CZ2000182A3 - Vyvolání samčí sterility u rostlin silnou expresí avidinu - Google Patents

Abstract

Rostliny vykazující samčí sterilitu se mohou produkovat zvýšením endogenní koncentrace avidinu v rostlinných tkáních. Tohoto účinkuje možné dosáhnout produkcí transgenních rostlin, které obsahují expresivní vektor, ve kterém promotorje operativně spojený se sekvencí DNA kódující avidin. Popisují se způsoby obnovení samčí fertility. Dále se popisují metody produkce semen s jednou nebo více požadovaných charakteristik zma.

Description

Vyvolání samčí sterility u rostlin silnou expresí avidinu

Oblast techniky

Vynález popisuje způsob řízení plodnosti rostlin za použití molekul DNA, které kódují avidin. Vynález zvláště popisuje způsoby produkce transgenních rostlin, které vykazují samčí sterilitu a exprimují avidin. Vynález popisuje způsoby obnovení samčí plodnosti u potomstva rostlin vykazujících samčí sterilitu. Vynález dále popisuje způsoby produkce hybridních semen, zvláště hybridních semen s jedním nebo více charakteristickými znaky za použití rostlin, které exprimují avidin.

Dosavadní stav techniky

Řízení pylové plodnosti je u produkce hybridních plodin podstatné. Popisuje se například v publikaci J. M. Poehlman, Breeding field crops, 3-rd ed. (Van Nostrand and Reinhold, New York, NY, 1987). Při produkci hybridní kukuřice řízení pylové fertility v typickém případě doprovází fyzické odstranění samčího květenství nebo odstranění tyčinek dříve než dojde k rozprášení pylu.. Mechanické odstraňování tyčinek je méně pracné ve srovnání s manuálním odstraňováním. Je méně spolehlivé a vyžaduje následné testování plodiny. Běžně se používá manuální odstranění. Oba způsoby způsobují ztrátu výtěžku samičího rodiče.

Nejzajímavější zemědělské plodiny mají však samičí i samčí orgány na jednom květu, proto emaskulace není jednoduchá. Zatímco je možné před rozptylem pylu odstranit ručně orgány, kde se tvoří pyl, tato forma hybridní produkce je velmi pracná a finančně náročná.

Pylovou plodnost je možné také řídit aplikací spreje, který má gametocidní vlastnosti. Popisuje se například v publikaci Cross et al., Ser. Plant Reprod. 7: 235 (1991).

Například aplikace spreje na prašníky vede k další pylové mitóze u pšenice, k degeneraci tapetálních buněk u ječmene a k malformaci nebo aborci pylu u Eragrostis. Popisuje se například v publikaci Bennet et al., Nátuře 240: 566 (1972), Colhoun et al., Plant Cell Environ. 6: 21 (1983); Berthe et al., Crop. Sci. 18: 35: (1978). Chemický přístup je však také velmi pracný a nese potenciální problémy s toxicitou použitých chemikálií, které se dostanou do okolního prostředí. Tento přístup je velmi citlivý na správné načasování aplikace.

Navíc komerční produkce hybridního semene použitím gametocidů je velmi omezena náklady a dostupností chemikálií, stejně jako vhodností a délkou působení aplikace. Použití gametocidů vážně omezuje jejich fytotoxické účinky. Síla těchto účinků závisí na genotypu rostliny. K dalšímu omezení vedou skutečnosti, že chemikálie nejsou účinné v případě plodin s dlouhým obdobím květenství, protože nově vzniklé květy nemusí být touto chemikálií ovlivněny. Proto je nutné aplikaci opakovat.

Řada současných běžně dostupných produkčních systémů hybridních semen vhodných pro produkci plodin na poli spoléhá na genetické způsoby řízení opylení. Rostliny, které se používají jako samičí rostliny, buď nejsou dostatečné v rozptylu pylu, produkují pyl, který není schopný biochemicky umožnit samooplodnění, nebo jsou nedostatečné :v produkci pylu. Rostliny, které nejsou schopny se samy oplodnit se nazývají „samo-inkompatibilní. Problémy spojené s použitím samoinkompatibilního systému zahrnují dostupnost a množení samoinkompatibilní samičí linie. V některých případech se samoinkompatibilita obchází chemickou cestou nebo nezralá papuly se opylí ručně dříve než se aktivuje biochemický mechanizmus, který blokuje pyl. Samo-inkompatibilní systémy, které se mohou deaktivovat, jsou často velmi náchylné ke stresujícím klimatickým podmínkám nebo snižují účinnost biochemického blokování samoopylení.

Širšímu zájmu z hlediska komerčně dostupné produkce semen se těší systémy založené na genetické kontrole pylu, které způsobují samčí sterilitu. Tyto systémy se dělí do dvou základních typů: (1) jaderná samčí sterilita, kde nedochází k tvorbě pylu vzhledem k mutaci v jednom nebo více jaderných genech nebo (2) cytoplazmatická genetická samčí sterilita, která se běžně nazývá „cytoplazmatická samčí sterilita (CMS), kde je blokována nebo přerušena tvorba pylu, protože dojde ke změnám v cytoplazmatické organele, kterou jsou obvykle mitochondrie.

Jaderná sterilita může být buď dominantní nebo recesivní.

V typickém případě se dominantní sterilita může použít pouze v případě tvorby hybridních semen, jestliže je možné vegetativní nebo klonální pomnožení samičí linie. Recesivní sterilita se může použít, jestliže lze snadno rozlišit sterilní a plodné rostliny. Komerční využitelnost systémů dominantní a recesivní sterility je však omezena finančními náklady na klonální množení, resp. hrubnutím samičí linie samooplodňujících se rostlin.

Ačkoli existují hybridizační schémata zahrnující použití CMS, jejich komerční využití je omezené. Jedním příkladem systému CMS je specifická mutace v mitochondriích, které se nacházejí v cytoplazmě, což může vést ve správném jaderném pozadí k selhání tvorby zralého pylu. V některých případech jaderné pozadí může kompenzovat cytoplazmatickou mutaci a dochází k normální tvorbě pylu. Specifické jaderné „obnovovací geny umožňují tvorbu pylu v rostlinách s mitochondriemi CMS..

V obecném případě použití CMS při komerční produkci semen zahrnuje použití tří šlechtících linií: linie vykazující samčí sterilitu (samičí rodič), udržovací linie, která je izogenní s linií vykazující samčí sterilitu, ale obsahuje plně funkční mitochondrie, a samčí rodičovské linie. Samčí rodičovská linie může nebo nemusí nést v cytoplazmě specifické obnovovací geny.

			·. ·· ·· ···· · ···· ·· · : ······ · - Λ Λ Λ Λ · · ·	• ·· • · · • · · • · ·
v		4	·· · · · · » w • · · ··*· · ···· ·· ·· ··	• · · • · ·
	U plodin,	jako je zelenina,	kde získání semene	z hybridu
	nemá význam,	je možné použít	systém CMS, aniž	je nutné

obnovení tvorby pylu. V případě plodin, kde plody nebo semena jsou komerčním produktem, se musí u samčího rodiče obnovit plodnost hybridního semene specifickými obnovovacími geny nebo hybrid vykazující samčí sterilitu se musí opylit. Opylení neobnovených hybridů se může dosáhnout tím, že zahrnují malé procento samčích plodných rostlin, které způsobují opylení. Ve většině druhů je rys CMS dědičný po samičím rodiči, protože všechny cytoplazmatické organely se obvykle dědí pouze z buňky vajíčka.

Systém CMS má omezení, která mohou zabránit jeho použití jako jediné metody pro produkci rostlin vykazujících samčí sterilitu. Například jeden určitý typ CMS kukuřice (Tcytoplazma) propůjčuje citlivost na toxin produkovaný infekcí určitou plísní. Ačkoli se systémy CMS dosud používají v případě řady plodin, mohou být zničeny za určitých podmínek prostředí.

Je proto zřejmé, že způsoby řízení produkce pylu jiným způsobem, než jsou manuální, mechanické, chemické a tradiční genetické metody jsou velmi potřebné.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob produkce rostlin vykazujících samčí sterilitu, které se dosáhne heterogenní expresí avidinu.

Dále je předmětem vynálezu chimérický gen obsahující sekvenci DNA, která kóduje avidin, jež je operativně spojena se sekvencí rostlinného promotoru.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob zrušení samčí sterility vyvolané expresí avidinu.

Dále jsou předmětem vynálezu způsoby produkce semen s jedním nebo více charakteristickými znaky.

Těchto a dalších předmětů vynálezu lze dosáhnout v souladu s jedním provedením vynálezu tím, že se izolovaná molekula DNA

• · • · • ·· · ·· obsahující nukleotidovou sekvenci kódující avidin operativně spojí se sekvencí rostlinného promotoru. Ve výhodném provedení vynálezu je izolovaná sekvence DNA obsažena v expresívním vektoru. V jiném preferovaném provedení vynálezu je sekvence rostlinného promotoru konstitutivní promotor a v jiném preferovaném provedení vynálezu je konstitutivní promotor promotor ubikvitinu. V jiném preferovaném provedení vynálezu je gen avidinu operativně spojen s exportní signální sekvencí.

V souladu s jiným provedením vynálezu se připravuje transgenní rostlina, která obsahuje heterogenní nukleotidovou sekvenci obsahující gen avidinu, přičemž heterogenní nukleotidová sekvence zvyšuje koncentraci avidinu ve tkáních rostliny, což způsobuje samčí sterilitu. V preferovaných provedeních vynálezu je transgenní rostlinou kukuřice, sója, kanola nebo slunečnice. V jiném provedení vynálezu heterogenní molekula DNA dále obsahuje sekvenci konstitutivního promotoru, která je v preferovaném provedení vynálezu sekvencí promotoru ubikvitinu. V jiném preferovaném provedení vynálezu molekula heterologní DNA dále obsahuje tkáňově specifický promotor. Zvláště preferovaným tkáňově specifickým promotorem je promotor specifický pro prašník.

Dále je předmětem vynálezu způsob produkce transgenní rostliny vykazující samčí sterilitu, při němž se do rostlinných buněk zavádí expresívní vektor obsahující promotor a gen avidinu, přičemž promotor kontroluje . expresi genu avidinu a kde exprese genu avidinu způsobuje samčí sterilitu. V preferovaném provedení vynálezu se transgenní rostlina regeneruje z rostlinných buněk. V jiném preferovaném provedení vynálezu promotor -obsahuje ubikvitinový promotor, tkáňově specifický promotor nebo indukovatelný promotor.

Vynález dále popisuje způsob použití genu avidinu za účelem produkce hybridní rostliny vykazující samčí sterilitu, který zahrnuje produkci první rodičovské rostliny vykazující samčí sterilitu obsahující shora v textu popsanou molekulu • · · · • · · · · · • φ · · φ · · · ······ · • φ φ φ · φ Φ·Φ • · φ φ · · · · φφφφ φφ ·· ··

DNA, kde exprese avidinu způsobuje samčí sterilitu. Dále zahrnuje produkci druhé transgenní rodičovské rostliny exprimující druhý cizorodý gen a křížení prvního rodiče s druhým rodičem za vzniku hybridní rostliny, která exprimuje druhý cizorodý gen a ve které produkt druhého cizorodého genu redukuje expresi avidinu v hybridní rostlině, přičemž vzniká hybridní rostlina vykazující samčí sterilitu.

V preferovaném provedení vynálezu se druhý cizorodý gen vybral ze skupiny zahrnující antikódující gen, ribozymový gen a gen externí průvodní sekvence. V jiném preferovaném provedení vynálezu antimediátorový gen obsahuje sekvence mRNA avidinu, které v dalším preferovaném provedení jsou řízeny indukovatelným promotorem. V jiném preferovaném provedení vynálezu ribozymový gen obsahuje sekvence mRNA avidinu.

V dalším preferovaném provedení vynálezu gen externí průvodní sekvence obsahuje sekvence mRNA avidinu. V dalším preferovaném provedení vynálezu molekula DNA první rodičovské rostliny obsahuje operátor LexA, který je operativně spojen s uvedeným z promotorem, kde druhým cizorodým genem je represorPVý LexA.

