JPH03504806A

JPH03504806A - 変更された花、種又は胚芽をもつ植物

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Publication number: JPH03504806A
Application number: JP2511721A
Authority: JP
Inventors: ドゥ・グリフ，ウィリー; ファン・エメロ・ヨハン; デ・オリヴェイラ・デュルセ・エレオノラ; ドゥ・スザ，マリア―ヘレナ; ファン・モンターグ，マルク
Original assignee: プラント・ジェネティック・システムズ・エヌ・ブイ
Priority date: 1989-08-04
Filing date: 1990-08-01
Publication date: 1991-10-24
Anticipated expiration: 2016-03-07
Also published as: ES2152208T3; PT94905B; ZA906179B; IE902830A1; EP0412006B1; JP3143120B2; DE69033667T2; DK0412006T3; IL95267A0; GR3035206T3; WO1991002068A1; ATE197816T1; AU6273390A; IL95267A; DE69033667D1; PT94905A; CA2038933A1; EP0412006A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】４、前記外来性ＤＮＡは同様に、好ましくは前記雌性不稔ＤＮＡと同じ遺伝子座の中に、（ｃ）前記植物の少なくとも特定の細胞又は少なくとも特定の組織の中に存在するとき、同じ第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを少なくともこの特定の細胞又は特定の組織内に含んでいないその他の植物からこの植物を容易に分離できるようにするような第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化する標ｍＤＮＡ、及び（ｄ）少なくとも前記特定の細胞又は特定の組織の中で前記標識ＤＮＡの表現を誘導することのできる第２のプロモータ（なおこの標ｗｉＤＮＡはこの第２のプロモータと同じ転写単位内にあり、このプロモータの制御下にある）も含む、請求の範囲１乃至３のいずれか１項に記載の細胞。

５、前記外来性ＤＮＡ配列にはさらに、（ｅ）前記タンパク質又はポリペプチドを前記植物の花、種子又は胚芽の細胞の葉緑体又はミトコンドリアの中に移送することのできるトランジットペプチドをコード化する第１のＤＮＡ　（なおこの第１のＤＮＡは、雌性不稔ＤＮＡ及び前記第１のプロモータと同じ転写単位内しかもこの雌性不稔ＤＮＡとこの第１のプロモータの間にある）；及び／又は、（ｆ）少なくとも前記特定の細胞又は特定の組織の葉緑体又はミトコンドリア内に前記第２のタンパク質又はポリペプチドを移送することのできるトランジットペプチドをコード化する第２のＤＮＡ、（なおこの第２のＤＮＡは、前記標ｗｉＤＮＡ及び前記第２のプロモータと同じ転写単位内しかもこの標識ＤＮＡ及び第２のプロモータの間にある）が含まれている、請求の範囲ｌ乃至４のいずれか１項に記載の細胞。

６、前記外来性ＤＮＡ配列にはさらに、（ｇ）前記植物の花、種子又は胚芽の前記細胞の外で前記第１のタンパク質又はポリペプチドを分泌することのできる分泌シグナルペプチドをコード化する第３のＤＮＡ　（なおこの第３のＤＮＡは前記雌性不稔ＤＮＡ及び前記第１のプロモータと同じ転写単位内しかもこの雌性不稔ＤＮＡとこの第１のプロモータの間にある）；及び／又は、（ｈ）少なくとも前記特定の細胞又は特定の組織の外で前記第２のタンパク質又はポリペプチドを分泌することのできる分泌シグナルペプチドをコード化する第４のＤＮＡ、（なおこの第４のＤＮＡは、前記標識ＤＮＡ及び前記第２のプロモータと同じ転写単位内しかもこの標識ＤＮＡと前記第２のプロモータの間にある）が含まれている、請求の範囲１乃至５のいずれか１項に記載の細胞。

７、前記雌性不稔ＤＮＡが、ＲＮＡ分解酵素特にＲＮＡ分解酵素Ｔ１又はバルナーゼ、ＤＮＡ分解酵素特にエンドヌクレアーゼ特にＥｃｏＲＩ　；たん白質分解酵素特にパパイン特にババインジモーゲン又はパパイン活性タンパク質；グルカナーゼ；リパーゼ特にホスフォリパーゼＡ、；脂質ペルオキシダーゼ；細胞壁阻害剤；細菌性毒素；又はリボシーム；特にＳＴＭＧタイプの遺伝子のいずれか、ＫＴ１３遺伝子、２Ｓアルブミンといった種子特異的貯蔵タンパク質をコード化する遺伝子又はｃＤＮＡクローンｐＭＯＮ９６０８に相応する遺伝子によりコード化されるｍＲＮＡに対するリボシームをコード化すること、前記雌性不稔ＤＮＡは、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）特にＴ２又はＲｈをコード化し、特にＮ１ｃｏｔｉａｎａ　ａｌａｔａのＳｌ、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ６又はＳ７対立遺伝子によりコード化される糖タンパク質をコード化するか、又はアンチセンスＤＮＡ特にＳＴＭＧ型遺伝子、ＫＴＩ３遺伝子、２５アルブミンといった種子特異的貯蔵タンパク質をコード化する遺伝子又はｃＤＮＡクローンｐＭＯＮ９６０８に相応する遺伝子のアンチセンスＤＮＡである、請求の範囲ｌ乃至６のいずれか１項に記載の細胞。

８、前記雌性不稔ＤＮＡが、植物ホルモンの合成に触媒として作用する酵素特にＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａの遺伝子１、遺伝子２又は遺伝子４によりコード化される酵素又代替的には、組団悪…ｒｉｕｍＴ−ＤＮＡ（７）遺伝子及び遺伝子２によりコード化される酵素を特徴とする請求の範囲１乃至６のいずれか１項に記載の細胞。

９、前記雌性不稔ＤＮＡは、ウィルス依存性ＲＮＡポリメラーゼ特にＴＮＶＮプレカーゼを前記第１のプロモータの制御下で、又前記第１のタンパク質又はポリペプチドをコード化する遺伝子の負鎖なコード化すること、又この遺伝子は細胞内での前配負鎖の表現を誘導することのできるもう１つの第１のプロモータと同じ転写単位内にありこのプロモータの制御下にあること、さらにこの遺伝子は、前記ウィルス依存性ＲＮＡポリメラーゼにより特異的に認識されるＴＮＶサブゲノミックブロモータといったウイルスサブゲノミックブロモータに対しその３° 末端にて融合されていることを特徴とする請求の範囲１乃至６のいずれか１項に記載の細胞。

１０、前記標識ＤＮＡが、除草剤抵抗性遺伝子特にｓｆｒ又は５ｆｒｖ遺伝子；除草剤に対しより低い親和力を有する除草剤に対する変更された標的酵素特にグリフォセートの標的としての変更５−エノルビルビルシキメートー３リン酸塩シンターゼ又はフォスフイノトリシンといったグルタミンシンセターゼ阻害剤の標的としての変更グルタミンシンセターゼをコード化する遺伝子；少な（とも前記特定の細胞又は特定の組織に対し色を付与するタンパク質又はポリペプチドをコード化する遺伝子特に遺伝子Ａ１又はＧＵＳ遺伝子；前記植物に対してストレス許容性を付与するタンパク質又はポリペプチドをコード化する遺伝子特にＭｎ− スーパーオキシドディスムターゼをコード化する遺伝子；又は疾病又は有害生物抵抗性を付与するタンパク質又はポリペプチドをコード化する遺伝子特に虫害抵抗性を付与するＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓ内毒素をコード化する遺伝子又は細菌抵抗性を付与する殺菌ペプチドをコード化する遺伝子である、請求の範囲４乃至９のいずれか１項に記載の細胞。

１１、前記第１のプロモータが、ＰＳＴＭＧＯ７、ＰＳＴＭＧＯ８、ＰＳＴＭＧ４Ｂ１２又はＰＳＴＭＧ３Ｃ９，Ｓ遺伝子といった自家不和合性遺伝子から誘導されたプロモータ、ＫＴ１３遺伝子のプロモータ；種子特異的貯蔵タンパク質をコード化する遺伝子のプロモータ例えばＦＡＴ２Ｓプロモータ；ＣＤＮＡクローンｐＭＯＮ９６０８に相応する遺伝子のプロモータ；又は、それぞれｉ）ＳＴＭＧ型遺伝子又はＳ遺伝子、１ｉ）ＫＴ１３遺伝子、１ｉｉ）ＡＴ２Ｓ遺伝子又は１ｖ）ｃＤＮＡクローンｐＭＯＮ９６０８に対し雑種形成することのできるｉ）花柱−柱頭特異的、ｉｉ）胚芽軸持異的、ｉｉｉ　）種子特異的又はｉｖ）胚珠特異的ｍＲＮＡに対してコード化するＤＮＡのプロモータである、請求の範囲１乃至１０のいずれか１項に記載の細胞。

１２、第２のプロモータが、構成プロモータ特に３５Ｓプロモータ、３５Ｓ’３プロモータ、ＰＮＯＳプロモータ又はｐｏｃｓプロモータ：創傷誘発性プロモータ特にＴＲＩ’又はＴＲ２°プロモータ；光合成活性をもつ植物組織内で選択的に遺伝子表現を誘導するプロモータ特にＳＳＵプロモータ；又は、葉細胞、花弁細胞又は種子細胞特に種皮細胞内で選択的に遺伝子表現を誘導するプロモータである、請求の範囲４乃至１１のいずれか１項に記載の細胞。

１３、前記外来性ＤＮＡ配列で形質転換された前記植物の２倍体又は１倍体細胞の培養から得られ、同型接合植物として前記植物を再生するのに用いることができ、及び、特に、前記第１のプロモータは、ｉ）胚珠といった雌生殖体の細胞内で特にこの細胞の減数分裂の後に、又はｉｆ）種子又は胚芽の細胞といった前記雌生殖体細胞から誘導された細胞内で、選択的に前記雌性不稔ＤＮＡの表現を誘導することができる、請求の範囲１及び３乃至１２のいずれか１項に記載の細胞。

１４、特にｐＭＧｌｏｏ、ｐＭＧ　Ｉ　Ｏ１，９ＭＧ１０２、ｐＭＧ　１０３、ｐＭＧ　１０４又は９ＭＧ１０５といった、請求項１乃至１３のいずれかの前記外来性ＤＮＡ配列を含む、植物特にＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの感染を受けることのできる植物の細胞を形質転換させるのに適したベクター。

１５、その細胞の核ゲノム内に安定した形で統合された状態で請求の範囲ｌ乃至１３のいずれか１項の前記ＤＮＡ配列をもつ雌性不稔植物及びこの植物の再生物質を生産する方法において、かくしてこの雌性不稔ＤＮＡは前記植物の花特に難詰又は種子又は胚芽の細胞内で選択的に表現されこの細胞内で前記第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを生産することができるものとなること、又前記標識ＤＮＡは前記植物の前記特定の細胞又は特定の組織内で表現されこの植物を未形質転換植物から分離できるものにすること、ならびにａ）前記外来性ＤＮＡ配列を前記細胞の核ゲノム内に導入することによって前記植物の細胞を形質転換させる段階、及び次にｂ）この植物及び生殖物質を前記細胞から再生する段階という非生物学的段階が含まれていることを特徴とする方法。

１６、請求の範囲１乃至１３のいずれか１項の植物細胞を含む植物細胞培養。

１７、Ｍ求の範囲１乃至１３のいずれか１項の植物細胞を含む植物。

１８、請求の範囲１７の植物の果実、特に種無し果実。

１９、交雑種子又は種無し果実を生産するための方法において、ａ）好ましくは前記プロモータ及び前記標識ＤＮＡ特に除草剤に対する抵抗性を付与する前記標識ＤＮＡ特にｓｆｒ又は５ｆｒｖ遺伝子を含む請求の範囲１乃至１３のいずれかの外来性ＤＮＡ配列をこの雌性不稔植物の細胞の核ゲノム内に安定した形で統合された状態で含む雌性不稔雄性稔性の植物、を、ｂ）ｉ）その雄すい細胞内で生産又は過剰生産されたときこの雄すい細胞の代謝、機能及び／又は発育を著しく混乱させ、かつこの雄ずい細胞内で選択的に雄性不稔ＤＮＡの表現を誘導することのできるプロモータと同じ転写単位内にありこのプロモータの制御下にある第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化する雄性不稔ＤＮＡ及び、ｉｉ）オプションとして、同じ遺伝子座内でもう１つの標識ＤＮＡ及びそのプロモータ好ましくは前記標識ＤＮＡと前記第２のプロモータ、を安定した形で統合された状態で中に含む核ゲノムを有する雄性不稔雌性稔性植物と他家受粉させる段階、を特徴とする方法。

２０、前記第１のプロモータは、花又は胚芽特に花の細胞の中で選択的に前記雌性不稔ＤＮＡの表現を誘導することを特徴とする請求の範囲１９の方法によって得られた交雑種子。

２１、請求の範囲２０の交雑種子を栽培することによって得られた交雑植物。

２２．前記第１のプロモータは種子の細胞内で前記雌性不稔ＤＮＡの表現を誘導することを特徴とする請求の範囲１９の方法により得られた種無し果実。

２３、Ｍ求の範囲１１の第１のプロモータ、特にＰＳＴＭＧＯ７、ＰＳＴＭＧＯ８、ＰＳＴＭＧ４Ｂ１２又はＰＳＴＭＧ３Ｃ９゜２４、前記雌性不稔ＤＮＡは天然では前記第１のプロモータの制御下になく及び／又は天然では前記標識ＤＮＡと同じ遺伝子座の中には見られないこと、特に前記第１のＤＮＡ又は前記第３のＤＮＡは、天然では前記第１のプロモータと前記雌性稔性ＤＮＡの間にはないことを特徴とする請求の範囲１乃至１３のいずれかの外来性キメラＤＮＡ配列。

２５、ＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを中で表現することができ核ゲノムの中に安定した形で統合された外来性遺伝物質を含む植物及び種子といったこの植物の生殖材料を生産するため又はこの植物の果実を生産するための方法において、ａ）前記ＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを表現しない出発植物細胞又は植物組織から前記外来性遺伝物質を含む前記植物の形質転換された細胞又は組織を生産する段階、ｂ）前記外来性遺伝物質を含む前記形質転換された植物細胞又は植物組織からこの植物の再生植物又は生殖物質又はその両方を生産する段階という非生物学的段階、及びＣ）オプションとして前記再生植物又は生殖物質又はその両方を生物学的に複製する段階を含むような方法であって、前記遺伝物質を含む前記形質転換された植物細胞又は植物組織を生産する段階は、請求の範囲１乃至１３のいずれか１項の外来性ＤＮＡ配列ならびに前記植物細胞又は植物組織内での前記外来性ＤＮＡ配列の表現を可能にし形質転換された植物細胞又は植物組織内ならびにそれに統（世代全体を通してこれから生産された植物及び生殖物質の中での前記外来性ＤＮＡ配列の安定した統合をひき起こすことのできる調節要素で、前記出発植物細胞又は植物組織の核ゲノムを形質転換することによって特徴づけられることを特徴とする方法。

明細書変更された花、種又は胚芽を持つ植物本発明は、外来性ＤＮＡ配列がその核ゲノム内に安定した形で統合されるように細胞が形質転換された雌性不稔植物及びその生（繁）殖性物質（例えば種）に関する。本発明の外来性ＤＮＡ配列は、１）植物の花、特にその難詰又は種子又は胚芽の細胞内で生産又は過剰生産された場合に、この花又は種子又は胚芽の細胞の代謝、機能及び／又は発育を著しく混乱させるような第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化し、２）前記植物の花、特にその単数又は複数の難詰又は種子又は胚芽の細胞内で選択的に雌性不稔ＤＮＡの発現を誘導することができる第１のプロモータと同じ転写単位内にありこのプロモータの制御下にあるような第１の外来性ＤＮＡ　（以下「雌性不稔ＤＮＡＪと呼ぶ）を含む。特に本発明は、これに基づく外来性ＤＮＡ配列が、１）植物の特定の細胞又は組織内に少なくとも存在する場合にこの植物全体を少なくともこの特定の組織又は細胞内に第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを含まないその他の植物から容易に分離できるものにするような第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化し、２）植物の特定の細胞又は組織内で標識ＤＮＡの表現を誘導することのできる第２のプロモータと同じ転写単位内にありかつこのプロモータの制御下にあり、３）雌性不稔ＤＮＡと同じ植物細胞核ゲノムの遺伝子座内にあるような第２の外来性ＤＮＡ（ｒ標識ＤＮＡＪ　）をも含みつる１つの外来性キメラＤＮＡであるような核雌性不稔植物及びその生殖物質に関する。　本発明は同様に、少なくとも１つの第１のプロモータの制御下にある少な（とも１つの雌性不稔ＤＮＡを含み、しかも、雌性不稔ＤＮＡ及び第１のプロモータに隣接して少な（とも１つの第２のプロモータの制御下で少なくとも１つの標識ＤＮＡも含みつるような外来性キメラＤＮＡ配列にも関する。

