CN1309704A - 在花药和花粉中表达的启动子序列 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于在植物中表达的表达盒,其使异源基因在花药和/或花粉中特异表达。此表达盒包括水稻CatA基因启动子,该启动子具有SEQ ID NO:1所示序列,或具有包括SEQ ID NO:1所示序列一部分并与SEQ ID NO:1所示序列具有相同启动子活性的序列,所述表达盒还包括插入异源基因的位点,从而使异源基因可表达地连于启动子。本发明还提供了一种含有异源基因的重组质粒,以及用此重组质粒将异源基因导入植物的方法。

Description

在花药和花粉中表达的启动子序列

技术领域

本发明涉及利用植物基因的启动子育种实用植物，本发明尤其涉及通过利用水稻的过氧化氢酶基因A(后文指作CatA)的启动子序列育种实用植物。

背景技术

已知通过品种间杂交产生的F1杂种(第一子代)可以呈现比其亲代优良的性质，并通常作为育种作物的方法而令人感兴趣。对作物如自身受粉水稻，已研究出产生花粉无能育性的雄性不育系的方法以作为利用该性能所需的技术之一。通常地，从植物遗传资源库中寻求雄性不育系，或通过诱变选择雄性不育系。但不易于将这种基因导入实用品种中，且应用受限。

近年来，作为利用生物技术的方法，已推荐一种方法，其中在花药和/或花粉中诱导表达的启动子与具有抑制这种器官形成功能的基因连接(例如，编码核酸酶，蛋白酶，葡聚糖酶等的基因)，并被导入植物中，从而抑制能育花粉的形成(例如Mariani等，自然347:741(1990))。或者，这样的方法被认为是有前途的，该方法涉及利用在花药和/或花粉中诱导表达的启动子，在这种器官形成时期，转录被表达的基因的反义RNA，或导入分解这种mRNA的核酶。

已知一些种类的在花药和/或花粉中诱导表达的基因的启动子，如番茄，拟南芥，玉米等的基因启动子(例如Twell等，植物生理学，91:1270-1274(1989)；Paul等，植物分子生物学19:611-622(1992)；Guerrero等，Mol.Gen.Genet.224:161～168(1990))。但是存在一个问题即其活性太低，不能实际应用。另外，为人工控制花药和/或花粉的形成，如果分离并鉴定在这些器官的任何发育阶段中均起作用的启动子是非常有益的，并可产生含有高活性启动子的表达盒。

因此，如果可从水稻基因中获得花药和/或花粉的高活性的启动子并可实际应用，对实用植物包括作物如水稻的育种是十分有益的。

发明描述

本发明涉及通过遗传工程技术育种植物，并且目的在于提供在植物中表达的表达盒，及含有在花药和/或花粉中具有高活性的植物基因启动子的重组质粒，以及利用其的方法。

本发明人发现水稻的过氧化氢酶A(CatA)基因在花药和花粉中呈现高启动子活性，并基于此信息完成本发明。

本发明提供了在植物中表达的表达盒，其使异源基因在花药和/或花粉中特异表达。此表达盒包括水稻CatA基因启动子，该启动子具有SEQ ID NO:1所示序列，或具有包括SEQ ID NO:1的一部分且具有与SEQ ID NO:1所示序列相同启动子活性的序列，此表达盒还含有插入异源基因的位点，由此异源基因可表达地连于启动子。本文中示作SEQ ID NO:1的序列是一种包括水稻CatA结构基因5’上游区和第一内含子的序列。

本发明还提供了一种重组质粒，以使异源基因在花药和/或花粉中特异表达。此重组质粒含有具有SEQ ID NO:1所示序列，或具有包括SEQ ID NO:1序列的一部分且具有与SEQ ID NO:1所示序列相同启动子活性的序列的水稻CatA基因启动子，及与启动子可表达地连接的异源基因。

另外，本发明提供了一种将希望在花药和/或花粉中特异表达的异源基因导入植物的方法，此方法包括用上述重组质粒转化植物细胞，及使转化的植物细胞再分化以获得植物体。

上述异源基因可以是具有抑制花药和/或花粉形成的功能的基因。通过在上述方法中应用这种基因，可以产生雄性不育植物。在上述方法中，植物细胞可以是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞。

附图的简要描述

图1是质粒CatA-GUS-△0的制备方案图式。

图2是各种启动子的活性对比图。

图3是示出花药GUS组织的染色结果照片。

图4是示出花粉GUS组织的染色结果照片。

实施本发明的最佳模式

下面对本发明进行进一步阐述：

分离水稻CatA基因启动子

分离水稻过氧化氢酶A(CatA)基因的方法，及包括本发明启动子区的基因组CatA基因的碱基序列，已由本发明人在1992年在日本生物科学，生物技术及农业化学学会的日本生物科学，生物技术及农业化学杂志66(3),488(1992)上发表，及由Higo等在植物分子生物学30:505-521(1996)上发表。但是，CatA基因表达在花药及花粉中是否存在，及对任何转化的水稻的分析还未公布。

