DE69721840T2 - Zuckerrohr bacilliformviruspromotor - Google Patents

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Eines der Hauptziele der Pflanzengentechnik ist es, Pflanzen zu erhalten, die verbesserte Merkmale oder Eigenschaften haben. Diese Merkmale oder Eigenschaften umfassen Virusresistenz, Insektenresistenz, Herbizidresistenz, erhöhte Stabilität und einen verbesserten Nährwert, um einige zu nennen. Jüngste Fortschritte in der Gentechnik haben die Inkorporation von präselektierten Genen in Pflanzenzellen ermöglicht, um der Pflanze der Wahl die gewünschten Qualitäten zu verleihen. Das eingeführte Gen, das heißt „Transgen", wird dann in den Zellen der regenerierten Pflanze exprimiert, so dass die Pflanze die Eigenschaft oder das Merkmal, das durch das Transgen kodiert wird, aufweist.
  • Um ein Transgen in einer Pflanzenzelle zu exprimieren, muß das geeignete regulatorische Signal in der geeigneten Lokation in Bezug auf das Transgen vorhanden sein. Diese regulatorischen Signale umfassen im Allgemeinen eine Promotorregion, eine 5' untranslatierte Leadersequenz und eine 3' Polyadenylierungssequenz. Die Promotorregion beeinflusst die Rate, mit welcher das RNA-Produkt des Transgens und das resultierende Proteinprodukt des Transgens gemacht wird. Die Promotoraktivität kann auch von der Anwesenheit verschiedener anderer, cis-wirkender, regulatorischer Elemente abhängen, die, in Verbindung mit zellulären Faktoren, die Stärke, Spezifität und die Transkriptionsinitiationsstelle bestimmen (für eine Review siehe Zawel und Reinberg, Curr. Opin. Cell Biol., 4, 488 (1992)). Starke Promotoren sind in der Lage, die RNA-Synthese auf einer höheren Rate zu steuern relativ zu schwachen Promotoren. Konstitutive Promotoren steuern die RNA-Produktion in vielen oder allen Zelltypen.
  • Der Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotor (CaMV35S für Englisch cauliflower mosaic virus 35S promoter) ist ein starker, konstitutiver Promotor in Pflanzen (Odell et al., Nature, 313, 810 (1985); Jensen et al., Nature, 321, 669 (1986); Jefferson et al., EMBO J., 6, 3901 (1987); Kay et al., Science, 236, 1299 (1987); Sanders et al., Nucl. Acids, Res., 4, 1543 (1987)). Dieses wurde durch die Detektion beträchtlicher Level von Reportergenproteinen oder mRNAs in Extrakten, die aus den Blättern, Stämmen, Wurzeln und Blüten von transgenen Pflanzen vorbereitet wurden, gezeigt. Als ein Resultat findet der CaMV35S-Promoter in dem Gebiet der Pflanzengentechnik eine weite Anwendung. Obwohl der CaMV35S-Promoter ein starker, konstitutiver Promoter in Assays, die Zellextrakte involvieren, zu sein scheint, zeigen detaillierte histologische Analysen der Reportergenprodukte, die auf der Zell- und Gewebeebene detektierbar sind, einen ziemlich hohen Grad in der Expressionsvariabilität der Genprodukte in Pflanzengeweben.
  • CaMV ist ein Caulimovirus, eine Untergruppe der Pararetroviren, die ikosaedrische Kapside haben und nur Dikotyledonen infizieren, obwohl der CaMV35S-Promoter ein starker Promoter in Monokotyledonen ist. Der Zuckerrohr Bacilliformvirus (SCBV für Sugarcane bacilliform virus), der Commelina Yellow Mottle Virus (CoYMV) und der Rice Tungro Bacilliform Virus (RTBV) sind Badnaviren, eine Untergruppe der Pararetroviren, die bacilliforme Kapside haben und hauptsächlich Monokotyledonen infizieren. Ein Promotorfragment, das aus dem CoYMV isoliert wurde, verleiht ein gewebespezifisches Expressionsmuster, das unterschiedlich zu dem Muster ist, das durch den CaMV35S-Promoter verliehen wird. Transformierte Tabakpflanzen, die den CoYMV-Promotor verbunden mit dem β-Glukuronidasereportergen („GUS"; uidA) enthielten, zeigten, dass, während der CoYMV-Promotor in allen Organen aktiv ist, die β-Glukuronidaseaktivität hauptsächlich im Phloem, den phloemassoziierten Zellen und dem axialen Parenchym der Wurzeln, Stämme, Blätter und Blüten vorkommt (Medberry et al., Plant Cell, 4, 185 (1992); Medberry und Olszewski, Plant J., 3, 619 (1993)). Im Gegensatz dazu ist der CaMV35S-Promoter in fast allen Zelltypen aktiv (Medberry et al., Plant Cell, 4, 185, (1992); Medberry und Olszewski, Plant J., 3, 619 (1993)). Darüber hinaus ist der CoYMV-Promotor in Tabaksuspensionszellen 30% so aktiv und in Maissuspensionszellen bis zu 25% so aktiv verglichen mit einem duplizierten CaMV35S-Promoter (Medberry et al., Plant Cell, 4, 185 (1992)).
  • Transgener Reis, der den RTBV-Promotor verbunden mit dem GUS-Gen enthält, zeigt eine starke, phloemspezifische Promotoraktivität. Dieses war in Übereinstimmung mit der Expression dieses Promotors in Reisprotoplasten. Der RTBV-Promotor zeigte jedoch nur schwache Aktivität in Maisprotoplasten (Bhattacharyya-Pakrasi et al., Plant J., 4, 71 (1993); Yin et al., Plant J., 7, 969 (1995)). Im Gegensatz dazu zeigt der entsprechende CaMV-Promoter eine starke Promotoraktivität in Protoplasten und in fast allen Geweben transgener Pflanzen (von Hohn und Fütterer reviewed, Curr. Opin. Genet. Dev., 2, 90 (1992)).
  • Was folglich benötigt wird ist ein hochexprimierter, konstitutiver Promotor, um Transgene in fertilen, transgenen monokotylen und dikotylen Pflanzen zu exprimieren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes und aufgereinigtes DNA-Molekül bereit, das ein präselektiertes DNA-Segment umfasst, das einen Zuckerrohr Bacilliformvirus (ScBV) -promotor oder eine biologisch aktive Untereinheit davon umfasst, die einen konstitutiv hohen Expressionslevel von dem wirksam verbundenen, präselektierten DNA-Segmenten in beiden, monokotylen und dikotylen Pflanzen, Pflanzengeweben, Pflanzenteilen oder Pflanzenzellen verleihen. Während die Nukleotidsequenz des Genoms von ScBV bekannt ist (Bouhida et al., J. Gen. Virol., 74, 1 (1993)), war die Lokation eines Promotors für die virale RNA über die gesamte Genomlänge, sogar nach Nukleotidsequenzvergleichen des ScBV-Genoms mit Promotorsequenzen naher verwandter Viren wie CoYMV und RTBV, nicht offensichtlich. Überraschenderweise ist der ScBV-Promotor in vielen Zelltypen ein starker und konstitutiver Promotor ungleich der starken, gewebespezifischen Expression, die für die CoMYV- und RTBV-Promotoren beobachtet werden. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein präselektiertes DNA-Segment, das einen ScBV-Promotor umfasst, der SEQ ID NO: 3 umfasst, das heißt ein präselektiertes DNA-Segment, das den Nukleotidpositionen 5999–7420 des ScBV-Genoms entspricht. Wie hierin unten beschrieben verleiht der ScBV-Promotor eine konstitutive und vaskuläre Genexpression in A. sativa und A. thaliana. Der ScBV-Promotor kann folglich für konstitutive und gewebespezifische, pflanzliche und nicht-pflanzliche Genexpression in Monokotyledonen und Dikotyledonen eingesetzt werden. Zum Beispiel kann der ScBV-Promotor mit Genen verbunden sein, die Getreiden eine Resistenz gegen Schädlinge verleihen, die die Getreidegräser am Stengel attackieren, beispielsweise Blattläuse, die den barley yellow dwarf virus übertragen, oder die eine gewebespezifische Resistenz an dikotyle Wirte verleihen, in welchen Organe wie die Wurzel durch Pathogene befallen werden, beispielsweise die soybean cyst nematode.
  • Wie hierin verwendet umfasst „ScBV" irgendeinen nicht-verpackten, bacilliformen, DNA-enthaltenden Badnavirus, der in der Lage ist, Saccharum oder verwandte Gattungen zu infizieren. Weitere charakteristische Eigenschaften von Badnaviren sind von Lockhart und Olszewski in The Encyclopedia of Virology, Webster und Granoff (eds.), Academic Press, New York, NY (1994) beschrieben.
  • Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff „ScBV-Promotor" eine Nukleotidsequenz, die, wenn diese Sequenz wirksam mit einem präselektierten DNA-Segment verbunden ist, das ein Protein, ein RNA-Transkript oder eine Mischung davon kodiert, zu der Expression des verbundenen, präselektierten DNA-Segments führt, das heißt der kodierten RNA und/oder dem kodierten Protein. Ein bevorzugter ScBV-Promotor hat wenigstens etwa 60%, vorzugsweise wenigstens etwa 80%, besonders vorzugsweise wenigstens etwa 90% und sogar besonders vorzugsweise wenigstens etwa 95% Nukleotidsequenzidentität mit SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5. Eine weitere, bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein ScBV-Promotor, der die minimale Zahl an zusammenhängenden Nukleotiden umfasst, welche die RNA-Transkription iniziieren.
  • Wie hierin verwendet bedeutet „biologisch aktiv", dass der Promotor wenigstens etwa 0,1%, vorzugsweise wenigstens etwa 10% und besonders vorzugsweise wenigstens etwa 25% der Aktivität des ScBV-Promotors hat, umfassend SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5. Die Aktivität eines Promotors kann durch Verfahren, die in Fachkreisen gut bekannt sind, bestimmt werden. Siehe zum Beispiel (Medberry et al., Plant Cell, 4, 185 (1992); Medberry et al., The Plant J., 3, 619 (1993); Sambrook et al., In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989); McPherson et al., U.S. Patent No. 5,164,316.
  • Darüber hinaus wird eine Expressionskassette bereitgestellt, die ein erstes präselektiertes DNA-Segment umfasst, das einen ScBV-Promotor umfasst, der in einer Wirtszelle funktionell ist und wirksam mit einem zweiten präselektierten DNA-Segment verbunden ist, das ein Protein, ein RNA-Transkript oder eine Kombination davon kodiert. Eine bevorzugte Wirtszelle ist eine Pflanzenzelle, beispielsweise eine monokotyle oder dikotyle Zelle. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Expressionskassette, die einen ScBV-Promotor umfasst, der wirksam mit einem selektierbaren Markergen verbunden ist. Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist eine Expressionskassette, die einen ScBV-Promotor umfasst, der SEQ ID NO: 3 umfasst.
  • Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Selektion stabiler, genetischer Transformanden von transformierten Pflanzenzellen und Verfahren zur Herstellung fertiler, transgener Pflanzen aus den besagten Pflanzenzellen bereit. Das Verfahren zur Herstellung von transformierten Pflanzenzellen umfasst die Einführung eines rekombinanten DNA-Segments in regenerierbare Pflanzenzellen, das ein erstes präselektiertes DNA-Segment umfasst, welches einen ScBV-Promotor wirksam verbunden mit einem zweiten präselektierten DNA-Segment umfasst, um transformierte Zellen zu gewinnen. Dann wird eine transformierte Zellinie identifiziert oder selektiert. Exemplarische Transformationsverfahren umfassen die Verwendung von Mikroprojektilbombardements, um ein präselektiertes DNA-Segment, das ein phänotypisch beobachtbares oder detektierbares Merkmal kodiert, das wirksam mit dem ScBV-Promotor verbunden ist, in regenerierbare, monokotyle Pflanzenzellen einzuführen. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren, wobei die Expression des rekombinanten DNA-Segments in den transformierten Zellen den transformierten Zellen ein phänotypisches Kennzeichen verleiht wie eine Herbizid- oder Antibiotikumresistenz.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „rekombinantes DNA-Segment" auf eine Nukleinsäure, das heißt auf eine DNA, die aus irgendeiner geeigneten Gewebequelle gewonnen oder isoliert worden ist und aus dem Verdund mit anderen Zellkomponenten isoliert worden ist, wie Nukleinsäuren oder Proteinen. Die DNA kann anschließend in vitro chemisch verändert werden, so dass ihre Sequenz nicht natürlich vorkommt oder natürlich vorkommenden Sequenzen entspricht, die nicht so positioniert sind wie sie in einem Genom positioniert sein würden, das nicht mit exogener DNA transformiert worden ist, so dass sie sequenziert, repliziert und/oder exprimiert werden kann.
  • Ein bevorzugtes, isoliertes, rekombinantes DNA-Segment umfasst ein erstes, präselektiertes DNA-Segment, das einen in Pflanzenzellen funktionellen ScBV-Promotor umfasst, der wirksam mit einem zweiten, präselektierten DNA-Segment verbunden ist, das ein selektierbares Markergen umfasst. Ein weiteres, bevorzugtes, isoliertes, rekombinates DNA-Segment umfasst ein zweites, präselektiertes DNA-Segment, das einem Gen entspricht, welches bereits in dem Pflanzengenom vorhanden ist, oder einem Gen entspricht, welches normalerweise nicht in dem Pflanzengenom vorhanden ist und die der Pflanze einen agronomisch nützlichen Phänotyp verleihen, beispielsweise eine Schädlingsresistenz. Wenn das präselektierte DNA-Segment normalerweise in dem Pflanzengenom vorhanden ist, muß es nicht oder nicht hoch exprimiert sein. Folglich wird das präselektierte DNA-Segment eingeführt, um die Expression des Proteins oder RNA-Transkripts zu verändern, die durch das präselektierte DNA-Segment in Zellen der Pflanze kodiert werden.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer fertilen, transgenen Pflanze bereit. Das Verfahren umfasst das Einführen eines rekombinanten DNA-Segments, das ein erstes, präselektiertes DNA-Segment umfasst, das einen ScBV-Promotor wirksam verbunden mit einem zweiten präselektierten DNA-Segment umfasst, in regenerierbare Pflanzenzellen, um regenerierbare transformierte Zellen zu gewinnen. Eine Population transformierter Zellen wird selektiert oder identifiziert und eine fertile, transgene Pflanze daraus regeneriert. Das rekombinante DNA-Segment wird durch einen vollständigen, sexuellen Zyklus der besagten transgenen Pflanze zu deren Nachkommenschaft übertragen, so dass es von den Pflanzennachkommen exprimiert wird. Folglich stellt die Erfindung auch eine transgene Pflanze und Samen, andere Pflanzenteile, Gewebe und Pflanzennachkommen, die davon abstammen, bereit.
  • Die transgenen Pflanzen der Erfindung umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, eine transgene T0- oder R0-Pflanze, das heißt die erste Pflanze, die aus den transformierten Pflanzenzellen regeneriert wurde, eine transgene T1- oder R1-Pflanze, das heißt die Pflanze der ersten Nachkommengeneration und die Nachkommenpflanzen weiterer Generationen, die davon abstammen, welche das rekombinante DNA-Segment umfassen und exprimieren. Um das rekombinante DNA-Segment in regenerierbare, monokotyle Zellen einzuführen, kann das Mikroprojektilbombardement verwendet werden, während Agrobacterium-vermittelter DNA-Transfer verwendet werden kann, um die rekombinante DNA in regenerierbare, dikotyle Zellen einzuführen.
  • Es wird auch eine transformierte, monokotyle oder dikotyle Pflanze bereitgestellt, deren Zellen ein rekombinantes DNA-Segment umfassen, das ein erstes, präselektiertes DNA-Segment umfasst, das einen Zuckerrohr Bacilliformviruspromotor umfasst, der wirksam mit einem zweiten, präselektierten DNA-Segment verbunden ist. Das zweite, präselektierte DNA-Segment wird in den transformierten Zellen in einer Menge exprimiert, die unterschiedlich zu der Menge in den Zellen einer Pflanze ist, in der sich die Zellen nur durch die Abwesenheit des rekombinanten DNA-Segments von den transformierten Zellen unterscheiden. Solche Zellen können in einigen Fällen untransformierte Zellen desselben Teils der transformierten oder transgenen Pflanze umfassen. Das zweite, präselektierte DNA-Segment wird exprimiert, um die transformierte Pflanze oder einen Teil davon von der entsprechenden untransformierten Pflanze oder einem Teil davon identifizierbar zu machen.
  • Das rekombinante DNA-Segment wird durch einen vollständigen, normalen, sexuellen Zyklus der transformierten Pflanze auf die nächste Generation übertragen.
  • Es wird auch ein Verfahren bereitgestellt, das die Gewinnung einer Nachkommenschaft von einer fertilen, transgenen Pflanze umfasst, die durch das Verfahren, welches oben beschrieben wird, erhalten wurde.
