JP2001145429A

JP2001145429A - タペート層特異的ジンクフィンガー転写因子の遺伝子を用いて花粉稔性を低下させる方法

Info

Publication number: JP2001145429A
Application number: JP33068099A
Authority: JP
Inventors: Sanjae Kapur; サンジャエカプール; Akira Kobayashi; 晃小林; Hiroshi Takatsuji; 博志高辻
Original assignee: NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RE; NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RESOURCES; Bio Oriented Technology Research Advancement Institution; Sasaki Co Ltd
Current assignee: NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RE; NATL INST OF AGROBIOLOGICAL RESOURCES; Bio Oriented Technology Research Advancement Institution; Sasaki Co Ltd
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 1999-11-19
Publication date: 2001-05-29

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】雄性不稔に代表される植物形質の改変に有用
な、葯の組織に特異的な遺伝子を利用する遺伝子工学的
手法を提供する。【解決手段】（ｉ）特定の塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｉｉ）（ｉ）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御
する転写因子をコードするＤＮＡ、又は（ｉｉｉ）
（ｉ）もしくは（ｉｉ）の断片であるＤＮＡのいずれか
である核酸と、この核酸に作動可能に連結されたプロモ
ーターとを含む、植物発現カセットを準備し、花粉の発
達を制御する内因性の転写因子を有する植物の細胞を提
供する工程では内因性の転写因子をコードする遺伝子
は、核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
され、発現カセットを植物細胞に導入し、植物細胞を植
物体に再生し、内因性の転写因子の発現が抑制された植
物体を選択する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、雄しべの葯に特異
的に発現する遺伝子およびその利用に関する。本発明
は、特に、葯のタペート層に特異的に発現する、ペチュ
ニア由来のジンクフィンガー型転写因子（ＺＰＴ３−
２）の遺伝子およびその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】花粉の稔性は、農業・園芸における様々
な局面で問題になる。たとえば、交雑育種における交配
の際、自家受粉を避けるために、多くの労力がかかる除
雄（雄しべの除去）の作業が行われる。種苗産業におい
ては、交雑育種によって得られた優れた品種を商業的に
保護したいという立場から、花粉稔性の無い形質が求め
られている。このような要請から、花粉の稔性を制御す
る技術（ｐｏｌｌｉｎａｔｉｏｎｃｏｎｔｒｏｌ）が
強く求められてきた。従来、特定の作物では、細胞質雄
性不稔性の系統が交雑育種に用いられ、一定の成功を収
めてきた。しかし、細胞質不稔形質は多くの場合、耐病
性の低下などの好ましくない副次効果を伴い、さらに形
質が不安定であること、種子の大量生産が困難なことな
どの問題がある。化学薬品処理によって稔性を低下させ
る方法も研究されているが、安全性評価および作用機作
解明が遅れており、実用化には至っていない。そこで、
遺伝子工学を用いた優れた雄性不稔化技術が求められて
いる。

【０００３】タペート層は、葯壁の最も内側に位置し、
胞子形成細胞（花粉細胞）を取り囲んでいる組織であ
る。タペート層の役割は、花粉の発達に欠かせない重要
なものであり、単に花粉細胞の支持体としてだけでな
く、花粉の発達に必要な栄養の供給、四分子（ｔｅｔｒ
ａｄ）を包むカロース層の分解、花粉細胞表面のエキシ
ン層などを構成する化合物の供給など、多岐にわたって
いる。葯の発達は、胞子形成細胞の減数分裂直後にあた
る四分子期、四分子からの微小胞子の放出期、花粉細胞
の拡大および空胞形成に特徴付けられる一核期、有糸分
裂により栄養細胞および生殖細胞への分化が生じる有糸
細胞分裂期、その後の二核期という、各段階に区分され
る。これらの段階を経て、最終的に葯が開裂し、成熟し
た花粉粒が放出される。以上の発達過程において、タペ
ート層の機能の一部でも損なわれると、多くの場合、正
常な花粉の発達が阻害され、花粉稔性が失われることが
知られている。

【０００４】上記のように、遺伝子工学による雄性不稔
化技術には大きな期待が寄せられている。特に、タペー
ト層のような、外部に露出していない小さな領域で特異
的に発現する遺伝子を利用できれば、植物に好ましくな
い形質を付与することなく、雄性不稔化を達成し得る可
能性が高いと考えられる。タペート層に特異的なプロモ
ーター、および、それを含む雄生不稔化のための遺伝子
構築物の例は、いくつか報告されている（Ｓｈｉｖａｎ
ｎａおよびＳａｗｈｎｅｙ編，Ｐｏｌｌｅｎｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒｃｒｏｐｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ（Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ）ｐ
ｐ．２３７−２５７，１９９７）。しかし、発現の組織
特異性および時期特異性が高い、花粉稔性の制御のため
に有用な新たな遺伝子に対する要望が依然として存在す
る。

【０００５】本発明者らは、最近、ペチュニア由来の新
規な転写因子として、ＰＥＴｈｙＺＰＴ３−２（以下、
ＺＰＴ３−２と略す）を含む７つのジンクフィンガー
（ＺＦ）型転写因子のｃＤＮＡ配列を特定した。そし
て、ノーザンブロット分析から、それぞれの転写因子が
葯特異的に、葯の発達の異なる段階において一過性の発
現を示すことを報告した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｐｌ
ａｎｔＪ．，１３：５７１，１９９８）。しかし、こ
れらの転写因子の植物における生理的な機能および作
用、ならびに転写因子をコードする遺伝子の正確な発現
部位およびその発現調節機構は不明であった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、雄性
不稔に代表される植物形質の改変に有用な、葯の組織に
特異的な遺伝子を利用する遺伝子工学的手法を提供する
ことにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、以前にペ
チュニアから単離した、葯特異的な転写因子の一つ（Ｚ
ＰＴ３−２）をコードする遺伝子をペチュニアに再導入
した。その結果、導入遺伝子が内因性遺伝子の発現を抑
制することによって、花粉の正常な発達が阻害され、花
粉の稔性が著しく低下することを見出した。さらに本発
明者らは、ＺＰＴ３−２のゲノム遺伝子から上流領域を
単離し、そのプロモーター活性の組織特異性を調べた。
その結果、４分子期から一核期にかけてのタペート層に
おいて、プロモーター活性が組織および時期特異的に発
現されることを見出した。本発明は、これらの知見に基
づいて完成された。

【０００８】本発明は、その第１の局面において、雄性
不稔性の植物を作出する方法であって、以下の工程を包
含する方法に関する：（ｉ）配列番号１によって示され
る塩基配列の第１位から第１８８６位までの配列を有す
るＤＮＡ、（ｉｉ）（ｉ）の塩基配列を有するＤＮＡと
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、花粉の
発達を制御する転写因子をコードするＤＮＡ、または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の断片であるＤＮＡ
のいずれかである核酸と、上記核酸に作動可能に連結さ
れたプロモーターとを含む、植物発現カセットを提供す
る工程；花粉の発達を制御する内因性の転写因子を有す
る植物の細胞を提供する工程であって、ここで、内因性
の転写因子をコードする遺伝子は、上記核酸とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズする、工程；発現カ
セットを植物細胞に導入する工程；発現カセットが導入
された植物細胞を、植物体に再生する工程；および、再
生された植物体であって、上記核酸が発現されることに
よって、内因性の転写因子の発現が抑制された植物体を
選択する工程。本発明の上記方法は、植物に雄性不稔性
を付与する方法として、利用され得る。

【０００９】１つの実施態様において、上記核酸は上記
プロモーターに対して順方向で連結され、上記植物体の
細胞内でセンス方向に転写され得る。

【００１０】１つの実施態様において、上記核酸は上記
プロモーターに対して逆方向で連結され、上記植物体の
細胞内でアンチセンス方向に転写され得る。

【００１１】１つの実施態様において、上記植物は双子
葉植物である。双子葉植物は、好ましくはナス科植物で
あり、より好ましくはペチュニア属植物である。

【００１２】１つの実施態様において、上記発現カセッ
トは植物発現ベクターに組み込まれている。

【００１３】本発明の第１の局面によればまた、上記い
ずれかに記載の方法により作出された、雄性不稔性の植
物が提供される。

【００１４】本発明は、その第２の局面において、雄性
不稔性の植物を作出する方法であって、以下の工程を包
含する方法に関する：（ａ）配列番号３によって示され
る塩基配列の第１位から第１９９１位までの配列を有す
るＤＮＡ、または（ｂ）（ａ）の一部の配列を有し、葯
のタペート層に特異的なプロモーター活性を示すＤＮＡ
のいずれかを含むプロモーターと、上記プロモーターに
作動可能に連結された異種遺伝子とを含む、植物発現カ
セットを提供する工程；発現カセットを植物細胞に導入
する工程；および、発現カセットが導入された植物細胞
を、植物体に再生する工程。本発明の上記方法は、植物
に雄性不稔性を付与する方法として、利用され得る。