本発明はさらに、本発明に基づ（外来性ＤＮＡ配列を含み植物細胞の形質転換に適しており、か（してこの外来性ＤＮＡ配列は細胞の核ゲノム内に安定した形で統合されることになるようなベクターにも関する。

本発明はさらに、外来性ＤＮＡ配列で形質転換された核ゲノムを有する１つの植物の細胞及び植物細胞培養にも関する。

本発明はさらに、雌性不稔ＤＮＡは１）第１のプロモータの制御下にあり、２）植物の細胞の核ゲノム内に安定した形で統合され、３）第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの形で植物の花、特にその雌器又は各々の種子又は各々の胚芽の細胞内で表現され得、要すれば４）第２のプロモータの制御下で標識ＤＮＡと同じ遺伝子座内にあることを特徴とする外来性ＤＮＡ配列を含む核雌性不稔雄性捻性植物及びその生殖物質の生産方法にも関する。

本発明はさらに、１）好ましくは植物に対し除草剤に対する抵抗性を付与するタンパク質をコード化する標識ＤＮＡをその核ゲノム中に含んでいる可能性のある本発明に基づ（雌性不稔植物と、２）そのゲノム内に標識ＤＮＡの無い雌性稔性植物を交配することによる、成長して雑種植物になるような雑種種子の生産方法にも関する。本発明は特に、商業的規模で特にほぼ無作為の個体群で、広範な手仕事を必要とせずに雑種種子を生産するための方法に関する。

ｌ豆立１１植物の雑種形成は、親株の望ましい形質の組合せをもつ子を生産するための重要なプロセスとして認められている。結果として得られた雑種の子は往々にして、収量、環境変化に対する適応能力及び疾病抵抗性といったさまざまな形質において、親株をしのぐ能力をもつ。この能力は「ヘテロシス（雑種強勢）又は「ハイブリッド・ヴイガー（雑種強勢）」と呼ばれる。その結果、雑種形成は、トウモロコシ、さとうきび及びひまわりといった主要作物を改良するために広く用いられてきた。主としてほとんどの植物が自家受粉及び他家受粉の両方を受けることができるという事実に関連する数多くの理由から、雑種種子の収穫物を生産するためさほど自家受粉無しに植物の他家受粉を制御することは、商業的規模では達成し難いことであった。

自然界においては、作物植゛物の大部分は同じ植物上、通常は同じ花の中で互いに近いところに、雄性及び雌性の生殖器を生成する。これは自家受粉に有利に働く。しかしながらいくつかの植物は、他家受粉に有利に作用するその生殖器の特別な形態の結果、その例外となっている。これらの植物は、改良された雑種強勢及び適応能力をもつ雑種の子孫を生成する。Ｃａｎｎａｂ組」社、　　（大麻）におけるこのような形態の１つでは、別々の植物に雑器と難詰がある。　Ｚｅａ　ｍａｙｓ　（とうもろこし）におけるもう１つのこのような形態には、同一植物の異なる部分に雑器及び難詰がある。　Ｅｌａｅｉｓ旺江並匹旦（ギネアアブラヤシ）におけるもう１つのこのような形態には、植物の発達の中の異なる時期に稔性となる雄性及び稔性雌性の生殖体がある。

Ａｎａｎａｓ　ｃｏｍｏｓｕｓ　（パイナツプル）といったその他のいくつかの植物種は、その生殖器の特殊な生理学を通して他家受粉に有利に作用している。

このような植物は、１つの植物の花粉が同じ植物の又は同じ遺伝子型をもつ他の植物の雌生殖体と受精できないようにするいわゆる「自家不和合性システム」を発達させている。

その他のいくつかの種は、いわゆる「雄性不稔」のゲノム特性を自然に示すことにより、他家受粉に有利に作用する。この特性により、植物のめ（や（）は、巧が生成した花粉が成熟してしまわないうちに退化する。「背の高い植物における雄性不稔Ｊ　、Ｍ、　Ｌ。

Ｈ，Ｋａｕｌ　ｌＨ７年（理論及び応用遺伝学研究書１０゜Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｖｅｒｌａｇ出版）を参照のこと。このような天然の雄性不稔特性は、劣性欠失が関与することが最も多い広範な天然の突然変異の結果として生じるものと考えられており、天然の条件下ではいかなる種子も生成されないことから優性的に自家受粉する植物種においてはこの特性を維持することは容易でない。

その他のいくつかの植物は、雌性配偶体、雌性生殖体、雌性接合体又は種子のいずれかの機能不全のために「雌性不稔」特性を自然に示すことによって、他家受粉に有利に作用している。これらの植物は生存種子を全（生産しない。雌生殖器の特定の組織の全ての発育段階が関与する数多くの異なる突然変異がこの条件を導き出し得る。この特性により、雄性不稔は、より広（知られている雌性不稔及び自家不和合性といった現象と区別される。１つの種が生産できる子孫の数を減少させるものの、雌性不稔形質はいくつかの植物特に多年生植物にとって自然の中でのいくつかの進化面の利点を有している。多年生植物においては、栄養成長速度は植物の栄養組織と生殖組織の間のバイオマス（生物体積）の分布によって六方決定される。従って雌性不稔植物は、雌性稔性植物に比べより勢いよく成長する傾向をもつ。

雌性不稔を誘発する突然変異は恐らく雄性不稔を誘発する突然変異と同じように頻繁に起こると思われるが、雌性不稔誘発突然変異は、植物育種及び種子生産において使用されることが比較的少なく、従って研究もはるかに少なく、このような突然変異の例はわずかじか存在しない。

自然の雌性不稔についての１つの詳しい例示資料は、いわゆるｒ　ｐｉｓｉｆｅｒａＪ条件が、発育中の種子が外皮を生成できないことをその特徴としているようなギネアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ　　ｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）についてのものである。その結果、発育中の種子は早い時期に流産し、熟した果実は全く形成されない。ｒ　ｐｉｓｉｆｅｒａＪ遺伝子型をコード遺伝石型伝子は、半価性対立遺伝子として作用する。対立遺伝子に対して同型接合の植物は、種子の外皮を生成することができず、従って成熟した果実も種子も全く生成できない。対立遺伝子に対して異型接合体の植物は、薄い外皮（０，５〜２　ｍｍ）を有する種子及び成熟した果実を生成するが、一方針生型植物（対立遺伝子をもたない）は、厚み２ｍｍから６ｍｍの外皮をもつ種子及び成熟した果実を生み出す。

これら２つの遺伝子型は種子収量においては識別不能であり、その遺伝子型は雌性親株の遺伝子型によって決定される。あぶらやしの育種においては、あらゆる商業的種子生産において雄性親株としてｒ　ｐｉｓｉｆｅｒａＪ型が用いられる。ｒｐｉｓｉｆｅｒａＪヤシからの花粉を野生型の雌性親株と交配することにより、薄い外皮の果実を生成する均質のＦ１雑種種子の個体群が得られる。

雑種種子の商業的生産に用いられる、自然の雌性不稔をもつ植物のもう１つの例としては、アルファルファがある。アルファルファは、雄性不稔遺伝子を有するものとして知られていたが、雄性不稔及び雄性稔性の植物を別々の帯状に播いた雑種種子生産システムのテストに際し、無視できる量の雑種種子が生成されるように思われた。この低生産量は、受粉を担うミツ蜂が雄性不稔植物に対し低い親和力しかもたず、雄性不稔植物の自家受粉に有利に働いたせいであった。

すぐれた結実度を得るには、雄性稔性及び雄性不稔の親株を互いにきわめて密に混植する（従って別のうねにではなく）ことが必要であると思われた。このことは、雌性不稔遺伝子が発見され雄性不稔植物内に交配されたときに可能となった。従って、無作為に播かれた画地内で生産されつる唯一の種子は、雌性不稔及び雄性不稔親株の間の他家受粉により得られた雑種種子であった。

その他の作物については、雌性不稔が報告されている。例えばモロコシ類（Ｃａｓａｄｙ他、（１９６０年）Ｊ。

Ｈｅｒｅｄ、　５１．３５−３８）　、綿花（ＴｕｓｔｕＳ及びＭｅｙｅｒ共著（１９６３年）　Ｊ、　Ｈｅｒｅｄ、　５４．１６７−１６８）、トマト　（Ｈｏｎｍａ及びＰｒａｔａｋ　（１９６４年）Ｊ、　Ｈｅｒｅｄ、５５，１４３− １４５）　、小麦（Ｇｏｔｚｏｖ及びＤｚｅｌｅｐｏｖ　（１９７８年）　Ｇｅｎ、　Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄ２、４８０−４８７）及びトウジンヒエ（Ｈａｎｎａ及びＰｏｗｅｌ共著、Ｊ、　Ｈｅｒｅｄ、　６５．２４７−２４９）。しかしながら、雌性不稔系統を維持するにはいくつかの問題点があり、この理由のため、このような系統は商業的に大きい規模で使用されないのである。

雄性不稔性に比べると、雌性不稔は雑種種子の生成においていくつかのその他の利点を提供する。雌性不稔は、種なし果実の生産及び栄養バイオマス生産量の向上を可能にし、いくつかのケースにおいては１つの季節内でより多くの着花を誘発することができる。

及皿立１刀本発明に従うと、安定した形で中に統合された状態で外来性ＤＮＡ配列好ましくはキメラＤＮＡ配列を含む核ゲノムを有する植物の細胞において、ａ）前記植物の花、特にその難詰又は種子又は胚芽の細胞内で生産又は過剰生産された場合にこの細胞の代謝、機能及び／又は発育を著しく混乱させる、第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化する雌性不稔ＤＮＡ、ｂ）前記植物の花、特にその難詰又は種子又は胚芽の細胞内で選択的に雌性不稔ＤＮＡの表現を誘導することのできる第１のプロモータ（なお雌性不稔ＤＮＡはこの第１のプロモータと同じ転写単位内にあり、このプロモータの制御下にある）を特徴とする植物細胞が提供される。

形質転換された細胞の核ゲノム内の外来性ＤＮＡ配列は同様に、好ましくは雌性不稔ＤＮＡと同じ遺伝子座においてＣ）植物の少なくとも特定の細胞又は特定の組織の中に存在するとき、同じ第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを少なくともこの特定の細胞又は組織内に含んでいないその他の植物からこの植物を容易に分離できるようにするような第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化する標識ＤＮＮＡ　、及びｄ）少なくとも特定の細胞又は特定の組織の中で標識ＤＮＡの表現を誘導することのできる第２のプロモータ（なおこの標識ＤＮＡはこの第２のプロモータと同じ転写単位内にあり、このプロモータの制御下にある）も含むことができる。

同様に、本発明に従うと、雌性不稔ＤＮＡ及び第１のプロモーターを含みかつ標識ＤＮＡ及び第２のプロモータならびに、外来性キメラＤＮＡ配列がその細胞質内で表現されるような植物細胞の葉緑体又はミトコンドリア内に第１のタンパク質又はポリペプチド及び／又は第２のタンパク質又はポリペプチドを輸送することのできるトランジットペプチド：及び／又は外来性キメラＤＮＡ配列が中で表現される植物細胞又は植物組織から第１のタンパク質又はポリペプチド及び／又は第２のタンパク質又はポリペプチドを分泌することのできる分泌シグナルペプチドをコード化する少な（とも１つの付加的なりＮＡをも含むことができる外来性キメラＤＮＡ配列が提供される。

さらに本発明に従うと、各々外来性ＤＮＡ配列な含む細胞から成る雌性不稔雄性稔性植物及び植物細胞培養；雌性不稔植物の果実；雌性不稔植物を雌性不稔植物と交配させることによって生成される雑種種子及び植物；及び、このような雑種種子ならびに種なし果実の生産方法、も提供される。

さらに、本発明に従うと、花柱、柱頭、子房及び胚芽に特異的な第１のプロモータが提供される。

及豆立二遡左ｊ１本発明に従うと、本発明に基づく外来性ＤＮＡ配列を細胞の核ゲノム内に安定した形で挿入するため周知の方法で植物細胞を形質転換することにより植物の単一細胞から雌性不稔雄性稔性植物が生産される。この外来性ＤＮＡ配列は、第１のプロモータの制御下にありこのプロモータに対しその５°末端で融合されており、しかも、ポリアデニル化シグナルを含む適当な転写終止（又は調節）シグナルに対してその３°末端に融合されているような少な（とも１つの雌性不稔ＤＮＡを含んでいる。従って、第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドは、植物を雌性不稔にするため植物の全ての胚芽内及び／又は全ての種子内及び／選択的に生産又は過剰生産される。外来性ＤＮＡ配列は同様に、第２のプロモータの制御下にありこのプロモータに対しその５°末端で融合されしかもその３゜末端においてポリアデニル化シグナルを含む適当な転写終止シグナルに融合されている少なくとも１つの標識ＤＮＡをも含みうる。標ｍ　Ｄ　Ｎ　Ａは好ましくは雌性不稔ＤＮＡと同じ遺伝子座内にあり、従って第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドは、特定の組織又は特定の細胞内に第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを含まないその他の植物からこの植物を容易に識別及び／又は分離させることができるように雌性不稔植物の少なくとも特定の組織又は特定の細胞内で生成される。こうして、植物の子孫内への雌性不稔ＤＮＡ及び標識ＤＮＡの両方の合同分離が、高い確実性で保証されることになる。

植物の細胞（特にＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに感染しつる植物）は、好ましくは本発明に従うと、外来性ＤＮＡ配列を含みＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが運んでいる安全化（武装解除）されたＴｆ−プラスミドである１つのベクターを用いて形質転換される。この形質転換は、例えば欧州特許公報０１１６．７１８号及び０２７０８２２号に記されているような手順を用いて行なうことができる。好ましいＴｉ−プラスミドベクターは、周縁配列の間又は少なくともＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡの右縁配列の左側に位置づけられた形で、外来性ＤＮＡ配列を含む。当然のことながら、例えば直接遺伝子移入（例えば欧州特許公報０，２２３，２４７号に記載のもの）、花粉媒介形質転換（例えば欧州特許公報０．２７０，３５６号、ＰＣＴ公報ＷＯ８５１０］、　８５６及び欧州特許公報０，２７５，０６９に号に記されているもの）、生体外原形質体形質転換（例えば米国特許４６８４６１１号に記されているもの）、植物ＲＮＡウィルス媒介形質転換（例えば欧州特許公報０．０６７．５５３号及び米国特許４．４０７，９５６号に記載のもの）、及びリボゾーム媒介形質転換（例えば米国特許４５３６４７５号に記載のもの）といった手順を用いて、その他のタイプのベクターを植物細胞の形質転換のために用いることもできる。

好ましくは、本発明に基づく核雌性不稔雄稔性植物は、第１のプロモータの制御下にある雌性不稔ＤＮＡ及び好ましくは第２のプロモータの制御下にある標識ＤＮＡを伴う外来性ＤＮＡ配列を含む安全化されたＴｉ−プラスミドベクターを用いて植物細胞を形質転換することによって提供される。標識ＤＮＡは、Ｔｉ−プラスミドベクター内の雌性不稔ＤＮＡの上流にあっても下流にあってもよいが、好ましくは、これら２つは互いに隣接し合い周縁配列の間にあるか或いは又少なくともＴｉ−プラスミドベクターの右周縁配列の左側に位置づけされ、植物細胞の核ゲノム内に一緒に適切に移入されるようになっている。しかしながら望まれる場合には、細胞は最初雌性不稔ＤＮＡ及び第１のプロモータを含む外来性ＤＮＡ配列で形質転換され、その後、細胞の核ゲノム内の雌性不稔ＤＮＡの遺伝子座の中又は近くに挿入された標識ＤＮＡ及び第２のプロモータで形質転換されてもよいし、或いは又この形質転換を逆に行なうこともできる。この目的に適当なベクターは、外来性ＤＮＡ配列で細胞を形質転換する場合について前述したものと同じである。好ましいベクターは、安全化されたＴｉ−プラスミドベクターである。