  • Wie hierin verwendet meinen die Begriffe „transgen" oder „transformiert" in Bezug auf eine Pflanzenzelle, einen Pflanzenteil (einschließlich den Samen), ein Pflanzengewebe oder eine Pflanze, eine Pflanzenzelle, einen Pflanzenteil, ein Pflanzengewebe oder eine Pflanze, die ein isoliertes, aufgereinigtes, präselektiertes DNA-Segment umfassen, das in das Genom einer Pflanzenzelle, eines Pflanzenteils, eines Pflanzengewebes oder einer Pflanze durch ein „gentechnisches" Transformationsverfahren eingeführt worden ist. Das heißt das Genom einer transgenen Pflanzenzelle, eines Pflanzenteils, eines Pflanzengewebes oder einer Pflanze ist durch wenigstens ein präselektiertes DNA-Segment erweitert worden. Die Begriffe „wildtyp", „nativ" oder „nicht transgen" beziehen sich auf eine untransformierte Pflanzenzelle, Pflanzenteil, Pflanzengewebe oder Pflanze, das heißt eine, wo das Genom nicht durch die Anwesenheit eines präselektierten DNA-Segments verändert worden ist.
  • Die Transformation von Pflanzen gemäß der Erfindung kann im Wesentlichen mittels irgendeinem der verschiedenen Verfahren durchgeführt werden, die für jene verfügbar sind, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie der Pflanzen Fachkenntnisse ahebn. Diese umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, das Mikroprojektilbombardement, die Mikroinjektion, die Elektroporation von Protoplasten oder Zellen, die partielle Zellwände umfassen, den Silikoncarbidfiber-vermittelten DNA-Transfer und den Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer. Pflanzen, die bei der Anwendung der Erfindung brauchbar sind, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Hafer, Weizen, Soja, Mais, Tabak, Reis, Gerste, Kartoffel, Tomate, Salat, Ölsamenraps, Baumwolle, Flacks, Zuckerrüben, Sorghum, Sonnenblumen, Alfalfa, Hirse und Roggen.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 stellt die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1) des Zuckerrohr Bacilliformvirus dar.
  • 2 stellt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 2) des Zuckerrohr Bacilliformvirus dar.
  • 3 stellt die Expressionskassetten dar, die einen ScBV-Promotor umfassen, der zur Pflanzentransformation brauchbar ist.
  • 4 stellt (A) eine Karte von Konstrukten dar, die verwendet wurden, um die Aktivität des ScBV-Promotors in A. sativa zu testen. Die resultierenden pMON755i-Derivate, die die ScBV-Kassetten 1, 2 oder 3 enthalten, wurden mit pScBV-1, pScBV-2 bzw. pScBV-3 bezeichnet; und (B) eine Karte der Reportergenregion in dem binären Vektor, der verwendet wurde, um die Promotoraktivität der ScBV-3-Kassette in A. thaliana zu testen. Die ScBV-3-Kassette wurde in die SalI- und XbaI-Stelle von pOCA101 kloniert. Die Klonierungsschritte führten zu der Entfernung der SpeI/StuI und der SalI/XhoI Stellen.
  • 5 A. sativa- und A. thaliana-Gewebe gefärbt auf GUS-Aktivität: (A) A. sativa-Antheren; (B) A. sativa-Fruchtknoten; (C) A. thaliana-Blütenorgane; (D) A. sativa-Ärchen; (E) A. sativa-Stengel; (F) A. sativa-Blatt; (G) A. thaliana-Blatt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Das Einführen von exogenen Genen (Transgenen) in Pflanzen, um eine fertile, transgene Pflanze mit verbesserten, agronomischen Eigenschaften bereitzustellen, hat das Potential zur Langzeitverbesserung und der Expansion der Agrikultur weltweit. Die vorliegende Erfindung stellt in Pflanzen eine konstitutive und starke Expression von Transgenen bereit, die beispielsweise Substanzen kodieren, die zu veränderten, agronomischen oder physiologischen Merkmalen führen. Solche transgenen Pflanzen und die davon gewonnenen Samen können dieses Merkmal sexuell auf ihre Nachkommen übertragen. Exemplarische Merkmale für transgene Pflanzen umfassen eine erhöhte Stresstoleranz, Schädlingsresistenz, Krankheitsresistenz (zum Beispiel Bakterien, Viren und Pilze), verbesserte Erträge, einen verbesserten Nährstoffwert und verbesserte Kornzusammensetzung oder -qualität.
  • Um eine konstitutive und starke Expression von Transgenen in Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzengeweben oder Pflanzenteilen bereitzustellen, wird ein Zuckerrohr Bacilliformviruspromotor, der beispielsweise SEQ ID NO: 3 umfaßt, wirksam mit einem definierten Transgen verbunden, das heißt einem präselektierten DNA-Segment, und in regenerierbare Pflanzenzellen eingeführt. Die resultierende, regenerierte, transgene Pflanze exprimiert das Protein oder RNA-Transkript, das von dem präselektierten DNA-Segment kodiert wird, auf einem hohen und gleichmäßigen Level, vorzugsweise in allen Geweben und Zellen der transformierten Pflanze. Eine bevorzugte ScBV-Promotorsequenz ist zwischen den Nukleotiden 5999 und 7420 (SEQ ID NO: 3) des ScBV-Genoms (SEQ ID NO: 2) lokalisiert. Es wird vorzugsweise eine 5' untranslatierte Leadersequenz mit dem Promotor gekoppelt. Die Leadersequenz kann von dem ScBV-Genom selbst oder von einer anderen Quelle als dem ScBV sein, beispielsweise von dem ersten Intron der Mais-Alkoholdehydrogenase und den 5' untranslatierten Leadersequenzen des Petunien-HSP70 (Winter et al., Mol. Gen. Genet., 211, 315 (1988)); des Soya-HSP17,9 (Raschke et al., J. Mol. Biol., 199, 549 (1988)); oder des Mais-HSP70 (Rochester et al., EMBO J., 5, 541 (1986)).
  • I. Rezipientenzellen
  • Die vorliegende Erfindung setzt Rezipientenzellen ein, die empfänglich für die Transformation und die darauffolgende Regeneration in stabil transformierte, fertile Pflanzen sind. Für zum Beispiel die Transformation von Monokotyledonen können unreife Embryonen, meristematisches Gewebe, gametisches Gewebe, embryogene Suspensionskulturen oder embryogenes Kallusgewebe als eine Quelle für Rezipientenzellen eingesetzt werden, die bei der Ausführung der Erfindung brauchbar sind. Bevorzugte Rezipientenzellen für die Transformation von Hafer sind Haferkalluskulturen, die von unreifen Embryonen iniziiert wurden. Um eine solche Kultur von Hafenezipientenzellen bereitzustellen, werden unreife Haferembryonen geschält und sterilisiert. Die Embryonen werden in Flüssigmedien über Nacht inkubiert, dann herausgeschnitten und auf feste Medien mit der Skutellumseite nach unten plaziert, um eine Kalluskultur zu initiieren. Ein bevorzugtes festes Medium zur Initiation einer Kalluskultur ist MS2D (siehe Torbert et al., Plant Cell Reports, 14, 635 (1995)).
  • Zur Transformation von Dikotyledonen können Organ- und Gewebekulturen als eine Quelle für Rezipientenzellen eingesetzt werden. Folglich können Gewebe, beispielsweise Blätter, Samen und Wurzeln, von Dikotyledonen eine Quelle für Rezipientenzellen bereitstellen, die in der Ausführung der Erfindung brauchbar ist.
  • Die kultivierten, empfänglichen Rezipientenzellen werden vorzugsweise auf festen Unterlagen angezogen. Nährstoffe werden den Kulturen in Form von Medien bereitgestellt und die Umweltbedingungen der Kulturen werden kontrolliert. Medien und Umweltbedingungen, die das Wachstum von regenerierbaren Pflanzenkulturen unterstützen, sind im Stand der Technik gut bekannt.
  • II. DNA-Sequenzen
  • Es kann so gut wie jede DNA-Komposition für die Übertragung auf die Rezipienten-Pflanzenzellen verwendet werden, um letzten Endes fertile, transgene Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung zu produzieren. Das DNA-Segment oder Gen, das für die zelluläre Einführung ausgewählt wurde, wird häufig ein Protein kodieren und kann in den resultierenden, transformierten Zellen exprimiert werden, um zu einem screenbaren oder selektierbaren Merkmal zu führen und/oder um der regenerierten Pflanze einen verbesserten Phänotyp zu verleihen. Das DNA-Segment oder Gen, das für die zelluläre Einführung ausgewählt worden ist, kann auch eine antisense-RNA kodieren, das heißt ein Komplement eines prädeterminierten DNA-Moleküls oder eines Teils davon, die in einer untransformierten Pflanzenzelle exprimiert werden. Die Transkription einer antisense-RNA supprimiert die Expression der komplementären RNA, beispielsweise von einer, welche eine unerwünschte Eigenschaft kodiert. Folglich kann ein präselektiertes DNA-Segment in Form von Vektoren und Plasmiden oder linearen DNA-Fragmenten, die in einigen Fällen nur das in der Pflanze zu exprimierende DNA-Element enthalten, und dergleichen eingesetzt werden. Dieses mag jedoch nicht immer der Fall sein und die vorliegende Erfindung umfasst auch transgene Pflanzen, die nicht exprimierte Transgene enthalten. Exemplarische DNA-Sequenzen werden in den Tabellen 1, 2 und 3 in Weising et al. bereitgestellt (Ann. Rev. Genet., 22, 421 (1988)), und in Lundquist et al. (U.S. Patent No. 5, 484, 956), wobei beide davon hierin als Referenz enthalten sind.
  • Für bestimmte Ausführungsformen wird in Erwägung gezogen, dass jemand wünschen könnte, replikationskompetente, virale Vektoren in der Pflanzentransformation einzusetzen, wie solche, die zur Maistransformation eingesetzt werden, um das präselektierte DNA-Segment in die Pflanzen zu transferieren. Solche Vektoren umfassen zum Beispiel die wheat dwarf virus (WDV) „shuttle"-Vektoren wie pW1-11 und PW1-GUS (Ugaki et al., Nucl. Acid Res., 19, 391 (1991)). Diese Vektoren sind zur autonomen Replikation sowohl in Maiszellen als auch in E. coli in der Lage und können als solche eine erhöhte Sensitivität zur Detektion von DNA-übertragenen gegenüber transgenen nicht-Maispflanzenzellen bereitstellen.
  • Eine replizierender Vektor kann auch zur Übertragung von Genen nützlich sein, die von DNA-Sequenzen transponierbarer Elemente wie Ac, Ds oder Mu flankiert werden, da diese Elemente aktiv die Integration der gewünschten DNA begünstigen würden und daher die Häufigkeit einer stabilen Transformation erhöhen. Es wird auch in Erwägung gezogen, dass transponierbare Elemente nützlich wären, um DNA-Fragmente einzuführen, denen Elemente fehlen, die zur Selektion und Erhaltung des Plasmidvektors in Bakterien nötig sind, beispielsweise Antibiotikaresistenzgene oder DNA-Replikationsursprünge.
  • Eine DNA, die zur Einführung in Pflanzenzellen brauchbar ist, umfasst, dass sie von irgendeiner Quelle abgeleitet oder aus irgendeiner Quelle isoliert wurde, die anschließend durch eine Struktur, Größe und/oder Funktion charakterisiert, chemisch verändert und später in Pflanzen eingeführt werden könnte. Ein Beispiel für eine solche DNA, die aus einer Quelle „isoliert" wurde, wäre eine brauchbare DNA-Sequenz, die aus der besagten Quelle mit chemischen Mitteln, beispielsweise durch die Verwendung von Restriktionsendonukleasen, ausgeschnitten oder entfernt wurde, so dass sie weiter manipuliert werden kann, beispielsweise separiert oder amplifiziert mit zum Beispiel einer Polymeryasekettenreaktion (PCR für Englisch polymerase chain reaction), zur Verwendung in der Erfindung durch die Methodologie der Gentechnik. Die Wiedergewinnung oder Isolation eines gegebenen DNA-Fragments aus einem Restriktionsverdau kann die Auftrennung des Verdaus auf einem Polyakrylamid- oder Agarosegel durch Elektrophorese, die Identifikation des Fragments von Interesse durch einen Vergleich seiner Mobilität gegenüber der Mobilität eines Marker-DNA-Fragments bekannten Molekulargewichts, das Entfernen der Gelsektion, die das gewünschte Fragment enthält und die Trennung des Gels von der DNA einsetzen. Siehe Lawn et al., Nucleic Acids Res., 9, 6103 (1981) und Goedel et al., Nucleic Acids Res., 8, 4057 (1980). Folglich ist die DNA „isoliert", insofern sie von wenigstens einer kontaminierenden Nukleinsäure frei ist, mit der sie normalerweise in der natürlichen RNA- oder DNA-Quelle assoziiert ist und vorzugsweise im wesentlichen von irgendeiner anderen Säugetier-RNA oder -DNA frei ist. Die Phrase „frei von wenigstens einer kontaminierenden Quellennukleinsäure, mit der sie normalerweise assoziiert ist" schließt den Fall mit ein, wo die Nukleinsäure in die Quelle oder natürliche Zelle zurückgeführt wird, sie aber in einer unterschiedlichen, chromosomalen Lage ist oder anderweitig von Nukleinsäuresequenzen, die normalerweise nicht in der Quellenzelle gefunden werden, flankiert wird.
  • Ein Beispiel für eine DNA, die sich von einer Quelle „ableitet", wäre eine DNA-Sequenz oder ein DNA-Segment, die oder das als ein brauchbares Fragment innerhalb eines gegebenen Organismus identifiziert wird und welche oder welches dann chemisch in einer im wesentlichen reinen Form synthetisiert wird. Deshalb umfasst eine „rekombinante oder präselektierte DNA" vollständig synthetische DNA-Sequenzen, semisynthetische DNA- Sequenzen, DNA-Sequenzen, die aus biologischen Quellen isoliert wurden und DNA-Sequenzen, die sich von RNA ableiten, sowie Mischungen davon.
  • Die eingeführte DNA umfasst, ist aber nicht darauf beschränkt, DNA von Pflanzengenen und nicht-pflanzlichen Genen wie solche von Bakterien, Hefen, Tieren oder Viren. Darüber hinaus ist es innerhalb des Bereichs der Erfindung, ein präselektiertes DNA-Segment aus einem gegebenen Pflanzengenotyp zu isolieren und anschließend mehrfache Kopien des präselektierten DNA-Segments in denselben Genotyp einzuführen, zum Beispiel um die Produktion eines gegebenen Genprodukts zu steigern. Die eingeführte DNA kann modifizierte Gene, Teile von Genen oder chimäre Gene umfassen, einschließlich Genen desselben oder eines anderen Planzengenotyps. Der Begriff „chimäres Gen" oder „chimäre DNA" wird als ein Gen oder eine DNA-Sequenz oder ein DNA-Segment definiert, umfassend wenigstens zwei DNA-Sequenzen oder Segmente aus Spezien, die unter natürlichen Bedingungen die DNA nicht kombinieren oder deren DNA-Sequenzen oder DNA-Segmente auf eine Weise positioniert oder verbunden sind, die normalerweise nicht in dem nativen Genom der untransformierten Pflanze auftritt.
  • Die eingeführte DNA, die zur Transformation hierin verwendet wurde, kann zirkulär oder linear, doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Im allgemeinen ist die DNA in Form von chimärer DNA wie Plasmid-DNA, die auch kodierende Regionen enthalten kann, die von regulatorischen Sequenzen flankiert werden, welche die Expression der rekombinanten DNA, die in der resultierenden Pflanze vorhanden ist, begünstigen.
  • Im allgemeinen wird die eingeführte DNA relativ klein sein, das heißt kleiner als etwa 30 kb um jede Anfälligkeit gegenüber einem physikalischen, chemischen oder enzymatischen Abbau zu minimieren, von welchen bekannt ist, dass sie mit der Größe der DNA zunehmen. Wie oben erwähnt wird die Anzahl der Proteine, der RNA-Transkripte oder der Mischungen davon, die von den DNA-Molekülen kodiert werden, welche in das Pflanzengenom eingeführt werden, vorzugsweise präselektiert und definiert, bis sich zum Beispiel eins bis etwa 5–10 solcher Produkte der eingeführten DNAs gebildet haben können.
  • A. Vorbereitung einer Expressionskassette
  • Eine Expressionskassette gemäß der Erfindung kann ein rekombinantes DNA-Molekül umfassen, das ein präselektiertes DNA-Segment enthält, welches wirksam mit einem ScBV-Promotor verbunden und funktionell in einer Wirtszelle, vorzugsweise einer Pflanzenzelle ist. Vorzugsweise ist die Expressionskassette selbst chimär, das heißt die Kassette umfasst DNA von wenigstens zwei verschiedenen Spezies oder DNA von derselben Spezien, die in einer Weise verbunden oder assoziiert ist, wie sie in dem „nativen" oder Wildtyp der Spezien nicht vorkommt.
