を果たしうる。

例証となる態様において、特異的な植物組織の発生に
変更を及ぼすための遺伝子のメチル化を行わせる候補と
ドミナントネガティブ遺伝子は、DAMメチラーゼ遺伝子
である。この遺伝子は、花粉の形成または機能に不可欠
である遺伝子領域を不活性化し、これにより、雄性不稔
の植物を形成するために用いられる。

特に、本発明の第１の遺伝的構築物の構成因子は以下
の通りである。

トウモロコシC1遺伝子などの転写アクチベーターが、
lexAなどの細菌のDNA結合タンパク質と融合される（Bre
nt and Ptashne,1985）。「lexA−C1」と命名されたこ
の遺伝子融合体は、5126プロモーターなどの葯特異的な
プロモーターの制御の下に置かれる。この遺伝的構築物
は、 5126::lexA−C1 と命名される。

DAMメチラーゼ遺伝子は、lexA結合部位（Lex）を含む
最小の35Sプロモーターの後方に置かれ、以下のよう
に、 35S−lexAop::DAM の記号で示される。

35S−lexAop::DAMおよび5126::lexA−C1は、同一のプ
ラスミド上に存在する２つの別々の転写単位であり、こ
のプラスミドは好ましくは選択マーカー遺伝子を含んで
いる。

本発明の構築物を含むトランスジェニック植物は、当
該の植物種が再分化に対する感受性をもつ限り、これと
同一な構築物により形質転換を受けた培養物から再分化
させることができる。

植物は、本明細書において開示した方法および当業者
に周知の方法により、形質転換された細胞もしくは培養
物、または移植片から再分化させることができる。本文
脈における「培養物」は、細胞の凝集体、カルス、また
は培養に適したそれらの誘導体を包含する。方法は植物
の種によって異なる。種子は、再分化した植物、または
当業者に周知の育種法を用いた、同じ種の適した植物と
の間の交雑種から採取する。

以前に記載した第１の構築物が植物に形質転換された
場合、DAMメチラーゼ遺伝子の葯特異的なプロモーター
のみによって転写が制御されている状況と比べて発現量
の増加という結果が起こる。発現の増強は、Lexオペレ
ーターと特異的に結合し、DAMメチラーゼ遺伝子の発現
を制御して雄性不稔を引き起こす、転写アクチベーター
lexA−C1の産生に起因する。本発明の方法は特に、例え
ばトウモロコシにおいて変更した時にドミナントネガテ
ィブの表現型をもたらす遺伝子の発現のために魅力的で
ある。一般に、これらの遺伝子によってコードされる遺
伝子産物は、野生型のタンパク質、例えばトウモロコシ
CDC21遺伝子などの機能を妨げるために高度に発現する
必要がある。

この効果を消失させるために、第１の構築物を有する
第１の植物は、5126またはその他の適したプロモーター
を含む第２の構築物を含有する第２の植物と交配され
る。その他の適したプロモーターは、5126欠失変異プロ
モーター、またはDNA結合タンパク質lexAのみを発現す
るlexA遺伝子と融合された構成的プロモーターなどのそ
の他の葯特異的プロモーターを含む。このタンパク質は
lexAオペレーターと特異的に結合するが、遺伝子の発現
は活性化しない。むしろそれは発現を抑制し、このため
DAMメチラーゼ遺伝子の発現を遮断し、第１および第２
の遺伝的構築物の両方を有する植物を雄性捻性にする。

本発明による、このシステムの構成因子を利用する他
の方法は、lexA DNA結合部位（すなわち、lexAオペレー
ター）を組織特異的なプロモーターである5126に埋め込
み、lexAリプレッサーの発現を誘導性のプロモーターと
共役させることである。5126プロモーターの転写によっ
て発現する遺伝子はすべて、lexAの発現を誘導する化学
物質を適用することによって遮断（抑制）される。lexA
リプレッサータンパク質は、5126プロモーター内に位置
するlexAopと結合し、DNAのこの領域と結合した結果と
して、レポーター遺伝子の発現を遮断する。例えば、こ
のシステムをDAMメチラーゼ遺伝子とともに用いる場合
は、化学的誘導物質の適用により、不稔性の表現型は消
失し、植物は雄性捻性になる。

例として、適した遺伝子構築物は以下の成分を含む： 1. 5126::lexA−op::DAMメチラーゼ、 2. ［ホルモン（オーキシン、サリチル酸）、化学的毒
性緩和剤およびその類似物によって誘導することができ
るプロモーター］::lexA、および 3. 例えば除草剤もしくは抗生物質に対する抵抗性を付
与するもの、またはアミノ酸の補償もしくは核酸栄養要
求性に影響を与える選択マーカー。

この構築物が植物に組み込まれた場合、結果として生じ
る表現型は、化学的誘導物質の非存在下においては雄性
不稔である。しかし、誘導因子を適切な時期に適用する
ことにより、雄性捻性の植物を得ることができ、不稔性
構築物を含む植物と捻性を回復させるための抑制性構築
物を含む植物とを遺伝的に交雑させる必要がなくなる
（米国特許出願第07/848,465号を参照）。除草剤抵抗性
遺伝子の例には、グルホシネート（バイアロフォス（bi
alophos））抵抗性に対するBARおよびPATが含まれる。

本発明の構築物が、除草剤抵抗性遺伝子などの選択マ
ーカーと連結した場合には、結果として生じる構築物
は、雄性不稔の植物と雄性捻性の植物からの花粉とを交
雑させることにより生じる植物に対して除草剤を適用す
ることによって分離した雄性捻性の植物を破壊する方法
を可能とする。雄性不稔の植物のみが生き残るであろ
う。

植物を形質転換させるために用いた組換えDNA構築物
においてこのシステムの構成因子を利用する他の方法
は、組織特異的なプロモーター（例えば葯特異的なプロ
モーター5126）に、DNA配列の発現を制御することがで
きるオペレーター（例えばlexAオレペーター）を埋め込
むことである。この際、この組織特異的なプロモーター
は、例えばDAMメチラーゼなどのドミナントネガティブ
遺伝子のような、花粉の形成または機能を抑制する遺伝
子産物を産生するDNA配列と機能的に連結している。こ
のようなオペレーターの埋め込みは、本発明のプロモー
ターのヌクレオチド配列の上流または下流に、それを
（当業者に周知の方法に従って）配置することを含む。

この効果を消失させるために、第１の構築物によって
形質転換された植物は、5126またはその他の適したプロ
モーターを含む第２の構築物を含有する第２の植物と交
配される。この際、その他の適したプロモーターは、51
26欠失変異プロモーター、または例えば第１の構築物の
オペレーターと結合することができるDNA結合タンパク
質lexAを発現するlexA遺伝子のような、DNA結合タンパ
ク質をコードする遺伝子の発現を制御する構成性プロモ
ーターなどの、その他の葯特異的プロモーターを含む。
明確に言えば、このDNA結合タンパク質は、第１の構築
物のオペレーターと結合して発現を抑制し、このために
花粉の形成および機能を抑制する遺伝子産物をコードす
るDNA配列の発現を遮断し、第１および第２の遺伝的構
築物の両方を有する植物を雄性捻性にする。

特殊な態様において、第２の構築物によって産生され
るlexAリプレッサータンパク質は、第１の構築物におけ
る5126プロモーターに埋め込まれたlexAオペレーターと
結合し、DNAのこの領域との結合の結果として、例えばD
AMメチラーゼなどのドミナントネガティブ遺伝子のよう
な、花粉の形成および機能を抑制する遺伝子の発現を遮
断し、形質転換された植物を雄性捻性にする。

本発明の他の態様によれば、葯特異的な5126プロモー
ターなどの組織特異的なプロモーターと機能的に連結し
たドミナントネガティブ遺伝子としてメチラーゼ遺伝子
を有する遺伝的構築物は、本発明の実践のために適して
いる。植物の発生を変更するための方法は、本発明の様
相を代表している。このような方法には、好ましくは、（ａ）メチラーゼ遺伝子および適したプロモーターを含
む遺伝的構築物による植物の形質転換、および（ｂ）メチラーゼ遺伝子が発現する環境における植物の
育成、およびそれによる、発生過程のために不可欠であ
る一つまたは複数の遺伝子のプロモーターのメチル化に
よっての、その発現の変更、という段階が含まれる。

雄性不稔の植物を作出するためには、プロモーター
は、好ましくはタペータム、葯、または初期の花粒粉の
ような特異的な組織においてのみ、花粉の形成または機
能に不可欠である組織においてのみ遺伝子を発現させ
る。構築物は、花粉の形成または機能を抑制することが
できる遺伝子産物をコードするDNA配列として、メチラ
ーゼ遺伝子を含むこともできる。適したメチラーゼ遺伝
子の一つは細菌のDAM（DNAアデニンメチル化）遺伝子で
ある。起源となる細菌には大腸菌が含まれる。DAMの部
類の遺伝子は、ヌクレオチド配列GATCにおいてアデニン
のN6位をメチル化する。構築物は標的DNAを含み、それ
は標的DNAによるmRNAの合成を抑制するため、ドミナン
トネガティブである。

組織特異的なプロモーターは、例えば特異的な組織に
おける遺伝子などのDNA配列の発現を制御することがで
きるプロモーターである。植物において可逆的な雄性不
稔を引き起こすためには、組織において活性化してお
り、直接的または間接的に花粉の構造および／または機
能に影響を与えるプロモーターが特に適している。

組織特異的なプロモーターの探索は、植物遺伝学にお
ける新規な概念による恩恵を受けており、正常な植物の
mRNAから変異を取り除くことにより、本発明における目
的とする機能である葯の発生に特異的に関連するゲノム
の領域において正常と異なるmRNAが得られた。本発明に
適した一つの態様は、例えば5126と命名された新規な植
物プロモーターの活性DNA配列のような、葯特異的なプ
ロモーターである。

メチラーゼ遺伝子および適したプロモーターを含む遺
伝的構築物の利用による、雄性不稔の系統の産生のため
の方法および組成は以下に記載した。

植物の雄性不稔の表現型と、本発明の遺伝的構築物の
植物の核ゲノム内への挿入との相関を明らかにするた
め、植物のDNAのサザンブロット分析を実施した。この
分析により、雄性不稔が本発明の遺伝的構築物の存在と
相関することが明らかになった。

本発明の一つの態様において、分離される雄性捻性の
植物が野外で生育しないように破壊するために、構成的
プロモーターを選択マーカーと連結させ、プロモーター
による調節を受けるメチル化遺伝子を含む遺伝的構築物
を有する植物の中に導入した。このシステムは、その系
において雄性捻性の近交系の植物が同じ種類の雄性不稔
の植物と交配される、不稔性の近交系を維持する場合に
有用である。雌性の雄性不稔の植物から採取した種子
は、選択因子に対する抵抗性の有無に関して1:1に分離
されるであろう。植物に対して選択因子を噴霧すること
もできる。その結果、選択マーカー遺伝子を維持してい
る植物のみが生き残る。これらの植物は、メチル化性の
構築物による形質転換を受けた植物である。

また、本発明は、本発明の方法によって産生された雄
性不稔の植物、およびこのような植物の種子にも関す
る。

本発明による、植物の発生に影響を与えるためのカス
ケード的機序を作成するための形質転換性の遺伝的構築
物において、２種類の遺伝的システムを併用した。第１
のシステムは、例えば転写アクチベーターの発現などの
遺伝子の発現を制御する組織特異的なプロモーターを重
点とする。第２のシステムは、花粉の形成または機能を
抑制する遺伝子産物をコードするDNA配列、例えば、そ
の発現産物が花粉の形成および機能に障害を及ぼすメチ
ラーゼ遺伝子のようなドミナントネガティブ遺伝子を含
む。

本発明の特有な構成要素は、これらの両方のシステム
の要素が組み込まれ、特異的な調節因子および存在する
遺伝子に依存して独特の表現型を引き起こすように相互
作用することができる調節性の要素および構造遺伝子を
含む、形質転換性の遺伝的構築物である。一つの親植物
においてこの構築物が存在することにより、本発明のい
くつかの利点が生じる。例えば、雄性不稔を達成するた
めの一段階アプローチが実施されている。例えば、本発
明は、植物における可逆的な雄性不稔の産生において、
組織特異的なプロモーター、ドミナントネガティブ遺伝
子、およびドミナントネガティブ遺伝子を活性化するこ
とができる転写アクチベーターを包含する特異的なDNA
の区域を含む、遺伝的構築物の使用を企図している。し
たがって、一つの面における本発明は、雄性捻性を操作
するための新たな核となる基盤を提供する。