本発明の雌性不稔ＤＮＡの選定は重要なことではない。雌性不稔ＤＮＡが中で表現される花及び／又は種子及び／又は胚芽のいずれかの細胞の適切な代謝、及び／又は機能及び／又は発達を有害な形で著しく混乱させ好ましくはこの細胞を死に導くような第１のＲＮ　Ａ、タンパク質又はポリペプチドをコード化するように、適当な雌性不稔ＤＮＡを周知のやり方で選択し分離することができる。雌性不稔ＤＮＡの好ましい例は、（あらゆるグアニン残基の後で結合を加水分解することによりＲＮＡ分子を分解する）ＲＮＡ分解酵素Ｔ１といったＲＮＡ分解酵素）及びバルナーゼ；エンドヌクレアーゼなどのＤＮＡ分解酵素（例、ＥｃｏＲＩ）；又は、パパインなどのタンパク質分解酵素（例：パバインジモゲーン及びパパイン活性タンパク質）をコード化する。雌性不稔ＤＮＡのその他の好ましい例は、Ｔ、（クワタ他著（１９８８年）　Ｅｕｒｏ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７６、６８３−６９７］又はＲｈ［ホリウチ他著（１９８８年）Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　１０３，４０８−４１８　］　といったりボヌクレアーゼ；又は特にＮ１ｃｏｔｉａｎａ　ａｌａｔａのＳｌ、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ６及びＳ７対立遺伝子によりコード化されるもののような種タンパク質［１ｉ１０（：１ｕｒｅ他　（１９８９年）　Ｎａｔｕｒｅ　３４２，９５５−９５７）をコード化する。

雌性不稔ＤＮＡのその他の例は、サイトカイニン生合成の最初の段階に触媒として作用しＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴ−ＤＮＡの遺伝子４によりコード化される酵素であるイソペンテニルトランスフェラーゼ（転移酵素）；又はオーキシン合成に関与しＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔ　−ＤＮＡの遺伝子ｌ及び遺伝子２によりコード化される酵素の一方又は両方といった植物ホルモン合成に触媒として作用する酵素をコード化する。雌性不稔ＤＮＡのさらにその他の例は、グルカナーゼ、ホスホリパーゼＡ２といったリパーゼ（Ｖｅｒｈｅｉｊ他（１９８１年）　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒ、　ｍａｃｏｌ、　９１．９２−２０３）　；脂質ペルオキシダーゼ；又は植物細胞壁阻害剤をコード化する。雌性不稔ＤＮＡのさらにその他の例は、細菌毒素といった植物細胞に対し有毒なタンパク質（例ニジフチリア毒素又はボッリンのＡ−フラグメント）をコード化する。

雌性不稔ＤＮＡのさらにもう１つの例は、１）本発明の植物の花、種子又は胚芽の細胞に対し内因性でありこの細胞の中に天然に転写されたＤＮＡの鎖（ストランド）に相補的なりＮＡの鎖をコード化し、（ｉ）例えば欧州特許公報０，２２３，３９９号に記されているような内因性プロモータの制御下にあるアンチセンスＤＮＡである。このようなアンチセンスＤＮＡは、天然に生産されたＲＮＡの翻訳を阻害するため、花、種子又は胚芽の細胞内に天然に生成されたコード化部分及び／又は非コード化部分に結合することのできるＲＮＡ配列内に転写されつる。このようなアンチセンスＤＮＡの例としては、本書の例２中のＳＴＭＧＯ？遺伝子、Ｓ　ＴＭＧ　Ｏ８遺伝子、Ｓ　ＴＭＧ４Ｂ１２遺伝子及び３７ＭＧ３Ｃ９遺伝子のようなＳＴＭＧタイプの遺伝子、ＫＴ１３遺伝子（Ｊｏｆｕｋｕ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ共著（１９８９年）「植物細胞Ｊ　１，１０７９−１０９３）、２Ｓアルブミンといった種子特異的貯蔵タンパク質をコード化する遺伝子（１（ｒ２ｂｂｅｒｓ他著（１９８８年）、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８７．８５９−８６６　；　Ａｌｔｅｎｂａｃｈ他（１９８７年）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ４，２３９−２５０；（Ｓｃｏｌｆｉｅｌｄ及びＧｏｕｃｈ共著Ｊ、Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅｍ、　２６２．１２２０２−１２２０８）　；又は、ｃＤＮＡクローンＰＭＯＮ９６０８に相応する遺伝子［Ｇａ５５ｅｒ他著（１９８９年）「植物細胞Ｊ　！、１５］のアンチセンスＤＮＡがある。このようなアンチセンスＤＮＡは、例えば花柱（ＳＴＭＧＯ７、ＳＴＭＧＯ８、ＳＴＭＧ４Ｂ　１２、又は３７ＭＧ３Ｃ９遺伝子のアンチセンスＤＮＡの場合）：胚芽軸（ＫＴ１３遺伝子のアンチセンスＤＮＡの場合）一種子（２Ｓアルブミンコード化遺伝子のアンチセンスＤＮＡの場合）；及び胚珠細胞（ＰＭＯＮ９６０８のアンチセンスＤＮＡの場合）の中で、植物相補的内因性ＤＮＡ鎖（又は遺伝子）の内因性プロモータの制御下で、植物の花、種子又は胚芽の細胞の中で自然に表現されつる。雌性不稔ＤＮＡのさらにもう１つの例は、Ｈａｓｌｏｆｆ及びＧｅｒｌａｃｈ共著（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ　３３４，５８５−５９１に記されているように一定の与えられた標的配列に対するきわめて特異的な口割を行なうことのできる特異的ＲＮＡ酵素（すなわち、いわゆる「リボシーム」）をコード化する。このようなりボジームは、例えば、ＳＴＭＧ０７遺伝子、ＳＴＭＧＯ８遺伝子、ＳＴＭ０４Ｂ　１２遺伝子、３７ＭＧ３Ｃ９遺伝子、ＫＴＩ３遺伝子２Ｓアルブミンといった種子特異的貯蔵タンパク質をコード化する遺伝子又はｃＤＮＡクローンｐＭＯＮ９６０８に相応する遺伝子によりコード化されるＲＮＡに対してターゲテイングされたりボジームである。

雌性不稔ＤＮＡのさらにその他の例は、花、種子及び／又は胚芽を、真菌感染といった特定の疾病にかかりやすくすることのできる生成物をコード化する。このような雌性不稔ＤＮＡは、雌性不稔ＤＮＡが中で表現されていない他の全ての細胞又は組織がその特定の疾病に対する抵抗性をもっているような植物の中で用いることができる。

雌性不稔ＤＮＡのさらにもう１つの例は、ｌ）本発明の第１のプロモータの制御下でＴＮＶＮプレカーゼ［Ｍｅｕｌｅｗａｔｅｒ他　（１９９０年）、［ウィルス学」１７７、１−１１　］　といったウィルス依存型ＲＮＡポリメラーゼをコード化する第１の遺伝子、ならびに第２の遺伝子すなわち（ｉ）本発明の植物細胞内で生産又は過剰生産されたとき細胞の代謝、発達及び／又は機能を著しく混乱させる本発明に基づ（第１のタンパク質又はポリペプチドをコード化し、かつｉｉ）その３°末端においてウィルスＲＮＡ複製認識配列又はＴＮＶサブゲノミックブロモータ（Ｌｅｘｉｓ他（１９９０年）　Ｊ、　ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ　６４（４）、　１７２６−１７３３）といったいわゆる「ウィルス性すブゲノミックブロモータ」に融合され、さらに１ｉｉ）本発明に基づく植物細胞内での負鎖の表現を誘導することのできる本発明に基づく第１のプロモータといったもう１つの適切なプロモータに対しその５゜末端で融合されこのプロモータの制御下にあるような遺伝子の負鎖（すなわちアンチセンスＤＮＡ）の組合せを含んでいる。ウィルス性すブゲノミックブロモータ配列は、第１の遺伝子によりコード化されたウィルス依存型ＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識される。この認識により、第１のタンパク質又はポリペプチドの合成に通じる、ワトソン鎖としての第２の遺伝子の負鎖のくり返しの複製が導き出される。第１の遺伝子及び負鎖は両方残本発明の植物細胞の核ゲノムの中で提供される。これは、１回の形質転換事象、２回の連続した形質転換事象又は、そのゲノムの中に挿入された負鎖をもつ植物とそのゲノム内に挿入された第１の遺伝子をもつ植物を交配することによって、達成できる。

本発明の外来性ＤＮＡに関して用いている「外来性」という語は、この外来性ＤＮＡ配列が、外来性の雌性不稔ＤＮＡ及び／又は外来性の第１のプロモータを含んでいることを意味している。雌性不稔ＤＮＡ及特表千３−５０４８０６　（９）び第１のプロモータならびに標識ＤＮＡ、第２のプロモータ及び外来性ＤＮＡ配列内のその他のあらゆるＤＮＡに関して用いている「外来性」という語は、このようなりＮＡが、その起源である植物、細菌、動物、真菌、ウィルスその他の細胞内に自然に見い出される場合と比べ、本発明に従ってこのようなりＮＡにより形質転換された植物細胞内で同じゲノム環境の中にないことを意味している。すなわち、例えば、外来性雌性不稔ＤＮＡ又は標識ＤＮＡは、１）原植物内の核ＤＮＡであり、２）形質転換された植物細胞に対し内因性であり（すなわち形質転換されている植物と同じ遺伝子型をもつ原植物からのもの）、シかも３）形質転換された植物細胞内の本発明に基づく外来性ＤＮＡ配列内で（原植物からの）３ °末端転写調節シグナル及びそれ自体の内因性プロモータと同じ転写単位内にあるものの、４）形質転換された細胞内で原植物内で天然にそれをとり囲んでいた遺伝子によってとり囲まれることがないよう、原植物内における場合とは異なる場所にて形質転換された植物の核ゲノム内に挿入されていることができる。外来性雌性不稔又は標識ＤＮＡは例えば、１）原植物内の核ＤＮＡであり、２）形質転換された植物細胞に対して内因性であるものの、３）形質転換された植物細胞内の本発明に基づく外来性キメラＤＮＡ配列で３°末端転写調節シグナル及び／又は異なる（つまり独自のものでない）内因性プロモータと同じ転写単位内にあることもできる。

外来性雌性不稔又は標識ＤＮＡは同様に例えば、１）原植物内の核ＤＮＡであり、２）形質転換された植物細胞に対し内因性であるものの、３）形質転換された植物細胞内の本発明の外来性キメラＤＮＡ配列内で３°末端転写調節シグナル及び／又は非相同プロモータと同じ転写単位内にあることができる。外来性雌性不稔又は標識ＤＮＡは同様に例えば、形質転換された植物細胞に対し非相同で、形質転換された植物細胞内の本発明に基づ（外来性キメラＤＮＡ配列内で（例えば形質転換されつつある植物と同じ遺伝子型をもつ植物の核ゲノムからの）３゛転写調節シグナル及び／又は内因性プロモータと同じ転写単位内にあることができる。外来性雌性不稔ＤＮＡの１つの例は、形質転換されつつある植物と同じ遺伝子型をもつ植物の核ゲノムからきたもので、代謝、機能及び／又は発達を著しく混乱させるため花、種子及び／又は胚芽の形質転換された細胞内で酵素が過剰生産されるように、形質転換されつつある植物の花、種子及び／又は胚芽の細胞に対して内因性であるタンパク質分解酵素又はリボヌクレアーゼといった触媒酵素をコード化するものであってよｋＸ、好ましくは、雌性不稔ＤＮＡ及び標識ＤＮＡは各々、形質転換中の植物細胞に対して非相同である。

本発明の外来性ＤＮＡ配列内の雌性不稔ＤＮＡ、第１のプロモータ、標識ＤＮＡ、第２のプロモータ及びその他のあらゆるＤＮＡに関して用いる「非相同」という語は、このようなりＮＡが、形質転換されつつある植物と同じ遺伝子型をもつ植物の細胞の核ゲノム内に自然に見い出せないことを意味している。非相同ＤＮＡの例どしては、形質転換されつつある植物と同じ遺伝子型をもつ植物から得られる葉緑体及びミトコンドリアＤＮＡがあるが、好ましい例は、形質転換されつつある植物と異なる遺伝子型をもつ植物からの葉緑体、ミトコンドリア及び核ＤＮＡ、動物及び細菌ゲノムからのＤＮＡ及び真菌及びウィルスのゲノムからの染色体及びプラスミドＤＮＡである。

本発明の外来性ＤＮＡ配列に関して用いる「キメラの」という語は、その雌性不稔ＤＮＡのうち少な（とも１つが１）自然の中で１つの雌性不稔ＤＮＡに対してその第１のプロモータの制御下になく、及び／又は２）自然の中で、その標識ＤＮＡのうち少なくとも１つと同じ遺伝子座の中に見い出されない、ということを意味している。本発明に基づく外来性キメラＤＮＡ配列の例としては、植物起源の第１のプロモータの制御下にある細菌起源の雌性不稔ＤＮＡ及び、植物起源の第１のプロモータの制御下にあり、細菌起源の標識ＤＮＡと同じ遺伝子座にある植物起源の雌性不稔ＤＮＡ、がある。

「花」というのは、花の器官全体ならびにその苗状軸（又は５ｈｏｏｔ　ａｐｅｘ茎端）、かく片、花弁、雄性生殖器（又は雄すい）又は雄性生殖器（又は６皮）を含み、本発明に従ってその全体又は一部分の発育が遅らされたり止められると、花の中の生存種子の発達が妨げられるが雄性生殖体の発達は妨げられないようなものを意味する。「雑器」というのは、雌性生殖体及び／又は生存種子及び／又は生存胚芽ならびにその単数又は複数の個々の部分すなわちその胚珠、子房、花柱、柱頭、花冠、圧盤、が（及び胎座組織などの生産に関与する花の器官全体のことである。「胚芽」というのは、植物の胚芽全体ならびに単数又は複数のその個々の部分すなわち、胚芽軸及び子葉を含むものである。

本発明に基づく雌性不稔ＤＮＡが花特にその単数又は複数の雑器の細胞中、種子の細胞中及び／又は本発明の植物の胚芽中で選択的に表現されるためには、外来性ＤＮＡ配列内の雌性不稔ＤＮＡを制御する第１のプロモータが植物の花、種子及び／又は胚芽の細胞内で選択的に遺伝子表現を誘導することができるプロモータであることが好ましい。このような花、種子及び／又は胚芽特異的プロモータは内因性プロモータ又は外因性プロモータであってよ（、植物細胞の核ゲノムからのものでもミトコンドリア又は葉緑体ゲノムからのものであってもよい。いずれの場合でも、第１のし外来性のものである。好ましくは、第１のプロモータは、雌性不稔ＤＮＡが花特にその単数及び複数の雑器又は種子又は胚芽の単数又は複数の特定の組織の細胞内特に花柱細胞、子房細胞、隔膜細胞、種皮細胞、胚乳細胞、胚芽軸細胞及び／又は子葉細胞の中でのみ表現されるようにする。

本発明に基づく第１のプロモータは、植物の花、種子、及び／又は胚芽を殺す又は不能にし植物が稔性雌性生殖体、生存種子及び／又は生存胚芽を生産できないようにするため、第１のプロモータが植物の花、種子及び／又は胚芽の細胞内で選択的に雌性不稔ＤＮＡの表現を誘導するよう、雌性不稔にされるべき１本の植物から周知の方法で選択及び分離されつる。この第１のプロモータは好ましくは、植物が雄性稔性でありつづけるように、特に花の雑器内で稔性雌性生殖体、生存種子及び／又は生存胚芽の生産に関与していないその植物のその他の部分内の雌性不稔ＤＮＡの表現を妨げるのに有効であるようにも選択され分離される。

例えば、適当な花特異的（好ましくは雌性生殖器特異的）、種子特異的又は胚芽特異的な第１のプロモータを、以下の作業により雌性不稔にされるべき植物内で識別及び分離することができる：１、その花、種子、又は胚芽好ましくはその子房、花柱、胎座、がく、杯盤、隔膜、種皮、胚乳又は胎盤の発育中に植物内に存在しているにすぎないｍＲＮＡを探すこと；２、この花、種子又は胚芽特異的ｍＲＮＡを分離すること；３、この特異的ＲＮＡからｃＤＮＡを調整すること；４、この特異的ｍＲＮＡに対しコード化するＤＮＡを含む植物ゲノム内の領域を識別するためのプローブとしてこのＣＤＮＡを用いること；　そして次に、５、この特異的ｍＲＮＡに対してコード化するＤＮＡから上流（例えば５°）にありこのＤＮＡをプロモータを含む植物ゲノムの一部分を識別すること。

