JP3105242B2 - 変更された花を有する植物 - Google Patents

変更された花を有する植物

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、遺伝子導入核雄性不稔又は雌性不稔植物の
稔性を回復させる方法であって、該回復植物の核ゲノム
内に安定した形で組込まれた回復植物の核ゲノムからの
外来性DNA配列を有する遺伝子導入被稔性回復植物を提
供するため、不稔性植物を遺伝子導入稔性回復植物と交
配することによる方法に関する。本発明に基づく外来性
DNA配列は、外来性DNA（以下「稔性回復DNA」と呼ぶ）
を含んでおり、この外来性DNAは、１）被回復植物の
花、特にその雄性又は雌性生殖器官、又は種子又は胚の
細胞中で産生又は過剰産生された場合、花、種子又は胚
細胞内の第２のRNA、タンパク質又はポリペプチドの活
性を妨げる第１のRNA、タンパク質又はポリペプチドを
コードし、上記第２のRNA、タンパク質又はポリペプチ
ドは、花、種子又は胚細胞中で産生又は過剰産生された
場合、この花、種子又は胚細胞の代謝、機能及び／又は
発生を不利な形で著しく妨げるものであり、２）第２の
RNA、タンパク質又はポリペプチドが産生又は過剰産生
されている被回復植物の少なくとも同じ花又は種子又は
胚細胞内で稔性回復DNAの発現を誘導することのできる
第１のプロモーターと同じ転写単位内にありこのプロモ
ータの制御下にある。第２のRNA、タンパク質又はポリ
ペプチドは、不稔性植物の核ゲノムに由来し、被回復植
物の核ゲノム内に安定した形で組込まれている「不稔性
DNA」にコードされており、この不稔性DNAは、ｉ）被回
復植物の各々の花、特に少なくとも１つのその雄性又は
雌性生殖器、又は各々の種子又は各々の胚の特定の細胞
の中で選択的に不稔性DNAの発現を誘導することがで
き、ii）特定の花、種子又は胚細胞内での稔性回復DNA
の発現が無い場合に被回復植物を雄性又は雌性不稔にす
ることができる、「不稔性プロモーター」の制御下にあ
る。
回復植物から被回復植物に移入された本発明に基づく
外来性DNA配列は、場合によっては、第２の外来性DNA
（「第１の標識DNA」）をも含みうる外来性キメラDNA配
列であり、上記第２の外来性DNAは、１）植物の少なく
とも特定の組織又は特定の細胞内に存在するとき、その
植物全体を、少なくともその特定の組織又は細胞内に第
３のRNA、タンパク質又はポリペプチドを含まないその
他の植物から容易に分離又は識別できるものにするよう
な第３のRNA、タンパク質又はポリペプチドをコード
し、２）植物の少なくとも特定の組織又は特定の細胞内
で第１の標識DNAの発現を誘導することのできる第２の
プロモーターと同じ転写単位内にあって、このプロモー
ターの制御下にあり、しかも、３）稔性回復DNAと同じ
被回復植物核ゲノム遺伝子座内にある。
本発明は同様に、少なくとも１つの第１のプロモータ
ーの制御下にある少なくとも１つの稔性回復DNAを含
み、同様に稔性回復DNA及び第１のプロモーターに隣接
して少なくとも１つの第２のプロモーターの制御下にあ
る少なくとも１つの第１の標識DNAをも含みうるような
外来性キメラDNA配列にも関する。
本発明はさらに、本発明の外来性DNA配列を含み、植
物細胞の形質転換に適したベクターであって、かくして
外来性DNA配列は細胞の核ゲノム内に安定した形で組込
まれることになるようなベクター；結果として得られる
稔性回復植物細胞；かかる稔性回復植物細胞の培養；こ
のような稔性回復植物細胞から再生でき、しかも、中に
安定した形で組込まれた状態で外来性DNA配列を含む核
ゲノムを有する、稔性回復植物及びその生殖材料（例え
ば種子）；その核ゲノム内に安定した形で組込まれた状
態で、外来性DNA配列ならびに少なくとも１つの不稔性
プロモーターの制御下にある少なくとも１つの不稔性DN
Aを含んでいる、被稔性回復植物及びその生殖材料；及
び、被稔性回復植物の細胞ならびにその培養にも関す
る。
本発明はさらに、植物の細胞を外来性DNA配列で形質
転換することにより回復植物及びその生殖材料を生産す
る方法において、稔性回復DNAは、１）第１のプロモー
ターの制御下にあり、しかも、場合によっては、第２の
プロモーターの制御下にある第１の標識DNAと同じ遺伝
子座内にあり、２）植物の細胞の核ゲノム内に安定した
形で組込まれることを特徴とする方法にも関する。
本発明はさらに、１）好ましくは回復植物に除草剤抵
抗性を付与するタンパク質をコードする第１の標識DNA
をも、核ゲノム内に安定した形で組込まれた状態で含ん
でいる回復植物を、２）核ゲノム内に安定した形で組込
まれた状態で、ａ）不稔性プロモーターの制御下にある
不稔性DNAと、この不稔性DNAに隣接して好ましくは核ゲ
ノムの同じ遺伝子座内にある、ｂ）第４のRNA、タンパ
ク質又はポリペプチドをコードし、第２の標識DNAの発
現によってこの植物がかかる発現の無い植物と容易に分
離又は識別されうる状態になるように少なくとも特定の
組織又は細胞内での第２の標識DNAの発現を誘導できる
第３のプロモーターの制御下にあり、好ましくは不稔性
植物に除草剤抵抗性を付与する、第２の標識DNAとを有
する核雄性又は雌性不稔植物と、交配することによって
生産された雑種種子にも関する。本発明は特に、過度の
手作業を必要とせず、高い他家受粉効率で、好ましくは
ほぼ無作為の個体群の中で商業的規模で生産されるよう
な雑種種子に関する。
発明の背景 植物の雑種形成は、親株の望ましい形質の組合せをも
つ子孫を生産するための重要なプロセスとして認められ
ている。結果として得られた雑種の子孫は、往々にし
て、収量、環境変化に対する適応能力及び疾病抵抗性と
いったさまざまな形質において、親株をしのぐ能力をも
つ。この能力は「ヘテロ−シス（雑種強勢）」又は「ハ
イブリッド・ヴィガー（雑種強勢）」と呼ばれる。その
結果、雑種形成は、トウモロコシ、テンサイ及びヒマワ
リのような主要作物を改良するために広く用いられてき
た。主としてほとんどの植物が自家受粉及び他家受粉の
両方を受けることができるという事実に関連するさまざ
まな理由から、雑種種子の収穫物を生産するためのさほ
ど自家受粉を伴わない制御された植物の他家受粉は、商
業的規模では達成し難いことであった。
自然界においては、作物植物の大部分は、同じ植物
上、通常は同じ花の中で互いに近いところに、雄性及び
雌性の生殖器を生成する。これは自家受粉に有利に働
く。しかしながら、いくつかの植物は、他家受粉に有利
に作用するその生殖器の特別な形態の結果、その例外と
なっている。これらの植物は、改良された生長力及び適
応能力をもつ雑種の子孫を生成する。Cannabis ssp.
