CN115820691A - 一种基于LbCpf1变体的水稻碱基编辑系统和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于LbCpf1变体的水稻碱基编辑系统和应用，该变体称为dLbCpf1。本发明的水稻碱基编辑系统包含了上述变体、crRNA和ABE8e，通过将本发明的碱基编辑系统转入生物体或生物细胞内，使dLbCpf1、crRNA和ABE8e的编码基因均得到表达，可以实现基因组靶点序列A:T到G:C的精准替换编辑。利用本发明的dCas12a融合ABE的碱基编辑系统，可以识别PAM序列为TTTV的靶点序列，从而在A/T富集区域内实现高效率和高精准度的定向碱基编辑，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种高效水稻碱基编辑系统及应用。
背景技术
CRISPR/Cas9基因组编辑系统自问世以来，就有着其它基因组编辑技术无可比拟的优势，被认为能够在活细胞中广泛使用，并是迄今为止最有效、最便捷的基因组编辑系统。后来发现的CRISPR/Cpf1系统和CRISPR/Cas9系统同属CRISPR-Cas Class2系统，但前者仅需要一条更短的crRNA即可实现基因编辑，更有潜力实现更简单、更精确的基因组工程操作。单个Cpf1蛋白在crRNA处理中起作用、靶位点识别和DNA切割。通过crRNA引导Cpf1蛋白找到目的DNA，通过Cpf1的Ruv核酸酶结构域和Nuc辅结构域进行切割。目前植物中有三种Cpf1：FnCpf1、LbCpf1和AsCpf1，而其中效率最高的是LbCpf1。LbCpf1可有效识别基因组中的TTTV(V＝A/C/G)序列作为PAM，从而靶向其下游序列。
Cas9核酸酶利用引导RNA(guide RNA，gRNA)可在多种细胞的基因组特定靶点定位，对其进行切割从而产生DNA双链断裂(double strand breaks，DSBs)，然后利用细胞内源的DNA修复机制来实现编辑。根据不同DNA修复通路的激活，将会导致基因的失活或者突变的校正，为了提高基因突变的校正效率，碱基编辑器(base editor，BE)应运而生。在2017年，刘如谦团队开发出了腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors,ABEs)，该工具能够实现腺嘌呤A到鸟嘌呤G的单碱基转换，2020年刘如谦团队在ABE7.10上继续升级，用噬菌体辅助进化生成了ABE8e(TadA-8e V106W)，其编辑速度比ABE7.10快590倍，脱靶效应并没有显著提高。ABE系统由gRNA和融合蛋白构成，其中，融合蛋白一般由改造的Cas9蛋白(Cas9nickase,Cas9n)和腺嘌呤脱氨酶组成。其原理为脱氨酶与Cas9切口酶(Cas9n)的N末端融合，在gRNA引导下，使非靶链中的腺苷脱氨，暴露为单链DNA(single-stranded,ssDNA)，然后将腺嘌呤A转化为肌苷I(A-to-I)，最后，DNA聚合酶将肌苷I识别为鸟嘌呤G进行复制，而互补链上原来与腺嘌呤A互补的胸腺嘧啶T将会变成胞嘧啶C，进而完成碱基置换过程。但目前该系统仅利用nCas9蛋白突变体(Cas9 nicknase，nCas9)或dCas9蛋白突变体(deactivated Cas9，dCas9)作为效应蛋白，所识别的PAM序列为鸟嘌呤/胞嘧啶富集区。因此，利用现有的碱基编辑系统无法在水稻等植物的基因组上的腺嘌呤/胸腺嘧啶富集区域进行高效的编辑操作。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种能识别非G序列，且高效的碱基编辑系统，如将生物体或生物细胞中PAM序列为TTTV的靶点序列中的A:T突变成G:C。进而实现在水稻等植物的基因组上的腺嘌呤/胸腺嘧啶富集区域进行高效的编辑操作。
为解决上述技术问题，本发明首先提供一种识别PAM序列为TTTV dLbCpf1，其特征在于，所述dLbCpf1包含：
(a)序列表中SEQ ID NO：1所示序列；
(b)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；
(c)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者
(d)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列。
其中，dLbCpf1的DNA切割活性缺失。
另一方面，本发明提供一种基于LbCpf1变体的水稻碱基编辑系统，其特征在于，所述水稻碱基编辑系统包含所述LbCpf1变体，所述LbCpf1变体为dLbCpf1，其如序列表SEQ IDNO：1所示，其序列具体为：
优选地，所述水稻碱基编辑系统包括所述dLbCpf1的编码基因、crRNA的DNA分子以及腺嘌呤脱氨酶ABE8e的编码基因；
所述crRNA靶向目标靶点序列；
所述目标靶点序列的PAM序列为TTTV。
优选地，碱基编辑系统包括融合蛋白；所述融合蛋白由dLbCpf1的对应蛋白和腺嘌呤脱氨酶ABE8e组成；dLbCpf1蛋白变体的编码基因如序列表中SEQ ID NO：1所示；腺嘌呤脱氨酶ABE8e的编码基因如序列表中SEQ ID NO：2所示。