V jiném preferovaném provedení je promotorové sekvence promotorovou sekvencí specifickou pro prašník obsahující prašníkový box vybraný ze skupiny zahrnující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 4, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 5, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 6 a jejich funkční fragmenty.

V dalším preferovaném provedení vynálezu prašníkový box vykazuje nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 4, SEQ ID NOP: 5 nebo SEQ ID NO: 6 a promotor specifický pro prašník dále obsahuje jaderný promotor vybraný ze skupiny zahrnující CaMřV35S, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 7, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 8, nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 9 a jejich funkční fragmenty.

• · · · · · « 4 4 • · · ftft * · • · ·· > · · · • · · • · · · ···· ··

Vynález dále popisuje způsob obnovení plodnosti u rostlin vykazujících saftyčí sterilitu expresí avidinu, zahrnující aplikace roztoku biotinu ve formě spreje na rostliny.

Vynález popisuje způsob produkce semen, které vykazují jednu nebo více zajímavých charakteristik. V preferovaném provedení vynálezu první rodičovská rostlina, která vykazuje samčí sterilitu a nese jednu nebo více kopií genu avidinu, se kříží jako samičí rostlina s druhou rodičovskou rostlinou, která vykazuje samčí plodnost a nese jeden nebo více zajímavých charakteristik semene. Produkovaná semena vykazují charakteristiky samčího rodiče. V preferovaném provedení vynálezu rodičovskou rostlinou je kukuřice, sója, kanola nebo slunečnice. V jiném provedení vynálezu gen avidinu je gen streptavidinu.

1. Definice

V popisu, který následuje se často používá řada termínů. Následují definice, které umožňují porozumět vynálezu.

Termín „strukturní gen je sekvence DNA, která se přepisuje na informační RNA (mRNA), která se pak překládá na aminokyselinovou sekvenci, která je charakteristická pro specifický polypeptid.

Termín „cizorodý gen znamená sekvenci DNA, která je operativně, spojená s alespoň jedním heterogenním regulačním

Κι/νΆ ň/f elementem. fTibcvolný jiný gen než je kukuřičný strukturální gen .5126 se považuje za cizorodý gen, jestliže expresi uvedeného genu řídí regulační element specifický pro prašník genu 5126.

Termín „pcrmotor znamená sekvenci DNA, která řídí přepis genu, jako je strukturní gen, antimediátorový gen, ribozymový gen nebo gen externí průvodní sekvence. V typickém případě se promotor nachází v 5'oblasti genu blízko místu počátku transkripce. Jestliže promotorem je indukovatelný promotor pak rychlost transkripce se zvyšuje jako odezva na indukční • · fe · • · fefe ···· fe fe » fe činidlo. Naopak rychlost transkripce neni regulována indukčním činidlem, jestliže promotor je konstitutivní. Rostlinný promotor je promotorové sekvence, která bude řídit expresi genu v rostlinné tkáni.

„Jaderný promotor obsahuje nukleotidové sekvence podstatné pro funkci promotoru, které zahrnují TATA box a počátek transkripce. Podle této definice jaderný promotor může nebo nemusí vykazovat detekovatelnou aktivitu za nepřítomnosti specifických sekvencí, které mohou zesílit aktivitu nebo propůjčit tkáňově specifickou aktivitu. Jaderný promotor SGB6 je například tvořen asi 38 nukleotidy ve směru 5' od místa počátku transkripce genu SGB6, zatímco jaderný promotor viru květákové mozaiky (CaMV35S) je tvořen asi 33 nukleotidyů ve směru 5' od místa počátku transkripce genomu 35S.

„Tkáňově specifický promotor je sekvence DNA, která v případě, že je operativně spojena s genem, řídí silnější transkripci uvedeného genu ve specifické tkáni ve srovnání s některou nebo se všemi ostatními tkáněmi v organizmu. Například promotor specifický pro prašník je sekvence DNA, která řídí silnější transkripci asociovaného genu v rostlinné tkáni prašníku. Promotor SGB6 specifický pro prašník může například řídit expresi cizorodého genu v tkáni prašníku, ale nikoli ve tkáni kořenů nebo v koleoptilní tkáni.

Termín „promotor specifický pro prašník' funkční elementy: „prašníkový box

Konkrétní prašníkový box může charakteristiky klasického zesilovače. Kombinace prašníkového boxu a jaderného promotoru může stimulovat expresi genu do vyššího rozsahu než samotný jaderný promotor. To platí i v případě chimérického promotoru specifického pro obsahujícího prašníkový box a jaderný promotor z různých genů. Takové chimérické regulační specifické pro prašník se popisují dále v textu.

zahrnuje dva a jaderný promotor, vykazovat funkční prašník odvozené promotory ·· ·· < ♦ <

• · · ’ • · · · · ' • · * · <

«· *· ·« ···· ♦ · ·· • · · · • · · ♦ · • · · · znamená molekulu z templátové mRNA „Operátor je sekvence DNA, která se nachází v genu směrem k 5' a která obsahuje nukleotidovou sekvenci, kterou rozeznává a na kterou se váže represorový protein. Vazba represorového proteinu s rozpoznaným operátorem vede k inhibici transkripce genu. Například gen LexA kóduje represorový protein, který se váže na operátor LexA.

„Izolovaná molekula DNA je fragment DNA, který se oddělil z DNA organizmu. Například klonovaná molekula DNA kódující gen avidinu je izolovaná molekula DNA. Jiným příkladem izolované molekuly DNA je chemicky syntetizovaná molekula DNA nebo enzymaticky produkovaná cDNA, která není začleněna do genomové DNA organizmu.

„Zesilovač je regulační element DNA, který může zvýšit účinnost transkripce.

Termín „komplementární DNA (cDNA) , jednořetězcové DNA, která se vytvořila enzymovou reverzní transkripcí. V typičkém případě se při iniciaci reverzní transkripce používá primer komplementární s částmi mRNA. Odborníci také používají termín „cDNA, což znamená molekulu dvouřetězcové DNA obsahující uvedenou molekulu jednořetězcové DNA a její komplementární řetězec DNA.

Termín „exprese znamená biosyntézu genového produktu. Například v případě strukturálního genu exprese zahrnuje transkripci strukturálního genu na mRNA a translaci mRNA na jeden nebo více polypeptidů.

„Klonovací vektor je molekula DNA, jako je plazmid, kozmid nebo bakteriofág, který má schopnost se samostatně replikovat v hostitelských buňkách. Klonovací vektory v typickém případě obsahují jedno nebo malý počet rozpoznávacích míst restrikčních endonukleáz, do nichž lze začlenit cizorodou sekvenci DNA tak, aby se dala stanovit, aniž dojde ke ztrátě podstatné biologické funkce vektoru. Do uvedených mísu se dá také začlenit markerový gen, který je vhodný pro použití při identifikaci a selekci buněk

4 4

44 ·· · 4 · · • 4 4 · • 4 » * ·

4 · ·

4444 44

44

4« 4 • 4 4 4

4 4 4 <

·4 <

44 transformovaných klonovacím vektorem. Markerové geny v typickém případě zahrnují geny, které poskytují rezistenci na tetracyklin nebo ampicilin.

„Expresivní vektor je molekula DNA obsahující gen, který se exprimuje v hostitelské buňce. V typickém případě expresi genu řídí jisté regulační elementy, které zahrnují konstitutivní nebo indukovatelný promotor, tkáňově specifické elementy a zesilovače. Říká se, že takový gen je „operativně spojen s regulačními elementy.

„Rekombinantní hostitel může být libovolná prokaryontní nebo eukaryontní buňka, která obsahuje buď klonovací vektor nebo expresivní vektor. Tento termín také zahrnuje ty eukaryontní buňky, které jsou geneticky obsahovaly v chromozómu nebo v genomu hostitelské buňky klonovaný gen(y).

„Transgenní rostlina je rostlina vykazující jednu nebo více rostlinných buněk, které obsahují cizorodý gen.

U eukaryontů RNA polymeráza II katalyzuje transkripci strukturálního genu za vzniku mRNA. Molekula DNA se může navrhnout tak, aby obsahovala templát RNA polymerázy II, ve které transkript RNA má sekvenci, která je komplementární se prokaryontní a upraveny, aby sekvencí specifické antimediátorová RNA

RNA. Transkript RNA se nazývá a sekvence DNA, která kóduje antimediátorovou RNA, se označuje jako antimediátorový gen. Molekula antimediátorové RNA je schopna se vázat na molekulu. mRNA, což vede k inhibici translace mRNA.

„Ribozym je molekula RNA, která obsahuje katalytické centrum. Termín zahrnuje RNA enzymy, RNA upravené samosestřihem a samo-štěpené RNA. Sekvence DNA, která kóduje ribozym se nazývá ribozymový gen.

„Externí průvodní sekvence je molekula RNA, která směruje endogenní ribozym, RNasu P., na určitý typ intracelulární mRNA, což vede ke štěpení mRNA RNasou P. Sekvence DNA, která

4·· 44 4 444» η 44 444 4 444 44 4 • 44 4444 4444

4444 44 44 44 44 44 kóduje externí průvodní sekvenci, se nazývá gen externí průvodní sekvence.

„Charakteristika zrna nebo semene je nutriční nebo fyziologická charakteristika semene, přednostně řízená dominantním genem, která podstatně ovlivňuje průmyslový typ. Charakteristiky zrna nebo semena zahrnují obsah oleje, proteinu nebo škrobu a kvalitu proteinu a typ škrobu.

Termín „jednoduché křížení znamená křížení mezi dvěma inbredními liniemi.

Termín „dvojité křížení znamená křížení mezi dvěma jednoduchými kříženími.

Termín „třícestné křížení označuje potomstvo křížení mezi jednoduchým křížením a inbrední linií.

„Hybrid je první generace potomků křížení mezi dvěma jednotlivci, kreré se liší jedním nebo více geny.

„Inbrední linie je čistá linie, která obvykle vzniká samoopylením a selekcí.

„Syntetická line je směs kmenů, klonů, inbredů nebo jejich vzájemných hybridů, která se udržuje volným opylením po specifický počet generací. Komponentové jednotky se v pravidelných intervalech pomnoží a synteticky rekonstituují.

Termín „schopnost specifického kombinování Znamená charakteristiku specifického kombinování genetických kmenů při křížení ve vztahu k průměrné účinnosti všech kombinací.

Termín „opylovač znamená rodičovskou rostlinu vykazující samčí plodnost, která je donorem pylu pro samičí rodičovskou rostlinu, která vykazuje samčí sterilitu. Rostlina opylovač může mít jakékoli z mnoha genetických pozadí, a proto může být inbrední linií, hybridem, syntetickou volně opylovanou linií nebo genetickou matečnou rostlinou. Touto rostlinou může být transgenní linie. Rostlina opylovač může vykazovat jednu nebo více žádoucích charakteristik semene nebo zrna.

2. Přehled sssssaaaaar12 ♦ ft • ftft · • · · ·

I · · · · • ft ftftftft • ft ftft • ft · · ft · • · ftftftft • · · · · · « • · · ft ftft « ► ftft ftft ftft

Vynález popisuje způsoby vytvoření rostlin vykazující samčí sterilitu tím, že se připraví transgenní rostliny, které exprimují avidin. Avidin se může exprimovat konstitutivně, . způsobem, který není tkáňově specifický nebo se může exprimovat způsobem, který je specifický pro prašník. Vynález dále popisuje způsoby obnovení plodnosti.

Vynález se týká způsobu produkce hybridních semen, které vykazují jednu nebo více charakteristik zrna nebo semene. V preferovaném provedení vynálezu se první hybrid, který vykazuje samci sterilitu a nese jednu nebo více kopií genu avidinu, kříží jako samičí rodič s druhým hybridem. Druhý hybrid vykazuje samčí plodnost a jednu nebo více charakteristik zrna nebo semene. Produkovaná hybridní semena vykazují jednu nebo více charakteristik zrna nebo semene samčí rodičovské rostliny.