  • 1. DNA-Moleküle gemäß der Erfindung, die den ScBV-Promotor umfassen
  • Ein Promotor ist eine DNA-Region, die die Genexpression reguliert. Promotorregionen werden typischerweise in der flankierenden DNA-Sequenz stromaufwärts von der kodierenden Sequenz in Viren sowie prokaryotischen und eukaryotischen Zellen gefunden. Eine Promotorsequenz sorgt für die Regulation der Transkription der stromabwärts gelegenen Gensequenz und umfasst typischerweise von etwa 50 bis etwa 2000 Nukleotidbasenpaare. Promotorsequenzen können auch regulatorische Sequenzen wie Enhancersequenzen enthalten, die den Level der Genexpression beeinflussen. Einige isolierte Promotorsequenzen können für die Genexpression von heterologen DNAs sorgen, das heißt einer DNA, die unterschiedlich zu der nativen oder homologen DNA ist. Es ist auch bekannt, dass Promotorsequenzen stark oder schwach oder induzierbar sind. Ein starker Promotor sorgt für einen hohen Level der Genexpression, während ein schwacher Promotor für einen sehr niedrigen Level der Genexpression sorgt. Ein induzierbarer Promotor ist ein Promotor, der für ein An- und Abschalten der Genexpression als Antwort auf ein exogen zugegebenes Mittel oder einen Umwelt- oder Entwicklungsstimulus sorgt. Promotoren können auch für eine gewebespezifische oder entwicklungsbedingte Regulation sorgen. Eine isolierte Promotorsequenz, die ein starker Promotor für heterologe DNAs ist, ist vorteilhaft, weil sie für einen ausreichenden Level an Genexpression sorgt, um eine einfache Detektion und Selektion transformierter Zellen zu ermöglichen und für einen hohen Level an Genexpression sorgt, wenn dieser gewünscht wird.
  • Das DNA-Molekül der Erfindung umfasst ein präselektiertes DNA-Segment, das einen Zuckerrohr Bacilliformvirus (ScBV) -promotor umfasst. ScBV ist ein Pararetrovirus. Im Allgemeinen haben Pararetroviren einen Promotor, der die Transkription eines RNA-Transkripts steuert, das als beides, als eine Vorlage für die Replikation des viralen Genoms und als mRNA dient. Während der Replikation der zirkulären, doppelsträngigen, viralen DNA bindet das 3'-Ende der Wirts-tRNA nahe dem 5'-Ende des ScBV-Transkripts, um die DNA-Synthese durch die viruskodierte reverse Transkriptase zu primen. Folglich sind die ScBV-Promotoren im Allgemeinen 5' zu der tRNA-Bindungsstelle und 3' zu der 5'-Hälfte des dritten offenen Leserahmens (ORF III) in dem viralen Genom positioniert. Promotoren von ScBV-Isolaten können durch die Aufreinigung von Virion und/oder viraler DNA mittels der Methodologie beschrieben in Bouhida et al. (supra) vorbereitet und die Promotorregion kloniert werden, wobei Verfahren verwendet werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, beispielsweise das Screenen einer DNA-Expressionsbibliothek, die durch die Ligation des ScBV viralen DNA-Fragments mit einem screenbaren Markergen erstellt wurde. Als Alternative kann ein ScBV-Promotor von der viralen DNA unter Verwendung eines degenerierten Primers, zum Beispiel BADNAT (Lockhart und Olszewski, in: Proceedings of INIPAB Conference on Breeding Banana and Plantains for Pest and Disease, pp. 105–113 (1994)) und eines Primers, der an eine konservierte Region des viralen Genoms hybridisiert, zum Beispiel der tRNA- Bindungsstelle oder der DNA, die die virale Replikase kodiert, amplifiziert werden.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein isoliertes und aufgereinigtes DNA-Molekül, das ein präselektiertes DNA-Segment umfasst, das einen ScBV-Promotor umfasst, der SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 oder eine davon abweichende Nukleotidsequenz (siehe unten) umfasst. Es wird auch bevorzugt, dass die ScBV-Promotor-enthaltende DNA Sequenzen ausschließt, die die Translation des RNA-Transkripts, das durch den ScBV-Promotor generiert wird, inhibieren oder damit interferieren, zum Beispiel, wenn das RNA-Transkript einen hohen Grad an Sekundärstruktur hat oder potentielle Start (ATG) -kodons kodiert.
  • Ein präselektiertes DNA-Segment kann mit dem ScBV-Promotor mittels Standardverfahren kombiniert werden, wie sie in Sambrook et al. (In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)) beschrieben werden. Kurz, das präselektierte DNA-Segment kann stromabwärts von dem Promotor unter Verwendung von Restriktionsenzymen subkloniert werden, um sicherzustellen, dass die DNA in der richtigen Orientierung in Bezug auf den Promotor inseriert wird, so dass die DNA exprimiert werden kann. Ist das präselektierte DNA-Segment einmal wirksam mit dem Promotor verbunden, kann die so gebildete Expresionskassette in ein Plasmid oder in andere Vektoren subkloniert werden.
  • 2. Varianten des DNA-Moleküls gemäß der Erfindung
  • Nukleinsäuremoleküle, die Nukleotidsequenzvarianten des ScBV-Promotors kodieren, umfassend SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 und dergleichen, können durch eine Auswahl von Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, vorbereitet werden. Diese Verfahren umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, die Isolierung aus einer natürlichen Quelle (im Falle von natürlich auftretenden Nukleotidsequenzvarianten, zum Beispiel von anderen Isolaten des ScBV, die aus infiziertem Pflanzenmaterial isoliert wurden) oder die Vorbereitung mittels Oligonukleotid-vermittelter (oder sie directed) Mutagenese, PCR-Mutagenese und Kassettenmutagenese einer früher vorbereiteten, varianten oder einer nicht-varianten Version des ScBV-Promotors. Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese ist ein bevorzugtes Verfahren zur Vorbereitung von Nukleotidsubstitutionsvarianten des ScBV-Promotors. Diese Technik ist im Stand der Technik wohlbekannt, wie durch Adelman et al., DNA, 2, 183 (1983) beschrieben. Kurz, die ScBV-Promotor-DNA wird durch die Hybridisierung eines Oligonukleotids verändert, das die gewünschte Mutation zu einer DNA-Vorlage kodiert, wobei die Vorlage die einzelsträngige Form eines Plasmids oder Bakteriophagen ist, das oder der die unveränderte oder native DNA-Sequenz des ScBV-Promotors enthält. Nach der Hybridisierung wird eine DNA-Polymerase verwendet, um einen gesamten, zweiten, komplementären Strang von der Vorlage zu synthetisieren, was folglich zur Inkorporation des Oligonukleotidprimers führt und die ausgewählte Veränderung in dem ScBV-Promotor kodieren wird.
  • Im allgemeinen werden Oligonukleotide von wenigstens 25 Nukleotiden Länge verwendet. Ein optimales Nukleotid wird 12 bis 15 Nukleotide haben, die vollständig komplementär zu der Vorlage auf jeder Seite des Nukleotids oder der Nukleotide sind, das oder die die Mutation kodiert oder kodieren. Dieses stellt sicher, dass die Oligonukleotide richtig mit dem einzelsträngigen DNA-Vorlagemolekül hybridisieren werden. Die Oligonukleotide sind fertig synthetisiert, wobei Techniken verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt sind, wie diese, beschrieben durch Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 5765, (1978).
  • Die DNA-Vorlage kann durch jene Vektoren generiert werden, die sich entweder von Bakteriophage-M13-Vektoren (die kommerziell erhältlichen M13mp18 und M13mp19 Vektoren sind geeignet) ableiten oder jenen Vektoren, die einen einzelsträngigen Phagenreplikationsursprung enthalten, wie er von Viera et al., Meth. Enzymol., 153, 3 (1987) beschrieben wird. Auf diese Weise kann die DNA, die mutiert werden soll, in einen dieser Vektoren inseriert werden, um eine einzelsträngige Vorlage zu generieren. Die Herstellung der einzelsträngigen Vorlage wird in den Abschnitten 4.21–4.41 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y. 1989) beschrieben.
  • Alternativ kann die einzelsträngige DNA-Vorlage durch die Denaturierung doppelsträngiger Plasmid (oder anderer) -DNA unter Verwendung von Standardtechniken generiert werden.
  • Für die Veränderung der nativen DNA-Sequenz wird das Oligonukleotid an die einzelsträngige Vorlage unter geeigneten Hybridisationsbedingungen hybridisiert. Ein DNA-polymerisierendes Enzym, gewöhnlich das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, wird dann zugegeben, um den komplementären Strang zu der Vorlage zu synthetisieren, wobei das Oligonukleotid als ein Primer für die Synthese verwendet wird. Folglich wird ein Heteroduplexmolekül gebildet, so dass ein Strang der DNA die mutierte Form des ScBV-Promotors kodiert und der andere Strang (die ursprüngliche Vorlage) die native, unveränderte Sequenz des ScBV-Promotors kodiert. Dieses Heteroduplexmolekül wird dann in eine geeignete Wirtszelle transformiert, gewöhnlich einen Prokaryoten wie E. coli JM101. Nachdem die Zellen gewachsen sind, werden sie auf Agaroseplatten ausplattiert und gescreent, wobei der Oligonukleotidprimer mit 32-Phosphat radiomarkiert wurde, um die bakteriellen Kolonien, die die mutierte DNA enthalten, zu identifizieren. Die mutierte Region wird dann entfernt und in einen geeigneten Vektor zur Proteinherstellung untergebracht, im allgemeinen ein Expressionsvektor von der Art, die typischerweise für die Transformation eines geeigneten Wirts eingesetzt wird.
  • Das Verfahren, das direkt oben beschrieben wurde, kann so modifiziert werden, dass ein Homoduplexmolekül erzeugt wird, worin beide Stränge des Plasmids die Mutationen) enthalten. Die Modifikationen sind wie folgt: das einzelsträngige Oligonukleotid wird an die einzelsträngige Vorlage wie oben beschrieben angelagert. Eine Mischung aus drei Desoxyribonukleotiden, Desoxyriboadenosin (dATP), Desoxyriboguanosin (dGTP) und Desoxyribothymidin (dTTP) wird mit einem modifizierten Thiodesoxyribocytosin, genannt dCTP-(aS) (welches von der Amersham Cooperation erhältlich ist) kombiniert. Diese Mischung wird zu dem Vorlage-Oligonukleotidkomplex zugegeben. Auf die Zugabe einer DNA-Polymerase zu dieser Mischung wird ein zweiter Strang der DNA identisch zu der Vorlage, mit Ausnahme für die mutierte Base, generiert. Zusätzlich wird dieser neue DNA-Strang dCTP-(aS) anstelle von dCTP enthalten, welches dazu dient, den DNA-Strang vor dem Verdau mit Restriktionsendonukleasen zu schützen.
  • Nachdem der Vorlagenstrang der doppelsträngigen Heteroduplex mit einem geeigneten Restriktionsenzym genickt worden ist, kann der Vorlagenstrang mit der Exo-III-Nuklease oder einer anderen geeigneten Nuklease hinter der Region, die die zu mutagenisierende(n) Stelle(n) enthält, verdaut werden. Diese Reaktion wird dann angehalten, um ein Molekül zu hinterlassen, das nur teilweise einzelsträngig ist. Ein vollständige, doppelsträngige DNA-Homoduplex wird dann unter Verwendung der DNA-Polymerase in Anwesenheit aller vier Desoxyribonukleotidtriphosphate, ATP und der DNA-Ligase gebildet. Dieses Homoduplexmolekül kann dann in eine geeignete Wirtszelle wie E. coli JM101 transformiert werden.
  • Die Ausführungsformen der Erfindung umfassen ein isoliertes und aufgereinigtes DNA-Molekül, das ein präselektiertes DNA-Segment umfasst, das einen ScBV-Promotor umfasst, der SEQ ID NO: 3 oder Nukleotidsequenzvarianten von SEQ ID NO: 3 umfasst, die nicht die biologische Aktivität des Promotors reduzieren.
  • 3. Bevorzugte, präselektierte DNA-Segmente
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt ein Verfahren zur Einführung eines präselektierten DNA-Segments in fertile Pflanzen bereit, das, wenn das präselektierte DNA-Segment von dem ScBV-Promotor in der Pflanze exprimiert wird, der Pflanze eine gewünschte, agronomische Eigenschaft verleiht. Solche DNA-Segmente oder „Gene" werden zum Beispiel in Lundquist et al. (U.S. Patent No. 5,484,956), Lundquist et al. (U.S. Patent No. 5,508,468), Dobres (internationale Anmeldung PCT/US95/11231) und von K. Weising et al. (Ann. Rev. Genet., 22, 421 (1988), siehe Tabellen 1, 2 und 3) offenbart, wobei davon alle hierin durch Referenz enthalten sind. Die vorliegende Erfindung ist jedoch im Bereich nicht auf die präselektierten DNA-Segmente beschränkt, die eine gewünschte, agronomische Eigenschaft kodieren, da viele andere präselektierte DNA-Segmente, die Proteine oder RNA-Transkripte kodieren, den Pflanzen wünschenswerte Merkmale verleihen, innerhalb des Bereichs der Erfindung sind.
  • Bevorzugte, agronomische Eigenschaften, die durch das präselektierte DNA-Segment kodiert werden, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Insektenresistenz oder -toleranz, Herbizidresistenz oder -toleranz, Krankheitsresistenz oder -toleranz (zum Beispiel Resistenz gegenüber Viren oder Pilzpathogenen), Stresstoleranz (erhöhte Salztoleranz), verbesserter Nährwert oder gesteigerte Erträge. Genetische Studien haben zum Beispiel gezeigt, dass eine Pflanze, um der Infektion mit einem bestimmten Pflanzenpathogen zu widerstehen, ein Resistenz (R) -Gen haben muss, das direkt oder indirekt mit einem einzigen Avirulenz (avr) -Gen interagiert, das in dem Genom des Pathogens vorhanden ist. Folglich kann die Einführung eines präselektierten DNA-Segments, das ein R-Gen umfasst, in eine Pflanze, der das R-Gen fehlt, dieser Pflanze gegenüber einem Pathogen, welches das entsprechende avr-Gen exprimiert, eine Resistenz verleihen.
  • Eine gesteigerte Resistenz gegenüber Pilzinfektionen kann durch die Einführung eines präselektierten DNA-Segments in eine Pflanze erhalten werden, das ein mit der Pathogenese zusammenhängendes (PR für englisch pathogenesis related) Protein kodiert. PR-Proteine sind Proteine, die von Getreiden als Antwort auf eine Infektion durch einige pathogene Pilze synthetisiert werden (Scott, Australasian Plant Path., 23, 154 (1994)).
  • Eine gesteigerte Resistenz gegenüber viralen Infektionen kann durch die Einführung eines präselektierten DNA-Segments in eine Pflanze erhalten werden, das ein virales Hüllprotein kodiert. Nelson et al. (Bio/technol., 6, 403 (1988)) offenbart zum Beispiel, dass die Expression des Tabakmosaikvirus (TMV) -hüllproteins in einer Tomatenpflanze der Pflanze Toleranz gegenüber dem TMV und dem Tomatenmosaikvirus (ToMV), einem Virus verwandt mit dem TMV, verleiht. Clark et al. (Internationale Anmeldung PCT/EP92/03001) offenbart, dass die Expression des Maize Dwarf Mosaic Virus-Hüllproteins in Mais zu Pflanzen führt, die verringerte Erkrankungssymptome aufzeigen, wenn sie dem Virus exponiert werden.
  • Vaeck et al. (Nature, 328, 33 (1987)) offenbart, dass die Expression des Bacillus thurigenesis (Bt) -endotoxingens in Tabak, diese Pflanzen toleranter gegenüber einem Insektenbefall machte. Lundquist et al. (U.S. Patent No. 5,484,956) offenbart, dass die Expression des Gens, welches das Bt-Endotoxin kodiert, transgenem Mais eine Insektenresistenz verleiht.
  • Darüber hinaus wird vorgesehen, dass mehr als ein präselektiertes DNA-Segment in eine Pflanze eingeführt werden kann. Zum Beispiel kann ein Plasmid, das ein selektierbares Markergen (siehe unten) und ein Gen, das eine Resistenz gegenüber einem bestimmten Virus verleiht, beispielsweise dem Barley Yellow Dwarf Virus, in regenerierbare Pflanzenellen eingeführt werden.
  • 4. Optionale Sequenzen in der Expressionskassette
  • Die Expressionskassette kann optional auch andere DNA-Sequenzen enthalten.
  • a. Markergene
  • Um das Vermögen zu verbessern Transformanden zu identifizieren, mag jemand wünschen ein Markergen, das selektiert und gescreent werden kann, als oder zusätzlich zu dem exprimierbaren, präselektierten DNA-Segment einzusetzen. „Markergene" sind Gene, die Zellen, die das Markergen exprimieren, einen abweichenden Phänotyp verleihen und folglich erlauben, solche transformierten Zellen von Zellen, die keinen Marker haben, zu unterscheiden. Solche Gene können entweder einen selektierbaren oder screenbaren Marker kodieren, abhängig davon, ob der Marker ein Merkmal verleiht, auf welches man mit chemischen Mitteln ‚selektieren’ kann, das heißt durch die Verwendung eines selektiven Agenzes (zum Beispiel einem Herbizid, einem Antibiotikum oder dergleichen) oder ob der Marker einfach ein Merkmal ist, das man durch Beobachtung und Testen identifiziert kann, das heißt durch ‚Screenen’ (zum Beispiel die β-Glucuronidase). Natürlich sind im Stand der Technik viele Beispiele für geeignete Markergene bekannt und können in der Ausführung der Erfindung eingesetzt werden.
