JP2001507572A

JP2001507572A - 植物種子の栄養物含有率を変更するための方法

Info

Publication number: JP2001507572A
Application number: JP52695998A
Authority: JP
Inventors: エー．キリハラ，ジュリー; エー．ヒッバード，ケネス; アンソニー，ジャニス
Original assignee: デカルブジェネティクスコーポレイション
Priority date: 1996-12-09
Filing date: 1997-12-09
Publication date: 2001-06-12
Also published as: ZA9710988B; US20060112443A1; WO1998026064A2; CA2274493A1; US7547820B2; HUP0000281A3; AR010334A1; US6960709B1; EP0942971B1; US6326527B1; HUP0000281A2; EP0942971A2; WO1998026064A3; AU5795898A; ATE484584T1; BR9713692A; DE69740024D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、遺伝子的に構築され、選択されたDNA配列、及び植物種子の栄養含有率を変更するためへのそれらの使用方法を提供する。本発明の方法は、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸の重量％を高めること、又は植物中のスターチ含有率を高めることに向けられる。１つのそのような方法は、植物種子貯蔵タンパク質、好ましくは動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸において不完全である種子貯蔵タンパク質をコードするmRNAに対して、実質的に同一か又は相補的なRNA分子をコードする選択されたDNA配列により植物の細胞を安定して形質転換することを包含する。他の方法は、少なくとも２つの選択されたDNA配列により細胞を安定して形質転換することを包含し、ここで１つの配列は植物種子貯蔵タンパク質をコードするmRNAに対して実質的に同一か又は相補的なRNA分子をコードし、そして他は、選択されたポリペプチドをコードする。形質転換された細胞は、繁殖性トランスジェニック植物及び種子を生成するために使用される。トランスジェニック種子は、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸において不完全な種子貯蔵タンパク質の生成の実質的な阻害をもたらす選択されたDNA配列の発現、及び／又は動物の食物に必須のアミノ酸の重量％の上昇により特徴づけられる。

Description

【発明の詳細な説明】植物種子の栄養物含有率を変更するための方法発明の分野本発明は、一般的に、前もって選択されたDNA構造体を用いてのトウモロコシ種子の栄養物含有率の修飾に関する。より具体的には、本発明は、トランスジェニックトウモロコシ植物の種子中のタンパク質、たとえば種子貯蔵タンパク質、たとえばプロラミン（ゼイン）のレベルを変更するために、トウモロコシ植物を形質転換するためへのあらかじめ選択されたDNA構造体の使用に関する。従って、本発明は、トランスジェニックトウモロコシ植物の種子において、栄養的に不完全なタンパク質を栄養的に増強されたタンパク質により置換し、そして／又は澱粉のレベルを高めるための機構を提供する。発明の背景農業的に重要な種子収穫物において、貯蔵タンパク質遺伝子の発現は、種子植物の栄養特性に直接的に影響を及ぼす。トウモロコシにおいては、貯蔵タンパク質のプロラミン(ゼイン)(Zein)画分は、成熟種子における全タンパク質の50％以上を占める。α−ゼインと称するゼインが特に豊富である。α−ゼインポリペプチドは、非常に低レベルの必須アミノ酸リシン及びトリプトファンを含む。従って、トウモロコシ種子タンパク質は、全種子貯蔵タンパク質のそのような高い割合がα−ゼインにより寄与されるので、それらのアミノ酸が不十分である(Mertz など.，1964)。ゼインプロフィールの操作に基づいてトウモロコシを改良するための育種段階の進歩は、ゼインタンパク質の複雑性により妨げられる。用語“ゼイン”とは、いくつかの100種の関連するタンパク質のファミリーを包含する。ゼインは次の４種の構造的に別個のタイプに分けられ得る：α−ゼインは19,000 及び22,000ドルトンの分子量を有するタンパク質を含み；β−ゼインは14,000ドルトンの分子量を有するタンパク質を含み；γ−ゼインは27,000及び26,000ドルトンの分子量を有するタンパク質を含み；そしてδ−ゼインは10,000ドルトンの分子量を有するタンパク質を含む。α−ゼインは、トウモロコシ仁の内胚乳に見出される主要ゼインタンパク質である。しかしながら、ゼインタンパク質の複雑さは、それらのサイズ分類の度を越える。タンパク質配列の分析は、ゼインアミノ酸配列にマイクロ異種核が存在することを示す。これは、ゼインタンパク質において変化差異を示す等電点電気泳動分析と一致している。ゼインタンパク質をコードする70以上の遺伝子が同定されており（Rubenstein，1982）、そしてそのゼイン遺伝子は、少なくとも３種の染色体上に位置する。従って、ゼインタンパク質は、多重遺伝子族によりコードされる。配列及びハイブリダイゼーションデータに基づけば、ゼイン多重遺伝子族は、いくつかのサブファミリーに分けられる。個々のサブファミリーは、次のクローンとの配列相同性により定義される：Ａ20，Ａ30，Ｂ49，Ｂ59又はＢ36。Ｂ49及びＢ36を使用するハイブリッド−選択翻訳研究は、主に重い種類（23KD）のα− ゼインタンパク質をコードするmRNAを選択し、そしてＡ20，Ａ30及びＢ59は軽い種類（19KD）のα−ゼインタンパク質を選択する(Heidecker and Messing，1986 )。サブファミリーＡ20，Ａ30及びＢ49の個々におけるゼイン配列の比較は、４種の個別の機能ドメインを同定した(Messingなど.，1983)。領域Ｉは、すべてではないが、ほとんどのゼインに存在するシグナルペプチドに対応する。領域II及びIVは、成熟ゼインタンパク質のそれぞれのアミノ及びカルボキシル末端に対応する。領域IIIは、20個のアミノ酸の配列のタンデム反復体を有する領域を包含する、領域IIとIVとの間のコード領域に対応する。種子のアミノ酸含有率の変更を導びく、ゼイン合成における低下を引き起こすことが知られているいくつかの突然変異が存在する。たとえば、劣性突然変異op aque−２についてホモ接合性（homozygous）の植物の種子においては、ゼイン含有率は、約50％減じられる(Tsaiなど.，1978)。opaque−２突然変異は主に、19 及び22KDのα−ゼインタンパク質の合成に影響を及ぼし、19KDのゼイン画分のレベルの有意な低下を引き起こし、そして22KDのゼイン画分の蓄積をかろうじて検出できるレベルまで減じる(Joaesなど.，1977)。この変異体においては、種子に蓄積される、より栄養的に均衡のとれたタンパク質、たとえばアルブミン、グロブリン及びグルテリンの割合の付随的上昇が存在する。変更された貯蔵タンパク質パターンの最終的な結果は、変異体種子における必須アミノ酸リシン及びトリプトファンの上昇である(Misraなど,．1972)。２種の劣性突然変異floury−２及びsugary−１は、種子におけるメチオニンの上昇されレベルをもたらす。floury−２変異体の種子における高められたメチオニン含有率は、19及び22KDのα−ゼイン画分のレベルの低下によるゼイン／グルテリン割合の低下、及びグルテリン画分のメチオニン含有率の見かけ上の上昇の結果である（Hanselなど.，1973;Jones，1978）。sugary−１変異体においては、ゼイン及びグルテリン画分のメチオニン含有率の上昇と共にゼイン合成の低下が存在する(Paulisなど.，1978)。 opaque−２，floury−２及びsugary−１突然変異により示されるように、ゼイン合成の低下及び／又は貯蔵タンパク質画分の相対的割合の変化が、種子の全体のアミノ酸組成に影響を及ぼすことができる。不都合なことには、良好でない農業経済的特徴（核軟化(Kernel softness)収率の低下、耐病状の低下）が、不透明で且つ粉に富む突然変異に関係し、商業的育種へのそれらの容易な適用を妨げる。遺伝子が動物及び植物においてダウンレギュレートされ得るもう１つの手段は、アンチセンス遺伝子の発現を包含する。植物における遺伝子発現の操作へのアンチセンス遺伝子の使用の総説は、van der Krolなど．(1988a;1988b)に見出され得る。いくつかの内因性（endogenous）植物遺伝子の発現の阻害が報告されている。たとえば、アメリカ特許第5,107,065号は、アンチセンス遺伝子の発現によるポリガラクツロナーゼ活性のダウンレギュレーションを開示する。アンチセンス遺伝子を用いてダウンレギュレーションされる他の植物遺伝子は、カルコンシンターゼをコードする遺伝子、及びリブロース−１，５−ビホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットを包含する(van der Krolなど.，1988c;Rodermel など.，1988)。しかしながら、今日まで、種子の栄養物含有率を変更するためにアンチセンス技法を使用する試みの記載は存在していない。植物における遺伝子発現のダウンレギュレーションはまた、特定のトランスジーンの発現を通しても生じることができる。このタイプのダウンレギュレーションは、同時−抑制とに言及され、そしてトランスジーン及び第２のトランスジーン又は相同の内因性遺伝子の協調サイレンシングを包含する(Matzke and Matzke ，1995)。たとえば、タバコにおける除草剤耐性遺伝子の同時抑制(Brandleなど. ，1995)、トマトにおけるポリガラクツロニダーゼ(Flavell，1994)及びペチュニアにおけるカルコンシンターゼ（アメリカ特許第5,034,323号）が示されている。Flavell(1994)は、多コピー遺伝子又は遺伝子ファミリーが植物において発現されるべき関連する遺伝子の複数コピーのために同時抑制を回避するよう進化すべきであることを示唆した。従って、種々の栄養物含有率を変更し、そして良好な農業経済的特徴、たとえば親遺伝子型の核硬度(Kernel hardness)、収率及び耐病性の維持を有する核（k ernel）を生成するための方法の必要性が存在する。さらに、栄養的に好都合なアミノ酸、たとえばメチオニン及びリシンの高い含有率のタンパク質を多くし、そして／又は種子の澱粉含有率を高めながら、良好でない栄養的性質の種子貯蔵タンパク質の発現を低めるための方法の必要性が存在する。発明の要約本発明は、植物種子の栄養物含有率を変更するために、遺伝子的に構築させ、選択されたDNA配列又はセグメントを使用する方法を提供する。前記選択されたD NA配列の発現は、その対応する形質転換されていない、すなわち非トランスジェニック植物、植物組織、植物部分又は植物細胞に対して、トランスジェニック植物、植物組織、植物部分又は植物細胞における変更されたタンパク質及び／又はアミノ酸組成をもたらす。好ましくは、前記トランスジェニック植物の種子は、形質転換されていない、すなわち非トランスジェニック種子に比べて、動物の食物にとって必須の高められた量、たとえば重量％の少なくとも１つのアミノ酸を有する。動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸、たとえばリシン、メチオニン、イソロイシン、トリプトファン、又はトレオニンの種子における重量％の上昇は、動物、たとえば家禽及び豚のための飼料、又はヒト消費のためのそれらの種子の栄養価値を高める。従って、本発明は、発現カセットにより植物の細胞を安定して形質転換することを含んで成る方法を提供する。前記発現カセットは、メッセンジャーRNA（“標的”mRNA）、すなわち形質転換されていない植物細胞に存在する内因性又は“生来の”mRNAの全部又は部分に対して実質的に同一（センス）又は相補的（アンチセンス）であるRNA分子をコードする選択されたDNA配列を含んで成る。標的mRNAは、植物種子貯蔵タンパク質、好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸を欠失し、そしてより好ましくは動物の食物に必須であるアミノ酸を欠くタンパク質をコードする。得られる形質転換された細胞は、トランスジェニック種子を生成する繁殖能力を有するトランスジェニック植物を再生するために使用され、ここで選択された DNA配列が、その対応する非トランスジェニック種子、たとえば形質転換されていないRO対照植物の種子、又はトランスジェニック植物から単離された対応する形質転換されていない種子に存在する種子貯蔵タンパク質の量、重量％又はレベルに対して、種子貯蔵タンパク質の量、重量％又はレベルを実質的に減じ又は低めるのに効果的な量でトランスジェニック種子において発現される。種子貯蔵タンパク質は、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸を欠失するタンパク質である。好ましくは、種子貯蔵タンパク質の量の低下は、より高い％の栄養的に好都合なアミノ酸を含んで成る種子貯蔵タンパク質の重量％の上昇をもたらす。選択されたDNA配列は好ましくは、19KD又は22KDのα−ゼインタンパク質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする。種子貯蔵タンパク質、たとえばα−ゼインの低下は、核硬度の程度の低下に付随され得る。核の硬度は、それらの場合、opaque−２突然変異(Lopes and Larkins ，1991)について記載のような核表現型（Kernel phenotype）の修飾により、又は一定の内胚乳タンパク質、たとえば27KDのγ−ゼインのレベルを高めるために植物を遺伝子的に修飾することによって高められ得る。本発明の遺伝子的に構築されたDNA配列は、そこに含まれるコード領域がインビトロで単離され、そして少なくとも機能的に同定されていることにおいて“選択”される。従って、“選択された”DNAは、細胞から単離され、精製され、そして増幅されたDNA配列又はセグメントである。選択されたDNA配列の選択は、選択されたDNA配列のセンス鎖によりコードされるポリペプチドのアミノ酸組成、及び好ましくは、種子に蓄積するポリペプチドの能力に基づかれるであろう。好ましくは、前記コード領域の類はまた、確かめられている。また、好ましくは、単離されたDNA分子は、それが、好ましくはキメラ発現カセットを生成するために連結されている、異なった源からの選択されたDNA配列を含むことにおいて、 “組換え体”である。選択されたDNA配列は好ましくは、約２〜３kbである。本発明はさらに、植物、植物部分、植物組織又は植物細胞中の澱粉含有率を高めるための方法を提供する。前記方法は、発現カセットにより植物の細胞を安定して形質転換することを含んで成る。前記発現カセットは、植物種子貯蔵タンパク質をコードする少なくとも1つのmRNAの全部又は部分に対して実質的に同一の又は相補的なRNA分子をコードする選択されたDNA配列を含んで成る。好ましくは、その選択されたDNA配列は、植物及び／又は種子において機能するプロモーターに作用可能に連結される。形質転換された細胞は、繁殖能力を有する植物及び種子を再生するために使用される。選択されたDNA配列は好ましくは、その対応する非トランスジェニック種子に存在する種子貯蔵タンパク質の重量％よりもトランスジェニック種子において種子貯蔵タンパク質の重量％を低めるのに効果的な量で、トランスジェニック種子において発現される。選択されたDNA配列はまた、好ましくは、その対応する非トランスジェニック種子に存在する澱粉の重量％よりも、トランスジェニック種子における澱粉の重量％を高めるのに効果的な量で、トランスジェニック種子において発現される。種子の澱粉の重量％の上昇は、その種子の食品価値、又は加工食品又は種々の産業用途への使用のための澱粉法としてのその価値を改良する。さらに、トランスジェニック種子における澱粉含有率の上昇は、それらの種子から回収された澱粉の上昇をもたらすことができる。種子貯蔵タンパク質のファミリー又はサブファミリーを阻害するための方法もた提供される。種子貯蔵タンパク質、たとえばトウモロコシにおけるゼインタンパク質は、多重遺伝子族にコードされる。一定のサブファミリーにおける種子貯蔵タンパク質のアミノ酸配列の一部、及び前記貯蔵タンパク質をコードするDNA 配列は、それぞれ、アミノ酸、及びDNAを共有し、すなわち配列相同性である（ “ファミリー”特異的配列と称する）。サブファミリーにおけるゼイン種子貯蔵タンパク質のアミノ酸配列の他の部分、及び前記貯蔵タンパク質をコードするDN A配列は、お互いアミノ酸、及びDNAを共有し、すなわち配列相同性である（“サブファミリー”特異的配列と称する）。ファミリー又はサブファミリー特異的配列に対応する予備選択されたDNA配列は、ゼインタンパク質のファミリー又はサブファミリーの生成を阻害するために使用され得る。ゼインタンパク質のファミリー又はサブファミリーのメンバー間で、配列に関して実質的に相同であるmRNA の全部又は部分に対して実質的に同一であるか、又は相補的であるRNA分子をコードする選択されたDNA配列を含んで成る発現カセットが提供される。次に、その選択されたDNA配列を含んで成る発現カセットが、植物細胞中に導入され、それがトランスジェニック植物及び種子を生成するために再生される。トランスジェニック種子は、種子貯蔵タンパク質の選択されたファミリー又はサブファミリーの実質的な阻害により特徴づけられる。好ましい態様において、選択されたDNA配列は、α−ゼインタンパク質のＡ20サブファミリーにおいて、複数のタンデムコピーで存在する20個のアミノ酸配列をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的であるRNA分子をコードする。本発明のもう１つの態様は、少なくとも２種の選択されたDNA配列により安定に形質転換された植物細胞、植物組織、植物部分又は植物を含んで成る。第１の予備選択されたDNA配列は、種子貯蔵タンパク質、たとえば内因性種子貯蔵タンパク質、好ましくは他の種子貯蔵タンパク質に比較して、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸において相対的に不完全であるタンパク質をコードする mRNAの全部又は部分に対して実質的に同一の又は相補的なRNA分子をコードする。第２の選択されたDNA配列は、所望のアミノ酸組成のポリペプチド、すなわち動物の食物に必須である少なくとも１つのアミノ酸を含んで成るポリペプチドをコードする。前記ポリペプチドは好ましくは、種子細胞構造及び従って粒状性質の破壊を最少にする物性を有する。個々の選択されたDNA配列は、植物及び／又は種子において機能的なプロモーターに作用可能に連結されることが好ましい。形質転換に続いて、それらのゲノム中に安定して、すなわち染色体的に組込まれる第１及び第２の選択されたDNA配列を有する形質転換された植物細胞が選択され、そして繁殖能力を有するトランスジェニック植物及び種子を再生するために使用される。そのトランスジェニック種子は、非トランスジェニック種子に存在するその種子貯蔵タンパク質、又はそのタンパク質に存在するアミノ酸の量、重量％又はレベルよりも、不所望の種子貯蔵タンパク質又はそのタンパク質に存在するアミノ酸の量、重量％又はレベルを実質的に減じ又は低めるのに効果的な量での第１のDNA配列の発現により特徴づけられる。トランスジェニック種子はまた、好ましくは、非トランスジェニック種子に存在する動物の食物に必須のアミノ酸の量、重量％又はレベルよりも、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸の量、重量％又はレベルを高めるのに効果的な量での植物タンパク質としての第２のDNA配列の発現により特徴づけられる。好ましい態様においては、トランスジェニックトウモロコシ種子における第１の選択されたDNA配列の発現は、19KD又は22KDのα−ゼインの重要％を阻害する。もう１つの好ましい態様においては、トランスジェニック種子における第２の選択されたDNA配列の発現が、10KDのδ−ゼインタンパク質の重量％の低下をもたらす。さらにもう１つの好ましい態様においては、トランスジェニック種子における第２の選択されたDNA配列の発現が、27KDのゼインタンパク質の重量％の上昇をもたらす。さらにもう１つの好ましい態様においては、第２の選択された DNAは、合成ポリペプチド、たとえばMB1をコードする(Beauregardなど.，1995) 。MB１は、また、α−らせんコンホメーションを取る動物栄養物のための必須アミノ酸（たとえばメチオニン、トレオニン、リシン及びロイシン）に高度に富んでいる安定した合成ポリペプチドである。その合成ポリペプチドMB１は、トウモロコシゼインタンパク質のいくつかの性質を共有し、たとえばMB１はアルコール溶解性であり、そして複数のα−らせんドメインを含む。しかしながら、選択された所望のアミノ酸組成を有する、合成及び天然に存在する他のポリペプチド、及びそれをコードする遺伝子は、本発明の実施において使用され得る。本明細書において使用される場合、用語“ポリペプチド”とは、タンパク質を包含する。本発明はまた、植物におけるポリペプチドの量、重量％又はレベルを高めるための方法も提供する。前記方法は、種子貯蔵タンパク質をコードする第１の選択されたDNA配列、及び選択された、所望するポリペプチドの少なくとも１部をコードする第２の選択されたDNA配列により、植物、植物細胞、植物組織又は植物部分を安定して形質転換することを含んで成る。前記ポリペプチドは、形質転換されていない植物又は植物細胞（“内因性”又は“生来の”）のゲノムによりコードされ得、又は他方では、形質転換されていない“野生型”植物又は植物細胞（“異種”、“非生来の”又は“外来性”と称する）のゲノムに対して生来のものではなく、すなわちそのゲノムに存在することができない。好ましくは、第２の選択されたDNA配列は、細菌酵素、たとえばAK，DHDPS，DPSPS、細菌毒素、たとえばBtからの結晶性毒素、種子貯蔵タンパク質、たとえばＺ27、又は非トウモロコシ種子貯蔵タンパク質、たとえば堅及び豆果種子貯蔵タンパク質をコードする。たとえば、アメリカ特許第4,769,061号；アメリカ特許第4,971,908号；PCT ／US90／04462;PCT／WO89／11789；及びAltenbachなど.，（1989）を参照のこと。そこに安定して、すなわち染色体的に組込まれた第１及び第２の選択されたDN A配列を存する形質転換された植物細胞が、選択され、そして繁殖能力を有すトランスジェニック植物及び種子を再生するために使用される。本発明のトランスジェニック種子は、少なくとも１つの種子貯蔵タンパク質の発現の実質的な阻害により特徴づけられる。第２の予備選択されたDNA配列は、非トランスジェニック種子におけるアミノ酸の重量％に対して、第２の選択されたDNA配列によりコードされるポリペプチドに存在する少なくとも１つのアミノ酸の重量％を高めるのに効果的な量で前記トランスジェニックの種子において発現される。他方では、第２の選択されたDNA配列は、第２の選択されたDNA配列のみにより形質転換された種子に存在するポリペプチドの量、重量％又はレベルに対して、そのポリペプチドの量、重量％又はレベルを高めるのに効果的な量でトランスジェニック種子において発現される。本発明はまた、選択されたDNA配列、及び上記方法において有用な発現カセット、並びにそれにより生成される繁殖能力を有するトランスジェニック植物及び／又は種子を提供する。本発明の好ましい繁殖能力を有するトランスジェニック植物及び種子は、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸の重量％の上昇、及び／又はスターチ含有率の上昇を示す。繁殖能力を有するトランスジェニック植物及び種子は、えり抜きの近交系の機能的農業経済的特徴を維持しながら、優性態様で、アミノ酸又は澱粉含有率の上昇を伝達する植物系が開発され得るよう、真の育種植物を生成するために使用される。本発明の他の態様は、選択されたDNA配列により形質転換された植物細胞、植物部分、植物組織及び微生物を包含する。図面の簡単な説明図１は、ゼインタンパク質の機能的ドメインを示す図である。ゼインサブファミリーの個々のためのコンセンサスアミノ酸配列が示される。ゼインタンパク質の反復部分のコンセンサスが、領域IIIｂに示される。星印は、その位置でのコンセンサスの欠失を示す。点は、配列を整列するために挿入されるギャップを示す。図２は、Ａ20のRNA配列である（配列番号１）。図３は、Ｚ４のDNA配列である（配列番号２）。図４は、Ｚ４遺伝子のギャップ部位(Ａ)(配列番号９及び10)、ドメインIIIＢ( Ｂ)(配列番号11及び12)、並びにポリ（Ａ）領域(Ｃ)(配列番号13及び15)を標的化するオリゴヌクレオチドプライマーを示す。図５は、pDPG340及びpDPG380を担持するヘミ接合性形質転換体（GW01）のＲ１ ×非形質転換近交系、及びＲ２自家受粉に起因する分離集団の個々の核からのゼイン抽出物のSDS−PAGE分析を示す。レーン１〜８は、Ｒ１世代におけるCNに対して交雑されたＲ２核及び第２集団において自家受粉されたＲ２核からのゼイン抽出物を含む。レーン９は、形質転換されていないCNからのゼイン抽出物を含む。レーン10〜17は、第１世代におけるAWに対して交雑されたＲ２仁及び第２世代において自己受粉されたＲ２仁からのゼイン抽出物を含む。レーン18は、形質転換されていないAWからのゼイン抽出物を含む。レーン19は分子量マーカーを含む。図６は、形質転換されていない近交系AW及びCVに対するヘミ接合性pDPG530形質転換体の交雑に起因する分離集団からのガラス状又は不透明仁のゼイン抽出物のSDS−PAGE分析を示す。KP014×AW（レーン１〜２）；AW×KP014(レーン３〜４ )；KP015×AW（レーン５〜６）；AW×KP015(レーン７〜８)；CV×KP015(レーン９〜10)；AW×KP015(レーン11〜12)。レーン13〜19は、それぞれ、AW，CV，ILP ，IHP，AK835不透明、AK835正常、及びＷ64Ａ不透明である。レーン20は、分子量マーカーを含む。図７は、ヘミ接合性形質転換体及び形質転換されていない近交系の交雑に起因する分離集団の個々の核からのタンパク質のゼイン抽出物のSDS−PAGE分析を示す。pDPG530形質転換体KP015(AW×KP015、レーン１〜２；CV×KP015、レーン３〜４；KP015×AW、レーン５〜６)、及びKP016(CV×KP016、レーン７〜８；KP016 ×AW、レーン９〜10)、及びpDPG531形質転換体KQ018（KQ018×AW、レーン11〜12 ）。レーン13〜18は、それぞれ形質転換されていない対照CW，AR，CV，AW，W64A ，Ｑ２及びＷ64Ａである。レーン19〜20は、分子量マーカーを含む。図８は、形質転換されていない近交系AW及びCVに対するヘミ接合性pDPG530及びpDPG531形質転換体の交雑に起因する分離集団からの成長する核におけるα− ゼインmRNAレベルを示す。 