Izoloval se gen avidinu a začlenil se do expresívního vektoru vhodného pro zavedení do rostlinné tkáně. Expresivní vektor dále obsahuje promotor, kterým může být konstitutivní promotor, který není tkáňově specifický, jako je promotor ubikv^itinu, tkáňově specifický promotor, jako je promotor specifický pro prašník nebo indukovatelný promotor. Expresivní vektor může obsahovat exportní signálovou sekvenci. Silná exprese genového produktu, který se akumuluje v cytoplazmě může vést k toxicitě vzhledem k rostlinné buňce.

Odstraněním genového produktu z cytoplazmy tak může dojít k omezení buněčné toxicity. Rostlinné geny a jejich exportní signální sekvence jsou v oboru dobře známy (popisuje se v publikaci Jcnes and Robinson, Tansley Review 17: 567-597 (1989). Expresivní vektor se zavedl do rostlinné tkáně za použití standardních metod a vybraly se a pomnožily se transgenní rostliny. Transgenní rostliny exprimující avidin vykazuji samčí sterilitu. Samčí plodnost je možné obnovit, ^{c !} P když se v transgenní rostlině bexprimuje druhý gen, který inhibuje transkripcí genu avidinu nebo inhibuje translaci mRNA «· • » ·

4 4 4 • 4 •444 44 ·· ·444 4· 44 • · 4 4 4 · 4 • 4 4 4 4 4 4

4 ·>4 44 4 • ·· « 4 44 4 • 4 4· 4« ·· avidinu. Podle uvedeného provedení vynálezu dočasné suprese genu avidinu se dosáhne, jestliže se supresorový gen operativně spojí s indukovatelným promotorem. V jiném případě se samčí plodnost obnoví, když se vyvíjející se rostliny postříkají roztokem biotinu.

f f

3. Izolace molekul DNA, kterč kóduji avidin

Nukleotidové sekvence kódující avidin se mohou izolovat za použití metod dobře známých v oboru. Například nukleotidové sekvence genu streptavidinu je dobře známa. Popisuje v publikaci Argarana et al., Nucleic Acids Res., 14(4): 18711882 (1986). V jiném případě cDNA kódující avidin bílku kuřecího vajíčka se může izolovat z cDNA knihovny kuřecích vejcovodů způsoby, které se popisují v publikaci Gope et al., Nucleic Acid. Res. 15: 3595 (1987).

Genomové klony genu avidinu je možné získat z genomové DNA organizmu, o kterém je známo, že produkuje avidin. Avidinový gen kuřete se může například klonovat z kuřecí genomové DNA způsoby popsanými v publikaci Keinanen et al., Eur. J. Biochem. 220: 616 (1994).

Avidinové geny je také možné izolovat za použití polymerázové řetězové reakce (PCR) za použití standardních metod, které se popisují v publikaci Erlich , PCR Technology: Principles and aplicationS for DNA amplification (Stockton Press, NY, 1989 a Innis et al., PCR Protocols: A guide to methods and applications (Academie Press, San Diego, 1990). Způsoby amplífikace PCR dlouhých nukleotidových sekvencí, jako je systém ELONGASE™ (Life Technologies, lne. Gathersburg, MD) , se mohou také použít při získání delších nukleotidových sekvencí, jako jsou genomové klony kódující avidin. Priméry PCR, které jsou komplementární s 5' a 3'konci známých sekvencí genu avidinu, se mohou syntetizovat za použití komerčních oligonukleotidových syntetizérů, jako jsou ty, které produkuje firma Applied Biosystems (Foster City, CA) . V preferovaném *:Ο Ο .·? .*? warff

9» 9999 99

9*

9* » · 9 9 • · 9 • · · ·

99 » 9 9 9

Β 9 9 9

I 9 9 9

Μ provedení vynálezu primery zahrnují další sekvence obsahující místa, které štěpí nukleotidové restrikční endonukleázy. Přítomnost takových míst umožňuje řízené klonování produktů PCR do vhodných klónovacích vektorů po ošetření vhodným restrikčním enzymem; popisuje se v publikaci Finney, „Molecular Cloning of PCR Products v Current protocols in r.olecular biology, Ausubel et al., Eds. (John Wiley and Sons_; New Yo^rk, 1987) str. 25.7.1.

Templátovcu DNA pro PCR může být buď cDNA nebo genomová DNA a může se připravovat z vhodného organizmu za použití metod dobře známých v oboru (popisuje se v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New Yo_rk.) . Genomová DNA se může připravit přímo z ptačí, plazí tkáně nebo z tkáně obojživelníků za použití běžně dostupných činidel, jako je Triazol™ (Life Technologies, lne. Gaithersburg, MD) . V jiném případě cDNA kódující avidin se může připravit za použití mRNA extrahované z tkáně kuřecích vejcovodů za použití komerčně dostupného kitu (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Připravená mRNA. se použije jako templát pro syntézu cDNA za použití poly(dT) nebo náhodných hexamerových primerů pomocí standardních metod. Což se popisuje v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New Yc,.rk, Syntéza cDNA pak probíhá za použití běžně dostupného kitu (Pharmacia) a je možné ji použít přímo pro PCR za použití způsobu popsaného v publikaci Saiki et al., Science 239: 487 (1988 .

Fragmenty genomové DNA nebo cDNA izolované metodami popsanými shora v textu se začlenily do vektoru, jako je bakteríofág neoo kozmid, v souladu s běžnými metodami, jako je použití štěpení restrikčními enzymy, přičemž vznikají vhodné konce, nebo se může použít alkalická fosfatasa, aby se předešlo nežádoucímu spojení molekul DNA, a ligace vhodnými lígázamí

Mecody úpravy takových vektorů se popisuj i ·· ··»·

Φ· ·· 9999 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 *

9 9 9 9 9 9 9 9 *

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 *

9999 99 99 99 99 99 v publikaci Ausubel et al., (eds.), Current protocols in molecular biology, str. 3.0.5-3.17.5 (1990).

V jiném případě nukleotidové sekvence kódující avidin se mohou získat syntézou molekul DNA kódujících avidin za použití začleňujících se dlouhých oligonukleotidů (popisuje se v publikací Ausubel et al., (eds.), Current protocols in molecular biology, str. 8.2.3 až 8.2.13 a Wosnick et al., Gene

60: 115 řetězovou (1987

Současné metody využívající polymerázovou reakci poskytují schopnost syntetizovat geny o velikosti až 1,8 kb (popisuje se v publikaci Adang et al., Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993); Bambot et al., PCR Methods and Applications 2: 266 (1993)). Nukleotidové sekvence syntetizovaného genu avidinu může být založena na libovolné molekule DNA kódující avidin (popisuje se například v publikaci Gope et al., Nucleic Acid. Res. 15: 3595 (1987).

Tyto klony se mohou analyzovat za použití různých standardních metod, jako je restrikční analýza, Southernova analýza, analýza extenzí primeru a analýza DNA sekvence. Analýza extenze primeru nebo analýza ochranou nukleázou SI se může například použít při lokalizaci pfo^p£/«%Mho místa počátku transkripce klonovaného genu (popisuje se v publikaci Ausubel et al., (eds.;, Current protocols in molecular biology, str.

4.8.1-4.8.5 (1990), Walmsley et al., „Quantítative and Qualitative Analysis of Exogenous Gene Expression by SI Nuclease Protection Assay in Methods in Molecular Biology, vol. 7: Gene transfer and expression protocols, Murray (ed. ) pages 271-281 (Humana Press lne. 1991). Tyto a příbuzné metody jsou dobře známy v oboru a používají se při izolaci jiných žádoucích genů a při jejich klonování a expresí.

4. Klonování genu avidinu do expresívního vektoru a příprava transgenní rostliny

Po té, co se izoloval gen avidinu, začlenil se do expresívního vektoru za použití standardních metod (popisuje • · · ·

se v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New York.). Výběr vhodného expresívního vektoru bude záviset na způsobu zavedení vektoru do hostitelských buněk. V typickém případě expresívní vektor obsahuje: (1) prokaryontní elementy DNA kódující bakteriální počátek replikace a gen rezistence na antibiotika, aby došlo k růstu a k selekci expresívního vektoru v bakteriálním hostiteli, (2) klonovací místo pro začlenění exogenní sekvence DNA, například genu avidinu, (3) elementy eukaryontní DNA, které řídí iniciaci transkripce exogenního genu, jako je promotor, (4) elementy DNA, které řídí zpracování transkriptů, jako je transkripční terminační/polyadenylační sekvence a (5) gen kódující markerový protein (např. reportní gen), kde gen je' operativně spojen s elementy DNA, které řídí iniciaci transkripce. Expresívní vektor může dále obsahovat sekvenci DNA kódující exportní signální sekvenci operativně spojenou s exogenní sekvencí DNA. Obecně se rostlinné expresívní vektory a reportní geny popisují v publikaci Gruber et al., „Vectors for Plant Transformation, in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.) p. 89-111 (CRC Press,

1993).

V preferovaném provedení vynálezu se používá systém rostlinného ubikvitinového promotoru. Rostlinné .ubikvitinové promotory jsou v oboru známy. Popisují se například v dokumentu přihlášky evropského' patentu č. 0 342 926. Ubikvitinový promotor je konstitutivní promotor.

V jiném preferovaném provedení vynálezu se používá indukovatelný promotor, což umožňuje indukovatelnou regulaci exprese avidinu. Příkladem takového indukovatelného promotoru je systém glutathion-5-transferasy u kukuřice, popisuje se v publikaci Wiegand et al., Plant. Mol. Biol. 7: 235 (1986). Tato metoda také umožňuje reverzibilní indukci samčí sterility. Tak exprese avidinu a doprovodná samčí sterilita se •9 9999 může řídit aktivací promotoru. V případě, že promotor není aktivován, není exprimován avidin a rostliny vykazují samčí sterilitu.

Exprese může zahrnovat selektovatelný nebo vyhledávatelný markér. Mnohé z běžně používaných pozitivních selektovatelných markerových genů vhodných pro rostlinnou transformaci byly izolovány z bakterií a kódují enzymy, které metabolicky odstraňují toxicitu selektivního chemického činidla, kterým může být antibiotikum nebo herbicid. Jiné pozitivní selektivní markeřové geny kódují změněný cíl, který není citlivýé vůči inhibitoru.

Běžně používaným selektovatelným markerovým genem při transformaci rostlin je gen fosfotransferasa neomycinu II (nptll), izolovaný z Tn8, který , je-li umístěn pod kontrolu rostlinných regulačních signálů, propůjčuje rezistenci na kanamycin; Fraley et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4803 (1983). Jiný běžně používaný selekční markér je gen fosfotransferasy hygromycinu, který dodává rezistenci na antibiotikum hygromycin; Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol. 5: 299 (1985)). Dalšími pozitivními selektovatelným!

markerovými geny bakteriálního původu, které dodávají rezistenci na antibiotika, jsou acetyltransferasa gentamycinu, fosfotransferasa streptomycinu, aminoglykosid-3 adenyltransferasa a determinanta rezistence na bleomycin; Hayford et al., Plant Physiol. 86: 1216 (1988), Jones et al.,

Mol. Gen. Gene“. 210: 86 (1987), Svab et al., Plant Mol. Biol. 14: 197 (1990), Hille et al., Plant Mol. Biol. 7: 171 (1986).

Další pozitivní selekční markerové geny pro transformaci rostlin nejsou bakteriálního původu. Tyto geny zahrnují myší dihydrofolátovou reduktasu, rostlinnou synthasu 5'enolpyruvylšikimát-3-fosfátu rostlinnou synthasu acetolaktátu; Eichhelz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13: 67 (1987), Shah et al., Sceince 233: 478 (1986), Charest et al., Plant Cell Rep. 8: 643 (1990).