【００１５】１つの実施態様において、上記植物は双子
葉植物である。双子葉植物は、好ましくはナス科植物で
あり、より好ましくはペチュニア属植物である。

【００１６】１つの実施態様において、上記発現カセッ
トは植物発現ベクターに組み込まれている。

【００１７】本発明の第２の局面によればまた、上記い
ずれかに記載の方法により作出された、雄性不稔性の植
物が提供される。

【００１８】本発明は、その第３の局面において、以下
の（Ｉ）または（ＩＩ）のＤＮＡを含むプロモーターに
関する：（Ｉ）配列番号３によって示される塩基配列の
第１位から第１９９１位までの配列を有するＤＮＡ；ま
たは、（ＩＩ）（Ｉ）の一部の配列を有し、葯のタペー
ト層に特異的なプロモーター活性を示す、ＤＮＡ。

【００１９】本発明は、その第４の局面において、上記
プロモーターと、上記プロモーターに作動可能に連結さ
れた異種遺伝子とを含む、植物に雄性不稔性を付与する
ために有用な植物発現カセットに関する。

【００２０】

【発明の実施の形態】本発明について、以下に、より詳
細に説明する。

【００２１】（ＺＰＴ３−２遺伝子由来の転写因子）本
発明の第１の局面である、雄性不稔性の植物を作出する
方法において有用な核酸は、（ｉ）配列番号１によって
示される塩基配列の第１位から第１８８６位までの配列
を有するＤＮＡ、（ｉｉ）（ｉ）の塩基配列を有するＤ
ＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
花粉の発達を制御する転写因子をコードするＤＮＡ、ま
たは（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）の断片であるＤ
ＮＡのいずれかである。本発明における上記核酸は、好
ましくは（ｉ）のＤＮＡ、すなわち、ＺＰＴ３−２をコ
ードするＤＮＡ、またはその断片であり、より好ましく
は（ｉ）のＤＮＡである。

【００２２】本明細書において「転写因子」とは、遺伝
子の調節領域のＤＮＡに結合してｍＲＮＡの合成を制御
するタンパク質をいう。ある種の転写因子は、そのＤＮ
Ａ結合ドメインにジンクフィンガーモチーフと呼ばれる
保存性の高いアミノ酸配列を有することが知られてい
る。ＺＰＴ３−２は、Ｃｙｓ２／Ｈｉｓ２型（ＥＰＦフ
ァミリー）のジンクフィンガータンパク質であって、４
４４アミノ酸からなる全長のアミノ酸配列内に３つのジ
ンクフィンガーモチーフを含み、さらにＤＬＮＬ配列と
称される疎水性領域を含む転写因子である（Ｋｏｂａｙ
ａｓｈｉら、前出）。ＺＰＴ３−２をコードするｃＤＮ
Ａ配列（配列番号１）を、対応する推定アミノ酸配列
（配列番号２）と共に図１Ａ〜１Ｄに示す。

【００２３】本明細書において、核酸またはＤＮＡの
「断片」とは、植物体に導入され、適切な様式で発現さ
れたときに、当該植物の内因性の転写因子の発現を抑制
し得る断片をいう。この断片は、上記（ｉ）または（ｉ
ｉ）のＤＮＡの、ジンクフィンガーモチーフをコードす
る領域以外から選択され、少なくとも約４０塩基対以
上、好ましくは約５０塩基対以上、より好ましくは約７
０塩基対以上、さらに好ましくは約１００塩基対以上の
長さを有する。

【００２４】本明細書において、ハイブリダイゼーショ
ンのための「ストリンジェントな条件」とは、特定の塩
基配列（例えば、ペチュニア由来のＺＰＴ３−２をコー
ドするＤＮＡ）と、これと相同性の高い他の塩基配列
（例えば、ペチュニア以外の植物に存在する、ＺＰＴ３
−２のホモログをコードするＤＮＡ）とのオリゴヌクレ
オチド二本鎖を形成させるのに十分な条件を意図する。
本発明に適用されるストリンジェントな条件の代表的な
例として、次の条件が挙げられる：１ＭＮａＣｌ、１
％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、³²Ｐ標識プローブ
ＤＮＡ（１ｘ１０ ⁷ｃｐｍ）および５０μｇ／ｍｌサケ
精子ＤＮＡを含む溶液中で、６０℃で１６時間ハイブリ
ダイズさせた後、２ｘＳＳＣ／１％ＳＤＳで６０℃、３
０分間の洗浄を２回繰り返す。

【００２５】本発明における、ＺＰＴ３−２をコードす
るＤＮＡ、およびこれとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、花粉の発達を制御する転写因子をコー
ドするＤＮＡを単離するためには、公知の転写因子の遺
伝子によりコードされるアミノ酸配列の保存領域に対応
するデジェネレートプライマー対を用い得る。このプラ
イマー対を用いて、植物のｃＤＮＡまたはゲノミックＤ
ＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、その後、得られた増幅
ＤＮＡ断片をプローブとして用いて、同じ植物のｃＤＮ
Ａライブラリーまたはゲノミックライブラリーをスクリ
ーニングすることができる。そのようなプライマー対の
例として、５’−ＣＡＲＧＣＮＹＴＮＧＧＮＧＧＮＣＡ
Ｙ−３’（配列番号４）と、３’−ＲＴＧＮＣＣＮＣＣ
ＮＡＲＮＧＣＹＴＧ−５’（配列番号５）との組合せが
挙げられる（ここで、Ｎはイノシンであり、ＲはＧまた
はＡであり、そしてＹはＣまたはＴである）。上記プラ
イマー配列は、それぞれ、ＺＰＴ３−２のジンクフィン
ガーモチーフに含まれるアミノ酸配列ＱＡＬＧＧＨに対
応する。

【００２６】従って、本発明に適用されるストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件はまた、ＰＣＲの条
件としても規定され得、代表的な例においては、上記デ
ジェネレートプライマー（配列番号４および５）が用い
られ得る。この際のＰＣＲ反応条件は、９４℃で５分間
の変性の後、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、そ
して７２℃で１分間を３０サイクル繰り返し、最後に、
７２℃で７分間インキュベーションを行う条件であり得
る。

【００２７】ＰＣＲは、市販のキットおよび装置の製造
者の指針に基づいて行うか、当業者に周知の手法で行い
得る。遺伝子ライブラリーの作製法、および遺伝子のク
ローニング法なども当業者に周知である。例えば、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，１９８９）を参照のこと。得られた遺伝子
の塩基配列は、当該分野で公知のヌクレオチド配列解析
法または市販されている自動シーケンサーを利用して決
定し得る。

【００２８】本明細書において、転写因子が「花粉の発
達を制御する」とは、代表的には、この転写因子の発現
が阻害されるとき、花粉の形態または機能において有意
な変化が観察されることをいう。本発明における転写因
子は、代表的には、それをコードする遺伝子の発現が阻
害されることにより、好ましくは約６０％以上、より好
ましくは約７５％以上、さらに好ましくは約９０％以上
の花粉細胞を、成熟する前に死滅せしめる。ここで、転
写因子の発現が阻害されるとは、ノーザンブロット法に
より測定したとき、ｍＲＮＡの量が、野生型のコントロ
ール植物と比較して約１０分の１以下になることをい
う。

【００２９】上記のようなスクリーニングによって単
離、同定された遺伝子によってコードされる転写因子
（すなわち、ＺＰＴ３−２およびＺＰＴ３−２ホモロ
グ）が花粉の発達を制御することは、本明細書の開示に
従って形質転換植物を作出し、その花粉の特性を観察す
ることによって、確認し得る。

【００３０】本発明においては、花粉の発達を制御する
転写因子をコードするＤＮＡまたはその断片を利用し
て、植物細胞において、当該ＤＮＡと同一のまたは相同
な塩基配列を含む内因性遺伝子の発現を抑制し得る。標
的となる内因性遺伝子もまた、花粉の発達を制御する転
写因子である。本発明の方法によれば、好ましくは、花
粉の発達を制御する内因性転写因子以外の発現を実質的
に抑制することなく、内因性転写因子の発現のみを選択
的に抑制することによって、植物に雄性不稔性が付与さ
れる。

