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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Züchtung einer nützlichen
Pflanze unter Ausnutzung eines Promoters eines Pflanzengens. Genauer bezieht
sich die vorliegende Erfindung auf die Züchtung einer nützlichen
Pflanze durch Nutzung eines Promotergens von Catalasegen A (auf
das hiernach Bezug genommen wird als „CatA") aus Reis.
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Wissenschaftlicher
Hintergrund
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Es
ist bekannt, dass eine F1-Hybride (erste Tochtergeneration), welche
durch Kreuzen zwischen den Kulturformen geschaffen wird, Eigenschaften zeigen
kann, die jenen ihrer Eltern überlegen
sind, und dies hat gewöhnlich
als ein Verfahren zum Züchten
von Feldfrüchten
viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Wie für Feldfrüchte, wie zum Beispiel Reis, welcher
Selbstbestäubung
erfährt,
wurden Verfahren zum Schaffen männlicher
steriler Linien, deren Pollen keine Fertilität haben, als eine der für die Nutzung dieser
Eigenschaft notwendigen Techniken studiert. Üblicherweise wurde eine genetische
Pflanzenquelle für
männliche
sterile Linien durchsucht oder männliche
sterile Linien wurden selektiert durch das Induzieren von Mutagenese.
Es ist jedoch nicht einfach, solche Gene in praktische Kulturformen
einzuführen und
die Anwendungen sind beschränkt.
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Kürzlich wurde
als ein Verfahren, das Biotechnologie nutzt, ein Verfahren vorgeschlagen,
in welchem ein Promoter, der Expression in Antheren und/oder Pollen
induziert, mit einem Gen ligiert wird, das eine Funktion des Inhibierens
der Bildung solcher Organe hat (z.B. ein Gen, das für Nuklease,
Protease, Glucanase etc. kodiert), und in eine Pflanze eingeführt wird,
wodurch die Bildung von fertilem Pollen inhibiert wird (zum Beispiel
Mariani et al., Nature 347: 737–741,
1990). Alternativ werden Verfahren als vielversprechend angesehen,
welche das Transkribieren einer Gegensinn-RNA eines Gens, das zum Zeitpunkt
der Bildung solcher Organe zu exprimieren ist, oder das Einführen eines
Ribozyms, welches solche mRNAs abbaut, durch Nutzen eines Promoters, welcher
Expression in Antheren und/oder Pollen induziert, involvieren.
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Etliche
Promoterarten von Genen, welche Expression in Antheren und/oder
Pollen induzieren, sind für
Tomaten, Arabidopsis thaliana, Mais und Ähnliche bekannt (zum Beispiel
Twell et al., Plant Physiol. 91: 1270–1274, 1989; Paul et al., Plant
Molecular Biology 19: 611–622,
1992; Guerrero et al., Mol. Gen. Genet. 224: 161–168, 1990). Es gibt jedoch
ein Problem dahingehend, dass ihre Aktivität zu niedrig ist, um sie in
praktische Verwendung zu bringen. Ferner wäre es sehr nützlich,
um künstlich
die Bildung von Antheren und/oder Pollen zu kontrollieren, falls
ein Promoter, welcher in jedem der Entwicklungsstadien dieser Organe
funktioniert, isoliert und charakterisiert worden wäre, und
eine Kassette, die einen hoch aktiven Promoter enthält, geschaffen
werden könnte.
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Demgemäß würde es signifikant
zu dem Züchten
von nützlichen
Pflanzen, einschließlich
Feldfrüchten
wie Reis, beitragen, falls ein Promoter für Antheren und/oder Pollen,
welcher hoch aktiv ist und praktische Verwendung erlaubt, aus Reisgenen
gewonnen werden könnte.
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Offenbarung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Züchten einer Pflanze durch Techniken
der Gentechnik und hat ein Ziel des Bereitstellens einer Expressionskassette
für die
Expression in Pflanzen und eines rekombinanten Plasmides, welches
einen Pflanzengenpromoter mit einer hohen Aktivität in Antheren
und/oder Pollen enthält,
ebenso wie ein Verfahren zum Nutzen derselben.
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Die
Erfinder fanden, dass das Catalase-A-(CatA-)Gen aus Reis eine hohe
Promoteraktivität
in Antheren und Pollen zeigt und bewerkstelligten die vorliegende
Erfindung, basierend auf dieser Information.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Exprimieren eines
heterologen Gens in Antheren und/oder Pollen einer Pflanze in einer
Menge, die höher
ist als in einem anderen Gewebe oder Organ derselben Pflanze, bereit,
umfassend die folgenden Schritte: Bereitstellen einer Expressionskassette,
umfassend einen Reis-CatA-Genpromoter mit einer wie in Sequenz ID
Nr. 2 gezeigten Sequenz, oder mit einer Sequenz, welche einen Teil
davon einschließt
und welche eine Promoteraktivität
hat, die äquivalent
ist mit jener der Sequenz, wie sie in Sequenz ID Nr. 1 gezeigt ist,
und eine Stelle für
das Inserieren eines heterologen Gens, so dass das heterologe Gen
exprimierbar an den Promoter gekoppelt ist; Inserieren des heterologen
Gens in die Insertionsstelle, um ein rekombinantes Plasmid zu bilden; Transformieren
einer Pflanzenzelle mit dem zuvor genannten rekombinanten Plasmid
und Redifferenzieren der transformierten Pflanzenzelle, um einen Pflanzenkörper zu
gewinnen.
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Hierin
ist die wie in Sequenz ID Nr. 1 gezeigte Sequenz eine Sequenz, einschließend die 5'-stromaufwärts liegende
Region und das erste Intron des Reis-CatA-Strukturgens.
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Das
zuvor genannte heterologe Gen kann ein Gen sein, welches eine Funktion
des Inhibierens der Bildung von Antheren und/oder Pollen hat. Durch die
Verwendung solch eines Gens bei dem zuvor genannten Verfahren kann
eine männliche
sterile Pflanze geschaffen werden. Bei dem zuvor genannten Verfahren
kann die Pflanzenzelle entweder eine monocotyledone Zelle oder eine
dicotyledone Zelle sein.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
ein schematisches Diagramm, das die Zubereitung des Plasmids CatA-GUS-Δ0 erläutert.
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2 ist
ein Diagramm, in welchem die Aktivitäten zahlreicher Promotoren
verglichen werden.
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3 ist
eine Fotographie, die ein GUS-Gewebefärbungsergebnis für eine Anthere
zeigt.
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4 ist
eine Fotographie, die ein GUS-Gewebefärbungsergebnis für Pollen
zeigt.
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Beste Weisen
zum Durchführen
der Erfindung
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Hiernach
wird die vorliegende Erfindung detaillierter beschrieben werden.