• ·

Jiné běžné selektovatelné markerové geny pro rostliny nesou rezistenci na herbicidní inhibitory synthasy glutaminu. V dokumentech přihláška evropského patentu č. 0 333 033 (Kumada et al.) a US patent č. 4,975,374 (Goodman et al. ) se popisují nukleotidové sekvence genů synthasy glutaminu, které dodávají rezistenci na herbicidy, jako je L-fosfinothricin. Nukleotidové sekvence genu fosfinothricinacetyltransferasy se uvádí v dokumentu přihláška evropského patentu č. 0 242 246 (Leamans et al.). V publikaci De Greef et al., Bio/Technology 1: 61 (1985) se popisuje produkce transgenních rostlin, které exprimují chimérické geny bar kódující aktivitu fosfinothricinacetyltransferasy.

Další skupina markerových genů pro transformaci rostlin vyžaduje vyhledávání potenciálně transformovaných rostlinných buněk místo přímé genetické selekce transformovaných buněk na rezistenci k toxické látce, jako je antibiotikum. Tyto geny jsou zvláště vhodné při kvantifikaci nebo vizualizaci prostorového profilu exprese genu ve specifických tkáních a často se nazývají reportními geny, protože mohou fúzovat s genem nebo s genovou regulační sekvencí při zkoumání genové exprese.

Běžně používané geny pro vyhledávání potenciálně transformovaných buněk zahrnují . β-glukuronidasu. (GUS), β~ galaktosidasu, luciferasu a acetyltransferasu chloramfehikolu (popisuje se v publikaci Jefferson, Plant. Mol. Biol. Rep. 5: 387 (1987), Teeri et al. , EMBO J. 8: 343 (1989), Koncz et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84: 131 (1987), De Block et al., EMBO J. 3: 1681 (1984) . Jiným přístupem k identifikaci relativně vzácných transformačních jevů je použití genu, který kóduje dominantní konstitutivní regulátor dráhy anthomycinové pigmentace Zěa Mays, což se popisuje v publikaci Ludwig et al., Science 247: 449 (1990).

«· ···· ·· 99

4 · · · · * • · « · · · · • · 4 4 9 9 9 9 • ••· · · · ·

49 49 44

Expresívní vektory mohou obsahovat gen avidinu operativně spojený se sekvencí DNA, která kóduje peptidovou exportní signální sekvenci; popisuje se v publikaci Hones and Robinson. Vektor je připraven tak, že signální sekvence se fúzuje s Nkoncem proteinové sekvence avidinu, což umožňuje při normálním buněčném zpracování přesné štěpení molekuly proteinu za vzniku zralého aktivního avidinu. Ve zvláště preferovaném provedení vynálezu se jako signální sekvence používá signální sekvence alfa-amylasy ječmene (popisuje se v publikaci Rogers et al.,

J. Biol. Chem. 260: 3731-3738 (1985)).

Expresívní vektory obsahující gen avidinu se mohou zavést do protoplastů nebo do intaktních tkání, jako jsou nezralá embrya a meristémy nebo do kultur kalusu nebo do izolovaných buněk. Upřednostňuje se, aby expresívní vektory se zavedly do intaktních tkání. Obecné metody kultivace rostlinných tkání se popisují například v publikaci Miki et al., „Procedures for Introducing Eoreign DNA into Plants, in Methods in plant molecular biology and biotechnology, Glick et al., (eds.), pages 67-88 (CRC Press, 1993) a Phillips et al., „Cell/Tissue Culture and In Vitro Manipulation,, in Corn and Corn improvement, 3^rd Edition, Sprague et al., (eds.) p. 345-387 (amrican Society of Agronomy, lne. et al., 1988.

Metody zavádění expresívních vektorů do rostlinných tkání zahrnují přímou infekci nebo společnou kultivaci rostlinné tkáně s mikroorganizmem Agrobacterium. tumefaciens. (popisuje se v publikaci Horsch et al., Science 227: 1299 (1985)).

Přednostně se jako vektor pro cizorodé sekvence DNA používá odstrojený vektor Ti. Transformace se může uskutečnit za použití postupů popsaných například v přihlášce evropského patentu č. 116 718 (1984) a 270 822 (1988). Preferované vektory Ti-plazmidu obsahují cizorodou sekvenci DNA uloženou mezi hraničními sekvencemi nebo alespoň umístěnou proti směru exprese od pravé hraniční sekvence.

• 9 • · · · · · • 9

9 · ·

9 9 9 9 «

9 9 9 9 «

9 9 9 9 9 I

9 9 9 9 9 « » 99 *· ··

PCT WO 85/01856 a 275 069), in vitro

Další typy vektorů mohou být používány při transformaci rostlinných buněk postupy, jako je přímý transfer genu (popisuje se například v přihlášce v přihlášce evropského patentu č.

transformace protoplastů (popisuje se například v US patentu č. 4,684,611), transformace zprostředkovaná rostlinnými viry (popisuje se například v přihlášce evropského patentu č. 067 553 a US patentu č. 4,407,956) a transformace zprostředkovaná lipozomy (popisuje se například v US patentu č. 4,536,475). Vhodné metody při transformaci kukuřice se popisují v publikaci Fromm et al., Bio/Technology 8: 833 (1990) a Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2: 603 (1990).

Standardní metody vhodné pro transformaci rýže se popisují v publikaci Christou et al., Trends in Biotechnology 10: 239 ;i992) a Lee et al,

Proč. Naťl.Acad. Sci USA 88: 6389 jednoděložných rostlin, kukuřice, čirok, ječmen (1991). Pšenici je možné transformovat za použití metod, které jsou podobné postupům transformace kukuřice a rýže. Dále v publikaci Casas et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 11212 (1993) se popisuje způsob transformace čiroku, zatímco v publikaci Wan et al., Plant Physiol. 104: 37 (1994) se popisuje způsob transformace ječmene.

V obecném případe se preferují metody přímé transformace zvláště obilovin, jako je rýže, a pšenice. Vhodné metody přímého přenosu zahrnují zavedení zprostředkované mikroprojektily, DNA je možné zavést injekcí, elektroporací a podobně (popisuje se například v publikaci Gruber et al., „Vectors for Plant Transformation, in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. (eds.) p. 89-111 (CRC Press, 1993), Miki et al., Miki et al., „Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants, in Methods in plant molecular biology and biotechnology, Glick et al., (eds.), pages 67-88 (CRC Press), 1993), Klein et al., Bio/Technology 10: 268 (1992). Více se upřednostňuje, když se expresívní vektory zavedou do tkání jednoděložné rostliny za použití mikroprojektilů.

5. Regulace samčí plodnosti

A. Produkce rostlin vykazujících samčí sterilitu

Za účelem vyvolat samčí sterility v souladu s vynálezem se zkonstruuje expresívní vektor, ve kterém sekvence DNA kódující avidin je operativně spojena se sekvencemi DNA, které regulují transkripci genu v rostlinné tkáni. Obecné požadavky, které musí splňovat expresívní vektory, jsou formulovány shora v textu. Za účelem dosažení samčí sterility expresí avidinu se preferuje, aby avidin nebyl exprimován pouze dočasným způsobem, ale aby byl expresivní vektor zaveden do rostlinné embryonální tkáně takovým způsobem, že bude avidin exprimován v pozdějším stádiu vývoje v dospělé rostlině. Mitotické stability lze například dosáhnout za použití rostlinných virových vektorů, který se replikují epichromozomálně.

Preferovaným způsobem získání mitotické stability je integrace sekvencí expresívního vektoru do hostitelského chromozomu. Takovou . mitotickou stabilitu lze dosáhnout zavedením expresívního vektoru do rostlinné tkáně mikroprojektily neBo použitím jiných standardních metod, ^teré se popisují shora v textu (Fromm et al., Bio/Technology 8: 833 (1990), Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2: 603 (1990) a Walters et al. , Plant Molec. Biol. 18: 189 (1992).

Transkripce genu avidinu po zavedení do rostlinné tkáně se přednostně řídí konstitutivním promotorem, který nespecificky stimuluje genovou expresi v rostlinné tkáni. Příkladem konstitutivního promotoru vhodného pro tyto účely je ubikvitinový promotor, jak se popisuje shora v textu.

Transkripce genu avidinu se může také řídit promotorem, který stimuluje expresi genu tkáňově specifickým způsobem. Zvláště preferovaným promotorem, který je specifický pro prašník, je promotor 5126, který se izoloval z kukuřičné

4 • 4

44 · * · 4 4

444 44 4 4444 ·· 444 4 444 44 4 irtbrední linie B73. Promotor 5126 stimuluje expresi cizorodého genu z prašníků ve kvarterním stádiu jednojaderných mikrospor.

Dalším vhodným promotorem, který je specifický pro prašník_> je promotor SGB6, který se také izoluje z linie B73. Promotor SGB6 může indukovat expresi cizorodého genu v tapetálních buňkách prašníků od kvarterního stádia do středního jednojaderného stádia vývoje mikrospor.

V jiném případě exprese genu specifického pro prašník se může provést za použití kombinace prašníkového boxu a jaderného promotoru. Zvláště preferovaným prašníkovým boxem je box 5126, který obsahuje následující nukleotidovou sekvenci:

5' GCGGCCGCGG ATCCGCTCAT CTGCTCGGTA CCAACCAGCC CGCCGGCGCC TAGGCGAGTA GACGAGCCAT GGTTGGTCGG

TTTCCTATTA CCATGCACAG ATCT 3' [SEQ ID NO: 4]. AAAGGATAAT GGTACGŤGTC TA6A

Jiný vhodný prašníkový box je ve fragmentu, který obsahuje baží exprese a je definovaný genů\ počátečního nukleotidy 583 až 490 místa transkripce SGB6.

proti směru Nukleotidová sekvence tvořící prašníkový box SGB6 obsahující 94 párů baží je:

(-SÍ3) ACAGTTCACT AGATATGCAT GATCTITAAC AATTGCTGCT TGTCAAGTGA TCTATACGTA CTACAAATTG TTAACGACGA

GGATTGTGCG GTTTCTTTTG CCACAAATGG CATGAACAGA CCTAACACGC CAAAGAAAAC CGTGTTTACC GTACTTGTCT

GTAATCCGGG ACGC (-490) [SEQ IC HO: S]. CATTAGGCCC TGCG

V jiném případě vhodný prašníkový box se získal z kukuřičného promotoru G9, který stimuluje expresi genu během rmSibítčkého až kvarterního stádia vývoje. Prašníkový box G9 obsahuje následující nukleotidovou sekvenci:

• · · • · ♦ · 9 9 »9 9· • · 9 * • 4 4 · • 4 4 4

4 4 4 • 4 44

GCGGCCGCGG ATCCTGGCTG CGCCGGCGCC TAGCACCGAC

AGAAAAAAAA ATTGTTGCAT TCTTTTTTTT TAACAACGTA

AACCAAACCA G7AGTTGAGG TTGGTTTGGT CATCAACTCC

TCACCAACGT AGATCT 3' AGTGCTTGCA TCTAGA

GATGAAACCG ATGCGAGAGA CTACTTTGGC TACGCTCTCT

GTAGTTGGCG CCTGTCACCC CATCAACCGC GGACAGTGGG

CACGCCCTGT TTGCTCACGA GTGCGGGACA AACGAGTGCT [SEQ IQ N0:«].

Prašníkové boxy 5126, SGB6 a G9 se mohou získat syntézou oligonukleotidů, jak se popisuje shora v textu. Odborníci mohou provést deleční analýzu popsaného prašníkového boxu, aby se lokalizovala jedna nebo více dalších regulačních sekvencí, které jsou specifické pro prašník. Takové „funkční fargmenty prašníkových boxů se mohou také použít při regulaci exprese genu avidinu způsobem, který je specifický pro prašník.

Preferované jaderné promotory se získaly z jaderného promotoru 5126, z jaderného promotoru SGB6, z jaderného promotoru G9 a z jaderného promotoru X/řfW , A-y, 35S.