AW×KP015（pDPG530形質転換体；レーン１〜10；上部パネル）；KP015×AW(pD PG530形質転換体；レーン11〜20；上部パネル)；CV×KP015（pDPG530形質転換体；レーン１〜10；下部パネル）；及びKQ012×AW(pDPG531形質転換体；レーン11 〜20；下部パネル)。核は、受粉の21日後に単離された。図９は、pDPG503形質転換された（右）及び形質転換されていない（左）核の超構造を示す。図10は、形質転換されていない近交系AW及びCVに対するpDPG531形質転換体の交雑に起因する分離集団からのゼイン抽出物のSDS−PAGE分析を示す。CV×KQ012 (レーン１〜４)；KQ012×AW（レーン５〜８）；KQ020×AW（レーン13〜15）；KQ 020×CV（レーン16〜19）。対照CW，AR，CV及びAW（それぞれレーン９〜12）。レーン20は分子量マーカーを含む。発明の特定の記載定義本明細書において使用される場合、配列における“実質的に同一”又は“実質的に相同”とは、２つの核酸、又はアミノ酸配列がお互いに対して、少なくとも約65％、好ましくは約70％、より好ましくは約90％及びさらにより好ましくは約 98％の配列同一性又は相同性を有することを意味する。本発明の第１の選択されたDNA配列によりコードされるRNA分子は、相同内因性遺伝子の発現又は前記第１の選択されたDNA配列に対して実質的な同一性を有する第２の選択されたDNA配列の発現の同時抑制を引き起こすのに十分な配列同一性又は相同性を有する。本明細書において使用される場合、“実質的に相補的な”とは、２つの核酸配列が、お互いに対して、少なくとも約65％、好ましくは約70％、より好ましくは約90％及びさらにより好ましくは約98％の配列相補性を有することを意味する。実質的に相補的なRNA分子は、mRNAの翻訳の低下又は阻害をもたらすために種子貯蔵タンパク質をコードするmRNAに対して十分な配列相補性を有するものである。本明細書において使用される場合、“実質的な低下”又は“実質的な減少”とは、トランスジェニック植物、植物部分、植物細胞又は植物組織が、その対応する非トランスジェニック植物、植物部分、植物細胞又は植物組織におけるアミノ酸又はポリペプチドの量、レベル又は重量％に対して、低下した又は減少した量、レベル又は重量％の特定のアミノ酸又はポリペプチドを有することを意味する。好ましくは、トランスジェニック植物、植物部分、植物組織又は植物細胞におけるそのアミノ酸又はポリペプチドの低下した量、レベル又は重量％は、その対応する非トランスジェニック植物、植物部分、植物細胞又は植物組織におけるそのアミノ酸又はポリペプチドの量、レベル又は重量％に対して、約10〜100％及びより好ましくは約70％〜100％、そしてさらにより好ましくは約80〜100％である。本明細書において使用される場合、形質転換された（トランスジェニック）植物細胞、植物組織、植物部分又は植物におけるポリペプチド又はアミノ酸の“増加された”又は“高められた”レベル、量又は重量％は、その対応する形質転換されていない植物細胞、植物部分、植物組織又は植物におけるそのポリペプチド又はアミノ酸のレベル、量又は重量％よりも高い。アミノ酸の重量％の増加は、非トランスジェニック植物、植物部分、植物組織又は植物細胞におけるアミノ酸の重量％に対して、トランスジェニック植物、植物部分、植物組織又は植物細胞におけるアミノ酸の重量％の約１〜50％、好ましくは約５〜40％、及びより好ましくは、約10 〜30％の増加である。トランスジェニック植物、植物部分、植物組織又は植物細胞におけるポリペプチドの量の増加は、その対応する非トランスジェニック植物、植物部分、植物組織又は植物細胞におけるポリペプチドの量に対して、好ましくは少なくとも約２〜100倍、より好ましくは少なくとも約３〜80倍、及びさらにより好ましくは少なくとも約５〜30倍である。たとえば、トウモロコシ種子における平均リジン含有率は、約0.24〜0.26％であり、トウモロコシ種子における平均メチオニン含有率は、約0.17〜0.19％であり、そしてトウモロコシ種子における平均トリプトファン含有率は約0.08〜0.10 ％である（Dale，1996）。従って、種子における本発明の選択されたDNA配列の発現は、それらの種子におけるメチオニン、トリプトファン又はリシンの含有率の上昇をもたらす。ポリペプチドのアミノ酸組成は、当業界において良く知られている方法により決定され得る(Jarrettなど.，1986;Jonesなど.，1983;AACC，1 995)。本明細書において使用される場合、“遺伝子的に修飾された”又は“トランスジェニック”とは、形質転換により植物細胞、植物部分、植物組織又は植物のゲノム中に導入された選択されたDNAセグメントを含んで成る、植物細胞、植物部分、植物組織又は植物を意味する。用語“野生型”とは、形質転換されていない植物細胞、植物部分、植物組織又は植物、すなわちゲノムが選択されたDNAセグメントの存在により変更されていないものを意味する。本明細書において使用される場合、“植物”とは、完全な植物、植物組織、植物部分、たとえば花粉又は胚、植物細胞、又は植物細胞グループを意味する。本発明の方法に使用され得る植物の種類は、一般的に形質転換技法の影響を受けやすい種子をつける高等植物の広い種類、たとえば単子葉植物及び双子葉植物である。形質転換された植物細胞、植物部分又は植物組織から再生された植物、又はその再生された、形質転換された植物に由来する子孫に由来する種子は、飼料又は食品として直接的に使用され得、又はさらなる加工により変えられ得る。本発明の実施においては、最とも好ましい植物種子は、トウモロコシ又はゼアマイス（Zea mays）の種子である。本発明に従っての植物の形質転換は、植物分子生物学の当業者に知られている種々の手段のいづれかにより実施され得る。それらは、プロトプラスト、又は部分的な細胞壁を含んで成る細胞のマイクロインジェクティル衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及びアグロバクテリウム(Agrobacterium)−介在DNAトランスファーを包含するが、但しそれらだけには限定されない。本明細書において使用される場合、用語“動物の食物に必須である少なくとも１つのアミノ酸において不完全な種子貯蔵タンパク質”とは、タンパク質が動物の食物に必須である、平均重量％よりも低い少なくとも１つのアミノ酸を有することを意味する。動物の食物に必須であるアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン及びバリンを包含する。動物の食物に必須である好ましいアミノ酸は、メチオニン、トレオニン、リジン、イソロイシン、トリプトファン、及びそれらの混合物である。植物貯蔵タンパク質は、１又は複数のそれらの必須アミノ酸を含むことができる。たとえば、トウモロコシ種子におけるリジンの平均重量％は、約0.24〜0.26 ％である。従って、リジンを含まない種子貯蔵タンパク質、たとえばα−ゼインは、リジンが不完全である。特定のアミノ酸の平均重量％は、当業界において良く知られている方法により決定される。本明細書において使用される場合、“単離された”とは、細胞から物理的に単離されるか、又は単離されたDNAセグメントの配列に基づいてインビトロで合成されるかいづれかを意味する。本明細書において使用される場合、“生来の”とは、インビトロで操作されていない、すなわち単離、精製及び増幅されていないDNA配列又はセグメントを意味する。Ｉ．本発明のDNA分子Ａ．選択されたセンス及びアンチセンスDNA配列の単離１．α−ゼイン種子貯蔵タンパク質本発明において有用な、遺伝子的に構築され、単離され、精製されたDNA分子は、植物種子貯蔵タンパク質、たとえばα−ゼインタンパク質の１つをコードするmRNAの全部又はその部分に対して実質的に相同の又は相補的なRNA分子をコードする選択されたDNA配列を含んで成る。本明細で使用される場合、“種子貯蔵タンパク質”とは、植物の成熟種子、たとえばトウモロコシにおける主要タンパク質の１つであり、そしてタンパク質のプレ形のアミノ末端でシグナルペプチド配列を含み、そしてタンパク質の成熟形においてアミノ酸配列のタンデム反復体を含んで成るタンパク質である。植物種子貯蔵タンパク質又はゼインタンパク質は、ゼインタンパク質、たとえばα−ゼイン、たとえば19,000及び22,000ドルトンのタンパク質；β−ゼインタンパク質、たとえば14,000ドルトンの分子量を有するタンパク質；γ−ゼインタンパク質、たとえば27,000 及び16,000ドルトンの分子量を有するタンパク質；並びにδ−ゼインタンパク質、すなわち10,000ドルトンの分子量を有するタンパク質を４包含するが、但しそれらだけには限定されない。ある種子貯蔵タンパク質は、動物の食物にとって必須の少なくとも１つのアミノ酸が不完全である。たとえば、19KD及び22KDのα− ゼインタンパク質は、動物の食物に必須である低レベルのアミノ酸リジン及びトリプトファンを含む。他の態様において、選択されたDNA配列は、種子貯蔵タンパク質特異的mRNAのファミリー又はサブファミリーの全部又は部分に対して実質的に相補的であるか又は同一であるRNA分子として発現される。RNA分子又は対応するDNA配列は、同じファミリー又はサブファミリーの種子貯蔵タンパク質をコードするそれぞれ他のRNA又はDNA配列と、約65％又はより好ましくは90％の核酸配列相同性又は相補性を有する。選択されたアンチセンスDNA配列の発現は、相補的mRNAの翻訳を実質的に阻害し、そして選択されたセンスDNA配列の発現は、相同種子貯蔵タンパク質をコードする内因性DNA配列の発現の同時抑制をもたらす。好ましい選択されたDNA分子は、種子貯蔵タンパク質の同じファミリー又はサブファミリーの20 個のアミノ酸のタンデム反復領域をコードするDNA配列に対して相補的であるRNA 分子をコードする。選択されたセンス又はアンチセンスDNA配列は、好ましくは、約15個のヌクレオチドへ2,000個のヌクレオチド及びより好ましくは、約50〜1,000個のヌクレオチドを有するRNA分子をコードすることができる。前記DNA配列は、その５’末端又は３’末端に由来し、そしてコード及び／又は非コード領域の全部又は部分のみを含むことができる。センス又はアンチセンスDNA配列は、種子貯蔵タンパク質をコードするmRNAの発現の実質的な阻害を提供するために、少なくとも15個のヌクレオチドを有するRNA配列を供給すべきであることが、当業者により理解されるであろう。本発明の選択されたDNA配列は、コードするDNA分子、配列又はセグメントをクローニンすることによって得られ、そして種子貯蔵タンパク質のmRNAとして発現され得る。選択されたDNA配列の部分は、また、センスコード配列の５’又は３ ’末端に位置する非コードヌクレオチドを含むことができる。種子貯蔵タンパク質をコードするmRNA配列に対して実質的に相補的であるRNA配列をコードする選択されたＤＮＡ配列は典型的には、反対の配向（すなわち５’→３’よりもむしろ３’→５’）でクローン化された“センス”DNA配列である。種子貯蔵タンパク質をコードするセンスDNA配列は、Sambrookなど.，（1989）及びアメリカ特許第5,508,468号に記載のような標準方法を用いてクローン化され得る。十分な長さの種子貯蔵タンパク質をコードする選択されたDNA配列のサブフラグメントは、制限酵素を用いて生成され得る。そのサブフラグメントは好ましくは、種子貯蔵タンパク質の既知の機能的ドメインに基づいて選択される。種子貯蔵タンパク質は次の少なくとも４種の異なった機能的ドメインを有する：シグナルペプチドドメイン、シグナルペプチドの下流に位置する成熟タンパク質のアミノ末端部分を含むドメイン、成熟タンパク質のアミノ末端の下流に位置する20個のアミノ酸配列のタンデム反復体を含むドメイン、及びタンパク質のカルボキシ末端を含むドメイン。α−ゼインタンパク質におけるそれらの機能的ドメインのサイズ及び位置は、図１に示されており、そしてα−ゼインタンパク質のアミノ酸配列と、他の種子貯蔵タンパク質のアミノ酸配列とを比較することによって、他の種子貯蔵タンパク質について決定され得る。センス又はアンチセンス種子貯蔵タンパク質、たとえばα−ゼインDNA配列の全部又は部分を提供することができる選択されたDNA配列の適切な例は、Messingなど.，（1983）により記載のようにして調製されたcDNAクローンＡ 20，Ａ30，Ｂ49，Ｂ59，Ｂ36，Ｚ４及びＺ15を包含する。好ましいcDNAクローンは、19KDのα−ゼインタンパク質をコードするＡ20クローン、及び22KDのα−ゼインタンパク質をコードするＺ４クローンである。Ｚ４及びＡ20 DNA配列の一部は、制限エンドヌクレアーゼにより生成され得る。植物における発現のために適切なベクターにおいて、Ａ20又はＺ４ RNAのいづれかの部分に対して相同であるか又は相補的な選択されたDNA配列は、種子貯蔵タンパク質の生成を実質的に低めるために使用され得ることがまた理解される。そのようなDNA配列の例は、DNA又はRNA配列の５’領域、たとえばプロモーター及びキャップ部位の３’領域（図４Ａ）、又は遺伝子、たとえばポリ（Ａ）末端の上流のAATAAA−様ポリアデニル化シグナルの３’領域（図４Ｃ）に対して相同であるか又は相補的である配列である。遺伝子ファミリー又はサブファミリーにおける１つよりも多くの遺伝子に共通する保存されたドメイン、たとえばドメインIIIＢ又は図１に示される１又は複数の他のドメインに対して相同であるか又は相補的である選択されたDNA配列はまた、前記遺伝子ファミリー又はサブファミリーのメンバーの発現を実質的に阻害するためにも有用であることがさらに理解される。選択されたDNA配列は、種子貯蔵タンパク質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に同一であるRNA分子、たとえば10KDのゼイン、27KDのゼイン又はMB１をコードするmRNAに対して実質的に同一のRNA分子をコードする選択されたDNA配列をコードすることができることがさらに理解される。好ましい態様においては、19KDのα−ゼインタンパク質をコードするセンスDN A配列、及び／又は22KDのα−ゼインタンパク質をコードするセンスDNA配列は、Huなど．(1982)及びGeraghtyなど．(1982)に記載のように、内胚乳組織から生成されたcDNAライブラリーから調製される。19KDのα −ゼインタンパク質及び／又は22KDのα−ゼインタンパク質をコードするcDNAクローンは、標準の方法、たとえばDNAハイブリダイゼーション、又はウェスターンブロット分析を包含する免疫技法による遺伝子発現の検出により特徴づけられ得る。19KD又は22KDのα−ゼインタンパク質のコード配列の存在は、DNA配列決定により確かめられ得る。２．他の選択されたDNA配列本発明の方法において有用なもう１つの選択されたDNA配列は、植物及び／又は種子において機能的なプロモーターに作用可能に連結される、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸を含んで成る植物タンパク質を包含する、ポリペプチドをコードする。動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸を含んで成るポリペプチドをコードする選択されたDNA配列の植物細胞における発現は、アミノ酸残基の重量％がその対応する形質転換されていない植物又は種子に通常存在する量よりも、形質転換された植物細胞から生成される植物、又は前記植物に由来の種子において実質的に高められるように、ポリペプチドの発現の上昇を提供する。好ましくは、選択されたDNA配列は、第２の選択されたアンチセンス又はセンスDNA配列により植物細胞中に同時形質転換され、この発現が動物の食物に必須のアミノ酸について相対的に不完全な種子貯蔵タンパク質の発現の阻害をもたらす。動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸を含んで成るポリペプチドをコードする選択されたDNA配列は、植物種子において発現されるポリペプチド、たとえば10KDのゼインタンパク質であり得る。動物の食物に必須の１又は複数のアミノ酸残基を含む他のポリペプチドは、合成ポリペプチドMB１を包含する(Beaunegardなど.，1995)。動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸を含む、天然に存在するポリペプチド、又は合成ポリペプチドをコードするいづれかの遺伝子は、本発明において使用され得ることが理解される。Ｚ10及びMB１タンパク質はそれぞれ、天然に存在するタンパク質及び合成ポリペプチドの例示であるが、但し当業者は、多くの他のタンパク質が本発明の実施において有用であることを十分に理解するであろう。それらのポリペプチドをコードする選択されたDNA配列は、前記に引用されたS ambrookなど．により記載のようにして、標準の方法により得られる。たとえば、10KDのゼインタンパク質をコードするcDNAクローンは、Kiriharaなど．(1988) により記載のようにして、トウモロコシ内胚乳組織から得られる。次に、DNA配列は好ましくは、植物細胞又は種子において機能的なプロモーターと共に組合される。好ましいプロモーターは、植物種子の成長の間に機能するプロモーター、たとえばＺ27又はＺ10プロモーターである。合成ポリペプチドMB１をコードする遺伝子は、Mary A．Hefford（Center for Food and animal Research，Agriculture and Agri-Food Canada）から得られる。合成ポリペプチド、たとえばMB１をコードする選択されたDNA配列は、種子貯蔵タンパク質に由来するシグナル配列に作用可能に連結される。たとえば、MB１ DNA配列は、15KDのゼインシグナルペプチド配列に作用可能に連結され得る。選択されたDNA配列は所望の種子貯蔵タンパク質をコードすることがまた理解される。従って、第１の選択されたDNA配列の発現は不所望の種子貯蔵タンパク質の発現を阻害することができ、そして第２の選択されたDNA配列の発現は所望する遺伝子生成物、たとえば所望する種子貯蔵タンパク質をコードすることができる。たとえば、部分遺伝子DNA配列を含んで成る、第１の選択されたDNA配列の発現は、それらの部分DNA配列標的DNA又はRNA配列が、所望のポリペプチドの発現の抑制を回避するために、所望のポリペプチド、たとえば10KDのゼイン又はMB１をコードする第２の選択されたDNA配列に存在しない場合、不所望の種子貯蔵タンパク質の発現の抑制のために好都合であることが構想される。Ｂ．発現カセットのための任意の配列１．プロモーター好ましくは、本発明の選択されたDNA配列は、その選択されたDNA配列の発現を提供するプロモーターに作用可能に連結される。プロモーターは好ましくは、植物及び／又は種子において機能的なプロモーター、及びより好ましくは、植物種子の成長の間、機能的なプロモーターである。選択されたDNA配列は、発現カセットを形成するために、それがプロモーターから下流に位置する場合、そのプロモーターに作用可能に連結される。ほとんどの内因性遺伝子は、遺伝子発現を調節する、プロモーターとして知られる、cDNAの領域を有する。プロモーター領域は典型的には、原核及び真核細胞において、コード配列から上流のフランキングDNAに見出される。プロモーター配列は、下流の遺伝子配列の転写の調節を提供し、そして典型的には、約50〜約 2,000のヌクレオチド塩基対を含む。プロモーター配列はまた、遺伝子発現のレベルに影響を及ぼすことができる調節配列、たとえばエンハンサー配列を含む。いくつかの単離されたプロモーター配列は、異種DNA、すなわち生来の又は相同D NAとは異なるDNAの遺伝子発現を提供することができる。プロモーター配列はまた、強いか又は弱く、あるいは誘導性であることも知られている。強いプロモーターは高レベルの遺伝子発現を提供し、他方弱いプロモーターは非常低レベルの遺伝子発現を提供する。誘導性プロモーターは、外因的に付加された因子、又は環境又は成長剌激に応答して、遺伝子の発現の開始又は停止を提供するプロモーターである。細菌プロモーター、たとえばＰ_tacプロモーターは、形質転換された細菌細胞に添加されるイソチオプロピルガラクトシドのレベルに依存して、種々のレベルの遺伝子発現に誘導され得る。プロモーターはまた、組織特異的調節又は成長調節を提供することができる。異種DNAのための強いプロモーターである単離されたプロモーター配列は、それが形質転換された細胞の容易な検出及び選択を可能にするために十分なレベルの遺伝子発現を提供し、そして所望される場合、高レベルの遺伝子発現を提供するので、好都合である。好ましい発現カセットは一般的に、植物プロモーター、たとえばCaMV35Sプロモーター(Odellなど.，1985)又は他のもの、たとえばCaMV19S(Lawtonなど.，198 7)，nos(Ebertなど.，1987)，Adh1(Walkerなど.，1987)、スクロースシンターゼ (Yangなど.，1990)、α−チューブリン、コビキチン、アクチン(Wangなど.，199 2)，cab(Sullivanなど.，1989)，PEPCase(Hudspethなど.，1989)又はＲ遺伝子複合体に関係するもの(Chandlerなど.，1989)を包含するが、但しそれらだけには限定されない。さらなる適切なプロモーターは、カリフラワーモザイクウィルスプロモーター、10KDのゼインタンパク質をコードする遺伝子からのＺ10プロモーター、27KDのゼインタンパク質をコードする遺伝子からのＺ27プロモーター、誘発性プロモーター、たとえばエンドウrbcS遺伝子に由来する光誘発性プロモーター(Coruzziなど.，1971)及びイネからのアクチンプロモーター(McElroyなど.，1 990)を包含し；種子特異的プロモーター、たとえば豆からのフォセオリンプロモーターがまた使用され得る（Seng upta-Gopalan，1985）。特に好ましいプロモーター、たとえばＺ10又はＺ27プロモーターは、植物種子成長の間、機能的であり得る。本発明の実施において有用な他のプロモーターがまた、当業者に知られている。あるいは、新規組織−特異的プロモーター配列は、本発明の実施において使用され得る。特定の組織からのcDNAクローンが単離され、そして組織において特異的に発現されるそれらのクローンが、たとえばノザンブロッティグを用いて同定される。好ましくは、単離された遺伝子は高いコピ類で存在しないが、しかし特定組織において比較的豊富である。次に、対応するゲノムクローンのプロモーター及び制御要素は、当業者に良く知られている技法を用いて存在化され得る。選択されたDNA配列は、発現カセットを生成するために、前記に引用されるSam brookなど.,に記載される標準方法により、プロモーターと共に組合わされ得る。手短に言及すれば、プロモーター、たとえば35Ｓ CaMVプロモーターを含むプラスミドは、Jefferson(1987)に記載のようにして構成され得、又はClontech La b，Palo Alto，Californiaから得られる（たとえば、PBI121又はPBI221)。典型的には、それらのプラスミドは、プロモーターから下流の異なった制限酵素に対しての特異性を有する複数のクローニング部位を有するように構成される。選択されたDNA配列は、制限酵素を用いて、プロモーターから下流にサブクローン化され、そしてDNAが、センス又はアンチセンスRNAとして発現されるようにプロモーターに関して正しい配向で挿入されていることを確保するよう配置され得る。選択されたDNA配列がプロモーターに作用可能に連結されると、そのようにして形成された発現カセットは、プラスミド又は他のベクター中にサブクローン化され得る。選択されたセンスDNA配列が得られると、DNA配列の全部又は部分が、反対の配向（すなわち３’→５’）で、発現ベクター（下記参照のこと）中にサブクローン化され得る。同様に、選択されたDNA配列の全部又は部分は、センス配向（すなわち５’→３’）でサブクローン化され得る。選択されたDNA配列は、発現カセットを形成するために、プロモーターから下流にサブクローン化される。好ましい態様においては、Ｚ４ 22KDのα−ゼインタンパク質をコードするcD NAクローンがトウモロコシ内胚乳組織から単離される。制限エンドヌクレアーゼを用いて、Ｚ４遺伝子のための完全なコード配列が、アンチセンスDNA配列を形成するために中間ベクター中に、３’→５’配向でサブクローン化される。Ｚ10 プロモーターと称する、10KDゼインタンパク質からのプロモーター領域は、発現カセットを形成するために、Ｚ４遺伝子のための完全なコード配列を含むアンチセンスDNA配列から上流にサブクローン化される。次に、この発現カセットが、植物細胞の形質転換のために適切なベクター中にサブクローン化され得る。本発明のもう１つの好ましい態様においては、Ｚ27プロモーターと称する、27 KDのゼインタンパク質からのプロモーター領域が、アンチセンスDNA配列から上流にサブクローン化される。本発明のもう１つの好ましい態様においては、制限エンドヌクレアーゼを用いて、19KDのα−ゼインタンパク質をコードするＡ20遺伝子の完全なコード配列が、アンチセンスDNA配列を形成するために、中間ベクター中に３’→５’配向でサブクローン化される。Ｚ10プロモーター、又は他方では、Ｚ27プロモーターが、Ａ20アンチセンスDNA配列から上流にクローン化される。一部のＺ４又はＡ20 のDNA配列がまた、Ｚ10又はＺ27プロモーターの下流に３’→５’アンチセンス配向でクローン化され得る。さらに、一部の又は完全なＺ４又はＡ20のDNA配列の上流にＺ10又はＺ27プロモーターを含んで成る発現カセットが構成され、ここで前記DNA配列は、５’→３’センス配向で、プロモーターの方法にサブクローン化されている。２．配列の標的化さらに、発現カセットが構成され、そして植物細胞内の細胞間区画に選択されたDNA配列又はセグメントの生成物を標的化し、又はタンパク質を細胞外環境に向けるために使用される。これは、一般的に、トランジット又はシグナルペプチド配列をコードするDNA配列を、選択されたDNA配列のコード配列に連絡することによって達成され得る。得られるトランジット、又はシグナルペプチドは、タンパク質を、それぞれ特定の細胞間又は細胞外目的地に輸送し、そして次に、後− 翻訳的に除去され得る。トランジットペプチドは、細胞間膜、たとえば液胞、小胞、プラスチド及びミトコンドリア膜を通してのタンパク質の輸送を促進することによって作用し、そしてシグナルペプチドは細胞外膜を通してタンパク質を方向づける。細胞内又は外の区画中へのタンパク質の輸送を促進することによって、それらの配列は、特定の位置における特定の遺伝子生成物の蓄積を高めることができる。たとえば、アメリカ特許第5,258,300号を参照のこと。３．３’配列発現カセットが植物細胞中に導入される予定である場合、その発現カセットはまた、任意には、転写を終結するためのシグナルとして作用し、そして得られる mRNAのポリアデニル化を可能にする３’非翻訳植物調節DNA配列を含むことができる。３’非翻訳調節DNA配列は好ましくは、約300〜1,000個のヌクレオチド塩基対を含み、そして植物転写及び翻訳終結配列を含む。