【００３１】すなわち、本発明における発現抑制技術が
適用される植物細胞は、花粉の発達を制御する内因性の
転写因子を有する植物の細胞であって、この内因性の転
写因子をコードする遺伝子は、上記ＺＰＴ３−２または
ＺＰＴ３−２ホモログのＤＮＡとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするものとして規定される。ここ
で「ストリンジェントな条件」の定義は、ＺＰＴ３−２
ホモログの特定に関連して上述した条件と同じである。
本発明の範囲を限定する意図ではないが、上記方法によ
って雄性不稔性を付与し得る植物は、ＺＰＴ３−２遺伝
子が単離されたペチュニア、またはＺＰＴ３−２ホモロ
グをコードする遺伝子が単離された植物と、進化系統学
上近縁の植物であることが望ましい。ここで、進化系統
学上近縁とは、代表的には同じ目に分類され、好ましく
は同じ科に分類され、より好ましくは同じ属に分類さ
れ、さらに好ましくは同じ種に分類される植物である。
もっとも、葯の最内層にタペート層が存在し花粉の発達
に不可欠な機能を果たしていることは、ほとんどの種子
植物に共通する事実であるので、この点を考慮すれば、
ＺＰＴ３−２と同一または類似の機能を果たす転写因子
が他の植物にも広く存在し得ることは容易に理解され
る。

【００３２】内因性遺伝子の発現を抑制するための手法
として、代表的にはコサプレッションおよびアンチセン
ス技術を利用し得る。コサプレッションは、植物細胞に
組み換え遺伝子を導入したとき、その遺伝子自体、およ
びその遺伝子の一部と相同な配列を含む内因性遺伝子の
両者の発現が抑制されることをいう。コサプレッション
が利用される場合、本発明における発現カセットは、転
写因子をコードするＤＮＡまたはその断片を、プロモー
ターに対して順方向で連結された形態で含む。転写因子
をコードするＤＮＡまたはその断片は、発現カセットと
して植物細胞に導入された後、プロモーターの制御下で
センス方向に転写され得る。この導入ＤＮＡの作用によ
り、所望とする遺伝子発現の抑制が可能となる。コサプ
レッションは、形質転換植物の一部の個体で認められ、
他の個体では十分に起こらない場合が多い。そのため、
通常、遺伝子発現が意図されたように抑制された個体
が、慣用的な手順に従って選択される。

【００３３】アンチセンスは、植物細胞に組み換え遺伝
子を導入したとき、導入遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）
が、内因性遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）の相補的な配
列とハイブリッドを形成して、内因性遺伝子がコードす
るタンパク質の翻訳が阻害されることをいう。アンチセ
ンスが利用される場合、本発明における発現カセット
は、転写因子をコードするＤＮＡまたはその断片を、プ
ロモーターに対して逆方向で連結された形態で含む。転
写因子をコードするＤＮＡまたはその断片は、発現カセ
ットとして植物細胞に導入された後、プロモーターの制
御下でアンチセンス方向に転写され得る。このアンチセ
ンス転写物の作用により、所望とする遺伝子発現の抑制
が可能となる。

【００３４】（ＺＰＴ３−２遺伝子由来のプロモータ
ー）本発明の第２の局面である、形質が改変された植物
を作出する方法において有用なプロモーターは、（ａ）
配列番号３によって示される塩基配列の第１位から第１
９９１位までの配列を有するＤＮＡ、または（ｂ）
（ａ）の一部の配列を有し、葯のタペート層に特異的な
プロモーター活性を示すＤＮＡのいずれかを含むプロモ
ーターである。本発明における上記プロモーターは、好
ましくは（ａ）のプロモーター、すなわち、ＺＰＴ３−
２遺伝子のプロモーターである。

【００３５】ＺＰＴ３−２遺伝子のプロモーター領域
の、組識特異的な発現活性に必須でない配列を除去して
得られる、タペート層に特異的なプロモーター活性を有
する配列は、本発明の範囲内にある。このような配列
は、常法に従ってプロモーターのデリーション実験を行
うことによって、得ることができる。簡潔には、ＺＰＴ
３−２遺伝子のプロモーター領域の様々な欠失変異体
（例えば、ＺＰＴ３−２遺伝子のプロモーター領域を、
５’上流側から種々の長さに欠失させた変異体）と、適
切なレポーター遺伝子（例えば、ＧＵＳ遺伝子）とを融
合したプラスミドを用いて、欠失変異体の組識特異的プ
ロモーター活性を測定することによって、その活性に必
須な領域を特定し得る。

【００３６】いったんプロモーター活性に必須の領域が
特定されると、さらにその領域内の配列または隣接配列
を改変して、プロモーターの発現活性の程度を高めるこ
とも可能である。このようにして得られる改変体もま
た、タペート層に特異的なプロモーター活性を示す限
り、本発明の範囲内にある。

【００３７】本発明において、「タペート層に特異的な
プロモーター活性を示す」とは、プロモーターが、天然
の植物中で、または任意の構造遺伝子に連結させた発現
カセットとして植物に導入されたときに、ＤＮＡの転写
を開始させることにより遺伝子の発現を指示する能力
を、タペート層において特異的に示すことを意味する。
ここで「特異的」とは、同じ植物体の花の、他のすべて
の組織（花粉、花糸、花柱、花頭、花弁、萼（がく）な
どを含む）よりも、プロモーターの発現活性が高いこと
をいう。上記特異的なプロモーターは、好ましくは、同
じ植物体の花の他のすべての組織および花以外の部分
（根、葉、茎など）よりも、プロモーターの発現活性が
高く、より好ましくは、同じ植物体の花の他のすべての
組織および花以外の部分において実質的に活性を示さな
い。発現活性の程度は、常法に従って、タペート層にお
けるプロモーターの発現レベルと、花の他の組識におけ
る同じプロモータの発現レベルとを比較することによっ
て、評価され得る。プロモーターの発現レベルは、通
常、そのプロモーターの制御下で発現される遺伝子産物
の産生量によって決定される。

【００３８】上記の特異的プロモーターを利用する植物
への雄性不稔性の付与は、本発明におけるプロモーター
に作動可能に連結された任意の異種遺伝子が、この遺伝
子を導入された形質転換植物において、プロモーターの
制御下でタペート層に特異的に発現される結果として生
じ得る。多くの組織特異的プロモーターにおいて、その
組織特異性が種間を越えて保存されていることは周知で
あるので、本発明のプロモーターもまた幅広い植物種に
適用し得ることが容易に理解される。

【００３９】本発明のプロモーターは、例えば、公知の
ｃＤＮＡをプローブとして用いて、植物のゲノミックラ
イブラリーをスクリーニングし、そして対応のゲノミッ
ククローンからコード領域の上流配列を単離することに
より得ることができる。ｃＤＮＡの例として、上述した
ペチュニア由来の転写因子であるＺＰＴ３−２のｃＤＮ
Ａが挙げられる。

【００４０】本発明におけるプロモーターは、天然から
単離されたものに限定されず、合成ポリヌクレオチドも
含み得る。合成ポリヌクレオチドは、例えば、上記のよ
うにして配列決定されたプロモーターの配列またはその
活性領域を、当業者に周知の手法によって合成または改
変することにより入手し得る。

【００４１】（発現カセットおよび発現ベクターの構
築）本発明における転写因子をコードするＤＮＡは、当
業者に周知の方法を用いて、適切なプロモーターに作動
可能に連結された発現カセットとして、公知の遺伝子組
換え技術を用いて、植物細胞に導入され得る。同様に、
本発明におけるタペート層特異的プロモーターは、所望
の異種遺伝子に作動可能に連結された発現カセットとし
て、植物細胞に導入され得る。

【００４２】上記転写因子に連結され得る「プロモータ
ー」は、植物で発現する任意のプロモーターを意味し、
構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、および
誘導性プロモーターのいずれをも含み得る。

【００４３】「構成的プロモーター」は、植物細胞内外
の刺激と関係なく一定のレベルで構造遺伝子を発現せし
めるプロモーターをいう。異種遺伝子が植物の他の組織
または器官で発現しても、植物に望ましくない形質を与
えない場合には、構成的プロモーターの使用が簡便であ
り、好ましい。構成的プロモーターの例としては、カリ
フラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモ
ーター（Ｐ３５Ｓ）、およびノパリン合成酵素のプロモ
ーター（Ｔｎｏｓ）が挙げられるが、これらに限定され
ない。

【００４４】「組織特異的プロモーター」は、本発明に
おいては、少なくともタペート層を含む葯の組織におい
て特異的に構造遺伝子を発現せしめるプロモーターをい
う。このような組織特異的プロモーターには、本発明に
おけるＺＰＴ３−２遺伝子由来のプロモーターに加え
て、葯特異的に発現活性を示す他の公知のプロモーター
が含まれる。したがって、タペート層特異的プロモータ
ーと転写因子をコードする配列とを含む、天然のＺＰＴ
３−２遺伝子の発現カセット自体を、必要に応じて他の
調節エレメントと組み合わせて、使用することも本発明
の範囲に含まれる。