Zvláště preferovaným jaderným promotorem je jaderný promotor 5126, který obsahuje následující nukleotidovou sekvenci:

5' AGATCTAACT AAGGTATATA TGTGCATAGT CTCCTAATTC TCTAGATTCA TTC CAT AT AT ACACGTATCA GA5GATTAAG

TTCATCTTCA ACCTCTAGCT GATTGATCTC TGGTATTTAC aagtagaagt tggagatcga ctaactagag ACCATAAATG

CACTCTTTCC TTCCTTCCTT CCTTCAATTC taaataccac GTGAGAAAGG AAGGAAGGAA GGAAGTTAAG ATTTATGGTG

AAATCAAAGT TGCTTTGCCA TG 3’ [SEQ IP NO:?3 · TTTAGTTTCA ACGAAACGGT AC

Jaderný promotor SGB6 obsahuje přibližně 38 nukleotidů proti směru přepisu genu od počátečního místa transkripce genu SGB6. Vhodný jaderný promotor SGB6 obsahuje následující nukleotidovou sekvenci:

• 9

9 9· 49 · · * · ·

4 4 4 9 4 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 4 9 4 9 9 9

9 4 4 4 4 9 9 4 9 9

4499 94 44 44 44 44

5' ATCTCACCCT ATTAATACCA tgctgacgag TAGAGTGGGA TAATTATCGT ACGACTGCTC

CCAATAGC 3' (SEC -D NO: CGTTATCG

Vhodný jaderný promotor získaný z genu G9 obsahuje nukleotidovou sekvenci:

5' agatctctat aaaacacgca gggactggaa agcoagatti tctagagata totgtgcgt ccctgacctt TCGCTCTAAA

CACAGCTGAA AGCAGCCAAA ACGCAflAAGC TGCACTGCAT

GTGTCGACTT TCGTCGGTTT TGCGTCTTCC ACGTGACGTA

ACATCGAGCT AACTATCTGC ACCCATG 3' [SEQ ID NO:9]TGTAGCTCGA TTGATACACG TCGGTAC

Vhodnými jadernými promotory také jsou funkční fragmenty jaderných promotorů 5126, SGB6 a Θ9. Metody získání takových funkčních fragmentů jsou uvedeny shora v textu.

Okno vývoje exprese genu avidinu se může rozšířit za použití chimerového regulačního elementu, který obsahuje prašníkový box z jednoho genu a promotor z druhého genu, který je specifický pro prašník. Regulační sekvence SGB6 stimulují expresi genu z kvarterního do střední-jednojaderného stádia vývoje, zatímco regulační sekvence G9 stimulují expresi genu během nn&iózy a kvarterního stádia vývoje. Transkripce cizorodého genu během ;?!ěiózy a středního j ednoj aderného stádia vývoje se stimuluje kombinací prašníkového boxu a promotoru G9. Takové různé kombinace prašníkových boxů a promotorů specifických pro prašník jsou zvláště vhodné pro využití podle vynálezu.

Může se také použití virový jaderný promotor. Příklady vhodných jaderných virových promotorů zahrnují jaderný promotor květákového mozaikového viru (CaMV), jaderný promotor mozaikového viru krtičníku a podobně (popisuje se v publikaci Gruper et al.,). Výhodný virový jaderný promotor je CaMV35S nebo jeho varianty.

Za účelem vybrat transformované buňky, expresivní vektor obsahuje selekční markerový gen, jako je gen nesoucí • · 19 rezistenci na herbicid. Takové geny například nesou rezistenci na fosfinothricin, glyfosat, sulfonylmočoviny, atrazin nebo imidazolinon. Upřednostňuje se, aby selekčním markerovým genem byl gen bar nebo par, který kóduje acetyltransferasu fosfinothricinu. Nukleotidové sekvence genů bar se popisují v dokumentu přihlášce Evropského patentu č. 0 242 246 (Laemans et al., 1987), v publikaci White et al., Nucleic Acids Res. 18: 1062 (1990). V publikaci Wohllenben et al., Gene 70: 25 (1988) se popisuje nukleotidové sekvence genu pat. Exprese genu bar a pat umožňuje rezistenci na herbicidy, jako je glufosinat (prodávaný jako Basta® a Ignite®)a bialafos (prodávaný jako Herbi-ace® a Liberty®).

Expresívní vektor může obsahovat sekvence DNA kódující avidin, které řídí konstitutivní promotor nebo promotor specifický pro prašník, stejně jako selekční markerový gen řízený konstitutivním promotorem. V jiném případě selekční markerový gen se může zavést do hostitelských buněk v odděleném selekčním expresívním vektoru „ko-transformací embryonální tkáně.

B. Obnovení samčí plodnosti u hybridu Fl

Shora popsané metody se mohou použít při produkcí transgenních rostlin vykazujících samčí sterilitu a produkujících hybridy Fl pomocí křížení inbredních linií ve velkém měřítku. Jestliže všechny vaječné buňky transgenních rostlin vykazujících samčí sterilitu neobsahují rekombinantní gen avidinu, pak část hybridů Fl bude vykazovat fenotyp samčí plodností. Na druhé straně hybridy El budou vykazovat samčí sterilitu, jestliže rekombinantní gen avidinu je přítomen ve všech vajíčkových buňkách transgenních rostlin vykazujících samčí sterilitu. Aby došlo k produkci hybridů Fl vykazujících samčí sterilitu, může být nutné použít systém obnovení samčí plodnosti. Takový systém obnovení samčí plodnosti je zvlášť ssssgsgsmsM t· #« ···· · ··· * >· >·· ·«·· ···· ·· ·· ···· ·# « • · · • ·· ♦ · · • ·· ·· · sterilitu s rostlinou výhodný u aiutogamní species, jestliže produkt, který se sklízí je semeno.

Běžně užívaný přístup, jak obnovit plodnost u linie transgenních rostlin vykazujících samci neplodnost, vyžaduje produkci druhé linie transgenních rostlin „linie obnovující fertilitu. Transgenní rostlina, která vykazuje samčí způsobenou expresí barnasy se bude křížit vykazující samčí plodnost, která exprimuje inhibitor barnasy, jak se diskutuje shora v textu (popisuje se v publikaci Mariani et al., Nátuře 157: 384 (1992).

V tomto případě analogický přístup vyžaduje produkci linie obnovující fertilitu transgenních rostlin, která exprimuje ribozymy cílené k mRNA avidinu nebo která exprimuje antimediátorový avidin. Ribozymy se například mohou navrhnout tak, aby se exprimovala endunukleázová aktivita, která je řízena do jisté cílové sekvence v molekule mRNA. Například v publikaci Stainecke et al., EMBO J. 11:

100 % inhibice exprese genu

1525 (1992) se dosáhlo až neomycinu ribozymy fosfotransferasy v protoplastech . rostliny tabáku.

V publikaci Farrizan et al., Antisense Res. And Devel. 3: 253, se popisuje chloramfenikolu inhibice aktivity acetyltransferasy u protoplastů rostliny tabáku za použití vektoru, který je exprimován upraveným ribozymem. V souladu s vynálezem mRNA avidinu poskytuje vhodnou cílovou molekulu RNA pro ribozym.

Za použití podobného přístupu se může plodnost obnovit použitím expresívního vektoru obsahujícího nukleotidovou sekvenci, která kóduje antimediátorovou RNA. Navázání molekul antimediátořové

RNA na cílové molekuly mRNA vede k hybrídizačnímu blokování translace (popisuje se v publikaci Paterson et al., Porc. Nati. Acad. Sci. USA 74: 4370 (1987).

V souladu s vynálezem vhodná molekula antimediátorové RNA bude mít sekvenci, která je komplementární s molekulou mRNA.

V preferovaném provedení vynálezu antimediátorová RNA je •444 44 ·♦ ···♦ řízena indukovatelným promotorem, který umožňuje obnovení samčí fertility.

Dále se mohou zkonstruovat expresívní vektory, ve kterých expresívní vektor kóduje transkripty RNA schopné vyvolat štěpení molekul RNA avidinu zprostředkované RNasou P. V souladu s tímto přístupem je možné zkonstruovat externí průvodní sekvenci, která směřuje endogenní ribozym, RNasu P na mRNA avidinu, jenž je následně štěpena buněčným ribozymem (popisuje se v publikaci Altman et al.

5,268,053, Yuan et al., Science 263

U.S. Patent č. 1269 (1994). Externí průvodní sekvence s výhodou zahrnuje 10 až 15 nukleotidů, které jsou komplementární s mRNA avidinu,

3'-NCCA nukleotidovou sekvenci, kde N je s výhodou purin. Transkripty externí průvodní sekvence se váží na specie cílové mRNA tím, že vytvoří páry baží mezi RNA a komplementárními externími průvodními sekvencemi, což vyvolá štěpení mRNA RNasou P v nukleotidu, který se nachází na 5'-straně oblasti párovaných baží.

V případě alternativní metody obnovení samčí plodnosti transgenní rostliny vykazující samčí sterilitu obsahují ros lí iny expresívní vektor, který vedle promotorové sekvence operativně spojené s genem avidinu, také obsahuje prokaryontní regulační element. Transgenní rostliny vykazující samčí plodnost se produkují tak, že exprimují prokaryontní polypeptid. Tato exprese je řízena promotorem. V případě hybridů Fl prokaryontní polypeptid váže prokaryontní regulační sekvenci a potlačuje expresi avidinu.

Systém gen LexA/operátor LexA se může použít při regulaci exprese genu podle vynálezu (popisuje se v dokumentu US patent č. 4,833,080 a Wang et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1805 (1993)). Expresívní vektor rostliny vykazující samčí sterilitu bude obsahovat sekvenci operátoru LexA, zatímco expresívní vektor rostliny vykazující samčí fertilitu bude obsahovat sekvenci kódující represor LexA. V případě hybridu Fl se represor LexA ygasagaic ·· ·· ·* ··»< ·· ·· • · · · 9 9 9 99 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 „„ · · · ···· ···· 28 ··*» »· ·· »· ·♦ ·♦ bude vázat na sekvenci operátoru LexA a bude inhibovat transkripci genu avidinu.

Molekuly DNA operátoru LexA je možné získat například syntézou fragmentů DNA, které obsahují známé sekvence operátoru LexA; viz například US patent č. 4,833,080 a Garriga et al., Mol. Gen. Genet. 235: 125 (1992). Gen LexA se může získat syntézou molekuly DNA kódující represor LexA. Postup syntézy genu se diskutuje shora v textu a sekvence genu LexA se popisují například v publikaci Garriga et al., Mol. Gen. Genet. 235: 125 (1992). V jiném případě se mohou molekuly DNA kódující represor LexA získat z plazmidu pRB500 z instituce American Type Culture Collection, č. uložení 67758.

Odborníci mohou snadno nalézt jiné strategie obnovení samčí fertility za použití prokaryontních regulačních systémů, jako je systém lac represor/lac operon nebo systém trp represor/trp operon.

Jiné metoda obnovení plodnosti využívá vysoké afinity avidinu k biotinu pro postřikování vyvíjejících se rostlin roztokem biotinu. Roztok biotinu může obsahovat minimální množství pomocného organického rozpouštědla, jako je DMSO, aby se zaručilo úplné rozpuštění biotinu. Roztok biotinu však nemusí obsahovat žádné další organické rozpouštědlo. Postřik může být zahájen již v meiotické fázi vývoje pylu. Může však být zahájen i později během vývoje pylu. Postřik se obvykle opakuje v pravidelných intervalech až do doby,. kdy dojde k rozprášení pylu. Intervaly mezi jednotlivými postřiky kolísají mezi 1 až 7 dny. V preferovaném provedení vynálezu se postřik opakuje každé 3 až 5 dní.

6. Produkce hybridních semen s požadovanými charakteristikami zrna

Hybridní semena s jednou nebo více požadovanými charakteristikami zrna nebo semene se mohou s výhodou produkovat za použití rostlinných linií vykazujících samčí

9· 9· • · · · • · 9 • 9 9 ·

9 9

9999 99 ·· 9999

99 • 9 9 4

9 9 4

9 9 4

9 9 4

99 syntetické operativně sterilitu podle vynálezu. Transgenní linie nesoucí gen avidinu se kříží jako samičí rodič vykazující samčí sterilitu s rostlinou opylovačem, která vykazuje samčí plodnost a nese jeden nebo více genů kódujících požadovanou charakteristiku zrna nebo semene. Rostlinná linie opylovač vykazující samčí plodnost je přednostně v případě genu(ů) řídících požadovanou charakteristiku zrna nebo semene homozygotní. Produkují se a sklízejí se hybridní semena, které mají požadovanou charakteristiku zrna nebo semene. Způsob produkce hybridních semen, kdy rodič vykazující samčí sterilitu se kříží s opylovací linií vykazující samčí plodnost nes^cijeden nebo více genů kódujících požadované charakteristiky zrna nebo semene, se někdy nazývá metoda „top křížení (popisuje se například v dokumentu US patentu č. 5,196,636).