好ましい３’側要素は、アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のノパリンシンターゼ遺伝子からの要素(Bevanなど.，1983)、アグロバクテリウムツメファシエンスのオクトピンシンターゼ遺伝子からのＴ７転写体のためのターミネーター、及びジャガイモ又はトマトからのプロテアーゼインヒビターＩ又はII 遺伝子の３’末端に由来し、但し当業者に知られている他の３’側要素もまた使用され得る。それらの３’側の非翻訳調節配列は、Au（1987）に記載のようにして得られ、又はClontech，Palo Alto，Californiaから入手できるプラスミドに容易に存在する。３’側の非翻訳調節配列は、標準の方法により、予備選択されたDNA配列の３’末端に操作可能的に連結され得る。４．選択可能及びスクリーニング可能マーカー配列形質転換体を同定する能力を改良するためには、発現できる選択されたDNA配列又はセグメントとして、又はその他に、選択可能又はスクリーン可能マーカー遺伝子を使用することが所望される。“マーカー遺伝子”は、マーカー遺伝子を発現する細胞に明確な表現型を付与し、そして従って、そのような形質転換された細胞の、マーカーを有さない細胞からの区別を可能にする遺伝子である。そのような遺伝子は、マーカーが化学的手段により、すなわち選択剤（たとえば除草剤、抗生物質、又は同様のもの）の使用を通して、“選択できる”形質を付与するかどうか、又はそれが観察又は試験を通して、すなわち“スクリーニング”（たとえばＲ−遺伝子座形質）により同定できる単なる形質であるかどうかに依存して、選択可能又はスクリーン可能マーカーのいづれかをコードすることができる。もちろん、適切なマーカー遺伝子の多くの例は、当業界において知られており、そして本発明の実施において使用され得る。選択可能又はスクリーン可能マーカー遺伝子はまた、その分泌が形質転換された細胞についての同定又は選択の手段として検出され得る“分泌可能マーカー”をコードする遺伝子でもある。例は、抗体相互作用により同定され得る分泌可能抗原をコードするマーカー、又はそれらの触媒活性により検出され得る分泌可能酵素を包含する。分泌可能タンパク質は、多くの種類、たとえばEL ISAにより検出できる小さな拡散性タンパク質；及び細胞壁に挿入され、又はトラップされるタンパク質（たとえばリーダー配列、たとえばエクステンシン又はタバコPR−Ｓの発現単位に見出される配列を含むタンパク質）を包含する種々の種類に分類される。検出可能な分泌可能マーカーに関しては、細胞壁において隔離されるようになり、そしてユニークエピトープを包含するポリペプチドをコードする遺伝子の使用が特に好都合であると思われる。そのような分泌された抗原マーカーは、植物組織において低いバックグラウンドを提供するエピトープ配列、すなわち効果的発現、及び形質膜を通しての標的化を付与し、そして細胞壁に結合され、そして抗体に接近できるタンパク質を生成するプロモーターリーダー配列を理想的には使用するであろう。ユニークエピトープを含むよう修飾された、正常に分泌された壁タンパク質は、すべてのそのような必要条件を満たすであろう。この態様での修飾のために適切なタンパク質の１つの例は、エクステンシン、又はヒドロキシプロリンに富んでいる糖タンパク質（HPRG）である。トウモロコシHPRGの使用(Stiefelなど.，1990)は、この分子が分子生物学、発現、及びタンパク質構造に関して十分に特徴づけられているので、好ましい。しかしながら、種々のエクステンシン及び／又はグリシンに富んでいる壁タンパク質(Kellerなど.，1989)のいづれか１つは、スクリーン可能マーカーを創造するために、抗原性部位の付加により修飾され得る。本発明の開示の要素は、特定のマーカー遺伝子の使用を通して詳細に例示される。しかしながら、この開示に関しては、多くの他の可能な選択可能及び／又はスクリーン可能マーカー遺伝子が、下記に示されるものの他に、当業者に明らかであろう。従って、次の議論は徹底的であるよりむしろ例示的であることが理解されるであろう。本明細書に開示される技法、及び当業界に知られている一般的な組換え技法の観点から、本発明は、形質転換された植物細胞、たとえば単子葉植物細胞を生成するために、マーカー遺伝子を包含するいづれかの遺伝子の受容体細胞中への導入を可能にする。本発明に関しての使用のための可能な選択マーカーは、カナマイシン耐性をコードし、そしてカナマイシンを用いて選択され得るneo遺伝子(Potrykusなど.，1 985)、すなわちＧ418及び同様のもの；ビアラホス耐性をコードするbar遺伝子；変更されたEPSPシンターゼタンパク質をコードし(Hincheeなど.，1988)、従ってグリホセート耐性を付与する遺伝子；ニトリラーゼ遺伝子、たとえばブロモキシニルに対する耐性を付与する、クレブシエラオザエナエ（Klebsiella ozaenae ）からのbxn(stalkerなど.，1988)；イミダソリノン、スルホニウレア又は他のA LS−阻害性化学物質に対する耐性を付与する変異体アセトラクテートシンターゼ遺伝子(ALS)(ヨーロッパ特許第154,204号、1985)；メトトレキセート−耐性をDH FR遺伝子(Thilletなど.，1988)；除草剤デラポンに対する耐性を付与するダラポンデハロゲナーゼ遺伝子；又は５−メチルトリプトファンに対する耐性を付与する突然変異誘発されたアントアニレートシンターゼ遺伝子を包含するが、但しそれらだけには限定されない。変異体EDSPシンターゼ遺伝子が使用される場合、追加の利点が、適切なクロロプラスト形質ペプチド、CTPの導入を通して実現され得る（ヨーロッパ特許出願第0218571号、1987）。形質転換体を選択するために系に使用できる選択マーカーの例示的態様は、酵素ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、たとえばストレプトミセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）からの bar遺伝子、又はストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces virido chromogenes）からのpat遺伝子である（アメリカ特許第5,550,318号）。酵素ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT)は、除草剤ビアラホスにおける活性成分、ホスフィノトリシン(PPT)を不活性化する。PPTはグルタミンシンターゼを阻害し(Murakamiなど.，1986;Twellなど.，1989)、アンモニアの急速な蓄積及び脂肪の死を引き起こす。単子葉植物に関してのこの選択システムを用いることにおける成功は、穀物の形質転換に報告されている主な困難性のために、特に驚くべきことである（Potrykus，1989）。使用され得るスクリーニング可能マーカーは、種々の色原体基質が知られている酵素をコードするβ−グルクロニダーゼ又はUidA遺伝子(GUS)；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の生成を調節する生成物をコードするＲ−遺伝子座遺伝子(Dellaportaなど.，1988)；種々の色原体基質（たとえばPADAC、色原体セファロスポリン）が知られている酵素をコードするβ−ラクタマーゼ遺伝子 (Sutcliffe，1978)；色原体カテコールを転換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするxylE遺伝子(Zukowskyなど.，1983)；α−アミラーゼ遺伝子(Ikutaなど.，1990)；容易に検出できる化合物メラニンを形成するために縮合する、DOPA及びドーパキノンにチロシンを酸化できる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子(Katzなど.，1983)；色原体基質が存在する酵素をコードするβ −ガラクトシダーゼ遺伝子；生物発光検出を可能にするルシフェラーゼ(lux)遺伝子(Owなど.，1986)；又はカルシウム−感受性生物発光検出に使用され得るアエクオリン遺伝子(Prasherなど.，1985)、又は緑色螢光タンパク質遺伝子(Niedzなど.，1995)を包含するが、但しそれらだけには限定されない。トウモロコシＲ遺伝子は複合体からの遺伝子は、スクリーニング可能マーカーとして特に有用であると思われる。トウモロコシにおけるＲ遺伝子複合体は、ほとんどの種子及び植物組織におけるアントシアニン色素の生成を調節するよう作用するタンパク質をコードする。トウモロコシ株は、成長及び組織特異的態様で、色素形成を調節するために組合う、１又は４個ほどの多くのＲ対立遺伝子を有することができる。Ｒ遺伝子複合体からの遺伝子は、形質転換された細胞におけるこの遺伝子の発現が細胞を害しないので、トウモロコシ形質転換に適用された。従って、そのような細胞中に導入されるＲ遺伝子は赤色の色素の発現を引き起こし、そして安定して組込まれる場合、赤色の区域として視覚的に評点をつけられ得る。トウモロコシ系がアントシアニン生合成経路において酵素中間体をコードする遺伝子のための優性対立遺伝子（Ｃ２，Ａ１，Ａ２，Bz１及びBz２）を担持するが、しかしＲ遺伝子座では劣性対立遺伝子を担持する場合、Ｒによるその系統からのいづれかの細胞の形質転換は、赤色の色素形成をもたらすであろう。典型的な系統は、rg-Stadler対立遺伝子及びTR112、すなわちｒ−ｇ，ｂ，Ｐ１であるＫ55誘導体を含むWisconsin 22を包含する。他方では、トウモロコシのいづれかの表現型が、Ｃ１及びＲ対立遺伝子が一緒に導入される場合、利用され得る。Ｒ遺伝子調節領域は、キメラ遺伝子の発現を制御するための機構を提供するために、キメラ構造体に使用され得ることがさらに、提案される。表現型発現の多様性は、いづれか他の遺伝子座よりもＲ遺伝子座で知られている(Coeなど.，198 8)。領域５’〜構造Ｒ遺伝子から得られる調節領域は、遺伝子、たとえば昆虫耐性、渇水耐性、除草剤耐性、又は他のタンパク質コード領域の発現を方向づけることにおいて価値があると思われる。本発明のためには、Ｒ遺伝子ファミリーメンバーのいづれかが都合良く使用され得ると思われる（たとえば、Ｐ，Ｓ，Lc、等）。しかしながら、最とも好ましいものは、一般的にSn（特に、Sn：bo13)であろう。Snは、Ｒ遺伝子複合体の優性メンバーであり、そしてSnが一定の実生及び植物細胞においてアントシアニン色素の組織特異的付着を制御することにおいてＲ及びＢ遺伝子座に機能的に類似し、従って、その表現型はＲに類似する。本発明への使用のために企画されるさらなるスクリーニング可能マーカーは、 lux遺伝子によりコードされるホタルルシフェラーゼである。形質転換された細胞におけるlux遺伝子の存在は、たとえばＸ−線フィルム、シンチレーションカウンティング、螢光分光計、低−光ビデオカメラ、光子カウンティングカメラ又はマルチウェル発光計を用いて検出され得る。このシステムは、たとえば組織培養プレート上での生物発光についての集団スクリーニングのために、又は完全な植物スクリーニングのためにさえ開発され得ることがまた認識される。５．他の任意の配列本発明の発現カセットはまた、プラスミドDNAをさらに含んで成ることができる。プラスミドベクターは、原核及び真核細胞における発現カセットの容易な選択、増幅及び形質転換を提供する追加のDNA配列を含み、たとえば、pUC−由来のベクター、たとえばpUC8,pUC9，pUC18，pUC19，pUC23，pUC119及びpUC120,pSK− 由来のベクター、pGEM−由来のベクター、pSP−由来のベクター、又はpBS−由来のベクターを包含する。追加のDNA配列は、ベクターの自己複製を提供するための複製の起点、好ましくは、抗生物質又は除草剤耐性をコードする追加の選択マーカー遺伝子、発現カセットにコードされるDNA配列又は遺伝子を挿入するための複数の部位を供給するユニーク多重クローニング部位、及び原核及び真核細胞の形質転換を増強する配列を包含する。植物及び原核細胞の両者における発現のために有用であるもう１つのベクターは、ベクターpGA582により例示されるような二元Tiプラスミド（Schilperoortなど.,アメリカ特許第4,940,838号に開示されるような）である。この二元Tiプラスミドベクターは、前記に引用されたAnにより特徴づけられており、そしてDr． Anから入手できる。この二元Tiベクターは、原核細菌、たとえばE.コリ及びアグロバクテリウム(Agrobacterium)において複製され得る。このアグロバクテリウムプラスミドベクターは、双子葉植物細胞に及びある条件下では、単子葉植物細胞、たとえばイネ細胞に、発現カセットをトランスファーするために使用され得る。この二元Tiベクターは好ましくは、効果的な植物細胞形質転換を提供するためのノパリンＴ DNA右及び左ボーダー、選択マーカー遺伝子、Ｔボーダー領域におけるユニーク多重クローニング部位、ColE1複製の起点、及び広い宿主範囲のレプリコンを含む。本発明の発現カセットを担持する二元Tiベクターは、原核及び真核細胞の両者を形質転換するために使用され得るが、しかし好ましくは、双子葉植物細胞を形質転換するためにも使用される。Ｃ．発現カセットのインビトロスクリーニング発現カセットが構成され、そして適切なプラスミド中にサブクローン化されると、それは、標準の方法、たとえばハイブリッド阻止された翻訳法により、種子貯蔵タンパク質をコードするmRNAの翻訳を実質的に阻害するその能力についてスクリーニングされ得る。たとえば、ハイブリッド選択又は阻止された翻訳のためには、予備選択されたアンチセンスDNA配列が、SP６／Ｔ７含有プラスミド（ProMega Corp．により供給されるような）中にサブクローン化される。植物細胞の形質転換のためには、適切なベクターは、本明細書に記載されるプラスミドを包含する。典型的には、ハイブリッド阻止翻訳は、特定の貯蔵タンパク質をコードするmRNAの翻訳の阻害を測定するインビトロアッセイである。このスクリーニング方法はまた、ゼインタンパク質遺伝子のファミリー又はサブファミリーの翻訳を阻害する選択されたアンチセンスDNA配列を選択し、そして同定するためにも使用され得る。対照として、その対応するセンス発現カセットは、植物中に導入され、そして表現型がアッセイされる。 III．宿主細胞中へのDNA分子のDNA供給本発明は一般的に、形質転換された細胞を創造するために、受容体細胞中に、予備選択されたDNA配列、たとえば選択されたDNAを導入するために向けられる段階を包含する。外因性（外来性）DNAを取る細胞の発生の頻度は、低いと思われる。さらに、DNAセグメント又は配列を受けるすべての受容体細胞が、DNAが植物ゲノム中に安定して組込まれ、そして／又は発現される、形質転換された細胞をもたらすとは限らない。いくつかは、単に初期及びトランジット遺伝子発現を示すかも知れない。しかしながら、実質的にいづれかの双子葉植物又は単子葉植物種からの一定の細胞は、本明細書に開示される技法の適用により、安定して形質転換され得、そしてそれらの細胞はトランスジェニック植物を再生した。本発明は、いづれかの植物種に向けられ、ここで種子は、比較的低いレベルの少なくとも１つの必須アミノ酸を含むか、又はまったく含まない貯蔵タンパク質を含む。その植物組織源の細胞は、好ましくは繁殖できるトランスジェニック植物及び／又は種子を再生することができる胚形成細胞又は細胞系である。細胞は、単子葉植物又は双子葉植物のいずれかに由来する。植物種の適切な例は、小麦、イネ、アラビドプシス(A rabidopsis)、タバコ、トウモロコシ、大豆、及び同様のものである。好ましい細胞型は、懸濁細胞培養物に存在することができるか、又は損なわれていない植物部分、たとえば未熟の胚に、又は特殊化された植物組織、たとえばカルス、たとえばタイプＩ又はタイプIIカルスに存在することができる、単子葉植物細胞、たとえばトウモロコシ細胞である。植物組織源の細胞の形質転換は、当業者に知られている多くの方法のいづれか１つの方法により実施され得る。例として次のものがある：エレクトロポレーションによる植物細胞中への直接的なDNAトランスファーによる形質転換(アメリカ特許第5,384,253号及びアメリカ特許第5,472,869号、Dekeyserなど.，1990)；PE G沈澱法による植物細胞への直接的なDNAトランスファー(Hayashimotoなど.，199 0)；マイクロプロジェクティル衝撃（ボンバートメント）による植物細胞への直接的なDNAトランスファー（McCabeなど.，1988；Gordon-Kammなど.，1990;アメリカ特許第5,489,520号；アメリカ特許第5,538,877号；及びアメリカ特許第5,53 8,880号）；及びアグロバクテリウムによる感染を通しての植物細胞へのDNAトランスファー・マイクロプロジェティル衝撃（ボンバートメント）又はエレクトロポレーションのような方法は、“裸の”DNAにより実施され得、ここで発現カセットが単純に、いづれかのE.コリー由来のプラスミドクローニングベクター上に担持され得る。ウィルスベクターの場合、システムは複製機能を保持するが、しかし疾病誘発のための機能を欠いていることが所望される。双子葉植物形質転換のための好ましい方法は、葉−ディスクプロトコールを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobac terium tumefaciens)による植物細胞の感染を通してである(Horschなど.，1985) 。単子葉植物、たとえばゼア・メイズが、胚形成カルス組織又は未熟の胚のマイクロプロジェティル衝撃を通して、又はペクチナーゼ含有酵素による細胞壁の部分的酵素破壊に続いてのエレクトロポレーションにより形質転換され得る（アメリカ特許第5,384,253号；及びアメリカ特許第5,472,869号）。たとえば、未熟ゼアマイス胚に由来する胚形成細胞系が、上記に引用されるGordon-Kammなど．(19 90)又はアメリカ特許第5,489,520号；アメリカ特許第5,538,877号及びアメリカ特許第5,538,880号により記載のようにして、促進された粒子処理により形質転換され得る。切り出された未熟胚がまた、アメリカ特許出願番号08／112,245号及びPCT公開WO95／06128に記載のようにして、組織培養誘発、選択及び再生の前、形質転換のための標的物として使用され得る。さらに、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いての単子葉植物の形質転換方法が、Hieiなど.(ヨーロッパ特許第0604662号、1994)及びSaitoなど.(ヨ一ロッパ特許第0672,752号、1995) により記載されている。マイクロプロジェクティル衝撃又はエレクトロポレーションのような方法は、 “裸の”DNAにより実施され得、ここで発現カセットが単純に、いづれかのE.コリー由来のプラスミドクローニングベクター上に担持され得る。ウィルスベクターの場合、システムは複製機能を保持するが、しかし疾病誘発のための機能を欠いていることが所望される。形質転換のための植物組織源の選択は、宿主植物の性質及び形質転換プロトコールに依存するであろう。有用な組織源は、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉セグメント、茎セグメント、雄穂、花粉、胚、胚軸、塊茎セグメント、分裂組織領域、及び同様のものを包含する。組織源が選択され、そして形質転換され、その結果、それは、形質転換に続いて、完全な繁殖性植物を再生する能力を保持し、すなわち全能性を有する細胞を含む。タイプＩ又はタイプII胚トウモロコシカルス及び未熟胚が、好ましいゼアマイス組織源である。単子葉植物の形質転換のための組織源の選択は、アメリカ特許出願第08／112,245号及びPCT公開WO95／06128号に詳細に記載されている。形質転換は、選択の植物組織に向けられる条件下で実施される。植物細胞又は組織が、選択されたDNA配列を担持するDNAに、一定の効果的な期間、暴露される。これは、エレクトロポレーションに関しては、１秒以下の電流のパルス〜２〜３日のプラスミド担持のアグロバクテリウム細胞の存在下での同時培養の範囲である。使用される緩衝液及び培地はまた、植物組織源及び形質転換プロトコールにより変化するであろう。多くの形質転換プロトコールは、形質転換される植物細胞又は組織から無菌フィルター紙ディスクにより分離される、固体培地プレートの表面上の懸濁された培養細胞（たとえば、タバコ、又はBlack Mexican Swee tコーン）の支持細胞層を用いる。Ａ．エレクトロポレーションエレクトロポレーションによりDNAを導入することを所望する場合、Krzyzekなど,(アメリカ特許第5,384,253号)の方法が特に好都合であろう。この方法においては、一定の細胞壁一分解酵素、たとえばペクチン−分解酵素が使用され、未処理の細胞よりもエレクトロポレーションによる形質転換に対して標的受容体細胞がより敏感にされる。他方では、受容体細胞は、機械的創傷により、形質転換により敏感にされ得る。エレクトロポレーションにより形質転換をもたらすためには、こわれやすい組織、たとえば懸濁細胞培養物、又は胚形成カルスを使用でき、又は他方では、未熟胚又は他の組織化された組織を直接的に形質転換することができる。予備選択された細胞又は器官の細胞壁が、それらをペクチン−分解性酵素（ペクチナーゼ又はペクトリアーゼ）に暴露し、又はそれらを制御された態様下で機械的に傷つけることによって、部分的に分解され得る。次に、そのような細胞は、この段階で実施され得るエレクトロポレーションによるDNA摂取を受け入れやすくなり、そして次に、形質転換された細胞が、新しく組込まれたDNAの性質に依存して、適切な選択又はスクリーニングプロトコールにより同定される。ｂ．マイクロプロジェクティル衝撃（ボンバートメント）植物細胞に形質転換性DNAセグメントを供給するためのさらなる好都合な方法は、マイクロプロジェクティル衝撃（ボンバートメント）である。この方法においては、微小粒子がDNAにより被覆され、そして推進力により細胞中に供給される。典型的な粒子は、タングステン、金、白金、及び同様のものから構成されるものを包含する。ある場合、金属粒子上でのDNA沈澱は、マイクロプロジェクティル衝撃を用いての受容体細胞へのDNA供給のためには必要でないと思われる。例示的な態様においては、非−胚形成BMS細胞が、トウモロコシにおける発現のために構築されたβ−グルコロニダーゼ又はbar遺伝子のいづれかを有するプラスミドを含む細菌E.コリ又はアグロバクテリウムツメファシエンスの損なわれていない細胞により衝撃を与えられた。細菌は、衝撃の前、エタノール脱水により不活性化された。β−グルコロニダーゼ遺伝子の低レベルのトランジット発現が、DNA供給に続いて24〜48時間で観察された。さらに、bar遺伝子を含む安定した形質転換体が、E.コリ又はアグロバクテリウムツメファシエンス細胞のいづれかによる衝撃に続いて、回収された。粒子は、DNAにより被覆されるよりもむしろ、DNAを含むことができると思われる。従って、粒子はDNA供給のレベルを高めることができるが、しかしそれら自体及び単独では、植物細胞中にDNAを導入するために必要ではないことが提案されている。単子葉植物を生殖的に安定して形質転換する効果的な手段の他に、マイクロプロジェクティル衝撃の利点は、プロトプラストの単離(Christouなど.，1988)、部分的に分解された細胞の形成、又はアグロバクテリウム感染に対する感受性が必要とされることである。加速によりトウモロコシ細胞中にDNAを供給するための方法の例示的な態様は、懸濁培養されたトウモロコシ細胞により被覆されたフィルター表面上に、スクリーン、たとえばステンレス鋼又はNytexスクリーンを通して、DNA又は細胞により被覆された粒子を推進するために使用され得るBioli stics Particle Delivery Systemである(Gordon-Kammなど.，1990)。前記スクリーンは、粒子を分散し、その結果、それらは受容体細胞に大きな凝集体で供給されない。プロジェクティル装置と衝撃を与えられる細胞との間のスクリーン介在は、プロジェクティル凝集体のサイズを減じ、そして凝集されたプロジェクティルによる受容体細胞上に付与される損傷を減じることによって、より高い頻度の形質転換に寄与することができると思われる。衝撃のためには、懸濁液中の細胞は好ましくは、フィルター又は固体培養培地上で濃縮される。他方では、未熟の胚又は他の標的細胞が、固体培養培地上に配置される。衝撃を与えられる細胞は、マクロプロジェクティル停止プレート下で適切な距離に配置される。所望には、１又は複数のスクリーンがまた、加速装置と衝撃を与えられる細胞との間に配置される。本明細書に示される技法の使用により、マーカー遺伝子を過渡的に発現する1000個までの又はそれ以上の中心細胞を得ることができる。衝撃後48時間で外因性遺伝子生成物を発現する問題の細胞の数は、しばしば、約１〜10であり、そして平均約１〜３である。衝撃による形質転換においては、最大数の安定した形質転換体を得るために、予備衝撃培養条件及び衝撃パラメーターを最適化することができる。衝撃のための物理的及び生物学的パラメーターの両者は、この技法においては重要である。物理的因子は、DNA／マイクロプロジェクティル沈澱物の操作に関与する因子、又はマクロー又はマイクロプロジェクティルのいづれかの路及び速度に影響を及ぼす因子である。生物学的因子は、衝撃の前及び直後、細胞の操作に関与するすべての段階、衝撃により関与する外傷の緩和を助けるための標的細胞の浸透調節、及びまた、形質転換するDNA、たとえば線状化されたDNA又は損なわれていない超らせんプラスミドDNAの性質を包含する。予備−衝撃操作は、未熟胚の好結果をもたらす形質転換のために特に重要であると思われる。従って、種々の衝撃パラメーターを、その条件を十分に最適化するための小規模研究において調節することが所望されると思われる。物理的パラメーター、たとえばギャップ距離、飛行距離、組織距離、及びヘリウム圧力を調節することが特に所望される。受容体細胞の生理学的状態に影響を及ぼし、そして従って、形質転換及び組込み効率に影響を及ぼす条件を改良することによって、外傷低下因子(TRF)をまた最少にすることができる。たとえば、受容体細胞の浸透状態、組織脱水及び継代培養段階又は細胞サイクルが、最適形質転換のために調節され得る。そのような小規模最適化研究からの結果は、本明細書において開示されており、そして他の日常の調節の実施は、当業者に知られているであろう。 II．安定したトランスジェニックトウモロコシの生成及び特徴化本明細書に論ぜられるいづれかの方法により受容体細胞に選択されたDNA配列を供給した後、本発明の次の段階は、一般的に、さらなる培養及び植物再生のために、形質転換された細胞を同定することに関する。上記で言及されたように、形質転換体を同定するための能力を改良するために、発現できる選択されたDNA 配列とて、又はその他に、選択可能又はスクリーン可能マーカー遺伝子を用いることが所望される。この場合、次に、潜在的に形質転換された細胞集団を、それを選択剤に暴露することによってアッセイすることができ、又は所望するマーカー遺伝子形質転換のために細胞をスクリーンすることができる。Ａ．選択形質転換された細胞を同定するための方法の典型的な態様は、選択剤、たとえば代謝インヒビター、抗生物質、除草剤又は同様のものに、衝撃を与えられた培養物を暴露することを包含する。