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Isolation
des Reis-CatA-Genpromoters
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Verfahren
zum Isolieren des Catalase-A-(CatA-)Gens aus Reis und der Basensequenz des
genomischen CatA-Gens, einschließlich der Promoterregion, gemäß der vorliegenden
Erfindung, wurden veröffentlicht
durch die Erfinder in dem Bericht des Treffens der JAPAN SOCIETY
FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY AND AGROCHEMISTRY 1992: Journal of
JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND AGROCHEMISTRY 66
(3), 488 (1992), und in Higo et al., Plant Molecular Biology 30:
505–521
(1996). Die Anwesenheit oder Abwesenheit von CatA-Genexpression
in Antheren und Pollen und die Analyse jeglichen transformierten
Reis wurde jedoch nicht veröffentlicht.
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Reis-CatA-Genpromoter
kann aus einer genomischen Bibliothek von Reis gescreent werden. Eine
genomische DNA-Bibliothek von Reis (Rice Genomic Library), welche
im Handel erhältlich
ist von CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA in den USA, kann
verwendet werden.
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Als
eine Sonde für
das Screening kann Reis-CatA-cDNA, welche durch die Erfinder isoliert worden
ist, verwendet werden. Verfahren zum Isolieren von Reis-CatA-cDNA
und ihre Basensequenz wurden bereits veröffentlicht durch die Erfinder
(Mori et al., Plant Molecular Biology 18: 973–976 (1992)).
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Als
erstes wird eine durch die Verwendung des Phagen λ zubereitete
genomische Reis-Genbibliothek
in E. coli so transfiziert, dass es Plaques erlaubt wird, sich zu
bilden. Unter Befolgung eines üblichen
Verfahrens werden die Plaques auf eine Membran wie Nitrocellulose übertragen
und dann mit einer markierten Sonde für das Screening hybridisiert. Nachdem
die Hybridisierung abgeschlossen ist, wird die Membran gewaschen
und an Autoradiographie ausgesetzt. DNA wird aus den Phagen, von
welchen bestätigt
wird, dass sie hybridisiert haben, zubereitet.
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Die
zubereitete Phagen-DNA wird durch eine Kombination geeigneter Restriktionsenzyme
verdaut und die Verdauung wird durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt.
Die aufgetrennten DNA-Fragmente werden auf eine Nylonmembran übertragen und
es wird ihnen erlaubt, mit der zuvor genannten Sonde für das Screening
zu hybridisieren, und sie werden gescreent auf der Basis von Signalintensitäten und
Unterschieden in Bandenmustern.
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Es
ist wahrscheinlich, dass die Klone, welche das stärkste Signal
ergeben, das CatA-Gen enthalten, wohingegen Klone, welche ein schwächeres Signal
ergeben, Gene enthalten, welche ähnlich
sind, aber nicht CatA sind. Basierend auf dem Bandenmustervergleich
können
Klone, in welchen ein Teil ihrer Gene deletiert worden ist, unterschieden
werden. Ferner können
durch Schaffen einer physikalischen Karte der Klone, basierend auf
Bandenmustern, Klone in welchen die 5'-stromaufwärts gelegene Region ihres Strukturgens
ungefähr
1,5 Kbp lang ist – von denen
angenommen wird, dass sie einen Promoter ergeben – identifiziert
werden.
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Folglich
kann ein vollständiges
genomisches CatA-Gen isoliert werden.
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Durch
Vergleichen der Basensequenz des genomischen CatA-Gens mit der Basensequenz
von CatA-cDNA kann eine Promoterregion identifiziert werden. In
dem Fall, wo das genomische Gen Introns hat, kann die Promotersequenz
nicht nur die 5'-stromaufwärts liegende
Region des Strukturgens einschließen, sondern auch andere Regionen,
wie zum Beispiel das erste Intron.
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Identifikation von Teilen
mit Promoteraktivität,
basierend auf GUS-Aktivitätsmessung
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Wenn
die Promoterregion des CatA-Gens erst einmal identifiziert ist,
kann ihre Sequenz ausgeschnitten werden und für die Expression in Pflanzen mit
einem Expressionsvektor ligiert werden. Um die Aktivität des ligierten
Promoters zu beurteilen, kann ein Plasmid zubereitet werden, in
welchem ein Reportergen, wie zum Beispiel ein Gen, welches für ein geeignetes
Enzym kodiert, stromabwärts
jenes Promoters ligiert wird. Dieses Plasmid wird in eine Pflanzenzelle
eingeführt
und die Genexpression wird zum Beispiel durch Messen enzymatischer
Aktivitäten
beobachtet. In dem Fall, wo eine Pflanze als ein Wirt verwendet wird,
ist es alltäglich,
Messungen durch die Verwendung eines Plasmids wie pBI221 zu machen,
zum Beispiel beruhend auf der Expression von β-Glucuronidase (GUS) als ein
Index. In der vorliegenden Spezifikation ist ebenfalls ein Verfahren
für das
Durchführen
von Messungen basierend auf GUS-Expression anwendbar.
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GUS-Aktivität kann gemessen
werden, indem im Grunde dem Verfahren von Jefferson et al. (EMBO
J 6: 3901–3907
(1987)) gefolgt wird. Genauer werden ein Protoplastenextrakt, der äquivalent
ist zu einer Proteinmasse von 50 μg,
25 μl von
20 mM 4-Methylumbelliferrylglucuronid
(4MUG), ein Extraktionspuffer und 100 μl Methanol zum Unterdrücken jeglicher
in Pflanzengeweben innewohnender GUS-ähnlicher Aktivität (Kosugi
et al., Plant Science 70: 133–140
(1990)) hinzugefügt
und nachdem die Gesamtmenge auf 500 μl angepasst ist, wird eine Inkubation
bei 37°C
durchgeführt.
Zwei Stunden später werden
200 μl aus
der Reaktionslösung
gesammelt. Hierzu werden 0,8 ml 0,2 M Na2CO3 hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen.
Mit einem Fluorospektrophotometer wird die Fluoreszenz bei 455 nm
unter Verwendung eines Exzitationslichtes von 365 nm gemessen. Die
enzymatischen Aktivitäten
werden in Begriffen von 4-MU pmol/min/mg Protein angegeben.
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Plasmide,
in welchen das GUS-Gen fusioniert worden ist mit verschiedenen Deletionsmutanten
der Promoterregion des Cat-Gens, z.B. wobei die CatA-Genpromoterregion
auf verschiedene Längen von
der 5'-stromaufwärts gelegenen
Seite deletiert worden ist, werden verwendet, um ihre Promoteraktivitäten zu messen,
wodurch die für
diese Aktivität
erforderlichen Teile und Ähnliches
identifiziert werden können.
Techniken zum Identifizieren solcher aktiver Teile sind Fachleuten
bekannt. Deswegen umfasst die vorliegende Erfindung zum Beispiel
jene Sequenzen, welche durch das Entfernen von Sequenzen erhalten
werden, die für
die CatA-Genpromoterregion nicht erforderlich sind und welche eine
Aktivität
haben, die äquivalent
ist zu jener des CatA-Genpromoters.
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Wenn
die CatA-Genpromoterregion und ihre aktiven Teile erst einmal identifiziert
worden sind, können
ihre Sequenzen weiter modifiziert werden, um ihre Promoteraktivität zu steigern
oder um ihre Spezifität
in Bezug auf das exprimierte Gewebe zu ändern. Zum Beispiel umschließt die vorliegende
Erfindung eine Sequenz, welche durch teilweises Modifi zieren der
CatA-Genpromoterregion oder aktiven Teilen davon erhalten wird und
welche immer noch eine Aktivität
hat, die äquivalent
ist zu jener vor der Modifikation.