（大麻）におけるこのような形態の１つでは、別々の植
物に雄器と雌器がある。Zea mays（トウモロコシ）にお
けるもう１つのこのような形態には、同一植物の異なる
部分に雄器及び雌器がある。Elaeis guineensis（ギネ
アアブラヤシ）におけるもう１つのこのような形態に
は、植物の発生中の異なる時期に稔性となる雄性及び雌
性の生殖体がある。
Ananas comosus（パイナップル）といったその他のい
くつかの植物種は、その生殖器の特殊な生理学を通して
他家受粉に有利に作用している。このような植物は、１
つの植物の花粉が同じ植物の又は同じ遺伝子型をもつ他
の植物の雌性生殖体と受精できないようにするいわゆる
「自家不和合性システム」を発達させている。
その他のいくつかの種は、いわゆる「雄性不稔」のゲ
ノム特性を自然に示すことにより、他家受粉に有利に作
用する。この特性により、植物の葯（やく）は、葯が生
成した花粉が成熟してしまわないうちに退化する。
［「高等植物における雄性不稔」、M.L.H.Kaul,1987年
（Monographs on Theoretical and Applied Genetics 1
0,Springer,Verlag出版）を参照のこと。］このような
天然の雄性不稔特性は、劣化欠失が関与することが多い
広範な天然の突然変異の結果として生じるものと考えら
れており、天然の条件下では種子が生成されないことか
ら、優勢に自家受粉する植物種においてはこの特性を維
持することは容易ではない。
天然に発生するいくつかのタイプの雄性不稔は細胞質
でコードされるが、その他のものは核でコードされる。
雄性不稔の１つのタイプは、核にコードされた雄性不稔
と細胞質にコードされた雄性不稔の両方の組合せの結果
である。雄性不稔を誘発する核対立遺伝子は通常劣性で
あり、雄性不稔性細胞質対立遺伝子を含み、雄性不稔誘
発核対立遺伝子に関して同型接合である植物だけが、表
現型上雄性不稔である。このタイプの植物においては、
対応する優性の雄性稔性誘発対立遺伝子又は「稔性回復
遺伝子」は、雄性稔性の表現型を生成する。その結果、
このタイプの植物の雄性不稔性の子孫は、雄性不稔植物
を稔性回復遺伝子を含む花粉で受粉させることによって
雄性稔性にすることができる。その結果、このタイプの
植物の子孫は、経済的産物が種子であるような商業的価
値のあるものである（例えばトウモロコシ、モロコシ類
及びヒマワリなど）。
天然に発生する既知の雄性不稔性遺伝子及び対応する
その稔性回復遺伝子の大部分は、ａ）雄性不稔及び回復
特性の原因である遺伝子の質が不充分である、及びｂ）
これらを発生させる作物の他家受粉能力が低い、という
２つの基本的な理由のため、新しい品種の育種又は生産
において、これまで使用されなかった。
1.遺伝子の品質 雄性不稔／稔性回復システムの潜在力を充分に実現す
るためには、次のようないくつかの品質必要条件を達成
しなくてはならない： ａ）広範な異なる環境条件下での雄性不稔性をコードす
る遺伝子の安定性。現在知られているシステムの大部分
は、それが核でコードされるか細胞質でコードされるか
に関わらず、充分な安定性を示さない。その結果、予想
できない或る種の気象条件下では、植物内で自家受粉が
起こり、異種起源の子孫が収穫される。種子証明規定要
件によると、ほとんどの主要農作物について１％未満の
非雑種種子が許容される。
ｂ）植物に対する副作用が無いこと。数多くの細胞質雄
性不稔性遺伝子は、草勢の減少を誘発する。これは、雑
種強勢効果がマイナス効果に比較して作物の著しい改良
を提供する場合、或る程度までは許容できる。雄性不稔
性遺伝子を有する作物中に見られたもう１つの副作用
は、或る種の植物病原体に対する感受性の増大にある
（例えば、Ｔ−細胞質雄性不稔性を有するトウモロコシ
植物はきわめてHelminthosporium maydisに感染しやす
い）。
回復遺伝子も又、通常これらの遺伝子自体のせいでは
なく回復遺伝子に密に関連した遺伝子のせいであるもの
の、往々にしてマイナスの副作用を示す。これらの副作
用は、ほとんどの場合において、疾病又は有害生物に対
する感受性の増大又は作物品質の低下から成る。
2.他家受粉の効率 受容できるコストでの雑種種子の生産のためには、妥
当な効率の他家受粉が不可欠である。他家受粉に対する
適合性の低い主要農作物については、手で他家受粉を行
なうことは現実的なことではない。従って、商品とし
て、F1雑種ではなくその自殖されたF2子孫を販売するこ
とが考慮されてきた（例えば、綿及び小麦）。しかしな
がら、この方法の欠点は、均一性及び雑種強勢（ヘテロ
ーシス）の喪失及び特異的な有用な遺伝子組合せの分離
にある。農民による作物の高い収量を確保するために
は、雑種作物が充分に稔性であることが有利である（た
だし、トウモロコシやナタネといったきわめて効率の良
い他家受粉種は例外である）。これは特に、風により容
易に輸送されない重い又は粘着性ある花粉を形成する作
物（例えば綿）、花粉媒介昆虫に対する魅力の無い作物
（例えば小麦）及び閉花受精を示す作物（例えば大豆）
の場合に言えることである。
発明の要約 本発明に従うと、核ゲノムの中に安定した形で組込ま
れた状態で、外来性DNA配列、好ましくは外来性キメラD
NA配列を含んでいるような遺伝子導入被稔性回復植物が
提供される。上記外来性DNA配列又は外来性キメラ配列
は、 （ａ）植物の花、特にその雄器又は雌器、種子又は胚の
細胞内で産生又は過剰産生された場合、花、種子又は胚
細胞内で第２のRNA、タンパク質又はポリペプチドの活
性を妨げる第１のRNA、タンパク質又はポリペプチドを
コードする稔性回復DNA;この第２のRNA、タンパク質又
はポリペプチドは、花、種子又は胚細胞中で産生又は過
剰産生された場合に、花、種子又は胚細胞の代謝、機能
及び／又は発生を著しく妨害しうるものであり；第２の
RNA、タンパク質又はポリペプチドは、同様に植物の核
ゲノム内に安定した形で組込まれ、しかも植物の花、特
にその雄器又は雌器、及び／又は種子及び／又は胚の各
々の特定の細胞内で選択的に不稔性DNAの発現を誘導す
ること、ひいては特定の花、種子及び／又は胚の細胞内
で稔性回復DNAの発現が無い場合にその植物を雄性不稔
又は雌性不稔にすることのできる不稔性プロモーターの
制御下にある不稔性DNAによって、コードされる；及び （ｂ）不稔性プロモーターが不稔性DNAの遺伝子発現を
誘導する植物の、少なくとも特定の花、種子及び／又は
胚細胞内で、稔性回復DNAの発現を誘導することのでき