本発明に基づく第１のプロモータの例としては、花柱及び／又は柱頭特異的プロモータである例２に記されているＳＴＭＧ−型の遺伝子のＮ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍプロモータである。その他の植物種からのその他の花柱−柱頭特異釣竿１のプロモータは、上記段階４と同様プローブとしてＳＴＭＧ−型遺伝子を用いてそのゲノムから分離することができる。雑種形成条件の下で、このようなプローブは、その他の植物種のゲノムからのＤＮＡ配列の混合物の中で花柱− 柱頭特異的ｍＲＮＡに対しコード化するＤＮＡに交雑する（Ｍａｎｉａｔｉｓ他著（１９８２年）［分子クローニング、実験室マニュアルＪ　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊行〕。その後、上記段階５にあるように、もう１つの花柱−柱頭特異的な第１のプロモータを識別することができる。例えばＮ１ｃｏｔｉａｎａ　ａｌａｔａから分離されるように、Ｓ− 遺伝子といった自家不和合性遺伝子から、その他の花柱特異的プロモータを分離することができる［ＭｃＣ１ｕｒｅ他（１９８９年）、　Ｎａｔｕｒｅ　３４２．９５５−９５７］。

トマト植物の胚珠の中でのみ表現される遺伝子と排他的に交雑するｃＤＮＡクローンｐＭＯＮ９６０８［Ｇａ５５ｅｒ他著（１９８９年）Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ（植物細胞）１．１５］のようなその他の難詰特異的ｃＤＮＡを用いて、その他の難詰特異的プロモータを識別することが可能である。

このような第１のプロモータのその他の例としては、胚芽軸持異的なプロモータであるＫＴＩ３遺伝子のプロモータ［Ｊｏｆｕｋｕ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ共著（１９８９年）　ＴｈｅＰｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、　ｉ、　１０７９−１０９３　］　　；及びに佳旦匹ｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　（Ｋｒｅｂｂｅｒｓ他　（１９８８年）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉ。

１、８７．８５９−８６６］の４つの２Ｓアルブミン遺伝子（ＦＡＴ２Ｓ遺伝子」）のプロモータであるＰＡＴ　２Ｓ１、ＰＡＴ２Ｓ２、ＰＡＴ２Ｓ３及びＰＡＴ２Ｓ４などのＰＡＴ２Ｓプロモータといった種子特異的貯蔵タンパク質をコード化する遺伝子から誘導された種子特異的プロモータがある。

本発明の外来性ＤＮＡ配列内に１つ以上の雌性不稔ＤＮＡが存在する場合、全ての雌性不稔ＤＮＡは単一の第１のプロモータの制御下にあることができるが、好ましくは、各々の雌性不稔ＤＮＡはそれ独自の別々の第１のプロモータの制御下にある。雌性不稔ＤＮＡが外来性ＤＮＡ配列内に複数存在する場合、各々の雌性不稔ＤＮＡは、同じ又は異なる第１のＲＮＡ、ポリペプチド又はタンパク質をコード化することができる。例えば、雌性不稔ＤＮＡがＲＮＡ分解酵素Ｔ１といったＲＮＡ分解酵素をコード化する場合、雌性不稔ＤＮＡ及びその第１のプロモータの少な（とも３つ特に４つ乃至５つのコピーが外来性ＤＮＡ配列内に提供されていることが好ましい。このような場合、全ての雌性不稔ＤＮＡ及びその第１のプロモータが外来性ＤＮＡ配列及びこの外来性ＤＮＡ配列で植物細胞を形質転換するのに用いられるあらゆるベクター内で互いに隣接していることも同様に好ましい。複数の雌性不稔ＤＮＡが遺伝子１及び遺伝子２又はＴＮＶＮブレカーゼ及びＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ分解酵素又はタンパク質分解酵素といった異なる生成物をコード化する場合、雌性不稔ＤＮＡは互いに隣接せず、おそら（は外来性ＤＮＡ配列で植物細胞を形質転換するのに用いられる同じベクター内に存在しさえせず、又は本発明の雌性不稔植物の同じ親株内に存在しさえしないことが好ましいかもしれない。

本発明の標識ＤＮＡの選択も同様に重要なことではない。標識ＤＮＡを表現する植物又はその組織、種子さらには細胞が、第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを表現しない植物又はその組織、種子さらには細胞から容易に識別され分離されつるようにする第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化するように、１つの適当な標識ＤＮＡを周知の方法で選択及び分離することができる。標識ＤＮＡの例は、ジヒドロケルセチン−４−レダクターゼ（還元酵素）をコード化するＡ１遺伝子［Ｍｅｙｅｒ他著（１９８７年）、Ｎａｔｕｒｅ　３３０．６７７−６７８　］及びグルコロニダーゼ遺伝子［Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ他著（１９８８年）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

［ＪＳＡ　（ｒＰＮＡｓＪ）８３．８４４７］といった、植物細胞に識別可能な色を与えることができるか、或いは又、葉の知性成長又はさまざまな形状といった特異的な形態特性を植物に与久ることのできるタンパク質をコード化する。標識ＤＮＡのその他の例は、植物に対して、欧州特許出願明細書８８／４０２２２２．９号に記されているようなスーパーオキシドディスムターゼによって提供されるようなストレス許容性；欧州特許出願明細１Ｆ８６／３００２９１．１号に記されているような虫害抵抗性を与えるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ内毒素をコード化する遺伝子又は欧州特許出願明細書８８／４０１６７３．４号内に記されているように細菌抵抗性を付与する細菌ペプチドをコード化する遺伝子により提供されるもののような疾病又は有害生物抵抗性を付与する。

好ましい標識ＤＮＡは、欧州特許出願明細書８７／４００．５４４．０内に記されているようにＢｉｏｌａｐｈｕｓ及びホスフォフィツトリシンといったグルタミンシンセターゼ阻害剤に対する抵抗性を与える酵素をコード化するｓｆｒ遺伝子及び５ｆｒｖ遺伝子；ならびに欧州特許公報０．２４０．７９２号記載のホスフィノトリシンのための標的としての変更グルタミンシンセターゼ及び欧州特許公報０．２１８．５７１号記載のグリフォサートのための標的としての変更５− エノールビルビルレキメート−３リン酸塩シンターゼといった天然産の内因性酵素に比べて低い除草剤親和性をもついくつかの除草剤の変更標的酵素をコード化する遺伝子などのように、除草剤の作用を阻害又は中和する第２のタンパク質又はポリペプチドをコード化する。その他の例としては、除草剤ブロムオキシニル（Ｓｔａｌｋｅｒ他著（１９８８年）「農業的に重要な作物の遺伝子改良」、刊行：８０丁、　Ｆｒａｌｅｙ、　Ｎ、　Ｍ、　Ｆｒｅｙ及びＪ、　５ｃｈｅｌｌ、　Ｃｏｋｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｌ　　；除草剤スルフｔニル尿素［Ｌｅｅ他著（１９８８年）、　ＥＭＢＯＪ、７．１２４１−１２４８１　　；及び除草剤２．４Ｄ　［エルサレム第２回植物分子生物学国際シンポジウム、１９８８年１１月１３日〜１８日で提出されたもの］の作用を中和するタンパク質をコード化する標識ＤＮＡがある。

標識ＤＮＡを制御する本発明の第２のプロモータも同様に、この標識ＤＮＡによりコード化される第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドの性質に応じて望まれるように植物全体の中に構造的にか或いは又単数又は複数の特定の組織又は特定の細胞の中で選択的に、この標識ＤＮＡが表現されるような形で、周知の方法で選択及び分離されつる。例えば、標識ＤＮＡが除草剤抵抗性をコード化する場合、３５Ｓブロモータ（Ｏｄｅｌｌ他著（１９８５年）　、Ｎａｔｕｒｅ　３１３．８１０−８１２　］、３５Ｓ’　３プロモータ［Ｈｕｌｌ及びＨｏｗｅｌｌ著（１９８７年）　Ｖｉｒｏｌｏｚｙ　（ウィルス学）２３６．４８２−４９３）　、　Ｔ　ｉ−プラスミドのツバリンシンセターゼ遺伝子のプロモータ（ｒ　Ｐ　Ｎ　ＯＳ　Ｊ　）　　［Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ著　（１９８３年）Ｎａｔｕｒｅ　３０３．２０９−２１３３又はオクトビンシンターゼ遺伝子のプロモータ［ｒ　Ｐ　ＯＣＳＪ　（Ｄｅ　Ｇｒｅｖｅ他著、１９８２年、Ｊ、　Ｍｏｌ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ、　１（６）、　４９９−５１１）］　といった強力な構造的第２プロモータを用いて、植物の全ての細胞内で標識ＤＮＡを表現させることが有効でありうる。標識ＤＮＡが疾病抵抗性を付与するタンパク質をコード化する場合には、例えばＴｉ−プラスミドのＴＲＩｏ又はＴＲ２°プロモータ［Ｖｅｌｔｅｎ他著、（１９８４年）　ＥＭＢＯ，Ｊ、ム２７２３−２７３０　）といったＴＲプロモータを用いることにより傷害組織内で選択的に標識ＤＮＡを表現させることが有効でありうる。

標識ＤＮＡが除草剤抵抗性をコード化する場合、例えば、Ｒｕｂｉｓｃｏの小さいサブユニットをコード化する遺伝子のプロモータ〔欧州特許出願明細書８７／４００．５４４．０号）を用いることにより緑色組織内で選択的に標識ＤＮＡを表現させることも有効でありうる。標識ＤＮＡが１つの色素をコード化する場合、花弁細胞、葉細胞又は種子細胞といった特定の細胞内、好ましくは種皮の外側層の中で標識ＤＮＡを表現させることも有効でありうる。

以下の作業によって、雌性不稔でかつ形質転換されていない植物から容易に識別できるものにすべき植物のための組織特異的な第２のプロモータを既知の方法で識別し分離することができる：１、花弁、葉又は種子といった成る種の組織の発育の間のみ植物内に存在するｍＲＮＡを探すこと；２、この組織特異的ｍＲＮＡを分離すること；３、この組織特異的ｍＲＮＡからｃＲＮＡを調整する４ｏ組織特異的ｍＲＮＡについてコード化するＤＮＡを含む植物ゲノム内の領域を識別するため、プローブｔしてこのｃＤＮＡを使用すること；そして次に５、組織特異的ｍＲＮＡについてコード化するＤＮＡから上流にあり、かつ前記ＤＮＡのためのプロモータを含んでいるような植物ゲノムの一部分を識別すること。

複数の標識ＤＮＡが本発明の外来性ＤＮＡ配列内に存在する場合には、全ての標識ＤＮＡは単一の第２のプロモータの制御下にあることもできるが、好ましくは、各標識ＤＮＡはそれ独自の別々の第２のプロモータの制御下にある。さらに好ましくは、各々の標識ＤＮＡは独自の第２のプロモータの制御下にあり、異なる第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化して、形質転換された植物に対し区別できる異なる特性を提供する。いくつかのケースにおいては、標識ＤＮＡ　（単数又は複数）と第２のプロモータ（単数又は複数）が互いに対して及び本発明の外来性ＤＮＡ配列内及びこの外来性ＤＮＡ配列で植物細胞を形質転換するのに用いられるあらゆるベクター内に含まれる単数又は複数の雌性不稔ＤＮＡに対して隣接していることが好ましいかもしれない。その他のケースにおいては、標識ＤＮＡが互いに対して及び／又は雌性不稔ＤＮＡに対して隣接していないことが好ましいかもしれない。

雌性不稔ＤＮＡによってコード化される第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドが、花及び／又は種子及び／又は胚芽の細胞の核又は細胞質内で作用することによりこれらの細胞の代謝、機能及び／又は発達を大幅に妨害することが一般に好ましい。しかしながら、形質転換された植物の細胞の葉緑体又はミトコンドリアの中に、細胞質から第１のタンパク質又はポリペプチド及び／又は第２のタンパク質又はポリペプチドを輸送させることが望ましい場合、この外来性ＤＮＡはさらに、トランジットペプチドをコード化する第１の付加的な外来性ＤＮＡを含むことができる。

この第１の付加的なりＮＡは、第１のタンパク質又はポリペプチドがこのように輸送されろ場合には雄性不稔ＤＮＡと第１のプロモータの間に位置づけされ、第２のタンパク質又はポリペプチドがこのように輸送される場合には標識ＤＮＡと第２のプロモータの間にある。「トランジットペプチド」というのは、細胞の核ＤＮＡによりコード化される前駆体タンパク質として１つの細胞内に生産されるタンパク質のサブユニット又は葉緑体又はミトコンドリアタンパク質と通常結びつけられているポリペプチドフラグメントである。このトランジットペプチドは、葉緑体又はミトコンドリアの中への核コード化された葉緑体又はミトコンドリアタンパク質又はサブユニットの転座プロセスの原因となるものであり、このようなプロセス中、このトランジットペプチドは葉緑体又はミトコンドリアタンパク質又はサブユニットから分離されるか又はタンパク質分解により除去される。

単数又は複数のこのような第１の付加的なりＮＡは、欧州特許出願明細書８５／４０２．５９６．２号及び８８／４０２．２２２．９号内及びＶａｎ　ｄｅｎ　Ｂｒｏｅｃｋ他著（１９８５年）　Ｎａｔｕｒｅ３１３、　３５８−３６３；　５ｃｈａｔｚ著　（１９８７年）Ｅｕｒ、　Ｊ、　ｏｆＢｉｏｃｈ、　１６５．１−６；及びＢｏｕｔｒｙ他著　（１９８７年）Ｎａｔｕｒｅ３２８、３４０− ３４２の中に一般的に記されているように単数又は複数の第１又は第２のタンパク質又はポリペプチドを輸送するため、本発明に基づく外来性ＤＮＡ配列内に提供されつる。葉緑体内への輸送のための適当なトランジットペプチドの一例としては、酵素ＲＵＢＰカルボキシラーゼの小さいサブユニットのトランジットペプチド（欧州特許出願明細書８５／４０２　。

５９６．２号）があり、ミトコンドリア内への輸送のためのトランジットペプチドの一例としては、酵素Ｍｎ−スーパーオキシドディスムターゼのトランジットペプチドがある〔本書中の例１０及び欧州特許出願明細書８９／４０１．１９４．９参照〕。

同様に、雌性不稔ＤＮＡによりコード化される第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドが、植物内の細胞代謝、機能及び／又は発達を妨害するように細胞間で作用することが一般に好ましい。しかしながら、第１のタンパク質又はポリペプチド及び／又は第２のタンパク質又はポリペプチドをそれらが表現される植物細胞の細胞間部域の外又はそれらが表現される組織の外で分泌させることが望ましい場合、外来性ＤＮＡ配列はさらに、分泌シグナルペプチドをコード化する第２の付加的な外来性ＤＮＡを含むことができる。

この第２の付加的な外来性ＤＮＡは、第１のタンパク質又はポリペプチドが分泌される場合には雌性不稔ＤＮＡと第１のプロモータの間に位置づけされ、第２のタンパク質又はポリペプチドが分泌される場合には標識ＤＮＡと第２のプロモータの間に位置づけされる。［分泌シグナルペプチド」というのは、特に真核細胞内において、転座の間１通常細胞から分泌されるタンパク質と結びつけられている天然のポリペプチドフラグメント、或いは又転座の間にタンパク質又はポリペプチドと結びつけられたとき細胞からのその分泌を誘発するような人工的ポリペプチドフラグメントのことである。適当な分泌シグナルペプチドの例は、Ｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ　（１９８６年）、　ＮＡＲ１４（１１）、　４６８３−４６９０゜Ｄｅｎｅｃｋｅ他（１９９０年）、　Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　　（植物細胞）２、５１−５９；及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ及びＴａｑｕｅ（１９９０年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｌｏｇｙ　（国際細胞学評論）、印刷中；の中に記されている。

本発明の外来性ＤＮＡ配列においては、３°転写終止及びポリアデニル化シグナルは、植物細胞内でｍＲＮＡの適正な転写終止及びポリアデニル化を提供することのできるシグナルの中から、従来の方法で選択されつる。これらの転写終止及びポリアデニル化シグナルは、転写されるべき遺伝子の自然のシグナルであってよいが、外来性又は非相同のものであってもよい。非相同の転写終止及びポリアデニル化シグナルの例としては、オクトビンシンターゼ遺伝子［Ｇｉｅｌｅｎ他（１９８４年）ＥＭＢＯＪ、旦、　８３５−８４５　）及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７　［Ｖｅｌｔｅｎ及び５ｃｈｅｌｌ共著（１９８５年）、　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｉｃｈ　（核酸研究）（ｒＮＡＲＪ）１３．６９８１−６９９８　］のものがある。