Linie vykazující samčí sterilitu a plodnost, které se kříží za vzniku hybridních semen podle vynálezu, mohou být libovolnou kompatibilní kombinací hybridní, inbrední nebo linie. Transgenní linie nesoucí gen avidinu spojený s konstitutivním nebo indukovatelným promotorem se produkují za použití metod popsaných shora v textu. Linie vykazující samčí sterilitu mohou nést jednu nebo více kopií genu avidinu.

Transgenní linie vykazující samčí sterilitu, které nesou gen avidinu se mohou stát inbrední linií tím, že se potlačí samčí sterilita libovolnou z popsaných metod. Ribozymy se například navrhnou tak, aby se exprimovala endonukleasová aktivita, která je cílena na jistou sekvenci v molekule RNA avidinu. Gen kódující ribozym je operativně spojený s indukovatelným promotorem. Rostlina vykazující samčí sterilitu se ošetří indukčním činidlem, exprimuje se ribozym a deaktivuje se mRNA avidinu, což vede k obnovení samčí plodnosti. V jiném případě se plodnost obnoví použitím nukleotidové sekvence, která kóduje antimedíátorovou RNA. Navázání molekul antimediátorové RNA na molekuly cílové mRNA • ft ftft·· • · • · · ft · · • · · ft I • ft ftft· « ftft· ft « • ••ft ftft ftft • ft ftft • ftft « • ftft 4 • ftft 4 » ftft <

ft· ·· vede k hybridizačnímu zablokování translace.

V souladu s vynálezem vhodná molekula antimediátorové RNA bude mít sekvenci, která je komplementární s mRNA avidinu. V preferovaném provedení vynálezu antimediátorové RNA se řídí indukovatelným promotorem. Aktivace tohoto promotoru pak umožňuje obnovení samčí sterility.

Při dalším alternativním přístupu se v linii vykazující samčí sterilitu produkují transkripty RNA, které jsou schopny vyvolat štěpení molekuly mRNA avidinu zprostředkované RNasou Ρ. V souladu s tímto přístupem se může zkonstruovat externí průvodní sekvence řídící endogenní ribozym RNasu P, na mRNA avi^dinu, kteríf se následně štěpí buněčným ribozymem. Transkripty externí průvodní sekvence se váží na specie cílové mRNA tím, že vytvoří páry baží mezi RNA a komplementárními externími průvodními sekvencemi, což vyvolá štěpení mRNA RNasou P, v nukleotidu, který se nachází na 5'-straně oblasti párovaných baží.

V případě dalšího přístupu obnovení samčí plodnosti podle vynálezu se produkuji transgenní rostlinné linie vykazující samčí sterilitu, které obsahují expresívní vektor, jenž vedle promotorové sekvence operativně spojené s genem avidinu, také obsahuje prokaryontní regulační element. Vznikají transgenní linie, které obsahují uvedený gen avidinu spolu s genem kódujícím prokaryontní gen operativně spojený s indukovatelným promotorem. Transgenní rostlinná linie se ošetří indukčním činidlem za vzniku prokaryontního polypeptidu, který se váže na prokaryontní regulační sekvenci, čímž se potlačí exprese avidinu a obnoví se samčí plodnost.

Pří další metodě obnovení plodnosti se využívá vysoká afinita avidinu vůči biotinu. Transgenní linie vykazující samčí sterilitu se postřikuji roztokem biotinu. Bíotin se váže na avidin a deaktivuje ho, čímž dochází k obnovení samčí fertility. Postřik se provádí na začátku mfcřózy při vývoji pylu, může probíhat i později. V preferovaném provedení

33CK35 ·« 99 »9 9999

99*9 9«

9« • 9 9 4 • 9 9 4

9 9 9 4 • · · 4 • 9 *9 vynálezu potlačení samčí sterility se dosahuje postřikem rostlin bíotinem.

Opylující linie vykazující samčí sterilitu a samčí fertilitu, které se používají při produkci hybridních semen s požadovanou charakteristikou zrna a semene podle metod v souladu s vynálezem, jsou inbrední linie, hybridní linie, syntetické volně opylené linie nebo genetická mateční rostlina. Inbrední linie, hybridní linie, syntetické volně opylené linie nebo genetická mateční rostlina se produkují libovolným způsobem, které jsou dobře známy v oboru (popisují se v publikaci J. M. Poehlman, Breeding field crops, 3^rd ed. (Van Nostrand and Reinhold, New Yc. rk, NY, 1987). Mezi vybranými inbredními a/nebo hybridními liniemi se provádí testovací křížení, aby se vyhodnotila schopnost specifického kombinování. Stanovují se komerčně přijatelné kombinace.

Vybrala se opylovací rostlinná linie vykazující samčí plodnost, která (1) nese jeden nebo více genů s požadovanými charakteristikami zrna nebo semene a (2) je kompatibilní s linií vykazující samčí sterilitu, se kterou se bude křížit. Gen(y) řídící vybranou charakteristiku zrna nebo semene mohou být dominantní tak, že se snadno exprimuje v hybridních semenech. Avšak gen(y) řídící vybrané charakteristiky semen a zrna mohou být recesivni

V případě, ze gen řídící charakteristiku zrna nebo semene může být recesivní, pak linie vykazující samčí sterilitu a opylovací linie vykazující samčí plodnost se kříží a charakter recesivity.

vzniká rostlina, která nese tento V případě, že gen(y) řídící charakteristiku zrna a semene jsou recesivní pak obě linie vykazující samčí sterilitu a opylovač jsou přednostně homozygotní v případě uvedeného genu(ů) tak, že požadovaný fenotyp se exprimuje ve všech semenech produkovaných křížením. Obdobně linie vykazující samčí sterilitu a opylující linie vykazující samčí plodnost mohou každá nést geny, které řídí charakteristiky zrna nebo semen v semenech potomstva. Gen(y) t» 9 999 »· fe· • fefefe 99 • fefe 9 9

9 fefefe · fefefe fe fe fefefefe fefe fefe fefe fe· • fefefefe • · · · · • « fe fefe · • fefefefe • fe fefe fefe kódující charakteristiky zrna nebo semene se zavedou do linie vykazující samčí sterilitu nebo do opylující linie vykazující samčí plodnost tradičními metodami šlechtění a/nebo metodami genetického inženýrství.

Požadovaná charakteristika zrn nebo semen je nutriční nebo fyziologická charakteristika semene, která podstatně ovlivňuje průmyslový typ, klíčení nebo rezistenci na různá onemocnění. Požadovaná charakteristika zrna nebo semene zahrnuje takové charakteristiky, jako je obsah oleje, proteinu a škrobu, stejně jako kvalita proteinu a typ škrobu. Metody podle vynálezu se používají pří produkci speciálních typů semen nebo zrna vhodných pro obchodování na různých trzích. Kukuřice s vysokým obsahem oleje se například používá při nahrazení živočišných tuků, které se přidávají do potravy chovných zvířat. Kukuřice s vysokým obsahem amylosy se používá při výrobě lepidel, degradovatelných plastových filmů a balícího materiálu. Škrob pocházející z kukuřice s vysokým obsahem vosku se používá při přípravě mnoha různých potravin, jako jsou polévky a pudinky.

Opylující linie vykazující samčí sterilitu může nést jeden nebo více genů, které ovlivňují charakteristiky týkající se škrobu a proteinu. Geny, které ovlivňují charakteristiky týkající se škrobu a proteinu zahrnují, ale nejsou omezeny na cukry (su) , amylasové plnidlo (ae), křehkost (bt), matnost (du) , moučnost (fl), opalescence (o), zrohovatělost (h) , scvrklost (sh) a voskovatost (wx) (popisuje se například v publikaci Hannah et al., Sci. Hortic. 55: 177-197 (1993)). Charakterizovaly se vlastnosti škrobu získaného z rostlin kukuřice, které jsou homozygotní, recesivní v případě genu ae, du, wx, ae a aewx (popisuje se v publikaci Brockett et al., Starch/Starke 40: 175-177 (1988) a US patent č. 5,516,939.

V jiném případě opylující linie se může transformovat genem, který může ovlivňovat obsah škrobu. Opylující linie vykazující samčí sterilitu se může transformovat bakteriálním

4444 •

« 4 4 4 • 4 · • · · ♦ • 4 ·

4444 44 semeno.

4 4 • 44

4 4 4

4 4 4

44

44

4 4

4 4

4 4

4 4 <4 genem, který kóduje pyrofosforylasu ADP-glukosy, která je aktivní v přítomnosti metabolitů, který inhibují rostlinný enzym. Výsledná semena mají vyšší obsah škrobu (popisuje se v publikaci Sivak et al., J. of Environ. Polymer Degradation 3(3) : 145-152 (1995) .

Opylující linie může nést jeden nebo více genů, které ovlivňují obsah mastných kyselin. Gen fanl například kontroluje v sóje nízký obsah linolenové mastné kyseliny (popisuje se v publikaci Hammond et al., Crop Sci. 231: 192 (1993)). Gen fas kontorluje v sóje vysoký obsah mastné stearové kyseliny (popisuje se v publikaci Graef et al., Crop Sci. 25: 1076 (1985)). Geny fapl a fap2 řídí v sóje nízký, resp. vysoký obsah palmitové kyseliny (Erickson et al., Crop Sci. 18: 544 (1988) ) .

Opylující linie může být transformována genem, který ovlivňuje obsah oleje v semenech. Opylující linie může například nést gen kódující desaturázu stearoylacylového nosičového proteinu (stearoyl-ACP), která katalýzuje první desaturační krok při biosyntéze semenného oleje. Gen stearoylACP desaturázy může být operativně spojen s promotorem specifickým pro semena. Rostliny, jako je slunečnice, kukuřice, kanola nebo sója, které jsou transformované genem stearoyl-ACP desaturázy, produkují změněné množství kyseliny stearové a může se použít při produkci semenného oleje, který obsahuje upravené nebo pozměněné množství nasycených a nenasycených mastných kyselin (popisuje se například v dokumentu US patent č. 5,443,974).

V jiném případě opylující linie může nést antimediátorový gen, který inhibuje expresi cílového genu při biosyntetické dráze charakteristiky zrna nebo semene. Opylující linie například nese antimediátorový gen, který inhibuje expresi stearoylacylové desaturasy. Antimediátorový gen může být operativně spojen s promotorem, který je specifický pro Rostliny transformované antimediátorovým genem

—⁵ ht *·······' • · · · ·· «· · * · · stearoyl-ACP desaturasy produkují v semenech zvýšené množství stearatu (popisuje se například v publikaci Knutzon et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 2624-2628 (1992)).

Poměr rodičovských semen linie vykazující samčí sterilitu a opylující linie vykazující samčí fertilitu, kultivovaných na poli za účelem produkce semen v souladu s metodou „top křížení, závisí na genovém vybavení každé rodičovské linie a kolísá za účelem optimalizace výtěžku. Poměr linie vykazující samčí sterilitu ku opylující linii vykazující samičí fertilitu je přibližně v rozmezí 6:1 až 9:1. Upřednostňuje se, aby tento poměr byl přibližně 8:1. Více se upřednostňuje poměr 8:1.

Popis obrázků na výkrese

Obrázek č. 1 zobrazuje plazmid PHI5168 kódující avidin, ve kterém kukuřičný promotor ubifeyitinu (zahrnující první exon plus první intron) řídí expresi exportní signální sekvence alfa-amylasy ječmene a oblast kódující avidin.

Obrázek č. 2 zobrazuje plazmid PHI610 kódující gen bar.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava transgenní rostliny kukuřice vykazující samčí sterilitu silnou konstitutivní expresí avidinu.