水稻CatA基因启动子可筛选自水稻的基因组文库。可使用商购自美国CLONTECH实验室公司Palo Alto,CA的水稻基因组DNA文库(水稻基因组文库)。

筛选探针可使用已由本发明人分离的水稻CatA cDNA。分离水稻CatA cDNA的方法及其碱基序列已由本发明人公布(Mori等，植物分子生物学18:973-976(1992))。

首先，通过将λ噬菌体转染进大肠杆菌以使噬斑生成而制备水稻基因组基因文库。之后将噬斑移至如硝基纤维素的膜上，然后用标记的探针杂交筛选。在杂交完成之后，将膜冲洗并进行放射自显影。从被证实已杂交的噬菌体中制备DNA。

制备的噬菌体DNA通过适当的组合限制性内切酶进行酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切物。分离的DNA片段移至尼龙膜上，并用上述探针杂交筛选，并在信号强度及带型不同的基础上筛选。

可以推测提供最强信号的克隆含有CatA基因，而提供较弱信号的克隆含有类似于而非CatA的基因。基于带型对比，可确定其中其基因的一部分已缺失的克隆。另外，通过产生基于带型的克隆物理图谱，其中结构基因的5’上游区为大约1.5kbp长的克隆可被鉴别，该5’上游区被推测为构成启动子。

因此，可分离完整CatA基因组基因。

通过对比CatA基因组基因的碱基序列与CatA cDNA的碱基序列，可鉴别启动子区。在基因组基因具有内含子的情况中，启动子序列不仅包括结构基因的5’上游区，还包括如第一内含子的区域。

基于GUS活性测定鉴别启动子活性区

一旦鉴别出CatA基因的启动子区，可切下其序列并连接于表达载体以在植物中表达。为评价连接的启动子活性，可制备一种质粒，其中报道基因如编码适当酶的基因连接于启动子的下游。此质粒被导入植物细胞中，并通过测定酶活性观测基因表达。在植物被用作宿主的情况中，通过使用如pBI221的质粒，依于β-葡糖醛酸酶(GUS)的表达作为指标进行测定。在本申请书中，基于GUS表达的测定方法是可以使用的。

GUS活性可基本依于Jefferson等的方法(EMBO J 6:3901～3907(1987))测定。具体地，加入等于50μg蛋白质的原生质体提取物，25μl 20mM的4-甲基umbelliferryl葡糖醛苷(4MUG)，提取缓冲液，及100μl甲醇以抑制植物组织中固有的任何类GUS活性(Kosugi等，植物科学70:133-140(1990))，并在将总体积调节至500μl之后，在37℃进行保温培养。2小时之后，从反应溶液中收集200μl，向其中加入0.8ml 0.2M Na₂CO₃以中止反应。用荧光分光光度计，通过使用365nm激发光测定455nm荧光。酶活性以4-MU pmol/分/mg蛋白质表示。

使用如下质粒测定启动子活性，从而可鉴别为此活性等所需的部分，此质粒中GUS基因与CatA基因的启动子区的各种缺失突变体融合，如CatA基因启动子区已从5’上游侧缺失各种长度。鉴别这种活性部分的技术本领域技术人员已知。因此，本发明例如包括通过除去CatA基因启动子区非所需的序列而获得的具有与CatA基因启动子相同活性的那些序列。

一旦鉴别出CatA基因启动子区及其活性部分，其序列可进一步修饰以增强其启动子活性或改变其与表达组织相关的特异性。例如，本发明包括一种序列，其通过部分修饰CatA基因启动子区或其活性区而获得，并仍具有修饰前相同活性。

具有SEQ ID NO:1所示序列的启动子区在花药和/花粉中特异表达其活性。因此，在本申请说明书中，“相同”启动子活性意为活性水平至少与相关启动子区的活性水平类似，活性的特异性也至少与相关启动子区的活性特异性相似。应指出术语“相同”不排除活性水平及特异性明显高于相关启动子区的活性水平及特异性的情况。例如，“具有与SEQ ID NO:1所示序列相同启动子活性”意为当GUS基因在本申请说明书后面的实施例中所述条件类似的条件下表达时，GUS活性大约是SEQ ID NO:1所示序列的GUS活性的50％或更高，优选大约70％或更高，更优选大约90％或更高，且此活性在花药和/或花粉中特异表达。

在本申请说明书中，在花药和/或花粉中“特异”表达意为相应基因产物至少在花药或花粉中以高于在相同植物体的至少一种其它组织或器官中表达量表达。这意味着例如在花药和花粉中表达的基因产物量高于相同植物体任何部分的叶片中的量。所述的表达特异性可通过在类似于本申请说明书后文的实施例中所述的那些条件下，产生转化的植物加以评价。