同様に、本発明に従うと、本発明の外来性ＤＮＡ配列を含む植物細胞培養は、２倍体［Ｃｈｕｏｎｇ及びＢｅｖｅｒｓｄｏｒｆ　（１９８５年）Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、　３９．２１９−２２６）又は−培体細胞培養に対して必要な形質転換を行ない、次に（−培体細胞培養については）周知の技術（例えばコルヒチンを用いて）染色体の数を倍増することにより同型接合の優性雌性不稔雄性稔性植物を再生するために用いることができる。「植物組織と細胞培養」Ｐｉａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙｆｆｉ物生物学）３．　Ａ、　Ｒ，Ｌｉ５ｓ　Ｉｎｃ、　Ｎ、　Ｙ（１９８７年）を参照のこと。かくして、外来性ＤＮＡ配列は、このように形質転換された植物細胞の各々の核ゲノム内で同型接合の形をしていることになる。このことは、雌性不稔ＤＮＡが全ての生殖体又はそれから誘導された植物細胞の中に存在しこの中で表現されつるように、種子又は胚芽細胞といった雌性生殖体から誘導された細胞内で、特に減数分裂後の胚珠といった雌性生殖体の一定の与えられた発達段階における遺伝子の表現を誘導する第１のプロモータの制御下にある雌性不稔ＤＮＡを含む植物細胞培養のために好ましいことである。

同様に本発明に従うと、雑種植物にまで成長できる雑種種子を生産するための方法が提供されている。これらの方法には、ａ）花好ましくはその少なくとも１つの難詰又は胚芽内で選択的に第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドが表現されるような、本発明に基づく核雌性不稔雄性稔性植物と、ｂ）雄性不稔植物を他の点では慣習的な１つのやり方で交配させることが関与している。適当な雄性不稔雌性稔牲植物は、欧州特許出願明細書８９／４０１１９４．９号に、（ａ）植物の雄ずい細胞内で生産又は過剰生産させられたとき、雄ずい細胞の代謝、機能及び／又は発達を不利な形で著しく混乱させるようなＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化する雄性不稔ＤＮＡ　、及び（ｂ）植物の雄すい細胞内好ましくはめ、花粉及び／又は花糸細胞特に内面層（タベータム）及び／又は朽表皮細胞内で選択的に雄性不稔Ｄ　Ｎ　Ａの表現を誘導することのできるプロモータ（なおこの雄性不稔ＤＮＡはこのプロモータと同じ転写単位内にありこのプロモータの制御下にある）が中に安定した形で統合されており、しかもオプションとして同じ遺伝子座の中に、（ｃ）植物の少なくとも特定の組織又は少なくとも特定の細胞内に存在するとき、少なくとも特定の組織又は細胞内にこのＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを含まないその他の植物からこの植物を容易に分離できるようにするようなＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化するもう１つの標識ＤＮＡ　、及び（ｄ）少なくとも特定の組織又は特定の細胞の中でもう１つの標識ＤＮＡの表現を誘導することができしかも、このもう１つの標識ＤＮＡと同じ転写単位内にありこのＤＮＡを制御することができるもう１つのプロモータ、を有しているような１つの核ゲノムを有するものとして記述されている。

雌性不稔植物及び雄性不稔植物は、精確な栽植様式の必要なく、他家受粉の機会を増大させるように互いの近くに任意に栽植される。発芽できる収穫種子は、雌性不稔植物による雄性不稔植物の受精の結果であり、１００％の雑種となる。雌性不稔及び雄性不稔特性の原因である外来性ＤＮＡ配列がそれぞれの親株の核ゲノム内に異型接合の形で存在する場合、このような雑種種子から栽培された植物は、２５％稔性、２５％雌性不稔、２５％雄性不稔及び２５％稔性となるだろう、雌性不稔性をコード化する外来性ＤＮＡ配列が同型接合の形で雄性稔性親株の核ゲノム内に存在する場合（これは第１のプロモータが胚珠、種子又は胚芽特異的プロモータであるときに好ましい）、このような雑種種子から栽培された全ての植物は雌性不稔となる。

さらに本発明に従うと、その他の点では慣習的なものであるやり方で、ａ）第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドが種子内で選択的に表現され、第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化する外来性ＤＮＡ配列が植物の核ゲノム内で好ましくは同型接合の形をしているような、本発明に基づ（核雌性不稔雄性稔性植物と、ｂ）雄性不稔雌性稔性植物を交配させることにより種無し果実を生産するための方法が提供されている。

雌性不稔ＤＮＡ、場合によっては好ましくは、植物の核ゲノム内に安定した形で統合され本発明に従って優性対立遺伝子として何世代にもわたり伝達できる除草剤抵抗性をコード化する標識ＤＮＡをも用いて形質転換された植物は、雑種作物を育種し生産するために現在用いられている細胞質及び核雄性不稔システムに対する代替案であり、このシステムに比べ利点を提供しつるものである。この点において、雌性不稔雄性稔性植物は、以下に記すとおり、１）作物中の阻害された種子形成、２）容易に他家受粉しない作物のための雑種種子及び植°物系統のより容易な育種を提供することができる。

１．１五■［λｌ査種子が望ましくない副産物であるような、人工的に栽培された多種多様な作物が存在する。

ａ）植物の経済的産物がその栄養部分で構成されている場合、種子生産を阻害することにより、植物のエネルギーを栄養バイオマス生産に集中させることができる。その例としては、多年生植物（例えば、青刈飼料用イネ科牧草、青刈飼料豆果及びゴムの木）、いくつかの−学生植物（例えばサトウキビ及びジャガイモ）及び特に通常経済的産物が収穫される前に開花し結実するような全ての作物がある。その他の例としては、その栄養組織内で、薬学又は工業的用途のためのタンパク質、ポリペプチド又はその他の代謝産物を生産する、遺伝子工学によって得ることのできる植物がある。

ｂ）植物の経済的産物がその果実であり、消費者の好み（トマト、メロン及びカンキツ類）のため又はそうでなければ果実の中に貯蔵されつるバイオマスを種子形成が使い果たしてしまうため（例えば、加工すべきトマト内に高い固形含有率を提供する目的で）のいずれかの理由で果実が種なしであることが望まれる場合。このような作物は果実の形成を必要とすることから、通常果実の流産を誘発する種無し条件を、単為結果を得る可能性によって補償しなくてはならない。天然の単為結果果実誘発遺伝子はトマトやメロンといったいくつかの作物内に存在する。

Ｃ）植物がその種子を目的として栽培されているのではないが、収穫後に残った栄養分体が種子形成をひき起こしつる場合。これらの種子からの再成長は、次の、栽培において多大な雑草問題をひき起こす可能性がある。この「雑草」問題は、特にテンサイについてよく知られている。

ｄ）植物がその花を目的として栽培されている場合（例えば切花、鉢物又は庭用観賞植物）。これらの種については、結実を避けることが望ましい場合が多い。

切花又は鉢物の場合、花の受精は往々にして花弁の老化の加速化を誘発する。庭用観賞植物の場合、果実及び種子の形成は、開花の期間及び強さを減少する。

２、！Ｌｕ土ニュ１工学的に生み出された雌性不稔は、天然の細胞質又は核の雄性不稔システム又は工学的に生み出された核雄性不稔システムと組合わせた種子生産手段として、種子が経済的な収穫物でな（容易に他家受粉しないような作物における（例えば青刈飼料イネ科牧草、青刈飼料豆果、テンサイ及び数多（の野菜）商業的膜種種子の生産のために役立つ、雄性不稔植物での核雌性不稔植物の育種は、雑種種子の品質をより良く制御できるようにしく例えばあやまって雄性条が収穫されることはない）、雄性不稔及び雌性不稔親株の無作為の混植を通して他家受粉に有利に作用することによりさらに結実度を高め、又受精能の回復剤を必要としない。

このような雑種種子（例えばテンサイ）の生産のための戦略には、以下のような段階が含まれると考えられる〔なお、ｒＭＳＪは雄性不稔、ｒＦｓＪは雌性不稔、ｒＨＪは除草剤抵抗性を表わす］。

Ａ、　　　　で、Ａの　幸Ａａ）系統Ａを、雄すい特異プロモータの制御下にある雄性不稔ＤＮＡ及びそれに隣接する除草剤抵抗性をコード化する標識ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡで、欧州特許出願明細書８９／４０１．１９４．９号に従って形質転換し、ＡＩ′Ｉ■Ｈ／ｗａｓｈを得る。

Ａｂ）系統Ａ′″“７″″ｇ′″との交配を通して、系統ＡＩ″′Ｈ／１ｈを維持する。これにより：５０％のｐ、ＭｍＨ／″″″ｈ　（雄性不稔、除草剤抵抗性）及び５０％のＡ　＠　ｈ　／″″″″（稔性、除草剤感受性）が得られる。

Ｂ、　　　　汽　Ｂの　章Ｂａ）系統Ｂを、植物の雌性器官の細胞内に選択的に遺伝子表現を誘導する第１のプロモータの制御下にある雌性不稔ＤＮＡ及びそれに隣接して除草剤抵抗性をコード化する標識ＤＮＡを含む本発明に基づくキメラＤＮＡ配列で形質転換し、Ｂ　ＦｓＭ／ｆｉハを得る。

Ｂｂ）Ｂｆｎ′ｔ″ｈトノ交配ヲ通シテ系統ＢＦｓＨ／ｌＲ′″ヲ維持し、次のものを得る：５０％のＢＦｍＨ／１ｍｈ　　（雌性不稔、除草剤抵抗性）及び５０％のＢｒ＊ｎｚｒｓｒ＋　　（稔性、除草剤抵抗Ｃａ）Ａｂ）及びＢｂ）で得られた種子を無作為に植えつけする。

Ｃｂ）他家受粉及び自家受粉が起こる前に望ましくない遺伝子型を、除草剤噴霧により除去する。

Ｃｃ）他家受粉が起こり：Ａ　１１１Ｎ／１１１１１１＋１　Ｘ　Ｂ　ＦＩＮ／ｆｇｈ以下の遺伝子型を伴う１００％の雑種種子が得られる：２５％（７）ＡＢ’″１４／ａｓ′′、　ＩＢＨ／１ｚｈ２５％（７）　Ａ　Ｂ　ＭｍＨ７ｍ＊ｈ　、　ｔｌｌｈ／１ｌｌｈ２５％のＡ　Ｂ　１ｍ　＊　ｈ　／　Ｉａ　Ｍ　１１゜２５％のＡ　Ｂ　Ｉ′＋＊ｈ／ｍ″″。

これは、市販されている種子を表わす。

大部分の主要な作物が小胞子誘導された２重−培体を得る能力を有することから、多少の差こそあれ直接的な方法で同型接合雌性不稔植物の生産が可能となる［　Ｃｈｕｏｎｇ及びＢｅｖｅｒｓｄｏｒｆ　（１９８５年）、Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ。

３９、２１９−２２６　］。これにより数多くの場合において、雌性不稔ＤＮＡと同じ植物細胞核ゲノムの遺伝子座の中に標識ＤＮＡを有することが不要となる。このことは特に、同型接合雌性不稔植物が栄養機能的に増殖されつる場合に言えることである。（例えば数多くの野菜）。

ｂ）ｅを　　　Ａ雌性不稔ＤＮＡが標識ＤＮＡ　（例えば除草剤抵抗性をコード化する）と同じ形質転換植物核ゲノム遺伝子座の中にある場合、同型接合雌性不稔植物は、系統評価プログラム内の検定親株としてその他の数多くの系統よりも技術的に優れている。このことは特に、種子が経済的収穫物でなく、他家受粉が容易な作物について言えることである。実際、これらの雌性不稔植物は、異なる系統の間でのかけ合わせの結果得られた種子からテスト中の異なる植物系統からの自家受粉種子を全て除去することを容易にしながら、互いに近接した数多くの雌性稔性及び雄性稔性系統のテストを可能にする。

以下の実施例は本発明を例示している。

例中で参照している図は、以下のとおりである。

図ＩＡは、例１のＳＴＭＧＯ７遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す。

図ＩＢは、例１のＳＴＭＧＯ８遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す。

図２Ａは、例１のＳＴＭＧ４Ｂ　ｌ　２遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す。

図２Ｂは、例１のＳ　Ｔ　Ｍ　Ｇ　３　Ｃ９遺伝子のｃＤＮＡ配列を示す。

図３は、例４のベクターｐＭＧ　１００の地図を示す。

図４は１例６のベクターｐＭＧ　１０１の地図を示す。

図５は、例８のベクターｐＭＧ　１０２の地図を示す。

図６は、例８のベクターｐＭＧ　Ｉ　Ｏ３の地図を示す。

図７は、例１０のベクターｐＭＧ１０４の地図を示す。

図８は、例１０のベクターＰＭＧ　１０５の地図を示す。

例中に相反する記述のないかぎり、組換え型ＤＮＡを作り取り扱う手順は全て、Ｍａｎｉａｔｉｓ他著、「立土クローニング−マニュアルＪ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　（ＩＢ２年）に記されている標準化された手順により実施された。例中に用いられている以下のベクターは、ブタベスト条約の規定に基づき、ドイツ連邦共和国Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　ｗｅｇ　ＩＢ、　Ｄ−３３００Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、のＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ＦＬＩｒ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄＺｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｎ　（ｒＤｓＭＪ　）に寄託されている：１−Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　　ｒブティ・ハバナ　８Ｒ１からの　　−旦、　・ＤＮＡの周知の手順（Ｍａｔｉａｔｉｓ他、１９８２年）を用いて、以下の異なるタバコ組織から総量ＲＮＡを分離した：段階３〜７で花からの花柱−柱頭組織［Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０．１４６０−１４６７に従って〕　；段階８〜１１で、花粉粒を発達させなかった花からのいわゆる「幼年段階」の花柱−柱頭組織［Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　１９８８年に従って］　；幼年段階の花からのいわゆる「老年段階」の子房組織；及び！止五で栽培された実生苗からの茎、根及び葉の組織壷Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰＬＣ，Ｂｕｃｋｉｎｇｓｈａｍｓｈｉｒｅ、米国）キット、ｃＤＮＡ合成システムプラス−ＲＰＮ１２５６Ｙ／Ｚを用いて、このキット内の使用上の指示に従って、幼年及び老年の花柱−柱頭組織から、ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを、ＡｍｅｒｓｈａｍキットｃＤＮＡクローニングシステム− ラムダｇｔｌ　０−ＲＰＮ１２５７を用いて、このキット内の指示に従って、ラムダｇｔｌｏベクター内でクローニングした。このようにして得られたｃＤＮＡライブラリから、一方では実生苗からのｃＤＮＡプローブ及び他方では花柱−柱頭組織からのｃＤＮＡプローブを用いて、差別（分化）スクリーニングを行なった。選択されたクローンをｐＧＥＭｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ）内でサブクローニングした。これらのサブクローンの各々のプローブを調整し、さまざまなタバコ組織（根、茎、葉、がく片、花弁、５、幼年段階の花柱−柱頭、老年段階の花柱−柱頭及び老年段階の子房）からの総量ＲＮＡ１０μｇを用いてノーサンプロット法でその特異性についてまず検査した。花柱−柱頭ｍ　ＲＮ　Ａとこれらのノーサン法において特異的に交雑させられたサブクローンを、幼年の子房、種子及びウィルス感染した葉を含む上述の組織から分離された２μｇのポリＡ”　ｍＲＮＡとノーサン法で再度交雑させた。ｒｐＭＧＯ７Ｊ及びｒｐＭＧＯ８Ｊと呼ばれそれぞれ０．９６３ｋｂ及び０．４．７２ｋｂのインサートを含むクローンは、花柱−柱頭特異ｃＤＮＡ配列であることが立証された。これらのクローンを配列づけし、そのＤＮＡ配列をそれぞれ図ＩＡ及び図ＩＢに示した。ｐＭＧＯ７のＤＮＡ配列は８００個のヌクレオチドの配列全体にわたり１つのオーブンリーディングフレーム（ｒＯＲＦＪ）の存在を明らかにしている。ｐ、ＭＧＯ８の配列は、配列全体にわたる１つのＯＲＦを明らかにしている。