【００４５】「誘導性プロモーター」は、化学薬剤、物
理的ストレスなどの特定の刺激を与えたときに構造遺伝
子を発現せしめ、刺激の非存在下では発現活性を示さな
いプロモーターをいう。誘導性プロモーターの例として
は、オーキシンで誘導可能な、グルタチオンＳ−トラ
ンスフェラーゼ（ＧＳＴ）プロモーター（ｖａｎｄｅ
ｒＫｏｐ，Ｄ．Ａ．ら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，３９：９７９，１９９９）が挙げられるが、こ
れに限定されない。

【００４６】本明細書において、用語「発現カセット」
または「植物発現カセット」とは、本発明における転写
因子をコードするＤＮＡと、これに作動可能に（すなわ
ち、当該ＤＮＡの発現を制御し得るように）連結された
植物発現プロモーターとを含む核酸配列、ならびに、本
発明におけるタペート層特異的プロモーターと、これに
作動可能に（すなわち、インフレームに）連結された異
種遺伝子とを含む核酸配列をいう。

【００４７】上記のタペート層特異的プロモーターに連
結され得る「異種遺伝子」とは、ＺＰＴ３−２遺伝子以
外のペチュニアにおける内因性遺伝子、もしくはペチュ
ニア以外の植物における内因性遺伝子、または植物に対
して外来の遺伝子（例えば、動物、昆虫、細菌、および
真菌に由来する遺伝子）であって、その遺伝子産物の発
現がタペート層において所望される任意の遺伝子をい
う。本発明における異種遺伝子の好ましい例は、コード
する遺伝子産物が細胞毒性を示し、その発現によって花
粉の発達を阻害する遺伝子である。このような遺伝子の
具体例として、ｂａｒｎａｓｅ遺伝子（Ｂｅａｌｓ，
Ｔ．Ｐ．およびＧｏｌｄｂｅｒｇ，Ｒ．Ｂ．，Ｐｌａｎ
ｔＣｅｌｌ，９：１５２７，１９９７）が挙げられる
が、これに限定されない。

【００４８】「植物発現ベクター」は、発現カセットに
加えて、さらに種々の調節エレメントが、宿主植物の細
胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をい
う。好適には、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、およ
びエンハンサーを含み得る。植物発現ベクターのタイプ
および使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に
応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
本発明に用いる植物発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ
領域を有し得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、特にアグロバクテ
リウムを用いて植物を形質転換する場合に遺伝子の導入
の効率を高める。

【００４９】「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク
質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡ
に転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加
に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの
安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼす
ことが知られている。ターミネーターの例としては、ノ
パリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、
およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５
Ｓターミネーターが挙げられるが、これらに限定されな
い。

【００５０】「薬剤耐性遺伝子」は、形質転換植物の選
抜を容易にするものであることが望ましい。カナマイシ
ン耐性を付与するためのネオマイシンホスホトランスフ
ェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、およびハイグロマ
イシン耐性を付与するためのハイグロマイシンホスホト
ランスフェラーゼ遺伝子などが好適に用いられ得るが、
これらに限定されない。

【００５１】本発明における植物発現ベクターは、当業
者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。植
物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＢＩ系のベクタ
ーまたはｐＵＣ系のベクターが好適に用いられるが、こ
れらに限定されない。

【００５２】（形質転換植物の作出）上述のように構築
された発現カセット、またはこれを含む発現ベクター
は、公知の遺伝子組換え技術を用いて、所望の植物細胞
に導入され得る。導入された発現カセットは、植物細胞
中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、植物細胞中
のＤＮＡとは、染色体のみならず、植物細胞中に含まれ
る各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）
に含まれるＤＮＡをも含む。

【００５３】本明細書において、用語「植物」は、単子
葉植物および双子葉植物のいずれも含む。好ましい植物
は、双子葉植物である。双子葉植物は、離弁花亜綱およ
び合弁花亜綱のいずれも含む。好ましい亜綱は、合弁花
亜綱である。合弁花亜綱は、リンドウ目、ナス目、シソ
目、アワゴケ目、オオバコ目、キキョウ目、ゴマノハグ
サ目、アカネ目、マツムシソウ目、およびキク目のいず
れも含む。好ましい目は、ナス目である。ナス目は、ナ
ス科、ハゼリソウ科、ハナシノブ科、ネナシカズラ科、
およびヒルガオ科のいずれも含む。好ましい科は、ナス
科である。ナス科は、ペチュニア属、チョウセンアサガ
オ属、タバコ属、ナス属、トマト属、トウガラシ属、ホ
オズキ属、およびクコ属などを含む。好ましい属は、ペ
チュニア属、チョウセンアサガオ属、およびタバコ属で
あり、より好ましくは、ペチュニア属である。ペチュニ
ア属は、Ｐ．ｈｙｂｒｉｄａ種、Ｐ．ａｘｉｌｌａｒｉ
ｓ種、Ｐ．ｉｎｆｌａｔａ種、およびＰ．ｖｉｏｌａｃ
ｅａ種などを含む。好ましい種は、Ｐ．ｈｙｂｒｉｄａ
種である。「植物」は、特に他で示さない限り、花を有
する植物体および植物体から得られる種子を意味する。

【００５４】「植物細胞」の例としては、花、葉、およ
び根などの植物器官における各組織の細胞、カルスなら
びに懸濁培養細胞が挙げられる。

【００５５】植物細胞への植物発現ベクターの導入に
は、当業者に周知の方法、例えば、アグロバクテリウム
を介する方法、および直接細胞に導入する方法が用いら
れ得る。アグロバクテリウムを介する方法としては、例
えば、Ｎａｇｅｌらの方法（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７：３２５（１９９０））が用い
られ得る。この方法は、まず、植物発現ベクターで（例
えば、エレクトロポレーションによって）アグロバクテ
リウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバ
クテリウムをリーフディスク法などの周知の方法により
植物細胞に導入する方法である。植物発現ベクターを直
接細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーショ
ン法、パーティクルガン、リン酸カルシウム法、および
ポリエチレングリコール法などがある。これらの方法
は、当該分野において周知であり、形質転換する植物に
適した方法が、当業者により適宜選択され得る。

【００５６】植物発現ベクターを導入された細胞は、例
えば、カナマイシン耐性などの薬剤耐性を基準として選
択される。選択された細胞は、常法により植物体に再生
され得る。

【００５７】再生した植物体において、導入した植物発
現ベクターが機能的であることは、当業者に周知の手法
を用いて確認し得る。例えば、内因性遺伝子の発現の抑
制を目的とする場合、この確認は、ノーザンブロット解
析を用いた転写レベルの測定によって行い得る。このよ
うにして、内因性の転写因子の発現が抑制された所望と
する形質転換植物体を選択することができる。組織特異
的プロモーターを用いた異種遺伝子の発現を目的とする
場合も、異種遺伝子の発現の確認は、通常、対象組織か
ら抽出されたＲＮＡを試料とするノーザンブロット解析
を用いて行い得る。この解析法の手順は当業者に周知で
ある。

【００５８】本発明の方法に従って内因性の転写因子の
発現が抑制され、花粉の稔性が低下したことは、例え
ば、転写因子をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで
形質転換して得られた植物の花粉の形態を、必要に応じ
て組識化学的染色を行ったうえ、顕微鏡観察することで
確認できる。

【００５９】また、本発明の方法に従ってプロモーター
がタペート層に特異的に発現されたことは、例えば、プ
ロモータとＧＵＳ遺伝子とが作動可能に連結された発現
ベクターで形質転換して得られた植物における、葯を含
む花の組織でのＧＵＳ活性の分布を、常法により組識化
学的染色を行うことで確認できる。

【００６０】

【実施例】以下に、実施例に基づいて本発明を説明す
る。本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものでは
ない。実施例で使用される制限酵素、プラスミドなど
は、商業的な供給源から入手可能である。

【００６１】（実施例１：ＺＰＴ３−２をコードするポ
リヌクレオチドを含む植物発現ベクターの構築）以前に
報告した葯特異的ＺＦ遺伝子（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、
前出）のうち、ＰＥＴｈｙＺＰＴ３−２（ＺＰＴ３−
２）のｃＤＮＡを、カリフラワーモザイクウイルスの３
５Ｓプロモーターの下流につないで、植物発現ベクター
を作成した。