形質転換され、そして使用される選択剤に対する耐性を付与するマーカー遺伝子を安定して組込んでいる細胞が、増殖し、そして培養物において分裂するであろう。敏感な細胞は、さらなる培養に対して敏感に反応しないであろう。 bar−ビアラホス又はEPSPS−グリホセート選択システムを用いるために、衝撃を受けた組織は非選択培地上で約０〜28日間、培養され、そして続いて、適切な場合、約１〜３mg／ｌのビアラホス又は約１〜３mMのグリホセートを含む培地に移される。約１〜３mg／ｌのビアラホス又は約１〜３mMのグリホセートの範囲が典型的には好ましいが、少なくとも約0.1〜50mg／ｌのビアラホス又は少なくとも約0.1〜50mMのグリホセートの範囲が本発明の実施において利用されることが提案されている。組織は、衝撃のためのいづれかの多孔性、不活性、固体又は半固体支持体、たとえばフィルター及び固体培養培地（但し、それだけには限定されない）上に配置され得る。ビアラホス及びグリホセートは、形質転換体の選択のために適切な剤の例として提供されているが、しかし本発明の技法はそれらを制限しない。スクリーン可能マーカー特徴の例は、トウモロコシにおいてＲ−遺伝子座の制御下で生成される赤色色素である。この色素は、この段階で、増殖を支持できる栄養培地を含む固体支持体上で細胞を培養し、そして色素形成されるコロニー（細胞の可視凝集体）から細胞を選択することによって検出され得る。それらの細胞は、懸濁培養において、又は固体培地上でさらに培養され得る。Ｒ−遺伝子座は、衝撃を与えられた未熟胚からの形質転換体の選択のために有用である。類似する態様において、Ｃ１及びＢ遺伝子の導入は、色素形成された細胞及び／又は組織をもたらすであろう。酵素ルシフェラーゼはまた、本発明においてスクリーン可能マーカーとして有用である。基質ルシフェリンの存在下で、ルシフェラーゼを発現する細胞は、写真又はＸ−線フィルム上で、発光計（又は液体シンチレーションカウンター）において、夜間視覚を増強する装置により、又は高い光感受性ビデオカメラ、たとえば光子カウンティングカメラにより検出され得る。すべてのそれらのアッセイは非破壊性であり、そして形質転換された細胞は、同定に続いて、さらに培養され得る。光子カウンティングカメラは、ルシフェラーゼを発現する特定の細胞又は細胞グループを同定し、そしてそれらを同時に操作することを可能にするので、特に価値あるものである。スクリーニング可能及び選択マーカーの組合せは形質転換された細胞の同定のために有用であろうと思われる。いくつかの細胞又は組織型においては、選択剤、たとえばビアラホス又はグリホセートは、形質転換された細胞を明確に認識するために活性の十分な除去を提供しても又はしなくても良く、又は形質転換体及び非形質転換体の実質的な非選択的阻害を引き起こすことができ、従って、効果的でない選択技法を引き起こす。成長阻害化合物、たとえば100％の阻害性を引き起こす濃度以下の濃度でのビアラホス又はグリホセートによる選択、続く、スクリーン可能マーカー遺伝子、たとえばルシフェラーゼの発現のための増殖組織のスクリーニングは、選択のみの影響を受けない細胞又は組織型からの形質転換体の回収を可能にすることが提案されている。例示的な態様において、ゼアマイスＬ．の胚形成タイプIIカルスは、致死下レベルのビアラホスにより選択される。続いて、遅く増殖する組織がルシフェラーゼ遺伝子の発現のためにスクリーンされ、そして形質転換体が同定された。この例においては、使用される選択条件もスクリーニング条件も、形質転換体を同定するためには十分でなかった。従って、選択及びスクリーニングの組合せは広範囲の種類の細胞及び組織型の形質転換体の同定を可能にするであろうことが提案されている。Ｂ．再生及び種子生成選択剤への暴露に対して生存する細胞、又はスクリーニングアッセイにおいて陽性であることが評価されている細胞が、植物の再生を支持する培地において培養される。典型的な態様においては、MS及びＮ６培地は、追加の物質、たとえば成長調節剤を含むことによって変性されている（アメリカ特許出願番号第08／59 4,861号の表１を参照のこと）。そのような目的のための好ましい成長調節剤は、ジカンバ(dicamba)又は２，４−Ｄである。しかしながら、成長調節剤、たとえばNAA，NAA＋２，４−Ｄ又はたぶんピクロラム（picloram）でさえ使用され得る。それらの及び同様の手段での培地の改良は、特定の成長段階で細胞の増殖を促進することが見出された。組織は、好ましくは、十分な組織が植物再生作用を開始するまで、成長調節剤を含む基本培地上で維持され、又は組織の形態等が少なくとも２週間、再生のために適切になるまで、反復した手動選択に従がい、次に、胚の成熟の助けとなる培地に移される。培養物は、この培地に２週間ごとに移される。苗条の成長は、成長調節剤を欠いている培地に移す時間の合図であろう。選択又はスクリーニングにより同定され、そして再生を支持する適切な培地において培養された、形質転換された細胞は次に、植物への成熟を可能にされるであろう。成長する苗木は、土壌を用いない植物成長混合物に移され、そして約85 ％の相対湿度、約600ppmのCO₂及び約25〜250のマイクロアインシュタインｍ^-2・Ｓ^-1の光での環境的に調節されたチャンバーにおいて堅く成長せしめられる。植物は好ましくは、成長チャンバー又は温室において成熟せしめられる。植物は、初期組織に依存して、形質転換体が同定された後、約６週〜10カ月、再生される。再生の間、細胞は組織培養容器における固体培地上で増殖される。そのような容器の例示的態様は、ペ ℃〜28℃で成長せしめられる。再生する植物が苗条及び根成長段階に達した後、それらは、さらなる成長及び試験のために、温室に移され得る。次に、成熟植物が、前記形質を発現することが知られている細胞系から得られる。可能なら、再生された植物は自家受粉される。さらに、再生された植物から得られた花粉が農業経済学的に重要な近交系の種子から増殖された植物に対して交雑される。ある場合、それらの近交系の植物からの花粉が、再生された植物を受粉するために、使用される。形質が、最初の及び後での再生子孫における形質の分離を評価することによって、遺伝的に特徴づけられる。組織培養物において選択された形質の植物における遺伝率及び発現は、その形質が商業的に有用である場合、特に重要である。再生された植物は、近交トウモロコシ植物のゲノム中に選択されたDNA配列を遺伝子移入するために、近交トウモロコシ植物に対して反復して交雑され得る。この方法は、戻し交雑転換として言及される。再現性近交親への十分な回数の交雑が、導入された選択されたDNA配列の存在を除いて、再現性近交親と実質的に同系である、戻し交雑転換の生成物を生成するために完結される場合、植物は、選択されたDNA配列を含むホモ接合性の戻し交雑転換された近交系を生成するために少なくとも１度、自家受粉される。それらの植物の子孫は真の繁殖を行なわれ、そして植物部分、たとえば種子における特定のアミノ酸の重量％、又はそれらの子孫におけるスターチの量が、広範囲の環境条件（下記参照のこと）下で野外において、再現性親近交系におけるアミノ酸の重量％及びスターチの量と比較される。アミノ酸の重量％又はスターチの量の決定法は、当業界において良く知られている。他方では、形質転換された組織培養物から再生された形質転換された単子葉植物からの種子が、野外において成長せしめられ、そして真の繁殖能力を有する植物を生成するために自家受粉される。次に、繁殖能力を有するトランスジェニック植物からの種子が、センス又はアンチセンスDNA配列の存在及び／又は発現について評価される。トランスジェニック種子組織が、標準の方法、たとえばSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、種子貯蔵タンパク質の生成における実質的な阻害について分析され得る。種子貯蔵タンパク質の生成の実質的な阻害は、形質転換されていない種子に通常存在するものより、好ましくは約70〜100％及びより好ましくは約80〜100％の種子貯蔵タンパク質の重量％の低下である。種子貯蔵タンパク質又はアミノ酸の重量％は、種子中の全タンパク質又はアミノ酸の合計重量当たり、存在するそのタンパク質又はアミノ酸の量に基づかれる。種子はまた、標準的方法により、動物の食物において必須の少なくとも１つのアミノ酸の重量％の上昇についても評価され得る。標的アミノ酸の重量％の上昇率は、形質転換されていない種子に通常存在するものに対して、好ましくは約50〜300％及びより好ましくは約100〜200％である。いづれにせよ、本発明を制限するものではないが、標的種子貯蔵タンパク質における発現の低下は、一般的に、動物の食物に必須のアミノ酸を有する他のタンパク質の上昇を伴う。センス又はアンチセンスDNA配列を発現し、そして動物の食物に必須のアミノ酸の重量％の上昇を有するトランスジェニック種子が同定されると、その種子は、真の繁殖能力を有する植物を成長せしめるために使用され得る。その真の繁殖能力を有する植物は、他の所望する農業経済的に機能的な形質を維持しながら、優性形質として動物の食物に必須のアミノ酸の重量％の増加を有する植物系を成長せしめるために使用される。農業経済的に卓越した系統への、動物の食物に必須のアミノ酸の重量％を高める形質の付加は、この形質を有する系統及びその形質を有さない系統を戻し交配し、そして分離世代における遺伝のパターンを研究することによって達成され得る。優性態様で標的形質を発現するそれらの植物が好ましくは選択される。戻る交配が、元の繁殖能力を有するトランスジェニック植物と、標的アミノ酸の高められた重量％の形質を発現しないが、所望の農業経済的機能特徴を示す近交系からの植物とを交雑することによって実施される。次に、得られる子孫が、形質を発現しない親に戻し交配される。この交配からの子孫はまた、分離し、その結果、子孫のいくつかは形質を担持し、そしていくつかは担持しない。この戻し交配は、所望する農業経済的機能形質を有するが、しかし動物の食物に必須のアミノ酸の重量％の上昇の形質を有さない近交系が優性態様で発現されるまで、反復される。戻し交配に続いて、新しいトランスジェニック植物は、動物の食物に必須のアミノ酸の重量％の上昇について、及び一群の農業経済的機能的特徴について評価される。それらの他の機能的農業経済的特徴は、核硬度(kernel handness)、収率、病気及び昆虫害虫に対する耐性、渇水耐性、及び除草剤耐性を包含する。それらの方法により改良され得る植物は、加工される植物（ニンジン、ジャガイモ、トマト、ルピナス、ヒマワリ及び綿の種子）、飼草（アルファルファ、クロバー及びウシノケグサ）、及び穀物（トウモロコシ、小麦、大麦、カラスムギ、イネ、サトウモロコシ、キビ、及びライ麦）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。植物又は植物部分は、飼料又は食物として直接使用され得、又はアミノ酸は飼料又は食物添加剤としての使用のために抽出され得る。Ｃ．安定して形質転換された植物組織の決定再生植物、又は再生された植物に由来する種子又は子孫における選択されたDN A配列の存在を確かめるために、種々のアッセイが実施され得る。そのようなアッセイは、たとえば当業者に良く知られている“分子生物学的“アッセイ、たとえばサザン及びノザンブロット及びPCR；免疫学的手段(ELISA及びウェスターンブロット)により、又は酵素機能によりタンパク質生成物の存在を検出する“生物学的”アッセイ；植物部分のアッセイ、たとえば葉、種子又は根のアッセイ；及びまた、再生された完全な植物の表現型の分析を包含する。 DNA分析技法は植物のいづれかの部分から単離されたDNAを用いて実施され得るが、RNAは特定の細胞又は組織型においてのみ発現され、そして従って、分析のためのRNAはそれらの組織から調製される必要がある。PCR技法はまた、導入された選択されたDNAセグメントから生成されたRNAの検出及び定量化のために使用され得る。PCRのこの用途においては、まず、酵素、たとえば逆転写酵素を用いてR NAをDNAに逆転写する必要があり、そして次に、従来のPCR技法の使用により、DN Aを増幅する必要がある。ほとんどの場合、PCR技法は、有用であるが、RNA生成物の完生性を示さないであろう。RNA生成物の性質についてのさらなる情報は、ノザンブロットにより得られる。この技法は、RNA種の存在を示し、そしてそのR NAの完全性についての情報を付与する。RNA種の存在又は不在はまた、ドット又はスロットブロットノザンハイブリダイゼーションを用いて決定され得る。それらの技法は、ノザンブロットの変法であり、そして常に、RNA種の存在又は不在を示すであろう。サザンブロット及びPCRは問題の選択されたDNAセグメントを検出するために使用され得るが、それらは、選択されたDNAセグメントが発現されるかどうかについての情報を提供しない。発現は、導入された、選択されたDNA配列のタンパク質生成物を特異的に同定し、又はそれらの発現により引き起こされる表現型の変化を評価することによって、評価され得る。特定のタンパク質の生成及び同定のためのアッセイは、タンパク質の物理的− 化学的、構造的、機能的、又は他の性質を使用することができる。ユニークな物理的−化学的又は構造的性質は、電気泳動方法、たとえば生来の又は変性されたゲル電気泳動、又は等電点電気泳動による、又はクロマトグラフィー技法、たとえばイオン交換又はゲル排除クロマトグラフィーによるタンパク質の分離及び同定を可能にする。個々のタンパク質のユニーク構造は、それらの存在を、ELISA アッセイのような型式により検出するために、特定の抗体の使用のための機会を付与する。高い特異性を有するアプローチ、たとえば抗体が電気泳動技法により分離された個々の遺伝子生成物を位置決定するために使用されるウェスターンブロットの組合せが使用され得る。追加の技法は、精製に続いてのアミノ酸配列決定により、注目の生成物の正体を絶対的に確かめるために使用され得る。それらは中でも最っと日常的に使用されるが、他の方法もさらに使用され得る。非常に頻繁には、遺伝子生成物の発現は、その発現の表現型結果を評価することによって決定される。それらのアッセイはまた、植物の化学的組成、形態、又は生理学的性質の変化を分析するために多くの形を取ることができる。化学的組成は、アミノ酸組成を変える貯蔵タンパク質をコードする予備選択されたDNAセグメントの発現により変更され得、そしてアミノ酸分析により検出され得る。 IV．動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸の重量％の上昇本発明は、その対応する形質転換されていない（非トランスシミニック）植物又はその種子に通常存在するものよりも、トランスジェニック植物又は種子における、動物の食物に必須のアミノ酸の量を高めることに向けられる。植物細胞は、種子貯蔵タンパク質、好ましくは、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸において不完全である種子貯蔵タンパク質をコードするmRNAに対して、実質的な同一性（センス）又は相補性（アンチセンス）を有するRNA分子をコードする予備選択されたDNA配列により安定して形質転換される。形質転換された細胞は、繁殖能力を有するトランスジェニック植物及び種子を再生するために使用される。アンチセンス又はセンスRNA分子は、種子貯蔵タンパク質の生成を阻害するのに効果的な量で種子において発現される。必須アミノ酸において不完全な種子貯蔵タンパク質の低下は、形質転換されていない種子に通常存在するものよりも、トランスジェニック種子における他のタンパク質に存在する他のアミノ酸、好ましくは必須アミノ酸の重量％の上昇をもたらす。好ましい態様においては、トウモロコシ細胞系は、10KDのゼインタンパク質のためのプロモーターに操作可能的に連結される19KD又は22KDのα−ゼインタンパク質をコードするmRNAのすべて又は一部に対して実質的に同一か又は相同的なRN Λ分子をコードする選択されたDNA配列を含んで成る発現ベクターにより形質転換される。もう１つの好ましい態様は、Ｚ27プロモーターに選択されたDNA配列を連結することを包含する。発現ベクターは好ましくは、さらに、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含んで成る。トウモロコシ細胞系は、バイオリスティク(biolistic)形質転換により形質転換され、そして形質転換体は始め、その対応する形質転換されていない細胞の増殖を阻害するレベルで存在する剤の存在下での増殖により選択される。形質転換体はさらに、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)又は逆転写酵素(RT−PCR)分析により、選択されたDNA配列の存在又は発現のために特徴づけられる。選択されたDNA分子を有する形質転換されたトウモロコシ細胞系は、PCR公開WO95／06128号に記載のような方法により繁殖性トランスジェニック植物を再生するために使用される。その繁殖性トランスジェニック植物は、自家受粉され、又は第２の植物種に交雑され、そしてトランスジェニック種子は、定量的ウェスターンブロット又はSDS−PAGEにより19KD又は22KDのα−ゼインタンパク質の生成の阻害について、及び動物の食物に必須のアミノ酸、たとえばリシンの重量％の上昇について特徴づけられる。他の態様においては、本発明は、少なくとも２つの異なった予備選択されたDN A配列により植物組織源の細胞を安定して形質転換することによって、植物又は種子における動物の食物に必須のアミノ酸の重量％を高めることに向けられる。第１の選択されたDNA配列は、種子貯蔵タンパク質、好ましくは、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸において不完全である種子貯蔵タンパク質のためのmRNAに対して実質的に同一の、又は相補的なRNA分子をコードする選択されたDNA配列を含んで成る。第２の選択されたDNA配列は、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸を含んで成るポリペプチドをコードする。選択されたDNA 配列の１つ又は両者を含んで成る発現カセットは、任意には、選択マーカー遺伝子、及び任意にはレポーター遺伝子を含むことができる。個々の選択されたDNA 配列は、異なった選択マーカー遺伝子を含んで成り、その結果、両選択されたDN A配列を含む形質転換体は容易に選択され得る。植物組織源の細胞、及び前述の形質転換方法が、同時形質転換に使用され得る。同時形質転換は、連続的に行なわれ得、すなわち植物組織源の細胞が第１の選択されたDNA配列により形質転換され、そして形質転換体が選択され得る。次に、形質転換体が、第２の選択されたDNA配列により形質転換され、そして両選択されたDNA配列を有する形質転換体が選択され得る。典型的には、初期選択は、選択マーカー遺伝子により形質転換される形態に基づかれる。同時形質転換はまた、１つの段階において行なわれ、すなわち植物組織源の細胞が、たとえばエレクトロポレーション又はバイオリスティック形質転換により一度に、両選択されたDNA配列により形質転換され得る。他方では、２つの植物が交雑され得る。１つの植物のゲノムは第１の選択されたDNA配列を含み、そして交雑における他の植物のゲノムは第２の選択されたDNA配列を含んで成る。両選択されたDNA配列を含む形質転換体はさらに、標準の方法、たとえばPCR又はRT−PCR、サザンブロットハイブリダイゼーション、SDS−PAGE及び定量ウェスターンブロットにより、第１の選択されたDNA配列及び第２の選択されたDNA配列の存在及び／又は発現について特徴づけられる。導入された両配列を有する形質転換体は、前述のようにして、それから繁殖能力を有するトランスジェニック植物及び種子を生成するために使用される。次に、トランスジェニック種子が、両選択されたDNA配列の存在及び／又は発現について特徴づけられる。第１の選択されたDNA配列の発現は、動物の食物に必須のアミノ酸において不完全な種子貯蔵タンパク質の生成の実質的な阻害について種子を試験することによって検出され、そして定量化され得る。第２の選択されたDNA配列の発現は、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸を含んで成る植物タンパク質について定量ウェスターンブロットにより、及び／又は動物の食物に必須のアミノ酸、たとえばリシン又はメチオニンの重量％の、形質転換されていない種子に比較しての上昇により、検出され、そして定量化され得る。好ましい態様においては、トウモロコシ細胞系は、19KD又は22KDのα−ゼインタンパク質をコードするmRNAのすべて又は一部に対して実質的に同一の又は相補的なRNA分子をコードする第１の選択されたDNA配列、及び10KDのゼインタンパク質をコードする第２の選択されたDNA配列により同時形質転換される。19KD又は2 2KDのα−ゼインタンパク質は好ましくは、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸、たとえばリシン、メチオニン又はトリプトファンにおいて不完全である。10KDのゼインタンパク質は好ましくは、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸、たとえばメチオニンを含んで成る。第１の選択されたDNA配列を含んで成る、単離され、精製されたDNA分子はまた好ましくは、選択マーカー遺伝子、又はレポーター遺伝子、たとえばGUSを含んで成る。第２の選択されたDNA分子は、第２の選択マーカー遺伝子、たとえばグリホセート耐性EDSPSを含むことができる。本発明のさらなる態様においては、トウモロコシは、19KD又は22KDのα−ゼインmRNAに対して同一か又は相補的であるRNA分子をコードする第１の選択されたセンスDNA配列、及び合成タンパク質MB１をコードする第２の選択されたDNA配列により同時形質転換される。他方では、第２の選択されたDNA配列は27KDのゼインタンパク質をコードする。従って、動物の食物に必須の少なくとも１つのアミノ酸を含んで成る他の合成又は天然に存在するタンパク質をコードする遺伝子が、MB１により置換され得ると思われる。さらにより好ましくは、トウモロコシは、19KD又は22KDのα−ゼインmRNAに対して同一か又は相補的であるRNA分子をコードする第１の選択されたセンスDNA配列、合成タンパク質MB１をコードする第２の選択されたDNA配列、及び27KDのゼインタンパク質をコードする第３の選択されたDNA配列により同時形質転換される。両選択されたDNA配列を有する形質転換体は、繁殖能力を有するトランスジェニック植物及び種子を含んで生成するために使用される。トランスジェニック種子は、定量ウェスターンブロットにより、及び動物の食物に必須のアミノ酸、たとえばメチオニン又はリシンの重量％の上昇により決定される、19KDの又は22KD のα−ゼインタンパク質の生成の実質的な阻害により特徴づけられる。トランスジェニック種子及び植物は、真の繁殖能力を有する植物を成長せしめるために使用され、その結果、動物の食物に必須のアミノ酸の重量％の上昇の形態が、上記のようにして、農業経済的に機能的性質をまだ維持しながら、優性形質として発現され得る。Ｖ．植物種子中のスターチ含有率を高めるための方法本発明はまた、植物及び／又は種子における澱粉の重量％の上昇を付与する。前記方法は、少なくとも１つの種子貯蔵タンパク質をコードするmRNAのすべて又は一部に対して実質的に相同の又は相補的なRNA分子をコードする第１の選択されたDNA配列により植物組織の細胞を安定して形質転換することを含んで成る。決っして本発明を制限するものではないが、種子における種子貯蔵タンパク質の発現の低下が種子における澱粉の重量％の上昇をもたらすと思われる。選択されたDNA配列は好ましくは、植物及び／又は種子において機能的なプロモーターに作用可能に連結される。形質転換された細胞は、繁殖能力を有するトランスジェニック植物及び／又は種子を再生するために使用される。トランスジェニック種子は、少なくとも１つの種子貯蔵タンパク質の生成の実質的な阻害について種子を試験することによっての選択されたDNA配列の発現について、及び形質転換されていない種子に通常存在するものに対する、澱粉の重量％の上昇について特徴づけられる。第１の選択されたDNA配列は、少なくとも１つの植物種子貯蔵タンパク質をコードするDNA配列に由来する。植物種子貯蔵タンパク質は、トウモロコシのゼインタンパク質、たとえばα−、β−、γ−、又はδ−ゼインタンパク質を包含する。必ずしも本発明を制限するものではないが、種子貯蔵タンパク質の発現の低下は、種子におけるスターチの重量％の上昇をもたらすと思われる。好ましくは、第１の選択されたDNA配列の存在は、少なくとも１つの種子貯蔵タンパク質の実質的な阻害をもたらし、そしてより好ましくは、α−ゼインタンパク質の阻害をもたらす。前記第１のDNA配列の調製及び適切なプロモーターへのその結合は、下記のように達成され得る。植物組織の細胞が上記のようにして形質転換され、そして形質転換体が選択される。形質転換体は、繁殖能力を有するトランスジェニック植物及び種子を生成するために使用される。トランスジェニック種子は、形質転換されていない種子に存在するものよりも、種子におけるスターチの重量％の上昇により特徴づけられる。種子におけるスターチ含有物の重量％は、酵素加水分解及びグルコース決定により測定され得る。スターチの重量％は、種子の合計重量に対して、種子におけるスターチの重量を比較することによって計算される。トランスジェニック種子におけるスターチの重量％の上昇率は、形質転換されていない種子におけるスターチに対して、好ましくは約１〜10％、より好ましくは約３〜８％及びさらにより好ましくは約５〜７％である。スターチの重量％の上昇を有するトランスジェニック種子は、前記のようにして、農業経済的に機能的な形質をまだ維持しながら、優性態様でこの形質を発現する真の繁殖植物を成長せしめるために使用され得る。トウモロコシ核（kernel）におけるα−ゼインレベルの低下はまた、核における澱粉顆粒を取り囲むタンパク質性マトリックスの主要部分を構成するα−ゼインとして、穎果の湿式微粉砕のような操作からの澱粉回収の程度を高めることができる(Lopes and Larkins，1993)。それらの疎水性タンパク質の量の低下は、澱粉顆粒の回収を促進する。これは、高アミローストウモロコシ、又はロウ質トウモロコシから得られる特殊澱粉のために特に有意である。なぜならば、それらの澱粉はNo．２黄色のデント・トウモロコシから得られる価値よりも、より高い価値のものであるからである。澱粉収率の上昇、すなわち湿式微粉砕により回収され得る、核に存在するスターチの上昇率は、選択されたDNA配列を含まない植物からの穎果に対して、選択されたDNA配列を含む植物からの穎果において、好ましくは約１〜20％、より好ましくは約３〜15％及びさらにより好ましくは約６〜12％高い。 VI．種子貯蔵タンパク質のファミリー又はサブファミリーの発現を阻害するための方法本発明はまた、種子貯蔵タンパク質のファミリー又はサブファミリーの発現を阻害するための方法も提供する。種子貯蔵タンパク質、たとえばトウモロコシゼインタンパク質は、多重遺伝子族によりコードされる。