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Eine
Promoterregion mit der wie in Sequenz ID Nr. 1 gezeigten Sequenz
exprimiert ihre Aktivität
in Antheren und/oder Pollen in einer Menge, die höher ist
als in einem anderen Gewebe oder Organ derselben Pflanze. Deswegen
bedeutet in der vorliegenden Spezifikation eine „äquivalente" Promoteraktivität ein Maß an Aktivität, das wenigstens ähnlich ist
mit dem Maß an
Aktivität
einer Referenzpromoterregion, wo die Spezifität der Aktivität ebenfalls
wenigstens ähnlich
ist zu der Spezifität
der Aktivität
der Referenzpromoterregion. Es sollte bemerkt werden, dass von dem
Begriff „äquivalent" nicht beabsichtigt
ist, dass der Fall ausgeschlossen ist, wo das Niveau und die Spezifität der Aktivität signifikant
höher sind
als jene der Referenzpromoterregion. Zum Beispiel bedeutet „mit einer
Promoteraktivität, äquivalent
zu jener wie in Sequenz ID Nr. 1 gezeigten Sequenz", wenn das GUS-Gen
in Protoplasten unter ähnlichen
Bedingungen, wie jene, die in den folgenden Beispielen der vorliegenden
Spezifikation beschrieben sind, exprimiert wird, dass die GUS-Aktivität ungefähr 50% oder mehr,
vorzugsweise ungefähr
70% oder mehr und noch bevorzugter ungefähr 90% oder mehr der GUS-Aktivität für die wie
in Sequenz ID Nr. 1 gezeigte Sequenz ist und dass die Aktivität in wenigstens
entweder Antheren und/oder Pollen in einer Menge exprimiert wird,
die höher
ist als in einem anderen Gewebe oder Organ derselben Pflanze.
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In
der vorliegenden Erfindung bedeutet „spezifisch" in Antheren und/oder
Pollen exprimiert seiend, dass ein genetisches Produkt von Interesse
wenigstens entweder in Antheren oder Pollen exprimiert wird, in
einer Menge, die höher
ist als in wenigstens einer Art eines anderen Gewebes oder Organs
desselben Pflanzenkörpers.
Dies bedeutet zum Beispiel ein genetisches Produkt, das in Antheren
und Pollen in einer höheren
Menge als in einer Blattspreite in jedem Teil desselben Pflanzenkörpers exprimiert
wird. Die Spezifität
der Expression wie beschrieben kann beurteilt werden durch Produzieren
einer transformierten Pflanze unter Bedingungen, ähnlich wie
jene, die in dem folgenden Beispiel der vorliegenden Spezifikation
beschrieben sind.
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Konstruktion einer Expressionskassette
und eines rekombinanten Plasmids, ebenso wie Nutzung derselben
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Eine
Sequenz, die die CatA-Genpromoterregion oder aktive Teile davon,
von denen bestätigt worden
ist, dass sie aktiv sind, einschließt, kann in einen geeigneten
Expressionsvektor für
die Expression in Pflanzen eingebaut werden. Auf der Seite des 3'-Endes dieser Sequenz,
die in einen Expressionsvektor für
Expression in Pflanzen inkorporiert worden ist, wird eine geeignete
Linkersequenz (z.B. ein Linker mit multiplen Klonierstellen) eingeführt, wodurch eine
Expressionskassette, welche für
einen Pflanzenwirt geeignet ist, produziert werden kann. Demgemäß bedeutet
in der vorliegenden Spezifikation eine „Stelle zum Inserieren eines
heterologen Gens" eine
Stelle, welche innerhalb eines Linkers oder einer Sequenz, welche ähnlich wie
ein Linker funktioniert, inkludiert ist. Die Expressionskassette
kann andere Regulationselemente einschließen, wie beschrieben. Zum Beispiel
kann eine Terminatorsequenz eingeschlossen sein, um die Expressionseffizienz
oder Ähnliches
zu verbessern. Die Terminatorsequenz kann an die Promotersequenz über die
zuvor genannte Linkersequenz mit multiplen Klonierstellen gebunden
sein.
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Ein
heterologes Gen, von dem beabsichtigt ist, dass es exprimiert wird,
wird exprimierbar 3'-stromabwärts des
Promoters (z.B. an den multiplen Klonierstellen) innerhalb der zuvor
genannten Expressionskassette für
die Expression in Pflanzen gekoppelt, wodurch ein rekombinantes
Plasmid geschaffen worden ist. In der vorliegenden Spezifikation bedeutet
ein „heterologes
Gen" jedes Gen,
anders als das CatA-Gen, welches für Reis oder andere Pflanzen
endogen ist, oder jedes Gen, welches für die Pflanze fremd ist, solchermaßen, dass
die Expression ihres genetischen Produktes in Antheren und/oder
Pollen gewünscht
wird.
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Durch
Nutzen eines demzufolge geschaffenen rekombinanten Plasmids kann
eine Pflanzenzelle transformiert werden. Die Transformation der Pflanzenzelle
kann durchgeführt
werden durch allen Fachleuten bekannte Verfahren, z.B. ein Verfahren unter
Nutzen von Agrobakterien oder ein Elektroporationsverfahren für Protoplasten.
Zum Beispiel kann die Zubereitung von Protoplasten einer Pflanzenzelle durchgeführt werden,
indem den in Kyozuka et al., Mol. Gen. Genet. 206: 408–413 (1987)
beschriebenen Verfahren gefolgt wird.
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Der
transformierten Pflanzenzelle kann erlaubt werden, dass sie durch
gewöhnliche
Verfahren so redifferenziert, um ein transformiertes Pflanzengewebe
und schließlich
einen Pflanzenkörper
zu ergeben. Bei der Zubereitung eines für die Transformation zu verwendenden
rekombinanten Plasmids kann der CatA-Genpromoter in einen binären Vektor
inkorporiert werden, welcher in der Lage ist, sowohl in einem bakteriellen
Wirt als auch einem Pflanzenwirt, zum Beispiel, exprimiert zu werden.
Solche binären
Vektoren sind Fachleuten wohl bekannt. Zum Beispiel ist es durch
die Verwendung eines Vektors eines pBI-Systems, einschließlich Agrobakterium-Expressionssysteme,
möglich,
das Infektionssystem von Mikroorganismen hinsichtlich Pflanzen zu
verwenden. Durch Ausnutzung eines geeigneten rekombinanten Plasmides
kann das heterologe Gen von Interesse in jede transformierbare Pflanze
eingeführt
werden, einschließlich
monocotyledonen, z.B. Reis, und dicotyledonen, z.B. Tabak.