ドミナントネガティブ遺伝子は、発現した場合、植物
に優性表現系をもたらす。ヘルスコビッツ（Herskowit
z）（1987）は、「ドミナントネガティブ」の用語を、
過剰発現した場合に野生型の遺伝子の活性を失わせる変
異型のポリペプチドをコードする遺伝子という意味で用
いた。野生型の遺伝子とは、それに変異が由来する遺伝
子のことである。この記載において、「ドミナントネガ
ティブ遺伝子」という熟語は、この遺伝子を受け取る宿
主細胞の内因性の遺伝的過程を破壊すると同時に、単一
のコピーにおいて効果的であるか、または遺伝子産物の
産生量の増加もしくは遺伝子の複数のコピーの同時発現
のいずれかによる遺伝子の過剰発現によって効果を生み
出す可能性がある産物をコードする遺伝子に適用され
る。ドミナントネガティブ遺伝子の部類の具体例は、細
胞障害性遺伝子、メチラーゼ遺伝子、および成長抑制遺
伝子である。ドミナントネガティブ遺伝子には、ジフテ
リア毒素Ａ鎖遺伝子（Czako and An,1991），トウモロ
コシにおけるCDCなどの細胞分裂周期の変異（Colasant
i,et al.,1991）,WT遺伝子（Farmer,et al.,1994），お
よびP68（Chen,et al.,1991）が含まれる。本発明の遺
伝的構築物におけるドミナントネガティブ遺伝子の候補
遺伝子としても、大腸菌から単離された遺伝子などのDA
Mメチラーゼ遺伝子は典型的な例である。候補遺伝子
は、それが由来する源に対して、有害であっても有害で
なくともよい。実際に、候補遺伝子はその源において本
質的な機能を果たしていることもできる。

例証となる態様において、特異的な植物組織の発生に
変更を及ぼすための遺伝子のメチル化を行わせる候補と
ドミナントネガティブ遺伝子は、DAMメチラーゼ遺伝子
である。この遺伝子は、花粉の形成または機能に不可欠
である遺伝子領域を不活性化し、これにより、優性不稔
の植物を形成するために用いられる。

トウモロコシC1遺伝子などの転写アクチベーターが、
lexAなどの細菌のDNA結合タンパク質と融合されたもの
（Brent and Ptashne,1985）。「lexA−C1」と命名され
たこの遺伝子融合体は、5126プロモーターなどの葯特異
的なプロモーターの制御の下に置かれる。この遺伝的構
築物は、 5126::lexA−C1 と命名される。

植物は、本明細書において開示した方法および当業者
に周知の方法により、形質転換された細胞もしくは培養
物、または移植片から再分化させることができる。本文
脈における「培養物」は、細胞の凝集体、カルス、また
は培養に適したそれらの誘導体を包含する。方法は植物
の種によって異なる。種子は、再分化した植物、または
当業者に周知の育種法を用いる、細分化した植物と同じ
種の適した植物との間の交雑種から採取する。

上述した第１の構築物が植物に形質転換された場合に
は、DAMメチラーゼ遺伝子の葯特異的なプロモーターの
みによって転写が制御されている状況と比べて発現量の
増加という結果が起こる。発現の増強は、Lexオペレー
ターと特異的に結合し、DAMメチラーゼ遺伝子の発現を
制御して雄性不稔を引き起こす、転写アクチベーターle
xA−C1の産生に起因する。本発明の方法は特に、例えば
トウモロコシにおいて、変異した時にドミナントネガテ
ィブの表現型をもたらす遺伝子の発現のために魅力的で
ある。一般に、これらの遺伝子によってコードされる遺
伝子産物は、野生型のタンパク質、例えばトウモロコシ
CDC21遺伝子などの機能を妨げるために高度に発現する
必要がある。

本発明による、このシステムの構成因子を利用する他
の方法は、lexA DNA結合部位（すなわち、lexAオペレー
ター）を組織特異的なプロモーターである5126に埋め込
み、lexAリプレッサーの発現を誘導性のプロモーターと
共役させることである。5126プロモーターの転写によっ
て発現する遺伝子はすべて、lexAの発現を誘導する化学
物質を適用することによって遮断（抑制）される。lexA
リプレッサータンパク質は、5126プロモーター内に位置
するlexAopと結合し、DNAのこの領域と結合した結果と
して、レポーター遺伝子の発現を遮断する。例えば、こ
のシステムをDAMメチラーゼとともに用いる場合は、化
学的誘導物質の適用により、不稔性の表現型は消失し、
植物は雄性捻性になる。

例として、適した遺伝子構築物は以下の構成成分を含
む。

1. 5126::lexA−op::DAMメチラーゼ、 2. ［ホルモン（オーキシン、サリチル酸）、化学的毒
性緩和剤およびその類似物によって誘導することができ
るプロモーター］::lexA、および 3. 例えば除草剤もしくは抗生物質に対する抵抗性を付
与するもの、またはアミノ酸の補償もしくは核酸栄養要
求性に影響を与える選択マーカー。

この構築物が植物に組み込まれた場合、結果として生じ
る表現型は、化学的誘導物質の非存在下においては雄性
不稔である。しかし、誘導因子を適切な時期に適用する
ことにより、雄性捻性の植物を得ることができ、不稔性
構築物を含む植物と捻性を回復させるための抑制性構築
物を含む植物とを遺伝的に交雑させる必要がなくなる
（米国特許出願第07/848,465号を参照）。除草剤抵抗性
遺伝子の例には、glufosinate（bialophos）抵抗性に対
するBARおよびPATが含まれる。

本発明の構築物が、除草剤抵抗性遺伝子などの選択マ
ーカーと連結した場合には、結果として生じる構築物
は、雄性不稔の植物と雄性捻性の植物からの花粉とを交
雑させることにより生じる植物に対して除草剤を適用す
ることによって分離された雄性捻性の植物を破壊する方
法を可能とする。雄性不稔の植物のみが生き残るであろ
う。

この効果を消失させるために、第１の構築物によって
形質転換された植物は、5126またはその他の適したプロ
モーターを含む第２の構築物を含有する第２の植物と交
配される。この際、その他の適したプロモーターは、51
26欠失変異プロモーターまたは例えば第１の構築物のオ
ペレーターと結合することができるDNA結合タンパク質l
exAを発現するlexA遺伝子のような、DNA結合タンパク質
をコードする遺伝子の発現を制御するその他の葯特異的
プロモーターを含む。明確に言えば、このDNA結合タン
パク質は、第１の構築物のオペレーターと結合して発現
を抑制し、このために花粉の形成および機能を抑制する
遺伝子産物をコードするDNA配列の発現を遮断し、第１
および第２の遺伝的構築物の両方を有する植物を雄性捻
性にする。

特殊な態様において、第２の構築物によって産生され
るlexAリプレッサータンパク質は、第１の構築物におけ
る5126プロモーターに埋め込まれたlexAオペレーターと
結合し、DNA配列のこの領域との結合の結果として、例
えばDAMメチラーゼなどのドミナントネガティブ遺伝子
のような、花粉の形成および機能を抑制する遺伝子の発
現を遮断し、形質転換された植物を雄性捻性にする。

本発明の構築物が、除草剤抵抗性遺伝子などの選択マ
ーカー遺伝子と連結した場合には、結果として生じる構
築物は、雄性不稔の植物と雄性捻性の植物からの花粉と
を交雑させることにより生じる植物に対して除草剤を適
用することによって雄性捻性の分離された植物を破壊す
る方法を可能とする。雄性不稔の植物のみが生き残るで
あろう。

本発明の他の態様によれば、葯特異的な5126プロモー
ターなどの組織特異的なプロモーターと機能的に連結し
たドミナントネガティブ遺伝子としてメチラーゼ遺伝子
を有する遺伝的構築物は、本発明の実践のために適して
いる。植物の発生を変更するための方法は、本発明の様
相を代表している。このような方法は、好ましくは以下
の段階を含む。

（ａ）メチラーゼ遺伝子および適したプロモーターを含
む遺伝的構築物による植物の形質転換、および（ｂ）メチラーゼ遺伝子が発現する環境における植物の
育成、およびそれによる、発生過程のために不可欠であ
る一つまたは複数の遺伝子のプロモーターのメチル化に
よっての、その発現の変更。

雄性不稔の植物を産生するためには、プロモーターは
特異的な組織においてのみ、好ましくはタペータム、
葯、または初期の花粒粉のような、花粉の形成または機
能に不可欠である組織においてのみ遺伝子を発現させ
る。構築物は、花粉の形成または機能を抑制することが
できる遺伝子産物をコードするDNA配列として、メチラ
ーゼ遺伝子を含むこともできる。適したメチラーゼ遺伝
子の一つは細菌のDAM（DNAアデニンメチル化）遺伝子で
ある。起源となる細菌には大腸菌が含まれる。DAMの部
類の遺伝子は、ヌクレオチド配列GATCにおいてアデニン
のN6位をメチル化する。構築物は標的DNAを含み、それ
は標的DNAによるmRNAの合成を抑制するため、ドミナン
トネガティブである。

組織特異的なプロモーターの探索は、植物遺伝学にお
ける新規な概念による恩恵を受けており、正常な植物の
mRNAから変異を取り除くことにより、本発明における関
心のある機能である葯の発生に特異的に関連するゲノム
の領域において正常と異なるmRNAが得られた。本発明に
適した一つの態様は、例えば5126と命名された新規な植
物プロモーターの活性DNA配列のような、葯特異的なプ
ロモーターである。

図面の簡単な説明図１（配列番号:1）は、5126のゲノムのクローンの、
コード領域から上流の領域を含むヌクレオチド配列の一
覧であり、このヌクレオチド配列は、5126プロモーター
のプロモーター要素の配列を含む。クローン5126のコー
ド配列は、第1488位のATG開始コドンから始まる。

図２は、DP5130プラスミドのマップを表示したもの
で、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子と融合させたトウモ
ロコシ5126プロモーターのNhe・欠失変異体を示してい
る。

図３は、P5126欠失変異体の相対活性を示したもので
ある。各座標は翻訳開始コドンからの相対位置を示す。

図４は、5126プロモーターの組織特異性およびプロモ
ーターの欠失断片に関する情報を示したものである。

図５は、DP5814プラスミドにおいて用いた−503 P512
6欠失体の分裂段階特異性を示したグラフである。Pre＝
減数分裂前、Mei1＝減数第一分裂、Mei2＝減数第二分
裂、Ｑ＝花粉４分子期、QR＝４分子放出期、EU＝初期単
核小胞子期、EMU＝初期−中期単核小胞子期、LMU＝後期
−中期単核小胞子期。

図６は、大腸菌のDAMメチラーゼと融合させた5126欠
失プロモーターを含み、さらに、倍加したCaMV 35Sプロ
モーター、遺伝子BARと融合させたADH1イントロン、お
よびpin IIターミネーターをも含むDP5814プラスミドの
マップを示したものである。

図７は、新規なBspH I制限部位の内部に変異を誘発さ
せたATGコドンを含有する大腸菌lexA202遺伝子を含む。
L87BspH Iプラスミドのマップを示したものである。

図８は、倍加したCaMV 35Sプロモーター、lexA202・
トウモロコシC1遺伝子ハイブリッドと融合させたADH1イ
ントロン、およびpin IIターミネーターを含む、L121プ
ラスミドのマップを示したものである。

図９は、倍加したCaMV 35Sプロモーター、lexA202遺
伝子と融合させたADH1イントロン、およびpin IIターミ
ネーターを含む、DP5817プラスミドのマップを示したも
のである。

図10は、lexA結合部位、ADH1イントロン、ホタルルシ
フェラーゼ、およびpin IIターミネーターを含む最小の
CaMV 35Sプロモーター（−33）を含む、DP6232プラスミ
ドのマップを示したものである。