る第１のプロモーター；なお稔性回復DNAは、この第１
のプロモーターと同じ転写単位内にあり、このプロモー
ターの制御下にある、 を特徴とする。
被回復植物の核ゲノム内の外来性DNA配列は、同様
に、好ましくは稔性回復DNAと同じ遺伝子座内に、 （ｃ）植物の少なくとも特定の組織又は特定の細胞内に
存在するとき、この植物を、少なくとも特定の組織又は
特定の細胞内に第３のRNA、タンパク質又はポリペプチ
ドを含まないその他の植物から容易に分離又は識別でき
るものにするような第３のRNA、タンパク質又はポリペ
プチドをコードする第１の標識遺伝子；及び （ｄ）少なくとも特定の組織又は特定の細胞内で第１の
標識DNAの発現を誘導するこのできる第２のプロモータ
ー（なお第１の標識DNAは第２のプロモーターと同じ転
写単位内にあり、このプロモーターの制御下にある） をも含んでいてもよい。
同様に本発明に従うと、稔性回復DNA及び第１のプロ
モーターを含み、しかも第１の標識DNA及び第２のプロ
モーターならびに、その細胞質内で外来性キメラDNA配
列が発現されている植物細胞の葉緑体又はミトコンドリ
ア内へと第１のタンパク質又はポリペプチド又は第３の
タンパク質又はポリペプチドを輸送することのできるト
ランジットペプチドをコードする少なくとも１つの付加
的なDNAをも含みうる、外来性キメラDAN配列が提供され
る。
さらに本発明に従うと、安定した形で組込まれた状態
で、不稔性プロモーターの制御下にある不稔性DNA及び
好ましくは第３のプロモーターの制御下にある第２の標
識DNAを含む核ゲノムを有する、遺伝子導入雄性不稔又
は雌性不稔植物を、第１のプロモーターの制御下にある
稔性回復DNA及び好ましくは第２のプロモーターの制御
下にある第１の標識DNAが安定した形で組込まれている
核ゲノムをもつ遺伝子導入稔性回復植物と交配すること
によって、遺伝子導入稔性回復植物を提供するための方
法が提供される。
さらに本発明に従うと、外来性DNA配列で形質転換さ
れ、稔性回復植物を再生するのに使用できる、遺伝子導
入稔性回復植物の細胞ならびにそれで構成された培養細
胞；遺伝子導入被稔性回復植物の細胞ならびにそれで構
成された培養細胞；及び遺伝子導入稔性回復植物を、不
稔性プロモーターの制御下にある不稔性DNAを有する遺
伝子導入雄性又は雌性不稔植物と交配することによっ
て、遺伝子導入被稔性回復植物へと生長する雑種種子を
得るための方法も提供される。
発明の詳細な説明 本発明に従うと、細胞の核ゲノム内に本発明に基づく
外来性DNA配列を安定した形で挿入するよう周知のやり
方で植物細胞を形質転換することによって、稔性回復植
物が、植物の単一の細胞から生産される。この外来性DN
A配列には、第１のプロモーターの制御下にあり、その
５′末端でこの第１のプロモーターに融合され、その
３′末端でポリアデニシル化シグナルを含む適当な転写
終結（又は調節）シグナルに融合されている、少なくと
も１つの稔性回復DNAが含まれる。かくして、第１のRN
A、タンパク質又はポリペプチドは、少なくとも回復植
物の花、好ましくはその単数又は複数の雄性又は単数又
は複数の雌性生殖器、及び／又は種子及び／又は胚の各
々の細胞内で産生又は過剰産生され、そのため回復植物
が核雄性不稔又は核雌性不稔植物と交配された場合、雑
種雄性稔性雌性稔性の子孫が得られることになる。この
外来性DNA配列は、第２のプロモーターの制御下にあ
り、その５′末端でこの第２のプロモーターに融合さ
れ、その３′末端でポリアデニル化シグナルを含む適当
な転写終結シグナルに融合された、少なくとも１つの第
１の標識DNAをも含んでいてもよい。この第１の標識DNA
は、好ましくは稔性回復DNAと同じ遺伝子座内にあり、
かくして第３のRNA、タンパク質又はポリペプチドは、
少なくとも稔性回復植物の特定の組織又は特定の細胞内
で産生され、この植物を特定の組織又は特定の細胞内に
第３のRNA、タンパク質又はポリペプチドを含まない植
物から容易に識別及び／又は分離できるようにしてい
る。こうして、きわめて高い確実性で稔性回復DNA及び
第１の標識DNAの両方が植物の子孫にいっしょに分離す
ることが保証される。
植物（特にAgrobacteriumの感染を受けることのでき
る植物）の細胞は、好ましくは、外来性DNA配列を含みA
grobacteriumにより運ばれる非病原化されたTi−プラス
ミドであるベクターを用いて、本発明に従って形質転換
される。この形質転換は、例えば欧州特許公報0,116,71
8号及び0,270,822号内に記されている手順を用いて行な
うことができる。好ましいTi−プラスミドベクターは、
Ti−プラスミドのＴ−DNAのボーダー配列の間、又は少
なくとも右側ボーダー配列の左側に位置づけされた形
で、外来性DNA配列を含む。当然のことながら、直接遺
伝子移入（例えば欧州特許公報0,223,247号に記載のも
の）、花粉媒介形質転換（例えば欧州特許公報0,270,35
6号、PCT公報W085/01856及び欧州特許公報0,275,069号
に記されているもの）、生体外原形質体（プロトプラス
ト）形質転換（例えば米国特許4,684,611号に記されて
いるもの）、植物RNAウイルス媒介形質転換（例えば欧
州特許公報0,067,553号及び米国特許4,407,956号に記載
のもの）及びリボゾーム媒介形質転換（例えば米国特許
4,536,475号に記載のもの）といった手順を用いて、そ
の他のタイプのベクターを植物細胞の形質転換のために
用いることもできる。
好ましくは、本発明に基づく稔性回復植物は、第１の
プロモーターの制御下にある稔性回復DNA（及び場合に
よっては第２のプロモータの制御下にある第１の標識DN
A）を含む外来性DNA配列を含む非病原化されたTi−プラ
スミドベクターを用いて、植物細胞を形質転換すること
によって提供される。標識DNAは、Ti−プラスミドベク
ターにおいて稔性回復DNAの上流にあっても下流にあっ
てもよいが、好ましくはこれら２つの互いに隣接し合
い、Ti−プラスミドベクターのボーダー配列の間にある
か又は少なくとも右側ボーダー配列の左側に位置づけさ
れ、植物細胞の核ゲノム内に一緒に適切に移入されるよ
うになっている。しかし望まれる場合には、細胞を、最
初、稔性回復DNA及び第１のプロモーターを含む外来性D
NA配列で形質転換し、その後、稔性回復DNAと同じ細胞
核ゲノム内遺伝子座内に挿入される形で標識DNA及び第
２のプロモーターを用いて形質転換してもよいし、或い