  • In den Begriffen selektierbare und screenbare Markergene sind auch Gene umfasst, die einen „sekretierbaren Marker" kodieren, dessen Sekretion als ein Mittel zur Identifizierung oder Selektion von transformierten Zellen detektiert werden kann. Beispiele umfassen Marker, die ein sekretierbares Antigen kodieren, das durch eine Antikörperinteraktion identifiziert werden kann, oder sogar sekretierbare Enzyme, die durch ihre katalytische Aktivität detektiert werden können. Sekretierbare Proteine fallen in eine Anzahl von Klassen, einschließlich kleiner, diffusionsfähiger Proteine, die beispielsweise durch einen ELISA detektierbar sind; kleine aktive Enzyme, die in der extrazellulären Lösung detektierbar sind (zum Beispiel α-Amylase, β-Lactamase, Phosphinotrizinacetyltransferase); und Proteine, die in der Zellwand inseriert oder verankert sind (zum Beispiel Proteine, die eine Leadersequenz umfassen, wie diejenige, die in der Expressionseinheit von Extensin oder Tabak-PR-S gefunden wird).
  • Elemente der vorliegenden Offenbarung sind im Detail durch die Verwendung bestimmter Markergene veranschaulicht, jedoch werden im Licht dieser Offenbarung zahlreiche andere, mögliche, selektierbare und/oder screenbare Markergene jenen, die auf diesem Gebiet Fachkenntnisse haben, zusätzlich zu den Nachstehenden offensichtlich sein. Folglich ist zu verstehen, dass die folgenden Diskussion vielmehr exemplarisch als vollständig ist. Im Licht der hierin offenbarten Techniken und der allgemeinen rekombinanten Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, macht die vorliegende Erfindung die Einführung eines jeden Gens, einschließlich der von Markergenen, in eine Rezipientenzelle möglich, um ein transformiertes Monokotyledon zu bilden.
  • 1. Selektierbare Marker
  • Mögliche selektierbare Marker zur Verwendung in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, ein neo-Gen (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet., 199, 183 (1985)), das eine Kanamyzinresistenz kodiert und durch die Verwendung von Kanamyzin, G418 und dergleichen selektiert werden kann; das npt II-Gen, das eine Paromomycinresistenz kodiert; das hyg-Gen, das eine Hygromycin-B-Resistenz kodiert; ein bar-Gen, das eine Bialaphosresistenz kodiert; ein Gen, das ein verändertes EPSP-Synthaseprotein kodiert (Hinchee et al., Biotech., 6, 915, (1988)), das folglich eine Glyphosatresistenz verleiht; ein Nitrilasegen wie bxn von Klebsiella ozaenae, das eine Resistenz gegenüber Bromoxynil verleiht (Stalker et al., Science, 242, 419 (1988)); ein mutiertes Acetolactatsynthasegen (ALS), das eine Resistenz gegenüber Imidazolinon, Sulfonylharnstoff und anderen ALS-inhibierenden Chemikalien verleiht (Europäische Patentanmeldung 154,204,1985); ein Methotrexatresistenz-DHFR-Gen (Thillet et al., J. Biol. Chem., 263, 12500 (1988)); ein Dalapondehalogenasegen, das eine Resistenz gegenüber dem Herbizid Dalapon verleiht; oder ein mutiertes Anthranilatsynthasegen, das eine Resistenz gegenüber 5-Methyltryptophan verleiht. Wo ein mutiertes EPSP-Synthasegen eingesetzt wird, kann ein zusätzlicher Vorteil durch die Inkorporation eines geeigneten Chloroplastentransitpeptids, CTP (Europäische Patentanmeldung 0,218,571, 1987), realisiert werden. Siehe auch Tabelle 1 von Lundquist et al. (U.S. Patent No. 5,484,956).
  • Eine veranschaulichende Ausführungsform eines selektierbaren Markergens, das geeignet ist verwendet zu werden, um Transformanden zu selektieren, ist das Gen, das das Enzym Phosphinotricinacetyltransferase kodiert wie das bar-Gen (siehe Somers et al., supra (1992)). Das Enzym Phosphinotricinacetyltransferase (PAT) inaktiviert den aktiven Bestandteil in dem Herbizid Bialaphos, Phosphinotricin (PPT). PPT inhibiert die Glutaminsynthase (Murakami et al., Mol. Gen. Genet., 205, 42 (1986); Twell et al., Plant Physiol., 91,1270 (1989)) was eine rasche Akkumulation von Ammoniak und den Zelltod hervorruft.
  • 2. Screenbare Marker
  • Screenabre Marker, die eingesetzt werden können, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, ein β-Glucuronidase oder uidA-Gen (GUS), das ein Enzym kodiert, für welches verschiedene, chromogene Substrate bekannt sind; ein R-Lokus-Gen, das ein Produkt kodiert, welches die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Farbe) in Pflanzengeweben reguliert (Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, pp. 263–282 (1988)); ein β-Lactamasegen (Sutcliffe, PNAS USA, 75, 3737 (1978)), das ein Enzym kodiert, für welches verschiedene chromogene Substrate bekannt sind (zum Beispiel PADAC, ein chromogenes Cephalosporin), ein xylE-Gen (Zukowsky et al., PNAS USA, 80, 1101 (1983)), das eine Catecholdioxygenase kodiert, die chromogene Catechole konvertieren kann; ein α-Amylasegen (Ikuta et al., Biotech., 8, 241 (1990)); ein Thyrosinasegen (Katz et al., J. Genet. Microbiol., 129, 2703 (1983), das ein Enzym kodiert, welches zur Oxidation von Thyrosin zu DOPA und Dopaquinon in der Lage ist, welches wiederum kondensiert, um die einfach zu detektierende Verbindung Melanin zu bilden; ein β-Galactosidasegen, das ein Enzym kodiert, für das es chromogene Substrate gibt; ein Luziferase (lux) -Gen (Ow et al., Science, 234, 856 (1986)), das eine Biolumineszenzdetektion ermöglicht; oder sogar ein Aequoringen (Prasher et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 126, 1259 (1985)), das in der kalziumsensitiven Biolumineszenzdetektion eingesetzt werden kann, oder ein grün fluoreszierendes Proteingen (Niedz et al., Plant Cell Reports, 14, 403 (1995)).
  • Ein weiterer screenbarer Marker, der für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen wird, ist die Leuchtkäferluziferase, die von dem lux-Gen kodiert wird. Die Anwesenheit des lux-Gens in transformierten Zellen kann unter Verwendung von zum Beispiel einem Röntgenfilm, einer Szintillationszählung, einer Fluoreszenzspektrophotometrie, von Schwachlichtvideokameras, photonenzählenden Kameras oder einer Multiwell-Luminometrie detektiert werden. Es ist auch vorgesehen, dass dieses System für das Screenen von Populationen auf Biolumineszenz wie auf Gewebekulturplatten oder sogar für das Screenen ganzer Pflanzen weiter entwickelt werden kann.
  • b. Andere Sequenzen
  • Transkriptionsenhancer oder Duplikationen von Enhancern können verwendet werden, um die Expression von einem bestimmten Promotor zu steigern. Beispiele für solche Enhancer umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Elemente des CaMV35S-Promotors und des Octopinsynthasegens (Last et al., U.S. Patent No. 5,290,924, herausgegeben am 1. März 1994). Es wird dargelegt, dass die Verwendung eines Enhancerelements wie dem ocs-Element und insbesondere viele Kopien des Elements bewirken werden die Transkriptionslevel von den benachbarten Promotoren zu steigern, wenn es in dem Kontext der Pflanzentransformation angewendet wird.
  • Da die DNA-Sequenz, die zwischen der Transkriptionsinitiationsstelle und dem Start der kodierenden Sequenz inseriert wurde, das heißt die untranslatierte Leadersequenz, die Genexpression beeinflussen kann, kann man auch eine bestimmte Leadersequenz verwenden. Bevorzugte Leadersequenzen umfassen jene, die Sequenzen umfassen, die ausgewählt wurden, um eine optimale Expression des zugeteilten Gens zu steuern, das heißt eine bevorzugte Konsensusleadersequenz zu umfassen, die die mRNA-Stabilität steigern oder aufrechterhalten kann und eine unpassende Initiation der Translation verhindert (Joshi, Nucl. Acid Res., 15, 6643 (1987)). Solche Sequenzen sind jenen, die auf diesem Gebiet Fachkenntnisse haben, bekannt. Einige Leadersequenzen jedoch, zum Beispiel die Leadersequenz des RTBV, haben einen hohen Grad an Sekundärstruktur, von der man erwarten wird, dass sie die mRNA-Stabilität und/oder die Translation der mRNA vermindert. Folglich werden Leadersequenzen, die keinen hohen Grad an Sekundärstruktur haben oder die einen hohen Grad an Sekundärstruktur haben, wobei die Sekundärstruktur nicht die mRNA-Stabilität inhibiert und/oder die Translation vermindert, oder Leadersequenzen, die sich von Genen ableiten, die in Pflanzen hoch exprimiert, werden besonders bevorzugt.
  • Regulatorische Elemente wie das Adh-Intron I (Callis et al., Genes Develop., 1, 1183 (1987)), das Saccharosesynthase-Intron (Vasil et al., Plant Physiol., 91, 5175 (1989)) oder das TMV-Omega-Element (Gallie et al., The Plant Cell, 1, 301 (1989)) können auch wo gewünscht umfasst sein. Weitere solche regulatorische Elemente, die in der Praxis der Erfindung nützlich sind, sind jenen, die auf diesem Gebiet Fachkenntnisse haben, bekannt.
  • Zusätzlich können Expressionskassetten konstruiert und eingesetzt werden, um das Genprodukt des präselektierten DNA-Segments auf ein intrazelluläres Kompartiment innerhalb der Pflanzenzelle zu richten oder ein Protein an die extrazelluläre Umgebung zu dirigieren. Dieses kann im Allgemeinen durch das Verbinden einer DNA-Sequenz, die eine Transit- oder Signalpeptidsequenz kodiert, mit der kodierenden Sequenz des präselektierten DNA-Segments erreicht werden. Das resultierende Transit- oder Signalpeptid wird das Protein zu einem bestimmten, intrazellulären bzw. extrazellulären Bestimmungsort transportieren und kann dann posttranslational entfernt werden. Transit- oder Signalpeptide wirken, indem sie den Transport von Proteinen über intrazelluläre Membranen, zum Beispiel die Membranen der Vakuole, Vesikel, Plastiden und Mitochondrien, erleichtern, während Signalpeptide die Proteine über die extrazelluläre Membran leiten. Durch die Erleichterung des Transports des Proteins in Kompartimente innerhalb oder außerhalb der Zelle können diese Sequenzen die Akkumulation des Genprodukts erhöhen.
  • Das Transit- oder Signalpeptid, das von dem präselektierten DNA-Segment kodiert wird, kann vielmehr zu einer bestimmte Organelle wie den Chloroplasten dirigiert werden, als dass es zum Cytoplasma dirigiert wird. Folglich kann die Expressionskassette ferner eine Chloroplasten-Transitpeptid-kodierende DNA-Sequenz umfassen, die wirksam zwischen einem ScBV-Promotor und dem präselektierten DNA-Segment eingebunden ist (für einen Review über plastid targeting Peptide siehe Heijne et al., Eur. J. Biochem., 180, 535 (1989); Keegstra et al., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40, 471 (1989)). Dieses wird beispielhaft durch die Verwendung des rbcS (RuBISCO)-Transitpeptids erläutert, das Proteine spezifisch zu den Plastiden dirigiert. Siehe zum Beispiel Glassman et al., U.S. Patent No. 5,258,300.
  • Es kann nützlich sein, DNA selbst innerhalb einer Zelle zielgerichtet zu dirigieren. Es kann zum Beispiel nützlich sein, eine eingeführte, präselektierte DNA zu dem Nukleus zu dirigieren, da dieses die Transformationsfrequenz steigern kann. Innerhalb des Nukleus selbst wäre es nützlich, ein Gen zielgerichtet zu dirigieren, um eine site spezifiic Integration zu erreichen. Es wäre zum Beispiel nützlich, ein durch Transformation eingeführtes Gen dazu zu bringen, ein existierendes Gen in der Zelle zu replazieren.
  • Wenn die Expressionskassette in eine Pflanzenzelle eingeführt werden soll, kann die Expressionskassette auch optional eine 3'-untranslatierte pflanzenregulatorische DNA-Sequenz umfassen, die als ein Signal wirkt, die Transkription zu terminieren und die Polyadenylierung der resultierenden mRNA vorsieht. Die 3'-untranslatierte, regulatorische DNA-Sequenz umfasst vorzugsweise von etwa 300 bis 1000 Nukleotidbasenpaare und enthält pflanzliche Transkriptions- und Translationsterminationssequenzen. Bevorzugte 3'-Elemente leiten sich von jenen des Nopalinsynthasegens von Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., Nucl. Acid Res., 11, 369 (1983)), dem Terminator für das T7-Transkript des Octopinsynthasegens von Agrobacterium tumefaciens und dem 3'-Ende des Proteaseinhibitor I- oder II-Gens aus Kartoffel oder Tomate ab, obwohl andere 3'-Elemente jenen, die auf diesem Gebiet Fachkenntnisse haben, bekannt sind, auch eingesetzt werden können. Diese 3' untranslatierten, regulatorischen Sequenzen können wie in An, Methods in Enzymology, 153, 292 (1987) beschrieben, erhalten werden oder sind bereits in Plasmiden von kommerziellen Quellen wie Clontech, Palo Alto und California erhältlich. Diese 3' untranslatierten, regulatorischen Sequenzen können wirksam mit dem 3'-Terminus des präselektierten DNA-Segments verbunden werden.
  • Es kann auch eine Expressionskassette in einen Expressionsvektor wie ein Plasmid eingeführt werden. Plasmidvektoren umfassen zusätzlich DNA-Sequenzen, die eine einfache Selektion, Amplifikation und Transformation der Expressionskassette in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen, zum Beispiel Vektoren die sich von pUC, pSK, pGEM, pSP oder pBS ableiten, bereitstellen. Folglich umfassen zusätzliche DNA-Sequenzen Replikationsursprünge, um eine autonome Replikation des Vektors bereitzustellen, selektierbare Markergene, die vorzugsweise Antibiotika- oder Herbizidresistenzen kodieren, einzigartige Multiple Cloning Sites, die mehrere Stellen vorsehen DNA-Sequenzen oder Gene zu inserieren, die in der Expressionskassette kodiert werden, und Sequenzen, die die Transformation von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen steigern.
  • Ein weiterer Vektor, der für die Expression in beiden, pflanzlichen und prokaryotischen Zellen, brauchbar ist, ist das binäre Ti-Plasmid (wie in Schilperoort et al. offenbart, U.S. Patent No. 4,940,838, herausgegeben am 10. Juli 1990), wie es durch den Vektor pGA582 exemplarisch erläutert wird. Dieser binäre Ti-Plasmid-Vektor ist früher durch An charakterisiert worden und von Dr. An erhältlich (siehe Methods in Enzymology, 153, 292 (1987)). Dieser binäre Ti-Vektor kann in prokaryotischen Bakterien wie E. coli und Agrobacterium repliziert werden. Die Agrobacterium-Plasmidvektoren können verwendet werden, um die Expressionskassette in Pflanzenzellen zu transferieren. Der binäre Ti-Vektor umfasst vorzugsweise den rechten und linken Rand der Nopalin T-DNA, um eine effiziente Pflanzenzell-Transformation bereitzustellen, ein selektierbares Markergen, einzigartige Multiple Cloning Sites in den T-Randregionen, den colE1-Replikationsursprung und ein weites Wirtsspektrumsreplikon des. Die binären Ti-Vektoren, die eine Expressionskassette gemäß der Erfindung tragen, können verwendet werden, um beide, prokaryotische und eukaryotische Zellen, zu transformieren, werden aber vorzugsweise verwendet, um Pflanzenzellen zu transformieren.
  • III. DNA-Übertragung
  • Die Expressionskassette oder der Expressionsvektor wird dann in eine Rezipientenzelle eingeführt, um eine transformierte Zelle zu bilden. Für die Einführung einer Expressionskassette in eine Pflanzenzelle wird die Häufigkeit des Auftretens, dass eine Pflanzenzelle DNA erhält, als niedrig angenommen. Darüber hinaus werden höchstwahrscheinlich nicht alle Rezipientenzellen, die ein DNA-Segment oder eine DNA-Sequenz erhalten, zu einer transformierten Zelle führen, worin die DNA stabil in das Pflanzengenom integriert und/oder exprimiert wird. Einige könnten nur eine anfängliche oder transiente Genexpression zeigen. Jedoch könnten bestimmte Zellen von praktisch jeder Pflanze stabil transformiert werden und diese Zellen zu transgenen Pflanzen regeneriert werden.
  • Ein präselektiertes DNA-Segment kann in Pflanzenzellen oder Geweben oder in prokaryotische oder eukaryotische nicht-pflanzliche Zellen durch derzeitig erhältliche Verfahren übertragen werden, die die Protoplastentransformation, das Tungston Whiskers (Coffee et al., U.S. Patent No. 5,302,523, herausgegeben am 12. April 1994), direkt durch Mikroorganismen mit infektiösen Plasmiden, infektiösen Viren, die Verwendung von Liposomen, die Mikroinjektion durch mechanische oder Laserstrahlverfahren, durch ganze Chromosomen oder Chromosomenfragmente, die Elektroporation, die Silikonkarbitfibern und das Mikroprojetilbombardement umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung erreicht die Einführung eines präselektierten DNA-Segments in monokotyle Zellen durch Transformationsverfahren, die besonders effektiv für Monokotyledonen sind und das Mikroprojetilbombardement (siehe Lundquist et al., U.S. Patent No. 5,538,877) umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind.