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Wie
oben beschrieben kann der CatA-Genpromoter spezifische Expression
in Antheren und/oder Pollen induzieren. Demgemäß ist es durch Nutzung eines
Gens, welches eine Funktion des Inhibierens der Bildung von Antheren
und/oder Pollen hat, als das heterologe Gen möglich, eine männliche sterile
Pflanze zu erzeugen. In der vorliegenden Spezifikation schließt „ein Gen,
welches eine Funktion des Inhibierens der Bildung von Antheren und/oder Pollen
hat" ein Gen ein,
dessen Genprodukt in der Lage ist, die Bildung von fertilen Pollen
zu inhibieren (z.B. Gene, die für
Nuklease, Protease, Glucanase, etc. kodieren), und ein Gen, welches
selbst eine Funktion des Inhibierens der Bildung von Antheren und/oder
Pollen hat (z.B. Gegensinn-RNA eines endogenen Gens, welches zum
Zeitpunkt der Bildung von Antheren und/oder Pollen exprimiert wird,
und Ribozyme, welche solche endogenen Gene abbauen können). Techniken
zum Selektieren von männlichen sterilen
Pflanzen und zum Züchten
von Pflanzen unter Verwendung solcher Selektion sind Fachleuten wohl
bekannt.
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Die
zuvor genannte Zubereitung von transformierten Pflanzen kann auch
genutzt werden, um Pflanzen andere Merkmale als männliche
Sterilität
zu verleihen. Zum Beispiel ist es möglich durch Ausnutzen eines
heterologen Gens, das für
ein toxisches Protein kodiert, Insektenschädlinge oder Ähnliches, welche
sich von Pollen ernähren,
zu kontrollieren. Alternativ ist es durch Ausnutzen eines heterologen Gens,
das für
ein Protein kodiert, welches ein Nährstoff werden kann, möglich, den
Nährwert
einer Feldfrucht zu steigern. Die Zubereitung jeglicher nützlicher
Pflanzen, welche spezifische genetische Expression in Antheren und/oder
Pollen nutzen, fällt
in die vorliegende Erfindung.
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines praktischen Promoters
aus einem Reisgen bereit, welcher hochaktiv in Antheren und/oder Pollen
ist. Demgemäß kann die
vorliegende Erfindung nicht nur für das Züchten von Reis sondern auch
für das
Züchten
von zahlreichen anderen Pflanzen verwendet werden.
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Beispiel
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Hiernach
wird die vorliegende Erfindung mit Bezug auf ein Beispiel beschrieben
werden. Der Schutzumfang der Erfindung ist jedoch nicht nur auf das
Beispiel beschränkt.
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1. Isolation eines genomischen
Reis-CatA-Gens: Screening aus einer genomischen Bibliothek
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Ein
Teil von CatA-cDNA (Mori et al., 1992 oben) wurde für das Klonieren
des genomischen CatA-Gens verwendet. Ein Insertteil eines λ-Phagen (Klon
Nr. 51, enthaltend eine cDNA, die nicht die volle Länge hat
(1,35 Kbp an der 3'-Seite,
wobei insgesamt ungefähr
0,45 Kbp fehlen, einschließlich
der 5'-untranslatierten
Region und etwas von der kodierenden Region, von den vollständigen 1,8
Kbp), welcher während
dem Kloniervorgang aus CatA-cDNA gewonnen worden ist, wurde durch
PCR amplifiziert. Aus diesem Phagen wurde DNA zubereitet und als eine
Matrize verwendet. Als Primer wurden λgt11-Forward Primer (λgt11-Vorwärtsprimer)
und λgt11-Reverse
Primer (λgt11-Umkehrprimer)
(Toyobo) verwendet. Das Produkt wurde mit Centricon-100 (Amicon)
aufgereinigt und wurde auf eine Konzentration von 25 ng/10 μl angepasst,
um als eine Sonde für ein
Multiprime-Markierverfahren
(Amersham) verwendet zu werden.
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Eine
genomische DNA-Bibliothek aus Reis (Rice Genomic Library), welche
kommerziell erhalten worden ist von CLONTECH Laboratories Inc.,
Palo Alto, CA in den USA, wurde für das CatA-Gen gescreent. Unter
Befolgung von üblichen
Verfahren wurde der Phage λEMBL-3,
umfassend diese genomische Bibliothek, in den E. coli-Stamm NM538 transfiziert
und Phagenplaques wurde es erlaubt, sich zu bilden. Die Phagenplaques
wurden auf eine Nylonmembran übertragen
und es wurde ihnen erlaubt, mit der zuvor genannten Son de unter
den Standardbedingungen wie folgt zu hybridisieren. Die Sonde wurde
mit 32P markiert.
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Hybridisierungslösung: 6 × SSC-0,1%
SDS, 5 × Denhardt's, 100 mg/ml Lachssperma-DNA; Hybridisierungstemperatur:
65°C; Hybridisierungszeit: über Nacht.
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Als
nächstes
wurde die Membran unter den folgenden Bedingungen gewaschen. Waschbedingungen:
2 × SSC-0,1%
SDS, Raumtemperatur, 5 Minuten + 30 Minuten; 1 × SSC-0,1% SDS; 68°C, 1 Stunde.
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Nach
dem Waschen wurde die Nylonmembran an Autoradiographie unter Befolgung
von üblichen
Verfahren ausgesetzt, wobei die Klone, welche mit der Sonde hybridisiert
hatten, detektiert wurden. Aus den Phagen, von welchen bestätigt wurde,
dass sie hybridisiert hatten, wurde DNA jeweils zubereitet.
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Die
DNA der zuvor genannten Phagen wurde mit einer Kombination aus zwei
oder drei Arten von Restriktionsenzymen wie SalI und ScaI verdaut
und die Verdauungen wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt.
Die aufgetrennten DNA-Fragmente wurden auf eine Nylonmembran übertragen und
es wurde ihnen erlaubt, mit dem zuvor genannten CatA-cDNA-Fragment,
das als eine Sonde verwendet wurde, zu hybridisieren. Die Hybridisierungsbedingungen
waren dieselben wie oben und die Membran wurde unter den folgenden
Bedingungen gewaschen. Waschbedingungen: 2 × SSC, Raumtemperatur, 5–10 Minuten,
zwei Mal, 2 × SSC-0,1% SDS,
65°C, 30
Minuten.
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Nach
dem Waschen wurde die Nylonmembran an Autoradiographie unter Befolgung
von gewöhnlichen
Verfahren ausgesetzt, wodurch das DNA-Fragment, welches mit der
Sonde hybridisiert hatte, detektiert wurde.
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Es
gab eine Gruppe aus Klonen, welche im Wesentlichen dieselbe Signalintensität und Bandenmuster
hatten, und von dem folglich vorausgesagt wurde, dass es dieselbe
Struktur hat, ebenso wie es Klone gab, deren Bandenmuster nur teilweise
identisch waren.
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Die
Klone, welche im Wesentlichen identische Signalintensitäten und
Bandenmuster hatten, werden als dem CatA-Gen entsprechend angesehen.
Die Klone, denen Teile der Bandenmuster fehlten, werden als Klone
angesehen, deren CatA-Gen zum Teil deletiert ist. Die Klone, welche
schwache Signale hatten, werden als Gene für andere Katalasen (Isozyme)
angesehen, welche ähnliche
Strukturen wie jene von CatA haben.