は又この形質転換を逆に行なうこともできる。この目的
に適当なベクターは、外来性DNA配列での細胞の形質転
換の場合について前述したものと同じである。好ましい
ベクタは非病原化されたTi−プラスミドベクターであ
る。
本発明に基づく稔性回復DNAの選定は重要なことでは
ないが、回復されるべき雄性又は雌性不稔性の原因であ
る不稔性DNAの選択によって左右され、このDNAに対応し
ていなくてはならない。特に、稔性回復DNAによりコー
ドされる第１のRNA、タンパク質又はポリペプチドの産
生又は過剰産生は、被回復植物の花細胞、好ましくは少
なくとも１つの雄性又は少なくとも１つの雌性生殖器の
細胞、又は種子細胞又は胚細胞内で、不稔性DNAにより
コードされる第２のRNA、タンパク質又はポリペプチド
の特異的活性を中和、阻害、相殺、克服又はその他の形
で妨害しなくてはならない。
本発明の稔性回復DNAに対応しなくてはならず、又こ
れらが妨害すべき作用を有するような雄性及び雌性不稔
DNAの例については、それぞれ本書中に参考として包含
されている欧州特許出願明細書89401194.9号及び904021
96.1号の中に記述されている。不稔性プロモーターによ
り不稔性DNAが発現されている花、特に雄器又は雌器、
種子及び／又は胚のいずれかの細胞内における不稔性DN
Aの効果を克服するよう、周知の方法で適当な稔性回復D
NAを選択及び分離することができる。
稔性回復DNAの好ましい例は、バルナーゼ（これはあ
らゆるグアニン残基の後で結合を加水分解することによ
りRNA分子を分解する）の活性を中和するバルスター；
エンドヌクレアーゼEcoR Iの活性を妨げるEcoR Iメチラ
ーゼ；又はパパンインのようなタンパク質分解酵素
（例：パパインチモーゲン及びパパイン活性タンパク
質）の活性を中和するタンパク質分解酵素抑制因子、を
コードする。
稔性回復DNAのもう１つの例は、不稔性プロモーター
の制御下で、そうでなければ不稔性である植物の花、種
子又は胚細胞内で転写される不稔性DNAをコードするDNA
の１つの鎖に対し相補的なDNAの鎖をコードするアンチ
センスDNA（例えば欧州特許公報0,223,399号に記載のも
の）である。このようなアンチセンスDNAは、不稔性DNA
の発現の結果として花、種子及び／又は胚内に生成され
た「不稔性RNA」のコード部分及び／又は非コード部分
に結合することのできるRNA配列内に転写され得、かく
してこのように産生された不稔性RNAの翻訳を中和す
る。このようなアンチセンスDNAの例としては、バルナ
ーゼ;EcoR I;サイトキニン生合成の第１段階にて触媒と
して作用しAgrobacterium T−DNAの遺伝子４によりコー
ドされる酵素であるイソペンテニルトランスフェラーゼ
等の植物ホルモンの合成に対し触媒として作用する酵
素；オーキシン合成に関与する、Agrobacterium T−DNA
の遺伝子１及び遺伝子２によりコードされる酵素、又は
代替的に遺伝子１又は遺伝子２のいずれかによりコード
される酵素；グルカナーゼ；ホスホリパーゼA2等のリパ
ーゼ［Verheij他著（1981年）Rev.Biochem.Pharmacol,9
1.,92−203］；脂質ペルオキシダーゼ；植物細胞壁抑制
因子；及び細菌毒素等の植物細胞にとって有害なタンパ
ク質（例；ジフテリア毒素又はポツリヌス毒性のＡ−フ
ラグメント）；等の第２のタンパク質をコードする不稔
性DNAのアンチセンスDNA、ならびに天然の自家不和合性
遺伝子をコードする不稔性DNAのアンチセンスDNAがあ
る。
稔性回復DNAのその他の例は、Haseloff及びGerlach
（1988年）Nature 334,585−591によって記述されてい
るように、一定の与えられた標的配列に対するきわめて
特異的な切断が可能な特異的RNA酵素（すなわち、いわ
ゆる「リボザイム」）をコードする。このようなリボザ
イムは、例えば、上に挙げた不稔性DNAの１つをその標
的とするリボザイムである。
稔性回復DNAのさらなる例は、上述の異なる稔性回復D
NAの単数又は複数の組合せでありうる。
本発明の外来性DNA配列に関して用いている「外来
性」という語は、この外来性DNA配列が外来性稔性回復D
NA及び／又は外来性の第１のプロモーターを含んでいる
ことを意味している。外来性DNA配列内の、陰性回復DNA
及び第１のプロモーター等のDNA、ならびに第１の標識D
NA、第２のプロモーター及びその他のDNA、のようなDNA
に関して用いられる「外来性」という語は、このような
DNAが、本発明に従ってこのDNAで形質転換された植物細
胞の中で、その起源である植物、細菌、動物、真菌、ウ
イルスその他の細胞の中で自然に見い出されるのと同じ
ゲノム環境の中にないということを意味している。すな
わち、例えば、外来性稔性回復DNA又は第１の標識DNA
は、１）原植物内の核DNAであり、２）形質転換された
植物細胞に対し内在性であり（すなわち形質転換される
植物と同じ遺伝子型をもつ原植物からのものである）；
しかも３）形質転換された植物細胞内の本発明に基づく
外来性DNA配列内で（原植物からの）３′末端転写調節
シグナル及びそれ自体の内在性プロモーターと同じ転写
単位内にあるものの、４）形質転換された植物内では原
植物内で天然にそれをとり囲んでいた遺伝子によってと
り囲まれることがないよう、原植物内における場合とは
異なる場所に、形質転換された植物の核ゲノム内に挿入
されていることが考えられる。外来性稔性回復DNA又は
第１の標識DNAは同様に、例えば１）原植物内の核DNAで
あり、２）形質転換された植物細胞に対し内在性である
ものの）、３）形質転換された植物細胞内の本発明の外
来性キメラDNA配列内で、異なる（すなわちそれ自身の
ものでない）内在性プロモーター及び／又は３′末端転
写調節シグナルと同じ転写単位内にあることが考えられ
る。外来性稔性回復DNA又は第１の標識DNAは同様に、例
えば１）原植物内の核DNAであり、２）形質転換された
植物細胞に対し内在性であるものの、３）形質転換され
た植物細胞内で本発明の外来性キメラDNA配列内の非相
同プロモーター及び／又は３′末端転写調節シグナルと
同じ転写単位内にあることが考えられる。外来性稔性回
復又は第１の標識DNAは、例えば、形質転換された植物
細胞に対して非相同で、しかも、形質転換された植物細
胞内の本発明の外来性キメラDNA配列内で、内在性プロ
モーター及び／又は３′転写調節シグナル（例えば、形
質転換される植物と同じ遺伝子型をもつ植物の核ゲノム