另一方面，本发明提供一种用于所述的水稻碱基编辑系统的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括表达盒一和表达盒二；所述表达盒一表达上述的融合蛋白；所述表达盒二表达上述的crRNA和目标靶点序列。
另一方面，本发明提供一种所述的水稻碱基编辑系统的应用，所述应用包括利用所述碱基编辑系统中的dLbCpf1的编码基因、crRNA的DNA分子、腺嘌呤脱氨酶ABE8e的编码基因，以将其分别导入目标受体内，使所述dLbCpf1、所述crRNA和所述ABE8e的编码基因均得到表达，提高水稻基因组上为TTTV的PAM序列附近的A:T突变成G:C的定点替换效率，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。
另一方面，本发明提供一种所述的重组表达载体的应用，其特征在于：所述应用包括利用所述的重组表达载体中的dLbCpf1的编码基因、crRNA的DNA分子、腺嘌呤脱氨酶ABE8e的编码基因，以将其分别导入目标受体内，使所述dLbCpf1、所述crRNA和所述ABE8e的编码基因均得到表达，提高水稻基因组上为TTTV的PAM序列附近的A:T突变成G:C的定点替换效率，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。
优选地：所述受体可为植物愈伤组织。
优选地，“导入受体”的过程可经过侵染、共培养、筛选步骤来实现，进而得到编辑后的植物愈伤组织，然后利用愈伤组织分化成植株。
本发明将dLbCpf1的编码基因、crRNA的DNA分子、腺嘌呤脱氨酶ABE8e的编码基因导入生物体或生物细胞内，使所述dLbCpf1、所述crRNA和所述ABE8e的编码基因均得到表达，实现基因组靶点序列的编辑。
所述PAM序列为与所述靶点序列3′端相连的一段DNA序列。所述PAM序列中的N与所述靶点序列3′端相连。
优选地，所述的dLbCpf1蛋白变体的对应基因由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成。
所述的腺嘌呤脱氨酶基因由SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列构成。
所述靶点序列的长度可为23bp。
优选地，所述应用包括，所述应用过程包括：
(1)构建植物表达载体pHUC600-dLbCpf1-ABE8e；
(2)将crRNA表达盒连接于PUC57-AMP载体上形成PUC57-AMP-crRNA载体，并转入大肠杆菌XL-blue菌株并形成crRNA表达框；
(3)将crRNA表达框连接到pHUC600-dLbCpf1-ABE8e载体，得到植物表达载体pHUC611-dLbCpf1-ABE8e；
(4)将靶位点序列与pHUC611-dLbCpf1-ABE8e融合，得到pHUC611-dLbCpf1-ABE8e-PDS载体；
(5)利用水稻种子制备相应愈伤组织，并利用含有pHUC611-dLbCpf1-ABE8e-PDS载体的农杆菌菌株对愈伤组织进行侵染和共培养；
(6)对培养后的愈伤组织进行筛选、分化再生和培育。
本发明利用dLbCpf1融合ABE8e的碱基编辑系统在水稻中实现了更多的靶点序列中由A:T到G:C的替换，如PAM序列为TTTV的靶点序列，扩展了ABE介导的碱基替换系统的编辑范围。本发明的dLbCpf1变体融合ABE8e的碱基编辑系统具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为pHUC611-dLbCpf1-ABE8e载体质粒示意图。
图2为pHUC611-dLbCpf1-ABE8e靶向突变植株中的突变形式。
具体实施方式
以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。
在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,VitalyCitovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1——pHUC611-dLbCpf1-ABE8e重组表达载体的构建
本申请的发明人在进行LbCpf1的各种突变尝试过程中，找到了一种新型LbCpf1变体，将其用于构建基于LbCpf1的ABE8e编辑系统可以实现高效的水稻基因组上TTTV的PAM序列附近位点的A:T到G:C的定点替换。该LbCpf1本文中称为dLbCpf1。
此外，研究过程中，申请人注意到细菌的dLbCpf1工作温度为37℃，其无法用于植物转化，发明人将dLbCpf1蛋白的第156位氨基酸由D突变成R后，证实可以使其工作温度降低为22-28℃，落入到植物的遗传转化过程培养温度范围28-30℃之内，因此dLbCpf1的最终序列如SEQ ID NO:1所示。本发明采用的ABE8e(TadA-8e V106W)的序列如SEQ ID NO:2所示，其序列具体为：