カリフォルニア大学ロサンゼルス校（ＵＣＬＡ）のＧｏｌｄｂｅｒｇ教授から、ｐＧＥＭ３ｚｆ　（−）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、　ＵＳＡ）内でＰｓｔＩ　−３ｍａＩフラグメントとしてクローニングされた２つのＮｆｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ花柱−柱頭特異的ｃＤＮＡ　（４Ｂ１２及び３Ｃ９）を入手した。これらのクローンは、それぞれ０．７４８ｋｂ及び１．０４６ｋｂのインサートを含んでいた。これら２つのクローンのプローブを、その特異性を検査する目的で、さまざまなタバコ組織（根、茎、葉、が（片、豹、幼年段階の花柱−柱頭、老年段階の花柱−柱頭及び老年段階の子房）からのｌＯμｇの総量　ＲＮ　Ａとノーサン法にて交雑させた。これらのノーサン法は、クローンの特異性を確認し、４Ｂ１２の写しが０．８ｋｂであり３Ｃ９の写しが１．２ｋｂであることを明らかにした。２つのクローンをｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　１　（Ｐｒｏｍｅｇａ）内でサブクローニングさせ、このサブクローンを４Ｂ１２クローンについてはｒｐＭＧ４Ｂ１２Ｊ　、３Ｃ９クローンについてはｒｐＭＧ３ｃ９Ｊと呼んだ。これらのサブクローンを、幼年段階の子房、種子及びウィルス感染葉を含む上述の組織から分離された２μｇのポリＡ”　ｍＲＮＡを用いてノーサン法で再度その特異性について検査した。それぞれ０．７４８ｋｂ及び１．０４６ｋｂのインサートを含むクローンｐＭＧ４Ｂ　１２及びｐＭＧ３Ｃ９は花柱−柱頭特異的配列であることがわかった。これらのクローンを配列づけし、そのｃＤＮＡ配列をそれぞれ図２Ａ及び図２Ｂに示した。

２−−ＣＤＮＡクローンに　応　る −　　　　　’−ｒＳＴＭＧ刑′　　　　の阻既知の手順（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年）を用いて、タバコの雑器の花柱 −柱頭組織内で特異的に表現される相応するゲノム遺伝子を分離するのに、花柱 −柱頭特異的配列の例１のｃＤＮＡクローンの各々からのプローブを用いた。Ｐｒｏｍｅｇａが提供しているプロトコル（実験記録）に従って、タバコのゲノムＤＮＡを５ａｕ３Ａで部分的に消化させ、制限フラグメントをＸｈｏ　Ｉで消化されたラムダファージベクターＧ　Ｅ　Ｍ　、　　１２　（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングさせて、「ラムダ５ＴＧＯ７Ｊ、「ラムダ５ＴＧＯ８Ｊ、「ラムダ５ＴＧ４Ｂ１２Ｊ及び「ラムダ５ＴＧ３Ｃ９Ｊと呼ばれるゲノミッククローンを生成した。その後、これらのゲノミッククローンをＰｒｏｍｅｇａの手順に従ってｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　１　（Ｐｒｏｍｅｇａ）内でサブクローニングさせた。これらのサブクローンを、花柱−柱頭特異ＤＮＡ配列を含んでいるクローンを識別するためプローブとしてそれぞれのｃＤＮＡクローンを用いて、サザン法で再び分析した。それぞれｒｐｓＴＧＯ７Ｊ、ｒｐｓＴＧＯ８Ｊ、ｒＳＴＭＧ型　１２及びｒｐＳＴＧ３Ｃ９Ｊと呼ばれるこれらのサブクローンを配列決定した（　Ｍａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ　　（１９７７年）ＰＮＡＳ、　７４．５６０　］。これらのクローンの方向性は、両方向のりボブローブを用いてノーザン分析法で決定した。各々のｃＤＮＡをそのそれぞれのゲノミッククローン配列と比較したところ、相同性領域を識別することができた。各領域の５°末端において、ＡＴＧコドン及びコンセンサス配列ＴＡＴＡが見極められた。

このｒＴＡＴＡＪボックスが遺伝子のプロモータの一部であることは、ブライマー伸展によって確認されている（Ｍｃｋｎｉｇｈｔ他　（１９８７年）Ｃｅｌｌ（細胞）２５，３８５　］　。

プローブとして花柱−柱頭ｃＤＮＡを用いて分離された花柱−柱頭特異遺伝子は一般にｒＳＴＭＧ型」遺伝子と呼ばれている。ｐｓＴＧＯ７の花柱−柱頭特異遺伝子は、ｒｓＴＭＧＯ７Ｊ　、ｐｓＴＧＯ８（７）それはｒＳＴＭＧＯ８Ｊ　、ｐＳＴＧ４Ｂ　１２のそれはｒＳＴＭＧ４Ｂ　１２Ｊ　、ｐＳＴＧ３Ｃ９（７）それはｒｓＴＭＧ３ｃ９Ｊと呼ばれる。

例３−それぞれのＳＴＭＧ刑゛　　から６゛されたプロモータカセット　ｒＰＳＴＭＧ　　　の第１の非相同雌性不稔ＤＮＡと同じ転写単位内にありこれを制御するＳＴＭＧ型遺伝子のプロモータを含む５゛調節配列を含むキメラＤＮＡ配列を構築するためには、プロモータを含むＤＮＡフラグメントをｐＭＡＣ５−８のポリリンカー〔欧州特許出願明細書８７／４０２３４８．４号〕へとサブクローニングすることによってカセットが構築される。こうして、部位指向性突然変異誘発において用いるために本領ＤＮＡを分離するのに用いることのできるそれぞれのベクターが生成される。

部位指向性突然変異誘発（欧州特許出願明細書８７／４０２３４８．４号）を用いて、遺伝子の各々のＡＴＧ開始コドンなとり囲む配列は、突然変異が一定の与えられた制限酵素のための唯一の認識部位である一定の与えられた配列を作り出すような形で、変更される。結果として得られたプラスミドは各々新たに作られた制限部位を含む。この新たに作られた制限部位にまたがる正確なヌクレオチド配列は、それが、新たな制限部位を作り出す置換という点でのみ相応するＳＴＭＧ型遺伝子の５゛配列と異なっているということを確認するために見極められる。各々１つのプロモータ、そのＡＴＧ開始コドンに対するＳＴＭＧ型遺伝子の５ °未翻訳末端ならびに新たな制限部位を含んでいる新たに生成されたプロモータカセットは、全体としてｒＳＴＭＧｓ］と呼ばれる。プロモータとＳＴＭＧＯ７の５゛末端を含むＰ　Ｓ　Ｔ　ＩＪｉ　ＧはｒＰｓＴＭＧＯ７Ｊと呼ばれ、Ｓ　ＴＭＧ　Ｏ８のそれはｒＰｓＴＭＧＯ８Ｊ　、ＳＴＭＧ４Ｂ　１２のそれはｒＰＳＴＭＧ４Ｂ２ＪそしてＳ７ＭＧ３Ｃ９のそれはｒＰＳＴＭＧ３Ｃ９Ｊと呼ばれる。

例４−ＰＳＴＭＧ　　びＲＮＡ　　　　−Ｔｌ’　　　のキメラＤＮＡ　　夕１の図３に示されているｒｐＭＧｌｏｏＪという名のプラスミドが、各々以下の周知のＤＮＡフラグメントを例３のＰＳＴＭＧｓのうちの異なる１つと組立てることによって構築される：１．５ａｃＩ部位への挿入によりアンピシリンをコード化するβ−ラクタマーゼ遺伝子が不活性化されたｐＧｓｃ１７００からの、Ｔ−ＤＮＡ周縁配列を含むベクターフラグメント〔なおこれらの周縁配列の間には以下のＤＮＡフラグメント２−４が位置づけされている〕　；２　、　　Ａｒａｂｉｄｏ　ｓｉｓ　Ｒｕｂｉｓｃｏ　ＳＳＵプロモータ（ｒＰｓｓＵＪ又はｒＰｓｓＵＡＲＡＪ　）、除草抵抗性遺伝子ｓｆｒ　（欧州特許出願明細書８７／４００．５４４．０）及びａＴ−ＤＮＡ遺伝子７（Ｖｅｌｔｅｎ及び５ｃｈｅｌｌ　（１９８５年）ＭＡＲ，１３，６９８１）の３゜末端（すなわち転写終止）シグナルを含むキメラ配列；３、ツバリンシンターゼプロモータ　（ｒＰＮＯｓＪ　）、カナマイシン抵抗性をコード化するｎｅｏ遺伝子、及びオクトビンシンターゼ（ｒＯｃｓＪ　）遺伝子の３°末端シグナル〔欧州特許出願明細書８７／４００．５４４．０号；なお：こでｐＧＳＦＲ４０１はｒＰＧＳＲ４Ｊと呼ばれている〕を含むｐＧｓＦＲ４０１がらのＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｓ　ａ　ｃ　Ｉフラグメントを含むキメラ配列；及び４、Ａ、　ｏｒｈｙｚａｅがらのＴＮＡ分解酵素Ｔ１をコード化する合成遺伝子とフレーム内で融合された例３がらのＰＳＴＭＧプロモータカセットの１　つ（Ｑｕａａｓ他「生体リン酸塩とその類似体−合成、構造、代謝及び活性Ｊ　　（１’０７年）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｖ　Ｂ。

■、、アムステルダム；　Ｑｕａａｓ他（１９８８年）　Ｅｕｒ。

Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７３６１７−６２２３及びツバリンシンターゼ（ｒＮＯｓＪ　）遺伝子の３“末端シグナル［Ａｎ他（１９８５年）　ＥＭＢＯＪ、４（２）、　２７７］を含むキメラ配列。

各々のｐＭＧｌｏｏは、Ｔ−ＤＮＡ周縁配列内に３つのキメラ配列すなわち第２のプロモータとしてそれぞれｐｓｓｕ及びＰＮＯＳを有する標識ＤＮＡである□ 　ＰＳＳＵ−ｓｆｒ及びＰＮＯＳ−ｎｅｏ、ならびに第１のプロモータとしてＰＳＴＭＧの制御下にある雌性不稔ＤＮＡであるＰＳＴＭＧ−ＲＮａｓｅ　（ＲＮＡ分解酵素）Ｔｌ遺伝子を含む、２元タイプのＴ−ＤＮＡベクターである。ＰＳＴＭＧプロモータの制御下での雌性不稔ＤＮＡの表現は、花柱及び／又は柱頭細胞内で選択的にＲＮ　ａ　ｓ　ｅ　Ｔ　４を生産することになる。

ＲＮａｓｅＴｌはこれらの細胞の代謝にとって必要不可欠なものであるＲＮＡ分子を分解することから、これはこれらの花柱及び／又は柱頭の細胞にとって致命的なことである。

例５−　バコ　びアルファルファ　への　４の　キメラＤＮＡ　１の′ Ｅ、Ｃｏ１１（大腸菌）からｐＭＰ９０を含むＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　！ｉ！１ｆａＣ１ｅｎＳＣ５８ＣＩ　Ｒｉｆ”　［Ｋｏｎｃｚ及び５ｃｈｅｌｌ　（１９８６年）Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２０４．３８３−３９６］内に各々のｐＭＧｌｏｏ（例４からのもの）を可動化（授動）することにより、組換え型−一菌株を構築する。

結果として得られた、ｐＭＰ９０及びｐＭＧｌｏｏを宿すＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、欧州特許出願明細書８７／４００．５４４．０に記されているような標準的手順を用いたタバコの築盛（Ｎ、ｔａｂａｃｕｍ　ＰｅｔｉｔｅＨａｖａｎｅ、　５ＲＩ）の形質転換及びＤ’）Ｉａｌｌｕｉｎ他（１９９０年）Ｃｒｏｐ　５ｃｉｅｎｃｅ（作物学）且（印刷中）の中に記されている手順に従ったアルファルファの形質転換のために用いられる。

Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎは、共栽培の後Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株を殺すのに用いられる。形質転換された仮管を、５ｍ　ｇ　／　１２ホスフイノトリシン及び１００μｇ　／　ｍ　１２のカナマイシンを含む基質上で選択し、抵抗性ある仮管を植物内に再生させた。ＲＮａｓｅＴ１遺伝子が存在しているにもかかわらず植物が正常に成長していることを証明する苗条及び根の誘発の後、形質転換体を温室に移し、開花するまで栽培した。花を検査したところ、正常な花柱−柱頭形成は全（みられない。受粉の後、いかなる生存種子も形成されていない。形質転換された植物は雌性不稔である。

６−ＰＳＴＭＧ　　びＢａｒｄ　　のキメラＤＮＡ　１の図４に示されているｒｐＭＧｌｏｌＪという名のプラスミドが、各々例３のＰＳＴＭＧのうちの異なる１つと以下の周知のＤＮＡフラグメントを組立てることによって構築される：１、周縁配列間に以下のＤＮＡフラグメント２−４を有する、例４に記されているようなｐＧＳＣ１７００から誘導されたＴ−ＤＮＡ周縁配列を含むベクターフラグメント；２、ＰＳＳＵＳＳ上−タ、除草剤抵抗性遺伝子ｓｆｒ及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３゛末端を含む、例４のキメラ配列（Ｎｏ、２）；３、ＰＮＯＳプロモータ、カナマイシン抵抗性をコード化するｎｅｏ遺伝子及びＯｃｓ遺伝子の３゛末端シグナルを含む、例４のキメラ配列（Ｎｏ、３）；及び４　、　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｉｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓからのＢａｒｎａｓｅ遺伝子とフレーム内で融合された例３からのＰＳＴＭＧｓの１　つ（Ｈａｒｔｌｅｙ及びＲｏｇｅｒｓｏｎ　（１９７２年）　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（調製生化学）ム（３１，２４３−２５０３及び例４　）Ｎ　ＯＳ遺伝子の３゛末端を含むキメラ配列。

各々のｐＭＧｌｏｌは、Ｔ−ＤＮＡ周縁配列の中に３つのキメラ配列すなわち、第２のプロモータとしてそれぞれＰＳＳＵ及びＰＮＯＳを有する標識ＤＮＡであるＰＳＳＵ及びＰＮＯＳ−ｎｅｏ　；及び第１のプロモータとしてＰＳＴＭＧの制御下にある雌性不稔ＤＮＡであるＰ　Ｓ　Ｔ　Ｍ　Ｇ　−Ｂａｒｎａｓｅ遺伝子を含む２元タイプのＴ−ＤＮＡベクターである。ＰＳＴＭＧブロモータの制御下での雌性不稔ＤＮＡの表現は、花柱及び／又は柱頭の細胞内で選択的にＢａｒｎａｓｅを生成することになる。ＢａｒｎａｓｅはＲＮＡ分子を分解しかくして花柱及び／又は柱頭細胞の代謝を妨げることから、このことはこれらの細胞にとって致命的である。

例７−タバコ　びアルファルファ　への　６の　キメラＤＮＡ　１の′ 例５で記述したように、ｐＭＰ９０を含むＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｃ５８ＣＩ　Ｒｉｆ”　［Ｋｏｎｃｚ及び５ｃｈｅｌｌ（１９８６年）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２０４．３８３−３９６　］内にＥ、Ｃｏ１１（大腸菌）から各々のｐＭＧｌｏｌ（例６からのもの）を可動化（授動）することにより、組換え型Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株を構築する。結果として得られた、ｐＭＰ９０及びｐＭＧ　１００を宿すＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株は、タバコの築盛の形質転換及びアルファルファの形質転換のために用いられる。形質転換された板前及び苗条（従長板）を、５　ｍ　ｇ　／　１２のホスフィノトリシン及び１００ｇｇ／ｍβのカナマイシンを用いて選択する。Ｂａｒｎａｓｅ遺伝子が形質転換された除草剤抵抗性の板前及び苗条内で表現されていないことは、その成長によって示される。

形質転換された苗条を発根させ温室内の土壌に移し、開花するまで栽培する。タバコ及びアルファルファの両方の花を検査すると、例５に記述されている形質転換植物において観察されたものと基本的に同じ表現型が形質転換植物内に観察できる（すなわち正常な花柱−柱頭形成無し）。形質転換植物は、雌性不稔のキメラＤＮＡ　１の図５に示されているｒｐＭＧ１０２Ｊという名のプラスミドは、例３のＰＳＴＭＧのうちの異なる１つと以下の周知のＤＮＡフラグメントを組合わせることによって各々構築される；１、例４に記述したようにｐＧｓｃ１７００から誘導されたＴ−ＤＮＡ配列を含み、周縁配列間に以下のＤＮＡフラグメント２〜４を有するベクターフラグ及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３°末端を含む、例４のキメラ配列（Ｎｏ、２）、３、ＰＮＯＳプロモータ、ｎｅｏ遺伝子及びＯＣＳ遺伝子の３゛末端を含む、例４のキメラ配列（Ｎｏ。

３）、４、フレーム内で以下のものと融合された、例３からのＰＳＴＭＧの１つを含むキメラ配列；ａ）ペプチドならびにエステル、結合を攻撃することのできる植物のエンドペプチダーゼであるパパインチモーゲン顆粒をコード化するＣａｒｉｃａ巨凹り果実からのパパイン遺伝子［Ｃｏｈｅｎ他著（１９８６年）Ｇｅｎｅ（遺伝子）、　４８．２１９−２２７］　　、例３に記述されている部位指向性突然変異誘発を用いて、Ｃｏｈｅｎ他（１９８６年）に従ったパパイン遺伝子のＤＮＡ配列内で、以下の変更が加えられる：ｉ、第１のＡＴＧコドンの上流の位置１のヌクレオチドＡを、適当なＮｃｏＩクローニング部位を得るためにヌクレオチドＣに突然変異させる；及びｉｉ、位置４７．１１８及び１３５にあるグルタミン酸塩をコード化するＧＡＡコドンを、グルタミンをコード化するＣＡＡコドンへと突然変異させる。