からのもの）と同じ転写単位内にあることも考えられ
る。外来性稔性回復DNAの一例は、形質転換される植物
と同じ遺伝子型をもつ植物の核ゲノムからのもので、形
質転換される植物に対し内在性であるタンパク質分解酵
素又はリボヌクレアーゼ抑制因子等の触媒酵素の抑制因
子をコードすることができ、そのためこの酵素は、それ
が中で発現される花細胞、特に雄器及び雌器細胞、又は
種子細胞又は胚細胞の代謝、機能及び／又は発生を不利
な形で著しく妨害するようなタンパク質分解酵素又はリ
ボヌクレアーゼ（すなわち雄性又は雌性不稔性DNAによ
りコードされる第２のタンパク質）の活性を中和するべ
く、形質転換された細胞内で過剰産生されることにな
る。
好ましくは、各々の稔性回復DNA及び第１の標識DNA
は、形質転換される植物細胞に対し非相同である。
本発明の外来性DNA配列内の稔性回復DNA、第１又は第
３のプロモーター、第１の標識DNA及びその他のDNA等
の、DNAに関して用いられている「非相同の（heterolog
ous）」という語は、このようなDNAが、形質転換される
植物と同じ遺伝子型をもつ植物の細胞の核ゲノム内に、
天然に見い出されないということを意味している。非相
同DNAの例としては、形質転換される植物と同じ遺伝子
型を有する植物から得られた葉緑体及びミトコンドリア
DNAがあるが、好ましい例は、形質転換される植物とは
異なる遺伝子型をもつ植物からの葉緑体、ミトコンドリ
ア及び核のDNA、及び、動物及び細菌性ゲノムからのDNA
及び真菌及びウイルス性ゲノムからの染色体及びプラス
ミドDNAである。
本発明の外来性DNA配列に関して用いる「キメラ
（の）」という語は、その稔性回復DNAのうち少なくと
も１つが、１）自然界で、１つの稔性回復DNAに対する
その第１のプロモーターの制御下になく；及び／又は
２）自然界で、その第１の標識DNAの少なくとも１つと
同じ遺伝子座内に見い出されない、ということを意味し
ている。本発明の外来性キメラDNA配列の例には、植物
起源の第１のプロモーターの制御下にある細菌起源の稔
性回復DNA;及び植物起源の第１のプロモーターの制御下
にあり、しかも細菌起源の第１の標識DNAと同じ遺伝子
座内にある、植物起源の稔性回復DNAが含まれる。
「花」というのは、その発生が全体的又は部分的に遅
らされたか又は止められた場合、花の中の生存種子の発
生及び／又は増幅又はその雄性生殖体の発生及び／又は
増殖が妨げられるような、苗条軸、がく片、花片、雄性
生殖器（又は雄ずい）及び／又は雌性生殖器（又は心
皮）全体を含むものとする。「雄器」又は「雄性生殖
器」というのは、花の中で雄性配偶子の生産に関与して
いる器官全体、ならびにその葯、花粉及び花糸等の単数
又は複数のその個々の部分のことである；「雌器」又は
「雌性生殖器」というのは、花のうち雌性生殖体及び／
又は生存種子及び／又は生存胚の生産に関与する器官全
体、ならびに胚珠、子房、花柱、柱頭、花冠、花盤、隔
膜、がく及び胎座等の単数又は複数の個々の部分を意味
する。「胚」というのは、植物の胚全体、ならびにその
胚軸及び子葉等の単数又は複数の個々の部分を含む。
稔性回復DNAが、被稔性回復植物のうち、少なくと
も、不稔性DNAが中で発現されているような特定の細胞
内で発現されるためには、稔性回復DNAの発現を制御す
る第１のプロモーターが、少なくとも、不稔性プロモー
ターの制御下にある不稔性DNAが中で選択的に発現され
ているような同じ被稔性回復植物細胞（すなわち特定の
花細胞、好ましくは雄器又は雌器細胞、又は種子細胞又
は胚細胞）内で、遺伝子発現を誘導することのできるプ
ロモーターであることが好ましい。このような第１のプ
ロモーターは、内在性プロモーターであっても外因性プ
ロモーターであってもよく、植物細胞のミトコンドリア
又は葉緑体ゲノムから又は核ゲノムからのものでありう
る。いずれの場合でも、第１のプロモーターは、形質転
換されている植物細胞の核ゲノムに対し外来性である。
第１のプロモーターは構成的プロモーターであってよい
が、同様に、不稔性プロモーターと同じ選択的プロモー
ターであってもよい。好ましくは、第１のプロモーター
は、不稔性DNAが発現されているものと同じ特定の花、
種子又は胚細胞、特に同じ特定の花細胞の中での、充分
な量の稔性回復用の第１のRNA、タンパク質又はポリペ
プチドの産生を通して、稔性の回復をひき起こす。
本発明に基づく第１のプロモーターは、例えば、植物
の雄ずい（例えば葯）細胞内で選択的に不稔性DNAの発
現を誘導し、この植物のその他の部分における不稔性DN
Aの発現を妨げるのに有効な雄性不稔性プロモーターを
開示する、本書に参照により包含される欧州特許出願明
細書89,401194.9号；ならびに、植物の花の細胞、特に
雌器（例えば雌ずい）、又は種子細胞又は胚細胞内で選
択的に不稔性DNAの発現を誘導し、この植物のその他の
部分における不稔性DNAの発現を妨げるのに有効な雌性
不稔プロモーターを開示している、本書に参照により包
含される欧州特許出願明細書90402196.1号の中に記され
ているように、１つの植物種から既知の方法で選択及び
単離されうる。例えば、適当な内在性の器官又は組織特
異的な第１のプロモーターは、１つの植物内で、以下の
作業により識別及び単離されうる： 1.花、種子又は胚、好ましくは葯、花粉、花糸、子房、
胚珠、花柱、柱頭、胎座、がく、胚盤、隔膜、種皮、胚
乳又は子葉の発生の間にのみ植物の中に存在するmRNAを
探すこと； 2.この特異的mRNAを単離すること； 3.この特異的mRNAからcDNAを調製すること； 4.このcDNAをプローブとして用いて、特異的mRNAをコー
ドするDNAを含む植物ゲノム内の領域を識別すること、
そして次に 5.特異的mRNAをコードするDNAから上流にあり（すなわ
ち５′側）、このDNAのプロモーターを含む植物ゲノム
の一部分を識別すること。
これらの第１のプロモーターにより制御される遺伝子
はさらに、上述の工程４と同様にしてプローブとして用
いることができる。ハイブリダイゼーション条件におい
て、これらのプローブは、もう１つの植物種のゲノムか
らのDNA配列の混合物中の特定のmRNAをコードするDNAと
ハイブリダイズする［Maniatis他著（1982年），「Mole
cular Cloning.A Laboratory Manual」Cold Spring Har
bor Laboratory刊行］。その後、上記工程５にあるよう
に、もう１つの植物種についての特異的な第１のプロモ