构建表达盒及重组质粒以及它们的使用

包括CatA基因启动子区或其已被确认为有活性的活性部分的序列，可掺入适当的表达载体中以在植物中表达。在已掺入表达载体以在植物中表达的该序列的3’末端，导入适当的接头序列(例如具有多克隆位点的接头)，从而可产生适于植物宿主的表达盒。由此，在本申请说明书中“插入异源基因的位点”指包括在接头或功能类似于接头的序列中的位点。此表达盒可包括其它所需的调节因子，例如，可包括终止子序列以改良表达效果等。终止子序列通过上述具有多克隆位点的接头序列可与启动子序列结合。

待表达的异源基因可表达地连于上述表达盒内的启动子的3’下游(例如在多克隆位点)以在植物中表达，从而产生重组质粒。在本申请说明书中“异源基因”指除CatA基因之外水稻或其它植物任何内源基因，或相对于植物的任何外源基因，由此其基因产物的表达在花药和/或花粉中是所需的。

通过应用这样产生的重组质粒，可转化植物细胞。转化植物细胞可通过本领域已知的任何方法进行，例如用农杆菌的方法，或原生质体电穿孔法。例如通过Kyozuka等在Mol.Gen.Genet.206:408-413(1987)中所述方法可进行植物细胞原生质体的制备。

转化的植物细胞经一般方法可再分化，以提供转化的植物组织及最后的植物体。在用于转化的重组质粒的制备中，CatA基因启动子可掺入例如在细菌宿主和植物宿主中均能表达的二元载体中。本领域技术人员熟知这样二元载体。例如，通过使用包括农杆菌表达系统的pBI系统载体，利用植物相关的微生物感染系统是可能的。通过应用适当的重组质粒，相应的异源基因可导入任何可转化的植物中，包括单子叶植物，例如水稻，及双子叶植物，例如烟草。

如上所述，CatA基因启动子可诱导在花药和/或花粉中特异表达。由此，应用具有抑制花药和/或花粉形成功能的基因作为异源基因，可能产生雄性不育植物。在本申请说明书中，“具有抑制花药和/或花粉形成功能的基因”包括其基因产物能抑制能育花粉形成的基因(例如编码核酸酶，蛋白酶，葡聚糖酶等的基因)，和通过其自身呈现抑制花药和/或花粉形成功能的基因(例如在花药和/或花粉形成时表达的内源基因的反义RNA，及可分解这种内源基因的核酶)。本领域技术人员已熟知选择雄性不育植物的技术及用这种选择育种植物的技术。

上述转化植物的制备还可用于赋予植物除雄性不育性之外其它性状。例如，应用编码毒蛋白的异源基因，可控制在花粉上生存的有害昆虫。或者，应用编码可变为营养素的蛋白质的异源基因，可增强谷物的营养价值。利用在花药和/或花粉中特异基因表达制备任何实用植物都包括在本发明内。

本发明提供了在花药和/或花粉中高活性的水稻基因实用启动子的应用。由此，利用本发明不仅可育种水稻还可育种各种其它植物。

实施例

下面将阐述相关实施例。但本发明并非限于实施例。

实施例1、分离水稻CatA基因组基因：自基因组文库筛选

CatA cDNA的一部分(Mori等，(1992；前述))用于克隆CatA基因组基因。通过PCR扩增含有非全长cDNA(在3’侧1.35kbp，缺失全长1.8kbp的包括5’未翻译区和一些编码区的0.45kbp)的λ噬菌体的插入部分(克隆号No.51)，非全长cDNA在CatA cDNA克隆加工期间获得。从此噬菌体制备DNA并用作模板。使用λgtll-正向引物和λgtll-反向引物(Toyobo)作引物。产物用Centricon-100(Amicon)纯化，并调节至浓度为25ng/10μl，以用作Multiprime标记法(Amersham)的探针。

从商购自美国CLONTECH Laboratories Inc.,Palo Alto,CA的水稻基因组DNA文库(水稻基因组文库)中筛选CatA基因。经一般方法将包括此基因组文库的噬菌体λEMBL-3转染进大肠杆菌NM538菌株中，以使噬菌体噬斑形成。将噬菌体噬斑移至尼龙膜上，并在如下标准条件下使之与上述探针杂交，探针用32p标记。

杂交液：6×SSC-0.1％SDS,5×Denhardt’s,100μg/ml鲑精DNA；杂交温度：65℃；杂交时间：过夜。

接着，在以下条件下冲洗此膜。冲洗条件：2×SSC-0.1％SDS，室温，5分钟加30分钟；1×SSC-0.1％SDS,68℃,1小时。

冲洗之后，将尼龙膜经一般方法进行放射自显影，从而检测已与探针杂交的克隆，从确认已杂交的噬菌体中分别制备DNA。

上述噬菌体的DNA用二或三种限制性内切酶如SalⅠ和ScaⅠ酶切，并通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切物。分离的DNA片段移至尼龙膜上，并使之与上述用作探针的CatA基因杂交。杂交条件如上，并在以下条件下冲洗此膜。冲洗条件：2×SSC-0.1％SDS,65℃,30分钟。