【００６２】具体的には、プラスミドｐＢＩ２２１（Ｃ
ＬＯＮＴＥＣＨＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．
から購入）中のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプ
ロモーターを含むＤＮＡ断片（ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｂａ
Ｉ断片）およびＮＯＳターミネーターを含むＤＮＡ断片
（ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩ断片）を順次プラスミドｐＵＣ
ＡＰ（ｖａｎＥｎｇｅｌｅｎ，Ｆ．Ａ．ら、Ｔｒａｎ
ｓｇｅｎｉｃＲｅｓ．，４：２８８，１９９５）のマ
ルチクローニングサイトに挿入し、ｐＵＣＡＰ３５Ｓを
作製した。一方、ＺＰＴ３−２のｃＤＮＡを含むｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔベクターをＫｐｎＩサイトおよびＳ
ａｃＩサイト（いずれもベクター中のサイト）で切断
し、上記ｐＵＣＡＰ３５ＳのＫｐｎＩおよびＳａｃＩサ
イトの間に挿入した。さらにこの組み換えプラスミドを
ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＺＰＴ３−
２をコードするＤＮＡ断片をバイナリーベクターｐＢＩ
ＮＰＬＵＳ（ｖａｎＥｎｇｅｌｅｎ，Ｆ．Ａ．ら、前
出）のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトに導入し
た。構築されたＺＰＴ３−２遺伝子は、図２から明らか
なように、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）
の３５Ｓプロモーター領域（Ｐ３５Ｓ；０．９ｋｂ）、
本発明におけるＺＰＴ３−２をコードするポリヌクレオ
チド（ＺＰＴ３−２；約１．９ｋｂ）、およびノパリン
合成酵素のターミネーター領域（Ｔｎｏｓ；０．３ｋ
ｂ）から構成されている。図２中のＰｎｏｓは、ノパリ
ン合成酵素のプロモーター領域、ＮＰＴＩＩは、ネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子を示す。

【００６３】（実施例２：ＺＰＴ３−２プロモーター領
域の単離およびＧＵＳレポーター遺伝子との連結）ＺＰ
Ｔ３−２のｃＤＮＡをプローブにして、ペチュニアのゲ
ノムＤＮＡライブラリーから、対応するゲノミック・ク
ローンを単離し、転写開始点上流のＤＮＡ断片（プロモ
ーター領域；約２．０ｋｂ）をサブクローニングした。
このＤＮＡ断片をＧＵＳレポーター遺伝子の上流につな
いでバイナリー・ベクターにクローニングした。

【００６４】具体的には、ＺＰＴ３−２のｃＤＮＡを、
通常のランダムプライム法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前
出）を用いて［α３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識して放射性標
識プローブを作製し、これを用いてＥＭＢＬ３ベクター
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）中に作製したペチュニア
（Ｐｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａｖａｒ．Ｍｉｔ
ｃｈｅｌｌ）のゲノミックライブラリーをスクリーニン
グした。得られたクローンから遺伝子上流領域を含む約
２．０ｋｂのゲノムＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＳＫベクターのＥｃｏＲＩサイトにサブクローニング
し（ｐＢＳ−ＺＰＴ３−２−Ｅ）、塩基配列を決定した
（図３）。次に、ＺＰＴ３−２遺伝子上流配列中のＢｇ
ｌＩＩサイト（塩基番号２００６）にＳａｌＩ認識配列
を含むリンカーＤＮＡを挿入し、ＳａｌＩサイトを導入
した（塩基番号２０１６）。そして、ＥｃｏＲＩおよび
ＳａｌＩで切断して得られたＤＮＡ断片をｐＵＣＡＰＧ
ＵＳＮＴのＧＵＳコード領域の上流に挿入した（ｐＵＣ
ＡＰ−ＺＰＴ３−２−ＧＵＳＮＴ）。これによってＺＰ
Ｔ３−２遺伝子コード領域のＮ末端近傍の領域でｉｎｆ
ｒａｍｅでＧＵＳコード領域と接続された。さらにｐＵ
ＣＡＰ−ＺＰＴ３−２−ＧＵＳＮＴをＥｃｏＲＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩで切断して得られるＤＮＡ断片（ＺＰＴ
３−２プロモーター、ＧＵＳコード領域およびＮＯＳタ
ーミネーターを含む）をｐＢＩＮＰＬＵＳベクターに挿
入し、ｐＢＩＮ−ＺＰＴ３−２−ＧＵＳを得た（図
４）。

【００６５】（実施例３：各融合遺伝子のペチュニア細
胞への導入）上記の各発現ベクターを、以下の手順で、
アグロバクテリウムを介して、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎ
ｉａｈｙｂｒｉｄａｖａｒ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）
に導入した。

【００６６】（１）アグロバクテリウム・チュメファシ
エンスＬＢＡ４４０４株（ＣＬＯＮＴＥＣＨＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ．から購入）を２５０ｍｇ／
ｍｌのストレプトマイシンと５０ｍｇ／ｍｌのリファン
ピシンを含むＬ培地中、２８℃で培養した。Ｎａｇｅｌ
ら（前出）の方法に従って、細胞懸濁液を調製し、実施
例１および２で構築したプラスミドベクターをエレクト
ロポレーションにより、上記菌株に導入した。

【００６７】（２）各融合遺伝子をコードするポリヌク
レオチドを、以下の方法によって、ペチュニア細胞へ導
入した：上記（１）で得られたアグロバクテリウム・チ
ュメファシエンスＬＢＡ４４０４株をＹＥＢ培地（ＤＮ
ＡＣｌｏｎｉｎｇ第２巻、７８頁、Ｇｌｏｖｅｒ
Ｄ．Ｍ．編、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、１９８５）で振とう
培養（２８℃、２００ｒｐｍ）した。得られた培養液
を、滅菌水で２０倍に希釈し、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎ
ｉａｈｙｂｒｉｄａｖａｒ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）
の葉片と共存培養した。２〜３日後、抗生物質を含む培
地で上記細菌を除去し、２週間ごとに選択培地で継代
し、上記２種類の融合遺伝子と共に導入された、ｐＢＩ
ＮＰＬＵＳ由来のＮＰＴＩＩ遺伝子の発現によるカナマ
イシン抵抗性の有無に基づいて、形質転換されたペチュ
ニア細胞を選抜した。選抜した細胞を、常法によりカル
スを誘導した後、植物体に再分化した（Ｊｏｒｇｅｎｓ
ｅｎＲ．Ａ．ら，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
３１：９５７，１９９６）。

【００６８】（実施例４：ＺＰＴ３−２遺伝子を導入し
た形質転換ペチュニアの表現型）実施例１のベクターを
導入して得られた形質転換体を用い、ＺＰＴ３−２の発
現量の測定と花粉の形態の観察とを行うことによって、
ＺＰＴ３−２のｃＤＮＡ導入による植物への作用と効果
とを検討した。

【００６９】具体的には、ＺＰＴ３−２のｃＤＮＡを３
５Ｓプロモーターの制御下に導入した形質転換体（１５
個体）から、ノーザンブロット解析によって、コサプレ
ッションによる遺伝子発現の抑制が起こった個体（４個
体）を選抜した。ノーザンブロット解析の条件は、次の
通り：７％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、
２％ブロッキング試薬（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎ
ｎｈｅｉｍ製）、５０ｍＭリン酸ナトリウム・バッファ
ー（ｐＨ７．０）、０．１％ラウリルサルコシン・ナト
リウム、５０μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、および³²Ｐ標識
プローブＤＮＡ（１ｘ１０⁷ｃｐｍ）を含む溶液中で、
６８℃で１６時間ハイブリダイズさせた後、２ｘＳＳＣ
／０．１％ＳＤＳで６８℃、３０分間の洗浄。

【００７０】上記のコサプレッション形質転換体４個体
において、約９０％の花粉細胞が、成熟する前に死滅す
ることが観察された。常法によるフラボノール染色の結
果、これらの形質転換体において破裂した細胞には、花
粉細胞表面のエキシン層に含まれるはずのフラボノール
がほとんど検出されなった（図５；形質転換植物の花粉
を示す写真において、青白く見える不規則な形状の粒子
が、破裂した細胞である）。

【００７１】上記観察結果から、遺伝子発現の抑制が起
こった形質転換体の花粉細胞では、エキシン層の蓄積の
異常による細胞壁の発達不全のため、浸透圧に耐えられ
ない細胞が破裂したものと推測される。四分子期までの
花粉細胞の発達には正常植物との間に違いが認められな
い。花粉に異常が表れる時期は、エキシン層が蓄積する
時期およびＺＰＴ３−２遺伝子が本来発現する時期とよ
く符合しており、上記の作用機作を支持している。遺伝
子発現の抑制が起こった形質転換体において、花粉以外
の形質には変化が認められなかった。なお、ＺＰＴ３−
２遺伝子を過剰に発現する個体では、花粉および他の形
質のいずれについても変化は認められなかった。

【００７２】以上のように、ＺＰＴ３−２をコードする
遺伝子の導入によって、高い効率で花粉の発達を阻害
し、稔性を喪失させることができる。この効率は、遺伝
子導入の際に用いるプロモーターを最適化することで、
さらに高めることが可能である。例えば、実施例１のベ
クターに用いた単一のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに代
えて、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを２個直列につない
で活性を高めたもの（いわゆる、Ｅ２プロモーター）な
どが利用可能である。また、ＺＰＴ３−２遺伝子の導入
は、その効果が花粉に特異的であり、植物の他の形質に
は影響を与えない点で、選択的な形質改変技術として有
用であり得る。