ーターを識別することができる。
雄器特異的な第１のプロモーター及び不稔性プロモー
ターの例としては、欧州特許出願明細書89401194.9号に
記されているような、タバコから分離されたタペタム特
異プロモーターであるPTA29プロモーター、PTA29プロモ
ーター及びPTA13プロモーター；ならびに、PTA29、PTA2
6及びPTA13プロモーターが単離された遺伝子である欧州
特許出願明細書89401194.9の遺伝子TA29、TA26又はTA13
にハイブリダイズ可能なタペタム特異的mRNAをコードす
る遺伝子のあらゆるプロモーターがある。雌器特異的な
第１のプロモーター及び不稔性プロモーターの例として
は、欧州特許出願明細書90402196.1号内に記載のcDNAク
ローンpMON9608に対応する胚珠特異的プロモーター及び
PSTMG07、PSTMG08、PSTMG4B12及びPSTMG3C9等の花柱及
び／又は柱頭特異的プロモーター；ならびに、それぞれ
ｉ）STMGタイプの花柱−柱頭特異的遺伝子又はii）欧州
特許出願明細書90402196.1号のcDNAクローンpMON9608、
に対しハイブリダイス可能な、ｉ）花柱−柱頭特異的又
はii）胚珠特異的mRNAをコードする遺伝子のプロモータ
ーがある。
本発明の遺伝子導入稔性回復植物と交配されるべき遺
伝子導入不稔植物の中に複数の核不稔性DNAが存在する
場合には、回復植物は、少なくとも不稔性植物の核ゲノ
ム内の不稔性DNAの数に等しい数の本発明に基づく複数
の稔性回復DNAがその核ゲノム内に挿入されている必要
があるかもしない。全ての稔性回復DNAが単一の第１の
プロモーターの制御下にあってもよいが、好ましくは、
各々の稔性回復DNAは、少なくとも、不稔性プロモータ
ーが不稔性DNAに第２のRNA、タンパク質又はポリペプチ
ドを発現させるような細胞内において、第１のRNA、タ
ンパク質又はポリペプチドの発現を誘導するような独自
の個別の第１のプロモーターの制御下にある。各々の稔
性回復DNAはその第１のプロモーターに隣接しており、
全ての稔性回復DNA及びその第１のプロモーターは、好
ましくは、本発明の外来性DNA配列内で、及びこのよう
な外来性DNA配列で植物細胞を形質転換するのに用いら
れるあらゆるベクターの中で、互いに隣接している。し
かしながら、稔性回復DNAが外来性DNA配列内で互いに隣
接する必要はなく、いくつかの場合において、これらは
独立した形質転換事象を通して回復植物の核ゲノム内に
挿入されてもよい。
本発明の第１の標識DNAの選択も同様に重要ではな
い。第１の標識DNAを発現する植物がこれを発現しない
植物から容易に識別され、分離されうるようにする、第
３のRNA、タンパク質又はポリペプチドをコードするよ
うに、周知の方法で適当な第１の標識DNAを選択し、単
離することができる。多くの場合において、第１の標識
DNAは、本発明に従って稔性が回復されるべき核雄性又
は雌性不稔植物内で第２の標識DNAがコードするのと同
じRNA、タンパク質又はポリペプチドをコードする。第
１の標識DNAの例としては、ジヒドロケルセチン−４−
還元酵素をコードするA1遺伝子［Meyer他（1987年）Nat
ure 330,677−678］及びグルクロニダーゼ遺伝子［Jeff
erson他（1988年）、Proc,Natl,Acad,Sci.U.S.A.（「PN
AS］）83,8447］のように植物細胞に対し識別可能な色
を与えるもの；矮形性成長又は葉の異なる形状等の特定
の形態学的特性を提供するものの；欧州特許出願明細書
88402222.9号に記載されているようにスーパーオキシド
ジムスターゼをコードする遺伝子により提供されるよう
に、植物にストレス許容性を付与するもの；欧州特許出
願明細書86300291.1号に記されているように虫害抵抗性
を付与するBacillus thuringiensis内毒素をコードする
遺伝子により提供されるもののように、疾病又は有害生
物に対する抵抗性を植物に付与するもの；或いは、欧州
特許出願明細書88401673.4号に記されている細菌ペプチ
ドにより提供されるような、細菌抵抗性を植物に付与す
るもの等の、いずれかのタンパク質又はポリペプチドを
コードする、欧州特許出願明細書89401194.9号及び9040
2196.1号に記されている核雄性及び雌性不稔植物の核ゲ
ノム内の標識DNAがある。
好ましい第１の標識DNAは、欧州特許出願明細書87400
544.0内に記載されているようなBialaphos及びホスフィ
ノトリシン等のグルタミンシンセターゼ抑制因子に対す
る抵抗性を付与する酵素をコードするsfr遺伝子及びsfr
v遺伝子；ならびに、欧州特許公報0,240,792号に記され
ているホスフィノトリシンの標的としての改変グルタミ
ンシンセターゼ及びヨーロッパ特許公報0,218,571号に
記されているグルホセートの標的としての改変５−エノ
ールピルビルシキメート−３リン酸塩シンターゼ等の、
天然に産生される内在性酵素に比べ除草剤に対する親和
力が低い、いくつかの除草剤の改変標的酵素をコードす
る遺伝子等の、除草剤の活性を抑制又は中和する第３の
タンパク質又はポリペプチドをコードする。その他の第
１の標識DNAは、除草剤プロモキシニル［Stalker他著
（1988年）；「Genetic Improvements of Agricultural
ly important Crops」、刊行:R.T.Fraley,N.M.Frey及び
J.Schell,Cold Spring Harbor Laboratories］又は除草
剤スルフォニル尿素［Lee他著（1988年）EMBOJ.７.1241
−1248］又は除草剤2,4D（エルサレムにて1988年11月13
−18日に開催された第２回国際植物分子生物学シンポジ
ウムにて公表）の作用を中和する第３のタンパク質をコ
ードする。
第１の標識DNAを制御する本発明の第２のプロモータ
ーは、同様に、第３のRNA、タンパク質又はポリペプチ
ドの性質に応じて望まれるように、植物全体の中に構成
的に、又は単数又は複数の特定の組織又は細胞内で選択
的に、第１の標識DNAが発現されるように、周知のやり
方で選択及び単離されうる。多くの場合において、第２
のプロモーターは、本発明に従って稔性が回復されるべ
き雄性又は雌性不稔植物内で第２の標識DNAを制御する
第３のプロモーターと同じである。例えば、第１の標識
DNAが除草剤抵抗性をコードする場合、35Sプロモーター
［Odell他（1985年）Nature 313,810−812］、35S′３