Způsob tvoření transgenních rostlin kukuřice se popisuje v dokumentu přihlášky Evropského patentu č. 0 442 174. Dále pokračuje popis metodiky.

PHIS168 je vektor nesoucí gen avidinu, který je řízen promotorem ubikv itinu a také obsahuje terminační sekvenci PINII. Tento vektor se použil při přípravě transgenních rostlin kukuřice. Struktura vektoru PHI5168 se uvádí na obrázku č. 1. PHI610, což je expresívní vektor nesoucí gen bar, který řídí dvojitý promotor 35S, a také nese terminační sekvenci PINII, se transformoval spolu s avidinovou konstrukcí, což umožňuje selekci transgenních rostlin tím, že ·· 99 ···· 99 ·· • · · · 9 9 · · · 9 ·

99· ·· 9 9 9 9 9

99···· ······ jS 99999999999

9999 99 99 99 99 99 se ošetří transformační směsí s bialofos. Struktura PHI610 se uvádí na obrázku č. 2. Dva expresívní vektory se tranformovaly do embryogenních suspenzních kultur, které se získaly z embryogenní kuktury typu II podle metody popsané v publikaci

Green et al., Molecular Genetics of Plants and Animals, eds.

Downey et al., Academie Press, NY, 20, 147 (1983) . Kultury se udržovaly v kultivačním médiu Murashige and Skoog („MS), jak se popisuje v publikaci Murashige et al., Physio. Plant 15:

453 (1962), doplněném kyselinou 2,4-dichlorofenoxyoctoveu (2,4 —

D) v koncentraci 2 mg/1 a sacharosou v koncentraci 30 g/1.

Suspenzní kultury prošly 7 dní před experimentem sítem o velikosti pórů 710 mikronů a filtráty se udržovaly v kultivačním médiu MS.

Buňky se sklízely ze suspenzní kultury vakuovou filtrací probíhající za použití Buchnerovy nálevky (Whatman č. 614) a 100 ml (čerstvé hmotnosti) buněk se umístilo na Petriho misku o velikosti 3,3 cm. Buňky se dispergovaly v čerstvém kultivačním médiu o objemu 0,5 ml za vzniku tenké vrstvy buněk. Nezakrytá Petriho miska se umístila do komory přístroje na vystřelování částic vyrobeného firmou Biolistics lne.

(Geneva, NY) . Pro snížení tlaku v komoře na hodnotu 10,13 kPa, za účelem snížení decelerace mikročástic vzdušným třením se použila vakuová pumpa. Buňky bombardované tvolfrámovými částicemi mají průměrnou hodnotu průměru přibližně 1,2 mikronu (GTE SylVťVnia Precision Materials Group, Tovanda, Pennsylvania). Stejné množství směsi vektorů PHI5168 a PHI610 se nanesly na mikročástice tím, že se do 25 μΐ suspenze 50 mg wolframových částic na jeden mililitr destilované vody I v Ependorfově zkumavce o objemu 1,5 ml přidalo 5 μΐ roztoku DNA I (1 pg DNA na 100 lambda) v pufru TE při pH 7,7. Partikule tvoří I agregáty a ve zkumavce sedají na dno. I

Kultury transformovaných rostlinných buněk obsahující I cizorodé geny se kultivovaly po dobu 4 až 8 týdnů I v kultivačním médiu 560R (kultivační médium založené na N6 I

9999 99 1 »9 9· · 999 »9 99 9 9 9 9 » 999 9 999 · 9

99 99 99 « obsahující lmg/ml bialafosu). Toto médium je selekční médium pro buňky, které exprimují gen bar.

Tvorba embryí se pak indukovala v embryogenních kulturách a buňky klíčí za vzniku rostlin. Pro klíčení somatických embryí pozorovaných na udržovacím médiu pro kalus se použily dvě kultivační média. Kalus se nejdříve přenesl na kultivační médium (maturační médium) obsahující 5,0 mg/1 kyseliny indoloctové (IAA) po dobu 10 až 14 dní, zatímco pokračovala»' proliferace kalusu. Kalus se nanesl v množství 50 mg na jednu plotnu, aby se optimalizoval zisk na jednu jednotku hmotnosti materiálu.

Kalus se pak kultivační médium, přenesl z maturačního média na druhé které obsahuje omezené množství IAA (1 mg/ml) ve srovnání s prvním kultivačním médiem. Kultury se umístí v tomto okamžiku na světlo. Klíčící somatická embrya se charakterizovala prodlužováním zelených výhonků, což je spojeno s vývojem kořenů. Somatická embrya se pak přenesla na médium do kultivační zkumavky (150 x 25 mm) na dalších 10 až 14 dní. V tomto čase rostliny dosahují výšky 7 až 10 cm a jsou dostatečné velké a otužilé, aby se mohly přenést do skleníku.

rostlin	se	rostliny
z kořenů	se	opláchlo
umístily	do	běžných
π pro mlžení,	aby se
100 %,	aniž	: dojde

ztuhlé agarové médium. Rostlinky se květníků v růstové komoře se zařízení udržela relativní vlhkost blízko k nadměrnému smáčení kořenů rostlin. Po 3 až 4 týdnech v mlžící komoře byly rostliny dostatečně silné, aby se mohly přenést na pole.

Rostliny na poli se analyzovaly pozorováním samčí sterility. U vybraných rostliny se pak dále zkoumala přítomnost genu avidinu pomocí PCR a Southernova blotování a exprese avidinu testem ELISA za použití standardních metod.

rostlin se analyzovalo pomocí PCR. Zjistilo se, že 53 z nich je plodných a 41 je sterilních. Když se porovnala

plodnost každé rostliny s přítomností genu pro avidin, který se zjistil pomocí PCR, dosáhlo se 98 % korelace mezi přítomností genu a sterilitou rostliny. U 5 rostlin se detailněji zjišťovala přítomnost genu avidinu Southernovým blotováním. Southernova analýza ukázala, že tři rostliny obsahují gen avidinu. Všechny tyto tři rostliny vykazují sterilitu. Dvě rostliny, které nemají gen avidinu byly zcela plodné. Existuje 100 % korelace mezi přítomností genu avidinu a samčí sterilitou.

Příklad 2: Použití kmenů Agroba&terium obsahujίοίΆ binární vektor zahrnující sekvenci DNA kódující avidin, přičemž vznikají transgenní rostliny sóji vykazující samčí sterilitu

Způsob tvoření transgenních rostlin sóji se popisuje v dokumentu v přihlášce US patentu č. 07/920,409. Semeno sóji (Glycine max) odrůdy Pioneer 9341 se povrchově steriloval tak, že se vystavilo působení plynného chlóru, který se vyvíjel ve skleněné nádobě. Plyn vzniká přidáním 3,5 ml kyseliny chlorovodíkové (34 až 37 % hmotn.) ke 100 ml chlornanu sodného (5,25 % hmotn.). Expozice trvá 16 až 20 hodin v nádobách s objemem přibližně 1 kubické stopy. Povrchově sterilizované semeno se uchovává v Petriho misce při teplotě místnosti. Semeno klíží tak, že se umístí na 1/10 ředěného agarové pevné médium podle Gambourg (B5 základní médium s minimálním množstvím organických látek, Sigma katalog. Č. G5893, 0,32g/l sacharosy, 0,2 % (hmotn./objem) 2-(N-morfolino)-ethansulfonová kyselina (MES) (3,0 mM)), aniž se použijí regulátory růstu a kultivace probíhá při teplotě 28 °C, délka dne je 16 hodin, používá se chladné bílé fluorescentní osvětlení o intenzitě přibližně 20 μΕπίΆ“¹ . Po 3 nebo 4 dnech jsou semena připravena pro společnou kultivaci. Odstranil se potah semen. Kořenové prodloužení se odřízlo 3 až 4 mm pod děložními lístky.

Kultury mikroorganizmu Agrobacteri um tumefaciens, kmen LBA4404, které se kultivují přes noc a nesou upravený binární • · (hmotn./objem); 6ovou kyselinu (IBA) o plazmid obsahující gen avidinu, se kultivovaly do dosažení logaritmické fáze v minimálním kultivačním médiu A, které obsahuje tetracyklin v koncentraci 1 gg/ml. Tyto kultury se spojily a zjišťovala se hodnota optické hustoty při vlnové délce 550 nm. Dostatečný objem kultury se umístil do 15 kónických centrifugačních zkumavek o objemu 15 ml tak, že se po sedimentaci v každé zkumavce získalo přibližně 1 až 2 χ IO¹⁰ buněk s koncentrací 10⁹ buněk v jednom mililitru. Po centrifugaci se slije supernatant a zkumavky se uložily při teplotě místnosti až do dalšího použití inokula, ne však déle než 1 hodinu.

Inokulace se provádí tak, že každá plotna semen je ošetřena nově resuspendovaným peletem mikroorganizmů Agrobacterium. Bakteriální pelety se resuspendovaly jednotlivě v objemu 20 ml inokulačního média, které obsahuje sole B5 (G5893) , 3,2 g/1 sacharosy, 2,0 benzylaminopurin (BAP) , 45 μΜ; indol, koncentraci 0,5 μΜ; acetosyringon (AS) o koncentraci 100 μΜ, s upraveným pH na hodnotu 5,5 pomocí MES o koncentraci 10 mM. Resuspendování se dosáhlo zamícháním na vortexu. Inokulum se pak nalilo na Petriho misku obsahující připravená semena a děložní nodusy se zúžily skalpelem. To doprovází podélné rozpůlení semene skrz hrot výhonku, přičemž se zachovaly dvě celé dělohy. Obě poloviny výhonku se pak oddělí, respektive jejich dělohy, tím, že se od sebe páčí skalpelem. Děložní nod se pak ztenčí skalpelem podle osy symetrie. Je nutné dát pozor, aby se neprořízl celý explantát do axiální strany. Explantáty se připravují přibližně 5 minut a pak se inkubují po dobu 30 minut při teplotě místnosti spolu s bakteriemi, aniž dochází k míchání. Po 30 minutách se explantáty přenesou na plotny na stejné pevné médium obsahujícím Geltrite (Merck and Company lne. ) v koncentraci 0,2 % (hmotn./objem). Explantáty se uloží adaxiální stranou nahoru a srovnají se s povrchem média a kultivují se při teplotě 22 °C po dobu 3 • ·

9 9 4 9 4

4 · · · · • · · 4 · · ··· ·· 4 4 44 dnů při chladném bílém fluorescentním osvětlení o intenzitě přibližně 20 pEm’²S^_1'

Po třech dnech se explantáty přenesly do kapalného selekčního média, které obsahuje 3,2 g/1 solí B5 (G5893); 2% (hmotn./objem) sacharosy, 5 μΜ BAP, 0,5 μΜ IBA, 200 μg/l vankomycinu, 500 μg/ml cefotaximu, hodnota pH se upraví MES o koncentraci 3 mM na hodnotu 5,7. Explantáty se promývaly v Petriho misce za konstantního krouživého míchání při teplotě místnosti po doby 4 dní. Selekční médium se vymění čtyřikrát.

Explantáty se pak přenesou do agarosového selekčního média, které obsahuje sole B5 (G5893) o koncentraci 3,2 g/1, 2 % (hmotn./objem) sacharosy, 5,0 μΜ BAP, 0,5 μΜ IBA, 50 μ9/ιη1 sulfátu kanamycinu, 100 μg/ml vankomycinu, 30 pg/ml cefotaximu, 30 pg/ml timentinu. Hodnota pH se upravila 3 mM MES na hodnotu 5,7. Selekční médium se nechá ztuhnout 0,3 % (hmotn./objem) agarosou Seakem. Explantáty se položily do média adaxiální stranou dolů a kultivovaly se při teplotě 28 °C a při délce dne 16 hodin. Svítilo se chladným bílým fluorescentním světlem o intenzitě 60 až 80 μΕΐΐΐ~²3^_:1

Po dvou týdnech se explantáty opět promyly kapalným médiem na míchačce s krouživým pohybem. Promytí se uskutečnilo přes noc v selekčním médiu, které obsahuje sulfát kanamycinu v koncentraci 50 pg/ml. Následující den se explantáty umístily do selekčního média obsahující agarosu. Umístily se adaxiální stranou dolů a kultivovaly se další dva týdny.