冲洗之后，经一般方法将尼龙膜进行放射自显影，从而检测已与探针杂交的DNA片段。

存在一组基本相同信号强度及带型的克隆，从而推测其具有相同结构，还存在带型仅部分相同的克隆。

具有基本相同信号强度和带型的克隆被认为相应于CatA基因。缺失一部分带型的克隆被认为是CatA基因部分缺失的克隆。具有微弱信号的克隆被认为是与CatA基因具有相似结构的其它过氧化氢酶(异构酶)的基因。

通过Southern分析，部分碱基序列分析，基于CatA cDNA碱基序列的PCR分析等，可获得克隆λEM 74/81，其中含有相应于CatAcDNA的基因以及其5’上游大约1.5kbp的序列(其被推测为启动子区)。

通过HindⅢ和EcoRⅠ酶切切下克隆λEM 74/81的插入部分，并插入测序载体pBluescriptⅡ KS+或SK+(Stratagene,CA)。制备一些包括逐渐缺失自5’侧或3’侧的质粒，并测定其碱基序列。测定一4670bp的序列，其全部序列如SEQ ID NO:2所示。

基因组CatA基因的碱基序列已由本发明人公布(日本生物科学，生物技术及农业化学学会杂志(1992；前述)；及由Higo等(1996，前述)公布。如图1所示的从HindⅢ限制位点至EcoRⅠ限制位点的4670bp的序列已在DDBJ中登记，DDBJ为国际DNA碱基序列数据库(登记号No.D29966)。一4676bp的序列，其额外包括前端HindⅢ识别序列和后端EcoRⅠ识别序列，已由Higo等(1996，前述)公布。

实施例2、制备具有CatA基因启动子的重组质粒

得自以上实施例1中的CatA基因长度为4670bp。发现第一个外显子位于SEQ ID NO:2的1560位至1605位；第二个外显子位于SEQID NO:2的1894至2694位；第三个外显子位于SEQ ID NO:2的2781至3380位；第四个外显子位于SEQ ID NO:2的3730至4117位；且第一至第三个内含子存在于这些外显子之间。

基于此序列信息，可切下推测是启动子的区域。

图1示出含有水稻CatA基因启动子的质粒CatA-GUS-△0的制备。

克隆λEM 74/81用Eco52Ⅰ酶切并平端化，然后用HindⅢ酶切，并进行琼脂糖电泳以回收大约1.9 kbp的片段。获得具有克隆λEM74/81内插入序列的1～1901位序列的片段。此片段含有第一个外显子的上游序列，第一个内含子，及第二个外显子的一部分。此片段的5’末端是HindⅢ位点，3’末端是平端。

pBI 221，一种用于在植物细胞中表达的表达载体(CLONTECHLaboratories Inc.,Palo Alto,CA)，其包括花椰莱花叶病毒(CaMV)35S启动子，β-葡糖醛酸酶(GUS)编码区，和胭脂氨酸合酶终止子(NOS-T)。此pBI 221用HindⅢ和SmaⅠ酶切，并回收较大片段。此较大片段是pBI 221的片段，其中CaMV的35S启动子区已缺失。此片段与具有克隆λEM 74/81内上述插入序列的1～1901位序列的片段连接，从而产生CatA-GUS-△0。此方法已由本发明人与CatA基因的碱基序列一起公布(Higo等，(1996，前述))。

实施例3、转化水稻培养的细胞原生质体及表达GUS基因

实施例2中所得质粒导入水稻培养的细胞(Oc细胞)的原生质体中，以Higo等所述方式(1996，前述)进行。作为对照，使用pBI 221。

根据Higo等所述方式(1996；前述)从水稻培养的细胞(Oc细胞)中制备原生质体，通过电穿孔转化原生质体，及用原生质体提取物测定GUS基因表达。

结果示于图2，由此结果得出CatA基因启动子的活性比对照组即CaMV 35S启动子活性高大约1.5倍。

实施例4、制备转化的水稻(T0代)。

通过使用CatA-GUS-△0质粒，其已在实施例3中被证实在水稻培养的细胞(Oc细胞)中具有高活性，以如下方式转化水稻。

基本依据Akagi等的方法(Mol Gen Genet 215:501-506(1989))，从水稻植物中建立悬浮细胞(品种：Kinuhikari)。然后，从这些悬浮细胞中制备原生质体，质粒经电穿孔技术(基本依照Tada等，理论及应用遗传学80:475-480(1990))导入原生质体。原生质体再分化(基本依照Fujimura等，植物组织培养通信2:74-75(1985))。基于GUS染色选择之后，获得转化的水稻植物，详见下述。

1)从水稻子叶盘制备愈伤组织：

1.1)如下制备培养基：

①向MS基本培养基中加入2ppm 2,4-D,0.1％酪蛋白水解产物，和3％蔗糖，并将培养基调节至pH5.5。②向培养基中加入1％琼脂，并将培养基高压灭菌。③将培养基分液于清洁桌面内深φ9cm的培养皿中。