プロモーター［Hull及びHowell（1987年）「Virology」
86、482−493）、Ti−プラスミドのノパリンシンセター
ゼ遺伝子のプロモーター（「PNOS」）「Herrera−Estre
lla（1983年）、Nature 303,209−213）又はオクトピン
シターゼ遺伝子のプロモーター［「POCS」（De Greve
他、（1982年）、J.Mol.Appl.Genet.１（６）,499−51
1）］等の強い構成的な第２のプロモーターを用いて、
第１の標識DNAを植物の全ての細胞内で発現させること
が有益でありうる。第１の標識DNAが、疾病抵抗性を付
与するタンパク質をコードする場合には、例えばTi−プ
ラスミドのTR1′又はTR2′プロモーター等のTRプロモー
ターである［Velten他（1984年）EMBO J.３,2723−273
0］第２のプロモーターを用いることにより、障害組織
内で第１の標識DNAを選択的に発現させると有利かもし
れない。第１の標識DNAが除草剤抵抗性をコードする場
合には、例えば、Rubiscoの小サブユニットをコードす
る遺伝子のプロモーター（欧州特許出願明細書8740054
4.0）等を第２のプロモーターとして用いて、緑色組織
内で第１の標識DNAを選択的に発現させることが有利で
あるかもしれない。第１の標識DNAが色素をコードする
場合には、第１の標識DNAが花弁細胞、葉細胞又は種子
細胞等の特定の細胞、好ましくは種皮の外側層内で発現
されるように、第２のプロモーターを選択することが有
利であるかもしれない。
本発明の回復植物又は被回復植物内で本発明の外来性
DNA配列内に包含させるのに適した組織特異適な第２の
プロモーターを既知の方法で識別及び単離し、かくし
て、第２のプロモーターの制御下にある第１の標識DNA
を担持しているものとしてこの植物を容易に識別できる
ようにすることができる。これは、以下の作業によって
可能である： 1.花弁、葉又は種子等の特定の組織の発生中にのみその
植物内に存在するmRNAを探すこと、 2.この組織特異的mRNAを単離すること、 3.この組織特異的mRNAからcDNAを調製すること、 4.このcDNAをプローブとして用いて、組織特異的mRNAを
コードするDNAを含む植物ゲノム内の領域を識別するこ
と、そして次に、 5.組織特異的mRNAをコードするDNAから上流にあり、こ
のDNAのためのプロモーターを含む植物ゲノムの一部分
を識別する。
本発明の外来性DNA配列の中に複数の第１の標識DNAが
存在する場合、全ての第１の標識DNAが単一の第２のプ
ロモーターの制御下にあってもよいが、好ましくは、各
々の第１の標識DNAはそれ自体の個別の第２のプロモー
ターの制御下にある。さらに好ましくは、各々の第１の
標識DNAは、独自の第２のプロモーターの制御下にあ
り、形質転換された植物に対して異なる識別可能な特性
を与える異なる第３のRNA、タンパク質又はポリペプチ
ドをコードする。いずれの場合でも、第１の標識DNA及
び第２のプロモーターは、互いに対して、及び、本発明
の外来性DNA配列内及び外来性DNA配列で植物細胞を形質
転換するのに用いられるあらゆるベクター内に含まれる
単数又は複数の稔性回復DNAに対して、隣接しているべ
きである。
一般に、稔性回復DNAによりコードされる第１のRNA、
タンパク質又はポリペプチドは、不稔性DNAが発現され
ている植物細胞の核又は細胞質内で、不稔性DNAにより
コードされる第２のRNA、タンパク質又はポリペプチド
の活性を実質的に妨げるものであることが好ましい。し
かしながら、第１のタンパク質又はポリペプチド及び／
又は第３のタンパク質又はポリペプチドを、形質転換さ
れた植物の細胞の葉緑体又はミトコンドリアへと細胞質
から輸送させることが望ましい場合、外来性DNA配列は
さらに、トランジットペプチドをコードする付加的な外
来性DNAを含むことができる。この付加的なDNAは、第１
のタンパク質又はポリペプチドがこのように輸送される
べきである場合、稔性回復DNAと第１のプロモーターの
間にあり、第３のタンパク質又はポリペプチドがこのよ
うに輸送されるべき場合には、第１の標識DNAと第２の
プロモーターの間にある。「トランジットペプチド」と
いうのは、通常、葉緑体又はミトコンドリアタンパク質
又はこのタンパク質のサブユニットと結合しており、細
胞の核DNAによりコードされる前駆体タンパク質として
細胞内に生成されるポリペプチドフラグメントのことで
ある。トランジットペプチドは、葉緑体又はミトコンド
リアの中への、核にコードされた葉緑体又はミトコンド
リアタンパク質又はサブユニットの転移プロセスの原因
となるものであり、このようなプロセス中に、トランジ
ットペプチドは葉緑体又はミトコンドリアタンパク質又
はサブユニットから分離されるか又はタンパク質分解に
より除去される。欧州特許出願明細書85402596.2及び88
402222.9号及びVan den Broeck他（1985年）Nature 31
3,358−363;Schatz（1987年）Eur.J.of Bioch.165,1−
6;及びBoutry他（1987年）Nature 328,340−342に一般
的に記されているように、単数又は複数の第１又は第３
のタンパク質又はポリペプチドを輸送するために本発明
の外来性DNA配列内にこのような付加的なDNAを単数又は
複数与えることが可能である。葉緑体内への輸送のため
の適当なトランジットペプチドの一例は、酵素RUBPカル
ボキシラーゼの小サブユニットのトランジットペプチド
であり（欧州特許出願明細書85402596.2号）、ミトコン
ドリア内への輸送のためのトンジットペプチドの一例
は、酵素Mn−スーパーオキシドジスムターゼのトランジ
ットペプチド（欧州特許出願明細書89401194.9号；本書
例３も参照のこと）である。
本発明の外来性DNA配列において、３′転写終結シグ
ナルは、植物細胞内で適正な転写終結とmRNAのポリアデ
ニル化を提供することのできるものの中から選ぶことが
できる。転写終結シグナルは、転写されるべき外来性遺
伝子又はDNAの天然のものであってもよいし、或いは外
来性又は非相同性のものであってもよい。
非相同性転写終結シグナルの例としては、オクトピン
シンターゼ遺伝子［Gielen他（1984年）EMBO.J.３,835
−845］およびＴ−DNA遺伝子７［Velten及びSchell（19
85年）「Nucleic Acid Research」（「NAR」13、6981−