【００７３】（実施例５：ＺＰＴ３−２プロモーター活
性の組織特異性）実施例２のベクターを導入して得られ
た形質転換体を用い、ＧＵＳ活性による組織化学的染色
を行うことによって、上記ＤＮＡ断片が有する組織特異
的プロモーター活性を検出した。

【００７４】具体的には、ＺＰＴ３−２遺伝子の上流領
域とＧＵＳとの融合遺伝子を導入して得られた形質転換
体の花を用い、Ｘ−ＧＵＳを基質にしてＧＵＳ活性の分
布を調べた（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ，Ｓ．Ｒ．編、ＧＵＳ
ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ｕｓｉｎｇｔｈｅＧＵＳ
ｇｅｎｅａｓａｒｅｐｏｒｔｅｒｏｆｇｅｎ
ｅｅｘｐｒｅｓｓｉｎ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．１０３−１１４，１９９２）。そ
の結果、ＧＵＳ活性は葯のタペート層に特異的に検出さ
れた（図６）。発現の時期は一過的で、活性のピーク
は、花粉細胞における減数分裂直後の四分子期にほぼ相
当した。従って、ＺＰＴ３−２遺伝子のプロモーター
は、葯のタペート層に特異的な活性を示すことがわかっ
た。

【００７５】以上のように、ＺＰＴ３−２遺伝子のプロ
モーターは、四分子期前後のタペート層に特異的な活性
を示す。タペート層は、上述のように、花粉の発達に必
須の役割を果たす組織である。従って、このプロモータ
ーは、花粉の発達に関連する詳細な研究のためのツール
として有用である。さらに、このプロモーターまたはそ
の活性断片を用いて、細胞毒性のある遺伝子などを特異
的に発現させ、タペート層の組織を破壊しまたは機能を
失わせることによって、花粉の発達を阻害し得る。

【００７６】

【発明の効果】ＺＰＴ３−２遺伝子由来の転写因子をコ
ードするＤＮＡ、およびＺＰＴ３−２遺伝子由来のプロ
モーターを利用する本件発明の方法は、遺伝子工学的に
植物の形質を選択的に改変する技術、特に、雄性不稔形
質を付与する技術として有用である。