1.2)如下将种子灭菌：

①将Kinuhikari种子除去外壳，并取出褐色水稻谷粒。②将褐色水稻谷粒置于50ml烧杯中，并沉浸70％乙醇中30秒。③在自来水中将褐色水稻谷粒冲洗3次。④褐色水稻谷粒在5％次氯酸钠(加入几滴Tween 20)灭菌20分钟。⑤褐色水稻谷粒在无菌水中冲洗3次。⑥用镊子将褐色水稻谷粒置于琼脂培养基上(9个谷粒/φ9cm培养皿)。⑦褐色水稻谷粒，在大约300lux,26℃培养大约一个月。

2)建立悬浮液

2.1)如下制备培养基：

①向含有R2无机盐和维生素B5的基本培养基中加入1ppm 2,4-D,3％蔗糖和0.3％酪蛋白水解产物，并将培养基调节为pH5.5。②将20ml的培养物分液于100ml培养烧瓶中并高压灭菌。

2.2)如下建立悬浮液：

①将衍生自成熟种子子叶盘的易碎的愈伤组织移入液体培养基中。②将含有愈伤组织的烧瓶在26℃在微弱光线下以80rpm旋转。③在转移后第三天，用新鲜培养基置换培养基。④持续培养4天。⑤用愈伤组织培养物移液管分散愈伤组织，并只移出实际的愈伤组织部分。⑥每周将愈伤组织移至新鲜培养基上。

3)将基因导进原生质体

3.1)如下制备酶溶液：

①将4g Cellulase onozuka RS,lg Macerozyme R-10,0.5gCaCl₂·2H₂O，和7.28g甘露醇置入100ml烧杯中并混合。向混合物中加入水，并用搅拌器搅拌混合物以有效溶解。②将混合物调节为pH5.5，并补加至100ml。③将混合物置于37℃20分钟后，将混合物以12000rpm离心15分钟。④将10ml上清分液于每个离心管中，用Parafilm密封，冷冻保存。⑤将上清于热水浴中溶解，并进行过滤灭菌。

3.2)如下分离原生质体：

①使用培养4天的悬浮细胞。②使用愈伤组织培养物移液管，只将悬浮细胞(大约10g)移至具有10ml酶溶液的100ml烧瓶中。③将烧瓶在27℃在温育器中放置5小时。

3.3)如下纯化原生质体：

1)将烧瓶轻度旋转以使在瓶底的细胞浮起。2)将浮起的细胞迅速倾倒至155μm筛上。3)将筛轻轻上下振荡至酶溶液完全通过。4)滤过的酶溶液直接倾倒在77μm筛上。5)将筛轻轻支起以使酶溶液通过。6)滤过的酶溶液再倾倒于31μm筛上。7)将筛轻轻支起以使酶溶液通过。8)将酶溶液从烧杯中转移入离心管中。9)以600rpm离心1分钟。11)将上清用一次性移液管移至新的离心管中。12)将0.4M葡萄糖沿管壁倾注入离心管中，原生质体是悬浮的。13)以900rpm离心3分钟，弃去上清。14)将AA缓冲液沿离心管壁倾注入管中，原生质体被悬浮。15)以900rpm离心3分钟，弃去上清。16)沿管壁倾注入少量AA缓冲液。17)用血细胞计计数原生质体。18)测定原生质体悬浮液的液体量。19)用AA缓冲液将原生质体密度调节为1×10⁷个细胞/ml，其中AA缓冲液如下：35mM天冬氨酸钾，5mM葡糖酸钙，5mM天冬氨酸镁，5mM MES,0.4M甘露糖醇，pH5.8(不需调节)。

3.4)如下导入基因：

①用70％乙醇将电穿孔室灭菌。②将已溶于TE中的质粒(1μg/μl)加入原生质体悬浮液中。加入的质粒的终浓度如下：50μg/ml HPT2(hygro)；及100μg/ml CatA-GUS-△0。用于潮霉素选择的质粒HPT结构已被报道(Tada等，Theor Appl Genet 80:475-480(1990))。③将试管置于冰上20分钟。④将原生质体移进室内。⑤将电容器内已带电荷的电放电。放电条件是：880μF,475v/cm；时间大约持续30毫秒。⑥将原生质体放置10秒或10秒以上之后，将其回收入离心管中。⑦将原生质体在室温下放置20分钟。

3.5)如下培养原生质体：

①以900rpm将原生质体离心3分钟，弃去上清。②沿离心管壁注入c-med，原生质体被悬浮。用c-med将原生质体调节为1×10⁶个细胞/ml。在c-med培养的第三天从悬液中回收培养基，以12000rpm除去漂浮物。向40ml培养基中加入200μl 2,4-D(100ppm),400μl维生素B5和5.46g蔗糖，并调节至pH4.3。将培养基冷冻保存。在即将使用之前将培养基解冻，并进行过滤灭菌。③将750ml培养物分液于每个包被平皿中(Falcon#3002)。④用Conradi涂棒将培养物涂布于整个平皿上。⑤用Parafilm将平皿密封。⑥将平皿置于Tupperware中。为防止培养物干燥，Tupperware中还有含水烧杯或类似物。⑦在27℃黑暗中保温培养物。