  • Es wurde gezeigt, dass die Einführung und Expression fremder Gene in dikotyle (breitblättrige) Pflanzen, wie Tabak, Kartoffel und Alfalfa unter Verwendung der tDNA des tumorinduzierienden (Ti) Plasmids von Agrobacterium tumefaciens möglich ist (siehe zum Beispiel Umbeck, U.S. Patent No. 5,004,863, und die internationale Anmeldung PCT/US93/02480). Unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken und Bakteriengenetik kann eine breite Auswahl fremder DNAs in die tDNA in Agrobacterium inseriert werden. Im Anschluss an die Infektion durch das Bakterium, das das rekombinante Ti-Plasmid enthält, wird die fremde DNA in das Wirtspflanzenchromosom inseriert, wobei folglich eine genmanipulierte Zelle und letztendlich eine genmanipulierte Pflanze hergestellt wird. Ein zweiter Ansatz ist es, wurzelinduzierende (Ri für Englisch Root inducing) Plasmide als Genvektoren einzuführen.
  • Dikotyledonen sind für die Transformation durch Agrobacterium empfänglich. Kürzlich wurde gezeigt, dass Reis und Mais, welche Monokotylen sind, ebenso für die Transformation durch Agrobacterium empfänglich sind. Viele andere, wichtige, monokotyle Getreidepflanzen jedoch, einschließlich Weizen, Gerste, Hafer, Sorghum, Hirse und Roggen sind bis jetzt noch nicht erfolgreich durch Agrobacterium transformiert worden. Das Ti-Plasmid jedoch könnte in der Zukunft so manipuliert werden, um als ein Vektor für diese anderen monokotylen Pflanzen zu fungieren. Zusätzlich könnte es unter Verwendung des Ti-Plasmids als ein Modellsystem möglich sein, artifiziell Transformationsvektoren für diese Pflanzen zu konstruieren. Ti-Plasmide könnten auch in monokotyle Pflanzen durch artifizielle Verfahren eingeführt werden, wie durch eine Mikroinjektion oder eine Fusion von monokotylen Protoplasten und bakteriellen Spheroplasten, die die T-Region enthalten, die dann in die pflanzliche, nukleäre DNA integriert werden kann.
  • Andere Transformationsverfahren für Dikotyledonen umfassen das Blattscheibenverfahren von Horsch et al. (Science, 227, 1229 (1985)) und wie von Fry et al. (Plant Cell Reports, 6, 321 (1987)) für Brassica napus adaptiert.
  • IV. Herstellung und Charakterisierung von stabil transgenen Pflanzen
  • Nach der Bewerkstelligung der Übertragung eines präselektierten DNA-Segments auf die Rezipientenzellen durch irgendeines der oben diskutierten Verfahren, involviert der nächste Schritt der Erfindung im Allgemeinen die Identifizierung der transformierten Zellen für die weitere Kultivierung und Pflanzenregeneration. Wie oben erwähnt kann man, um das Vermögen zu verbessern Transformanden zu identifizieren, ein selektierbares oder screenbares Markergen als oder zusätzlich zu dem exprimierbaren, präselektierten DNA-Segment einsetzen. In diesem Fall würde man dann im Allgemeinen die potentiell transformierte Zellpopulation durch die Exposition der Zellen zu einem selektiven Agens oder zu selektiven Agenzien untersuchen oder man würde die Zellen auf das gewünschte Markergenmerkmal screenen.
  • A. Selektion
  • Eine exemplarische Ausführungsform der Verfahren zur Identifizierung transformierter Zellen involviert die Exposition bombardierter Kulturen mit einem selektiven Agens wie einem metabolischen Inhibitor, einem Antibiotikum, einem Herbizid oder dergleichen, wie es hierin oben beschrieben wird. Zellen, die transformiert worden sind und die ein Markergen stabil integriert haben, das ihnen Resistenz gegenüber dem verwendeten, selektiven Agens verleiht, werden wachsen und sich in Kultur teilen. Sensitive Zellen werden nicht für eine weitere Kultivierung zugänglich sein.
  • Es wird ferner in Erwägung gezogen, dass Kombinationen von screenbaren und selektierbaren Markern zur Identifikation transformierter Zellen verwendet werden. In einigen Zell- oder Gewebetypen könnte ein Selektionsagens wie das Antibiotikum Kanamyzin oder G418 eine entweder nicht ausreichend selektive Abtötung bereitstellen, um deutlich transformierte Zellen zu identifizieren, oder könnte eine erhebliche, nicht-selektive Inhibierung von Transformanden und Nicht-Transformanden gleichermaßen verursachen, was folglich dazu führen könnte, dass die Selektionstechnik fehl schlägt. Es wird vorgeschlagen, dass die Selektion mit einer wachstumsinhibierenden Verbindung wie einem Antibiotikum, mit Konzentrationen unter jenen, die eine 100% Inhibition verursachen, gefolgt von dem Screenen des wachsenden Gewebes auf die Expression eines screenbaren Markergens wie gus (beta-Glucuronidase) oder lux (Luciferase) einem ermöglichen würde, Transformanden von Zellen oder Gewebetypen wiederzugewinnen, die für die Selektion alleine nicht zugänglich sind. Deshalb können Kombinationen von Selektion und Screening die Indentifikation von Transformanden in einer breiteren Auswahl von Zellen und Gewebetypen ermöglich.
  • B. Regeneration und Samenherstellung
  • Zellen, die die Exposition mit dem selektiven Agens überleben, oder Zellen, die in einer Screening-Untersuchung positiv gezählt wurden, können in Medien, die die Regeneration der Pflanzen unterstützen, kultiviert werden. Den transformierten Zellen, die durch Selektion oder Screening identifiziert wurden und in einem geeigneten Medium, das die Regeneration unterstützt, kultiviert wurden, wird dann ermöglicht werden, sich zu reifen Pflanzen zu regenerieren. Nachdem die Pflanzen das Stadium der Trieb- und Wurzelentwicklung erreicht haben, können sie für weiteres Wachstum und Testen in ein Gewächshaus transferiert werden.
  • Reife Pflanzen werden dann von Zellinien erhalten, die identifiziert werden, wenn sie das präselektierte DNA-Segment exprimieren. Wenn möglich werden die regenerierten Pflanzen selbst bestäubt. Zusätzlich werden Pollen, die von den regenerierten Pflanzen erhalten wurden, mit samengezogenen Pflanzen agronomisch wichtiger Pflanzengenotypen gekreuzt. In einigen Fällen wird Pollen von Pflanzen dieser Genotypen verwendet, um die regenerierten Pflanzen zu bestäuben. Das Merkmal wird genetisch durch die Auswertung der Merkmalssegregation in der Nachkommenschaft der ersten und der späteren Generationen charakterisiert. Die Erblichkeit und Expression in Pflanzen von Merkmalen, die in Gewebekultur selektiert wurden, sind von besonderer Wichtigkeit, falls die Merkmale kommerziell brauchbar sein sollen.
  • Regenerierte Pflanzen können wiederholt mit anderen Pflanzengenotypen gekreuzt werden, um das präselektierte DNA-Segment in das Genom der anderen Pflanzen einzukreuzen (für Englisch introgress). Dieser Prozess wird als Rückkreuzungskonversion bezeichnet. Wenn eine ausreichende Anzahl von Kreuzungen mit dem wiederauftretenden Elter vervollständigt worden sind, um ein Produkt des Rückkreuzungskonversionsprozesses herzustellen, welches im wesentlichen mit dem wiederaufgetretenen Elter isogen ist, mit Ausnahme für die Anwesenheit des eingeführten präselektierten DNA-Segments, wird die Pflanze wenigstens einmal selbst bestäubt, um eine homozygote, rückkreuzungskonvertierte Pflanze herzustellen, die das präselektierte DNA-Segment enthält. Die Nachkommen dieser Pflanzen sind eine echte Züchtung.
  • Alternativ werden Samen von transformierten Pflanzen, die von transformierten Gewebekulturen regeneriert wurden, auf dem Feld gezogen und selbst bestäubt, um echte Züchtungspflanzen zu generieren.
  • Sind die echten Züchtungslinien einmal selektiert, werden Testkreuzungen gemacht und es wird Hybridsame hergestellt. Die Nachkommen von diesen Pflanzen werden echte Züchtungslinien. Die Testkreuzungshybriden und Züchtungspopulationen werden in mehreren verschiedenen Anordnungen auf dem Feld angepflanzt. Ein Evaluationsschema ist, die Populationen von Hybridpflanzen, die das präselektierte DNA-Segment enthalten, an vielen verschiedenen Orten wachsen zu lassen und die Leistung der Pflanzen an diesen verschiedenen Orten zu messen. Informationen werden gewonnen, sowie andere Messungen der Pflanzengesundheit, der Überlegenheit und der Lebensfähigkeit werden gemacht. Die Informationen bezüglich der Leistung dieser Hybriden einhergehend mit der Leistung von nicht-transformierten Hybriden wird verglichen.
  • Auf die Identifikation der besseren Leistung der transgenen Pflanzen sind die Elternselektionen besser und es wird eine Inzuchtlinie mittels konventioneller Zuchttechniken hergestellt. Die Hybridpflanzen, die ein oder mehrere Eltern haben, die das präselektierte DNA-Segment enthalten, werden in kommerziellen Tests und Evaluationsprogrammen getestet und die Leistung dokumentiert. Dieses Testen schließt die Evaluation der Leistungsmerkmale ein, durchgeführt über einen weiten geographischen Bereich, sowie die Verwendung der dedizierten Merkmale, um einen Leistungsvorteil und infolge dessen, den Wert aufzuzeigen.
  • Ein zusätzlicher Vorteil der Expression des präselektierten DNA-Segments ist die überlegene Leistung der elterlichen Linien bei der Produktion von Hybriden.
  • C. Charakterisierung
  • Um die Anwesenheit des oder der präselektierten DNA-Segment oder Segmente oder „transgens" oder „transgene" in den regenerierten Pflanzen zu bestätigen, kann eine Auswahl von Untersuchungen durchgeführt werden. Solche Nachweise schließen zum Beispiel ein „molekularbiologische" Nachweise, die jenen, welche auf diesem Gebiet Fachkenntnisse haben, gut bekannt sind, wie Southern und Northern Blotting und PCR; „biochemische" Nachweise wie die Detektion der Anwesenheit eines Proteinprodukts, zum Beispiel durch immunologische Mittel (ELISA's und Western Blots) oder durch die enzymatische Funktion; Pflanzenteilnachweise wie Blatt- oder Wurzelnachweise; und auch durch die Analyse des Phänotyps der gesamten regenerierten Pflanze.
  • 1. DNA-Integration, RNA-Expression und Vererbung
  • Genomische DNA kann aus Kalluszellinien oder jedem Pflanzenteil isoliert werden, um die Präsenz des präselektierten DNA-Segments zu bestimmen, wobei Techniken verwendet werden, die jenen, die auf diesem Gebiet Fachkenntnisse haben, gut bekannt sind. Bitte nehmen sie zur Kenntnis, dass die intakte Sequenz nicht immer vorhanden sein muß, vermutlich aufgrund von Rearrangements oder Deletionen von Sequenzen in der Zelle.
  • Die Präsenz von DNA-Elementen, die mittels der Verfahren gemäß Erfindung eingeführt wurden, kann durch die Polymerasekettenreaktion (PCR für Englisch polymerase chain reaction) bestimmt werden. Unter Verwendung dieser Technik werden diskrete DNA-Fragmente amplifiziert und mittels Gelelektrophorese detektiert. Diese Art von Analyse erlaubt einem zu bestimmen, ob ein präselektiertes DNA-Segment in einem stabilen Transformanden vorhanden ist, aber es weißt nicht die Integration des eingeführten, präselektierten DNA-Segments in das Wirtszellgenom nach. Zusätzlich ist es nicht möglich unter Verwendung von PCR-Techniken zu bestimmen, ob die Transformanden exogene Gene haben, die an verschiedene Stellen in das Genom eingeführt wurden, d. h. ob die Transformanden von einem unabhängigen Ursprung sind. Es wird in Erwägung gezogen, dass es unter Verwendung von PCR-Techniken möglich wäre, Fragmente der genomischen DNA des Wirts zu klonen, die zu einem eingeführten, präselektierten DNA-Segment benachbart sind.
  • Eine positive Probe für die DNA-Integration in das Wirtszellgenom und die unabhängigen Identitäten der Transformanden können unter Verwendung der Southern Hybridisationstechnik bestimmt werden. Unter Verwendung dieser Technik können spezifische DNA-Sequenzen, die in das Wirtszellgenom eingeführt worden sind und die Wirts-DNA-Sequenzen flankieren, identifiziert werden. Infolge dessen dient das Southern-Hybridisationsmuster für einen gegebenen Transformanden als ein Identifikationskennzeichen dieses Transformanden. Zusätzlich ist es mittels Southern Hybridisation möglich, die Anwesenheit von eingeführten, präselektierten DNA-Segmenten in DNA hohen Molekulargewichts zu demonstrieren, d. h. zu bestätigen, dass das eingeführte, präselektierte DNA-Segment in das Wirtszellgenom integriert worden ist. Die Technik der Southern-Hybridisation stellt Informationen bereit, die unter Verwendung von PCR erhalten wird, zum Beispiel die Anwesenheit eines präselektierten DNA-Segments, aber demonstriert auch die stabile Integration in das Genom und kennzeichnet jeden individuellen Transformanden.
  • Es wird in Erwägung gezogen, dass man unter Verwendung der Techniken der Dot- oder Slot-Blot-Hybridisierung, welche Modifikationen der Southern-Hybridisationstechniken sind, die selbe Information erhalten kann, die aus der PCR abgeleitet wird, zum Beispiel die Anwesenheit eines präselektierten DNA-Segments.
  • Beides, die PCR und Southern Hybridisationstechniken, können verwendet werden, um die Übertragung eines präselektierten DNA-Segments auf die Nachkommenschaft zu demonstrieren. In den meisten Fällen wird das kennzeichnende Southern-Hybridisationsmuster für einen gegebenen Transformanden in der Nachkommenschaft als eines oder mehrere, mendelsche Gene segregieren (Spencer et al., Plant Mol. Biol., 18, 201 (1992); Laursen et al., Plant Mol. Biol., 24, 51 (1994)), wobei die stabile Vererbung des Gens angezeigt wird.
  • Während DNA-Analysetechniken unter Verwendung von DNA durchgeführt werden können die aus jedem Teil einer Pflanze isoliert worden ist, mag RNA nur in bestimmten Zellen oder Gewebetypen exprimiert sein und es wird infolge dessen nötig sein, RNA für die Analyse aus diesen Geweben vorzubereiten. PCR-Techniken können auch zur Detektion und Quantifizierung von RNA verwendet werden, die von den eingeführten, präselektierten DNA-Segmenten hergestellt wurden. Bei dieser Anwendung der PCR ist es als erstes nötig, die RNA revers in DNA zu transkribieren, wobei Enzyme wie die reverse Transkriptase verwendet werden, und dann die DNA unter Verwendung konventioneller PCR-Techniken zu amplifizieren. In den meisten Fällen werden PCR-Techniken, obwohl nützlich, nicht die Integrität des RNA-Produkts demonstrieren. Weitere Informationen über die Beschaffenheit des RNA-Produkts kann durch Northern Blotting erhalten werden. Diese Technik wird die Anwesenheit einer RNA-Spezies demonstrieren und Informationen über die Integrität dieser RNA ergeben. Die An- oder Abwesenheit einer RNA-Spezies kann auch unter Verwendung von Dot- oder Slot-Blot-Northern-Hybridisierungen bestimmt werden. Diese Techniken sind Modifikationen des Northern Blottings und werden nur die An- oder Abwesenheit einer RNA-Spezies demonstrieren.
  • 2. Genexpression
  • Während Southern Blotting und PCR verwendet werden können um das in Frage gestellte, präselektierte DNA-Segment zu detektieren, stellen sie keine Informationen dahingehend bereit, ob das präselektierte DNA-Segment exprimiert sein wird. Die Expression kann durch die spezifische Identifizierung des Proteinprodukts der eingeführten, präselektierten DNA-Segmente oder die Evaluation der phänotypischen Veränderungen, die durch ihre Expression herbeigeführt werden, evaluiert werden.