ゼインタンパク質に対応するその多重遺伝子族は、次のような異なった分子量を有する：α−ゼインタンパク質は19KD及び22KDの分子量を有するタンパク質を含み；β−ゼインタンパク質は14KDの分子量を有するタンパク質を含み；γ−ゼインタンパク質は約27KD及び16KDの分子量を有するタンパク質を含み；そしてδ−ゼインタンパク質は約10 KDの分子量を有するタンパク質を含む。個々のファミリーは、いくつかのサブファミリーを有することができる。たとえば、α−ゼインタンパク質のためのサブファミリーは、Messingなど.,前記により記載されるように、cDNAクローンＡ20 ，Ａ30，Ｂ49，Ｂ59及びＢ36に対する配列相同性、又は22KDのα−ゼインをコードするＺ４cDNAクローンに対する配列相同性に基づいて決定される。典型的には、同じファミリーのメンバーは、約90％〜100％のアミノ酸配列相同性を共有し、そして異なったサブファミリーのメンバーは、約60％〜80％のアミノ酸配列相同性を共有する。 α−ゼインサブファミリーについてのアミノ酸配列の試験は、４種の機能的サブドメイン、及び図１に示されるようなそれらの機能的サブドメインにおける共有されるアミノ酸相同性の領域を同定した。それらのアミノ酸相同性の領域が、相同性について、ゼインタンパク質の他のサブファミリー及びファミリーからのアミノ酸配列を分析するために使用され得る。さらに、それらの領域は、ゼインタンパク質のファミリー又はサブファミリーの生成を阻害できるRNA分子をコードするDNA配列を選択するためにも使用され得る。ゼインタンパク質のファミリー又はサブファミリーの生成を阻害できるアンチセンスRNA配列は好ましくは、ゼインタンパク質のサブファミリー又はファミリーのすべてのメンバー間で実質的に相同である mRNA配列の一部に対して実質的に相補的である配列である。他方では、選択されたセンスDNA配列は、ゼインのファミリー又はサブファミリーの合成を抑制するために使用され得ると思われる。たとえば、図１に示されるように、Ａ20，Ａ30及びＢ49サブファミリーは、タンパク質のシグナルペプチド領域及びアミノ末端領域においてアミノ酸配列相同性を共有する。ゼインタンパク質のそれらの領域をコードするアンチセンスDNA 配列は、ゼインタンパク質のファミリーのための発現を阻害することができるRN A分子をコードすることができる。それらの領域をコードするアンチセンスDNA配列は、それらの領域におけるアミノ酸配列相同性に基づいて選択され得、そしてゼインタンパク質の１つ以上のサブファミリー又はファミリーの発現を阻害するために使用され得る。 20個のアミノ酸のタンデム反復体を含むドメインは、アミノ酸配列及びサイブにおいて最大の変動性を有する。異なったサブファミリーの配列が比較される場合、この領域に挿入及び欠失が存在する。α−ゼインタンパク質のこの領域をコードする選択されたアンチセンスDNA配列は、ゼインタンパク質のサブファミリーの発現を阻害できるRNA分子を発現するために使用され得る。ゼインタンパク質のこの領域からの選択されたアンチセンスDNA配列は、サブファミリー内で実質的に相同であるが、しかしサブファミリー間では実質的に相同でない。選択されたアンチセンスDNA配列は、種子貯蔵タンパク質のファミリー又はサブファミリーの翻訳を阻害するためのアンチセンスDNA配列の能力を決定するためのアンチセンス発現カセットを形成するために、プロモーターに連結される。標準的アッセイ、たとえばハイブリット阻止された翻訳法が使用され得る。選択されたアンチセンスDNA配列は、いくつかのサブファミリー、たとえばＡ20，Ｚ４，Ａ30及び／又はＢ49からのcDNAクローンの翻訳の実質的な阻害をもたらす。選択されたアンチセンスDNA配列は、ゼインタンパク質のファミリーを阻害することができる。選択されたアンチセンスDNA配列は、サブファミリー内のcDNAクローン又はゲノムクローンの翻訳を実質的に阻害し、そして選択されたアンチセンスDNA配列はゼインタンパク質のサブファミリーの発現を阻害するために使用され得る。選択されたアンチセンスDNA配列は、上記のような植物細胞を安定して形質転換するために使用される。センスDNA配列もまた使用され得る。繁殖能力を有するトランスジェニック植物及び種子は、形質転換された細胞から生成される。トランスジェニック種子は、定量ウェスターンブロットのような技法を用いることによって、ゼインタンパク質のファミリー又はサブファミリーの複数のメンバーの生成の阻害を評価することによって、選択されたアンチセンスDNA配列の発現について特徴づけられる。好ましい態様においては、Ａ20サブファミリーにおけるα−ゼインタンパク質のドメイン３のタンデム反復体領域をコードするmRNAに対して実質的に相補的な RNA分子をコードする好ましいアンチセンスDNA配列は、Ｚ10プロモーターと組合される。選択されたアンチセンスDNA配列を含んで成る発現カセットはまた、１又は複数の選択マーカー遺伝子を含むことができる。その予備選択されたアンチセンスDNA配列は、トウモロコシ細胞系中に安定して形質転換され、そして形質転換体は選択される。形質転換された細胞は、繁殖能力を有するトランスジェニック植物及び種子を生成するために使用される。トランスジェニック種子は、定量ウェスターンブロットによりα−ゼインタンパク質のＡ20サブファミリーの生成における実質的な阻害を確かめることによって、選択されたアンチセンスＤ NA配列の発現について評価される。 VII．種子における選択されたポリペプチドの生成を高めるための方法本発明はさらに、植物及び／又は種子における特定のポリペプチドの発現を高めるための方法を提供する。この方法は、必須アミノ酸において不完全な種子貯蔵タンパク質の合成を抑制するための第１の選択されたDNA配列、及びポリペプチド、たとえば酵素又は種子貯蔵タンパク質をコードする第２の選択されたDNA 配列による細胞の安定した形質転換を包含する。必ずしも本発明を限定するものではないが、少なくとも１つの種子貯蔵タンパク質の生成の実質的な阻害は、他のタンパク質を生成する植物細胞及び／又は種子の能力の上昇を伴うと思われる。第１及び第２の選択されたDNA配列を有する形質転換された細胞が得られ、そして繁殖性トランスジェニック植物及び／又は種子を生成するために使用される。第１の選択されたDNA配列は、少なくとも１つの種子貯蔵タンパク質のためのアンチセンス又はセンスRNAをコードする。第１の選択されたDNA配列は、発現カセットを形成するために、植物及び／又は種子において機能的なプロモーターと組合される。任意には及び好ましくは、発現カセットはまた、選択マーカー遺伝子、及ひ任意には、レポーター遺伝子を含んで成る。ポリペプチドをコードする第２の選択されたDNA配列は、植物及び／又は種子において機能的なプロモーターに作用可能に連結される。好ましくは、プロモーターは、植物及び種子の成長の間、機能的である。第２の選択されたDNA配列は、植物又は種子に、所望する機能的特徴、たとえば高められた病気又は害虫耐性、渇水耐性、高められたアミノ酸生合成、高められた栄養価値、高められた核硬度、及び同様のものを付与するポリペプチドをコードする。選択されたDNA配列は、Sambrookなど.,前記に提供される標準の方法により及び前記のようにして、プロモーターに作用可能に連結され得る。任意に及び好ましくは、第２の選択されたDNA配列を含んで成る発現カセットはまた、第１の選択されたDNA配列を含んで成る発現ベクターに存在する選択マーカー遺伝子とは異なる選択マーカーを含む。植物細胞の形質転換は、前記方法のいづれか１つの方法により実施される。植物細胞は、第１及び／又は第２の選択されたDNA配列により、連続的に又は同時に、形質転換され得る。植物細胞が連続的に形質転換される場合、第１の選択された配列を含んで成る形質転換体が、選択マーカー遺伝子の存在に基づいて得られる。次に、それらの形質転換された細胞は、第２の選択されたDNA配列により形質転換され、そして形質転換体が、第１の選択されたDNA配列を含んで成る発現カセット上に存在し、及び第２の選択されたDNA配列を含んで成る発現カセット上に存在する選択マーカー遺伝子の個々の存在に基づいて得られる。第１及び第２の選択されたDNA配列の両者を含む形質転換体が、繁殖能力を有するトランスジェニック植物及び／又は種子を再生するために使用される。トランスジェニック種子は、第１及び第２の選択されたDNA配列の発現により特徴づけられる。第１の選択されたDNA配列の発現は、少なくとも１つの種子貯蔵タンパク質の生成の実質的な阻害を測定することによって評価される。第２の選択されたDNA配列の発現は、標準の表現型又は遺伝子型方法、たとえばウェスターンブロットを用いて、選択されたポリペプチドを検出することによって評価される。ポリペプチドの発現の上昇は、第２の選択されたDNA配列により形質転換された植物又は種子に生成されるタンパク質の重量％を比較することによって決定され得る。ポリペプチドの発現は、第２の選択されたDNA配列により形質転換された植物及び／又は種子におけるよりも、好ましくは、約２〜100倍、及びより好ましくは、約５〜30倍、高められる。本発明は、次の例によりさらに説明されるであろう。実施例１．アンチセンスＤＮＡ構築物を含有するプラスミドの構築ゼインタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンからの配列を使用することによって、アンチセンス発現カセットを得た。以前にＧｅｔａｇｈｔｙｅｔａｌ．（１９８２）およびＨｕｅｔａｌ．（１９８２）により記載された、標準的方法により、ｃＤＮＡクローンを調製した。ｃＤＮＡクローンＡ２０は、ゼイン遺伝子のＺ１Ａサブファミリーの１９ｋＤの大きさのクラスのα−ゼインタンパク質をコードする。Ｚ４と表示する他のｃＤＮＡクローンは、遺伝子のＺ１Ｂファミリーの２２ｋＤの大きさのクラスのα−ゼインをコードする。Ｚ１ＡおよびＺ１Ｂのサブファミリーおよびそれらの特性を表Ｉに示す。クローンＡ２０およびＺ４の完全なｃＤＮＡ配列、ならびにそれらの配列の一部分を含んでなるアンチセンス発現カセットを発生させた。１９ｋＤおよび２２ｋＤのα−ゼインタンパク質の配列を検査することによって、各配列の一部分を選択した。第１図に示すように、ポリペプチドの主要な配列は、Ｍｅｓｓｉｎｇｅｔａｌ．（１９８３）が記載するように、４つのドメインに分割することができる。ドメインＩは高度に保存された２１アミノ酸のシグナルペプチドを含有する、このペプチドは内質網状質のルーメンの中へのゼインタンパク質の共翻訳輸送の間に切断される。ドメイン１１およびＩＶは、成熟ゼインタンパク質の、それぞれ、Ｎ−末端およびＣ−末端である。ドメインはＩＩＩは、２０アミノ酸の配列をコードする配列の９〜１０の直列反復を含有するので、サブファミリーの間の配列の相同性の主要な源を表す。ドメインＩＩＩの中に存在する反復の数は、α−ゼインタンパク質の大きさ（１９ｋＤまたは２２ｋＤ）を決定する。典型的には、サブファミリー内の個々のメンバーは９０〜１００％の配列の相同性を共有するが、サブファミリーの間の配列の相同性は約６５〜８５％の範囲である。詳細に後述する標準的組換え技術により、転写ベクターｐＳＰ７２およびｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウイスコンシン州メディソン）を使用して、ｉｎｖｉｔｒｏ系の分析のためのすべてのアンチセンスプラスミドを構築した。これらの転写ベクターは２．４６ｋｂの環状プラスミドであり、収れんＴ７およびＳＰ６転写プロモーターの間に挿入された１０３ｂｐのポリリンカー配列を含有する。２つの転写ベクターはプロモーターに関するポリリンカーの向きが異なる。アンチセンスプラスミドは、ｃＤＮＡクローンＡ２０およびＺ４のすべてまたは一部分に対して相補的であり、後述するように構築された。Ａ２０ゼインのＲＮＡ配列（配列識別ＮＯ：１）およびＺ４ゼインのＤＮＡ配列（配列識別ＮＯ：２）を、それぞれ、第２図および第３図に示す。アンチセンス構築物において使用する、関係するＡ２０およびＺ４遺伝子および遺伝子フラグメントを表ＩＩに示す。すべての制限酵素および修飾酵素および緩衝剤は、特記しない限り、ニュー・イングランド・バイオラブス・インコーポレーテッド（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ．）（マサチュセッツ州ベバーリイ）から入手し、製造業者の使用説明書に従い使用した。すべてのインサートフラグメントを、ジェネクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）法（ＢＩＯ１０１、カリフォルニア州ヴィスタ）により、ゲル単離し、精製し、そしてすべてのベクターを仔ウシ腸ホスファターゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、インジアナ州インヂアナポリス）で処理し、次いで低融点アガロース上でゲル単離した後、結合反応に添加した。Ａ２０およびＺ４からのｃＤＮＡクローンのすべてまたは一部分をコードするアンチセンス構築物を、次のようにして調製した：ＳＰ２０ＥＮＴ：Ａ２０ｃＤＮＡクローン（Ａ２０のＲＮＡ配列は第２図に示されている）からの全体の成熟コーディングおよび３’非翻訳配列（ｎｔｓ）を含有する、親プラスミドｐＵＣ１２／Ａ２０を、ＥｃｏＲＩ部位（ヌクレオチド１７５）およびＢａｌＩ部位（ヌクレオチド８８６）において消化して、３’ ｎｔｓの５５ｂｐを除外する全体の配列を含有する７１１ヌクレオチドのフラグメントを発生させた。ＥｃｏＲＩおよびＰｖｕＩＩで消化したｐＳＰ７２の中に、このフラグメントを結合して、ＳＰ６プロモーターに関して遺伝子の３’→５ ’アンチセンスの向きの遺伝子を発生させた。ＳＰ２０Ｒ３’：ヌクレオチド２９８におけるＰｓｔＩ部位からヌクレオチド８８６におけるＢａｌＩ部位までの３’ｎｔｓを通る中間反復領域をコードする配列を含有する４８８ｂｐのフラグメントを、実施例２におけるように調製した親プラスミドｐ１０２０Ｒ３’から単離した。ｐ１０２０Ｒ３’をＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化してフラグメントを発生させ、単離後、このフラグメントをこれらの酵素でまた消化したｐＳＰ７２の中に結合した。したがって、遺伝子のフラグメントはＳＰ６プロモーターに関して５’→３’の向きであった。ＳＰ２０Ｒ：ｐＵＣ１２／Ａ２０をＰｓｔＩで消化することによって、ヌクレオチド３９８からヌクレオチド６６０までの２６２ｂｐのフラグメントを発生させた。精製したフラグメントをＰｓｔＩで消化したｐＳＰ７２の中に結合して、ＳＰ６プロモーターに関して３’→５’の向きのＡ２０の中間反復領域をコードする配列を含有するｐＳＰ２０Ｒを作った。ＳＰ２０Ｐ：５’ｎｔｓを含有しかつ中間反復領域を通るシグナルペプチドをコードするフラグメントのＰＣＲ増幅により、Ａ２０転写単位の５’末端を再構築した。なぜなら、５’ｎｔｓおよびシグナルペプチドの配列はｐＵＣ１２／Ａ２０クローンの中に含有されなかったからである。増幅において使用したプライマーを、Ａ２０Ｐ５’．２（配列識別ＮＯ：３）およびＡ２０Ｐ３’（配列識別ＮＯ：４）と表示する。トウモロコシ同系交配系統Ａ６５４からの葉の組織から単離したゲノムＤＮＡからフラグメントを増幅し、そしてこのフラグメントはヌクレオチド５８からヌクレオチド４９０までの４５８ｂｐのＡ２０ｃＤＮＡ配列を含有した。ＰＣＲの条件を下に詳述する；すべての反応はＢｉｏｓｙｃｌｅｒTM炉（ＢｉｏｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中で実施した。各反応は、合計の１００．５μ ｌ／反応について、１０μｌの１０×ＰＣＲ反応緩衝液、１０μｌの２０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μｌの２ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０μｌの各プライマー（貯蔵液２．５ｍｌ）および０．５μｌ（２．５Ｕ）のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）を含有した。５６℃のアニーリング温度を使用し、そして合計３０サイクルを実施し、これらのサイクルは９４℃の変性温度における延長したインキュベーションを有する最初の３サイクルを含んだ。最初の３サイクルについてのパラメーターは下記の通りであった：９４℃において６０秒、５６℃のアニーリング温度において３０秒、および７２℃の合成温度において３０秒。残りの２７サイクルについて、パラメーターは下記の通りであった：反応を９４℃にした後、この温度において１５秒、次いで５６℃において１５秒、次いで７２℃において１５秒。４５８ｂｐの産物を設計して５’ＥｃｏＲＩ部位を付加し、内因性３’ＡｃｃＩ部位を含めた。これらの酵素で消化した後、増幅されたフラグメントをまたこれらの酵素で消化したｐＳＰ２０ＥＮＴの中に結合し、ｐＳＰ２０ＥＮＴからのＡ２０のより短い５’末端のフラグメントを含有する３２０ｂｐのフラグメントを置換した。再構築後、遺伝子はほぼ８６０ｂｐの長さであり、そしてほぼ５５ヌクレオチドの５’ｎｔｓ、シグナルペプチドをコードする配列、および全体のコーディング領域ならびに３’ｎｔｓを含有した。再構築された遺伝子はＳＰ６プロモーターに関して３’→５’の向きであった。ＳＰ２０Ｐ５’：Ａ２０遺伝子の５’を、ＰＣＲ増幅およびＥｃｏＲＩおよびＡｃｃＩを使用する消化後、ｐＳＰ７２の中にクローニングしてｐＳＰ２０Ｐ５’を発生させた。この構築物は４８５ヌクレオチドのＡ２０を含有し、５５ヌクレオチドの５’非翻訳配列および４０３ヌクレオチドのコーディング配列を含み、コーディング配列のほぼＮ−末端の半分を含む。挿入された配列はＳＰ６プロモーターに関して３’→５’の向きであった。ＳＰＺ４ＥＮＴ：本質的に、全体のＺ４転写単位はこのクローンの中に含有され、合計のインサートの大きさが９６０ヌクレオチドである。後述する２つのＺ４サブクローン、ｐＳＰＺ４Ｒ３’およびｐＳＰＺ４５’から、遺伝子を再構築した。親ベクターはｐＳＰＺ４Ｒ３’であり、Ｚ４配列のヌクレオチド６３０からヌクレオチド１３４１までの、３’ｎｔｓ配列に対して７１３ヌクレオチドの中間反復を含有した（Ｚ４のＤＮＡ配列は第３図に示されている）。ＳａｃＩ（これは挿入された遺伝子の外側のポリリンカー配列を切断する）およびＢａｍＨＩを使用する消化により、Ｚ４の５’末端を解放し、そしてＳａｃＩ（これもポリリンカー配列を切断する）およびｄＢａｍＨＩ消化により得られた、ｐＳＰＺ４５’からの５’配列を含有するインサートを線状化されたｐＳＰＺ４Ｒ３’に結合して、完全なＺ４転写単位を再構築した。ＳＰＺ４Ｒ３’：ＢａｍＨＩ（ヌクレオチド６３０）およびＸｂａＩ（ヌクレオチド１３４１）で消化後、３’非コーディング領域に対して中間反復領域を含有する、７１３ヌクレオチドのインサートフラグメントを単離した。同一酵素で消化したｐＳＰ７２の中に、このフラグメントを結合して、ＳＰ６プロモーターに関して３’→５’の向きの遺伝子フラグメントを発生させた。ＳＰＺ４５’：７６ヌクレオチドの５’非コーディング領域、シグナルペプチドの配列、およびほぼ１００ヌクレオチドの成熟タンパク質のコーディング配列を含有する２４７ヌクレオチドのフラグメントをｐＳＰ７２の中にクロ−ニングした。ＤｄｅＩで消化した後、ＤＮＡをクレノー処理して平滑末端をつくり、次いでＢａｍＨＩで消化して所望のフラグメントを解放した。フラグメントをＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化したｐＳＰ７２の中に結合して、ＳＰ６プロモーターに関して３’→５’の向きの遺伝子フラグメントを発生させた。ＳＰＺ１０ＥＮＴ：全体のＺ１０転写単位を含有する６７０ヌクレオチドのフラグメントを、ＥｃｏＲＩを使用する消化により、１０ｋＤのゼインｃＤＮＡクローンｐ１０ｋＺ−１から単離した（１０ｋＤのゼイン遺伝子の溶液はＫｉｒｉｈａｒａｅｔａｌ．１９８８の中に見出すことができる）。また、ＥｃｏＲＩでｐＳＰ７２を消化した後、インサートをベクターと結合して、ｐＳＰＺ１０ＥＮＴ、である３．１６ｋｂの環状プラスミドを生産した。双方の向きを含有するクローンが得られ、そしてＳＰ６プロモーターに関して３’→５’の向きの１０ｋＤの転写単位を含有するクローンをハイブリッド停止研究において使用した。実施例２．トウモロコシの形質転換において使用するためのアンチセンスＤＮＡ配列を含有するプラスミドの構築上の実施例１に詳細に記載したＺ４およびＡ２０配列の全体または一部分を使用して、トウモロコシ中で発現させるための１組のアンチセンスプラスミドを構築した。アンチセンス構築物を植物の内胚乳組織において機能するプロモーターと組合わせて、植物の種子の中で発現することができるＤＮＡ配列を形成した。ベクターの構築物プラスミドｐ１０Ｂおよびｐ１０Ｘをｐ１０ｎｏｓ３’から構築した。構築物ｐ１０ｎｏｓ３’は、短いポリリンカーから上流の１０ｋＤのゼインプロモーターをコードする遺伝子からの１１３７ｂｐのＺ１０プロモーターを含有し、前記ポリリンカーはｎｏｓポリＡ３’因子に隣接する。ｐ１０ｎｏｓ３’をＢａｍＨＩで消化し、クレノー処理してＢａｍＨＩ部位を平滑とし、次いでポリリンカーのインサートと結合して、Ｚ１０プロモーターに関して双方の向きのポリリンカーを含有するクローンを発生させることによって、ベクターｐ１０Ｘおよびｐ１０Ｂをつくった。ｐＳＰ７３をＢｇｌＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、次いでクレノー処理し、次いで調製されたｐＺ１０ｎｏｓ３’ベクターと結合することによって、ポリリンカーのフラグメントを得た。ｐ１０ＸバージョンはＺ１０プロモーターに近接するＸｈｏＩ部位で配向されたポリリンカーを含有するが、ｐ１０ＢバージョンはＺ１０プロモーターに近接するＢｇｌＩＩＩ部位で配向されたポリリンカーを含有する。双方のプラスミドはほぼ４．６５ｋｂの環状プラスミドである。実施例１に記載したように調製したアンチセンスＤＮＡ発現構築物を、後述するように、ｐ１０Ｂおよびｐ１０Ｘプラスミドを利用して、植物種子中で機能的なプロモーターと組合わせた。１０２０ＥＮＴ：ＳＰＺ１０ＥＮＴをＣｌａＩ（ポリリンカー配列において切断する）およびＸｈｏＩで消化することによって、成熟Ａ２０コーディング配列および３’非コーディング配列（実施例１、ＳＰＺ１０ＥＮＴの節を参照）を含有し、かついくつかのポリリンカー配列を含む、７２５ヌクレオチドのインサートフラグメントを得た。また、ＣｌａＩおよびＸｈｏＩで消化し、次いでインサートおよびベクターを結合して、Ｚ１０プロモーターに関して３’→５’に挿入されたＡ２０配列を含有するｐＳＰＺ１０ＥＮＴを発生させることによって、ベクターｐ１０Ｘを調製した。１０２０Ｒ３’：Ａ２０の３’非コーディング配列に対して中間反復を含有する、４８８ヌクレオチドのインサートフラグメントを、クローンｐＵＣ１２／Ａ２０から単離した。このインサートは、ヌクレオチド３９８におけるＰｓｔＩ部位からヌクレオチド８８６におけるＢａｌＩ部位に続く配列を含有する。Ａ２０配列の外側で切断するＨｉｎｄＩＩＩでｐＵＣ１２／Ａ２０を消化し、次いでｐｓｔＩ（ヌクレオチド３９８のＰｓｔＩ部位においてのみ消化する）で部分的に消化し、次いで７４０ヌクレオチドの所望のフラグメントをゲル単離することによって、フラグメントを得た。精製後、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩフラグメントをＢａｌＩで消化し、これは３’末端からほぼ２５２ヌクレオチドを除去し、ＰｓｔＩ／ＢａｌＩ末端を有する４８８ヌクレオチドのフラグメントを発生させた。このフラグメントをＳｍａＩおよびＰｓｔＩで切断したｐ１０Ｂの中に結合して、Ｚ１０プロモーターに関して３’→５’の向きでＡ２０Ｒ３’を挿入した。１０２０Ｒ：ｐＵＣ１２／Ａ２０をＰｓｔＩで消化することによって、Ａ２０からの中間反復領域を含有する２６２ヌクレオチドのインサートフラグメント（実施例１からのＳＰ２０Ｒにおけるような）を得た。また、ベクターｐ１０ＸをＰｓｔＩで消化し、結合後、Ｚ１０プロモーターに関して双方の向きのフラグメントを有するクローンを得た。インサート内の非対称ＡｃｃＩ部位を使用して、所望のアンチセンスの向きでフラグメントを含有するクローンを選択した。ｐＤＰＧ３８０：ｐＳＰ２０ＰをＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩ（それらの双方はポリリンカーにおいて切断する）で消化し、次いでフラグメントをＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐ１０Ｘの中に結合することによって、再構築されたＡ２０遺伝子（上記ｐＳＰ２０Ｐについて記載した）を含有する８６３ヌクレオチドのインサートフラグメントを得た。これにより、Ｚ１０プロモーターに関して３’→５’の向きの再構築されたＡ２０遺伝子が得られた。ｐＤＰＧ３４０：ｐＳＰＺ４ＥＮＴをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノー処理し、次いでＳａｌＩで消化することによって、ｐＳＰＺ４ＥＮＴについて詳細に後述するように全体のＺ４遺伝子を含有する８７５ヌクレオチドのフラグメントを得た。これらの酵素はｐＳＰＺ４ＥＮＴ中の遺伝子の外側でポリリンカー配列を切断する。ベクターｐ１０ＸをＮｃｏＩで消化し、クレノー処理し、次いでＸｈｏＩで消化した後、インサートフラグメントと結合した。生ずるクローンはＺ１０プロモーターに関して３’→５’の向きで遺伝子を含有した。１０Ｚ４Ｒ３’：ｐＳＰＺ４Ｒ３’をＳａｃＩおよびＳａｌＩ（これらはポリリンカー配列において切断する）で消化することによって、３’非コーディングを通してＺ４中間反復（実施例１においてｐＳＰＺ４Ｒ３’について記載した）から成る、ほぼ７５０ヌクレオチドのインサートを得た。ベクターｐ１０ＸをＳａｌＩおよびＸｈｏＩで消化し、そしてＸｈｏＩおよびＳａｌＩはコンパティブル末端をつくるので、これはＺ１０プロモーターに関して３’→５’の向きのＺ４Ｒインサートの方向的クローニングを生じた。１０Ｚ４５’：まず、ｐＵＣ１１９主鎖（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．、１９８９）を使用して、Ｚ４５’配列のインサート（実施例１、ＳＰＺ４５’ の構築を参照）を含有する、中間的ベクター１１９Ｚ４５’を構築した。Ｚ４５ ’インサートをＩＩ９Ｚ４５’からｐ１０Ｂベクターの中に動かすことによって、最終構築物１０Ｚ４５ＲＮを構築した。ベクターｐ１０ＢをＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩを使用する消化により調製し、次いでベクターおよびインサートを結合して、Ｚ１０プロモーターに関してアンチセンスの向きでＺ４５’を含有するｐ１０Ｚ４５’を発生させた。ｐＤＰＧ５３０およびｐＤＰＧ５３１：ＳＰＺ４Ｅｎｔからほぼ９６０ｂｐのフラグメントを切断し、末端の中に充填することによって、ｐＤＰＧ５３０およびｐＤＰＧ５３１を作った。ベクターは、プロモーターとターミネーターとの間のユニークＮｃｏＩ部位を含有するｐＢＳＫ（−）中のＺ２７プロモーター：：Ｎｏｓ３’領域の構築物であった。ベクターおよびインサートの双方を平滑末端とし、結合した。Ｚ４ＤＮＡ配列（ｐＤＰＧ５３１）のセンスの向きおよびＺ４ＤＮＡ配列（ｐＤＰＧ５３０）のアンチセンスの向きを有するクローンが同定された。実施例３．