ｂ）例４のＮＯＳ遺伝子の３゛末端。

各々のｐＭＧ　１０２は、Ｔ−ＤＮＡ周縁配列の中に３つのキメラ配列すなわち、第２のプロモータとしてそれぞれｐｓｓｕ及びＰＮＯＳの制御下にある植物形質転換のための優性で選択可能な標識をコード化する標識ＤＮＡであるＰＳＳＵ −ｓｆｒ及びＰＮＯＳ−ｎｅｏ、ならびに第１のプロモータとしてＰＳＴＭＧの制御下にある雌性不稔ＤＮＡであるＰＳＴＭＧパパインチモーゲン顆粒遺伝子、を含む二次タイプのＴ−ＤＮＡベクタである。ＰＳＴＭＧプロモータの制御下で雌性不稔ＤＮＡを表現させると、花柱及び／又は柱頭の細胞内で選択的に、花柱及び／又は柱頭細胞内でタンパク質を非削させかくしてこれらの細胞を死に導（ようなエンドペプチダーゼ（パパインチモーゲン顆粒）が生み出される。

図６に示されているｒｐＭＧ１０３Ｊという名のプラスミドも同様に、各々例３のＰＳＴＭＧのうちの異なる１つと以下の周知のＤＮＡフラグメントを組立てることによって構築される：１、例４に記されているようにｐＧＳＣ１７００から誘導されたＴ−ＤＮＡ周縁配列を含み、その周縁配列の間に以下のＤＮＡフラグメント２−４を有するベクターフラグメント；２、ＰＳＳＵＳＳ上−タ、除草剤抵抗性遺伝子ｓｆｒ及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３゛末端を含む、例４のキメラ配列（Ｎｏ、２）；３、ＰＮＯＳプロモータ、ｎｅｏ遺伝子及びＯＣＳ遺伝子の３°末端を含む、例４のキメラ配列（Ｎｏ。

３）；及び４、フレーム内で以下のものと融合された、例３のＰＳＴＭＧのうちの１つを含むキメラ配列：ａ）パパインチモーゲン顆粒の活性タンパク質を：Ｉ−Ｆ　化ｔ　６　Ｃａｒｉｃａ　Ｐａ　ａ　ａ果実からのパパイン遺伝子；例３に記述されているような部位指向性突然変異誘発を用いてＣｏｈｅｎその他（１９８６年）に従ったパパイン遺伝子の配列内で以下の変更が行なわれる：ｉ、活性タンパク質の第１のＩｌｅ残基の上流でＡｓｎをコード化するＡＡＴコドンを、適当なＥｃｏＲＶクローニング部位（ＧＡＴ、ＡＴＣ）を提供するＧＡＴコドンへと突然変更させる。パパインチモーゲン顆粒の活性タンパク質をコード化する配列とプロモータの直接的フレーム内融合を得るために、ＥｃｏＲＶの工学的に作られた部位を直接ＰＳＴＭＧに融合させる；又ｉｉ、位置４７．１１８及び１３５でグルタミン酸塩をコード化するＧＡＡコドンを、グルタミンをコード化するＣＡＡコドンへと突然変異させる；及びｂ）例４のＮＯ３遺伝子の３“末端。

各ｐＭＧ１０３は各ｐＭＧ１０２と同様、Ｔ−ＤＮＡ周縁配列内に３つのキメラ遺伝子すなわち、特表平３−５０４８０６　（２０）植物形質転換のための優性の選択可能な標識をコード化するＰＳＳＵ−ｓｆｒ及びＰＮＯＳ−ｎｅｏならびに、第１のプロモータとしてＰＳＴＭＧの制御下にあり、花柱及び／又は柱頭細胞内でタンパク質を非削させかくしてこれらの細胞を選択的に死に導くようなエンドペプチダーゼをコード化する雌性不稔ＤＮＡであるＰＳＴＭＧ−ベバイン活性タンパク質遺伝子を含む、２元タイプのＴ−ＤＮＡベクターである。

例９−タバコ　びアルファルファ　への　８の　キメラＤＮＡ　１の′ 例５に記されているように、各々のｐＭＧ１０２及び９ＭＧ１０３（例８からの）を、大腸菌から、ｐＭＰ９０を運ぶ別々のＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃ　５８　ＣＩＲｉｆ’内に可動化（授動）する。結果として得られる、ｐＭＧ　Ｉ　Ｏ２を伴うｐＭＰ９０及び９ＭＧ１０３を伴うｐＭＰ９０を宿す菌株は、例５の手順に従ってタバコ及びアルファルファを形質転換するのに用いられる。形質転換された除草剤−及びカナマイシン−抵抗性仮置、苗条及び根の中でパパイン遺伝子が表現されないことは、その成長により示される。

形質転換された植物を温室内に移し、開花するまで土壌中で栽培する。タバコ及びアルファルファの両方の花を検査し、例５に記されている形質転換植物内で観察されたものと同じ表現型が形質転換植物内に観察できる（すなわち正常な花柱、柱頭形成は全く無し）。形質転換植物は、雌性不稔である。

例１０−ＰＳＴＭＧ　　びＥｃｏＲＩをコード　　る゛　−のキメラＤＮＡ　１の図７に示されているｒｐＭＧ１０４Ｊという名のプラスミドを、各４例３のＰＳＴＭＧのうちの異なる１つと以下の周知のＤＮＡフラグメントを組立てることによって構築する：１．１）ＧＳＣ１７０１Ａ２　Ｅ欧州特許出願明細書８７／１１５９８５．１）から誘導されたＴ−ＤＮＡ周縁配列を含むベクターフラグメント；なお、これらの周縁配列の間には、以下のＤＮＡフラグメント２−５が位置づけられている；２、ＰＳＳＵＳＳ上−タ、除草剤抵抗性遺伝子ｓｆｒ及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３°末端を含む、例４のキメラ配列（Ｎｏ、２）３、ＰＮＯＳプロモータ、ｎｅｏ遺伝子及びＯＣＳ遺伝子の３°末端を含む、例４のキメラ配列（ＮＯ８４）；４、フレーム内で以下のものと融合された、例３のＰＳＴＭＧのうちの１つを含むキメラ配列：ａ）大腸菌からのＥｃｏＲＩ制限エン制限エンドヌクレアーゼ化しく　Ｇｒｅｅｎ他　（１９８１年）Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｒｎ、　２５６．２１４３−２１５３；　Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ及びＺａｂｅａｕ（１９８５年）遺伝子３７．２２９−２３９］　、　２本鎖ＤＮＡ上で標的配列ＧＡＡＴＴＣを認識し非削することができる遺伝子二側３で記述されているような部位指向性突然変異誘発を用いて、Ｇｒｅｅｎ他（１９８１年）に従った遺伝子のＤＮＡ配列内で以下の変更を行なう：ｉ、ＡＴＧ開始コドンのヌクレオチドをＡＴＧＣＡで置換し、開始コドンでＮ５ｉＩ部位を作り出し、以下のヌクレオチド配列を生み出す：Ａ　Ｔ’　Ｇ　ＣＡ％ＴＣＴ、ＡＡＴ、、、、及び、ｉｉ、ｐＥｃｏＲ１２内でクローニングされたＥｃｏＲＩ遺伝子のＨｉ　ｎｄＩＩ−Ｈｉ　ｎｄＩ［Ｉフラグメント（Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ及びＺａｂｅａｕ、１９８５年）を、ｐＭＡ　Ｃ５−８部位指向性突然変異誘発ベクターにクローニングする；及びｂ）７例４のＮＯＳ遺伝子の３゛末端；及び５、微生物内のＥｃｏＲＩ遺伝子の潜在的漏出性表現を克服するため、太１１又はＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ内のＥｃｏＲＩの活性を阻害することのできる、その天然のプロモータの制御下にある、ＥｃｏＲＩメチラーゼをコード化する遺伝子［Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ及びＺａｂｅａｕ、　１９８５年〕。

各ｐＭＧ　１０４は、Ｔ−ＤＮＡ周縁配列内に３つのキメラ配列すなわち、第２のプロモータとしてそれぞれｐｓｓｕ及びＰＮＯＳの制御下にある標識ＤＮＡであるＰＳＳＵ−ｓｆｒ及びＰＮＯＳ−ｎｅｏ、及び第１のプロモータとしてＰＳＴＭＧの制御下にある雌性不稔ＤＮＡであるＰＳＴＭＧ−ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を含む、２元タイプのＴ−ＤＮＡベクターである。花柱及び／又は柱頭細胞内で選択的にＰＳＴＭＧプロモータの制御下で雌性不稔ＤＮＡを表現させると、花柱及び／又は柱頭細胞内でＧＡＡＴＴＣ部位において２本鎖ＤＮＡを非削するＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼが生成されることになり［タイプＨの制限変更システムの再検討のためＷｉｌｓｏｎ　（１９８８年）ＴＩＧ４（１１１，３１４−３１８を参照のこと〕、かくして、これらの細胞を死に導く。

ｒｐＭＧ　Ｉ　Ｏ５Ｊと呼ばれるプラスミドも同様に。

各４例３のＰＧＴＭＧのうちの異なる１つと以下の周知のフラグメントを組立てることによって構築される；１、　ｐＧＳＣ１７０１Ａ２から誘導された、Ｔ−ＤＮＡ周縁配列を含むベクターフラグメント；なおこの周縁配列の間には以下のＤＮＡフラグメント２−５が位置づけされている；２、ＰＳＳＵＳＳ上−タ、除草剤抵抗性遺伝子ｓｆｒ及びＴ−ＤＮＡ遺伝子７の３°末端を含む、例４のキメラ配列（Ｎｏ、２）、３、ＰＭＯＳプロモータ、ｎｅｏ遺伝子及びＯＣＳ遺伝子のｎｅｏ末端を含む、例４のキメラ配列（Ｎｏ、３）；４、フレーム内で以下のものと融合された、例３のＰＳＴＭＧの１つを含むキメラ配列；ａ）ｐｓＯＤｌからの１旦！Ｉ　−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩのＮｃｏＩ−ＰｓｔＩフラグメントであるＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（ｒＭｎ−ＳＯＤＪ）のトランジットペプチドをコード化する遺伝子フラグメント［Ｂｏｗｌｅｒ他（１９８９年）Ｅｍｂｏ。

Ｊ４，３１−３８　］　　、なお、例３に記されているような部位指向性突然変異誘発を用いて、Ｂｏｗｌｅｒ他（１９８９年）に従い遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列中で以下の変更が行なわれる：ｉ、ＡＴＧ開始コドンの位、置−２及び−１で上流にあるＡＡヌクレオチドを、開始コドンでＮｃｏ　Ｉ部位を作り出し次のヌクレオチド配列を生み出すＣＣヌクレオチドに変える：ｃｏＩｉｉ、　　）ランジットペプチドのプロセッシング部位のすぐ下流にあるＴ、ＴＣＧ、ＣＴＣヌクレオチドを、プロセッシング部位の後ろにＰｓｔＩ部位を作り出し以下のヌクレオチド配列を生み出すべくＣ，ＴＧＣ，ＡＧＣに変える：なおここで、矢印はトランジットペプチドのプロセッシング部位を示し、上部ラインはＭ　ｎ　−５ＯＤコ一ド化配列に相応するアミノ酸配列を示す；ＮｃｏＩ−ＰｓｔＩフラグメントも同様にフレーム内で、ｆｆｌからのＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼをコード化する遺伝子と融合され［Ｇｒｅｅｎｅ他　（１９８１年）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５６゜２１４３−２１５３；Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ及びＺａｂｅａｕ　（１９８５年）遺伝子３７，２２９−２３９］　、ｐ　Ｍ　Ｇ　１０４内に見られるように２本鎖ＤＮＡ上で標識配列ＧＡＡＴＴＣを認識し非削することができる；及びｂ）例４のＮＯ３遺伝子の３°末端：及び５、周縁配列の外側のベクターフラグメント内に挿入されており、微生物内のＥｃｏＲＩ遺伝子の潜在的な漏出性表現を克服するため、人■Ｉ又はＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ内のＥｃｏＲＩ活性を抑制することのできる、その天然のプロモータの制御下にあるＥｃｏＲＩメチラーゼをコード化する遺伝子。

各々のｐＭＧ　１０５は、周縁配列内に３つのキメラ配列すなわち第２のプロモータとしてそれぞれｐｓｓｕ及びＰＮＯＳの制御下にある標識ＤＮＡであるＰＳＳＵ−ｓｆｒ及びＰＮＯＳ−ＮＰＴｎならびに第１のプロモータとしてＰＳＴＭＧを有しそれとの間にトランジットペプチドコード化配列を有する雌性不稔ＤＮＡであるＰＳＴＭＧ−）ランジットペプチド−ＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ遺伝子、を含む２元タイプのＴ−ＤＮＡベクターである。ＰＳＴＭＧプロモータの制御下にある雌性不稔ＤＮＡを花柱及び／又は柱頭細胞内で選択的に表現させると、制限エンドヌクレアーゼが生産され、この制限エンドヌクレアーゼは花柱及び／又は柱頭細胞のミトコンドリア内にクーゲティングされ、このような細胞のＧＡＡＴＴＣ部位で２本鎖ＤＮＡを非削することになる。こうしてこれらの細胞は死に導かれる。

１１−タバコ　びアルファルファ　への　ｌＯのキメラＤＮＡの゛例５に記されているように、各々のｐＭＧ　１０４及びｐＭＧ１０５（例１０からの）は、Ｋ１１からｐＭＰ９０を運ぶ別々のＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉａＣ５８ＣＩＲｉｆ’内へ可動化（授動）される。ｐＭＰ９０を伴う９ＭＧ１０４及びｐＭＰ９０を伴うｐＭＧ　Ｉ　Ｏ５を宿す、結果として得られた菌株は、例５に記されている手順に従ってタバコ及びアルファルファを形質転換するのに用いられる。ＥｃｃｉＲＩエンドヌクレアーゼ遺伝子が形質転換された除草剤及びカナマイシン抵抗性の板前、苗条及び機内で表現されていないことは、その成長によって示される。

形質転換された植物は、温室内に移され、開花するまで土壌中にて栽培される。

タバコとアルファルファの両方の花を検査し、例５で記されている形質転換植物において観察されたものと同じ遺伝子型が、形質転換植物について観察される〔すなわち正常な花柱−柱頭形成無し）。形質転換植物は、雌性不稔である。

言うまでもないことではあるが、本発明は何らかの特定の植物の形質転換に制限されるわけではない。本発明は、植物の花特にその煎器又は種子又は胚芽の細胞内における雌性不稔ＤＮＡの選択的な表現を誘導することのできる第１のプロモータの制御下にある雌性不稔ＤＮＡで形質転換されつる核ゲノムを有し、かくして自家受粉と他家受粉の両方が可能であるあらゆる植物に関する。

同様に、本発明は、上述の各側に記されている特異的プラスミド及びベクターに制限されるものではな（、むしろ第１のプロモータの制御下にある雌性不稔ＤＮＡを含む全てのプラスミド及びベクターを包含する。

さらに、本発明は、上述の各側に記されている特定のＰＳＴＭＧプロモータに制限されず、むしろ植物の花特にその単数又は複数の煎器及び／又は種子及び／又は胚芽の細胞内での雌性不稔ＤＮＡの選択的な表現を誘導することのできるプロモータをコード化する全てのＤＮＡ配列を包含する。

さらに、本発明は、上述の各側の中に記されている特定の雌性不稔ＤＮＡに限られるわけではなくむしろ、第１のプロモータの制御下で、生産植物の花、種子又は胚芽の細胞の代謝、機能及び／又は発達を不利な方向に著しく混乱させるような第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化する全てのＤＮＡ配列を内含する。

同様に、本発明は、上述の各側の中に記されている特定の標識ＤＮＡに限られるわけではな（むしろ、それが表現されている少な（とも特定の植物組織又は特定の植物細胞に対して、それが表現されていないような特定の植物組織又は特定の植物細胞に比べて全く異なる特徴を付与するような、第２のＤＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化するあらゆるＤＮＡ配列を内含する。