4)转化的植物的再生

4.1)如下选择及生长转化的细胞：

①在培养的第14天，加入600μl GⅠ培养基，GⅠ培养基通过向R2培养基中加入2ppm 2,4-D和0.4M葡萄糖而得，并调节其至pH4.9。②为选择潮霉素抗性愈伤组织，向GⅠ培养基中加入50μg/ml潮霉素。③加入GⅠ培养基二周后，将已生长的愈伤组织移至GⅡ琼脂培养基上。GⅡ琼脂培养基通过向R2培养基中加入2ppm 2,4-D,3％蔗糖，并调节至pH4.9之后向培养基中加入1％琼脂并高压灭菌而得。10ml培养基被分液于每个9cm×10mm培养皿中。

4.2)如下再生转化的植物：

①含有N6无机盐，维生素B5,3％蔗糖，1ppm NAA,4ppm细胞分裂素，3％山梨糖醇和0.03％酪蛋白水解产物的培养基调节至pH5.8，加入1.5％琼脂并高压灭菌培养基。②将培养基分液于清洁桌面上深φ90mm×20mm塑料培养皿中(40～50ml/皿)。③将已生长至直径大约为3mm的愈伤组织移至琼脂培养基上。④每个平皿上放置大约20个愈伤组织。⑤在连续300lux光下在27℃培养愈伤组织，在大约4周内植物再生。⑥在分化培养基上已分化的植物中，苗已生长至大约3cm长的那些植物连同其根移至Magenta型容器中。每个箱中移入9个苗。培养基通过在1/2MS培养基中加入1％蔗糖并调节至pH5.8而得。在加入0.15％Gelrite和加热熔化培养基后，将50ml Gelrite分液至每个Magenta型容器中并高压灭菌。⑦将有根的苗尖在连续10000 lux光下在27℃培养。⑧在大约一周内，苗端完全达到盖。在一些情况中，培养基中可不包含二价阳离子，如此培养可变为液态的。

前述方式中获得的再分化个体(T0代水稻)移至罐中。在生长的个体中，选择那些其中GUS已表达的个体，通过其叶的GUS组织染色而测定。

如下进行GUS染色以选择转化的植物：①制备一种含1mM X-Gluc,50mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)和10％Me-OH的染色液。②将得自①的500μl染色液分液于每个2ml微管中。③将再生植物的剪切叶片置于微管中。④微管在37℃保温24小时。⑤用70％Et-OH除去叶绿素。⑥选择已经GUS染色的水稻植物。

这样，选择15个T0代水稻植物个体，其中GUS在其叶片中表达，并收集其种子(T1代种子)。

实施例5、T1代水稻植物PCR选择

在上述实施例4中所得的15个植物品系中，10个品系的无壳的T1种子用1％抗形成素处理1小时，之后在自来水中浸泡2天，并在颗粒状泥土中(BONSORU No.1,Sumitomo Chemical)种植。用ISOPLANT(Nippon Gene)从秧苗的叶片中提取DNA。用提取的DNA作模板，使用引物F1813(5’-CATGGCTGGTTGATTCAGC-3’:CatA第一个内含子内的序列)和引物R2368(5’-CGTCGGTAATCACCATTCC-3’:GUS基因编码区内的一序列)，进行PCR，以检测导入的DNA存在与否。用AmpliTaq Gold(PerkinElmer)-DNA聚合酶进行PCR。反应条件如下：在94℃处理12分钟之后，进行35次循环，每次循环包括在94℃处理1分钟，在55℃处理2分钟，在72℃处理3分钟。

将反应液在1％琼脂糖中电泳，用溴化乙锭染色，并用紫外光照射，从而测定任何PCR产物的存在与否及规格。由此选择其中基因已被成功导入的T1代植物。

为证实导入的GUS基因是否表达，通过以下GUS组织染色法检测T1植物叶片的GUS活性。

作为观测水稻叶片GUS活性的GUS组织染色法，是根据“观测植物细胞的实验方法：从基因表达观测胞内结构与功能”；细胞技术学特别版本，植物细胞技术学系列62-3；在细胞水平检测GUS活性的方法(Misa TAKAHASHI,Hiromichi MORIKAWA)pp.71～79(由Hiroo FUKUDA,Mikio NISHIMURA,Kenzo NAKAMURA指导)加入部分修改而进行的一种方法。

步骤如下：①制备X-Gluc溶液(100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)1mMX-Gluc,0.3mM铁氰钾，0.3mM亚铁氰钾，0.2％Triton-X100)。②将500μl X-Gluc溶液分液于24孔滴定板的每个孔中。③将水稻植物的每个组织样本切片放入孔中，并在28℃处理16小时。④除去X-Gluc溶液，用70％乙醇脱色。⑤除去70％乙醇，将组织样本或切片沉浸在50％甘油溶液中。⑥用显微镜或立体显微镜观测。

根据GUS基因在叶片中的表达水平，将T1代植物分组。收集在叶片中高表达水平的植物的种子(T2代种子)。

实施例6、T2种子的播种，转化体的PCR选择及GUS组织染色

T2转化体的无壳的种子如上述处理并种植，从其秧苗叶片中以上述方式提取DNA，并进行PCR以测定导入的DNA序列存在与否。结果证实大约一半的检测T2植物是具有导入的GUS基因的转化体。