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Durch
eine detaillierte Southern-Analyse, eine Analyse auf Basenteilsequenzen,
eine PCR-Analyse,
basierend auf der CatA-cDNA-Basensequenz, etc., wurde ein Klon λEM74/81 gewonnen, in
welchem das CatA-cDNA entsprechende Gen, ebenso wie eine ungefähr 1,5 Kbp
umfassende Sequenz 5'-stromaufwärts dazu
(welche vermutlich die Promoterregion war), enthalten waren.
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Der
Insertteil des Klons λEM74/81
wurde durch HindIII- und EcoRI-Verdauung ausgeschnitten und in einen
Sequenziervektor inseriert, genannt pBluescript II KS+ oder SK+
(Stratagene, CA). Es wurden eine Reihe von Plasmiden, einschließlich schrittweisen
Deletionen von der 5'-Seite
oder der 3'-Seite
her, zubereitet und ihre Basensequenzen wurden bestimmt. Es wurde
eine 4.670 bp lange Sequenz bestimmt, wobei ihre volle Sequenz als
Sequenz ID Nr. 2 gezeigt wird.
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Die
Basensequenz des genomischen CatA-Gens wurde durch die Erfinder
veröffentlicht
(Journal of JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY
(1992, oben); und Higo et al. (1996; oben). Eine Sequenz mit 4,670
Basen von der HindIII-Restriktionsstelle bis zu der EcoRI-Restriktionsstelle,
wie in 1 gezeigt, wurde in DDBJ registriert, einer internationalen DNA-Basensequenzdatenbank
(Zugangsnummer D29966). Eine Sequenz aus 4.676 Basen, welche zusätzlich eine
vorausgehende HindIII-Erkennungssequenz und eine nachfolgende EcoRI-Erkennungssequenz
einschließt,
wurde veröffentlicht
in Higo et al. (1996; oben).
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2. Zubereitung eines rekombinanten
Plasmids, das den CatA-Genpromoter hat
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Das
in 1. oben gewonnene CatA-Gen war 4.670 bp lang. Es wurde herausgefunden,
dass das erste Exon an den Positionen 1.560 bis 1.605 der Sequenz
ID Nr. 2 existiert; das zweite Exon existiert an den Positionen
1.894 bis 2.694 der Sequenz ID Nr. 2; das dritte Exon existiert
an den Positionen 2.781 bis 3.380 der Sequenz ID Nr. 2; das vierte
Exon existiert an den Positionen 3.730 bis 4.117 der Sequenz ID
Nr. 2; und dass das erste bis dritte Intron zwischen diesen Exons
existiert.
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Basierend
auf dieser Sequenzinformation kann eine Region, von welcher vermutet
wird, dass sie der Promoter ist, ausgeschnitten werden.
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1 zeigt
die Zubereitung eines Plasmids CatA-GUS-Δ0, welches den Reis-CatA-Genpromoter enthält.
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Der
Klon λEM74/81
wurde mit Eco52I verdaut und die Enden wurden stumpf gemacht und
er wurde dann mit HindIII verdaut und an Agarosegelektrophorese
ausgesetzt, um ein ungefähr
1,9 Kbp großes
Fragment wiederzugewinnen. Ein Fragment mit der Sequenz von der
Position 1 bis zur Position 1.901 der Insertionssequenz innerhalb
des Klons λEM74/81
wurde erhalten. Dieses Fragment enthielt eine Sequenz stromaufwärts des
ersten Exons, des ersten Introns und eines Teils des zweitens Exons. Das
5'-Ende des Fragmentes
war die HindIII-Stelle und das 3'-Ende
war ein stumpfes Ende.
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pBI221,
ein Expressionsvektor für
Expression in Pflanzenzellen (CLONTECH Laboratories Inc., Palo Alto,
CA), schließt
den 35S-Promoter von Blumenkohlmosaikvirus (CaMV), die kodierende
Region von β-Glucuronidase
(GUS) und den Nopalinsynthaseterminator (NOS-T) ein. Dieser pBI221
wurde mit HindIII und SmaI verdaut und das größere Fragment wurde wiedergewonnen.
Dieses größere Fragment war
ein Fragment von pBI221, in welchem die 35S-Promoterregion von CaMV
deletiert worden war. Dieses Fragment wurde mit einem Fragment gekoppelt,
das die Sequenz von Position 1 bis Position 1.901 der zuvor genannten
Insertionssequenz innerhalb des Klons λEM74/81 hatte, wodurch CatA-GUS-Δ0 hergestellt
wurde. Dieses Verfahren wurde bereits durch die Erfinder zusammen
mit der Basensequenz des CatA-Gens publiziert (Higo et al. (1996;
oben)).
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3. Transformation
von kultivierten Zellprotoplasten aus Reis und Expression des GUS-Gens
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Das
in 2. oben gewonnenen Plasmid wurde in die Protoplasten von kultivierten
Reiszellen (Oc-Zellen) eingeführt,
in der in Higo et al. (1996; oben) beschriebenen Weise. Als eine
Kontrolle wurde pBI221 verwendet.
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Das
Verfahren für
die Zubereitung von Protoplasten aus kultivierten Reiszellen (Oc-Zellen), Transformation
von Protoplasten durch Elektroporation und Messung der GUS-Genexpression unter
Verwendung eines Protoplastenextraktes wurden unter Befolgung der
in Higo et al. (1996; oben) beschriebenen Weise durchgeführt.
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Die
Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Gemäß diesen
Ergebnissen zeigte der CatA-Genpromoter
eine Aktivität,
welche ungefähr
1,5-mal höher ist
als jene der Kontrolle, d.h. CaMV-35S-Promoter.
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4. Zubereitung von transformiertem
Reis (T0-Generation)
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Durch
die Verwendung von CatA-GUS-Δ0-Plasmid,
von welchem bestätigt
wurde, dass es eine hohe Aktivität
in den Protoplasten von kultivierten Reiszellen (Oc-Zellen) in 3.
oben hat, wurde Reis auf die folgende Weise transformiert.
-
Im
Wesentlichen unter Befolgung des Verfahrens von Akagi et al. (Mol.
Gen. Genet. 215: 501–506
(1989)) wurden Suspensionszellen aus einer Reispflanze (Kulturform:
Kinuhikari) etabliert. Dann wurden Protoplasten aus diesen Suspensionszellen
zubereitet. Das Plasmid wurde durch eine Elektroporationstechnik
(im Grunde gemäß Tada et al.,
Theor. Appl. Genet. 80: 475–480
(1990)) in die Protoplasten eingeführt. Die Protoplasten wurden
redifferenziert (im Grunde nach Fujimura et al., Plant Tissue Culture
Lett. 2: 74–75
(1985). Nach auf GUS-Färbung
basierter Selektion wurden transformierte Reispflanzen gewonnen.
Die Details sind unten beschrieben.