ＤＮＡ配列を含有するアンチセンスをスクリーニングするｉｎｖｉｔｒｏ方法いったん前もって選択されたアンチセンスＤＮＡ構築物および植物種子中で機能的であるプロモーターを含む発現カセットが、実施例２に記載したように、調製されると、１９ｋＤ（Ａ２０）および２２ｋＤ（Ｚ４）α−ゼインタンパク質をコードする遺伝子の翻訳を停止する能力について、発現カセットをスクリーニングした。アンチセンスＤＮＡ配列を含む発現カセットを、後述するように、標準的ハイブリッド停止翻訳によりスクリーニングした。鋳型の生産ｉｎｖｉｔｒｏ転写のためのすべての試薬を、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ウイスコンシン州マヂソン）から、それらのＳＰ６／Ｔ７転写プロトコールを使用して得た。わずかの変更をプロメガのプロトコールについて行った。プラスミドを適当な酵素で消化して鋳型を線状化し、挿入された遺伝子の末端を越える転写を防止した。特記しない限り、鋳型をＳＰ６転写のためにＸｈｏＩで消化し、そしてＴ７転写のためにＢｇｌＩＩで消化した。２０μｇのＤＮＡを１００μｌの合計体積において消化した。アリコートを完全な消化について分析するために、消化物をフェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽出し、次いで０．１体積の３Ｍの酢酸ナトリウム、２．５体積のエタノールで沈降させた。７０％のエタノールで洗浄した後、ペレットを１０μ ｌの無菌のＲＮアーゼを含有しない水の中に再懸濁させた。転写反応室温においてすべての試薬を融解した後、鋳型ＤＮＡを排除した、マスター転写混合物を調製した。これにより、反応のより大きい収率の均一性が得られた。各反応について、下記の成分を５μｌの鋳型ＤＮＡにＲＮアーゼを含有しない水中の１μｇ／μｌにおいて添加した：２０μｌの５４転写緩衝液、１０μｌの０．１ＭのＤＴＴ、２．５μｌの組換えＲＮａｓｉｎ（４０Ｕ／μｌで供給されるＲＮアーゼインヒビター）、２０μｌの１０ｍＭのｒＮＴＰ混合物、２．５μｌのＳＰ６またはＴ７（２０Ｕ／μｌ）、および４５μｌのＲＮアーゼを含有しない水。反応を３７℃において２時間インキュベートした後、鋳型を除去した。ＲＱｌＤＮアーゼ（１Ｕ／μｌ）で消化して鋳型を除去し、５．０μｌの酵素を転写反応に添加し、次いでこれを３７℃において１５分間インキュベートした後、転写体を抽出し、沈降させた。鋳型の調製について前述したように、抽出、沈降および洗浄を実施した。転写体の収量を２６０ｎｍにおける吸収の読みにより測定し、そして調製物の完全性を自然または変性のゲル分析により決定した。自然ゲルは時々異常な移動度のバンドを示したが、一般に転写調製物は期待した転写体のサイズと自然ゲル上のそれらの移動度との間においてほぼ線状の関係を示した。ハイブリッドの形成のための転写体のアニーリング翻訳前に、コントロールした温度および塩の条件下に、センス／アンチセンスの転写体の一定のモル比を使用して、転写体をアニールした。アニーリングの条件は下記の通りであった：１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｌまたは２以上のＲＮＡ、および合計の体積を２０μｌとするＲＮアーゼを含有しない水。ＲＮＡの添加量はアンチセンス／センスの転写体の４：１のモル比に基づき、各反応において４μｇのセンス転写体を使用し、そして変化する量のアンチセンス転写体を添加して４：１のモル比を維持した。アニーリングの前に、すべての転写体を６５℃に加熱し、次いで０℃に保持して、二本鎖の形成の効率を減少する分子内二次構造物の潜在的形成を減少した。４５℃において４５分間アニールした後、反応を半分に分割し、こうして、１０ μｌの反応をｉｎｖｉｔｒｏで翻訳し、そして残りの１０μｌを１．２％のアガロースゲル上で分析して、各サンプル中のハイブリッドの形成の程度を測定した。移動度の中に多分分子内相互作用のための異常が多少見られたが、この方法は２つの転写体の間の二本鎖の形成の程度を分析するために一般に有用であり、そしてハイブリッドの翻訳の結果とよく相関した。アニーリング反応のｉｎｖｉｔｒｏ翻訳および翻訳産物の分析コムギ胚芽ライゼイトおよびウサギ網状赤血球ライゼイト系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、Ｚ４ＥＮＴおよびＡ２０ＥＮＴ転写体の双方の翻訳を実施した。翻訳産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーにより分析したとき、双方の系は検出可能なタンパク質を産生したが、ウサギ網状赤血球系は、コムギ胚芽系よりも効率よく、Ｚ４ＥＮＴおよび０℃においてＥＮＴ転写体の双方を翻訳した。ヌクレアーゼ処理したウサギ網状赤血球ライゼイト系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、アニールしたサンプルの翻訳をｉｎｖｉｔｒｏで実施し、そして³⁵Ｓメチオニンを使用して翻訳産物を標識化した（Ａｍｅｒｓｈａｍ）。後述する変更を加えて本質的プロメガのプロトコールに従い、反応を実施した。翻訳産物を分析するために、４％のスタッキングゲルおよび１５％の分離ゲルを使用して、０．７５または１．５ｍｍのスペーサーを用いて、反応をＳＤＳ− ＰＡＧＥ上で実施した。ヘファー（Ｈｏｅｆｅｒ）装置上で、３５ｍＡの一定電流において、３〜３．５時間ゲルを展開した。１０μｌの各反応物を４０μｌの１×試料緩衝液に添加し、次いで７分間沸騰させた後、マイクロフージ中で３０秒間回転することによって、試料を電気泳動のために調製した。スタッキングゲルを取出した後、ゲルを震盪しながら１Ｍのサリチル酸ナトリウム溶液中で３０分間インキュベートして、放射性同位元素の検出を増強した。次いでゲルを水中で短時間すすぎ、スラブ乾燥で真空下に６５℃において２時間乾燥した。−７０ ℃増強スクリーン（ＬｉｇｈｔｎｉｎｇＰｌｕｓ、ＤｕｐｏｎｔＣｒｏｎｅｘ）を使用して、乾燥したゲルをフィルムに一夜露出した。現像後、ＬＫＢ２２０２ウルトロスキャン（Ｕｌｔｒｏｓｃａｎ）レーザーデンシトメーターを使用してゲルを走査し、そしてクロマトグラフ分析のためのマクシマ（Ｍａｘｉｍａ）ソフトウェア（ＷａｔｅｒｓＣｏ．）を使用して、データをコンパイルし、分析した。センスの向きでＺ４およびＡ２０遺伝子の完全なコピーを含有する、線状化プラスミドのｉｎｖｉｔｒｏ翻訳の結果は、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系を使用して、ゼイン遺伝子の翻訳に対するアンチセンス構築物の効果をモニターできることを示す。双方の翻訳系は、成熟Ａ２０遺伝子産物に対応する期待される１９ｋＤの分子量の種のタンパク質を産生した。興味あることには、しかしながら、ウサギ網状赤血球系はＺ４ＥＮＴ転写体を２２ｋＤの前タンパク質に翻訳したが、コムギライゼイト系はＺ４前タンパク質をプロセシングし、シグナルペプチドを除去して成熟ゼインを産生し、１９ｋＤとほぼ同一サイズのタンパク質を生じた。双方の系において、Ａ２０ＥＮＴ転写体の翻訳はＺ４ＥＮＴ転写体の翻訳よりも少なくとも２〜５×効率よかった。これは、多分、Ａ２０ＥＮＴタンパク質においてシグナルペプチドが欠如するか、あるいは２つの転写体の間の短い開始コドンのアクセス可能性の差でった。なぜなら、Ａ２０ＥＮＴ転写体は５’非コーディング配列を含有しなかったからである。共転写手順および転写後手順の双方を使用して、翻訳効率を増加する可能な手段として、Ｚ４ＥＮＴおよびＡ２０ＥＮＴ転写体のキャッピングを実施した。いずれの方法を使用しても、翻訳効率の増加は観察されなかった。Ｚ４ＥＮＴセンス転写体およびＺ４ＥＮＴアンチセンス転写体を使用して、ハイブリッド停止翻訳を実施して、アニーリングおよび翻訳の条件を確立した。滴定実験を実施して、Ｚ４の合成を完全に壊滅するために必要なアンチセンス：センス転写体の比を決定した。センス転写体の量の１、２および５倍過剰の量のアンチセンス転写体を添加し、コントロールした条件下のアニールを可能とした。この実験の結果を表ＩＩＩに示す。アニーリング反応において４：１の比のアンチセンス：センスを使用する、引き続く実験は、また、Ｚ４合成を排除することを見出したので、この比を後の実験において使用した。また、実験を実施して、フィルムのレーザーデンシトメーターの読みを使用するタンパク質の定量を可能とするために、放射能線量／フィルム露出のプロットが十分に線状であるかどうかを決定した。これを試験するために、負荷された抽出物の量／レーンを２５倍の範囲にわたって変化させた。結果が示すように、線量／応答のプロットは１０倍の範囲にわたってのみ許容可能であった。オートラジオグラムのデンシトメトリーは、フィルムに対してゲルの一夜の露出が意味ある線量−応答曲線を生成するが、より長い露出はそれを生成しないことを示した。完全な、完全に相補的なＺ４ＥＮＴセンスおよびアンチセンス転写体を使用する基本的プロトコールが確立されると、１系列の実験を開始して、Ｚ４転写単位の一部分のみを含有する構築物から作られたアンチセンス転写体の効果、ならびにＡ２０転写単位のすべてまたは一部分を含有する構築物から作られたアンチセンスの効果と、これらの結果を比較した。データを翻訳実験のいくつかのハイブリッド停止からコンパイルし、すべての実験は４：１のモル比のアンチセンス：センス転写体を使用して実施し、陰性の対照としてアンチセンス転写体を添加しないＺ４ＥＮＴセンス転写体（Ｚ４の１００％の合成またはＺ４合成における０％の減少を表す）を含み、そして陽性の対照としてＺ４ＥＮＴアンチセンス転写体を添加したＺ４ＥＮＴ転写体（Ｚ４合成の１００％の減少を表す）を含んだ。ラムダ転写体およびポリリンカー転写体を対照として使用した。結果を表ＩＶに示す。結果を表ＩＶに示す。全体のデータの組を合計して、Ｚ４合成の停止を行うアンチセンス転写体の効率について単一の概略のコンセンサスを発生させることによって、結果についての一般的結論を引き出すことができ、これらは下記の通りである：このデータが示すように、全体の相補的転写体は、期待されるように、翻訳の減少において最も効率よく、そして翻訳開始配列へのアンチセンス転写体のアニーリングは下流のコーディング領域への転写体のアニーリングよりも一般に効率よい。実施例４．トウモロコシの形質転換の分析のための試薬抗体の生産形質転換された細胞系統および植物におけるゼインの発現レベルに対するアンチセンス遺伝子の発現の効果についてスクリーニングするために、ターゲッテッドα−ゼインおよび全体のゼインの双方と反応性のポリクローナル抗体を生産した。後述するように、抗原を抽出し、精製した後、ウサギの中に接種し、引き続いて抗血清を特性決定する。Ａ．抗原の精製トウモロコシ同系交配系統ＢＳＳＳ５３の抽出により、全体のゼインを得た。この手順において、４ｇの乾燥仁をブラウン（Ｂｒａｕｎ）コーヒーミル中で微細粉末に粉砕し、１５ｍｌ／ｇのアセトンと、撹拌しながら、室温において９０分間インキュベートして脱脂した。次いで脱脂した粉末をブフナー漏斗を通して濾過し、乾燥させた。次いで、１０ｍｌ／ｇの０．５ＭのＮａＣｌを使用する２回の抽出を実施した。混合物を室温において３０分間撹拌した後、前述したように濾過した。最後に、粉末について１０ｍｌ／ｇの７０％のエタノール％のＢＭＥの各々を使用して各６０分間室温において撹拌しながら、２回の抽出を実施した。全体の８０ｍｌのエタノール抽出液をプールし、０．４５ミクロンのフィルターを通して濾過した後、回転蒸発器（ＲｏｔｏｖａｐｏｒＲ１１０、ＢｕｃｈｉＣｏｒｐ．）中の体積を減少させた。蒸発を６５℃において実施し、ほぼ４５分後、体積を２０ｍｌの溶液に減少し、これは曇った外観を有した。この溶液を無菌の脱イオン水で４０ｍｌに希釈した後、凍結し、凍結乾燥した。３２９ｍｇの乾燥重量が得られ、１ｍｇの試料を秤量し、１ｍｌの７０％のエタノールの中に再懸濁させ、ペターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）アッセイ（Ｐｅｔｒｓｏｎ、１９７９）によりタンパク質含量を定量した。ゼインは試料の乾燥重量の４５％を構成することが見出され、それゆえほぼ１４０ｍｇのゼインが得られた。２．５〜２５μ ｇの範囲のタンパク質を含有する試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲルの銀またはクーマッシーブルー染色により、期待されるゼインのプロフィルの純度および存在について分析した。調製物は期待されるタンパク質のプロフィルを表示し、２７ｋＤ、１９／２２ｋＤ、１６ｋＤ、１５ｋＤおよび１０ｋＤのゼインのすべてが期待される比率で存在した。したがって、この調製物を全体のゼインを全体のゼインに対するポリクローナル血清を発生させる抗原として使用した。下記のようにして、α−ゼイン（１９／２２ｋＤのゼイン）をトウモロコシ同系交配系統Ａ６５４種子から抽出した：全体のゼインについて前述したように６ｇの乾燥仁を粉砕し、プロセシングし、これからほぼ５００ｍｇの凍結乾燥した試料が得られた。タンパク質含量を決定した後、ゼインは試料の乾燥重量の80％を構成することが見出された。ゼインの残部からα−ゼインを精製するために、試料を調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた：１０ｍｇの試料を秤量し、５００μｌの試料緩衝液／５％のＢＭＥの中に再懸濁させ、次いで１０分間沸騰させて凝集物を除去した後、マイクロフージ中で３０秒間回転した。５５μｌ／レーンのアリコートを３ｍｍの厚さのゲル上に展開させ、４％のスタッカーおよび１５％の分離ゲルを使用した。余分の長いプレート（２５ｃｍの長さ×１４ｃｍの幅）を使用して、分解能を改良した。５０ｍＡの一定電流において３時間展開させた後、ゲルを１５ｍＡにおいて一夜展開させた。冷い０．２５ＭのＴＣＡでほぼ１０分間染色することによって、タンパク質を可視化した。次いでバンドを１９／２２ｋＤの範囲において切除し、ＳＤＳゲルの流れる緩衝液中で、ゲル片が透明に見えるまで、洗浄した。この緩衝液を取って置き、ゲル片を２０００の分子量のカットオフの透析管に移した。また、追加の２５ｍｇの染色材料をこの方式でプロセスし、すべてのゲルのスライスをプールした後、透析した。透析管をクリップで密閉し、バイオラドのミニ−サブゲル装置の中に入れ、クリップを電気泳動の方向に関して垂直に向けた。ＳＤＳ展開緩衝液を管のレベルに添加し、溶離を１０ｍＡにおいて一夜実施した。電極を短時間逆転し、次いで透析バッグ内の緩衝液を最初のゲルスライス洗浄液からの貯蔵緩衝液とともにプールし、１リットルの脱イオン水に対して透析し、数時間にわたって５回水を交換した。透析物を凍結乾燥し、調製を定量し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により純度について検査した。汚染するタンパク質種は見られず、したがって、ポリクローナル抗体の生産のために、この精製された抗原を使用してウサギを接種した。この手順から得られた精製されたα−ゼインの合計量は１０．９ｍｇであり、この手順について３１％の収率が得られた。Ｂ．抗原の調製および注射合計６匹のニュージーランド白ウサギを抗体の生産に使用した。後述するように、３匹に精製されたα−ゼインを注射し、残りの３匹に精製された全体のゼインを注射した。後述するように、６匹のウサギのうちの２匹を伝統的フロインド完全アジュバントおよびフロインド不完全アジュバントで処置し、そして残りの４匹を合成アジュバントで処置した。双方のα−ゼインおよび全体のゼインを秤量し、再懸濁し、６５℃に加熱してゼインを完全に可溶化した。注射すべき各ウサギについて、０．５ｍｇの精製されたα−ゼインまたは１．０ｍｇの全体のゼインを６０μｌの７０％のエタノールの中に再懸濁させた。ウサギ１〜３に抗原として全体のゼインを与え、そしてウサギ４〜６に精製されたα−ゼインの抗原を与えた。ウサギ１および４（以後、１Ｆおよび４Ｆと表示する）について、４４０μｌのＰＢＳ／ツイーン（リン酸緩衝生理食塩水／２％のツイーン８０、Ｓｉｇｍａ）をゼイン溶液に添加し、次いで５００μｌのフロインド完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）を添加し、そして管を激しく渦形成した。残りの４つの試料を下記のようにして構成した：６０ μｌの精製されたゼイン溶液または全体のゼイン溶液に、１００％のエタノール中で１４０ｍｇ／ｍｌにした５０μｌのＡＶＲＩＤＩＮＥ（Ｋｏｄａｋからの合成アジュバント）、７６０μｌのイントラリピド（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ）１０％の脂肪エマルジョン（Ｔｒａｖｅｎｏｌ）、および３００μｌのＰＢＳ／ツイーンを添加した。渦形成後、注射前に、試料をカップ型ソニケーター（Ｕｌｔｒｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）中で２〜３０秒間のバーストで超音波処理して完全なエマルジョンを調製した。試料を１００μｌのアリコートで動物の背中を横切って多数の部位に投与した。フロインド不完全アジュバントの代わりにフロインド完全アジュバントをウサギ１Ｆおよび４Ｆについて使用した以外、注射混合物を処方する前述の手順に従い、ブーストを３週毎に投与した。一次注射に加えて、合計３回のブーストを添加した。小さい体積（５ｍｌより少ない）の血を取って、プロセスの間の抗体力価および特異性をモニターするための血清を収集した。後述するように、ＳＤＳ −ＰＡＧＥ／ウェスタンブロット上に全体のゼインを展開させることによって、抗血清の特異性および力価を分析した。いったん力価が十分である（１：１０００血清の希釈において反応性である）ことが見出されたとき、いくつかの逐次の大きい体積（５０ｍｌ）の血を取った。Ｃ．抗血清の分析抗血清の免疫反応性および力価を測定するために、全体のゼインをＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンにより分析し、１：５０から１：１０００に希釈した抗血清を試験した。基本的手順は下記の通りであった：５００ｎｇの全体のゼイン／レーンを１０μｌの試料緩衝液／２％のＢＭＥ中に溶解し、７．５分間沸騰させ、次いで１５％のミニゲル（ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎＩＩ、ＢｉｏＲａｄ）上に分子量マーカー（ＢＲＬ）とともにオールタネイトレーンにおいて負荷し、２００Ｖにおいて４５分間展開させた。スタッキングゲルを取出し、このゲルを転移緩衝液（０．０５ＭのＴｒｉｓＣｌ、０．１９４Ｍのグリシン、２０％のメタノール）中で１０分間平衡化した後、調製した膜（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）をオーバーレイした。膜の調製を、製造業者の推奨に従い、メタノールですすぐことによって実施した後、転移緩衝液中で平衡化した。タンパク質を２７Ｖにおいて４０分間ゲニエ（Ｇｅｎｉｅ）エレクトロブロッター（ｉｄｅａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に転移した。転移後、膜をすすぎ、３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で３７℃において震盪培養機プラットフォーム上でｌ時間ブロックした。膜を分子量マーカーを含有するレーンにおいて切断してストリップに分割し、４℃において一夜１０ｍｌの被験抗血清の適当な希釈物と、ならびに全体のゼインに対して向けられた対照ポリクローナル抗血清とインキュベートした。一次抗血清を取出した後、膜のストリップを１×ＰＢＳ中で５×１０分の洗浄において洗浄した後、二次抗体とインキュベートした。二次抗体はヤギ抗ウサギアルカリ性ホスファターゼ接合抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ−ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から成り、３％のＢＳＡ／ＰＢＳ中で１：１０００に希釈した。震盪しながら室温において１時間インキュベートした後、ストリップを前述したように洗浄し、ストリップを４−クロローナフトール基質溶液（ＫＰＬ）中で、色の発生が完結するまで、ほぼ２〜５分間インキュベートした。ストリップを脱イオン水中ですすぐことによって、反応を停止させた。すべての６匹のウサギからの血清は期待された免疫反応性のプロフィルを表示することを、これらの結果は示した。詳しくは、ウサギ１Ｆ、２および３からの血清は１９／２２ｋＤの以外のみを免疫標識化し、他のゼインを免疫標識化しなかった（ゲル精製した抗原の品質はＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色により予測される品質と少なくとも同程度にすぐれることを示す。なぜなら、抗体の産生は実際に他のタンパク質種の汚染のいっそう感受性の測度であるからである。）さらに、ウサギ４Ｆ、５および６からの血清はプロフィルの中に存在する調製の相対量に対してほぼ比例してゼインのすべてとの反応性を表示し、２７ｋＤのゼインのわずか〜中程度の標識化、豊富な１９／２２ｋＤのゼインの非常に強い標識化、１６および１４ｋＤの中程度の標識化、および少ない存在量の１０ｋＤのゼインのわずかの標識化を示した。また、１：５０から１：１０００の範囲の希釈物を使用してブロットの免疫標識化を実施することによって、抗血清の力価を特性決定した（後の採血のために）。抗血清のより低い希釈はより高い希釈における対応する血清と同一のゼインを免疫標識化し、膜のバックグラウンドの染色は１：５００より低い血清の希釈において増加した。期待した免疫反応性のプロフィル（前述した）は１：１０００の希釈において得られたので、この希釈をそれ以上の分析のために使用した。１：１０００より高い希釈をこれらの実験において試験しなかったので、血清の保存が望ましい場合、１：２０００およびそれより高い希釈における血清の試験を示すことができるであろう。動物から得られた血清の合計量は下記の通りであった：ウサギ１、４および６からの血清の各々の４０ｍｌ、およびウサギ２、３および５からの血清の各々の８０ｍｌ。後者のウサギをそれ以上の採血のために選択した。なぜなら、免疫反応性のプロフィルは、ウサギ２および３からの血清の場合において、ウサギ１Ｆ（これは１０ｋＤのゼインと非常にわずかの反応性を示すことがある）よりもわずかにより特異性であり、そしてウサギ５および６からの血清の場合において、ウサギ４Ｆからの血清よりも１０ｋＤのゼインとわずかにより反応性であったからである。実施例５．Ｚ１０プロモーターアンチセンス構造体によるトウモロコシの形質転換胚形成トウモロコシのII型培養物を、PCT特許出願公開第WO95／06128号と米国特許願第08／112,245号に記載されているようにして、遺伝子型Ｂ73とＡ188の交雑に由来する発育中の種子から単離した未熟の胚から得た。II型培養物は、以下のプラスミドベクター類すなわちpDPG340(先に述べたＺ10プロモーター−Ｚ４アンチセンスDNA配列)またはpDPG380(先に述べたＺ10プロモーター−Ａ20アンチセンスDNA)およびpDPG363[トウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子由来のイントロン１に５’から３’への順に作動可能に連結されたハナヤサイ・モザイクウイルス35Ｓプロモーター、ストレプトマイセス・ヒグロスコヒ・カス（Streptomyces hygroscopicus）から単離したBar遺伝子およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacteriu m tumefaciens)のノパリンシンターゼ遺伝子由来の３’ターミネーターおよびポリアデニル化の配列を含有する植物発現カセットを含有している]のコンビネーションで衝撃(bombard)されたミクロプロジェクタイル(microprojectile)である。形質転換細胞系を、米国特許第5,489,520号、同第5,550,318号およびPCT特許願公開第WO95／006128号に記載されているようにして、bar遺伝子の発現によって与えられる除草剤のビアラフォス(bialaphos)に対する抵抗性によって選択した。トウモロコシの形質転換については、その外に、米国特許第5,538,877号、同第5,538,880号およびPCT特許願公開第WO95／06128号に記載されている。形質転換細胞系の同定は、先に述べたように、選択可能かまたはスクリーニング可能なマーカーを採用することによって達成できる。形質転換体中にアンチセンスDNAの配列が存在していることはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって確認した。５’PCRプライマーの配列は、TCTAGGAAGCAAGGAC ACCACC（配列番号：５）であった。３’PCRプライマーの配列はGCAAGACCGGCAACA GGATTCA（配列番号：６）であった。PCR反応によって、pDPG380を含有する、形質転換体の約1.0キロベースの大きさのDNAフラグメント、およびpDPG340含有形質転換体の約1.1キロベースの大きさのDNAフラグメントが生成した。Ｚ10プロモーターに作動可能に連結されたアンチセンスDNA配列を含有する形質転換カルス系を用いて、植物と種子を生成させた。一般に、植物は以下のようにして再生させる。選択剤に暴露されても生存している細胞または、選別検定法で正の評点を得た細胞を、植物の再生を維持する培地で培養した。代表的な実施態様で、この発明の発明者らは、成長レギュレーターなどの追加の物質を含有させることによってMS培地とＮ６培地を改変した（米国特許願第08／594,861号の表１を参照）。このような目的に用いる好ましい成長レギュレーターはディカンバ(dicamba)または２，４ −Ｄである。しかし、NAA，NAA＋２，４−Ｄまたはビクロラムを含む他の成長レギュレーターも使用できる。これらの方法および類似の方法で培地を改良すると、特定の発育段階において細胞の成長が容易になることが分かった。組織は、少なくとも２週間、植物再生作業を開始するのに十分な組織が得られるまで成長レギュレーターを含有する基本培地で維持するか、または組織の形態が再生を行うのに適切になるまで、人力選択を何回も繰り返すことが好ましく、次いで胚様体（embryoid）を成熟させる培地に移した。培養物は、２週間毎にこの培地に移した。苗条が発育しているのは、成長レギュレーターを欠いている培地に移す時期になっていることを合図している。選択またはスクリーニングによって同定され、次に、再生を維持する適切な培地で培養した形質転換細胞を、次いで、植物まで成熟させた。発育中の小植物を、無土壌植物成長混合物に移し、次に例えば、相対湿度が約85％、CO₂が600ppm および光が25〜250マイクロアインシュタインｍ^-2Ｓ^-1に環境が制御された室内で耐性を強化した。植物は、好ましくは、成長室または温室で成熟させた。植物は、形質転換体が同定された後、その始原組織によって、約６週間〜10ヶ月で再生された。再生中、細胞は、組織培養器中の固体培地で成長させた。このような容器の例示実施態様はペトリ皿とPlant Con(登録商標)であった。再生中の植物は好ましくは約19〜28℃で成長させた。再生中の植物は、苗条と根が発育する段階に到達した後、温室に移してさらに成長させて試験した。