  • Untersuchungen zur Herstellung und Indentifizierung spezifischer Proteine kann sich physikalisch-chemische, strukturelle, funktionelle oder andere Eigenschaften der Proteine zu Nutze machen. Einmalige, physikalischchemische oder strukturelle Eigenschaften erlauben die Proteine zu separieren und durch elektrophoretische Verfahren zu identifizieren, wie native oder denaturierende Gelelektrophorese oder isoelektrische Fokussierung oder chromographische Techniken wie Ionenaustauscher oder Gelausschlußchromatographie. Spezifische Antikörper können verwendet werden, um die einzigartigen Strukturen von Proteinen mittels Aufmachungen wie einer ELISA-Untersuchung zu detektieren, zum Beispiel um npt II zu detektieren. Kombinationen dieser Ansätze können eingesetzt werden, um eine noch höhere Spezifität zu erhalten, die dem Western Blotting, bei welchem Antikörper verwendet werden, die an individuelle Genprodukte binden, die durch elektrophoretische Techniken aufgetrennt worden sind. Zusätzliche Techniken können eingesetzt werden, um unumschränkt die Identität des Produkts von Interesse zu bestätigen, wie die Evaluation durch eine Aminosäuresequenzierung in Folge einer Aufreinigung. Obwohl diese Verfahren zu den am häufigsten eingesetzten Verfahren gehören, können andere Verfahren zusätzlich verwendet werden.
  • Es können auch Untersuchungsverfahren verwendet werden, um die Expression von Proteinen durch ihre Funktionalität zu identifizieren, insbesondere die Fähigkeit von Enzymen spezifische, chemische Reaktionen zu katalysieren, die spezifische Substrate und Produkte miteinbeziehen. Diese Reaktionen können durch die Bereitstellung und Quantifizierung des Substratverlusts oder der Generierung von Produkten dieser Reaktionen von physikalischen oder chemischen Verfahren gefolgt sein.
  • Die Expression eines Genprodukts ist sehr häufig durch die Evaluation der phänotypischen Ergebnisse ihrer Expression bestimmt. Diese Untersuchungen können auch viele Formen annehmen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, der Analyse der Veränderungen in der chemischen Zusammensetzung, Morphologie oder der physiologischen Eigenschaften der Pflanze. Die chemische Zusammensetzung kann durch die Expression der präselektierten DNA-Segmente verändert werden, die Proteine kodieren, die die Pigmentierung von Pflanzenteilen betreffen und können phänotypisch oder durch ein Produkt detektiert werden, das vermehrt wird, wenn das Protein, das durch das präselektierte DNA-Segment kodiert ist, exprimiert wird, was durch eine Hochleistungs-Flüssigchromatographie oder einen ELISA (zum Beispiel npt II) analysiert werden kann.
  • D. Etablierung der eingeführten DNA in andere Pflanzenvarietäten
  • Fertile, transgene Pflanzen können dann in einem konventionellen Pflanzenkreuzungsprogramm verwendet werden, um das präselektierte DNA-Segment in die gewünschten Linien oder Varietäten zu inkorporieren.
  • Im Allgemeinen wird der kommerzielle Wert der transformierten Pflanze, die hierin hergestellt wird, am höchsten sein, falls das präselektierte DNA-Segment in viele verschiedene Hybridkombinationen inkorporiert werden kann. Ein Landwirt baut typischerweise mehrere Hybriden an, basierend auf Unterschieden in der Reife, der Standabilität und anderen agronomischen Merkmalen. Außerdem muss der Landwirt basierend auf seiner oder ihrer geographischen Lage eine Hybride auswählen, da Hybriden, die zu einer Region adaptiert sind, generell nicht zu anderen Regionen adaptiert sind, aufgrund der Unterschiede in solchen Merkmalen wie Reife, Krankheits-, Dürre- und Insektenresistenz. Als solches ist es notwendig das Gen in eine große Anzahl parentaler Linien zu inkorporieren, sodass viele Hybridkombinationen hergestellt werden können, die das präselektierte DNA-Segment enthalten.
  • Pflanzenkreuzung und die Techniken und Fertigkeiten, die verlangt sind, um Gene von einer Linie oder Varietät zu einer Anderen zu Transferrieren, sind jenen, die auf diesem Gebiet Fachkenntnisse haben, gut bekannt. Folglich kann die Einführung eines präselektierten DNA-Segments, vorzugsweise in Form von rekombinanter DNA, in irgendeine andere Linie oder Varietät durch diese Zuchtverfahren bewerkstelligt werden.
  • E. Verwendung transgener Pflanzen
  • Es wird erwartet, dass die transgenen Pflanzen, die hierin hergestellt werden, nützlich für eine Vielfalt kommerzieller Zwecke und Forschungszwecke nützlich sind. Transgene Pflanzen können für die Verwendung in der traditionellen Landwirtschaft kreiert werden, um Merkmale zu besitzen, die für den Erzeuger von Vorteil sind (zum Beispiel agronomische Merkmale wie die Resistenz gegenüber einem Wasserdefizit, eine Schädlingsresistenz, eine Herbizidresistenz oder ein gesteigerter Ertrag), die für den Konsumenten des von der Pflanze geernteten Getreides von Vorteil sind (zum Beispiel ein verbesserter Nährwert in der menschlichen Nahrung oder im Tierfutter) oder die für den Essensverarbeiter von Vorteil sind (zum Beispiel verbesserte Verarbeitungsmerkmale). In solchen Anwendungen werden die Pflanzen im Allgemeinen für die Verwendung ihres Getreides in Lebensmitteln für Menschen oder Tiere angebaut. Andere Teile der Pflanzen jedoch, einschließlich der Stengel, den Schalen, den vegetativen Teilen und dergleichen, können auch einen Nutzen haben, einschließlich einer Verwendung als Tiersilage oder für dekorative Zwecke. Häufig werden chemische Getreidebestandteile für Nahrungsmittel und industrielle Verwendung extrahiert und es können transgene Pflanzen kreiert werden, die gesteigerte oder veränderte Level solcher Komponenten haben.
  • Transgene Pflanzen können auch in der kommerziellen Herstellung von Proteinen oder anderen Verbindungen Nutzen finden, wo die Verbindung von Interesse aus Pflanzenteilen, Samen oder dergleichen extrahiert oder aufgereinigt wird. Zellen oder Gewebe von diesen Pflanzen können kultiviert, in vitro gewachsen oder fermentiert werden, um solche Moleküle herzustellen.
  • Transgene Pflanzen können auch in kommerziellen Züchtungsprogrammen verwendet werden oder können mit Pflanzen verwandter Getreidearten gekreuzt oder gezüchtet werden. Die Verbesserungen, die von dem präselektierten DNA-Segment kodiert werden, können zum Beispiel von Zellen der einen Pflanzenspezies zu Zellen der anderen Pflanzenspezies, zum Beispiel durch Protoplastenfusion, übertragen werden.
  • Die transgenen Pflanzen können viele Verwendungen in der Forschung oder Züchtung haben, einschließlich der Kreation neuer, mutanter Pflanzen durch Insertionsmutagenese, um vorteilhafte Mutanten zu identifizieren, die später durch traditionelle Mutation und Selektion kreiert werden könnten. Ein Beispiel wäre die Einführung einer rekombinanten DNA-Sequenz, die ein transponierbares Element kodiert, das für die Generierung einer genetischen Variation verwendet werden kann. Die Verfahren gemäß der Erfindung können auch verwendet werden, um Pflanzen zu kreieren, die einmalige „Signatursequenzen" oder andere Markersequenzen haben, die verwendet werden können, um geschützte Linien oder Varietäten zu identifizieren.
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben werden.
  • Beispiel I
  • Expressionskassetten für die Pflanzentransformation
  • Um eine Expressionskassette, die einen ScBV-Promotor umfasst, werden drei Regionen des ScBV-Genoms mittls der Polymerasekettenreaktion (PCR für Englisch polymerase chain reaction) amplifiziert. Die Regionen sind stromaufwärts der offenen Leseramen und stromabwärts einer putativen tRNA-Bindungsstelle und umfassen keine AUG-Codons. Die PCR setzt einen BamHI-linearisierten pScBV-20 als die Vorlage ein (Bouhida et al., J. Gen. Virol., 74, 1 (1993)). Die Primer-Paare, die in der PCR eingesetzt werden, sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Amplifikationsreaktionen ergaben sich in den folgenden Regionen des ScBV-Genoms, das amplifiziert wurde: Nukleotidpositionen 5999–7205 (amplifiziert mit dem Primer SCBV-PRO FORW-5999, SEQ ID NO: 6 und dem Primer SCBV-PRO REV-7205, SEQ ID NO: 7), 5999–7299 (amplifiziert mit dem Primer SCBV-PRO FORW-5999, SEQ ID NO: 6 und dem Primer SCBV-PRO REV-7299, SEQ ID NO: 8) und 5999–7420 (amplifiziert mit dem Primer SCBV-PRO FORW-5999, SEQ ID NO: 6 und dem Primer SCBV-PRO REV-7420, SEQ ID NO: 9) (entsprechend dem Nummerierungssystem in Bouhida et al., supra). SCBV-PRO FORW-5999 wurde so synthetisiert, dass er eine PstI-Stelle umfasste. ScBV-PRO REV-7205, SCBV-PRO REV-7299 und SCBV-PRO REV-7420 wurden so synthetisiert, dass sie eine StuI-Stelle umfassten. Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte mit PstI und StuI verdaut und dann Gel-aufgereinigt.
  • Um Expressionsvektoren für Monokotyledonen vorzubereiten, wurden die Gelfragmente mit pMON755i ligiert (Medberry und Olszewski, Plant J., 3, 619 (1993)), der mit Pst1 und Stu1 verdaut wurde, um das CaMV35S-Promotorfragment zu entfernen. pMON755i wurde von pMON755 abgeleitet (Medberry et al., The Plant Cell, 4, 185 (1992)), indem ein modifizierten Mais-Alkoholdehydrogenase ersten Intronsegments 5' zu dem GUS-Gen inseriert wurde. Die resultierenden Plasmide wurden mit ScBV-1 (5999–7205), ScBV-2 (5999–7299) und ScBV-3 (5999–7240) bezeichnet.
  • Tabelle 1
    Figure 00440001
  • Um Expressionsvektoren für die Agrobakterium-vermittelte Transformation vorzubereiten, wird ein binärer Expressionsvektor konstruiert. ScBV-3 wurde mit PstI und StuI verdaut und ein 1,4 kb ScBV-enthaltendes Fragment an pBluescriptKS+ ligiert (Stratagene, La Jolla, CA), der mit SpeI verdaut worden ist, die überhängenden Enden mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt wurden und dann mit Pst1 verdaut wurde. Aus dem resultierenden Konstrukt wurde ein XhoI-XbaI-Fagment isoliert und mit pOCA101 ligiert, das mit Sal1 und Xba1 verdaut worden ist. pOCA101 ist ein Derivat von pOCA28 (Medberry et al., Nucl. Acids Res., 18, 5505 (1990)), in welchem der Polylinker durch ein HindIII-EcoRI-Fragment ersetzt wird, welches das GUS-Gen enthält. pOCA28 (Olszewski et al., Nucl. Acids Res., 16, 10765 (1988)) hat ein Smr/Spcr-Gen von pHP45omega (Prenti und Kritsch, Gene, 28, 303 (1984)), das ein BglII/SmaI-Fragment ersetzt, das eine Tetrazyklinresistenz enthält.
  • Um die Transkriptionsstartstelle eines ScBV-Promotors zu kartieren, wird ein markierter Primer oder ein markiertes DNA-Fragment und RNA, die von dem ScBV-Promotor gebildet wurde, in einer Primer-Extensionsreaktion und/oder einer S1-Nukleasereaktion eingesetzt. Ein nützlicher Primer, um die Transkriptionsstartstelle eines ScBV-Promotors zu kartieren, ist in Tabelle 1 gezeigt (MAP-SCBV-GUS: SEQ ID NO: 10).
  • Beispiel II
  • Monokotyledonen- (Hafer) Transformation mit ScBV-Prhomotor-Konstrukten
  • Transiente Expressionsanalysen in Mais (unter Verwendung von Black Mexican Sweet-Zellen, „BMS"-Zellen) und Haferssuspensionskulturen zeigten, dass ScBV-3 die höchsten Expressionslevel ergab. Insbesondere in BMS-Zellen verlieh ScBV-3 eine Expression, die zu etwa 25 und 800 mal mehr unabhängigen Ereignissen führte, die GUS-exprimierende Zellen hervorbrachten, als die Expression die von ScBV-2 bzw. pScBV-1 verliehen wird.
  • Unreife Haferembryonen (Avena sativa L. Varietät GP-1) wurden verwendet, um Kallus zu initiieren. Bröckliger, embryogener Kallus wurde visuell unter Verwendung eines low power microscopes (6,6x) selektiert und alle zwei Wochen auf MS2D-Medium, das MS-Salze enthält (Torbert et al., supra) subkultiviert. Gewebe, das sich von dem Kallus ableitet, wurde auf festes MS2D-Medium, das 0,2 M Sorbitol und 0,2 M Mannitol enthielt, als eine Osmotikum-Vorbehandlung für 4 Stunden vor dem Mikroprojektilbombardement, wie es von Vain et al. beschrieben wird (Plant Cell Reports, 12, 84 (1993)), ausplattiert.
  • Im Allgemeinen können entweder Wolfram- (1,1 Mikron; M-17; Biorad Laboratories, Hercules, CA) oder Gold- (1,0 Mikron; M-17; Biorad Laboratories, Hercules, CA) Partikel für das Mikropartikelbombardement eingesetzt werden. Es werden etwa 60 mg trockene Wolfram- oder Goldpartikel in 1 ml 100% Ethanol in ein Mikrotube gegeben. Das Tube wird kräftig für 1–2 Minuten gevortext oder unter Verwendung eines Standardaufsatzes bei niedriger Leistung für 30 Sekunden sonifiziert. Das Vortexen wird dreimal wiederholt. Dann wird das Mikrotube einer Zentrifugation bei 10000 rpm für eine Minute unterworfen. Der Überstand wird entfernt und 1 ml steriles, destilliertes Wasser zugegeben, die Partikel resuspendiert, zentrifugiert und der Überstand entfernt. Dieses Verfahren wird einmal mehr wiederholt. Die Partikel werden dann in 1 ml steriles, destilliertes Wasser resuspendiert. Fünfzig Mikroliter, genug 4–8 Bombardements, werden unter Vortexen in Mikrotubes aliquotiert. Wolfram- oder Goldaliquots werden bei –20°C aufbewahrt.
  • Zu einem einzigen 50 ml Partikelaliquot wird unter kontinuierlicher Bewegung das folgende inder folgenden Reihenfolge zugegeben: 5 μl DNA (1 μg/μl), 50 μl 2,5 M CaCl2 und 20 μl 0,1 M Spermidin (freie Base, tissue culture grade, Sigma Chemical Co.). Die Mischung wird für drei Minuten gevortext, einer Zentrifugation bei 10000 rpm für 10 Sekunden unterworfen und der Überstand entfernt. Die DNA-beschichteten Partikel werden mit 250 μl 100% Ethanol durch kurzes Vortexen gewaschen, dann einer Zentrifugation unterworfen und der Überstand entfernt. Die Partikel werden dann in 60 μl 100% Ethanol resuspendiert. Dann werden 5–10 μl der Suspension auf das Zentrum eines Macrocarriers aufgetragen. Der Suspension wird in einer erschütterungsfreien Umgebung mit geringer Luftfeuchtigkeit für etwa 1 Minute erlaubt zu trocknen.
  • Etwa 800 mg wurden in die Mitte einer Petrischale gegeben. Die Schale wurde 5 cm unter die Halteplatte positioniert und das Gewebe mit Goldpartikel, die mit pSCBV-3 und einem Plasmid beschichtet waren, das den npt II-Selektionsmarker für Pflanzen verbunden mit dem CaMV35S-Promotor enthielt (pH 24, siehe Torbert et al., supra) (0,625 μg/Bombardement) unter Verwendung des Biolistic® PDS-1000/He Partikelübertragungssystems (BioRad Laboratories, Hercules, CA), das entsprechend den Angaben des Herstellers betrieben wurde, bombardiert.
  • Das Gewebe blieb über Nacht auf dem Osmotikummedium (MS2D plus 0,4 M Osmotikum) und wurde auf MS2D Erhaltungsmedien für 7 Tage bei 20°C im Dunkeln transferiert. Das transformierte Gewebe wurde auf Selektionsmedium transferriert, das 50 mg/L Paromomyzin enthielt und das mit 0,35% low EEO Typ I Agarose (Sigma Chemical Co.) verfestigt wurde, und alle zwei Wochen subkultiviert (Torbert et al., supra). Wachsende Kolonien wurden nach etwa 6–8 Wochen isoliert und es wurde ihnen gestattet bis zu etwa vier weitere Wochen zu wachsen. Es wurden Triebe in Triebregenerationsmedium regeneriert (MS-Salze plus Thiamin-HCL, 20 g/L Saccharose, 2 mg/L NAA, 0,2 mg/L, BAP, 50 mg/L Paromomycin, pH 5,8, verfestigt mit 0,35% low EEO Typ I Agarose). Wurzeln wurden in Wurzelregenerationsmedium regeneriert (MS-Salze plus Thiamin-HCL verfestigt mit 0,35% niedrig EEO Typ I Agarose). Die Pflanzen wurden dann in Erde eingesetzt und bis zur Reife herangezogen.
  • Tabelle 2
    Figure 00480001
  • In stabil transformierten Geweben von A. sativa verlieh ScBV-3 den vegetativen Organen und in besonderem Maße dem Stengel (5E) eine konstitutive GUS-Expression. Im Blatt jedoch verlieh ScBV-3 ein Expressionsmuster, das meistens, aber nicht ausschließlich auf das vaskuläre Gewebe (5F) begrenzt ist. ScBV-3 führte auch zu einer konstitutiven GUS-Expression in den Blütenorganen wie der Palea, dem Lemma und dem Fruchtknoten (5D und 5B).