図11は、最小の−33 CaMV 35Sプロモーター、Adh1イ
ントロン、DAMメチラーゼおよびpi IIターミネーターを
伴うlexA結合部位を含み、さらにlexA202−C1と融合さ
せた5126プロモーターおよび選択マーカー構築物である
CaMV 35S:BARを含む、DP6509プラスミドのマップを示し
たものである。

図12は、種々の用量のDNAを用いた際の、トウモロコ
シ胚形成性懸濁細胞におけるlexA202−C1の活性化およ
びlexA媒介性の抑制を示す棒グラフである（図中の数字
はDNAの相対的な量を示す）。

図13は、大腸菌のlexA遺伝子と融合させた5126欠失プ
ロモーターを含み、さらに、倍加したCaMV 35Sプロモー
ター、BAR遺伝子と融合させたトウモロコシのADH1イン
トロン、およびpit IIターミネーターをも含むPHP6552
プラスミドのマップを示したものである。

図14は、大腸菌のlexA遺伝子と融合させたトウモロコ
シ・ユビキチンプロモーターおよびイントロンを含み、
さらに、倍加したCaMV 35Sプロモーター、BAR遺伝子と
融合させたトウモロコシADH1イントロン、およびpin II
ターミネーターをも含むPHP6555プラスミドのマップを
示したものである。

図15は、最小の−33 CaMVプロモーター、Adh1イント
ロン、トウモロコシ細菌殺傷性（cornynebacteriphag
e）のジフテリア毒素Ａサブユニット、および遺伝子７
ターミネーターを伴うlexA結合部位を含み、さらにlexA
202−c1と融合させた5126プロモーターおよび選択マー
カー構築物であるCaMV 35S::BARを含む、PHP6520プラス
ミドのマップを示したものである。

図16は、5126欠失プロモーター、ならびに最小の−33
CaMVプロモーター、Adh1イントロン、大腸菌のDamメチ
ラーゼおよびpin IIターミネーターを伴うlexA結合部位
を含み、さらに選択マーカー構築物であるユビキチン:P
ATを含む、PHP8036プラスミドのマップを示したもので
ある。

図17は、5126欠失プロモーター、ならびに最小の−33
CaMVプロモーター、大腸菌のDamメチラーゼおよびpin
IIターミネーターを伴うlexA結合部位を含み、さらに選
択マーカー構築物であるユビキチン::PATを含む、PHP80
37プラスミドのマップを示したものである。

図18（配列番号:23）は、5126のcDNAのDNA配列の一覧
である。cDNA配列の翻訳の推定上の開始点は、第73位の
ヌクレオチドである。

好ましい態様の詳細な説明本発明は、例えば雄性不稔を引き起こすことなどを目
的として、植物の発生に影響を及ぼすための、転写アク
チベーター、ならびにドミナントネガティブ遺伝子を活
性化するために、DNA結合部位に作用できる遺伝子、ド
ミナントネガティブ遺伝子、ならびにDNA結合部位に作
用する遺伝子を制御する組織特異的なプロモーターを含
む適したプロモーターを含む、遺伝的構築物の利用に関
する。トランスジェニック植物における適したドミナン
トネガティブ遺伝子には、サイトトキシン遺伝子、メチ
ラーゼ遺伝子、および成長抑制遺伝子が含まれる。ドミ
ナントネガティブ遺伝子には、ジフテリア毒素Ａ鎖遺伝
子（Czako and An,1991）、トウモロコシにおけるCDCな
どの細胞分裂周期の変異（Colasantiら、1991）、WT遺
伝子（Farmerら、1994）、およびP68（Chenら、1991）
が含まれる。例証となる態様においては、その発現産物
が植物のDNAにおけるアデニン残基のメチル化を触媒す
るDAMメチラーゼ遺伝子が用いられる。メチル化された
アデニンは、このようなメチル化された残基は植物のDN
Aにおいては内因性には認められないことから、メチル
化アデニンは細胞の生存能には影響を与えず、そこでDA
Mメチラーゼ遺伝子が発現する組織のみにおいて認めら
れると考えられる。DNA結合のために適したシステムはl
exA−C1システムである。一般的に、この構築物は外因
性であり、適したプロモーターを含む。

発生過程に変更を加えることは、雄性不稔の植物を産
生するために特に有用である。雄性不稔の植物を産生す
る一つの方法は、メチラーゼタンパク質に関するセンス
遺伝子を含む組換え分子（遺伝的構築物）を用いて植物
細胞に形質転換を施すことである。適したプロモーター
は、発生の制御のための戦略に応じて選択する。例え
ば、一つの戦略は、葯組織特異的なプロモーターを用い
ることにより、葯組織においてメチラーゼ遺伝子を選択
的に発現させるというものである。雄性不稔の植物を産
生するためには、常法（材料および方法の項を参照）に
従って、形質転換された細胞を植物体に再分化させるこ
とが必要であろう。

本発明の他の態様において、雄性不稔の植物は、花粉
の形成および／または機能に不可欠である細胞において
選択的に発現するプロモーターの制御の下にメチラーゼ
遺伝子が置かれることによって産生される。

本明細書における「外因性」とは、その環境に対して
異物である事柄を意味し、特に本明細書では、宿主植物
の正常な遺伝的総体において認められないか、または内
因的な状態の場合よりも高いレベルで発現する、遺伝的
構築物の部類を意味する。

「適したプロモーター」には、タペータム細胞、花粉
母細胞、または初期の小胞子を含む花粉の形成および機
能に不可欠な細胞における遺伝子の発現を制御する、組
織特異的または細胞特異的なプロモーターが含まれる。

花粉の発生または機能に不可欠である細胞に選択的に
影響を及ぼすために計画された態様において、タペータ
ム細胞などの特異的な細胞または組織において遺伝子の
発現を調節するプロモーターが、DNA結合タンパク質ま
たはメチル化センス遺伝子をコードする遺伝子を制御す
るために用いられる。

この文脈における適したプロモーターは、タペータム
組織のみにおいて発現を引き起こす組織特異的な調節性
要素である。このような適したプロモーターの一つが、
5126クローンに由来し、DNA配列の発現を葯組織に限定
させる、前記の5126プロモーターである。この5126プロ
モーターは、図１に示す通り、5126のゲノムのクローン
のコード領域から上流に位置する、葯組織においてDNA
配列の発現の制御または調節が可能なヌクレオチド配列
を含む。5126プロモーターの欠損変異体もまた、後出の
（Ｂ）項において特徴づけを行ったように、葯組織にお
いて所望の選択的な発現をもたらす5126プロモーターの
ヌクレオチド配列の特異的な領域に加えて、本発明にお
ける利用のために適している。このような5126プロモー
ターの特異的な領域の特徴づけはすでに行われており、
後出の（Ｂ）項に示している。その他の適したプロモー
ターには、G9、SGB6、およびTA39が含まれる。TA39プロ
モーターの単離および利用の詳細は、本明細書の材料お
よび方法の項に提示している。

本発明に関して、「植物における雄性不稔」という状
態は、生存可能な花粉を全く放出しない、100％の不稔
性を意味する。この状態は、放出された花粉の測定およ
び発芽検査などの方法を含む、当業者には周知の方法に
よって確かめることができる。

「葯特異的プロモーター」は、植物の一部またはその
他のすべての組織よりも、葯組織における関連する遺伝
子の転写を高レベルにさせるDNA配列である。好ましく
は、このプロモーターは葯のみにおいて発現を指図す
る。例えば、5126プロモーターは、葯細胞において発現
する。遺伝子の葯特異的プロモーターは、葯組織におい
て遺伝子の発現を指図するが、根、子葉鞘などのその他
の組織においては指図しない。この特異的なプロモータ
ーは、例えば、公表されている欧州特許出願第9381045
5.1号において説明されている。

「オペレーター」（または「DNA結合部位」）は、構
造遺伝子の5'端の方向に位置するDNA分子であり、活性
化または抑制の機能のいずれかを有するDNA結合タンパ
ク質によって認識および結合されるヌクレオチド配列を
含むDNA分子である。リプレッサータンパク質がその同
族のオペレーターと結合することにより、その構造遺伝
子の転写の抑制が引き起こされる。例えば、lexA遺伝子
はlexAオペレーターと結合するリプレッサータンパク質
をコードしている。

「単離DNA分子」は、生物体のゲノムのDNAに統合され
ていない、DNAの断片である。単離DNA分子は化学的に合
成されたものでもよい。

「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を意味す
る。例えば、構造遺伝子の場合、発現には、構造遺伝子
のmRNAへの転写、およびmRANの一つまたはそれ以上のポ
リペプチドへの翻訳が含まれる。

「クローニングベクター」は、宿主細胞内において自
律的に複製する能力を持つ、プラスミド、コスミド、ま
たはバクテリオファージなどのDNA分子である。クロー
ニングベクターは、そのベクターの本質的な生物機能を
失うことなく、確定できる様式で外来のDNAを挿入する
ことができる制限酵素認識部位を典型的には一つまたは
少数含んでおり、また、クローニングベクターによって
形質転換された細胞の同定および選択における利用に適
したマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子は、典型的
には、テトラサイクリン抵抗性またはアンピシリン抵抗
性を提供する遺伝子を含む。

「発現ベクター」は、宿主細胞において発現される遺
伝子を含むDNA分子である。典型的には、遺伝子の発現
は、構成的または誘導性のプロモーター、組織特異的な
調節性要素、およびエンハンサーを含む特定の調節性要
素の制御の下に置かれている。このような遺伝子は、調
節性要素と「機能的に連結している」と呼ばれる。

以下の例は、本発明の特異的および好ましい態様の見
本として示したものである。これらの例は、本発明の範
囲をいかなる様式においても限定するものではない。本
発明の精神および範囲にとどまる限りにおいて、多くの
変更および修正を施すことが可能であることが理解され
るべきである。

例1. 5126プロモーターの単離および特徴解析（Ａ）方法葯特異的なプロモーターの単離のために用いた方法
は、トウモロコシについては新規なものであった。適し
た遺伝子を単離するために発生的境界域の前および後に
mRNAを採取することができるので、適した葯組織特異的
な遺伝子が発現すると考えられる発生時期が決定された
後のみに遺伝子単離に関するサブトラクション法のみが
有用であった。

雄性捻性のトウモロコシからの葯および雄性不稔のト
ウモロコシからの葯の発生を詳細に比較した結果、小胞
子の変性が起こるわずか前の時点での葯のmRNAのサブト
ラクションにより、独自の葯特異的なmRNAを得られるこ
とが示唆された。全体のRNAは、小胞子の変性が起こる
わずか前の時点に雄性不稔の植物の葯から単離した。優
性の雄性不稔変異株Ms44を用いる場合、これは小胞子生
成における花粉四分子期またはその前後の時点に葯を採
取することを意味した。また、捻性の同胞種の植物から
の葯もこの時期に採取した。雄性捻性および雄性不稔の
植物を、mRNAの源として収集した。

（１）RNAの単離：これは、当業者に周知であるグアニ
ジン・イソチオシアネート法により実施した。

（２）mRNAの単離：これは、インビトロゲン（Invitrog
en）社製のオリゴdTカラムを用いて行った。

（３）cDNAライブラリーの構築：ライブラリーは、優性
の雄性不稔変異株（Ms44）およびその雄性捻性同胞種
（ms44）のトウモロコシ貯蔵（イリノイ大学のトウモロ
コシ保存センター（Maize Stock Center）から入手する
ことができる）の雄穂のmRNAから作成した。このライブ
ラリーは、pCDNA IIベクターおよびBstX I部位における
クローニングによる二方向クローニング法を用いたイン
ビトロゲンにより作製した。

（４）サブトラクション：サブトラクションは、インビ
トロゲン社の「The Subtractor I」の2.3版の操作マニ
ュアルに記載されている通りに実施した。優性の雄性不
稔ライブラリーからの標識したcDNAをドライバーとして
用い、標識していない雄性捻性のライブラリーをテスタ
ーとして用いた（材料および方法の項を参照）。この新
たなライブラリーは＃５と命名され、独自の優性捻性の
cDNAを複数含んでいることが予期された。