-
1) Kallusinduktion aus
Reisscutella
-
- 1.1) Ein Medium wurde wie folgt zubereitet:
(1)
Zu einem MS-Grundmedium wurden 2 ppm 2,4-D 0,1% Caseinhydrolysat
und 3% Saccharose hinzugefügt
und das Medium wurde auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt. (2)
1% Agar wurde zu dem Medium hinzugefügt und das Medium wurde autoklaviert.
(3) Das Medium wurde in tiefe Petrischalen mit 9 cm ∅ (ungefähr 40 ml/Schale)
in einer Sterilbank verteilt.
- 1.2) Samen wurden wie folgt sterilisiert:
(1) Kinuhikari-Samen
wurden entspelzt und die braunen Reiskörner wurden entnommen. (2)
Die braunen Reiskörner
wurden in ein 50 ml-Becherglas gegeben und in 70% Ethanol für 30 Sekunden
eingetaucht. (3) Die braunen Reiskörner wurden drei Mal in Leitungswasser
gespült.
(4) Die braunen Reiskörner
wurden in 5% Natriumhypochlorid (mit einigen Tropfen Tween 20 hinzugefügt) für 20 Minuten
sterilisiert. (5) Die braunen Reiskörner wurden drei Mal in sterilisiertem
Wasser gespült.
(6) Die braunen Reiskörner
wurden auf ein Agarmedium unter Verwendung von einer Pinzette gegeben
(9 Körner/∅ 9
cm in der Petrischale) gegeben. (7) Die braunen Reiskörner wurden
bei ungefähr
300 Lux, 26°C
für ungefähr 1 Monat
kultiviert.
-
2) Etablierung von Suspension
-
- 2.1. Ein Medium wurde wie folgt zubereitet:
(1)
Zu einem Grundmedium, einschließend R2-anorganische
Salze und B5-Vitamine
wurden 1 ppm 2,4-D, 3% Saccharose und 0,3% Caseinhydrolysat hinzugefügt und das
Medium wurde auf einen pH von 5,5 eingestellt. (2) 20 ml des Mediums
wurden in 100 ml Kulturkolben verteilt und in einem Autoklaven sterilisiert.
- 2.2) Eine Suspension wurde folgt etabliert:
(1) Aus dem
Scutellum eines reifen Samens gewonnene bröckelige Kalli wurden in ein
flüssiges Medium überführt. (2)
Der Kolben, der die Kalli enthielt, wurde bei 80 rpm bei 26°C unter Schwachlicht
rotiert. (3) Am dritten Tage nach der Überführung wurde das Medium mit
einem frischen ausgetauscht. (4) Die Kultur wurde für vier weitere
Tage fortgesetzt. (5) Unter Verwendung einer Kalluskulturpipette
wurden die Kalli vereinzelt und nur die tatsächlichen Kallusteile wurden überführt. (6)
Die Kalli wurden auf ein frisches Medium jede Woche überführt.
-
3) Einführung des
Gens in Protoplasten
-
- 3.1) Eine Enzymlösung wurde wie folgt zubereitet:
(1)
4 g Cellulase-Onozuka-RS, 1 g Macerozyme R-10, 0,5 g CaCl2·2H2O und 7,28 g Mannitol wurden in ein 100
ml-Becherglas gegeben und vermischt. Wasser wurde zu der Mischung
hinzugefügt
und die Mischung wurde mit einem Rührer gerührt, um Auflösung zu
bewirken. (2) Die Mischung wurde auf einen pH von 5,5 angepasst und
auf 100 ml aufgefüllt.
(3) Nachdem die Mischung bei 37°C
für 20
Minuten gelassen worden war, wurde die Mischung bei 12.000 rpm für 15 Minuten
zentrifugiert. (4) 10 ml des Überstands
wurden in jedes Zentrifugenröhrchen
verteilt, welches mit einem Parafilm verschlossen und eingefroren und
konserviert wurde. (5) Der Überstand
wurde in einem heißen
Wasserbad gelöst
und wurde an Filtrationssterilisation ausgesetzt.
- 3.2) Protoplasten wurden wie folgt isoliert:
(1) Am vierten
Tag der Kultur erhältliche
Suspensionszellen wurden verwendet. (2) Unter Verwendung einer Kalluskulturpipette
wurden nur die Suspensionszellen (ungefähr 10 g) in einen 100 ml-Kolben
mit 10 ml der Enzymlösung übertragen. (3)
Der Kolben wurde für
5 Stunden in einem Inkubator bei 27°C gelassen.
- 3.3) Die Protoplasten wurden wie folgt gereinigt:
(1) Der
Kolben wurde leicht rotiert, um es den Zellen am Boden zu erlauben,
zu flotieren. (2) Die flotierenden Zellen wurden schnell auf ein
155 μm-Sieb
dekantiert. (3) Das Sieb wurde leicht auf- und abgeschüttelt, um
darauf zu warten, dass die Enzymlösung vollständig hindurchgelaufen war. (4)
Die filtrierte Enzymlösung
wurde direkt aus dem Becherglas auf ein 77 μm-Sieb dekantiert. (5) Das Sieb
wurde leicht hochgezogen, um der Enzymlösung zu erlauben, hindurchzulaufen.
(6) Die filtrierte Enzymlösung
wurde wiederum auf ein 31 μm-Sieb
dekantiert. (7) Das Sieb wurde leicht hochgezogen, um der Enzymlösung zu
erlauben, hindurchzulaufen. (8) Die Enzymlösung wurde aus dem Becher glas
in ein Zentrifugenröhrchen durch
Dekantieren übertragen.
(9) Eine Zentrifugation wurde bei 600 rpm für 1 Minute durchgeführt. (10)
Der Überstand
wurde in ein neues Zentrifugenröhrchen
mit einer Wegwerfpipette überführt. (11)
Eine Zentrifugation wurde bei 900 rpm für 3 Minuten durchgeführt. Der Überstand
wurde verworfen. (12) 0,4 M Glucose wurde in das Zentrifugenröhrchen an
dessen Wand entlang gegossen und die Protoplasten wurden suspendiert. (13)
Eine Zentrifugation wurde bei 900 rpm für 3 Minuten durchgeführt. Der Überstand
wurde verworfen. (14) AA-Puffer wurde in das Zentrifugenröhrchen an
dessen Band entlang gegossen und die Protoplasten wurden suspendiert.
(15) Eine Zentrifugation wurde bei 900 rpm für 3 Minuten durchgeführt. Der Überstand
wurde verworfen. (16) Eine kleine Menge an AA-Puffer wurde in das Zentrifugenröhrchen entlang
dessen Wand gegossen. (17) Die Protoplasten wurden durch die Verwendung
eines Hämocytometers
gezählt.
(18) Die Fluidmenge der Protoplastensuspension wurde gemessen. (19)
Die Protoplastendichte wurde auf 1 × 107 Zellen/ml
durch die Verwendung von AA-Puffer angepasst, worin der AA-Puffer
wie folgt war: 35 mM K-Asparaginsäure, 5 mM Ca-Gluconat, 5 mM
Mg-Asparaginsäure,
5 mM MES, 0,4 M Mannitol, pH 5,8 (Einstellung ist unnötig) angepasst.