  • Regenerierte Pflanzen (T0-Generation) wurden auf die GUS-Aktivität gescreent. Es wurden 56 Pflanzen und in einigen Fällen viele Pflanzen von demselben Kallus wiedergewonnen. Pflanzen, die sich von demselben Kallus ableiten, wurden als eine Linie definiert. Da Pflanzen, die sich von demselben Kallus ableiten, potentiell unabhängige Ereignisse repräsentieren könnten, wurden Daten von Pflanzen, die von einem individuellen Kallus wiedergewonnen wurden, zusammengefasst. Die Hafergewebe wurden von Hand von den Pflanzen mit Blütenorganen und grünem, vegetativem Gewebe geschnitten.
  • Es wurden 23 stabil transformierte unabhängige Linien auf die GUS-Expression analysiert. Die Pflanzengewebe wurden mit einem GUS-histochemischen Färbepuffer in der Anwesenheit von 1 : 5000 (v/v) -Lösung des Detergens Silwet L-77 (OSI Specialitites, Charleston, WV) gefärbt und für 20 min. einem Vakuum unterworfen. Die Gewebe wurden für 8–48 Stunden bei Raumtemperatur gefärbt, für 24 Stunden entfärbt und in 70% Ethanol für die Analyse aufbewahrt. Die GUS-Expression wurde unter einem Disektinn Mmikroskop gezählt. Die Ergebnisse der GUS-Analyse sind in Tabelle 2 dargestellt. Eine GUS-Aktivität wurde in beinahe allen getesteten Organen von A. sativa detektiert und Linien mit einer GUS-Aktivität in einem Organ tendierten dazu, eine Aktivität in allen der getesteten Organen zu haben. Stengel, Palea, Deckspelze (Lemma) und Fruchtknoten hatten die höchsten Expressionslevel. Darüber hinaus hatten von den 23 getesteten, unabhängigen Linien über 82% detektierbare Level einer GUS-Expression in Blatt, Stengel, Blütenstandsstiel (Peduncle), Rachis, Spelze (Glume), Blütenstandsseitenachse (Rachilla), Palea, Deckspelze (Lemma), Anthere und Fruchknoten. Die Npt II-Level in den Pflanzenzellen, -Teilen oder -Geweben wurden durch einen NPTII -ELISA-Assay (5'-3', Boulder, CO) bestimmt, wie es auch in Torbert et al. (supra) beschrieben wird. Npt II wird in allen Linien, die GUS exprimieren, detektiert.
  • Es wurden A. sativa-Blümchen von reifen Pflanzen (kein vegetatives Gewebe) gesammelt. T1-Samen wurden durch Selbstbestäubung der T0-Pflanzen hergestellt. Diese Samen wurden geschält und dann durch das Einweichen zuerst in 95% Ethanol für 30 Sekunden und dann in 2,5% Bleiche und 1–2 Tropfen Tween-20/100 ml für 5 Minuten gefolgt von dem dreimaligen Waschen mit sterilem Wasser sterilisiert. Die Samen wurden in Magenta-Boxen auf MS-Medium, dem Hormone fehlten, zum Auskeimen gebracht, für 10–12 Tage angezogen und dann auf Erde transferiert. Vor dem Transfer auf die Erde wurden die ausgeschnittenen Wurzeln der T1-Pflanzen einer Färbung für die GUS-Genexpression wie oben beschrieben unterworfen. Die A. sativa-Nachkommen (T1)-Pflanzen und die T1-Setzlinge wurden einer Analyse auf die GUS-Genexpression unterworfen.
  • Tabelle 3. GUS-Genexpression in A. sativa T1-Setzlingen
    Figure 00500001
  • Beide, Samen und T1-Pflanzen, zeigten eine GUS-Aktivität, die folglich demonstrierte, dass das GUS-Gen erblich war. Die Ergebnisse der GUS-Analyse der T1-Pflanzen ist in Tabelle 4 dargestellt. Relativ zu den T0- Pflanzen schien der Expressionslevel in den T1-Pflanzen in den meisten Organen reduziert (Tabelle 2 und Tabelle 4). Dieses Ergebnis deutet an, dass die Expression in der Nachkommenschaft reduziert ist.
  • Tabelle 4. GUS-Genexpression in reifen A. sativa T1-Pflanzen
    Figure 00510001
  • Beispiel III
  • Dicotyledonen (Arabidopsis) -Transformation mit ScBV-Promotorkonstrukten
  • Ein Expressionsvektor, der einen ScBV-Promotor verbunden mit dem GUS-Gen umfasst, wurde in Arabidopsis thaliana (Columbia ecotype) mittels Vakuuminfiltration wie im wesentlichen von van Hoof und Green, Plant J., 10, 415 (1996); Bechthold et al., C. r. Acad. Sci., 316, 1194 (1993) beschrieben mit den folgenden Modifikationen transformiert: 200 μl/L Silwet L-33 wurden in der Infiltrationslösung eingesetzt und der Agrobakterium tumefaciens-Stamm C58C1 (pMP 90) wurde als ein nicht-eukaryotischer Wirt für den Expressionsvektor verwendet.
  • Samen von Pflanzen, die dem Vakuuminfiltrationsverfahren unterworfen wurden, (bezeichnet T1-Samen) wurden auf Kanamyzin-haltigen Platten ausgesät, wie von Feldmann beschrieben (In: „Methods in Arabidopsis Research" (C. Koncz, N. -H. Chua, und J. Schell, Eds.). World Scientific Publishing Co., Singapore. pp. 274–289 (1992)). Individuelle Pflanzen (T1-Pflanzen) die das Kanamyzin-Markergen trugen, wurden auf Erde transferiert. Gewebe von diesen Pflanzen wurden angefärbt, um die GUS-Aktivität wie oben für A. sativa-Gewebe beschrieben zu lokalisieren, mit Ausnahme dass das Silwet L-77-Detergens in einer 1 : 10000 -Verdünnung (v/v) verwendet wurde und die Färbelösung in das Gewebevakuum infiltriert wurde, indem es einem Vakuum für fünf Minuten unterworfen wurde. Die Samen der T1-Pflanzen (T2-Pflanzen) wurden gesammelt und die Nachkommenpflanzen (T2-Pflanzen) ebenfalls auf eine GUS-Aktivität gefärbt.
  • Die Tabellen 5 und 6 zeigen das verallgemeinerte Expressionsmuster des ScBV-Promotors in T1-bzw. T2-A. thaliana-Pflanzen. Es wurden 29 T1-Pflanzen untersucht, die von 7 infiltrierten Pflanzen abgeleitet wurden. Alle transformierten Setzlinge, die von einer einzigen, infiltrierten Pflanze abgeleitet wurden, wurden einer Linie zugeteilt.
  • In A. thaliana-Blüten ist das Expressionsmuster meistens vaskulär und dennoch zeigten die Staubblätter in einigen Blüten eine konstitutive GUS-Genexpression (5C). Wenn die Wurzeln von A. sativa gefärbt wurden, wurde in 44% der untersuchten Linien eine GUS-Expression detektiert, während in 86% der untersuchten Linien für A. thaliana-Wurzeln eine konstitutive GUS-Genexpression gefunden wurde.
  • Tabelle 5. GUS-Genexpression in A. thaliana T1-Pflanzen
    Figure 00530001
  • Tabelle 6. GUS-Genexpression in A. thaliana T1-Pflanzen
    Figure 00540001
  • Beispiel IV
  • Einführung eines ScBV-Promotorkonstrukts in Sojazellen, Regeneration transformierter R0-Pflanzen und Nachkommenherstellung
  • Es werden Sojaexplanate aus Meristemen, die aus den embryonischen Achsen unreifer Samen ausgeschnitten wurden, abgeleitet. Vor der Transformation werden die Meristemexplanate in einem hoch zytokininenthaltenden Medium (Barwhale et al., Planta, 176, 473 (1986)) über Nacht vorinkubiert. Der Boden einer 60 mm Petrischale wurde mit 1% Wasseragar gefüllt. Die Embryonen wurden oberflächensterilisiert und auf dem Agar in der Petrischale ausplattiert.
  • Eine Menge von 1–3 Mikrometer Goldkügelchen (Alfa Chemical Co.) wurden mit Polylysin vorbeschichtet, indem sie in 0,02% Polylysin gespült wurden und an der Luft getrocknet. Es wird ein linearisierter Expressionsvektor, der eine ScBV-Promotorsequenz, zum Beispiel SEQ ID NO: 3, wirksam verbunden mit einem präselektierten DNA-Segment umfasst, vorbereitet. Vorzugsweise umfasst der Expressionsvektor ferner ein Markergen, wie das neo-Gen (APT 3'II). Es werden 225 Mikrogramm des Expressionsvektors in wässriger Lösung zu 35 mg beschichteten Goldkügelchen zugegeben und dann schrittweise 22 μl 10 mM Na2HP O4 und 22 μl 10 mM CaCl2 zugegeben, die ein feines Präzipitat bilden, währen die Lösung unter N2 getrocknet wird. Im Allgemeinen werden 1,0–0,001 mg DNA pro mg Goldkügelchen vorbereitet. Die getrockneten, präzipitatbeschichteten Kügelchen werden dann in 100% Ethanol resuspendiert und auf 2,0 Millimeter plastikbschichteten, aluminisierten Mylarblättern etwa 9 mm auf 11 mm ausgelegt. Die beschichteten Kügelchen werden so aufgetragen, dass sie eine letztendliche Dichte von 0,2 mg/cm2 auf dem Mylarträgerblatt ergeben. Im Allgemeinen wird das Trägerblatt mit 0,05–40 mg beschichteter Kügelchen pro Quadratzentimeter beladen.
  • Es wird ein Vakuum von 500 mm Quecksilber angewendet. Eine 24 kV-Entladung von dem 2 Mikrofaradkondensator wird durch die Elektroden, welche die Partikel auf den Sojaembryo beschleunigen, entladen. Die bombardierten Embryos werden von der Zieloberfläche entfernt und auf Platten für Organogeneseverfahren ausplattiert, zum Beispiel siehe Barwhale et al., Planta, 176, 473 (1986).
  • Die Explanate werden in der Dunkelheit auf MS-Basismedium wie von Barwhale et al. (supra) modifiziert, ausplattiert. Im Anschluß an eine ein-bis zweiwöchige Inkubation in der Dunkelheit werden die Gewebe auf dasselbe Basismedium transferiert, das einen niederen Level an Zytochinin (1,7 Mikromolar) enthält, um die Triebverlängerung zu begünstigen. Die Triebe werden bei einer Höhe von 0,5–1,0 cm geerntet. Drei bis acht Triebe werden pro Explanat in 2–4 Monaten wiedergewonnen.
  • Nachdem die Triebe eine Höhe von 0,5–1,0 cm erreicht haben, werden sie auf die Wurzeln von keimenden, etwa zehn Tage alten Sojasetzlingen gepfropft. Vor dem Pfropfen werden sie auf ½ MS-Medium für eine Woche abgehärtet. Sobald ausreichend Prlanzengewebe erhalten wird, werden die Gewebe auf die Anwesenheit des Markergens hin untersucht. Falls zum Beispiel das neo-Gen als ein Markergen verwendet wird, wird die APH 3'II-Aktivität in den Pflanzengeweben untersucht.
  • Die Anwesenheit des präselektierten DNA-Moleküls von Interesse, zum Beispiel eines, das ein virales Hüllprotein kodiert, wird durch Southern Blot-Analyse detektiert. Zehn Mikrogramm genomischer DNA des Pflanzengewebes werden mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut. Die DNA wird dann Phenol:Chlorophorm-extrahiert und mit Ammoniumazetat und Ethanol präzipitiert. Die verdaute DNA wird auf einem Agarosegel durch Elektrophorese fraktioniert. Es wird eine 32P-markierte Sonde eingesetzt, die wenigstens mit einem Teil des DNA-Moleküls von Interesse übereinstimmt. Nach dem Waschen des Filters, werden die hybridisierenden DNA-Fragmente durch eine Autoradiographie sichtbar gemacht. Auf diese Weise werden Pflanzen aufgezeigt, die das DNA-Molekül von Interesse tragen. Eine Pflanze, deren Gewebe eine markergen enzymatische Aktivität zeigen oder die bei einer Southern Blot-Analyse für ein DNA-Molekül von Interesse oder für das Markergen positiv sind, werden zur Reife herangezogen. Die Pflanze wird selbst bestäubt und die Samen gewonnen. Es werden Setzlinge eingesetzt um Pflanzen zu generieren, deren Blätter auf die Markergenassoziierte, enzymatische Aktivität oder durch Southern Blot-Analyse auf das DNA-Molekül von Interesse hin untersucht werden.
  • Beispiel V
  • Einführung eines ScBV-Promotorkonstrukts in Tabakzellen, Regeneration von transformierten R0-Pflanzen und Nachkommenherstellung
  • Es werden Tabak-(Nicotiani tabacum var. samsun) Blattscheiben mit einem Durchmesser von etwa 6 mm von Oberflächen-sterilisierten Tabakblättern entnommen. Diese werden auf MS 104 Agarmedium für 2 Tage kultiviert, um eine partielle Zellwandbildung an den verwundeten Oberflächen zu begünstigen. Sie werden dann in einer Kultur von A. tumefaciens-Zellen untergetaucht, die ein Plasmid, das einen ScBV-Promotor wirksam verbunden mit einem präselektierten DNA-Segment hat, das zum Beispiel GUS kodiert, und eine weitere Expressionskassette, die eine Kanamyzinresistenz kodiert, und pMP90RK enthalten ein Helferplasmid, das über Nacht in Luria broth bei 28°C gezogen wird, und behutsam geschüttelt. Die Zellen werden aus der Bakteriensuspension entfernt, trocken geblottet und umgedreht auf Filterpapier inkubiert, das über „Pflege (für Englisch nurse)" -Kulturen von Tabakzellen plaziert wurde, wie von Horsch beschrieben (in vitro, 16, 103 (1980)). Nach zwei oder drei Tagen werden die Scheiben auf Petrischalen transferiert, die MS-Medien mit 500 μg/ml Carbenicillin und keine Pflegekultur enthielten.
  • Kontrollgewebe wird unter Verwendung von A. tumefaciens-Zellen erzeugt, die das Helferplasmid pMP90RK und einen unterschiedlichen Pflanzentransformationsvektor, pMON505 enthielten, der eine T-DNA- Region mit einem NOS-NPTII/NOS-Kanamyzinresistenzgen und ein selektierbares Markergen enthält.
  • Innerhalb von 10 Tagen nach dem Transfer auf die MS-Medien, tauchen aktiv wachsende Kallusgewebe an der Peripherie aller Scheiben, an beiden, der Kontrolle und den transformierten Platten, auf. Transformierte Tabakpflanzen werden dann durch die Regeneration aus den oben beschriebenen, transformierten Blattscheiben mittels dem Verfahren hergestellt, das von Horsch et al. beschrieben wurde (Science, 227, 1229 (1985)). Die erhaltenen transformierten Pflanzen enthalten die Expressionskassette, die den ScBV-Promotor mit dem β-Glucuronidasegen fusioniert enthält.
  • Dasselbe Verfahren wird verwendet, um transformierten Tabak mit einem CaMV35S-Promotor zu erhalten, der zu demselben, präselektierten DNA-Segment, das heißt GUS-fusioniert ist.
  • Transformierte Pflanzen, die das GUS-Gen enthalten, das entweder durch den ScBV-Promotor oder den CaMV35S-Promotor angetrieben wird, werden unter Verwendung eines histologischen Färbeverfahrens untersucht, um die GUS-Aktivität in den transformierten Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen mit Pflanzen, die mit ScBV/GUS/NOS transformiert wurden, werden mit den Ergebnissen desselben Untersuchungen verglichen, der mit Pflanzen durchgeführt wurde, die mit CaMV35S/GUS/NOS transformiert wurden.