（５）ユニークなクローン：クローンを無作為にライブ
ラリー＃５から単離し、挿入物をゲル精製した後、P32
を用いて無作為に六量体（hexamer）標識するととも
に、ニトロセルロース上でスロットブロット処理を施し
た。重複クローンは交差ハイブリッド形成法により無効
化した。5126はサブトラクション・ライブラリー＃５か
ら選び出した一つのクローンである。このクローンの葯
特異性を確かめるため、それを雄穂以外のcDNAとハイブ
リダイズさせた。

（６）完全長cDNAの単離:5126の完全長のcDNAを得るた
め、部分的な5126のcDNAクローンを単離し、m13汎用プ
ライマー5'TGTAAAACGACGGCCAGT 3'（M13 UP）（配列番
号:2）およびm13の逆プライマー5'CAGGAAACAGCTATGACC
3'（M13 RP）を用いて塩基配列を決定した。この5126の
部分的なcDNAクローンは、27ヌクレオチドから成るポリ
Ａ＋尾部を含む594塩基の挿入物を含む。全体のRNAおよ
びmRNAを、ライブラリー構築のために単離した。このcD
NAライブラリーは、ストラタジーン（Stratagene）社
が、Uni−Zap XR定方向クローニングシステムを用いて
作成した（EcoR IからXho Iまでを含む）。完全長の512
6 cDNAを得るために、部分長の5126 cDNAからのEag I断
片を用いて１×10⁶個のPFU細胞をスクリーニングした。
宿主細菌としてはER1647（NEB）を用いた。均一性を有
する10個の陽性クローンが精製された。プラスミドは、
Uni−Zap XRベクターからの、pBluescript SK（−）フ
ァージミドのインビボ切り出しによって作製した（スト
ラタジーン・ラムダザップ（Lambda Zap）始動マニュア
ル、14ページを参照）。塩基配列の決定は、クローンp5
126−５に関して、アメリカ合衆国バイオケミカル・カ
ンパニー（United States Biochemical Company）によ
り行った。この塩基配列は図18に示した。両鎖の塩基配
列は完全に決定され、これは部分長のcDNAの配列と合致
した。部分長のcDNAに対するノーザンブロットでは、転
写物の長さは約1.5Kbであることが示された。p5126−５
の長さは1.485Kbであり、このことはそれが完全長のcDN
Aの全体またはほぼ全体を有していることを示してい
る。

（７）ゲノムの単離：ゲノムライブラリーは、Sau3A1を
用いて部分的に分解され、λDASH II（Stratagene）のB
amH I部位にクローニングされた、トウモロコシ近交系B
73のDNAから作成した。部分長の5126 cDNAからのEag I
断片を用いて１×10⁶個のPFU細胞をスクリーニングし
た。宿主細菌としてはER1647（NEB）を用いた。３回の
スクリーニングの後、均一性を有する３個のクローンを
単離した。これらのλクローンからDNAを、ベロニーお
よびレコード（Bellony and Record）（1989）により報
告された方法を用いて単離し、制限部位のマッピングを
行った。３個のクローンはすべで同一であり、長さは約
18Kbであった。

（Ｂ）プロモーター5126の特徴解析（１）ノーザン分析：部分長の5126 cDNAに由来するEag I断片を、トウモロ
コシの黄化葉、根、生育６日目の苗の緑色葉、減数分裂
前の葯を伴う雄穂、減数分裂期の葯を伴う雄穂、花粉四
分子期から単核小胞子期までの葯を伴う雄穂、および
「ear shoot」から得たポリＡ＋のmRNAを含むノーザン
膜のプローブとして用いた。Eag I断片は、アマーシャ
ム社製のエンハンスド・ケミルミネッセンス（ECL）シ
ステム（Enhanced Chemiluminescence system）を用い
て、西洋ワサビペルオキシダーゼによりラベルした。プ
ローブハイブリダイゼーションおよび膜洗浄は、ECLシ
ステムの製造者のプロトコールに従って実施した。転写
物とハイブリダイズしたcDNAプローブの長さは約1.6kb
であり、花粉四分子期から単核小胞子期までの葯を伴う
雄穂からのmRNAのみに存在した。

（２）塩基配列分析： 5126のcDNAプローブとハイブリダイズさせた、ラムダ
DASH IIにおける３種のゲノムクローンを単離した。３
種のクローンとは、5126.4、5126.5、および5126.8であ
る。

ゲノムクローンの一つである5126.8から約5kb長のHin
d IIIIII断片を単離し、ベクターBluscript II KS＋（S
tratagene）のHind IIIIII部位にサブクローンした。２
つの異なる方向に挿入されたHind IIIIII断片を含む２
種類のプラスミド、DP4769およびDP4770を構築した。こ
のプラスミドDP4769およびDP4770については、m13汎用
プライマー、m13逆プライマーおよびオリゴヌクレオチ
ド5'CCTTCATCAGCTTCTGGCAG 3'（DO776）（配列番号:4）
を用いて、１本鎖に関して部分的に塩基配列を決定し
た。DO776の塩基配列は、5126 cDNA挿入体の5'部位の配
列に由来する。DP4770の２本鎖の塩基配列は、以下のオ
リゴヌクレオチド（それぞれ、配列番号５から８）を用
いる「プライマー・ウォーキング法」によって決定し
た。即ち、5'AGATCTCGGCCAGGCCCTTG 3'（D0990）、5'GA
GTTGATGAAGTGA 3'（CWG4770）、5'GAGATCAATCAGCTAGAGG
3'（PG2−２）、および5'TAAACCTAAGGCC 3'（PG2−
３）。Hind IIIIII部位からD0990に隣接する領域までの
DP4770の配列の長さは1594塩基である。

ゲノムクローン5126.8から約6kb長のSac I断片を単離
し、ベクターBluscript II KS＋（Stratagene）のSac I
部位に挿入した。２つの異なる方向に挿入されたSac I
断片を含む２種類のプラスミド、DP5053およびDP5054を
作製した。Sac I断片は、DP4769およびDP4770のために
用いたHind IIIIII断片と、1207塩基対にわたって重複
している。この重複はDP4769およびDP4770の領域の5'側
に存在し、5126のcDNA挿入体と相同である。DP5053の21
06個の塩基の配列は、DP4770の塩基配列決定のために用
いたものと同じオリゴヌクレオチドに加えて、オリゴヌ
クレオチド5'AATAGCCTAATTTATTAG 3'（PG2−４）、オリ
ゴヌクレオチド5'ACATGTTTCAAGTTCAA 3'（PG2−５）、
オリゴヌクレオチド5'CTTGTCAGAAGTTGTC 3'（PG2−5
C）、およびオリゴヌクレオチド5'CAACCATTACCGATGAA
3'（PG2−6C）（それぞれ、配列番号９から12）を用い
るプライマー・ウォーキング法によって決定した。

5126遺伝子のその他のコード配列の決定には5'RACE法
を用いた。5'RACEプライマー伸長は、トウモロコシ雄穂
からのポリA RNAによるプライマー伸長のために、DP477
0の配列に由来するオリゴヌクレオチド5'ACGAGCGGACGCA
CGACAG 3'（DO1168）（配列番号:13）による5'RACEシス
テム（Gibco BRL）を用いて実施した。Taq I DNAポリメ
ラーゼ（Perkin Elmer）によるPCR増幅のためには、同
じくDP4770の配列に由来する入れ子プライマー5'TCCGTC
GCCATCTGCGTCAC 3'（配列番号:14）、およびアンカープ
ライマー5'CACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG 3'（配
列番号:15）（DO805）（5'RACEシステムに含まれるアン
カープライマーに改変を加えたもの）を用いた。この5'
RACE法の産物を、pT7Blue（Ｒ）ベクターにサブクロー
ンした（ノバーゲン（Novagen）社より入手した）。こ
のPCR産物を含むクローンはCGR3Bと命名された。このプ
ラスミドの塩基配列は、DO805、DO1398、およびm13汎用
プライマーを用いて決定した。この5'RACE PCR挿入体は
412塩基長である。B73ライブラリーから得たゲノムクロ
ーンおよび本来のクローンと比べると、新たなA632ライ
ブラリーに属するほぼ完全長のcDNAの間には多型が認め
られる。

CGR3Bの塩基配列はDP4770の586塩基と一致しており、
ゲノム配列において123塩基のイントロンを含む。この
イントロンは、高度に保存されたイントロン・スプライ
スモチーフ（5'GTおよび3'AG）を含む。推定上の開始コ
ドンは、残る配列を伴うフレームにおいて見いだされ
る。この開始コドンは合理的な開始コドンモチーフ（CG
ATGG）を有している。この推定上の開始コドンのすぐ上
流に存在する、CGR3Bの配列はATに比較的富み、これは
5'非翻訳cDNA配列の特徴である。推定上の開始コドンの
上流に位置するCGR3Bには90個のヌクレオチドがあり、
これは植物における5'非翻訳領域としては合理的な長さ
である。さらに、DP4770において相同であるCGR3B配列
の5'末端は、合理的なTATAボックス（TATATA）の35塩基
下流にある。5126−５配列はCGR3Bの配列と重複してお
り、CGR3Bはさらに上流に43塩基を有する。

このサイズは、ノーザンハイブリダイゼーションから
推測される転写物のサイズである約1.6kbと合理的によ
く祖関する。

（３）部位特異的突然変異誘発 DP5055を作製するために、オリゴヌクレオチド5'GCTG
CTCACCATGGCAAAGCAAC 3'（DO1398）（配列番号:16）を
用いて、DP5053の推定翻訳開始コドンにおいてNco I部
位を作成するため部位特異的突然変異誘発（Su and El
−Gewely,1988）を用いた。

（４）レポーター構築物レポーター構築物DP5062を作製するために、5126のコ
ード領域の5'側に位置する約4kbのSca I−Nco I断片をD
P5055から単離し、ベクター、ホタルルシフェラーゼ領
域、およびプロテイナーゼＩ遺伝子の非翻訳領域（Pin
II）を含むDP1672のSma I−Nco I断片と結合させた。ポ
リクローニング領域におけるHind III部位からATG開始
コドンの587塩基上流にあるHind IIIIII部位までの配列
（DP5121）の除去、またはポリクローニング領域におけ
るPst I部位からATG開始コドンの170塩基上流にあるPst
I部位までの配列（DP5122）の除去により、DP5062の51
26プロモーター断片の5'端に欠失を導入した。プロモー
ター断片の5'端からのさらなる欠失は、翻訳開始コドン
の855塩基対上流にあるSph I部位、開始コドンの503塩
基対上流にあるNde I部位、または開始コドンの216塩基
対上流にあるKpn I部位を用いることにより作製した。D
P5062はSph IまたはNde Iを用いて分解し、T4DNAポリメ
ラーゼにより平滑末端化し、ポリメラーゼを不活性化し
た後にNco Iにより分解した。結果として生じたプロモ
ーター断片を、Pin II 3'領域と融合させたルシフェラ
ーゼリポーターのベクターを含む、DP1672のSma I/Nco
I断片にクローニングした。これにより、DP5131（Sph I
欠失）およびDP5130（Nde I欠失体）を作成した（図
２）。Kpn I欠失体（DP5164）は、（１）プロモーター
／ルシフェラーゼ連結部を含むKpn I/Cla I断片、
（２）Cla I/AlwN Iルシフェラーゼ/Pin II−3'/ベクタ
ー断片、および（３）DP5062の残るベクター片のAlwN I
/Kpn I断片、の３つの断片を連結することによって得
た。

（５）トランジェントアッセイ図３は、完全長の5126プロモーター−ルシフェラーゼ
構築物（DP5062）またはプロモーター欠失誘導体による
形質転換を受けた場合の、花粉四分子期から初期単核期
までの葯において得たルシフェラーゼ比活性を示したも
のである。本質的には、翻訳開始コドンの503塩基対上
流にあるNde I部位までの欠失変異体においては完全な
活性が観察されたが、開始コドンの216塩基対上流にあ
るKpn I部位まで欠失したものでは活性がほぼ完全に失
われた。開始コドンの170塩基対上流にあるPst I部位ま
での欠失したものでは全く活性が残らなかった。このこ
とから、不可欠な要素は、翻訳開始コドンから上流に17
0塩基対から503塩基対までの間に存在する可能性が高い
と考えられる。