人工合成dLbCpf1和ABE8e的融合蛋白序列，其中不含ABE8e基因的终止密码子，此外，分别在ABE8e的5’端及dLbCpf1变体的3’加上1个和3个核定位信号NLS。融合蛋白基因命名为dLbCpf1-ABE8e，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。合成的dLbCpf1-ABE8e基因连接于PUC57-AMP载体上，两端带上PstI/SacI酶切位点，形成PUC57-AMP-dLbCpf1-ABE8e载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。
用Axygen质粒提取试剂盒中提取上一步骤中大肠杆菌转化所获得质粒，用PstI/SacI酶切，回收dLbCpf1-ABE8e片段。同时利用PstI/SacI酶对植物表达载体pHUC600载体进行线性化处理，回收pHUC600，由于合成的dLbCpf1-ABE8e序列两端加有PstI/SacI酶切位点，可以利用T4连接酶将dLbCpf1-ABE8e连接到pHUC600载体，得到植物表达载体pHUC600-dLbCpf1-ABE8e。
crRNA表达盒从5'-3'具有以下4个元件：Os U3启动子、LbCpf1对应的成熟型直接重复序列(direct repeat，DR)、两个BsaI酶切位点用于对sg序列进行无缝克隆、转录终止子序列，具体序列见SEQ ID NO:3。加粗碱基表示Hind III酶切位点，为方便克隆至pCambia表达载体而设置；方框表示LbCpf1对应的成熟型DR序列；划线部分碱基为两个BsaI酶切位点相关的序列，构建碱基编辑载体时该序列会被sg序列代替；黑色底纹为转录终止子序列TTTTTTT；其余为OsU3启动子的序列。
crRNA表达盒由苏州金唯智生物科技有限公司合成，连接于PUC57-AMP载体上，两端带上HindIII酶切位点，形成PUC57-AMP-crRNA载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。
用Axygen质粒提取试剂盒中提取上一步骤中大肠杆菌转化所获得质粒，用HindIII酶切，回收crRNA表达框片段。同时利用HindIII酶对植物表达载体pHUC600-dLbCpf1-ABE8e载体进行线性化处理，回收pHUC600-dLbCpf1-ABE8e，利用T4连接酶将crRNA表达框连接到pHUC600-dLbCpf1-ABE8e载体，得到植物表达载体pHUC611-dLbCpf1-ABE8e，载体图如图1所示。
实施例2——碱基编辑载体的获得
选择水稻PDS基因(LOC_Os03g0184000)中第536-562位的核苷酸序列TTTAAGTTGGAGCTTATCCCAACATAC(下划线部分为所述5’TTTA-3’结构的PAM序列)，作为打靶位点。将靶位点序列与pHUC611-dLbCpf1-ABE8e融合形成pHUC611-dLbCpf1-ABE8e-PDS。利用冻融法将这个植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。
实施例3——以pHUC611-dLbCpf1-ABE8e-PDS为打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得。
1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养
将日本晴的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。
两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤组织转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。
2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备
将含有pHUC611-dLbCpf1-ABE8e-PDS载体的农杆菌菌株EHA105在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660至约0.10-0.25，室温静置30min以上。
3、侵染和共培养
向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min，其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。
4、前筛选和筛选培养
共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。
5、分化再生
每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。
6、生根与移栽
当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。
7、分子鉴定