  • Die histochemische Untersuchung der Tabakpflanzen, die die ScBV/GUS/NOS- und die CaMV35S/GUS/NOS- Konstrukte enthielten, involvierte eine Prüfung der Pflanzenorgan- und/oder Pflanzengewebeschnitte der transformierten Pflanzen, um die GUS-Aktivität zu bestimmen. Die Gewebe- oder Organschnitte der transformierten Pflanze wurden unter Verwendung einer Rasierklinge vorbereitet, um die Pflanzengewebe mit der freien Hand in Schnitte dünner als 0,5 mm Dicke zu sezieren. Die Schnitte werden dann in einen Überschuß X-Gluc-Lösung gegeben, so dass der Schnitt vollkommen bedeckt war. Das Ansetzen eines Vakuums an die Schnitte kann bei der Penetration der X-Gluc-Lösung helfen. Eine 50 ml X-Gluc-Lösung wird vorbereitet indem 25 ml 0,2 M Na3PO4-Puffer, pH 7,9, 24,0 ml dH2O, 0,25 ml 0,1 M K3[Fe(Cn)6], 0,25 ml 0,1 M K4[Fe(Cn)6] und 0,5 ml 1 M EDTA, pH 7,0 kombiniert werden. Zu dieser Lösung werden 50 mg X-Gluc (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-glucuronid) zugegeben, die von Research Organics (Cleveland, Ohio) erhalten wurden, und unter rühren gelöst. Die Lösung wurde dann vorzugsweise durch Filtration sterilisiert. Die Schnitte in der X-Gluc-Lösung werden dann für 2–4 Stunden auf 37°C gestellt. Es muss Vorsicht walten, um das Verdampfen der Lösung zu verhindern. Nach der Inkubationsperiode werden die Schnitte mit Phosphatpuffer oder destilliertem H2O gespült und dann umgehend mit einem Stereomikroskop oder einem Compound-Mikroskop untersucht. Falls es eine Interferenz von den Pigmenten gibt, kann das Gewebe in FAA-Lösung (85 ml 50% Ethanol, 5 ml Eisessig und 10 ml Formalin) für 24 Stunden fixiert werden. Probleme mit phenolischen Verbindungen können durch die Zugabe von Natriummetabisulfit auf 20 mM zu der Färbelösung kurz vor dem Färben gemildert werden. Ein positiver Test auf das Vorhandensein einer GUS-Aktivität wird durch eine blaue Koloration angezeigt, die in dem Gewebe des untersuchten Pflanzenschnittes auftaucht.
  • Eine histologische Färbeuntersuchung wird an Schnitten durchgeführt, die mit dem β-Glucuronidasegen transformiert wurden, das entweder von dem CaMV35S-Promotor oder dem ScBV-Promotor angetrieben wird. Ein typisches Färbeprofil wurde für den CaMV35S-Promotor, der das GUS-Gen antreibt, mit Färbungen in einigen Geweben und keinen Färbungen in anderen Geweben innerhalb einer einzigen, transgenen Pflanze beobachtet. Gewebe jedoch von einer transformierten Pflanze mit dem ScBV-Promotor angetriebenen GUS-Gen zeigten, dass die transformierte Pflanze einen angemessenen, vorzugsweise viel höheren GUS-Expressionslevel und ein gleichmäßigeres Expressionsmuster überall im Gewebe und den Zellen aufzeigt, als er in Geweben von Pflanzen, die mit CaMV35S/GUS transformiert wurden, beobachtet wurde. Dieses wird durch die vorherrschende, blaue Kolloration durch den gesamten Schnitt hindurch dargestellt.
  • Die Verteilung der Expression und die Anzahl der erhaltenen, hochexprimierenden, transgenen Pflanzen zeigen, dass der ScBV-Promotor in der Gewebeverteilung und der Gleichmäßigkeit der Expression überlegen ist, wenn er mit den CaMV/GUS-Pflanzen verglichen wird. Mehr als 90% der ScBV/GUS-enthaltenden, transformierten Pflanzen zeigen eine angemessene, vorzugsweise sehr starke GUS-Expression und dass die Färbung gleichmäßig von Pflanze zu Pflanze und Gewebe zu Gewebe ist. Diese Färbung ist durchwegs genauso gut in den ScBV-enthaltenden Pflanzen wie jene in den CaMV/GUS-Pflanzen.
  • Um einen weiteren Beweis bereitzustellen, dass der ScBV-Promotor ein starker und konstitutiv exprimierender Promotor ist, werden transgene Nicotiana tabacum-Pflanzen, die die Konstrukte enthalten, auf eine GUS-Aktivität hin unter Verwendung der fluorimetrischen Untersuchung von Jefferson et al. (EMBO J., 6, 3901 (1987)) in extrahierten Blättern, Blüten, Stämmen und Wurzeln untersucht. Die Inkubationen werden bei 37°C für 15 Minuten durchgeführt. Ein 1 g viertes Internodienblatt, eine Blüte, eine 4 cm lange Stengelsektion oder Wurzeln werden ausgeschnitten. Das ausgewählte Gewebe wird durch das Gefrieren in flüssigem Stickstoff, das Zerreiben mit einem Mörser und Pistill und das Resuspendieren in 1 ml 0,1 M K3P O4, pH 7,8, mM EDTA, 10 mM DT, 0,8 mM PMSF und 5% Glycerin resuspendiert. Die fluorogene Reaktion wurde in 2 mM 4-Methyl-umbelliferylglukuronid durchgeführt. Die Fluoreszenz wird unter Verwendung eines Hoechst DNA-Fluorometers (Modell TKO 100) gemessen. Die Proteinkonzentration der Pflanzenextrakte wurde durch eine Bradford-Untersuchung bestimmt.
  • Der CaMV35S-Promotor ergibt einen willkürlichen Expressionslevel von „1" für jedes analysierte Gewebe und daraufhin wird der relative Expressionslevel des ScBV-Promotors bestimmt. Es wurde gefunden, dass die GUS-Expression, die mit dem ScBV-Promotor erhalten wird, der, die mit dem CaMV35S-Promotor erhalten wird, überlegen ist.
  • Die Erfindung ist nicht auf die exakten Details, die oben gezeigt und beschrieben werden, beschränkt, denn es sollte sich verstehen, dass viele Variationen und Modifikationen gemacht werden könnten, während die Erfindung innerhalb des Geistes und Bereiches der Erfindung, die durch die Ansprüche definiert wird, bleibt.
  • Anhang Sequenzauflistung
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  • Figure 00730001
  • Figure 00740001

Claims (28)

  1. Verfahren zur Herstellung von transformierten Pflanzenzellen, das die Schritte umfasst: (i) Einführen eines rekombinanten DNA-Segments in regenerierbare Pflanzenzellen, das ein erstes DNA-Segment umfasst, das einen Zuckerrohr Bacilliformviruspromotor wirksam verbunden mit einem zweiten DNA-Segment umfasst, das ein exogenes Gen umfasst, um so transformierte Zellen zu erhalten, und (ii) Identifizieren oder Selektieren einer transformierten Zelllinie.
  2. Verfahren zur Herstellung einer fertilen, transgenen Pflanze, das die Schritte umfasst: (i) Einführen eines rekombinanten DNA-Segments in regenerierbare Pflanzenzellen, das ein erstes DNA-Segment umfasst, das einen Zuckerrohr Bacilliformviruspromotor wirksam verbunden mit einem zweiten DNA-Segment umfasst, das ein exogenes Gen umfasst, um so transformierte Zellen zu erhalten, und (ii) Identifizieren oder Selektieren einer Population transformierter Zellen, und (iii) Regenerieren einer fertilen, transgenen Pflanze davon, wobei das besagte, rekombinante DNA-Segment durch einen vollständigen, sexuellen Zyklus der besagten, transgenen Pflanze auf ihre Nachkommen übertragen wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die regenerierbaren Pflanzenzellen monokotyle Pflanzenzellen sind.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die regenerierbaren Pflanzenzellen dicotyle Pflanzenzellen sind.
  5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das rekombinante DNA-Molekül durch ein Verfahren in die Pflanzenzellen eingeführt wird, das ausgewählt ist aus: Agrobacterium-vermitteltem DNA-Transfer; Elektroporation; Protoplastentransformation; und Mikroprojektilbombarement.
  6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das erste DNA-Segment SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 5 umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das rekombinante DNA-Segment expimiert wird, um so den transformierten Zellen ein phänotypisches Merkmal zu verleihen.
  8. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das rekombinante DNA-Segment in der fertilen, transgenen Pflanze exprimiert wird, um so der Pflanze ein phänotypisches Merkmal zu verleihen.
  9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das zweite DNA-Segment ein selektierbares Markergen oder ein Reportergen umfasst.
  10. Verfahren, das die Gewinnung von Nachkommen einer fertilen, transgenen Pflanze umfasst, die nach Anspruch 2 hergestellt wurde, wobei die besagten Nachkommen die besagte, rekombinante DNA umfassen.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die besagten Nachkommen durch das Kreuzen der fertilen, transgenen Pflanze mit einer Pflanze der selben Spezies gewonnen werden.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, umfassend die Gewinnung von Samen von den besagten Nachkommen und die Gewinnung weiterer Pflanzennachkommen, die die besagte, rekombinante DNA von den besagten Samen umfassen.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die gewonnenen Nachkommen mit einer Pflanze der selben Spezies zurückgekreuzt werden, um weitere Nachkommen zu gewinnen, die die besagte rekombinante DNA umfassen.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei Samen von den besagten weiteren Pflanzennachkommen gewonnen werden und Pflanzen, die die besagte rekombinante DNA umfassen, aus dem besagten Samen wiederhergestellt werden.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die besagten weiteren Nachkommen mit einer Pflanze der selben Spezies zurückgekreuzt werden, um Nachkommen zu erhalten, die die besagte, rekombinante DNA umfassen.
  16. Transformierte Pflanze, die aus den transformierten Pflanzenzellen regeneriert worden ist, erhalten durch das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das zweite DNA-Segment das exogenes Gen umfasst.
  17. Transformierter Samen der transformierten Pflanze nach Anspruch 16.
  18. T0-transgene Pflanze, hergestellt durch das Verfahren nach Anspruch 2, die das besagte, rekombinante DNA-Segment umfasst.
  19. Samen, hergestellt von den T0-transgenen Pflanzen nach Anspruch 18, der das besagte, rekombinante DNA-Segment umfasst.
  20. T1-transgene Pflanze, die sich von der Pflanze nach Anspruch 18 ableitet, wobei die besagte, T1-Pflanze das besagte, rekombinante DNA-Segmentumfasst.
  21. Transgene Nachkommenpflanze, die sich von der Pflanze nach Anspruch 20 ableitet, wobei die besagte Nachkommenpflanze das besagte, rekombinante DNA-Segment umfasst.
  22. Pflanze nach einem der Ansprüche 18, 20 oder 21, wobei das rekombinante DNA-Segment exprimiert wird, so dass die transgene Pflanze ein phänotypisches Merkmal aufweist, das die transgene Pflanze gegenüber einer entsprechenden nicht-transgenen Pflanze identifizierbar macht.
  23. Fertile, transgene Pflanze, die ein rekombinantes DNA-Segment umfasst, das ein erstesDNA-Segment umfasst, das einen Zuckerrohr Bacilliformviruspromotor wirksam verbunden mit einem zweiten DNA-Segment umfasst, wobei das zweite DNA-Segment ein exogenes Gen umfasst und wobei das zweite DNA-Segment in den Zellen der transgenen Pflanze in einer Menge exprimiert wird, die unterschiedlich ist zu der Menge in den Zellen einer Pflanze, die sich nur dadurch von den Zellen der transgenen Pflanze unterscheiden, dass das rekombinante DNA-Segment fehlt, und wobei das rekombinante DNA-Segment über einen vollständigen, normalen, sexuellen Zyklus der transgenen Pflanze auf die nächste Generation übertragen wird.
  24. Fertile, transgene Pflanze nach Anspruch 23, die eine Monokotyledone ist.
  25. Expressionskassette, die ein erstes DNA-Segment umfasst, umfassend einen Zuckerrohr Bacilliformviruspromotor, der in der Lage ist, die RNA- Transkription in einer Wirtszelle zu initiieren, wirksam verbunden mit einem zweiten DNA-Segment, das ein exogenens Gen umfasst,.
  26. Expessionskassette nach Anspruch 25, die außerdem ein drittes DNA-Segmentumfasst, das ein aminoterminales Chloroplastentransitpeptid kodiert, welches wirksam mit dem zweiten DNA-Segment verbunden ist.
  27. Expressionskassette nach Anspruch 25, die außerdem ein Enhancerelement umfasst.
  28. Expressionskassette nach Anspruch 25, wobei das zweite DNA-Segment ein selektierbares Markergen oder ein Reportergen umfasst.
DE69721840T 1996-08-09 1997-08-13 Zuckerrohr bacilliformviruspromotor Expired - Lifetime DE69721840T2 (de)

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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6489462B1 (en) 1996-08-09 2002-12-03 Regents Of The University Of Minnesota Sugarcane bacilliform virus promoter
FR2756843B1 (fr) * 1996-12-09 1999-01-22 Inst Nat Sante Rech Med Souches de vih-1 non-m non-o, fragments et applications
US6666886B1 (en) 1999-02-16 2003-12-23 Regents Of The University Of Minnesota Tissue equivalent approach to a tissue-engineered cardiovascular valve
AU3736900A (en) * 1999-03-12 2000-09-28 Exelixis Plant Sciences, Inc. Trait-associated gene identification method
US7122721B1 (en) 1999-10-05 2006-10-17 Basf Aktiengesellschaft Plant gene expression under the control of constitutive plant V-ATPase promoters
WO2002046366A2 (en) * 2000-10-24 2002-06-13 Donald Danforth Plant Science Center Rf2a and rf2b transcription factors
AUPR160400A0 (en) * 2000-11-21 2000-12-14 Bureau Of Sugar Experiment Stations Plant virus promoter
EP1288302A1 (de) 2001-08-28 2003-03-05 Monsanto UK Ltd. Regulatorische Sequenzen aus Reis für die Genexpression in definierten Geweben von Weizen
US7598366B2 (en) 2002-07-17 2009-10-06 Queensland University Of Technology TaBV transcriptional control elements, chimeric constructs and uses therefor
JP4469568B2 (ja) 2003-07-09 2010-05-26 三菱化学株式会社 有機酸の製造方法
US8609936B2 (en) 2007-04-27 2013-12-17 Monsanto Technology Llc Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis
CA3090172C (en) 2009-08-31 2023-12-12 Basf Plant Science Company Gmbh Regulatory nucleic acid molecules for enhancing constitutive gene expression in plants
BR112012028848A2 (pt) * 2010-05-10 2018-05-15 Texas A & M Univ Sys composições, organismos, sistemas e métodos para expressar um produto de gene em plantas
EP2611925B1 (de) 2010-08-30 2017-11-29 Dow AgroSciences LLC Scbv-verstärker und seine verwendung für funktionelle genomik bei pflanzen
KR20140109909A (ko) * 2011-12-30 2014-09-16 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 합성 양방향성 ｓｃｂｖ 식물 프로모터를 위한 방법 및 구축물
MX344968B (es) 2012-02-01 2017-01-12 Dow Agrosciences Llc Peptido de transito al cloroplasto.
WO2013130813A1 (en) 2012-02-29 2013-09-06 Dow Agrosciences Llc Sugarcane bacilliform viral (scbv) enhancer and its use in plant functional genomics
US9264706B2 (en) * 2012-04-11 2016-02-16 Qualcomm Incorporated Bypass bins for reference index coding in video coding
AU2013205557B2 (en) 2012-04-17 2016-04-21 Corteva Agriscience Llc Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
US10683513B2 (en) 2013-12-31 2020-06-16 Dow Agrosciences Llc Tissue-specific expression and hybrid plant production
TW201542093A (zh) 2014-03-21 2015-11-16 艾格里遺傳學股份有限公司 用於控制玉米穗蟲之Ｃｒｙ１Ｄ
US20220220495A1 (en) 2019-05-10 2022-07-14 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
US20230203515A1 (en) 2019-09-12 2023-06-29 Basf Se Regulatory Nucleic Acid Molecules for Enhancing Gene Expression in Plants
WO2021069387A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
EP4069852A1 (de) 2019-12-03 2022-10-12 Basf Se Regulatorische nukleinsäuremoleküle zur steigerung der genexpression bei pflanzen
WO2024083579A1 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Basf Se Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants
CN116491421A (zh) * 2023-05-26 2023-07-28 广西大学 一种基因枪介导甘蔗胚胎遗传转化的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5352605A (en) * 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
US5164316A (en) * 1987-01-13 1992-11-17 The University Of British Columbia DNA construct for enhancing the efficiency of transcription
US5359142A (en) * 1987-01-13 1994-10-25 Monsanto Company Method for enhanced expression of a protein
US5097025A (en) * 1989-08-01 1992-03-17 The Rockefeller University Plant promoters
JP2879576B2 (ja) * 1989-08-29 1999-04-05 農林水産省農業生物資源研究所長 ダイズ退緑斑紋ウイルスス由来ｄｎａ配列
ES2150900T3 (es) * 1989-10-31 2000-12-16 Monsanto Co Promotor para plantas transgenicas.
US5304730A (en) * 1991-09-03 1994-04-19 Monsanto Company Virus resistant plants and method therefore
US5824857A (en) * 1991-11-08 1998-10-20 Washington University Plant promoter
DE4306832C1 (de) * 1993-03-04 1994-02-24 Max Planck Gesellschaft Verwendung einer Virus-DNA als Promotor zur gewebespezifischen Expression von Genen in transgenen Pflanzen
ATE266734T1 (de) * 1994-08-30 2004-05-15 Commw Scient Ind Res Org Pflanzentraskriptionsregulator von circovirus
US5646333A (en) * 1994-09-02 1997-07-08 Drexel University Plant promoter useful for directing the expression of foreign proteins to the plant epidermis
AUPO759397A0 (en) * 1997-06-26 1997-07-24 Bureau Of Sugar Experiment Stations Plant and viral promoters

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Publication number Publication date
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ATE239794T1 (de) 2003-05-15
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US5994123A (en) 1999-11-30
CA2380621A1 (en) 1999-02-25
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EP1304383A3 (de) 2003-12-17
CN1276014A (zh) 2000-12-06
WO1999009190A1 (en) 1999-02-25
CN1197970C (zh) 2005-04-20

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