【００７７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> DIRECTOR GENERAL OF NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL RESOURCS, MINISTRY OF AGROCULTURE, FORESTRY AND FISHERIES <120> METHOD OF DECREASING POLLEN FERTILITY BY USE OF GENE OF TRANSCRIPTION FACTOR SPECIFIC TO TAPETUM <130> J199412449 <140> <141> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1886 <212> DNA <213> Petunia hybrida <220> <221> CDS <222> (283)..(1617) <400> 1 cccacgcgtc cgcatgtgca gagataaata taaaccaaca tgacctacca ttaagatgag 60 acgatgatca tctaaaattt tggagctcag atgattttat tcgacaaatt tcctattttc 120 tcgctatggg tttccttttc agctaagcta cctccctcct tcttcttgat ttgattttct 180 tgggtttctt gtttcttctt gttttagggt ttttgataca catatatagt tgcttagtta 240 cgtagctaag taaggtgggt tatttcattt cttgaacttt ca atg gtt gat tat 294 Met Val Asp Tyr 1 caa gat ctt caa gtt ggg atg agc gga aca ctg tgg ata caa ctc aag 342 Gln Asp Leu Gln Val Gly Met Ser Gly Thr Leu Trp Ile Gln Leu Lys 5 10 15 20 att gaa gac aaa caa gtt caa gaa ttg gat cat agt caa gat att atg 390 Ile Glu Asp Lys Gln Val Gln Glu Leu Asp His Ser Gln Asp Ile Met 25 30 35 gac tat gag gtt cca aaa aat aat gat cat act agg att tgt gag gtg 438 Asp Tyr Glu Val Pro Lys Asn Asn Asp His Thr Arg Ile Cys Glu Val 40 45 50 tgt aac aaa ggg ttt agc tca ggt aaa gca ctt ggg ggt cac atg aga 486 Cys Asn Lys Gly Phe Ser Ser Gly Lys Ala Leu Gly Gly His Met Arg 55 60 65 att cac gtt cag gct gcc aaa aag ctc tta tct gtt ggt aaa aag tgc 534 Ile His Val Gln Ala Ala Lys Lys Leu Leu Ser Val Gly Lys Lys Cys 70 75 80 aaa aag ctg aac cca ttc ggt tcc agg tat tac aag aaa cga ata tta 582 Lys Lys Leu Asn Pro Phe Gly Ser Arg Tyr Tyr Lys Lys Arg Ile Leu 85 90 95 100 tta caa caa gat gat cat caa gat aat tac aac aat gac atc aag aat 630 Leu Gln Gln Asp Asp His Gln Asp Asn Tyr Asn Asn Asp Ile Lys Asn 105 110 115 cag ttg gca cca att tgt tca gtt tgt ggt aag aat ttt cca tca atg 678 Gln Leu Ala Pro Ile Cys Ser Val Cys Gly Lys Asn Phe Pro Ser Met 120 125 130 aaa tca ttg ttt ggg cat atg aga tct cat cct gaa agg gcc tgg aga 726 Lys Ser Leu Phe Gly His Met Arg Ser His Pro Glu Arg Ala Trp Arg 135 140 145 gga att caa cct cca gct cct aat aaa aac agt tgt ttg tca tca gct 774 Gly Ile Gln Pro Pro Ala Pro Asn Lys Asn Ser Cys Leu Ser Ser Ala 150 155 160 tcc aat gaa att gct gct act act aag tcg ggg gat tta tcg gtg cct 822 Ser Asn Glu Ile Ala Ala Thr Thr Lys Ser Gly Asp Leu Ser Val Pro 165 170 175 180 ggt tgg tct gtt aag gct aag cga ggc cga aag ggt act att gct gaa 870 Gly Trp Ser Val Lys Ala Lys Arg Gly Arg Lys Gly Thr Ile Ala Glu 185 190 195 gca tca tct aac tcg agt ctt ggt tct aga agt ttc tct ttt gat caa 918 Ala Ser Ser Asn Ser Ser Leu Gly Ser Arg Ser Phe Ser Phe Asp Gln 200 205 210 gaa aag gat gac gag gag cac gaa tta cac gat gct gtt ggt cat ctt 966 Glu Lys Asp Asp Glu Glu His Glu Leu His Asp Ala Val Gly His Leu 215 220 225 atg ttg tta gcc aat gga aat aag act agt gca gat caa gaa ttg gaa 1014 Met Leu Leu Ala Asn Gly Asn Lys Thr Ser Ala Asp Gln Glu Leu Glu 230 235 240 ata acc aac agt aat tcg ctt act tcc aaa gct gaa act gaa caa gtc 1062 Ile Thr Asn Ser Asn Ser Leu Thr Ser Lys Ala Glu Thr Glu Gln Val 245 250 255 260 gat gag aac aag aag aaa aag aag aag ata aag tta agg cgt ttg ggt 1110 Asp Glu Asn Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Leu Arg Arg Leu Gly 265 270 275 tct gta caa gac ctt gtt agt cca gtt tca gtt cat cat gac caa aaa 1158 Ser Val Gln Asp Leu Val Ser Pro Val Ser Val His His Asp Gln Lys 280 285 290 cta gtc atg gat acg cct gaa aaa tac aaa tgt aac act tgt gaa aag 1206 Leu Val Met Asp Thr Pro Glu Lys Tyr Lys Cys Asn Thr Cys Glu Lys 295 300 305 agc ttt gca act cat caa gca ctg gga gga cat agg tca agc cac aac 1254 Ser Phe Ala Thr His Gln Ala Leu Gly Gly His Arg Ser Ser His Asn 310 315 320 aag ttt aga atg gtc att caa aat tca gtt gaa gat gat gta gtt act 1302 Lys Phe Arg Met Val Ile Gln Asn Ser Val Glu Asp Asp Val Val Thr 325 330 335 340 aat gta gca act agt agc ata att ggc cca gtg gaa gaa cgt gaa gaa 1350 Asn Val Ala Thr Ser Ser Ile Ile Gly Pro Val Glu Glu Arg Glu Glu 345 350 355 gca gct gct agc acc tca aaa ttg ttg gtg gac cat aac aag aat gcc 1398 Ala Ala Ala Ser Thr Ser Lys Leu Leu Val Asp His Asn Lys Asn Ala 360 365 370 tca gca agt cag gta ctt ggg gtt cag aat agg tgc caa tgg gga agt 1446 Ser Ala Ser Gln Val Leu Gly Val Gln Asn Arg Cys Gln Trp Gly Ser 375 380 385 cca att gat cat caa gct ggt cca tca aca agt caa ttg act tca cca 1494 Pro Ile Asp His Gln Ala Gly Pro Ser Thr Ser Gln Leu Thr Ser Pro 390 395 400 ggt gaa gtt agc cat tca att ggt cga caa att ctg gat ttt gat ctc 1542 Gly Glu Val Ser His Ser Ile Gly Arg Gln Ile Leu Asp Phe Asp Leu 405 410 415 420 aat gaa tta ccc cct caa gaa gat gaa att gct ggt ggc cgt gat cat 1590 Asn Glu Leu Pro Pro Gln Glu Asp Glu Ile Ala Gly Gly Arg Asp His 425 430 435 cag tat ttt aca ttt ttt cca att taa ctactcctag gtagtgtttg 1637 Gln Tyr Phe Thr Phe Phe Pro Ile 440 445 tttagtctac agcttttaac tcttagctgg ttaggaatta acagctacta cttcatcatc 1697 agtgagaaag gccagtcatg taagttttgg catgttaatg atccatttac tagtagtgca 1757 aattgtggat aatagcgaac catcttggtt atttccattt ttttgctagt tttccataac 1817 aatgtggcat tttgaagaaa gggctgttga actttttttt cttatatctt catggaaagt 1877 acgatgttt 1886 <210> 2 <211> 444 <212> PRT <213> Petunia hybrida <400> 2 Met Val Asp Tyr Gln Asp Leu Gln Val Gly Met Ser Gly Thr Leu Trp 1 5 10 15 Ile Gln Leu Lys Ile Glu Asp Lys Gln Val Gln Glu Leu Asp His Ser 20 25 30 Gln Asp Ile Met Asp Tyr Glu Val Pro Lys Asn Asn Asp His Thr Arg 35 40 45 Ile Cys Glu Val Cys Asn Lys Gly Phe Ser Ser Gly Lys Ala Leu Gly 50 55 60 Gly His Met Arg Ile His Val Gln Ala Ala Lys Lys Leu Leu Ser Val 65 70 75 80 Gly Lys Lys Cys Lys Lys Leu Asn Pro Phe Gly Ser Arg Tyr Tyr Lys 85 90 95 Lys Arg Ile Leu Leu Gln Gln Asp Asp His Gln Asp Asn Tyr Asn Asn 100 105 110 Asp Ile Lys Asn Gln Leu Ala Pro Ile Cys Ser Val Cys Gly Lys Asn 115 120 125 Phe Pro Ser Met Lys Ser Leu Phe Gly His Met Arg Ser His Pro Glu 130 135 140 Arg Ala Trp Arg Gly Ile Gln Pro Pro Ala Pro Asn Lys Asn Ser Cys 145 150 155 160 Leu Ser Ser Ala Ser Asn Glu Ile Ala Ala Thr Thr Lys Ser Gly Asp 165 170 175 Leu Ser Val Pro Gly Trp Ser Val Lys Ala Lys Arg Gly Arg Lys Gly 180 185 190 Thr Ile Ala Glu Ala Ser Ser Asn Ser Ser Leu Gly Ser Arg Ser Phe 195 200 205 Ser Phe Asp Gln Glu Lys Asp Asp Glu Glu His Glu Leu His Asp Ala 210 215 220 Val Gly His Leu Met Leu Leu Ala Asn Gly Asn Lys Thr Ser Ala Asp 225 230 235 240 Gln Glu Leu Glu Ile Thr Asn Ser Asn Ser Leu Thr Ser Lys Ala Glu 245 250 255 Thr Glu Gln Val Asp Glu Asn Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Leu 260 265 270 Arg Arg Leu Gly Ser Val Gln Asp Leu Val Ser Pro Val Ser Val His 275 280 285 His Asp Gln Lys Leu Val Met Asp Thr Pro Glu Lys Tyr Lys Cys Asn 290 295 300 Thr Cys Glu Lys Ser Phe Ala Thr His Gln Ala Leu Gly Gly His Arg 305 310 315 320 Ser Ser His Asn Lys Phe Arg Met Val Ile Gln Asn Ser Val Glu Asp 325 330 335 Asp Val Val Thr Asn Val Ala Thr Ser Ser Ile Ile Gly Pro Val Glu 340 345 350 Glu Arg Glu Glu Ala Ala Ala Ser Thr Ser Lys Leu Leu Val Asp His 355 360 365 Asn Lys Asn Ala Ser Ala Ser Gln Val Leu Gly Val Gln Asn Arg Cys 370 375 380 Gln Trp Gly Ser Pro Ile Asp His Gln Ala Gly Pro Ser Thr Ser Gln 385 390 395 400 Leu Thr Ser Pro Gly Glu Val Ser His Ser Ile Gly Arg Gln Ile Leu 405 410 415 Asp Phe Asp Leu Asn Glu Leu Pro Pro Gln Glu Asp Glu Ile Ala Gly 420 425 430 Gly Arg Asp His Gln Tyr Phe Thr Phe Phe Pro Ile 435 440 <210> 3 <211> 2200 <212> DNA <213> Petunia hybrida <220> <221> promoter <222> (1)..(1991) <400> 3 gaattcaggg agtagaacgc ttgacaatat acctgttgct ccaaacttat aaattggggc 60 gacgatgaat gaagttaatc gatatgatta aattccatca cacagttatt gtttcaattc 120 ttgttaccta attttagtta cacttgcttc acttcttttt agtggcgctt tacaaaaata 180 atctagtcct cacattgaaa aaataatgcg atattagttt gacaataatt cagaagtact 240 tttgaatata tgcaaaaata attatttcta ctgttaagga aaagctgcaa atttctgttt 300 tttttttttt cagaagcaga agaaatttat taaattttca agataaaata atttttttaa 360 aagactatat caatttattt caactgttat atatctcaaa tataaataaa actctattct 420 tcttgtccat ctttatattt aaatttattc ctaccgatta aagaccttaa taatattttt 480 atactacatt ttaaatttta atcaaatgaa taaataatta aatagattaa ataaaaattt 540 tcttgatttt tttaaaaatc tttcacattt aaacaataat atcagccaca aatacaactt 600 tagtgctgtt tttttgcact atttttaaaa taagcagtct tttgcagcta gacagacaag 660 ttcatccaag tcaaatgcat cttaggtaaa ccaatgggcg tgaataattt tttttttcgc 720 gtaactttat atttctaaaa tcacttttcg tagtaaaatt ccaaaggata gaaggaaagt 780 ttgacgttat agcaaaatta tatgaaaaga tgatttctat ccttttataa gtgagtgaaa 840 tcaaagttca tatcatggtt gagaagattt ttattaatgg taaaacaaat taagggcttt 900 attgaaatat aagatggata ttatagcatt gatgtgggaa ttttggccgg tgtaaatgtg 960 gcatgaatat gatcggatcg gataaaattg ggcagaaaca cggcaagcta agattaaaaa 1020 acgcgcaang caaacacntc ancagtcaat gcaccactca agtagggtaa ttaatgacaa 1080 attttacatt caaactaaat taaatgcaca cggttaaaat ctctgttaaa agttttggta 1140 actttcagac tccttgaaca aactttccat ttggctaaag gtttgaacca aatgaatggg 1200 aatacctatg agatatacac cactggaaag tccaagataa tttgaaatta caagagtttc 1260 catttgatta ggctacttgt aatcttttga tttaattggt agtcaaattt taaaagatca 1320 gaatgatctt ccatttcaca ccatcactta tcccatatct ttatttacaa ttcaaaatac 1380 attaatatgt aaaacaaatt aaataactaa taatttcagt aaaactgttg gataattaaa 1440 ggcgaaaaga agattcttat ctcaaaagaa aaaattatat ctaaaataaa ttgggcgaaa 1500 ataaaatgtc aaaaataaaa cttacagagt aaacttagta tatttagtaa gtagtaggag 1560 taatatatac tccgtatctt tttttggcta accaattagc agtttcagaa tgactcttcc 1620 aaatccttag cttccgcact tggtcttctt tatatctcac aatatattgt ctttaagctc 1680 atttttttca taacatcaaa tctttcttca tatttgagtt gcatgtgcag agataaatat 1740 aaaccaacat gacctaccat taagatgaga cgatgatcat ctaaaatttt ggagctcaga 1800 tgattttatt cgacaaattt cctattttct cgctatgggt ttccttttca gctaagctac 1860 ctccctcctt cttcttgatt tgattttctt gggtttcttg tttcttcttg ttttagggtt 1920 tttgatacac atatatagtt gcttagttac gtagctaagt aaggtgggtt atttcatttc 1980 ttgaactttc aatggttgat tatcaagatc ttcaagttgg gatgagcgga acactgtgga 2040 tacaactcaa gattgaagac aaacaagttc aagaattgga tcatagtcaa gatattatgg 2100 actatgaggt tccaaaaaat aatgatcata ctaggatttg tgaggtgtgt aacaaagggt 2160 ttagctcagg taaagcactt gggggtcaca tgagaattca 2200 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> modified_base <222> (6) <223> i <220> <221> modified_base <222> (9) <223> i <220> <221> modified_base <222> (12) <223> i <220> <221> modified_base <222> (15) <223> i <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 cargcnytng gnggncay 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> modified_base <222> (6) <223> i <220> <221> modified_base <222> (9) <223> i <220> <221> modified_base <222> (12) <223> i <220> <221> modified_base <222> (15) <223> i <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 gtycgnranc cnccngtr 18