図４は、本来の5126プロモーター断片リポーター構築
物（DP5062）および２種類の重要な欠失変異体（DP5130
およびDP5164）を用いた場合の、葯、子葉鞘、根、およ
び胚形成性懸濁培養細胞におけるルシフェラーゼ比活性
を、陽性対照（positive control）および組織特異的な
対照（「構成的な」CaMV 35Sプロモーターによる制御を
受けるルシフェラーゼリポーター遺伝子を含むDP1528、
および葯特異的なプロモーターSGB6による制御を受ける
ルシフェラーゼリポーターを含む）と比較して示したも
のである。Nde I欠失体においては、完全長のプロモー
ター断片について観察される組織特異性が維持されてい
た。

図５は、5126（−503）プロモーターの葯活動性のタ
イミングを示したものである。この欠失プロモーター
は、減数分裂期から中期の単核小胞子期まで活性であっ
たが、初期の単核小胞子期において最も活性が高かっ
た。

例2. DAMメチラーゼプラスミドの構築 DAMメチラーゼ遺伝子は大腸菌から得た。どの植物に
由来するメチラーゼ遺伝子も適している。

DAMメチラーゼ遺伝子（Brooks.ら、1983によれば、19
5−1132ヌクレオチド）は、部位特異的突然変異誘発（S
u and ElGewly,1988）により改変し、開始コドンATGの
９ヌクレオチド5'側に位置する第186ヌクレオチドにSma
I部位を導入したものである。DP5814（図６）は、トウ
モロコシの形質転換に用いたプラスミドであり、これは
構成的に発現するBAR遺伝子に対してcisの関係で葯特異
的なDAMメチラーゼ遺伝子を含む。このプラスミドは、D
P5130（図２）からの512葯特異的プロモーター領域のNd
e I−Nco I欠失体を含む500塩基対のXho I/Nco I断片
と、上記の改変DAMメチラーゼ配列を含む1.0kb長のSma
I/BamH I断片とを連結することにより構築した。Xho I/
Nco I 5126プロモーター断片上に含まれるNco I部位
は、クローニングのための平滑末端を作成するため、確
立したプロトコール（Sambrookら、1989）に従い、T4DN
Aポリメラーゼ（Boehringer−Mennheim）を用いること
によってdNTPで満たした。その結果、プロモーター／遺
伝子連結部には、以下の配列によってコードされる３個
のＮ端残基が付加された（本来のDAMメチラーゼ遺伝子
が開始するMETには下線を施した。これは「ブロックス
（Brooks）ら、1983」におけるヌクレオチド195−197に
対応する）。

5'CCATGGGGACAATG 3'（配列番号:17） DAMメチラーゼの発現は、ジャガイモプロテイナーゼ
阻害性II遺伝子（ヌクレオチド２−310、Anら、1989に
よる）の3'Pin II配列を含む320塩基対のBamH I−Not I
断片を結合することによって終結する。1.6kb長のXho I
−Not I DNA断片上に含まれるこのキメラ型遺伝子は、p
Bluescript（Stratagene）のバックボーンにおいて、増
強されたカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモータ
ー（−421から＋２までのヌクレオチドで、−421から−
90までの直列型反復配列。Gardnerら、1981）、タバコ
モザイクウイルス（TMV）のリーダー配列（Gallieら、1
987において報告された、79塩基対のHind III−Sal I断
片）、トウモロコシ・アルコール脱水素酵素遺伝子のAd
n−Ｓ対立遺伝子からのイントロン１を含む579塩基対の
断片（Dennisら、1984）、酵素フォスフィノスリシン・
アセチルトランスフェラーゼをコードするBAR遺伝子
（ヌクレオチド160−704、Thompsonら、1987による。こ
こで第160ヌクレオチドは、MET開始コドンを作成するた
めにＧからＡに変更されている）、およびジャガイモプ
ロテイナーゼ阻害性II遺伝子（ヌクレオチド２−310、A
nら、1989による）からの終止配列、を含む単子葉植物
性の発現プラスミドにおけるXho I−Not I制限部位にク
ローニングした。

例3. 雄性不稔の植物の産生植物を、DP5814によって形質転換させた。DP5814は、
大腸菌のDAMメチラーゼ遺伝子と融合させたNde I欠失誘
導対、およびpin IIターミネーターを含む。このプラス
ミドは、BAR遺伝子と融合させたカリフラワーモザイク
ウイルスの35Sプロモーターを倍加した形で含む（Thomp
sonら、1987）。

構築物PHP6522（図13）は、DAMメチラーゼ遺伝子のコ
ード配列をlexAの第１−202アミノ酸までのコード領域
と置換した点を除き、DP5814に関して説明したものと同
じである（Golemis,1992）。

構築物PHP6555（図14）は、DP6522に関して説明した
ものと同じであるが、5126プロモーターを、トウモロコ
シ・ユビキチンプロモーターおよび1.9kb長のPst I DNA
断片上に含まれるイントロンと置換した点のみが異な
る。

DP5814を、Bialophos抵抗性の植物が再分化するカル
ス細胞株であるHiタイプII（B73×A188）の内部に射撃
導入した（Armstrong,1991）。雄性捻性の対照とするた
め、形質転換を施していない植物も育成した。トランス
ジェニックおよび対照のカルスを、PCR法によって分析
した。

当該の植物の種および用いた培養物の種類が再分化に
対する感受性を有する限りにおいて、メチラーゼ遺伝子
構築物を含むトランスジェニック植物を、同じ構築物に
よって形質転換された培養物から細分化させることがで
きる。この文脈における「培養物」とは、培養に適し
た、細胞の凝集体、カルス、またはそれらの誘導体を包
含する。

植物は、本明細書において開示した方法および当業者
に周知の方法により、形質転換された細胞もしくは培養
物、または移植片から再分化させることができる。方法
は植物の種によって異なる。種子は、再分化した植物、
または当業者に周知の育種法を用いて得られる、細分化
した植物と同じ種の適した植物との間の交雑種から採取
する。

例4. トウモロコシ植物の受精能に対する5126:DAMメチ
ラーゼの効果 DP5814構築物を用いて形質転換され、再分化したトウ
モロコシ植物を、DAMメチラーゼのコード領域の有無に
関してPCR法により分析し、受精可能な花粉を産生する
能力に関して点数をつけた。

大腸菌のDAMメチラーゼ遺伝子の有無を判定するため
に、当業者に非常に周知の方法であるポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）を用いた。用いたオリゴヌクレオチドはDO1
266およびDO1267である。

これらのオリゴヌクレオチドは以下の配列を有する。

DO1266（配列番号:18）： 5'ATG AAG AAA AAT CGC GCT TTT TTG AAG TGG GC−3' DO1267（配列番号:19）： 5' TCA CCC AGG CGG GCA AAA TCA GCC GAC A−3' これらのオリゴ体は、大腸菌のDAMメチラーゼ遺伝子
を特異的に増幅するためのPCR法におけるプライマーと
して用いた。

PCRにおいてDAMメチラーゼ遺伝子に関して陽性であっ
た25種の独立した一次トランスジェニック・トウモロコ
シを分析した。これらのDAMメチラーゼに関してPCR陽性
である植物のうち22種が雄性不稔であった。これらの植
物に対して実施したサザン分析により、単一コピーまた
は複数コピーの挿入が存在することが検出された。これ
らの雄性不稔の植物における花粉の発生を、PCR陰性ま
たは非形質転換植物のいずれかと比較した顕微鏡検査で
は、減数分裂前および減数分裂期の小胞子はすべての植
物において観察することができたが、花粉四分子期の小
胞子は、DAMメチラーゼ遺伝子に関してPCR陽性で、雄性
不稔である植物に由来する葯においてはまったく観察さ
れなかった。小胞子発生におけるこの変性は、5126Nde
I欠失プロモーターの制御の下で発現した場合に、発生
の同様の段階においてルシフェラーゼ活性が最初に検出
されたとの観察結果と一致しており、初期の小胞子発生
時期におけるDAMメチラーゼ遺伝子の発現が、正常な花
粉の形成を妨げることを示唆する。

雄性不稔のトウモロコシ植物に対して、形質転換して
いないトウモロコシ植物に由来する花粉を授粉し、その
種子を出芽させ、結果として得られた植物について、メ
チラーゼ遺伝子の存在と雄性不稔の相関を確定するため
に、除草剤抵抗性を有する雄性不稔の植物という条件お
よび35S:Bar−5126:DAMメチラーゼ構築物の存在という
２つの条件に関する同時分離を行った。13種の独立した
雄性不稔のTO事象に由来するT1集団のサザン分析によ
り、雄性不稔のバイアロフォス抵抗性の植物のすべてが
大腸菌のDAMメチラーゼ遺伝子およびBAR遺伝子を含み、
一方、雄性捻性のバイアロフォス感受性の分離群はこれ
らの遺伝子を含んでいないことが明らかになった。

T0植物においてなされた観察と同様に、減数第一分裂
と花粉四分子期との間の時期に小胞子発生の変性が起こ
った。

例5. 植物における雄性不稔の表現型と、メチル化の能
力を持つ遺伝的構築物の挿入との相関を調べるためのサ
ザンブロット法 9mlのCTAB抽出緩衝液（100mMトリスpH7.5、１％ヘキ
サデシルトリメチル−臭化アンモニア、0.7M塩化ナトリ
ウム、10mM EDTA）を、凍結乾燥した300mgの葉組織に添
加し、ボルテックス処理の後、65℃で１時間インキュベ
ートした。5mlのクロロホルム／オクタノール（24:1）
溶媒を添加し、５分間混合した。抽出物に対して、2500
rpmの遠心処理を30分間行った。最上層を取り除いて新
しい試験管に入れ、11mlのCTAB沈降緩衝液（CTAB抽出緩
衝液の組成から塩化ナトリウムを除いたもの）を添加し
た後、反転して30分間放置した。この試料に対して2000
rpmの遠心処理を10分間行った。ペレットを再懸濁化す
るために、100mMトリス（pH7.5）、10mM EDTA、0.7M Na
Clからなる溶液2mlを添加し、60℃で15分加熱した。10
μｌのRNAseA（10mg/ml）を添加し、37℃で30分間イン
キュベートした。5mlの冷却した100％エタノールを試験
管に添加し、ゆっくりと混合した後、曲率９インチのパ
スツールピペットを用いてDNAをすくい取り、76％エタ
ノールおよび0.2M酢酸ナトリウムを含む試験管に入れ、
20分間放置した。DNAを76％エタノールおよび0.2M酢酸
ナトリウムを含む新しい試験管に入れ、水分を除き、30
0μｌのTE（10Mトリス［pH7.5］、1mM EDTA）中に再懸
濁した。制限酵素によって分解した５μｇのゲノムDNA
を、トリス−酢酸緩衝液を含む0.8％のアガロースゲル
上で電気泳動した。この際、ゲルが膜状に変形するよう
に調製するために、500mlの0.25M HCl中にて20分間、0.
4M NaOH、0.6M NaClから成る溶液500ml中にて40分間、
および500mlの0.5Mトリス（pH7.5）、1.5M NaClから成
る溶液500ml中にて30分間、それぞれインキュベートし
た。25mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）を用いて、
アマーシャムナイロンFP膜上へ転写した。変形後、膜を
80℃の真空中で加熱した。膜は、最初に用いる前に、0.
1XSCP（1XSCP、0.1M NaCl、16mMリン酸ナトリウム、pH
7.0）および0.1％SDSを含む溶液中で30分間、65℃でイ
ンキュベートした。P32−dCTPでラベルしたDNAプローブ
は、アマーシャム社から提供されたランダムプライマー
ラベル化キットを用い、製造者の指示に従って作製し
た。DAMメチラーゼに特異的なプロモーターを作製する
ために、DP5814から635塩基対のBamH I DNA断片を単離
して標識化した。BAR特異的なプロモーターを作製する
ために、DP5814から560塩基対のNco I−BamH I DNA断片
を単離して標識化した。ラベルしたプローブは10分間95
℃で変性させ、20mlのハイブリダイゼーション緩衝液
（0.1X硫酸デキストランを含む0.1XSCP）中の濾紙に添
加し、65℃で一晩インキュベートした。0.1％SDSを含む
65℃の0.1XSCPで濾紙を３回洗浄した。この濾紙をスク
リーン（Dupont）とともに−70℃でＸ線フィルムに露光
させた。