Po kultivaci po dobu jednoho měsíce na selekčním médiu je transformovaná tkáň viditelná jako zelené oblasti regenerované tkáně proti pozadí, které tvoří vybledlá nezdravá tkáň. Explantáty bez uvedených zelených oblastí se vyhodí a explantáty se zelenými oblastmi se přenesou na elongační médium, které obsahuje sole B5 (G5893) o koncentraci 3,2 g/1, 2 % (hmotn./objem) sacharosy, IBA o koncentraci 3,3 μΜ, 1,7 μΜ kyseliny giberelové, 100 μ9/πι1 vankomycinu, 30 μς/ml • · · · · · fefefefe fefe ·· • fefefe * · · fefefefe • · · fefe · · · · · • fe fefe· » fefefe fefe · ···♦······· ^λ ······ *· >· ·· >· cefotaximu, 30 μς/ιηΐ timentinu. pH se upravilo 3 mM MES na hodnotu 5,7. Elongační médium je v pevné formě a obsahuje gelrit v koncentraci %,2 % (hmotn./objem). Zelené oblasti se umístí adaxiální stranou nahoru a kultivují se, jak se uvádí shora v textu. Kultivace se provádí na uvedeném médiu a každé dva týdny se kultivovaná tkáň přenese na nové plotny. Když výhonky dosáhnou délky 0,5 cm, odstřihnou se a umístí se na zakořeňovací médium do testovacích zkumavek 13 x 100 ml. Zakořeňovaci médium obsahuje sole B5 (G5893) o koncentraci 3,2 g/1, 15 g/1 sacharosy, 20 μΜ kyselinu nikotinovou, 900 mg/1 kyseliny pyroglutamové (PGA) a 10 μΜ IBA. Zakořeňovací médium se upravilo 3 mM MES na hodnotu pH 5,7 a vyskytuje se v pevné formě obsahující geltrit v koncentraci 0,2 % (hmot./objem). Po deseti dnech se výhonky přenesly do stejného média, které neobsahuje IBA nebo PGA. Výhonky se zakořenily a uchovávaly se ve zkumavkách za stejných podmínek okolí, jako před tím.

Když se kořenový systém dobře vyvinul, tak se rostlinky přenesly do sterilní půdy. Teplota, světelná perioda, intenzita světla zůstávají stejné jako dříve.

Exprese avidinu v transformovaných rostlinách se potvrdila a kvantifikovala za použití testu ELISA a přítomnost genu se potvrdila PCR a Sďthernovým blotováním. Stabilita exprese v následujících generacích rostlin se může hodnotit stejnými způsoby. Zjistilo se, že v sóje problémy sterility korelují s expresí avidinu.

Příklad 3: Příprava rostlin slunečnic vykazující*^' samčí sterilitu expresí avidinu.

Pro přípravu transgenních rostlin slunečnic a semen se použila expresívní kazeta kódující avidin. Sekvence DNA kódující avidin se začlenila do expresívní kazety a řídí je promotor ubikv.^itinu. Tato expresívní kazeta se pak subklónovala do binárního vektoru, jako je PHI 5765 za použití restrikčního místa EcoRI. Binární vektor se pak přenesl do pomocného kmene Agrobacterim tumefaciens.

Rostliny slunečnic se transformovaly mikroorganizmem Agrobacterim tumefaciens kmen LBA4404 po bombardování mikročásticemi, jak se popisuje v publikaci Bidney et al. , Plant Mol. Biol. 18: 301 (1992). Semena slunečnicové linie Pioneer SMF-3 se oloupala a povrchově sterilizovala. Semena jsou uložený na vlhkém filtračním papíře ve tmě při teplotě 26 °C po dobu 18 hodin. Dělohy a kořeny se odstranily a meristémové explantáty se kultivovaly na kultivačním médiu 374BGA (sole MS, vitamíny podle stoephard, 40 mg/1 adeninsulfátu, 3 % sacharosa, 2,8 % fytoagaru pH 5,6 plus 0,5 mg/1 BAP, 0,25 mg/1 IBA a 0,1 mg/1 GA) . O 24 hodin později se odstraní primární listy, aby se odhalil apikální meristém a explantáty se umístí do 2 cm kruhu do středu Petriho misky s vodním agarem o rozměrech 60 mm x 20 mm tak, aby apikální oblouk směřoval nahoru. Explantáty se dvakrát bombardují Wolframovými částicemi, které jsou v suspenzi v TE pufru nebo částicemi spojenými s expresívním plazmidem, který obsahuje gen avidinu. Explantáty meristému se společně kultivují na médiu 374BGA, na světle při teplotě 26 °C, po dalších 72 hodin.

Meristémy ošetřené mikroorganizmem Agrobacterium se pak přenesou na médium 374 ( 374 BGA s 1 % sacharosou, neobsahuje BAP, IAA nebo GA) doplněné 250 μρ/ιηΐ cefotaximu. Rostlinky se nechají vyvíjet další 2 týdny při 16 hodinách světelné periody a teplotě 26 °C až vznikne zelená oblast nebo vybledlá oblast. Rostlinky se přenesou na médium, které obsahuje kanamycin a nechají se růst. Přítomnost avidinu v rostlinách se potvrdí a kvantifikuje, jak se popisuje v příkladu 2. Ukázalo se, že výskyt samčí sterility koreluje s expresí avidinu v rostlinách.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaná molekula DNA obsahující promotor specifický pro prašník operativně spojený s nukleotidovou sekvencí kódující streptavidin.
2. 2. Expresívní vektor obsahující izolovanou molekulu DNA podle nároku 1.
3. 3. Transgenní rostlina, kde tato rostlina obsahuje uvedený expresívní vektor podle nároku 2.
4. 4. Transgenní rostlina podle nároku 3, kde tato rostlina je vybrána ze skupiny zahrnující kukuřici, sóju a slunečnici.
5. 5. Expresívní vektor podle nároku 2, kde nukleotidové sekvence kódující signální sekvenci je operativně spojena s uvedenou nukleotidovou sekvencí kódující streptavidin.
6. 6. Expresívní vektor podle nároku 5, kde uvedená signální sekvence je signální sekvence alfa-amylasy ječmene.
7. 7. Způsob produkce transgenní rostliny vykazující samčí sterilitu, vyznačující se tím, že se do rostlinných buněk zavede expresívní vektor obsahující s rostlinou kompatibilní promotor operativně spojený s nukleotidovou sekvencí kódující streptavidin a transgenní rostlina se regeneruje z uvedených transformovaných buněk, přičemž uvedený promotor řídí expresi uvedeného genu a uvedená exprese genu způsobuje samčí sterilitu uvedené transgenní rostliny.
8. 8. Způsob použití genu streptavidinu při produkci hybridní rostliny vykazující samčí fertilitu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

   (a) produkci první rodičovské rostliny vykazující samčí sterilitu obsahující molekulu DNA, která zahrnuje s rostlinou kompatibilní promotor operativně spojený s nukleotidovou sekvencí kódující streptavidin, přičemž • · · · • · ·· * · · • · · • ft ·· • · · · · • ftft·· • · · ftft · ft ftftftft • ftft ftft exprese uvedeného streptavidinu způsobuje samčí sterilitu, (b) produkci druhé transgenní rodičovské rostliny exprimující druhý cizorodý gen a (c) křížení uvedeného prvního rodiče s uvedeným druhým rodičem, přičemž vzniká hybridní rostlina, kde tato rostlina exprimuje uvedený druhý cizorodý gen a kde produkt uvedeného druhého cizorodého genu snižuje v uvedené hybridní rostlině expresi streptavidinu, přičemž vzniká hybridní rostlina vykazující samčí fertilitu.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedený druhý cizorodý gen je vybrán ze skupiny zahrnující antimediátorový gen, ribozymální gen a gen externí průvodní sekvence.
10. 10. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že uvedená molekula DNA uvedené první rodičovské rostliny dále obsahuje operátor LexA, který je operativně spojen s uvedeným promotorem a kde uvedený druhý cizorodý gen je gen represoru LexA.
11. 11. Způsob produkce semen, které vykazují požadovanou charakteristiku zrna, vyznačující se tím, ž e zahrnuje:

    (a) produkci první rodičovské rostliny, která vykazuje samčí sterilitu a obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující streptavidin operativně spojenou se sekvencí promotoru, jenž je kompatibilní s rostlinou, (b) produkci druhé rodičovské rostliny, která vykazuje samčí fertilitu a nese jeden nebo více genů řídících požadovanou charakteristiku zrna, (c) křížení uvedeného prvního rodiče s uvedeným druhým rodičem za vzniku hybridních semen s uvedenou charakteristikou zrna a (d) sklizeň uvedených semen.

    φφφφ

    Φ· 94 ·* • φ · · Φ ·

    ΦΦΦ · Φ φ · ΦΦ· Φ

    ΦΦΦ Φ · φφφφ ΦΦ Φ·

    ΦΦ ΦΦ Φ ΦΦΦΦ • ΦΦΦΦ

    ΦΦΦ Φ Φ Φ Φ · Φ φ Φ • ΦΦ ΦΦ
12. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, ž e uvedená první rodičovská rostlina je hybridní rostlina.
13. 13. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, ž e uvedená charakteristika zrna je vybrána ze skupiny zahrnující obsah oleje, proteinu a škrobu.
14. 14. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedená první a druhá rostlina je vybrána ze skupiny obsahující kukuřici, sóju, kanolu a slunečnici.
15. 15 Způsob podle nároků 8 nebo 11, vyznačující se tím, že uvedená sekvence promotoru kompatibilního s rostlinou je sekvence promotoru specifického pro prašník obsahující prašníkový box vybraný ze skupiny zahrnující:

    (a) molekulu DNA vykazující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1, (b) molekulu DNA vykazuj ící nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: ²' (c) molekulu DNA vykazuj ící nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 3, (d) funkční : fragment molekul . DNA popsaných v odstavci (a),

    (b) nebo (c).
16. 16.Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, ž e uvedený prašníkový box má nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 1 a uvedený promotor specifický pro prašník dále obsahuje jaderný promotor vybraný ze skupiny zahrnující:

    (a) jaderný ; promotor CaMV 35S 9 (b) molekulu v SEQ ID DNA vykazující nukleotidovou sekvenci uvedenou NO: 4, 4 (c) molekulu v SEQ ID DNA vykazující nukleotidovou sekvenci uvedenou NO: 5, (d) molekulu v SEQ ID DNA vykazující nukleotidovou sekvenci uvedenou NO: 6 a (e) funkční fragment molekul DNA popsaných v odstavci (b),

    (c) nebo (d).

    99 9999 ·· 99

    9 9 9 9 9 9

    9*9 99 « 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9

    9999 99 99

    99 99

    9 9 · 9 • 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9

    99 99 »9
17. 17. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedený prašníkový box má nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 2 a uvedený promotor specifický pro prašník dále obsahuje jaderný promotor vybraný ze skupiny zahrnuj ící:

    (a) jaderný promotor CaMV 35S,

    (b) molekulu v SEQ ID DNA NO : vykazuj ící 4, nukleotidovou sekvenci uvedenou (c) molekulu DNA vykazuj ící nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 5, (d) molekulu DNA vykazuj ící nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 6 a

    (e) funkční fragment molekul DNA popsaných v odstavci (b), (c) nebo (d).
18. 18. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedený prašníkový box má nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO: 3 a uvedený promotor specifický pro prašník dále obsahuje jaderný promotor vybraný ze skupiny zahrnuj ící:

    (a) j aderný promotor CaMV 35S, (b) molekulu DNA vykazuj ící nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 4, (c) molekulu DNA vykazuj ící nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 5, (d) molekulu DNA vykazuj ící nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 6 a

    (e) funkční fragment molekul DNA popsaných v odstavci (b), (c) nebo (d).