- 3.4) Das Gen wurde wie folgt eingeführt:
(1) Eine Elektroporationskammer
wurde mit 70% Ethanol sterilisiert. (2) Das Plasmid (1 μg/μl), welches
in TE gelöst
worden war, wurde zu der Protoplastensuspension hinzugefügt. Die
Endkonzentration des hinzugefügten
Plasmids war wie folgt: 50 μg/ml
HPT2 (hygro) und 100 μg/ml
CatA-GUS-Δ0.
Die Struktur des Plasmids HPT für Hygromycinselektion
wurde berichtet (Tada et al., Theor. Appl. Genet. 80: 475–480 (1990)).
(3) Das Teströhrchen
wurde auf Eis aufrecht gestellt und für 20 Minuten belassen. (4)
Die Protoplasten wurden in die Kammer übertragen. (5) Elektrizität, welche
in einen Kondensator geladen worden war, wurde entladen. Die Entladungsbedingungen waren:
880 μF,
475 V/cm und die Zeitkonstante war ungefähr 30 ms. (6) Nachdem die Protoplasten
für 10
Sekunden oder mehr belassen worden waren, wurden sie in einem Zentrifugenröhrchen wiedergewonnen.
(7) Die Protoplasten wurden bei Raumtemperatur für 20 Minuten belassen.
- 3.5) Protoplasten wurden wie folgt kultiviert:
(1) Die
Protoplasten wurden bei 900 rpm für 3 Minuten zentrifugiert.
Der Überstand
wurde verworfen. (2) c-med wurde in das Zentrifugenröhrchen entlang
dessen Wand gegossen und die Protoplasten wurden suspendiert. Die
Protoplasten wurden auf 1 × 106 Zellen/ml mit c-med angepasst. Nur das
Medium wurde aus der Suspension am dritten Tage der c-med-Kultur
wiedergewonnen und flotierende Substanz wurde bei 12000 rpm entfernt.
Zu 40 ml des Mediums wurden 200 μl
2,4-D (100 ppm), 400 μl
B5-Vitamine und 5,46 g Saccharose hinzugefügt und auf pH 4,3 eingestellt.
Das Medium wurde gefroren und konserviert. Das Medium wurde unmittelbar
vor der Verwendung aufgetaut und an Filtrationssterilisation ausgesetzt.
(3) 750 μl
der Kultur wurden in jede Kulturschale (Falcon #3002) verteilt.
(4) Die Kultur wurde über
die gesamte Schale unter die Verwendung eines Conradi-Spatels verteilt.
(5) Die Schale wurde mit einem Parafilm verschlossen. (6) Die Schalen
wurden in eine Tupperware gegeben. Um die Kultur vom Trocknen abzuhalten,
wurde ein Becherglas oder Ähnliches,
das Wasser enthält,
ebenfalls in die Tupperware inkludiert. (7) Die Kultur wurde an
einem dunklen Ort bei 27°C
inkubiert.
-
4) Regeneration transformierter
Pflanzen
-
- 4.1) Die transformierten Pflanzen wurden selektiert
und wachsen gelassen wie folgt:
(1) Am 14. Tage der Kultur
wurden 600 μl
eines GI-Mediums hinzugefügt.
Das GI-Medium wurde durch
Hinzufügen
von 2 ppm 2,4-D 0,4 M Glucose zu einem R2-Medium und Einstellen
seines pH-Wertes auf 4,9 erhalten. (2) Um hygromycinresistente Kalli
zu selektieren, wurden 50 μg/ml
Hygromycin zu dem GI-Medium hinzugefügt. (3) Zwei Wochen nach der
Zugabe des GI-Mediums wurden die Kalli, welche gewachsen waren,
auf ein GII-Agarmedium übertragen.
Das GII-Agarmedium wurde erhalten durch Hinzufügen von 2 ppm 2,4-D, 3% Saccharose
zu einem R2-Medium, Anpassen seines pHs auf 4,9 und danach Hinzufügen von
1% Agar zu dem Medium und es autoklavieren, 10 ml des Mediums wurden
in jede einer Petrischale ∅ 9 cm × 10 mm verteilt.
- 4.2) Die transformierte Pflanze wurde wie folgt regeneriert:
(1)
Ein Medium, das N6-anorganische Salze, B5-Vitamine, 3% Saccharose,
NAA 1 ppm, Kinetin 4 ppm, 3% Sorbitol und 0,03% Caseinhydrolysat
enthielt, wurde auf einen pH von 5,8 eingestellt. 1,5% Agar wurde
hinzugefügt
und das Medium wurde autoklaviert. (2) Das Medium wurde in tiefe
Plastikpetrischalen ∅ 90 mm × 20 mm verteilt (40 ml–50 ml/Schale)
in einer Sterilbank. (3) Die Kalli, welche zu einem Durchmesser
von ungefähr 3
mm gewachsen waren, wurden auf das Agarmedium übertragen. (4) Ungefähr 20 Kalli
wurden auf jede Schale gegeben. (5) Die Kalli wurden bei 27°C unter Dauerlicht
von 3000 Lux kultiviert. (6) Unter den Pflanzen, welche auf dem
Differenzierungsmedium differenziert hatten, wurden jene, deren
Schösslinge
auf ungefähr
3 cm Länge
gewachsen waren, in Gefäße vom Magentatyp
mit ihren Wurzeln übertragen.
(9) Schösslinge
wurden in jede Box übertragen.
Das Medium wurde gewonnen durch Hinzufügen von 1% Saccharose zu einem
1/2-MS-Medium und Einstellens seines pH-Wertes auf 5,8. Nach Hinzufügen von
0,15% Gelrite und thermischem Schmelzen des Mediums wurden 50 ml
des Gelrites in jedes Gefäß vom Magentatyp
verteilt und autoklaviert. (7) Die Schösslinge mit Wurzeln wurden
bei 27°C
unter Dauerlicht von 10.000 Lux kultiviert. (8) In ungefähr einer
Woche erreichten die Schösslingsspitzenenden
vollständig
den Deckel. In gewissen Fällen
können
divalente Kationen in dem Medium verloren gegangen sein, so dass
das Medium verflüssigt
worden sein kann.
-
Die
redifferenzierten Individuen (Reis der T0-Generation), die auf die
zuvor genannte Weise erhalten worden waren, wurden in einen Topf übertragen.
Unter den heraufgewachsenen Individuen wurden jene, in welchen GUS
exprimiert worden war, selektiert, wie durch GUS-Gewebefärbung ihrer
Blätter bestimmt.
-
Die
GUS-Färbung
für das
Selektieren der transformierten Pflanzen wurde nach dem folgenden Vorgehen
durchgeführt:
(1) Eine Färbelösung, enthaltend
1 mM X-Gluc, 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) und 10% Me-OH,
wurde zubereitet. (2) 500 μl
der Färbelösung, gewonnen
aus (1), wurde in jeweils 2 ml-Mikroröhrchen verteilt. (3) Blattschnitte
der regenerierten Pflanzen wurden in die Mikroröhrchen gegeben. (4) Die Mikroröhrchen wurden
bei 37°C
für 24
Stunden inkubiert. (5) Chlorophyll wurde mit 70% Et-OH entfernt.