実施例6. トランスジェントアッセイプラスミドの構築プラスミドL87を作製するため、lexA202遺伝子を含む
Hind III/Xho I片（Golemis and Brent,1992におけるpE
G202の第734−1406ヌクレオチド）を、pBluescript SK
＋（Stratagene）中にクローニングした。このプラスミ
ドの位置指定変異誘発（Su and ElGewley,1988）を、オ
リゴヌクレオチドDO2326（配列番号:20）： 5'CCGTTAACGCTTTCATGACGCCCGGAATTAAGC 3' を用いて実施した結果、lexA−202リーディングフレー
ムの開始ATG（ヌクレオチド754、Golemis and Brent,19
92）にBspH I部位が挿入され、プラスミドL87BspH I
（図７）が得られた。L87BspH Iから得られる、lexA配
列をコードするBspH I/EcoR I断片の第１−202残基を含
むキメラ型遺伝子を、前記のトウモロコシC1の第144−2
73残基のEcoR I/Hpa I断片とインフレーム融合し、pBlu
escriptのバックボーンにおいて、増強されたカリフラ
ワーモザイクウイルス35Sプロモーター（−421から＋２
までのヌクレオチドで、−421から−90までは直列型反
復配列。Gardnerら、1981）、タバコモザイクウイルス
（TMV）のリーダー配列（Gallieら、1987において報告
された、79塩基対のHind III−Sal I断片）、トウモロ
コシ・アルコール脱水素酵素遺伝子のAdh−Ｓ対立遺伝
子からのイントロン１を含む579塩基対の断片（Dennis
ら、1984）、およびジャガイモプロテイナーゼ阻害性II
遺伝子（ヌクレオチド２−310、Anら、1989による）か
らの終止配列、を含む単子葉植物性の発現プラスミド中
に導入し、プラスミドL121を得た（図８）。

構築物DP5817（図９）は上記の、増強されたCaMVプロ
モーター、TMVリーダーAdhイントロン、およびpin IIタ
ーミネーター配列を含む。L87BspH IからのBspH I/Sma
I断片上に位置する、lexAタンパク質の第１−202残基を
コードする配列（Golemis and Brent,1992におけるpEG2
02の第754−1382ヌクレオチド）を、L121に見いだされ
るlexA−C1キメラ型遺伝子との置換により、Adhイント
ロンの下流にクローニングした。

レポータープラスミドDP6232（図10）は、以下のヌク
レオチド配列を有する相補性のオリゴヌクレオチド、DO
2448およびDO2449Z上に存在する、lexA DNA結合部位が
３回直列反復された配列を含む。

DO2448（配列番号:21）： 5'GATCTACTGCTGTATATAAAACCAGTGGTTATATGTACAGTACTGC
TGTATATAAAACCAGTGGTTATATGTACAGTACGGATG 3' DO2449（配列番号:22）： 5'ACTACATATATTTTGGTCACCAATATACATGTCATGACGACATATA
TTTTGGTCACCAATATACATGTCATGCCGATG 3' これらのオリゴ体をアニーリングした後、切断された
CaMVプロモーター、TMVリーダー、ADHイントロン、ホタ
ル・ルシフェラーゼ遺伝子のコード領域（＋53−＋170
8、deWetら、1987）、およびPin II終結配列からなる上
流に位置するBg III/Nde I断片（第−33−＋２ヌクレオ
チド、Gardnerら、1981を参照）として、pBluescriptの
バックボーンにクローニングした。

構築物DP6509（図11）は、トウモロコシ植物において
発現するために設計された３つのキメラ型遺伝子を含む
プラスミドである。また、このプラスミドは、前記の通
りルシフェラーゼのコード配列に９塩基対を付加した状
態を維持して、DP6232のDAMメチラーゼ遺伝子に関して
説明したように、切断されたCaMVプロモーター、TMVリ
ーダー、ADHイントロン、およびpin IIターミネーター
の上流にlexA結合部位を含む。葯特異的な転写アクチベ
ーター5126::lexA−C1をコードする遺伝子配列は、上記
のDAMメチラーゼ・レポーター遺伝子のすぐ下流に位置
する。この遺伝子は、L121に関して説明したように、DP
5130からの5126プロモーター配列、LexA202−C1キメラ
配列、およびPin II配列を載せたXho I/Nco I断片を含
む。このプラスミドにコードされる第３の遺伝子は、DP
5814に関して説明したように、pBluescriptのバックボ
ーン上に、増強されたCaMVプロモーター、TMVリーダ
ー、Adhイントロン、BARコード配列、およびpin IIター
ミネーターを含む。

構築物DP6520（図15）は、DAMメチラーゼ遺伝子およ
びpin IIターミネーターのコード配列がジフテリア毒素
コード領域および遺伝子７ターミネーターによって置換
されている点を除き、PHP6509に関して説明した内容と
同じである（Czako and An,1990）。

構築物PHP8036（図16）は、5126プロモーターの第−5
03−−134位に加え、DP6509に関して説明したように、
最小の−33 CaMVプロモーター、TMVリーダー、ADH1イン
トロン、DAMメチラーゼのコード領域、およびpin IIタ
ーミネーターの上流にlexA結合部位が融合したものを含
む。また、このプラスミドは、1.9kbのトウモロコシ・
ユビキチンプロモーターおよびイントロンを、ストレプ
トマイセス・ビリドクロマジェネス（Streptomyces vir
idochromagenes）に由来する改変型のフォスフィノスリ
シン−Ｎ−ア−セチルトランスフェラーゼ遺伝子（Pa
t）およびノパリン合成酵素遺伝子（Droge,et al.）と
融合させることによって構築される選択マーカー構築物
であるUbi−Patも含む。

構築物PHP8037（図17）は、650塩基対のSal I/BamH I
DNA断片内に含まれるトウモロコシAdh1イントロンが、
プラスミドの5126:lexA:DAMメチラーゼ部分から除去さ
れている点を除き、PHP8036と同じである。

実施例7. lexA−C1とlexAのいずれか一方、または両方
の一過性の同時発現によるlexA結合部位を含むルシフェ
ラーゼレポーターの発現以下の２つの疑問点を明らかにするために実験を行っ
た。まず第１は、細菌のDNA結合タンパク質であるlexA
が、植物細胞における遺伝子の発現を促進および増強さ
せることができるかどうかである。第２は、lexAタンパ
ク質が転写アクチベーターlexA−C1と同時発現すること
により、アクチベーター介在性の遺伝子発現を抑制する
かどうかである。

lexAタンパク質は、lexA DNA結合部位（「lexAオペレ
ーター」）を含むDNAの領域と結合すると考えられる
が、mRNAの合成を開始するために必要な植物由来の転写
成分を増加させることはないと考えられる。しかし、DN
A結合タンパク質に対して転写アクチベーターとして作
用することができるタンパク質領域を並置することによ
り、リポーター遺伝子の発現の増強が起こると考えられ
ることが示されている（Rudenら、1991）。lexA遺伝子
がトウモロコシ細胞におけるリポーター遺伝子の発現を
促進する能力を検討するため、転写活性化ドメインをコ
ードするトウモロコシC1遺伝子の領域（Goffら、1991）
を、DNA結合タンパク質lexAと対応するDNAの領域とイン
フレーム融合させ、ハイブリッド遺伝子lexA202−C1を
作製した。このハイブリッド遺伝子は、図８に示すよう
なプラスミドL121を作製するため、構成的プロモーター
35Sの転写制御の下に置かれた。

さまざまな量のこの構築物を、lexA結合部位を含む一
定量のルシフェラーゼレポーター遺伝子、すなわちプラ
スミドDP6232とともに、トウモロコシの胚形成性懸濁細
胞内に同時射撃導入した。図12に示した通り、レポータ
ー単独の場合はルシフェラーゼ比活性はきわめて低かっ
たが（総タンパク質量１μｇ当たり14光単位（14LU/μ
ｇ）、lexA−C1トランスアクチベーターを射撃１回当た
り5ng以上の量を同時射撃導入した場合には、高いルシ
フェラーゼ活性（＞9000LU/μｇ）が検出された。

lexAタンパク質がルシフェラーゼの高レベルの発現を
抑制するかどうかを確定すめ、図９に示す35S:lexA構築
物を含むプラスミドDP5817を、DP6232およびL121ととも
に、L121またはDP5817の量を各種変更しながら同時射撃
導入した。図12に示す通り、lexA−C1構築物およびレポ
ーターを含む投与物に対するDP5817の追加により、ルシ
フェラーゼ活性の低下が生じた。これらのデータを総合
すると、トウモロコシの胚形成性懸濁細胞において、le
xA−C1融合タンパク質が同時発現した場合にはlexA DNA
結合部位を含む遺伝子の発現の増強が認められること、
およびこの発現はlexAタンパク質によって抑制されるで
あろうと考えられる。

例8. 雄性捻性の植物の復帰本発明によれば、雄性不稔の植物を雄性捻性に復帰さ
せるためにはいくつかの戦略がある。タペータム特異的
なプロモーター5126のようなプロモーターが転写アクチ
ベーターLexA−C1遺伝子と融合し（本明細書では5126::
LEXA−C1と呼ぶ）、その遺伝子のLexA部分がLexAオペレ
ーター（LexAop）と呼ばれるDNA領域と結合する細菌のL
exAタンパク質をコードし、その遺伝子のC1部分が、例
えば最小の35Sプロモーターなどの最小のプロモーター
要素の内部にLexAopを含む遺伝子の転写の活性化を促進
するためのトウモロコシの転写機構と相互作用するトウ
モロコシC1タンパク質をコードしている場合にはカスケ
ード的効果が起こる。

雄性不稔のトウモロコシ植物を作製するために、DAM
メチラーゼ遺伝子を、最小のCAMV 35Sプロモーターと融
合させたLexAopの制御の下に置いた。同じプラスミド上
に、5126::LexA−C1領域および選択マーカー35S:BARが
含まれる（図11、DP6509）。この構築物を導入した場
合、葯におけるDAMメチラーゼ遺伝子の発現によって植
物は雄性不稔となる。LexA−C1は5126による調節を受け
る。

5126::LexA−C1およびLexAop::DAMメチラーゼを含む
雄性不稔の植物に受精能を回復させるため、このような
植物を、LexAのDNA部分のみと融合した5126プロモータ
ーまたはその他の適したプロモーターを含む植物と交雑
させた。5126:lexAを含む遺伝的構築物の存在は雄性捻
性と対応する。lexAopと結合するタンパク質を発現する
が、DAMメチラーゼ遺伝子の転写の活性化は行わない遺
伝子の存在下においては、DAMメチラーゼタンパク質の
合成は抑制され、そのためこの植物は雄性捻性となる。

トランスジェニック・トウモロコシは植物、本明細書
で説明したように、プラスミドPHP6522、PHP6555、およ
びPHP6520を含むように作製される。雄性不稔性の構築
物であるPHP6520を含むトランスジェニック・トウモロ
コシ植物を作製したトランスジェニック事象のうち、５
件はT0世代において雄性不稔であることが確かめられ、
３件は雄性捻性植物であることが確かめられた。雄性不
稔を生じた事象のうち３件においては、T1世代における
雄性不稔の表現型に関して、イグナイト（Ignite）抵抗
性を用いる分離法によって分析した。その結果を表１に
示す。

雄性不稔の事象である937.59.35.2と937.63.25.1と
を、ユビキチンプロモーター（PHP6555）または葯特異
的プロモーター（PHP6522）の制御下にそれぞれ置かれ
たlexA遺伝子を植物に由来する花粉を用いることにより
交雑した。結果は、不稔性の構築物（PHP6520）および
抑制性の構築物（PHP6522または6555）の両方を含む植
物は雄性捻性となるが、不稔性の構築物PHP6520のみを
含む植物は雄性不稔となると考えられるというものであ
った。