稔性の形質転換した子孫を提供することによって、続いて、一連の品種改良操作を通じて、それ以上、組換え操作を必要とせずに、一つのトウモロコシ系を全く異なるトウモロコシ系へ選択された遺伝子を移動させることができる。トウモロコシ系間の遺伝子の移動は、トウモロコシ品種改良業界の基本的な教養であり、望ましい遺伝子（形質）を有するトウモロコシ系を単に戻し交雑して行われる。導入された導入遺伝子は、他のトウモロコシ遺伝子として、遺伝学的に挙動して、他のトウモロコシ遺伝子と同一の方式の品種改良技術で操作することができる点で価値がある。Ｚ10プロモーターアンチセンス構造体(pDPG340および／またはpDPG380)を含有する形質転換体を、AW，CN，CVおよびDDと呼ばれるエリート近交系(elite inbred line)を含む各種のトウモロコシ近交系と交雑させた。プラスミドのpDPG340およびpDPG380で形質転換し次にTsaiの1980年の報告にしたがって近交系のAWまたはCNと交雑させたトウモロコシ植物由来の成熟穀粒から、以下のようにして、ゼインタンパク質を抽出した。50mgの粉砕穀粒を、0.5ml の70％エタノール、１％β−メルカプトエタノール中に懸濁させ、室温で30分間〜一夜抽出した。得られた試料は、渦巻撹拌し、12,000rpmで５分間遠心分離した。ゼインタンパク質を含有する上澄液50μｌを取り出して乾燥した。１％のβ −メルカプトエタノールを含有する緩衝液を加えたSDSポリアクリルアミドゲル5 0μｌ中に、ゼインタンパク質を再懸濁させた。タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、次いでクーマジブルーで染色した。19KDと22KDのα−ゼインタンパク質の量には、定性的な差異は全く観察されなかった（図５）。さらに、穀粒内での全タンパク質の発現は、アンチセンス形質転換およびアンチセンス未形質転換のトウモロコシ系では類似しているようである。Ｚ10−アンチセンスDNA形質転換体のアミノ酸組成を分析した。アミノ酸類を、Jarrettらの1986年の報告、Jonesらの1983年の報告、AACCの1995年の報告に記載されているようにして、成熟穀粒から抽出した。その結果を表Ｖに要約した。データをｔ検定法で分析した結果、形質転換穀粒と未形質転換穀粒の間に、ｐ＜ 0.05の有意水準で有意差が認められた。形質転換穀粒と未形質転換穀粒は同じ穂由来のものである。形質転換体DD021の場合、ロイシンのレベルだけ、統計的に有意に減少した。形質転換体DD015とDD018の場合、リシンのレベルは統計的に有意に増大し、そしてロイシンのレベルは統計的に有意に減少した。これらの試験結果は、α−ゼイン類の発現がアンチセンス形質転換体内で抑制されかつ胚乳内で他のタンパク質の発現が増大している場合に予想される。α−ゼインタンパク質類はロイシン残渣(leucine residue)中に豊富に存在しているので、α−ゼインタンパク質の発現が減少すると、トウモロコシ穀粒中のロイシンのレベルは低下するであろうと予想される。同様に、非ゼインタンパク質は、ゼインタンパク質よりリシンを多く含有しているので、トウモロコシ穀粒中で、非ゼインタンパク質の発現が増大するとリシンのレベルが増大する。したがって、Ｚ10−アンチセンス形質転換体に関するアミノ酸組成のデータは、α−ゼインの発現がわずかに減少しかつ非ゼインタンパク質の発現が増大すると、種子中のロイシンのレベルが低下しかつリシンのレベルが増大することと一致している。同様のリシンのレベルの増大とロイシンのレベルの減少が、ゼインの合成が抑制されかつ非ゼインタンパク質の合成が増大するトウモロコシopaque−２突然変異体に観察される。しかし、opaque−２突然変異体は、野生型トウモロコシとは異なる他の表現型を示す（Di Fonzoらの1988年の報告；Bassらの1992年の報告）。実施例６．Ｚ２７プロモーター−アンチセンス発現カセットによるトウモロコシの形質転換遺伝子型Ａ１８８ｘＢ７３のトウモロコシ植物体をＨｉ−ＩＩトウモロコシ植物体と交配させた（Armstrong et al.，1991）。未熟胚（長さ１．２〜２．０mm ）を、授粉後１１〜１２日のＨｉ−Ｉの表面滅菌温室穂から切り取った。未熟胚からのＩＩ型カルスの高頻度発生のために、Ｈｉ−ＩＩ遺伝子型をＡ１８８ｘＢ７３交配から発生させた（Armstrong et al.，1991）。約３０個の胚／ペトリ皿を、１ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、１００ｍｇ／ｌのカゼイン加水分解物、６ｍＭのＬ−プロリン、０．５ｇ／ｌの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、０．７５ｇ／ｌのＭｇＣｌ₂および２％スクロースを含有するＮ６培地を２ｇ／ｌのＧｅｌｇｒｏ，ｐＨ５．８で凝固させた変法の培地（＃７３５培地）上で茎を下にして平板培養した。胚は暗所で２４℃ で２〜４日間培養した。衝撃の約４時間前に、胚を前記の培地に移して、スクロース濃度を３％から１２％に増大した。胚を高浸透性培地に移すと、それらは、皿の中心から２cmの位置から出発して、同心円で平板上に整列し、その根鞘末端が皿の中心に向かって配向するように位置した。通常、２５〜３５個の胚／平板では、２つの同心円が形成された。１０μｇのｐＤＰＧ１６５（米国特許第５，４８９，５２０号に記載）および１０μｇのｐＤＰＧ５３０を含有する金粒子を調製した。胚を含有する平板を、底から３番目の棚で、衝撃小室の停止スクリーンの５cm 下に載せた。１１００ｐｓｉ破裂円盤を用いた。胚の各平板に１回衝撃を与えた。選択開始前に、高浸透強度培地上で一夜、胚を回収し得た。高浸透性培地（７３５、１２％スクロース）上で一夜（１６〜２４時間）胚を回復せしめ、次に１ｍｇ／ｌのbialaphosを含有する選択培地（＃７３９、７３５＋１ｍｇ／ｌのbialaphosまたは＃７５０、７３５＋０．２Ｍマンニトールおよび１ｍｇ／ｌのbialaphos）に移した。胚を２４℃で暗所に保持した。初期選択平板上で３〜４週間後、約９０％の胚がＩＩ型カルスを形成した。これを、３ｍｇ／ｌのbialaphosを含有する選択培地（＃７５８）に移した。ＰＣＲ分析を用いて形質転換株を確定して、プラスミドｐＤＰＧ５３０の存在を検出した。形質転換組織中のＺ２７−アンチセンス発現カセットの存在を確証するために用いたＰＣＲプライマーを以下に示す：5’GCA CTT CTC CAT CAC CAC CAC 3’（配列番号：７）。ｐＤＰＧ５３０およびｐＤＰＧ５３１形質転換株のＰＣＲ増幅は、約５００塩基対のＤＮＡ生成物を生じた。ＰＣＴ公告ＷＯ９５／０６１２８に一般的に記載されているように、形質転換株を再生した。形質転換胚発生的カルスを再生培地（ＭＳ培地（Murashige and Skoog，1962）、０．９１ｍｇ／ＬのＬ−アスパラギン、１．４ｇ／ＬのＬ−プロリン、２０ｇ／ＬのＤソルビトール、０．０４ｍｇ／Ｌのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）および３ｍｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリンを含有）に移した。この培地上で約４週間、細胞を増殖させ、約２週間で新鮮な培地に移した。その後、形質転換株をＭＳ０培地（フィトホルモンが付加されていないＭＳ培地）に移した。本出願に前記したように、再生植物体を土壌に移した。植物体を、ＡＷ、ＣＶおよびＤＪと呼ばれるトウモロコシ近交株と交配させた。Ｚ２７−アンチセンス発現カセットを含有する種子は、ｏｐａｑｕｅ−２突然変異体穀粒の穀粒と同様に表現型が不透明であった。さらに、ヘミ接合体Ｚ−２７−アンチセンス形質転換株と非形質転換近交株との交配から得られた種子は、Ｚ−２７アンチセンス発現カセットＤＮＡ配列の存在と相関して、不透明表現型に関して分離する種子を生じた。ゼインタンパク質を、以下のように、プラスミドｐＤＰＧ５３０で形質転換させ、近交株ＡＷまたはＣＶと交配させたトウモロコシ植物体からの成熟穀粒から抽出した。５０μｇの粉砕穀粒を０．５ｍｌの７０％エーテル、１％β−メルカプトエタノール中に懸濁し、室温で３０分〜一夜、抽出した。試料を攪拌し、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ゼインタンパク質を含有する上清５０μｌを取り出し、乾燥した。ゼインタンパク質を、１％β−メルカプトエタノールを含有する緩衝液を充填するＳＤＳポリアクリルアミドゲル５０μｌ中に再懸濁した。タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、クーマシーブルーで染色した。分析した５つの形質転換株で、１９ｋＤおよび２２ｋＤ α−ゼインの量の低減が観察された。ｐＤＰＧ５３０形質転換株および相同ゲノム対照のクーマシーブルー染色ポリアクリルアミドゲルを、図６に示す。ＫＰ０１４と呼ばれる一形質転換株では、γ型ゼインタンパク質である２７ｋＤゼインタンパク質の発現も抑制されたが、このことは、トウモロコシにおけるアンチセンスＤＮＡの発現が関連する遺伝子族、即ちα−ゼインの発現を低減し、しかし関連タンパク質族の成員、即ち２７ｋＤゼインも抑制することを示唆する。２７ｋＤの同様の低減は、センスＤＮＡ配列でも観察された（図１０参照）。相同ゲノム対照は、ｐＤＰＧ５３０ＤＮＡ配列を欠く植物体由来の穀粒を分離しｐＤＰＧ５３０形質転換植物体と非形質転換近交株との交配から回収された。さらに、穀粒における全体的タンパク質発現は、ポリアクリルアミドゲル上のクーマシーブルーによる全タンパク質染色により立証されたように、非形質転換トウモロコシ株よりもアンチセンス形質転換株の場合の方が大きいと思われる（図７）。α−ゼイン合成の低減はｏｐａｑｕｅ−２突然変異株で観察されるが、しかし低減はＺ４アンチセンス発現トウモロコシ形質転換株依りはるかに少ない。種子中でのゼインタンパク質合成のアンチセンス抑制は、細胞中に存在するゼインＲＮＡの量の低減と、その結果としてのゼインタンパク質の合成低下の結果である、と予測される。ノーザンブロット分析を完了して、ｐＤＰＧ５８０形質転換株における定常状態ゼインＲＮＡ合成のレベルを確定した。ノーザンブロット分析に関する手法は、Sambrook et al.，(1989)に記載されている。授精２１日後にトウモロコシ穀粒から単離されたＲＮＡを、アガロースゲル電気泳動により分離し、Nitrobind膜にブロティングした。ブロットを、Ｚ４コード配列で精査した。ＫＰ０１５形質転換株のノーザンブロット分析を図８に示す。オートラジオグラフ上の濃いシグナル、例えばレーン３、９および１４（上部パネル）およびレーン３、５、１１および１２（下部パネル）は、正常レベルのザイン合成を示した非形質転換種子に対応する。他のレーン（薄いシグナル）は、発現カセットを含有する種子におけるザイン合成レベルの低減と不透明表現型を示した穀粒に対応する。Ｚ２７−アンチセンスＤＮＡ形質転換株のアミノ酸組成の分析に着手した。以下のように、３つの独立した形質転換株から得られた成熟穀粒からアミノ酸を抽出した。５０μｇの粉砕コーンミールを、アルゴンガス下で、１１０℃で２４時間、１ｍｌの６ＮＨＣｌ中で加水分解した。試料を５０ｍｌに希釈し、０．４５μフィルターを通して濾過した。ＨＰＬＣ分析前に、内部標準としてノルバリンを各試料に付加した。SupelcosilＬＣ−８ＨＰＬＣカラム上で、アミノ酸を分離した（Jarrett et al.，1986;Jones et al.，1983;AACC，1995）。単一穀粒からの分析結果を、表ＶＩに要約する。データをｔ検定により分析し、形質転換穀粒と非形質転換穀粒との間に差が認められ、これはｐ＜０．０５レベルで有意であった。形質転換および非形質転換穀粒は、育種集団からの相同ゲノム分離体である。リシンレベルは、ＫＰ０１５およびＫＰ０１６形質転換株からの分析された全穀粒で統計学的に有意に増大され、リシンはＫＰ０１４形質転換株からの分析された６つの穀粒のうちの４つで増大された。予測ロイシンレベルは、分析されたほとんどの形質転換穀竜で低減された。これらのデータは、形質転換トウモロコシ穀粒におけるアンチセンスＺ４ＤＮＡ配列の発現が穀粒中に存在するα −ゼインの量の低減を引き起こすことを立証する。アンチセンス発現穀粒中の総タンパク質は、低減するようとは思えない。さらに、α−ゼインの観察された低減は、不透明表現型を有する形質転換穀粒と相関する。トウモロコシ穀粒の胚乳細胞は、大型デンプン粒およびプロテインボディ中に封入されたタンパク質で主に構成される（Lopes and Larkins，1993）。ザインタンパク質は、プロテインボディの構造を保持するために不可欠である（Lendin g and Larkins，1989）。Ｚ２７プロモーター−アンチセンス形質転換株由来の胚乳細胞中に存在するプロテインボディの数の低減は、光学顕微鏡で観察された（図９）。この観察は、α−ザイン合成がＺ２７プロモーター−アンチセンスＤＮＡ形質転換株中で低減されたことの証拠でもある。実施例７．Ｚ２７プロモーター−センス発現カセットによるトウモロコシの形質転換高等植物では、遺伝子発現の同時抑制が記載されている（Napoli et al.，199 0）。同時抑制とは、トランスジェニックセンスＤＮＡ発現カセットの発現による内在遺伝子発現の抑制を示す。トウモロコシにおけるセンスゼイン発現カセットは、アンチセンス発現カセットの発現後、実施例６に記載したのと同様の方法での内在性ザイン発現の抑制を引き起こし得る、と予測される。プラスミドベクターｐＤＰＧ５３１は、Ｚ２７プロモーター−Ｚ４センスコード配列−ノパリンシンターゼ３‘領域発現カセットを包含する。ｐＤＰＧ５３１は、Ｚ４コード配列が逆配向でＺ２７と作用可能に連結されるという点でｐＤＰＧ５３０と異なる。即ち、ｐＤＰＧ５３１は、転写されて、２２ｋＤゼインタンパク質に翻訳され得る。プラスミドｐＤＰＧ５３１およびｐＤＰＧ１６５を、実施例６に記載したように、トウモロコシ細胞中に導入した。実施例６に記載したようにして、形質転換株を選択し、再生させた。植物体を３つのＺ２７−Ｚ４センス発現カセットから再生し、ＡＷ、ＣＶおよびＣＮと呼ばれる近交株と交配させた。非形質転換株およびＺ２７−Ｚ４形質転換株中に存在するα−ゼインタンパク質の量を、前記の用にクーマシーブルー染色ポリアクリルアミドゲル上で、アンチセンス形質転換株と関連して比較した。試料調製および分析は、実施例６と同様に実施した。図１０は、クーマシーブルー染色ポリアクリルアミドゲルを示す。各レーンは、非形質転換およびセンス発現カセット形質転換種子の分離集団の単一種子から抽出されたゼインタンパク質を示す。レーン１〜８はＫＱ０１２と呼ばれる形質転換株由来の種子を、そしてレーン１３〜１９は、ＫＱ０２０と呼ばれる二次形質転換株由来の種子を示す。レーン９〜１２は、非形質転換トウモロコシ種子を示す。レーン３、４、７、８、１４および１５は、センス発現カセット形質転換種子を示し、この場合、α−ゼインレベルは意外なことに、アンチセンス形質転換株で観察されたものに匹敵する方法で非常に低減した。センス形質転換株におけるザインタンパク質濃度の予想外の低減の他に、ゼイン含量の低減を示す種子も、一般的に不透明表現型およびＺ２７ゼインレベルの低減を示す。Ｚ２７プロモーター−Ｚ４センス形質転換株の表現型がアンチセンス形質転換株と同様であるか否かをさらに確定するために、個々の穀粒由来の種子で、リシンおよびロイシン濃度を分析した。ＫＱ０１８と呼ばれる一形質転換株では、リシンおよびロイシンレベルは、相同ゲノム形質転換および非形質転換種子において、統計的に同一であった。しかしながら、ＫＱ０１２と呼ばれる形質転換株では、リシンレベルは統計的に形質転換株で増大し、ロイシンレベルは形質転換株で統計学的に有意に低減した。したがって、Ｚ２７プロモーター−Ｚ４センス形質転換株は、アンチセンス形質転換株で観察されたものと同様の種子形態タンパク質およびアミノ酸組成表現型を生じると思われる。実施例８．植物体中のメチオニン含量を増大する方法種子のメチオニン含量を増大するための方法は、ゼインセンスまたはアンチセンスＤＮＡ配列（Ａ２０かまたはＺ４）および１０ｋＤゼインタンパク質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ配列によりトウモロコシ組織培養を同時形質転換することを包含する。１０ｋＤゼインタンパク質はメチオニンを多く有することが知られている。１０ｋＤゼインタンパク質の発現の増大と組合されたＡ２０および／またはＺ４ゼインタンパク質の発現の低減は、種子中のメチオニンの総重量％を約５０％〜３００％増大させると思われる。Ａ２０および／またはＺ４と相補的なまたは相同のＤＮＡ配列を含有するアンチセンスまたはセンスＤＮＡ配列を、実施例２および７に記載したように調製した。センスまたはアンチセンスＤＮＡ配列を用いてトウモロコシ細胞株の形質転換を首尾よく実行するための条件は、実施例５および６に記載されている。１０ｋＤゼインタンパク質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ配列を、米国特許第５，５０８，４６８号に記載されているように調製した。好ましくは、Ｚ１０ＤＮＡ配列は、２７ｋＤゼインタンパク質からのプロモーターを組合せた、３‘非コード配列を含めた１０ｋＤゼインタンパク質をコードする遺伝子を含有する。このＤＮＡ配列を有するプラスミドを調製した。これはｐＺ２７Ｚ１０と呼ばれ、米国特許第５，５０８，４６８号に記載されている。１０ｋＤゼインタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する形質転換細胞株、植物体および種子を、実施例５および６に記載したように調製した。Ｍｅｔ１種子を、米国特許第５，５０８，４６８号に記載されているようにして、作った。Ｍｅｔ１種子中でのＲＮＡレベルでのキメラＺ１０遺伝子の発現を実証した。バックグラウンドＭｅｔ１ｘＡ６５４ＢＣ２の分離穂から、未成熟胚乳（２１ＤＡＰ）を収穫した。ＤＮＡおよびＲＮＡをともに、個々の胚乳試料から調製した。Ｚ２７Ｚ１０遺伝子の存在／非存在に関してＰＣＲにより、ＤＮＡを分析した。Ｚ２７プロモーターおよびＺ１０コード領域の間の接合部にまたがるオリゴヌクレオチドでプローブするノーザンブロットにより、ＲＮＡ試料を分析した。結果は、遺伝子がＰＣＲ＋種子の胚乳組織では発現され、ＰＣＲ−種子の場合には発現されないことを実証する。２７ｋＤプロモーターと組合せた１０ｋＤゼインタンパク質を含有するＤＮＡ配列を含有する種子を、野外検定した。総計１３０の穂をＰＣＲ（発芽した苗のプールされた葉試料からのＤＮＡを用いて）により遺伝子型分類し、アミノ酸分析によりメチオニン含量を分析し、ＥＬＩＳＡで１０ｋＤゼインレベルを調べた。試験した数個のトウモロコシバックグラウンドで、１０ｋＤゼインレベルとメチオニン含量との間に陽性相関が認められた。したがって、α−ザイン合成がセンスまたはアンチセンスゼイン構築物の発現により低減される場合には、トランスジェニック１０ｋＤゼインの発現は種子のメチオニン含量を増大するものと思われる。結果は、１０ｋＤザインの発現を少なくとも約５〜１０倍に上げることができるならば、トウモロコシ種子中のメチオニン含量は有意に増大し得る（２．５〜３％まで）。形質転換種子における１０ｋＤゼインおよびメチオニンのレベル増大を示す２７ｋＤゼインプロモーターおよび／またはＺ４２２ｋＤゼインプロモーターおよび／または１０ｋＤゼインプロモーターと機能的に関連する１０ｋＤゼインを有するさらに別の形質転換株も、前記および米国特許第５，５０８，４６８号に記載されているように生成された。センスまたはアンチセンスＤＮＡ配列そして１０ｋＤゼイン毛な配列および選択可能なマーカー遺伝子を用いて、トウモロコシ組織培養は同時形質転換される。両ＤＮＡ配列を含有する形質転換細胞株は、ＰＣＲ分析により同定される。アンチセンスおよび１０ｋＤゼインＤＮＡ配列の両方に関してＰＣＲ分析に対して陽性である形質転換細胞株を用いて、実施例６に記載されているように、形質転換植物体および種子を再生する。ウエスタンブロットを用いて、１０ｋＤゼインおよびＺ４（２２ｋＤ）の発現に関して、種子を分析する。種子の総メチオニン含量を、実施例５および６に記載されているようにして確定する。１０ｋＤゼイン発現の増大は、Ａ２０および／またはＺ４ゼインタンパク質の低減と組合されて、種子の総メチオニン含量の有意の増大（約５０〜３００％まで）を引き起こす。実施例９．種子中の特定のアミノ酸のアミノ酸含量を増大する方法種子のアミノ酸含量は、レベルを変えることが種子において望ましい１つ又はそれ以上のアミノ酸を包含する合成ポリペプチドをコードする遺伝子の発現により増大される。アミノ酸含量は、内在性種子貯蔵タンパク質の発現がセンスまたはアンチセンス種子貯蔵タンパク質ＤＮＡ配列の発現により抑制された種子における、１つ又はそれ以上の所望のアミノ酸を包含する天然または合成ポリペプチドをコードする遺伝子の発現により変えられる。例えば、合成タンパク質ＭＢ１をコードする遺伝子は、貯蔵タンパク質合成がセンスまたはアンチセンスＤＮＡ配列の発現により抑制される植物体中に導入される。ＭＢ１コード配列は、貯蔵タンパク質の発現を低減したトランスジェニック植物体中に導入され、この場合、前記の植物体は貯蔵タンパク質センスまたはアンチセンスＤＮＡ配列で予め形質転換された。あるいは、ＭＢ１配列は、貯蔵タンパク質センスまたはアンチセンスＤＮＡ配列で同時に植物体中で形質転換される。本発明の好ましい実施態様では、貯蔵タンパク質アンチセンスまたはセンス発現カセットおよびＭＢ１発現カセットは、実施例５、７および８に記載されているように、同時にまたは引き続いて、トウモロコシ中で形質転換される。ＭＢ１植物体発現カセットを含有する、ｐＤＰＧ７８０と呼ばれるプラスミドベクターを構築した。Mary A．Hefford（Center for Food and Animal Research ，Agriculture and Agri-Food Canada，Ottawa，ON，K1A 0C6，Canada）からＭＢ１タンパク質コード配列を入手した。ＤＮＡ配列は、Beauregard et al.，199 5に記載されている。ＭＢ１は、メチオニン、トレオニン、リシンおよびロイシンを豊富に含有する合成タンパク質であって、ゼインタンパク質と同様のα−螺旋構造を示す。１５ｋＤザインタンパク質コード遺伝子５‘からの小胞体シグナル配列をＭＢ１コード配列と操作可能的に連結することにより、プラスミドベクターｐＤＰＧ７８０を構築した。１５ｋＤゼイン−ＭＢ１配列を、Ｚ２７プロモーター素子とノパリンシンターゼ３’領域（ｎｏｓ）との間のプラスミドベクターｐＺ２７−ｎｏｓに挿入した。発現カセットは、Ｚ２７プロモーター、Ｚ１５シグナル配列、ＭＢ１コード配列およびｎｏｓ３‘領域を、５’−３‘配向で包含する。当業者は、小胞体シグナル配列、タンパク質コード配列および３’領域に操作可能的に連結される種子特異的プロモーターを含有する別のプラスミドベクターを構築し得るが、この場合、前記のタンパク質コード配列は、所望のアミノ酸組成のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を包含する。プラスミドベクターｐＤＰＧ７８０は、選択可能なマーカー遺伝子を包含するベクター、例えばｂａｒ遺伝子を包含するｐＤＰＧ１６５とともに、トウモロコシ中に導入される。ＭＢ１発現カセットは、α−ゼインタンパク質の合成が抑制されるセンスまたはアンチセンスザイン導入遺伝子を含有するトウモロコシ植物体中で形質転換される。あるいは、センスまたはアンチセンスゼイン構築物は、ＭＢ１発現カセットを同時に用いて、トウモロコシ中で形質転換される。植物体は、実施例５、６および７に記載したようにして、再生される。種子のタンパク質組成は、実施例５および６に記載したようにして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析される。ザインタンパク質の低減が観察され、所望のアミノ酸組成のタンパク質の発現が観察される。種子のアミノ酸組成は、実施例５、６および７に記載したようにして確定される。所望のアミノ酸レベルは、導入遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸組成にしたがって変えられる。本発明を、その好ましい実施態様と関連させて説明してきたが、多数の修正は当業者には容易に明らかになり、本出願はそのあらゆる適応または変更を網羅するものとする、と理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 14/425 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者アンソニー，ジャニスアメリカ合衆国，ロードアイランド 02879，ウェイクフィールド，ベイフィールドドライブ 92 【要約の続き】いて不完全な種子貯蔵タンパク質の生成の実質的な阻害をもたらす選択されたDNA配列の発現、及び／又は動物の食物に必須のアミノ酸の重量％の上昇により特徴づけられる。

Claims