为证实导入的GUS基因是否表达，T2植物秧苗叶片的GUS活性以上述方式检测。在所有的其中GUS基因已经PCR证实存在的T2转化体中，在其叶片中观测到GUS活性。其中GUS基因在其叶片中表达被证实的植物继续生长，并在开花阶段收集其花药以检测花药及花粉中GUS活性。

结果示于图3和图4，对开花阶段收集的花药检测GUS活性表明其比叶片中GUS活性高。用显微镜对花药和花粉观测结果发现由于具有GUS活性，花药壁(图3)及花粉外膜的内层(图4)已被染成兰色。

工业实用性

根据本发明的CatA基因启动子在花药和花粉中具有非常高的活性。因此，本发明可通过对花药和/或花粉的遗传工程化用于植物例如水稻的育种。

                  序列表<110>农林水产省农业生物资源研究所所长代表的日本国<120>在花药和花粉中表达的启动子序列<130>AR010<140><141><160>2<170>Patentln Ver.2.0<210>1<211>1901<212>DNA<213>Dryza sativa<220><221>启动子<222>(1)..(1901)<400> 1tgtgcctatc acagcacacc tatcgttatc atcagcgtgg actaagaaca gaacaatttc 60tcatcttttg tttcctgaga agtttagacc accaagatat atgctgatga tgctgtagat 120agctagctag ttttgcaatt acttatgggt tgcatcacaa tcagggtctg tttagttccc 180aaacaaaatt tttcacgctg ttacatagga tgtttggaca catgcataga gtactaaatg 240tagaaaaaaa acaattaaac atttcgcctt gaaattacga gacaaatctt ttaagcctaa 300ttgcgccatg atttgacaat ttggtgctac aataaatatt tgctaataat agattaatta 360ggcttaataa attcgtcttg cagtttccag acggaatctg taatttattt tatgagatac 420agctgcttcg atcttccatc acatattcag accgtaccta atctgaaagg ttagtaattt 480gaactgcgta gtaatgctac aaggtaaatc aatcatcatc atcttgaatt ggttcctctt 540atagcactag gtaaaaagac aagggtgcat tctggctggg ctgtgttcga taaaggagtt 600tgactgagct agttagtggc atgaaaaccg gaacaggtga atagtacatg ataaactcag 660tattacctat tataaacttg aaaactaaat ttatttaaaa ttttaaagac tagcaaagta 720acgtgctctg caacggacgg attttaaaag atttatgtga atttcttgat ttagaaattg 780tatttgtcaa acataattgc aatcaaacat ccaatagaaa accaaaccac acacaaagat 840gtatttatgt agcattagaa gatctcacca actctaaatg atggtagatt caccatcacc 900attaaattct tttatatagt ataaaaagat tttgtacgaa acacactgtt tatagcttac 960agtttgagaa acgtgtatgt ttatgataaa cgaagggtgt agctgagcca tagctagcta 1020gcacaaagag cacctcgttc ttacagaata attaagcagc ctgaaattaa tctgagaaac 1080aagaaagaaa atgcagagac gttagctgca actgcaatca tgtcaaactt tggccgaccg 1140atcaagagaa aggggatgag ctaagctatc gatggcagca attcggcgcc gttgaaatca 1200atcgaagaga tatgatccga tgatctgatc tgatctgacg atggacatgc agtgatggca 1260cgcagctagt gagcactgat gaagtgatga cactccatgc atccaatcca ggcaatgcat 1320gtatttcctt tccacacgag gggggcccac atccacctca ccttatcctc gtccagttcc 1380tgtgggaccc aaccatgcag tatggccacc cgggcccacc agtcagtgtg tggcaccggt 1440ctccggtaag ctcaccgggg aggtcagtgc tcctcaccac ctcccgctat ataaccttta 1500ggcaggctgt ctcaccgagc aagctggaga gctagcagaa acaaacccct ctcactccca 1560gatacctgct gctgccacta gcccactacc atggatcctt gcaaggtcag tcactcagtg 1620actagtgaga ctaaatctac ttaatcttgt agttaataat tgaggtttca tttagctagt 1680tgtgtagatt caagagagag cttaacttct tatagaatat ttggtcgatt atcagaaact 1740tcctgaaata acctagatta tcgactagat tctacgaata tttctttttt agtctcaagc 1800tcttcaaaca tgcatggctg gttgattcag ctagtcgatc attaagtata taattaatta 1860attaattaat agtaatacgt gctacccatg cagttccggc c                     1901<210> 2<211> 4670<212> DNA<213> Oryza sativa<400> 2tgtgcccacc acagcacacc tatcgttatc atcagcgtgg actaagaaca gaacaatttc 60tcatcttttg tttcctgaga agtttagacc accaagatat atgctgatga tgctgtagat 120agctagctag ttttgcaatt acttatgggt tgcatcacaa tcagggtctg tttagttccc 180aaacaaaatt tttcacgctg ttacatagga tgtttggaca catgcataga gtactaaatg 240tagaaaaaaa acaattaaac atttcgcctt gaaattacga gacaaatctt ttaagcctaa 300ttgcgccatg atttgacaat ttggtgctac aataaatatt tgctaataat agattaatta 360ggcttaataa attcgtcttg cagtttccag acggaatctg taatttattt tatgagatac 420agctgcttcg atcttccatc acatattcag accgtaccta atctgaaagg ttagtaattt 480gaactgcgta gtaatgctac aaggtaaatc aatcatcatc atcttgaatt ggttcctctt 540atagcactag gtaaaaagac aagggtgcat tctggctggg ctgtgttcga taaaggagtt 600tgactgagct agttagtggc atgaaaaccg gaacaggtga atagtacatg ataaactcag 660tattacctat tataaacttg aaaactaaat ttatttaaaa ttttaaagac tagcaaagta 720acgtgctctg caacggacgg attttaaaag atttatgtga atttcttgat ttagaaattg 780tatttgtcaa acataattgc aatcaaacat ccaatagaaa accaaaccac acacaaagat 840gtatttatgt agcattagaa gatctcacca actctaaatg atggtagatt caccatcacc 900attaaattct tttatatagt ataaaaagat tttgtacgaa acacactgtt tatagcttac 960agtttgagaa acgtgtatgt ttatgataaa cgaagggtgt agctgagcca tagctagcta 1020gcacaaagag cacctcgttc ttacagaata attaagcagc ctgaaattaa tctgagaaac 1080aagaaagaaa atgcagagac gttagctgca actgcaatca tgtcaaactt tggccgaccg 1140atcaagagaa aggggatgag ctaagctatc gatggcagca attcggcgcc gttgaaatca 1200atcgaagaga tatgatccga tgatctgatc tgatctgacg atggacatgc agtgatggca 1260cgcagctagt gagcactgat gaagtgatga cactccatgc atccaatcca ggcaatgcat 1320gtatttcctt tccacacgag gggggcccac atccacctca ccttatcctc gtccagttcc 1380tgtgggaccc aaccatgcag tatggccacc cgggcccacc agtcagtgtg tggcaccggt 1440ctccggtaag ctcaccgggg aggtcagtgc tcctcaccac ctcccgctat ataaccttta 1500ggcaggctgt ctcaccgagc aagctggaga gctagcagaa acaaacccct ctcactccca 1560gatacctgct gctgccacta gcccactacc atggatcctt gcaaggtcag tcactcagtg 1620actagtgaga ctaaatctac ttaatcttgt agttaataat tgaggtttca tttagctagt 1680tgtgtagatt caagagagag cttaacttct tatagaatat ttggtcgatt atcagaaact 1740tcctgaaata acctagatta tcgactagat tctacgaata tttctttttt agtctcaagc 1800tcttcaaaca tgcatggctg gttgattcag ctagtcgatc attaagtata taattaatta 1860attaattaat agtaatacgt gctacccatg cagttccggc cgtcgagctc gttcgacacg 1920aagacgacga cgacgaacgc gggagctccg gtgtggaacg acaacgaggc gctgacagtg 1980gggcccaggg ggccgatcct cctcgaggac taccacctga tcgagaaggt ggcgcacttc 2040gcccgggagc gcatcccgga gcgcgtggtc cacgcccgcg gcgcctccgc caagggcttc 2100ttcgagtgca cccacgacgt caccgacatc acctgcgccg acttcctccg gtccccgggc 2160gcccagaccc ccgtcatcgt ccgcttctcc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Claims (7)