トランスジェニック事象は前記の通り、最小のCaMVプ
ロモーター（PHP8036またはPHP8037）と並置するように
lexA結合部位が埋め込まれた、改変型の5126プロモータ
ー（図１の内容のうち、第1488部位の開始コドンから相
対的に−503から−134の位置にあるヌクレオチド配列）
を含む構築物を用いて実施した。これらの構築物を導入
した場合、DNAメチラーゼ遺伝子の発現により、抵抗性
の植物は雄性不稔となる。PHP8036またはPHP8037のいず
れかを含むこのような雄性不稔の植物は、構成的（PHP6
555）または組織特異的（PHP6522）な様式でlexAリプレ
ッサーが発現する植物と交雑された。結果は、不稔性の
構築物（PHP8036またはPHP8037）および抑制性の構築物
（PHP6522または6555）の両方を含む植物は雄性捻性と
なるが、一方、不稔性の構築物であるPHP8036またはPHP
8037のみを含む植物は雄性不稔となると考えられるとい
うものである。

材料および方法サブトラクション・プローブ法（Invitrogen社によ
る）：サブトラクションcDNAプローブの作製は、サブトラク
ション・ライブラリーの作製方法と同様の方式によって
行った。この方法の概略を以下に図示する。この図式で
は、誘導された（メッセージ＋）mRNAプールから、ラベ
ルしたcDNAをまず合成する。その結果生じるcDNA−RNA
ハイブリッドを、鋳型mRNAを除去するためにアルカリ処
理し、続いてプールＢ（メッセージ−）からの過量の光
ビオチン標識mRNAとハイブリダイズさせる。その結果生
じる光ビオチン標識RNA/cDNAハイブリッドを遊離ストレ
プトアビジンと結合させ、選択的フェノール／クロロホ
ルム抽出によりハイブリッド混合物から除去する。サブ
トラクションライブラリーの手順と同じく、ハイブリッ
ドを形成していない（誘導された）cDNAを残して、スト
レプトアビジン−光ビオチン標識核酸複合体を抽出す
る。結果として得られるサブトラクトされたcDNAプロー
ブは、ハイブリダイゼーションブロットまたはスクリー
ニングライブラリーのために直接用いることができる。

サブトラクションcDNAプローブの使用により、組織特
異性を持つ稀な転写物に対応するcDNAクローンを同定す
る機会が増す。典型的なcDNAプローブにおいて、その全
体の構成はmRNAの豊富さと比例している。各種の程度で
発現した遺伝子に特異的な配列のためのcDNAプローブを
豊富にすることにより、プローブは意図するクローンに
対してさらに特異的となり、それはライブラリーのスク
リーニングを容易にする。サブトラクションcDNAライブ
ラリーは、特定の組織または誘導された細胞の状態に独
特である豊富さに乏しいmRNAを示すcDNAクローンを同定
するために、サブトラクトされたプローブとともに用い
ることができる。サブトラクトされたcDNAのライブラリ
ーを用いる利点は、非サブトラクトcDNAライブラリーと
対比して、スクリーニングする必要のあるクローンの数
が少ないことである。

トランジェントアッセイの方法：トウモロコシ胚形成性懸濁細胞培養物は、記載された
方法（Bowen,1992）で懸濁液中に保管され、３日から４
日毎に継代培養されている未成熟の胚に由来する。細胞
を継代培養して２日後に収集し、射撃導入を行う前に、
50mg/mlの密度の0.25Mマンニトールを含む増殖培地中に
て一晩処理した。各射撃導入に際して、1mlの増殖培地
で予め湿らせた濾紙上に25mgの細胞を載せた。３μｇの
レポータープラスミドDNA（DP6232）ならびに種々の量
のDP5817および／またはL121（0.01−３μｇ）を、0.75
mgの径1.8μｍのタングステン製微粒子に沈着させ、製
造者の指示（DuPont）に従い、PDS1000ヘリウム銃を用
いてその混合物の６分の１を細胞内に射撃導入した。24
時間後、細胞を収集し、1.5mlのスクリューキャップ式
微小遠心管に移し、以下の手順のすべてを通じて４℃に
維持した。試料を0.mlのGUS溶解製緩衝液によりホモジ
ェナイズし（Rao and Flynn,1990、ただし界面活性剤を
全く用いない条件に改変した）、遠心処理により不要物
を沈降させた。ルシフェラーゼアッセイは、積算時間10
秒の設定で蛍光測定器（モデル2010;Analytical Lumine
scene,San Diego,CA）を用い、カリス（Callis）ら（19
87）の記載に従って実施した。タンパク質の濃度は、バ
イオラッド（BioRad）社製タンパク質アッセイキットを
用いて測定した。抽出物中のタンパク質は一般に抽出１
回当たり0.75〜1.5μｇであった。ルシフェラーゼの非
活性（１μ／μｇ）は、25μｌの抽出物のルシフェラー
ゼ光単位の測定によって算出し、抽出物１μｌ当たりの
該当するタンパク質濃度に基づいて数値を修正した。表
１に示したルシフェラーゼ活性は、各処置について３回
行った射撃導入の結果の平均を表示したものである。

小胞子特異的mRNAと相同な配列を含むTA39ゲノムクロー
ンの単離;TA39プロモーターこの実施例は、核酸プローブの利用が可能なすべての
小胞子特異的なmRNAと相同な配列を含むゲノムDNAクロ
ーンを単離する方法を提供する。ここで説明する手法
は、小胞子特異的な調節性配列を、その利用可能なプロ
ーブと相同である小胞子特異的なmRNAを有するすべての
植物種から単離するために有用である。

タバコの葯特異的なcDNAクローンであるTA39は、UCLA
のロバート・ゴールドバーグ（Robert Goldberg）博士
から入手した。TA39は、いくつかのタペータム特異的な
転写物に関して観察されるものと同様の時間的パターン
を示して、約組織からのmRNAとハイブリッドを形成する
（Kultunowら、1990）。インサイチュ（in situ）ハイ
ブリダイゼーションにより、TA39が−１から＋１までの
ステージ中は小胞子および結合組織において低いレベル
で存在するが、ステージ１から６まではタペータムにお
いてレベルが上昇することが示された（Goldbergら、19
93）。

選択された植物のゲノムライブラリー、例えば、Mbo
Iで部分的に分解し、プラスミドEMBL−３にクローニン
グされた、N.tabacum,var.NK326（Clontech Laboratori
es,Inc.,Palo Alto,California）に由来するDNA断片の
市販ライブラリーは、cDNAクローンTA39に対する相同性
を持つクローンに関してスクリーニングされている。サ
ムブルック（Sambrook）ら（1989）に記載されている方
法のような、標準的なハイブリダイゼーション法が用い
られた。候補のクローンには、一貫したハイブリダイズ
性のプラークが精製されるか、または存在しないことが
示されるまで、プラークの採取、再平板培養、およびTA
39cDNA挿入物による再プローブ化から成る精製のための
サイクルを３回またはそれ以上施した。

TA39cDNAクローンに関するタバコのゲノムのDNAクロ
ーンは、２種類の異なるファミリーが同定されており、
それぞれのファミリーの中に２つの一部重複するクロー
ンが得られている。それぞれのファミリーの一つのクロ
ーンを特徴分析のために選択し、それらを8B3クローン
および14B1クローンと命名した。これらのゲノムクロー
ンのそれぞれにおけるTA39と相同な領域は、この相同な
領域の上流または下流に隣接する領域と併せて、制限酵
素切断分析およびDNAハイブリダイゼーションによりマ
ッピングされた。

これらのコード配列および関連する5'側の推定上の調
節性領域をサブクローンとして単離し、続いて塩基配列
の決定のためにさらにサグクローニングした。このよう
にして、ストラタジーン（Stratagene）社より入手した
exo IIIおよびリョクトウヌクレアーゼを用いることに
より、それぞれのゲノムクローンの欠失体の入れ子状セ
ットを作製した。アイオワ州立大学の核酸研究施設にお
いて、入れ子状欠失体の塩基配列を、自動DNAシーケン
サー（Applied Biosystems 373A）を用い、サンガー（S
anger）のジデオキシ・チェーンターミネーション法に
より決定した。TA39のcDNA挿入物についても、比較のた
めに塩基配列を決定した。小胞子特異的なmRNAのTA39 c
DNAと相同な領域において、ゲノムクローン8B3は完全に
TA39と相同であり、一方、ゲノムクローン14B1の相当す
る部分では、TA39との相同性は約90％であった。

ゲノムクローン14B1および8B3の転写のための開始点
を、推定状の翻訳開始部位の83塩基上流に位置する単一
ヌクレオチドに対するプライマー伸長実験によりマッピ
ングした。それぞれのクローンにおいて、マップされた
転写開始点の31塩基対上流に完全なTATAボックスが見い
だされ、両方のクローンとも、転写開始点の下流に110
個のアミノ酸から成る主要なオープンリーディングフレ
ームがそのまま存在していた（すなわち、転写開始部位
から相対的にみて「＋83」と呼ばれる位置）。また、両
方のクローンとも14B1および8B3のクローンの翻訳終止
コドンのそれぞれ29塩基対および37塩基対下流の位置に
ポリアデニル化認識部位を有していた。

形質転換の方法双子葉植物に対する形質転換の方法に
は、直接DNAを到達させるための、多くの異なる既知の
方法が含まれる。好ましい方法は、葉移植片に対する微
粒子銃による微粒子の射撃導入である。その他の方法に
は、移植片に対するアグロバクテリウム・デリバリー
法、アグロバクテリウムとプロトブラストとの共培養、
電気穿孔、プロトブラストへのPEG取り込みもしくはそ
の他の直接的DNAデリバリーまたは類似の方法、などが
含まれる。トウモロコシなどの単子葉植物について好ま
しい方法は、射撃導入による処置を受けた細胞にDNAを
直接到達させることであるが、電気穿孔などのその他の
方法も用いることができる。

植物の細胞は、本発明の外来性のDNA配列により、従
来の方式において形質転換される。形質転換された植物
がアグロバクテリウムの感染に感受性を持つ場合は、無
力化したT₁プラスミドであり、外来性のDNA配列を含む
ベクターを用いることが好ましい。形質転換は、例えば
欧州特許第0 116 718号および欧州特許第0 270 822号な
どに記載されている手順を用いて実施することができ
る。好ましくは、T₁プラスミドベクターは、境界配列の
間、または少なくとも正しい境界配列の上流の位置に外
来DNA配列を含む。植物細胞を形質転換させるために、
直接遺伝子導入（例えば、欧州特許第0 237 356号、PCT
国際公開85/01856号、および欧州特許第0 275 069号を
参照）、例えば米国特許第4,684,611号に記載されてい
るインビトロ（in vitro）でのプロトプラストの形質転
換、例えば欧州特許第0 067 553号および米国特許第440
7,956に記載されている植物ウイルスを介する形質転
換、および米国特許第4,536,475に記載されているリポ
ソームを介する形質転換などの手順により、その他の種
類のベクターを用いることもできる。

形質転換される植物がトウモロコシである場合は、ト
ウモロコシのいくつかの系統に関してフロム（Fromm）
ら（1990）およびゴードン−カム（Gordon−Kamm）（19
90）により記載されたものなどの、最近開発された形質
転換の方法が用いられる。

形質転換される植物がイネである場合は、イネのいく
つかの系統に関してシマモト（Shimamoto）ら（199
0）、ダッタ（Datta）ら（1990）、クリストウ（Christ
ou）ら（1991）およびリー（Lee）ら（1991）などによ
り記載されたものなどの、最近開発された形質転換の方
法が適している。

形質転換される植物がコムギである場合は、トウモロ
コシおよびイネに関する前記の内容と類似した方法を用
いることができる。好ましくは、単子葉植物、特にイ
ネ、トウモロコシまたはコムギなどの穀類の形質転換の
ためには、微粒子銃による形質転換または電気穿孔など
の直接的なDNA導入の方法が用いられる。このような直
接的な導入の方法が用いられる場合は、本質的には本発
明のDNA配列、QMトウモロコシ遺伝子および関連する調
節領域のみが植物のゲノムに組み込まれるように、形質
転換のためのDNAを最小にすることが好ましい。これに
関して、本発明のDNA配列が構築され、細菌の宿主生物
体におけるプラスミドにおいて複製される場合は、その
DNA配列を用いて植物を形質転換する前に、細菌の宿主
生物体における増殖に必要とされる、複製起点、宿主生
物体の選択のための抗生物質耐性遺伝子などのようなプ
ラスミド配列を、外来性DNA配列を含むプラスミドの部
分から分離しておくことが好ましい。