Ｆｉｇｕｒｅ　Ｉ　　ＡＦｉｇｕｒｅ　Ｉ　Ａ　（ｃｏｎｔ、　　１）Ｆｉｇｕｒｅ　Ｉ　Ａ　（ｃｏｎｔ、　２）Ｆｉｇｕｒｅ　Ｉ　Ａ　（ｃｏｎｔ、　３）Ｆｉｇｕｒｅ　Ｉ　　ＢＦｉｇｕｒｅ　Ｉ　Ｂ　（ｃｏｎｔ、　１）Ｆｉｇｕｒｅ　２　ＡＦｉｇｕｒｅ　２　Ａ　（ｃｏｎｔ、　　１）Ｆｉｇｕｒｅ　２　Ａ　（ｃｏｎｔ、２）Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＦｉｇｕｒｅ　２　ＢＦｉｇｕｒｅ　２　Ｂ　（ｃｏｎｔ、１）Ｆｉｇｕｒｅ　２　Ｂ　（ｃｏｎｔ、　２）Ｆｉｇｕｒｅ　２　Ｂ　（ｃｏｎｔ、３）Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓト ■ 国際調査！ｌ！４＆− ＰＣＴ／ＥＰ　　９０１０１２フ５

Claims

【特許請求の範囲】

１．安定した形で中に統合された状態で外来性ＤＮＡ配列好ましくはキメラＤＮＡ配列を含む核ゲノムを有する植物の細胞において、（ａ）前記植物の花特にその雌器又は種子又は胚芽の細胞内で生産又は過剰生産された場合にこの細胞の代謝、機能及び／又は発育を著しく混乱させるような第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化する雌性不稔ＤＮＡ、（ｂ）前記植物の花特にその雌器又は種子又は胚芽の細胞内好ましくは花柱、柱頭、胚珠、種皮、胚乳、胚芽軸又は胚芽子葉細胞内で選択的に前記雌性不稔ＤＮＡの表現を誘導することのできる第１のプロモータ、（ただし、この第１のプロモータがｉ）胚珠といった雌生殖体の細胞特に減数分裂を受ける雌生殖体細胞内又はｉｉ）種子又は胚芽の細胞といったこれらの雌生殖体細胞から誘導された細胞内で選択的に前記雌性不稔ＤＮＡの表現を誘導できる場合前記外来性ＤＮＡ配列は好ましくは前記形質転換された植物細胞の核ゲノム内に同型接合の形で存在することを条件とし、前記雌性不稔ＤＮＡは前記第１のプロモータと同じ転写単位内にありこの第１のプロモータの制御下にある）を特徴とする植物細胞。
２．前記外来性ＤＮＡ配列は前記細胞の核ゲノム内に同型接合形で存在する、請求の範囲１に記載の細胞。
３．前記第１のプロモータは、前記植物の花特にその雌器又は種子の細胞内好ましくは子房、胚珠、花柱、隔膜及び／又は種皮細胞の中で選択的に前記雌性不稔の表現を誘導することができる、請求の範囲１に記載の細胞。
４．前記外来性ＤＮＡは同様に、好ましくは前記雌性不稔ＤＮＡと同じ遺伝子座の中に、（ｃ）前記植物の少なくとも特定の細胞又は少なくとも特定の組織の中に存在するとき、同じ第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを少なくともこの特定の細胞又は特定の組織内に含んでいないその他の植物からこの植物を容易に分離できるようにするような第２のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化する標識ＤＮＡ、及び（ｄ）少なくとも前記特定の細胞又は特定の組織の中で前記標識ＤＮＡの表現を誘導することのできる第２のプロモータ（なおこの標識ＤＮＡはこの第２のプロモータと同じ転写単位内にあり、このプロモータの制御下にある）も含む、請求の範囲１乃至３のいずれか１項に記載の細胞。
５．前記外来性ＤＮＡ配列にはさらに、（ｅ）前記タンパク質又はポリペプチドを前記植物の花、種子又は胚芽の細胞の葉緑体又はミトコンドリアの中に移送することのできるトランジットペプチドをコード化する第１のＤＮＡ（なおこの第１のＤＮＡは、雌性不稔ＤＮＡ及び前記第１のプロモータと同じ転写単位内しかもこの雌性不稔ＤＮＡとこの第１のプロモータの間にある）；及び／又は、（ｆ）少なくとも前記特定の細胞又は特定の組織の葉緑体又はミトコンドリア内に前記第２のタンパク質又はポリペプチドを移送することのできるトランジットペプチドをコード化する第２のＤＮＡ、（なおこの第２のＤＮＡは、前記標識ＤＮＡ及び前記第２のプロモータと同じ転写単位内しかもこの標識ＤＮＡ及び第２のプロモータの間にある）が含まれている、請求の範囲１乃至４のいずれか１項に記載の細胞。
６．前記外来性ＤＮＡ配列にはさらに、（ｇ）前記植物の花、種子又は胚芽の前記細胞の外で前記第１のタンパク質又はポリペプチドを分泌することのできる分泌シグナルペプチドをコード化する第３のＤＮＡ（なおこの第３のＤＮＡは前記雌性不稔ＤＮＡ及び前記第１のプロモータと同じ転写単位内しかもこの雌性不稔ＤＮＡとこの第１のプロモータの間にある）；及び／又は、（ｈ）少なくとも前記特定の細胞又は特定の組織の外で前記第２のタンパク質又はポリペプチドを分泌することのできる分泌シグナルペプチドをコード化する第４のＤＮＡ、（なおこの第４のＤＮＡは、前記標識ＤＮＡ及び前記第２のプロモータと同じ転写単位内しかもこの標識ＤＮＡと前記第２のプロモータの間にある）が含まれている、請求の範囲１乃至５のいずれか１項に記載の細胞。
７．前記雌性不稔ＤＮＡが、ＲＮＡ分解酵素特にＲＮＡ分解酵素Ｔ１又はバルナーゼ；ＤＮＡ分解酵素特にエンドヌクレアーゼ特にＥｃｏＲＩ；たん白質分解酵素特にパパイン特にパパインジモーゲン又はパパイン活性タンパク質；グルカナーゼ；リパーゼ特にホスフォリパーゼＡ２；脂質ペルオキシダーゼ；細胞壁阻害剤；細菌性毒素；又はリボジーム；特にＳＴＭＧタイプの遺伝子のいずれか、ＫＴ１３遺伝子、２Ｓアルブミンといった種子特異的貯蔵タンパク質をコード化する遺伝子又はｃＤＮＡクローンｐＭＯＮ９６０８に相応する遺伝子によりコード化されるｍＲＮＡに対するリボジームをコード化すること、前記雌性不稔ＤＮＡは、リボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）特にＴ２又はＲｈをコード化し、特にＮｉｃｏｔｉｎａ　ａｌａｔａのＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ６又はＳ７対立遺伝子によりコード化される糖タンパク質をコード化するか、又はアンチセンスＤＮＡ特にＳＴＭＧ型遺伝子、ＫＴＩ３遺伝子、２５アルブミンといった種子特異的貯蔵タンパク質をコード化する遺伝子又はｃＤＮＡクローンｐＭＯＮ９６０８に相応する遺伝子のアンチセンスＤＮＡである、請求の範囲１乃至６のいずれか１項に記載の細胞。
８．前記雌性不稔ＤＮＡが、植物ホルモンの合成に触媒として作用する酵素特にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔ−ＤＮＡの遺伝子１、遺伝子２又は遺伝子４によりコード化される酵素又代替的には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｔ−ＤＮＡの遺伝子及び遺伝子２によりコード化される酵素をコード化する、請求の範囲１乃至６のいずれか１項に記載の細胞。
９．前記雌性不稔ＤＮＡは、ウイルス依存性ＲＮＡポリメラーゼ特にＴＮＶレプリカーゼを前記第１のプロモータの制御下で、又前記第１のタンパク質又はポリペプチドをコード化する遺伝子の負鎖をコード化すること、又この遺伝子は細胞内での前記負鎖の表現を誘導することのできるもう１つの第１のプロモータと同じ転写単位内にありこのプロモータの制御下にあること、さらにこの遺伝子は、前記ウイルス依存性ＲＮＡポリメラーゼにより特異的に認識されるＴＮＶサブゲノミックプロモータといったウイルスサブゲノミックプロモータに対しその３′ 末端にて融合されていることを特徴とする、請求の範囲１乃至６のいずれか１項に記載の細胞。
１０．前記標識ＤＮＡが、除草剤抵抗性遺伝子特にｓｆｒ又はｓｆｒｖ遺伝子；除草剤に対しより低い親和力を有する除草剤に対する変更された標的酵素特にグリフォセートの標的としての変更５−エノルピルビルシキメート−３リン酸塩シンターゼ又はフォスフィノトリシンといったグルタミンシンセターゼ阻害剤の標的としての変更グルタミンシンセターゼをコード化する遺伝子；少なくとも前記特定の細胞又は特定の組織に対し色を付与するタンパク質又はポリペプチドをコード化する遺伝子特に遺伝子Ａ１又はＧＵＳ遺伝子；前記植物に対してストレス許容性を付与するタンパク質又はポリペプチドをコード化する遺伝子特にＭｎ− スーパーオキシドディスムターゼをコード化する遺伝子；又は疾病又は有害生物抵抗性を付与するタンパク質又はポリペプチドをコード化する遺伝子特に虫害抵抗性を付与するＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ内毒素をコード化する遺伝子又は細菌抵抗性を付与する殺菌ペプチドをコード化する遺伝子である、請求の範囲４乃至９のいずれか１項に記載の細胞。
１１．前記第１のプロモータが、ＰＳＴＭＧ０７、ＰＳＴＭＧ０８、ＰＳＴＭＧ４Ｂ１２又はＰＳＴＭＧ３Ｃ９；Ｓ遺伝子といった自家不和合性遺伝子から誘導されたプロモータ；ＫＴ１３遺伝子のプロモータ；種子特異的貯蔵タンパク質をコード化する遺伝子のプロモータ例えばＰＡＴ２Ｓプロモータ；ｃＤＮＡクローンｐＭＯＮ９６０８に相応する遺伝子のプロモータ；又は、それぞれｉ）ＳＴＭＧ型遺伝子又はＳ遺伝子、ｉｉ）ＫＴ１３遺伝子、ｉｉｉ）ＡＴ２Ｓ遺伝子又はｉｖ）ｃＤＮＡクローンｐＭＯＮ９６０８に対し雑種形成することのできるｉ）花柱−柱頭特異的、ｉｉ）胚芽軸特異的、ｉｉｉ）種子特異的又はｉｖ）胚珠特異的ｍＲＮＡに対してコード化するＤＮＡのプロモータである、請求の範囲１乃至１０のいずれか１項に記載の細胞。
１２．第２のプロモータが、構成プロモータ特に３５Ｓプロモータ、３５Ｓ′３プロモータ、ＰＮＯＳプロモータ又はＰＯＣＳプロモータ；創傷誘発性プロモータ特にＴＲ１′又はＴＲ２′プロモータ；光合成活性をもつ植物組織内で選択的に遺伝子表現を誘導するプロモータ特にＳＳＵプロモータ；又は、葉細胞、花弁細胞又は種子細胞特に種皮細胞内で選択的に遺伝子表現を誘導するプロモータである、請求の範囲４乃至１１のいずれか１項に記載の細胞。
１３．前記外来性ＤＮＡ配列で形質転換された前記植物の２倍体又は１倍体細胞の培養から得られ、同型接合植物として前記植物を再生するのに用いることができ、及び、特に、前記第１のプロモータは、ｉ）胚珠といった雌生殖体の細胞内で特にこの細胞の減数分裂の後に、又はｉｉ）種子又は胚芽の細胞といった前記雌生殖体細胞から誘導された細胞内で、選択的に前記雌性不稔ＤＮＡの表現を誘導することができる、請求の範囲１及び３乃至１２のいずれか１項に記載の細胞。
１４．特にｐＭＧ１００、ｐＭＧ１０１、ｐＭＧ１０２、ｐＭＧ１０３、ｐＭＧ１０４又はｐＭＧ１０５といった、請求項１乃至１３のいずれかの前記外来性ＤＮＡ配列を含む、植物特にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの感染を受けることのできる植物の細胞を形質転換させるのに適したベクター。
１５．その細胞の核ゲノム内に安定した形で統合された状態で請求の範囲１乃至１３のいずれか１項の前記ＤＮＡ配列をもつ雌性不稔植物及びこの植物の再生物質を生産する方法において、かくしてこの雌性不稔ＤＮＡは前記植物の花特に雌器又は種子又は胚芽の細胞内で選択的に表現されこの細胞内で前記第１のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを生産することができるものとなること、又前記標識ＤＮＡは前記植物の前記特定の細胞又は特定の組織内で表現されこの植物を未形質転換植物から分離できるものにすること、ならびにａ）前記外来性ＤＮＡ配列を前記細胞の核ゲノム内に導入することによって前記植物の細胞を形質転換させる段階、及び次にｂ）この植物及び生殖物質を前記細胞から再生する段階という非生物学的段階が含まれていることを特徴とする方法。
１６．請求の範囲１乃至１３のいずれか１項の植物細胞を含む植物細胞培養。
１７．請求の範囲１乃至１３のいずれか１項の植物細胞を含む植物。
１８．請求の範囲１７の植物の果実、特に種無し果実。
１９．交雑種子又は種無し果実を生産するための方法において、ａ）好ましくは前記プロモータ及び前記標識ＤＮＡ特に除草剤に対する抵抗性を付与する前記標識ＤＮＡ特にｓｆｒ又はｓｆｒｖ遺伝子を含む請求の範囲１乃至１３のいずれかの外来性ＤＮＡ配列をこの雌性不稔植物の細胞の核ゲノム内に安定した形で統合された状態で含む雌性不稔雄性稔性の植物、を、ｂ）ｉ）その雄ずい細胞内で生産又は過剰生産されたときこの雄ずい細胞の代謝、機能及び／又は発育を著しく混乱させ、かつこの雄ずい細胞内で選択的に雄性不稔ＤＮＡの表現を誘導することのできるプロモータと同じ転写単位内にありこのプロモータの制御下にある第３のＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドをコード化する雄性不稔ＤＮＡ及び、ｉｉ）オプションとして、同じ遺伝子座内でもう１つの標識ＤＮＡ及びそのプロモータ好ましくは前記標識ＤＮＡと前記第２のプロモータ、を安定した形で統合された状態で中に含む核ゲノムを有する雄性不稔雌性稔性植物と他家受粉させる段階、を特徴とする方法。
２０．前記第１のプロモータは、花又は胚芽特に花の細胞の中で選択的に前記雌性不稔ＤＮＡの表現を誘導することを特徴とする請求の範囲１９の方法によって得られた交雑種子。
２１．請求の範囲２０の交雑種子を栽培することによって得られた交雑植物。
２２．前記第１のプロモータは種子の細胞内で前記雌性不稔ＤＮＡの表現を誘導することを特徴とする、請求の範囲１９の方法により得られた種無し果実。
２３．請求の範囲１１の第１のプロモータ、特にＰＳＴＭＧ０７、ＰＳＴＭＧ０８、ＰＳＴＭＧ４Ｂ１２又はＰＳＴＭＧ３Ｃ９。
２４．前記雌性不稔ＤＮＡは天然では前記第１のプロモータの制御下になく及び／又は天然では前記標識ＤＮＡと同じ遺伝子座の中には見られないこと、特に前記第１のＤＮＡ又は前記第３のＤＮＡは、天然では前記第１のプロモータと前記雌性稔性ＤＮＡの間にはないことを特徴とする、請求の範囲１乃至１３のいずれかの外来性キメラＤＮＡ配列。
２５．ＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを中で表現することができ核ゲノムの中に安定した形で統合された外来性遺伝物質を含む植物及び種子といったこの植物の生殖材料を生産するため又はこの植物の果実を生産するための方法において、ａ）前記ＲＮＡ、タンパク質又はポリペプチドを表現しない出発植物細胞又は植物組織から前記外来性遺伝物質を含む前記植物の形質転換された細胞又は組織を生産する段階、ｂ）前記外来性遺伝物質を含む前記形質転換された植物細胞又は植物組織からこの植物の再生植物又は生殖物質又はその両方を生産する段階という非生物学的段階、及びｃ）オプションとして前記再生植物又は生殖物質又はその両方を生物学的に複製する段階を含むような方法であって、前記遺伝物質を含む前記形質転換された植物細胞又は植物組織を生産する段階は、請求の範囲１乃至１３のいずれか１項の外来性ＤＮＡ配列ならびに前記植物細胞又は植物組織内での前記外来性ＤＮＡ配列の表現を可能にし形質転換された植物細胞又は植物組織内ならびにそれに統く世代全体を通してこれから生産された植物及び生殖物質の中での前記外来性ＤＮＡ配列の安定した統合をひき起こすことのできる調節要素で、前記出発植物細胞又は植物組織の核ゲノムを形質転換することによって特徴づけられることを特徴とする方法。