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ＺＰＴ３−２をコードする遺伝子（本明細
書中、単に「ＺＰＴ３−２遺伝子」ともいう）のｃＤＮ
Ａ配列、および対応するアミノ酸配列を示す図である。
３つのジンクフィンガーモチーフ、およびＤＬＮＬ配列
（アミノ酸４１１位〜４２５位）を下線で示す。

【図１Ｂ】図１Ａの続きである。

【図１Ｃ】図１Ｂの続きである。

【図１Ｄ】図１Ｃの続きである。

【図２】ＺＰＴ３−２ｃＤＮＡ配列を発現するため
の植物発現ベクター（ｐＢＩＮ−３５Ｓ−ＺＰＴ３−
２）の構成を示す概略図である。

【図３】ＺＰＴ３−２遺伝子のコード領域の上流配列
を示す図である。転写開始点（１７２１位）を太矢印
で、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を下線太字で示す。

【図４】ＺＰＴ３−２遺伝子のプロモーターを解析す
るための植物発現ベクター（ｐＢＩＮ−ＺＰＴ３−２−
ＧＵＳ）の構成を示す概略図である。

【図５】野生型のペチュニアの花粉と、ｐＢＩＮ−３
５Ｓ−ＺＰＴ３−２を導入したペチュニアの花粉とを撮
影した、生物の形態を示す写真である（倍率は２４０
倍）。花粉はいずれもフラボノール染色した。図５
（ａ）〜（ｄ）は、野生型ペチュニアのつぼみの異なる
成長段階における花粉を、図５（ｅ）〜（ｈ）は、形質
転換ペチュニアのつぼみの異なる成長段階における花粉
を、それぞれを示す。図５（ａ）および（ｅ）は、つぼ
みのサイズ５ｍｍでの花粉、図５（ｂ）および（ｆ）
は、つぼみのサイズ３５ｍｍでの花粉、図５（ｃ）およ
び（ｇ）は、つぼみのサイズ５０ｍｍでの花粉、そして
図５（ｄ）および（ｈ）は、成熟期の花粉である。

【図６】ｐＢＩＮ−ＺＰＴ３−２−ＧＵＳを導入した
ペチュニアのＧＵＳ染色した花の器官を撮影した、生物
の形態を示す写真である。葯が四分子期にある花（つぼ
み）を、撮影対象とした。図６（ａ）は、倍率２．５倍
での、つぼみの外観を、図６（ｂ）は、葯の低倍率（６
０倍）での断面図を、図６（ｃ）は、葯のタペート層周
辺の高倍率（２８０倍）での断面図を、それぞれ示す。

フロントページの続き (72)発明者小林晃北海道河西郡芽室町東２条南５丁目１番地農業試験場宿舎Ｄ棟204号 (72)発明者高辻博志茨城県つくば市観音台２−１−２農林水産省農業生物資源研究所内Ｆターム(参考） 2B030 AD20 CA14 CA17 CA19 4B024 AA08 CA04 DA01 EA04 FA01 FA02 FA07 GA11 GA14 GA17 4B065 AA88X AA88Y AA89X AA95Y AB01 AC20 BA01 BA03 BA25 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】雄性不稔性の植物を作出する方法であっ
て：（ｉ）配列番号１によって示される塩基配列の第１位か
ら第１８８６位までの配列を有するＤＮＡ、（ｉｉ）
（ｉ）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写
因子をコードするＤＮＡ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もし
くは（ｉｉ）の断片であるＤＮＡのいずれかである核酸
と、該核酸に作動可能に連結されたプロモーターとを含
む、植物発現カセットを提供する工程、花粉の発達を制御する内因性の転写因子を有する植物の
細胞を提供する工程であって、ここで、該内因性の転写
因子をコードする遺伝子は、該核酸とストリンジェント
な条件下でハイブリダイズする、工程、該発現カセットを該植物細胞に導入する工程、該発現カセットが導入された植物細胞を植物体に再生す
る工程、および該再生された植物体であって、該核酸が
発現されることによって、該内因性の転写因子の発現が
抑制された植物体を選択する工程を包含する、方法。
【請求項２】前記核酸が前記プロモーターに対して順
方向で連結され、前記植物体の細胞内でセンス方向に転
写され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記核酸が前記プロモーターに対して逆
方向で連結され、前記植物体の細胞内でアンチセンス方
向に転写され得る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記植物が双子葉植物である、請求項１
に記載の方法。
【請求項５】前記植物がナス科植物である、請求項４
に記載の方法。
【請求項６】前記植物がペチュニア属植物である、請
求項５に記載の方法。
【請求項７】前記発現カセットが植物発現ベクターに
組み込まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項８】請求項１から７のいずれかに記載の方法
により作出された、雄性不稔植物。
【請求項９】植物に雄性不稔性を付与する方法であっ
て：（ｉ）配列番号１によって示される塩基配列の第１位か
ら第１８８６位までの配列を有するＤＮＡ、（ｉｉ）
（ｉ）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな
条件下でハイブリダイズし、花粉の発達を制御する転写
因子をコードするＤＮＡ、または（ｉｉｉ）（ｉ）もし
くは（ｉｉ）の断片であるＤＮＡのいずれかである核酸
と、該核酸に作動可能に連結されたプロモーターとを含
む、植物発現カセットを提供する工程、花粉の発達を制御する内因性の転写因子を有する植物の
細胞を提供する工程であって、ここで、該内因性の転写
因子をコードする遺伝子は、該核酸とストリンジェント
な条件下でハイブリダイズする、工程、該発現カセットを該植物細胞に導入する工程、該発現カセットが導入された植物細胞を植物体に再生す
る工程、および該再生された植物体であって、該核酸が
発現されることによって、該内因性の転写因子の発現が
抑制された植物体を選択する工程を包含する、方法。
【請求項１０】雄性不稔性の植物を作出する方法であ
って：（ａ）配列番号３によって示される塩基配列の第１位か
ら第１９９１位までの配列を有するＤＮＡ、または
（ｂ）（ａ）の一部の配列を有し、葯のタペート層に特
異的なプロモーター活性を示すＤＮＡのいずれかを含む
プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結され
た異種遺伝子とを含む、植物発現カセットを提供する工
程、該発現カセットを植物細胞に導入する工程、および該発
現カセットが導入された植物細胞を植物体に再生する工
程を包含する、方法。
【請求項１１】前記植物が双子葉植物である、請求項
１０に記載の方法。
【請求項１２】前記植物がナス科植物である、請求項
１１に記載の方法。
【請求項１３】前記植物がペチュニア属植物である、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】前記発現カセットが植物発現ベクター
に組み込まれている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】請求項１０から１４のいずれかに記載
の方法により作出された、雄性不稔植物。
【請求項１６】植物に雄性不稔性を付与する方法であ
って：（ａ）配列番号３によって示される塩基配列の第１位か
ら第１９９１位までの配列を有するＤＮＡ、または
（ｂ）（ａ）の一部の配列を有し、葯のタペート層に特
異的なプロモーター活性を示すＤＮＡのいずれかを含む
プロモーターと、該プロモーターに作動可能に連結され
た異種遺伝子とを含む、植物発現カセットを提供する工
程、該発現カセットを植物細胞に導入する工程、および該発
現カセットが導入された植物細胞を植物体に再生する工
程を包含する、方法。
【請求項１７】以下の（Ｉ）または（ＩＩ）のＤＮＡ
を含むプロモーター：（Ｉ）配列番号３によって示され
る塩基配列の第１位から第１９９１位までの配列を有す
るＤＮＡ、または（ＩＩ）（Ｉ）の一部の配列を有し、
葯のタペート層に特異的なプロモーター活性を示す、Ｄ
ＮＡ。
【請求項１８】請求項１７に記載のプロモーターと、
該プロモーターに作動可能に連結された異種遺伝子とを
含む、植物に雄性不稔性を付与するために有用な植物発
現カセット。