デュポン（DuPont）社製ヘリウム銃のためのタングステ
ン/DNA法の手順（微粒子銃による微粒子射撃導入による
形質転換）径1.8μｍのタングステン微粒子60mgを測りとり、15ml
の遠心管に入れる。

2mlの0.1M HNO₃を添加し、20分間氷上にて超音波処理す
る。

HNO₃を取り除く。1mlの滅菌脱イオン水を添加し、試料
を2mlのサーステッド（Sarstedt）管に移す。軽く超音
波処理する。

遠心処理し、粒子をペレット状にする。

H₂Oを取り除く。1mlの100％EtOHを添加し、軽く超音波
処理する。

遠心処理し、粒子をペレット状にする。

EtOHを取り除く。1mlの滅菌脱イオン水を添加する。

超音波処理する。

250μｌの懸濁液をピペットで４本の2ml試験管に移す。

各試験管に750μｌの滅管脱イオン水を添加する。

使用するまでの間はタングステン試料を凍結しておく。

50μｌのタングステン/H₂O懸濁液をピペットで1.5ml試
験管に移す（最初に超音波処理する）。

10μｇのDNAを添加し、混合する。

50μｌの2.5M CaCl₂を添加し、混合する。

20μｌの0.1Mスペルミジンを添加し、混合する。

軽く超音波処理する。10000RPMで10秒間遠心処理する。

上清を除く。250μｌの100％EtOHを添加し、軽く超音波
処理する。

10000RPMで10秒間遠心処理する。

上清を除く。60μｌの100％EtOHを添加する。

トウモロコシの形質転換破砕しやすい胚形成性のタイプIIカルス（Armstrong,
1991）を、B73を用いて授粉したA188株から単離した１
−2mmの接合子胚から育成し、レジスター（Register）
ら（1994）に記載されている方法で維持した。形質転換
を行う前の４−６カ月は、カルスを２週間毎に継代培養
した。形質転換に際して、カルスを液体培地中に懸濁化
し、孔径710μｍのフィルターメッシュを用いて濾過
し、40mg/mlの密度に再懸濁した。200mgのカルス細胞を
グラスファイバー製のフィルター上に均等に広げ、金の
代わりに1.0μｍのタングステン粒子を用いる条件以外
は、レジスターら（1994）らの記載に従って微粒子の射
撃導入を実施した。形質転換体の選択および植物の再分
化はレジスターらの記載に従って実施したが、すべての
適した培地において、バイアロフォスの濃度は3mg/lに
上げた。

安定なトランスジェニック植物を回収するための、トウ
モロコシの形質転換の手順第１日細胞を液体培地中に置いた後、濾過する（710
μｍ）。100−200mgの細胞を収集して径5.5cmのグラス
ファイバー製フィルター上に、径3.5cmの広さに広げ
る。細胞を培地に移し、一晩インキュベートする。

第８日フィルターおよび細胞を培地から取り出し、水
分を除いた後に射撃導入を実施する。フィルターおよび
細胞を培地に戻す。

第５日フィルター上の細胞を選択培地（3mgのバイア
ロフォスを含む）に移す。

第12日フィルター上の細胞を新しい選択培地に移す。

第19日細胞をフィルターからはがし取り、8.6％の低
融点シーアガロースを含む5mlの選択培地中に分散させ
る。細胞および培地を、20mlのゲルライト（gel−rit
e）凝固培地を含む２枚の100mm×15mmのプレート上に広
げる。

第40日形質転換体と考えられるものをプレートから採
取する。

第61日新たなコロニーの有無に関してプレートを検査
する。

配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：（Ａ）名称:PIONEER HI−BRED INTERNATIONAL,INC. （Ｂ）街路名:700 CAPITAL SQUARE,400 LOCUST STR
EET （Ｃ）市名:DES MOINES （Ｄ）州名:IOWA （Ｅ）国名:UNITED STATES OF AMERICA （Ｆ）郵便番号:50309 （ii）発明の名称：トランスジェニック植物における
雄性不稔のための可逆的核遺伝システム（iii）配列数:23 （iv）文書通信情報：（Ａ）宛名:Foley ＆ Lardner （Ｂ）街路名:3000 K Street,N,W.,Suite 500 （Ｃ）州名:D.C. （Ｅ）国名:USA （Ｆ）郵便番号:20007−5109 （ｖ）コンピューター読み取りフォーム：（Ａ）メディア形式:Floppy disk （Ｂ）コンピューター:IBM PC comptible （Ｃ）運転システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Vers
ion ＃1.30 （vi）現出願データ：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（vii）親出願データ：（Ａ）出願番号:US 08/351,899 （Ｂ）出願日:08−DEC−1994 （viii）弁護士／代理人情報：（Ａ）氏名:BENT,Stephen A. （Ｂ）登録番号:29,768 （Ｃ）参照／明細書番号:33229/377/PIHI （ix）電気通信情報：（Ａ）電話：（202）672−5300 （Ｂ）ファックス：（202）672−5399 （Ｃ）テレックス:904136 （２）配列番号:1の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:1490塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:1: （２）配列番号:2の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:18塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:2: （２）配列番号:3の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:18塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:3: （２）配列番号:4の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:20塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:4: （２）配列番号:5の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:20塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:5: （２）配列番号:6の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:15塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:6: （２）配列番号:7の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:19塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:7: （２）配列番号:8の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:13塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:8: （２）配列番号:9の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:18塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:9: （２）配列番号:10の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:17塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:10: （２）配列番号:11の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:16塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:11: （２）配列番号:12の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:17塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:12: （２）配列番号:13の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:19塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:13: （２）配列番号:14の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:20塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列の記載：配列番号:14: （２）配列番号:15の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:33塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ix）配列の特徴：（Ａ）特徴を表す記号:misc_feature （Ｂ）存在位置:group（21..22,26..27,31..32）（Ｄ）他の情報:/note＝“N represents I" （xi）配列の記載：配列番号:15: （２）配列番号:16の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:23塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ix）配列の記載：配列番号:16: （２）配列番号:17の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:14塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ix）配列の記載：配列番号:17: （２）配列番号:18の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:32塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ix）配列の記載：配列番号:18: （２）配列番号:19の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:28塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ix）配列の記載：配列番号:19: （２）配列番号:20の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:33塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ix）配列の記載：配列番号:20: （２）配列番号:21の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:84塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ix）配列の記載：配列番号:21: （２）配列番号:22の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:78塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（iv）アンチセンス:YES （ix）配列の記載：配列番号:22: （２）配列番号:23の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）配列の長さ:1485塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類:DNA（genomic）（ix）配列の記載：配列番号:23:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アルバートソンマークシー. アメリカ合衆国アイオワ州ウェストデモイン 60スストリート 1930 エス (56)参考文献特表平２−503988（ＪＰ，Ａ) 特表平７−507680（ＪＰ，Ａ) 特表平６−506595（ＪＰ，Ａ) 特表平９−510615（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開589841（ＥＰ，Ａ２) Ｕｒｉｒｌｉ−ＳｈｏｖａｌＳ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．153（１），ｐｐ．274− 280（1983) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A01H 1/00 A01H 5/00 C12N 15/00 ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】植物における可逆的な雄性不稔を達成する
ための方法であり、（ａ）（ｉ）植物において発現した時に花粉の形成また
は機能を抑制する遺伝子産物をコードするDNA配列と、（ii）該DNA配列の発現を制御するオペレーターと、（iii）花粉の形成または機能に不可欠な細胞に特異的
であり、かつ遺伝子産物をコードするDNA配列と機能的
に連結しているプロモーターとを含む第１の組換えDNA
分子による遺伝的な形質転換が可能である花粉産生性の
植物ゲノムへの導入、（ｂ）該DNA配列の発現の結果として雄性不稔が実現さ
れる条件下における花粉産生性の植物の育成、ならびに（ｃ）雄性捻性である雑種植物を作成するため、DNA結
合タンパク質をコードするDNA配列、および該DNA結合タ
ンパク質が雄性不稔植物の組換えDNAのオペレーターと
結合することができるDNA配列の発現を制御するプロモ
ーターを含む第２の組換えDNA配列分子がゲノムに組み
込まれた雄性捻性の系統に由来する花粉と該雄性不稔の
植物との交雑、を含む方法。
【請求項２】第１の組換え分子の遺伝子産物がサイトト
キシンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】第１の組換え分子のプロモーターが葯特異
的なプロモーターである、請求項１記載の方法。
【請求項４】オペレーターがlexAオペレーターである、
請求項１記載の方法。
【請求項５】第１の組換え分子または第２の組換えDNA
分子がさらに選択マーカー遺伝子を含む、請求項１記載
の方法。
【請求項６】DNA結合タンパク質がlexAタンパク質であ
る、請求項１記載の方法。
【請求項７】第２の組換えDNA分子のプロモーターが花
粉の形成または機能に不可欠な細胞に特異的なプロモー
ターである、請求項１記載の方法。
【請求項８】第２の組換えDNA分子のプロモーターが葯
特異的なプロモーターである、請求項７記載の方法。
【請求項９】第２の組換えDNA分子のプロモーターが誘
導性のプロモーターである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】第２の組換えDNA分子のプロモーターが
構成的プロモーターである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】構成的プロモーターがトウモロコシ・ユ
ビキチンプロモーターである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】プロモーターが図１の第1488ヌクレオチ
ドにある開始コドンから相対的にみて上流に少なくとも
503塩基にわたるヌクレオチド配列を含む、請求項３記
載の方法。
【請求項１３】プロモーターが図１の第1488ヌクレオチ
ドにある開始コドンから相対的にみて上流に−503位か
ら−１位までのヌクレオチド配列を含む、請求項３記載
の方法。
【請求項１４】プロモーターが図１の第1488ヌクレオチ
ドにある開始コドンから相対的にみて上流に−587位か
ら−１位までのヌクレオチド配列を含む、請求項３記載
の方法。
【請求項１５】プロモーターが図１の第1488ヌクレオチ
ドにある開始コドンから相対的にみて上流に−890位か
ら−１位までのヌクレオチド配列を含む、請求項３記載
の方法。
【請求項１６】プロモーターが図１の第1488ヌクレオチ
ドにある開始コドンから相対的にみて上流に−503位か
ら−134位までのヌクレオチド配列を含む、請求項３記
載の方法。
【請求項１７】プロモーターが図１の第1488ヌクレオチ
ドにある開始コドンから相対的にみて上流に少なくとも
503塩基にわたるヌクレオチド配列を含む、請求項８記
載の方法。
【請求項１８】プロモーターが図１の第1488ヌクレオチ
ドにある開始コドンから相対的にみて上流に−503位か
ら−１位までのヌクレオチド配列を含む、請求項８記載
の方法。
【請求項１９】プロモーターが図１の第1488ヌクレオチ
ドにある開始コドンから相対的にみて上流に−587位か
ら−１位までのヌクレオチド配列を含む、請求項８記載
の方法。
【請求項２０】プロモーターが図１の第1488ヌクレオチ
ドにある開始コドンから相対的にみて上流に−890位か
ら−１位までのヌクレオチド配列を含む、請求項８記載
の方法。
【請求項２１】プロモーターが図１の第1488ヌクレオチ
ドにある開始コドンから相対的にみて上流に−503位か
ら−134位までのヌクレオチド配列を含む、請求項８記
載の方法。
【請求項２２】サイトトキシンがDAMメチラーゼであ
る、請求項２記載の方法。
【請求項２３】請求項１記載の方法により、第一の組換
え分子を含む雄性不稔性系統と第二の組換え分子を含む
雄性稔性系統とを交雑して得られる植物。
【請求項２４】第一の組換えDNA分子が、オペレータに
結合して花粉の形成または機能を抑制する遺伝子産物を
コードするDNA配列の転写を活性化する転写活性化因子
をコードする遺伝子をさらに含む、請求項１記載の方
法。
【請求項２５】転写活性化因子をコードする遺伝子が、
花粉の形成または機能に決定的な働きをする細胞または
組織におけるDNAの転写を作動する、図１記載の塩基配
列またはその変異配列や派生配列に機能的に連結してい
る、請求項24記載の方法。
【請求項２６】転写活性化因子が融合タンパク質であ
る、請求項24記載の方法。
【請求項２７】融合タンパク質が、lexAとClとが融合し
たタンパク質である、請求項26記載の方法。