按照上面的培养方式，对于pHUC611-dLbCpf1-ABE8e-PDS这个打靶载体，获得了48株植株。在移栽之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于Hitom分析。Hitom扩增引物为5’-GGAGTGAGTACGGTGTGCCATTGTTCATTTTGTGCCTGTA-3’及5’-GAGTTGGATGCTGGATGGTACTTCTGGGAATCTTGGTTTA-3’。按照Hitom试剂盒的说明书操作得到48株植株的编辑效果。结果说明，在pHUC611-dLbCpf1-ABE8e-PDS这个碱基载体获得的植株中，14颗植株出现了A突变成G，突变效率25％(表1)，在检测PDS的靶标突变植株中，均在PAM远端的第12位的A突变成G(图2)，没有发现其他类型的突变。由此可见，本发明的pHUC611-dLbCpf1-ABE8e单碱基编辑系统能获得较高的单碱基突变率，而且是在TTTV的PAM位置附近进行靶向突变，获得突变均为A:T到G:C的替换，即获得“干净”突变植株效率很高。
表1 pHUC611-dLbCpf1-ABE8e-PDS获得的定点突变植株突变类型
Claims (9)
1.一种基于LbCpf1变体的水稻碱基编辑系统，其特征在于，所述水稻碱基编辑系统包含所述LbCpf1变体，所述LbCpf1变体为dLbCpf1，其如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求所述的水稻碱基编辑系统，其特征在于，所述水稻碱基编辑系统包括所述LbCpf1变体、crRNA、和腺嘌呤脱氨酶ABE8e；所述腺嘌呤脱氨酶ABE8e基因如序列表中SEQ ID NO：2所示。
3.一种LbCpf1变体，其特征在于，所述LbCpf1变体的序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
4.一种基于LbCpf1变体的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括表达盒一和表达盒二；所述表达盒一表达权利要求3中所述LbCpf1变体；所述表达盒二表达所述crRNA和目标靶点序列，
其中所述融合蛋白的结构为：P1-A1-B-C-D-A2-E
式中，
P1为第一启动子；
A1、A2为无或核定位信号序列NLS；
B为腺嘌呤脱氨酶ABE8e基因序列；
C为任意的连接肽或连接序列；
D为dLbCpf1基因序列；
E为第一终止子；
所述的第二表达盒为crRNA表达盒，在所述crRNA表达盒中含有对应于crRNA的编码序列；
并且所述第二表达盒具有结构：P2-G-H-T
式中，
P2为第二启动子；
G为对应于直接重复序列(direct repeat,DR)
H为目标位点引导序列sg；
T为无或终止序列。
5.一种用于碱基编辑系统的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括表达盒一和表达盒二。
6.一种基于LbCpf1变体的水稻碱基编辑系统的应用，其特征在于：所述应用包括利用权利要求4所述的重组表达载体中的dLbCpf1的编码基因、腺嘌呤脱氨酶ABE8e的编码基因、crRNA的DNA分子，将其分别导入目标受体内，使所述dLbCpf1、ABE8e的编码基因、所述crRNA均得到表达，提高水稻基因组上为TTTV的PAM序列附近的A:T突变成G:C的定点替换效率，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述受体可为植物愈伤组织。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：“导入受体”的过程可经过侵染、共培养、筛选步骤来实现，进而得到编辑后的植物愈伤组织，然后利用愈伤组织分化成植株。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用过程包括：
(1)构建植物表达载体pHUC600-dLbCpf1-ABE8e；
(2)将crRNA表达盒连接于PUC57-AMP载体上形成PUC57-AMP-crRNA载体，并转入大肠杆菌XL-blue菌株并形成crRNA表达框；
(3)将crRNA表达框连接到pHUC600-dLbCpf1-ABE8e载体，得到植物表达载体pHUC611-dLbCpf1-ABE8e；
(4)将靶位点序列与pHUC611-dLbCpf1-ABE8e融合，得到pHUC611-dLbCpf1-ABE8e-PDS载体；
(5)利用水稻种子制备相应愈伤组织，并利用含有pHUC611-dLbCpf1-ABE8e-PDS载体的农杆菌菌株对愈伤组织进行侵染和共培养；
(6)对培养后的愈伤组织进行筛选、分化再生和培育。
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2022
- 2022-07-25 CN CN202210879291.0A patent/CN115820691B/zh active Active
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| Publication number | Publication date |
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