1、一种用于在植物中表达的表达盒，其使异源基因在花药和/或花粉中特异表达，所述表达盒包括：

具有SEQ ID NO:1所示序列，或具有包括SEQ ID NO:1所示序列一部分并与SEQ ID NO:1所示序列具有相同启动子活性的序列的水稻CatA基因启动子；和

插入异源基因的位点，从而使异源基因可表达地连于启动子。

2、一种重组质粒，其使异源基因在花药和/或花粉中特异表达，所述重组质粒包括：

具有SEQ ID NO:1所示序列，或具有包括SEQ ID NO:1所示序列的一部分并与SEQ ID NO:1所示序列具有相同启动子活性的序列的水稻CatA基因启动子；和

可表达地连于启动子的异源基因。

3、如权利要求2的重组质粒，其中异源基因具有抑制花药和/或花粉形成的功能。

4、一种将希望在花药和/或花粉中特异表达的异源基因导入植物的方法，该方法包括以下步骤：

用权利要求2的重组质粒转化植物细胞；及

再分化转化的植物细胞以获得植物体。

5、如权利要求4的方法，其中异源基因具有抑制花药和/或花粉形成的功能。

6、如权利要求4或5的方法，其中植物细胞是单子叶植物细胞。

7、如权利要求4或5的方法，其中植物细胞是双子叶植物细胞。

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