(6) Die Reispflanzen, welche GUS-gefärbt worden waren, wurden ausgewählt.
-
Folglich
wurden 15 Individuen an Reispflanzen der T0-Generation, in welchen
GUS in ihren Blättern
exprimiert worden war, ausgewählt
und ihre Samen wurden gesammelt (Samen der T1-Generation).
-
5. PCR-Selektion von Reispflanzen
der T1-Generation
-
Unter
den in 4. oben gewonnenen 15 Linien wurden die T1-Samen ohne Hüllen aus
10 Linien mit 1% Antiformin für
1 Stunde behandelt und danach in Leitungswasser für 2 Tage
eingetaucht und auf gekörnter
Erde (BONSORU Nr. 1, Sumitomo Chemical) ausgesät. Aus den Blattspreiten der
Sämlinge
wurde DNA extrahiert unter Verwendung von ISOPLANT (Nippon Gene).
Unter Verwendung der extrahierten DNA als eine Matrize wurde eine
PCR durchgeführt, mit
einem Primer F1813 (5'-CATGGCTGGTTGATTCAGC-3': eine Sequenz innerhalb
des ersten CatA-Introns) und einem Primer R2368 (5'-CGTCGGTAATCACCATTCC-3': eine Sequenz innerhalb
der kodierenden Region des GUS-Gens), um zu untersuchen, ob die
eingeführte
DNA-Sequenz vorhanden war oder nicht. PCR wurde durchgeführt durch
die Verwendung von AmpliTaq Gold (Perkin Elmer), einer DNA-Polymerase.
Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt: Nach Durchführen einer
Behandlung bei 94°C
für 12
Minuten wurden 35 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus
einer Behandlung bei 94°C
für 1 Minute,
einer Behandlung bei 55°C
für 2 Minuten
und einer Behandlung bei 72°C für 3 Minuten
bestand.
-
Die
Reaktionslösung
wurde an Elektrophorese in 1% Agarose ausgesetzt, mit Ethidiumbromid gefärbt und
mit Ultraviolettlicht bestrahlt, wodurch die Anwesenheit/Abwesenheit
und Größe jedes PCR-Produktes
bestimmt wurden. Folglich wurden die Pflanzen der T1-Generation,
in welche das Gen erfolgreich eingeführt worden war, selektiert.
-
Um
zu bestätigen,
ob das eingeführte GUS-Gen
exprimiert war oder nicht, wurde die GUS-Aktivität der Blattspreiten der T1-Pflanzen durch
das folgende GUS-Gewebefärbungsverfahren untersucht.
-
Als
das Verfahren der GUS-Gewebefärbung für Reisblattspreiten
zur Beobachtung von GUS-Aktivität
wurde ein Verfahren durchgeführt,
welches teilweise aus einem Verfahren modifiziert war, beschrieben
in „EXPERIMENTAL
PROTOCOLS FOR OBSERVING PLANT CELLS: FROM GENE EXPRESSION TO INTRACELLULAR
STRUCTUR AND FUNCTION";
Sonderausgabe von Cell Technology, Plant Cell Technology Folgen 62–3; METHOD
FOR DETECTING GUS ACTIVITY AT THE CELLULAR LEVEL (Misa TAKAHASHI,
Hiromichi MORIKAWA) Seiten 71–79
(überwacht
von Hiroo FUKUDA, Mikio NISHIMURA, Kenzo NAKAMURA).
-
Das
Vorgehen war wie folgt: (1) X-Gluc-Lösung [100 mM Phosphatpuffer
(pH 7,0), 1 mM X-Gluc, 0,3 mM Kaliumferricyanid, 0,3 mM Kaliumferrocyanid,
0,2% Triton-X100] wurde zubereitet. (2) 500 μl der X-Gluc-Lösung wurde
in jede Vertiefung einer 24-Well-Titerplatte
verteilt. (3) Jede Gewebeprobe oder Scheibe der Reispflanzen wurde
in eine Vertiefung gegeben und bei 28°C für 16 Stunden behandelt. (3)
Die X-Gluc-Lösung
wurde entfernt und eine Entfärbung
wurde mit 70% Ethanol durchgeführt.
(4) Der 70% Ethanol wurde entfernt und die Gewebeprobe oder Abschnitt
wurde in eine 50% Glycerollösung eingetaucht.
(5) Ein Mikroskop oder ein Stereomikroskop wurde für die Beobachtung
verwendet.
-
Die
Pflanzen der T1-Generation wurden in Gruppen eingeteilt, entsprechend
ihrem Expressionsmaß des
GUS-Gens in ihren Blättern.
Die Samen der Pflanzen, welche ein hohes Expressionsmaß in ihren
Blättern
zeigten, wurden gesammelt (Samen der T2-Generation).
-
6. Aussäen der T2-Samen,
PCR-Selektion von Transformanten und GUS-Gewebefärbung
-
Die
enthüllten
Samen der T2-Transformanten wurden wie oben erwähnt behandelt und ausgesät. DNA wurde
aus den Blattspreiten ihrer Sämlinge in
der zuvor genannten Weise extrahiert und eine PCR wurde durchgeführt, um
zu bestimmen, ob die eingeführte
DNA-Sequenz vorhanden
war oder nicht. Es wurde bestätigt,
dass ungefähr
die Hälfte
der untersuchten T2-Pflanzen Transformanten waren, mit dem eingeführten GUS-Gen.
-
Um
zu bestätigen,
ob das eingeführte GUS-Gen
exprimiert war oder nicht, wurde die GUS-Aktivität der Blattspreiten der Sämlinge der T2-Pflanzen
auf die zuvor genannte Weise untersucht. Für sämtliche der T2-Transformanten,
in welchen die Anwesenheit des Gus-Gens durch PCR bestätigt worden
war, wurde GUS-Aktivität
in ihren Blattspreiten beobachtet. Den Pflanzen, in welchen die
GUS-Genexpression in ihren Blattspreiten bestätigt worden war, wurde erlaubt,
weiter zu wachsen und ihre Antheren wurden während eines Blühstadiums
gesammelt, um die GUS-Aktivität
in den Antheren und Pollen zu untersuchen.
-
Die
Ergebnisse sind in den 3 und 4 gezeigt.
Die GUS-Aktivität,
wie durch das Sammeln von Antheren während eines Blühstadiums
untersucht, zeigte eine höhere
GUS-Aktivität als in
den Blattspreiten. Als ein Ergebnis der Beobachtung von Antheren
und Pollen im Mikroskop wurde gefunden, dass die Antherenwände (3)
und das Innere der äußeren Hülle des
Pollens (4) blau aufgrund von GUS-Aktivität gefärbt worden
waren.
-
Industrielle
Anwendbarkeit
-
Der
CatA-Genpromoter gemäß der vorliegenden
Erfindung hat eine sehr hohe Aktivität in Antheren und Pollen. Demgemäß ist die
vorliegende Erfindung nützlich
für das
Züchten
von Pflanzen, z.B. Reis, durch genetische Veränderung von Antheren und/oder
Pollen.