【特許請求の範囲】 1. 宿主細胞中で機能することができるプロモーターに作用可能に連結された、RNA分子をコードする選択されたDNA分子を含んで成る発現カセットであって、前記RNA分子が植物種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的であることを特徴とする発現カセット。 2. 宿主細胞中で機能することができるプロモーターに作用可能に連結された、RNA分子をコードする選択されたDNA分子を含んで成る発現カセットであって、前記RNA分子が植物種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分と実質的に同一であることを特徴とする発現カセット。 3. 前記植物種子貯蔵蛋白質がトウモロコシ種子貯蔵蛋白質である、請求項１又は２に記載の発現カセット。 4. 前記トウモロコシ種子貯蔵蛋白質がα−ゼイン蛋白質である、請求項３に記載の発現カセット。 5. 選択マーカー遺伝子をさらに含んで成る、請求項１又は２に記載の発現カセット。 6. プラスミドDNAをさらに含んで成る、請求項１又は２に記載の発現カセット。 7. 前記プロモーターが、植物種子の発達の間に機能するプロモーターである、請求項１又は２に記載の発現カセット。 8. 前記プロモーターが10kDゼインプロモーターを含んで成る、請求項１に記載の発現カセット。 9. 前記プロモーターが27kDゼインプロモーターを含んで成る、請求項１に記載の発現カセット。 10．前記選択されたDNA配列が、19kDα−ゼイン蛋白質のmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする、請求項１，８又は９に記載の発現カセット。 11．前記選択されたDNA配列が、22kDα−ゼイン蛋白質のmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする、請求項１，８又は９に記載の発現カセット。 12．前記選択されたDNA配列が、19kDα−ゼイン蛋白質のmRNAの全部又は部分と実質的に同一なRNA分子をコードする、請求項２，８又は９に記載の発現カセット。 13．前記選択されたDNA配列が、22kDα−ゼイン蛋白質のmRNAの全部又は部分と実質的に同一なRNA分子をコードする、請求項２，８又は９に記載の発現カセット。 14．前記選択されたDNA配列がMB１をコードする、請求項２又は９に記載の発現カセット。 15．核硬部(kernel hardness)をコードする第２の選択されたDNA配列をさらに含んで成る、請求項１又は２に記載の発現カセット。 16．動物の食物にとって必須である植物種子中の少なくとも１種のアミノ酸の重量％を増加させる方法であって、ａ）植物細胞中で機能することができるプロモーターに作用可能に連結された RNA分子をコードする選択されたDNA配列を含んで成る発現カセットにより植物細胞を安定に形質転換することによって形質転換された植物細胞を得、ここで前記 RNA分子は種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に同一であるか又は相補的であり；ｂ）前記形質転換された細胞を、種子を生産する繁殖能力を有するトランスジェニック植物に再生せしめ、ここで、前記選択されたDNA配列は、種子中で、対応する非トランスジェニック植物の種子中の種子貯蔵蛋白質の重量％に比べて種子貯蔵蛋白質の重量％を減少させるのに十分な量で発現され；そしてｃ）前記トランスジェニック植物から前記トランスジェニック種子を回収する；ことを含んで成る方法。 17．種子中の澱粉の重量％を増加せしめる方法において、ａ）植物細胞中で機能することができるプロモーターに作用可能に連結された RNA分子をコードする選択されたDNA分子を含んで成る発現カセットにより植物細胞を安定に形質転換することによって形質転換された植物細胞を得、ここで前記 RNA分子は種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に同一であるか又は相補的であり；ｂ）前記形質転換された植物細胞を種子を生産する繁殖能力を有するトランスジェニック植物に再生せしめ、ここで前記選択されたDNA配列は前記種子貯蔵蛋白質の生産を減少せしめるのに効果的な量で発現され、これにより対応する形質転換されていない種子中に存在する澱粉の重量％を超えてトランスジェニック種子中の澱粉の重量％を増加せしめ；そしてｃ）前記トランスジェニック種子を回収する；ことを含んで成る方法。 18．種子の澱粉抽出可能性を増加する方法において、ａ）植物細胞中で機能することができるプロモーターに作用可能に連結された RNA分子をコードする選択されたDNA配列を含んで成る発現カセットにより植物細胞を安定に形質転換することによって形質転換された植物細胞を得、ここで前記 RNA分子は種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に同一であるか又は相補的であり；ｂ）前記形質転換された細胞を、種子を生産する繁殖能力を有するトランスジェニック植物に再生せしめ、ここで前記選択されたDNAは前記貯蔵蛋白質の生産を減少せしめるのに効果的な量で発現され、これにより対応する形質転換されていない種子の澱粉抽出可能性を超えてトランスジェニック種子の澱粉抽出可能性を増加せしめ；そして前記トランスジェニック種子を回収する；ことを含んで成る方法。 19．植物種子中での植物種子貯蔵蛋白質の発現を阻害する方法であって、（ａ）植物細胞中で機能することができるプロモーターに作用可能に連結されたRNA分子をコードする選択されたDNA配列を含んで成る発現カセットにより植物細胞を安定に形質転換することによって形質転換された植物細胞を得、ここで前記RNA分子は前記植物種子貯蔵蛋白質のメッセンジャーRNAの全部又は部分に対して実質的に同一であるか又は相補的であり；（ｂ）前記形質転換された細胞を植物種子を生産する繁殖能力を有するトランスジェニック植物に再生せしめ、ここで前記選択されたDNA配列は、前記植物貯蔵蛋白質の発現を実質的に低下せしめるのに効果的な量で種子中で発現され；そしてｃ）前記種子を回収する；ことを含んで成る方法。 20．前記選択されたDNAセグメントが、種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分と実質的に同一なRNA分子をコードする、請求項16，17，18又は19に記載の方法。 21．前記選択されたDNAセグメントが、種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする、請求項16，17，18又は19に記載の方法。 22．前記選択されたDNAセグメントが、α−ゼイン蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分と実質的に同一なRNA分子をコードする、請求項20に記載の方法。 23．前記選択されたDNAセグメントが、α−ゼイン蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする、請求項21に記載の方法。 24．前記植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項16，17，18又は19に記載の方法。 25．前記細胞がトウモロコシ植物の細胞である、請求項24に記載の方法。 26．前記トランスジェニック植物の種子が、少なくとも１種の必須アミノ酸の増加した重量％を有する、請求項16又は19に記載の方法。 27．前記必須アミノ酸が、メチオニン、スレオニン、リジン、トリプトファン、イソロイシン及びこれらの混合から成る群から選択される、請求項26に記載の方法。 28．前記アミノ酸の重量％が少なくとも約50％〜300％増加する、請求項26に記載の方法。 29．前記選択されたDNA配列が、植物種子の発達中に機能するプロモーターに作用可能に連結されている、請求項16，17，18又は19に記載の方法。 30．前記プロモーターが10kDゼインプロモーターを含んで成る、請求項16，17 ，18又は19に記載の方法。 31．前記プロモーターが27kDゼインプロモーターを含んで成る、請求項16，17 ，18又は19に記載の方法。 32．前記選択されたDNA配列が、19kDα−ゼイン蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする、請求項21に記載の方法。 33．前記選択されたDNA配列が、22kDα−ゼイン蛋白質をコードするメッセンジャーRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする、請求項21に記載の方法。 34．前記選択されたDNA配列が、19kDα−ゼイン蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分と実質的に同じRNA分子をコードする、請求項20に記載の方法。 35．前記選択されたDNA配列が、22kDα−ゼイン蛋白質をコードするメッセンジャーRNAの全部又は部分と実質的に同一なRNA分子をコードする、請求項21に記載の方法。 36．前記細胞を、核硬部(Kernel handness)をコードする第２の選択されたDNA 配列により形質転換することをさらに含んで成る、請求項16，17，18又は19に記載の方法。 37．前記細胞が、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクティルボンバートメント及びリポゾーム封入から成る群から選択された方法により形質転換される、請求項16，17，18又は19に記載の方法。 38．前記細胞を、少なくとも１個の選択マーカー遺伝子により形質転換することをさらに含んで成る、請求項16，17，18又は19に記載の方法。 39．対応する形質転換されていない植物に比べて、機能的農業経済的特性を維持しながら少なくとも１種のアミノ酸の重量％の増加を優性形質として有する子孫植物を得るために、前記繁殖能力を有するトランスジェニック植物を育成することをさらに含んで成る、請求項26に記載の方法。 40．対応する形質転換されていない植物に比べて、機能的農業経済的特性を維持しながら、澱粉の重量％の増加を優性形質として有する子孫植物を得るために、前記繁殖能力を有するトランスジェニック植物を育成することをさらに含んで成る、請求項17又は18に記載の方法。 41．植物種子中の１群の種子貯蔵蛋白質遺伝子の発現を阻害する方法において、（ａ）植物又は種子中で機能することができるプロモーターに作用可能に連結されたRNA分子をコードする第１の選択されたDNA配列により植物細胞を安定に形質転換することによって形質転換された植物細胞を得、ここで前記RNA分子は種子貯蔵蛋白質において実質的に同種である（homologous）ポリペプチドをコードするメッセンジャーRNAの全部又は部分に対して実質的に同一であるか又は相補的であり；そして（ｂ）前記形質転換された植物を、種子を生産する繁殖能力を有するトランスジェニック植物に再生せしめ、ここで前記選択されたDNA配列は、種子中で、対応する非トランスジェニック種子中での種子貯蔵蛋白質の発現に比べて前記トランスジェニック種子中の種子貯蔵蛋白質発現を実質的に減少せしめるのに効果的な量で発現される；ことを含んで成る方法。 42．動物の食物にとって必須である少なくとも１種のアミノ酸の重量％を植物種子中で増加せしめる方法において、（ａ）第１の選択されたDNA配列及び第２の選択されたDNA配列により植物細胞を安定に形質転換することによって形質転換された植物細胞を得、ここで前記第１の選択されたDNA配列は種子貯蔵蛋白質をコードするメッセンジャーRNAの全部又は部分に対して実質的に同一であるか又は相補的であるRNA分子をコードし、前記第２のDNA配列は動物の食物にとって必須の少なくとも１種のアミノ酸を有するポリペプチドをコードし、そして各選択されたDNA配列は植物又は種子中で機能するプロモーターに作用可能に連結されており；そして（ｂ）前記形質転換された細胞を、トランスジェニック種子を生産する繁殖能力を有するトランスジェニック植物に再生せしめ、ここで前記第１の選択された DNA配列は、対応する非トランスジェニック種子中に存在する前記種子貯蔵蛋白質の量に比べて前記トランスジェニック種子中の前記種子貯蔵蛋白質の生産を実質的に低下せしめるのに効果的な量で発現され、そして前記第２の選択されたDN A配列は、対応する非トランスジェニック種子中に存在する前記必須アミノ酸の量に比べて前記トランスジェニック種子中の前記少なくとも１種の必須アミノ酸の重量％を増加せしめるのに効果的な量で発現される；ことを含んで成る方法。 43．種子中のポリペプチドの生産を増加させるための方法において、（ａ）第１の選択されたDNA配列及び第２の選択されたDNA配列により植物細胞を安定に形質転換することによって形質転換された細胞を得、ここで前記第１の選択されたDNA配列は種子貯蔵蛋白質をコードする少なくとも１種のメッセンジャーRNAの全部又は部分に対して実質的に同一であるか又は相補的であるRNA分子をコードし、前記第２の選択されたDNA分子はポリペプチドをコードし、そして各選択されたDNA配列は植物中で機能するプロモーターに作用可能に連結されており；（ｂ）前記形質転換された細胞を、トランスジェニック種子を生産する繁殖能力を有する植物に再生せしめ、ここで前記第１の選択されたDNA配列は、対応する非トランスジェニック種子中に存在する前記種子貯蔵蛋白質に比べて前記種子貯蔵蛋白質の生産を実質的に低下せしめるために効果的な量で発現され、そして前記第２の選択されたDNA配列は、対応する非トランスジェニック種子中に存在する蛋白質の重量％を超えて実質的に増加した重量％で前記トランスジェニック種子中で蛋白質として発現される；ことを含んで成る方法。 44．トランスジェニック種子を集めることをさらに含んで成る、請求項41，42 又は43に記載の方法。 45．前記ポリペプチドがα−ゼイン蛋白質において実質的に同種性（homologo us）である、請求項41に記載の方法。 46．前記第１の選択されたDNAセグメントが、種子貯蔵蛋白質をコードするmRN Aの全部又は部分と実質的に同一のRNA分子をコードする、請求項42又は43に記載の方法。 47．前記第１の選択されたDNAセグメントが、種子貯蔵蛋白質をコードするmRN Aの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする、請求項42又は 43に記載の方法。 48．前記選択されたDNAセグメントが、α−ゼイン蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分と実質的に同一のRNA分子をコードする、請求項46に記載の方法。 49．前記選択されたDNAセグメントが、α−ゼイン蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする、請求項47に記載の方法。 50．前記植物細胞が単子葉植物細胞である、請求項41，42又は43に記載の方法。 51．前記細胞がトウモロコシ植物細胞である、請求項50に記載の方法。 52．前記トランスジェニック植物の種子が少なくとも１種の必須アミノ酸の増加した重量％を有する、請求項42に記載の方法。 53．前記必須アミノ酸が、メチオニン、スレオニン、リジン、トリプトファン、イソロイシン及びこれらの混合から成る群から選択される、請求項52に記載の方法。 54．前記アミノ酸の重量％が少なくとも約50％〜300％増加する、請求項52に記載の方法。 55．前記選択されたDNA配列が、植物種子の発達中に機能するプロモーターに作用可能に連結されている、請求項41，42又は43に記載の方法。 56．前記プロモーターが10kDゼインプロモーターを含んで成る、請求項41，42 又は43に記載の方法。 57．前記プロモーターが27kDゼインプロモーターを含んで成る、請求項41，42 又は43に記載の方法。 58．前記選択されたDNA配列が、19kDα−ゼイン蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補性なRNA分子をコードする、請求項49に記載の方法。 59．前記選択されたDNA配列が、22kDα−ゼイン蛋白質をコードするメッセンジャーRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする、請求項49に記載の方法。 60．前記選択されたDNA配列が、19kDα−ゼイン蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分と実質的に同一なRNA分子をコードする、請求項48に記載の方法。 61．前記選択されたDNA配列が、22kDα−ゼイン蛋白質をコードするメッセンジャーRNAの全部又は部分と実質的に同一なRNA分子をコードする、請求項48に記載の方法。 62．前記第２の選択されたDNA配列がMB1をコードする、請求項 42又は43に記載の方法。 63．前記第２の選択されたDNA配列が10kDゼインをコードする、請求項42又は4 3に記載の方法。 64．前記細胞が、核硬質物(kernel hardness)をコードする第３の選択されたD NAにより安定に形質転換される、請求項42又は43に記載の方法。 65．前記第３の選択されたDNA配列が27kDメイズ蛋白質をコードする請求項64 に記載の方法。 66．前記細胞が、核硬質物(kernel hardness)をコードする第２の選択されたD NA配列により安定に形質転換される、請求項41に記載の方法。 67．前記第２の選択されたDNA配列が27kDゼイン蛋白質をコードする、請求項6 6に記載の方法。 68．前記細胞が、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクティルボンバートメント及びリポゾーム封入から成る群から選択された方法により形質転換される、請求項41，42又は43のいずれか１項に記載の方法。 69．前記細胞が、少なくとも１個の選択マーカー遺伝子により安定に形質転換される、請求項41，42又は43に記載の方法。 70．対応する形質転換されていない植物と比べて機能的農業経済的特性を維持しながら、少なくとも１種のアミノ酸の重量％の増加を優性形質として有する子孫植物を得るために、前記繁殖能力を有する植物を育成することをさらに含んで成る、請求項42に記載の方法。 71．動物の食物にとって必須である少なくとも１種のアミノ酸の増加した重量％を有する繁殖能力を有するトランスジェニックゼア・メイズ（Zea mays）植物であって、そのゲノムは植物種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAに対して実質的に同一であるか又は相補的であるRNA分子をコードする選択されたDNA配列により安定に増加されており、ここで前記選択されたDNA配列は、前記トランスジェニック植物の細胞中で、前記選択されたDNA 配列が存在しない点でのみ前記トランスジェニック植物の細胞と異る植物の細胞中の前記種子貯蔵蛋白質の量に比べて、前記種子貯蔵蛋白質の量を減少せしめるのに十分な量で発現され、そして前記選択されたDNA配列はトランスジェニック植物の完全な正常な性サイクルを通して次世代に伝達される、ことを特徴とするトランスジェニック植物。 72．増加した澱粉含量を有する繁殖能力を有するトランスジェニックゼア・メイズ（Zea mays）植物であって、そのゲノムは植物種子貯蔵蛋白質をコードする mRNAに対して実質的に同一であるか又は相補的であるRNA分子をコードする選択されたDNA配列により安定に増加されており、ここで前記選択されたDNA配列は、前記トランスジェニック植物の細胞中で、前記選択されたDNA配列が存在しない点でのみ前記トランスジェニック植物の細胞と異る植物の細胞中の前記種子貯蔵蛋白質の量及び澱粉含量に比べて、前記種子貯蔵蛋白質の量を減少せしめそして前記澱粉含量を増加せしめるのに十分な量で発現され、そして前記選択されたDN A配列はトランスジェニック植物の完全な正常な性サイクルを通して次世代に伝達される、ことを特徴とするトランスジェニック植物。 73．その種子が増加した澱粉抽出可能性（extractability）を有する繁殖能力を有するトランスジェニックゼア・メイズ（Zea mays）植物であって、該植物のゲノムは植物種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAに対して実質的に同一であるか又は相補的であるRNA分子をコードする選択されたDNA配列により安定に増加されており、ここで前記選択されたDNA配列は前記トランスジェニック植物の細胞中で、前記選択されたDNA配列が存在しない点でのみ前記トランスジェニック植物の細胞と異る植物の細胞中の前記種子貯蔵蛋白質の量及び澱粉抽出可能性に比べて、前記種子貯蔵蛋白質の量を減少せしめそして澱粉抽出可能性を増加せしめるのに十分な量で発現され、そして前記選択されたDNA配列はトランスジェニック植物の完全な正常な性サイクルを通して次世代に伝達される、ことを特徴とするトランスジェニック植物。 74．減少した量の種子貯蔵蛋白質を有する繁殖能力を有するトランスジェニックゼア・メイズ（Zea mays）植物であって、そのゲノムは植物種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAに対して実質的に同一であるか又は相補的であるRNA分子をコードする選択されたDNA配列により安定に増加されており、ここで前記RNA分子は、種子貯蔵蛋白質において実質的に同種性（homologous）であるペプチドをコードするmRNA分子の全部又は部分に対して実質的に同一であるか又は相補的であり、ここで前記選択されたDNA配列は前記トランスジェニック植物の細胞中で、前記選択されたDNA配列が存在しない点でのみ前記トランスジェニック植物の細胞と異る植物の細胞中の前記種子貯蔵蛋白質の量に比べて、前記種子貯蔵蛋白質の量を減少せしめるのに十分な量で発現され、そして前記選択されたDNA配列はトランスジェニック植物の完全な正常な性サイクルを通して次世代に伝達される、ことを特徴とするトランスジェニック植物。 75．減少した種子貯蔵蛋白質含有を有する繁殖能力を有するトランスジェニックゼア・メイズ（Zea mays）植物であって、そのゲノムは植物種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAに対して実質的に同一であるか又は相補的であるRNA分子をコードする選択されたDNA配列により安定に増加されており、ここで前記選択されたD NA配列は前記トランスジェニック植物の細胞中で、前記選択されたDNA配列が存在しない点でのみ前記トランスジェニック植物の細胞と異る植物の細胞中で前記蛋白質の量を減少せしめるのに十分な量で発現され、そして前記選択されたDN A配列はトランスジェニック植物の完全な正常な性サイクルを通して次世代に伝達される、ことを特徴とするトランスジェニック植物。 76．動物の食物にとって必須である少なくとも１種のアミノ酸の増加した重量％を有する繁殖能力を有するトランスジェニックゼア・メイズ（Zea mays）植物であって、そのゲノムは第１の選択されたDNA配列及び第２の選択されたDNA配列により安定に増加されており、ここで前記第１の選択されたDNA配列は種子貯蔵蛋白質をコードするメッセンジャーRNAの全部又は部分に対して実質的に同一であるか又は相補的であるRNA分子をコードし、前記第２のDNA配列は動物の食物にとって必須の少なくとも１種のアミノ酸を有するポリペプチドをコードし、そしてここで、前記選択されたDNA配列が存在しない点でのみ前記トランスジェニック植物の細胞と異る植物の細胞中の前記種子貯蔵蛋白質の量及び前記必須アミノ酸の重量％に比べて、前記トランスジェニック植物の細胞中で、前記第１の選択されたDNA配列は前記種子貯蔵蛋白質の生産を実質的に低下せしめるのに効果的な量で発現され、そして前記第２の選択されたDNA配列は、前記トランスジェニック種子中の前記少なくとも１種の必須アミノ酸の重量％を増加せしめるのに効果的な量で発現され、そして選択されたDNA配列はトランスジェニック植物の完全な正常な性サイクルを通して次世代に伝達される、ことを特徴とするトランスジェニック植物。 77．増加した量の選択されたポリペプチドを有する繁殖能力を有するトランスジェニックゼア・メイズ（Zea mays）植物であって、そのゲノムは、第１の選択されたDNA配列及び第２の選択されたDN A配列により安定に増加されており、ここで前記第１の選択されたDNA配列は種子貯蔵蛋白質をコードする少なくとも１つのメッセンジャーRNAの全部又は部分に対して実質的に同一であるか又は相補的であるRNA分子をコードし、前記第２の選択されたDNA分子はポリペプチドをコードし、そしてここで、前記選択されたD NA配列が存在しない点でのみ前記トランスジェニック植物の細胞と異る植物の細胞中の前記種子貯蔵蛋白質の量及び前記選択されたポリペプチドの量に比べて、前記トランスジェニック植物の細胞中で、前記第１の選択されたDNA配列は前記種子貯蔵蛋白質の生産を実質的に低下せしめるのに効果的な量で発現され、そして前記第２の選択されたDNA配列は、前記トランスジェニック種子中で前記選択されたポリペプチドを増加せしめるのに効果的な量で発現され、そして選択されたDNA配列はトランスジェニック植物の完全な正常な性サイクルを通して次世代に伝達される、ことを特徴とするトランスジェニック植物。 78．請求項71，72，73，74，75，76又は77に記載の植物に由来する種子。 79．請求項78に記載の種子に由来する子孫植物。 80．前記選択されたDNA配列が、α−ゼイン蛋白質において実質的に同種性（h omologous）であるペプチドをコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に同一であるか又は相補的であるRNA分子をコードする、請求項74に記載のトランスジェニック植物。 81．前記トランスジェニック植物の種子が増加した重量％の少なくとも１種の必須アミノ酸を有する、請求項71又は75に記載のトランスジェニック植物。 82．前記必須アミノ酸が、メチオニン、スレオニン、リジン、トリプトファン、イソロイシン及びこれらの混合から成る群から選択される、請求項81に記載のトランスジェニック植物。 83．前記アミノ酸の重量％が少なくとも約50％〜300％増加する、請求項81に記載のトランスジェニック植物。 84．前記プロモーターが10kDゼインプロモーターを含んで成る、請求項71，72 ，73，74又は75に記載のトランスジェニック植物。 85．前記少なくとも１つのプロモーターが10kDゼインプロモーターを含んで成る、請求項76又は77に記載のトランスジェニック植物。 86．前記プロモーターが27kDゼインプロモーターを含んで成る、請求項71，72 ，73，74又は75に記載のトランスジェニック植物。 87．前記少なくとも１つのプロモーターが27kDゼインプロモーターを含んで成る、請求項76又は77に記載のトランスジェニック植物。 88．種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする前記の選択されたDNAが、19kDα−ゼイン蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする、請求項71，72，73，74，75，76又は77に記載のトランスジェニック植物。 89．種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする前記の選択されたDNAが、22kDα−ゼイン蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分に対して実質的に相補的なRNA分子をコードする、請求項71，72，73，74，75，76又は77に記載のトランスジェニック植物。 90．種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分と実質的に同一なRNA分子をコードする前記の選択されたDNAが、19kDα−ゼイン蛋白質をコードするmRN Aの全部又は部分と実質的に同一なRNA分子をコードする、請求項71，72，73，74 ，75，76又は77に記載のトランスジェニック植物。 91．種子貯蔵蛋白質をコードするmRNAの全部又は部分と実質的に同一なRNA分子をコードする前記の選択されたDNAが、22kDα−ゼイン蛋白質をコードするmRN Aの全部又は部分と実質的に同一なRNA分子をコードする、請求項71，72，73，74 ，75，76又は77に記載のトランスジェニック植物。 92．前記第２の選択されたDNA配列がMB１をコードする、請求項76又は77に記載のトランスジェニック植物。 93．前記第２の選択されたDNA配列が10kDゼインをコードする、請求項76又は7 7に記載のトランスジェニック植物。 94．前記細胞を、核硬部(kernel hardness)をコードする遺伝子により安定に形質転換することをさらに含んで成る、請求項71，72，73，74，75，76又は77に記載のトランスジェニック植物。 95．前記細胞が、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクティルボンバートメント、及びリポゾーム封入から成る群から選択された方法により形質転換される、請求項71，72，73，74，75，76又は77に記載のトランスジェニック植物。 96．前記細胞を少なくとも１つの選択マーカー遺伝子により安定に形質転換することをさらに含んで成る、請求項75，76，77，78，79，80又は81に記載のトランスジェニック植物。