6998］のものがある。
同様に、本発明に従うと、本発明の外来性DNA配列を
含む植物細胞の培養（物）は、一倍体細胞培養物［Chuo
ng及びBeversdof（1985年）Plant Sci 39,219−226］に
ついて必要な形質転換を行ない、次に周知の技術により
（例えばコルヒチンを使用して）染色体の数を倍増させ
ることによって；又代替的には２倍体細胞培養（物）に
ついて必要な形質転換を行ない、次に、後に２倍体にさ
れうる１倍体後代を生産すべく再生植物の葯を培養する
ことによって、同型接合優性稔性回復植物を再生するの
に用いることができる。「Plant Tissue and Cell Cult
ure,Plant Biology ３、A.R.Liss,Inc.N.Y.（1987）参
照のこと。かくして外来性DNA配列は、培養（物）のこ
のようにして形質転換された植物の各々の核ゲノム内に
同型接合の形で存在することになる。これは、稔性回復
DNAがそれから誘導された全ての雄性又は雌性生殖体又
は植物細胞の中で存在し、発現されうるように、ｉ）特
に減数分裂後の、花粉等の植物の雄性生殖体、ii）特に
減数分裂後の、胚珠等の植物の雌性生殖体又はiii）種
子又は胚細胞等の雄性又は雌性生殖体から誘導された細
胞、の或る一定の発生段階において遺伝子の発現を誘導
する第１のプロモーターの制御下にある稔性回復DNAを
含む植物細胞培養にとって好ましいことである。
さらに本発明に従うと、雑種稔性回復植物に生長しう
る雑種種子を生成するための方法も提供されている。１
つの方法には、少なくとも１つの第３のプロモーターの
制御下にある少なくとも１つの第２の標識DNAを含む核
雄性不稔雌生稔性植物を、第２の標識DNAと同じもので
ある第１の標識DNAを持たず、少なくとも１つの第１の
プロモーターの制御下にある少なくとも１つの核雄性稔
性回復DNAを含む同型接合の核雄性稔性回復植物と、交
配する工程が関与している。この方法においては、雄性
不稔及び雌性稔性植物は無作為に播かれ、受粉の後、第
２の標識DNAによりコードされた選択可能な標識を用い
て、稔性回復植物が除去され、かくして雄性不稔植物上
でのみ種子が収穫されることになる。このことにより、
収穫された全ての種子が雑種であると同時に稔性である
ことが保証される。もう１つの方法には、同型接合型で
第２のプロモーターの制御下にある核第１標識DNA及び
第１のプロモーターの制御下にある核雌性稔性回復DNA
を含む核雄性不稔雌性稔性回復植物を、同型接合型で少
なくとも第２のプロモーターの制御下にある同じ核第１
標識DNA及び第１のプロモーターの制御下にある核雄性
稔性回復DNAを含む核雄性稔性雌性不稔回復植物と、交
配する作業が関与している。雄性不稔及び雄性稔性の親
株の両者共、ほぼ無作為の個体群（母集団）の中で栽培
することができ、かくして正確な栽植パターンの必要無
く他家受粉の機会が増大され、第１の標識DNAによりコ
ードされた特性を用いて、100％稔性の雑種種子を収穫
することができる。好ましくはこれらの方法の両方にお
いて、第１の標識DNAは構成的な第２のプロモーターの
制御下にあり、不稔性植物を特定の除草剤に対し耐性あ
るものにする第３のタンパク質又はポリペプチドをコー
ドする。すると、特定の除草剤を用いて、他家受粉に先
立ち、望ましくない遺伝子型を破壊することができる。
１）本発明に従った、優性対立遺伝子として何世代にも
わたり伝達可能な、核ゲノム内に安定した形で組込まれ
ている稔性回復DNAを含む稔性回復植物を、 ２）欧州特許出願明細書89401194.9号及び90402196.1号
に従った、優性対立遺伝子として何世代にもわたって伝
達可能な、核ゲノム内に安定した形で組込まれた不稔性
DNA、好ましくは不稔性DNAと第２の標識DNAの両方を含
む雄性又は雌性不稔性植物と交配する、本発明に従った
方法は、以下に記述するように、雑種作物を育種し生産
するための現在用いられているシステムに対する１つの
代替案であり、このシステムに比べいくつかの利点を提
供している： 1.穀物（例えば小麦、大麦、エンバク）、米、綿及び多
くのマメ科植物（例えば大豆及びエンドウ豆）といった
ような、容易に他家受粉せず、種子が経済的産物であ
り、増殖速度が低い作物については、本発明に基づく方
法は、100％雑種の稔性子孫を生産し、かくして高い結
実及び正常な収率を保証する可能性を提供する。親株と
して雄性不稔及び雌性不稔親株、及びそのそれぞれの不
稔性に対する回復遺伝子を用いて、雑種植物を生産する
ための典型的な戦略の一例には、以下のような工程が含
まれると考えられる（なお、ここで、「FH1」というの
は、除草剤１抵抗性に関連する雌性不稔性を意味し、
「RF」というのは、雌性不稔性の回復遺伝子であり、
「M1H1」というのは、除草剤１抵抗性に関する雄性不稔
性１を意味し、「M2H2」は除草剤２抵抗性に関連する雄
性不稔性２を意味し、「RM1」は雄性不稔性１の回復遺
伝子、「Ａ」は雌性親株、「Ｂ」は雄性親株を表わ
す）： A.雌性親株Ａの育成 1A a）（雄性親株の雌性不稔性DNAの発現生成物を特異
的に中和する）第１のRNA、タンパク質又はポリペプチ
ドをコードし、少なくとも雄性植物内の雌性不稔性DNA
が発現されるべきものと同じ細胞の中で遺伝子発現を誘
導する第１のプロモーターの制御下にある、本発明に基
づく稔性回復DNAを用いて、植物Ａを形質転換する。こ
うしてＡRF/rfが生み出される。
1A b）ＡRF/rfを自家受粉させ、25％のＡRF/RF植物を得
る。
1A c）雄器特異的プロモーターの制御下にある「雄性不
稔DNA1」及び除草剤１に対する抵抗性を付与する標識DN
Aを含むキメラDNA配列を用いて、ＡRF/RFを形質転換す
る。こうして雄性不稔性植物ＡRF/RF;M1H1/mhが生み出
される。
1A d）ＡRF/RF;M1H1/mh×ＡRF/RF;mh/mhの交配を行なう
ことにより雄性不稔性植物を増殖し、 50％ＡRF/RF;M1H1/mh：雄性不稔１、除草剤１に対し
て抵抗性、 50％ＡRF/RF;mh/mh：雄性稔性、除草剤感受性、 から成る子孫を得る。
この混合物を雌性親株のスケールアップの連続する世
代にわたって播き、純粋な雌性親株ストックを作り出す
ため交互の畦又は畦ブロックの形で除草剤１を用いる。
除草剤が散布されていない畦又は畦ブロックは、花粉源
として用いられる。除草剤処理された畦又は畦ブロック
の種子だけを収穫して次の世代を構成させる。
B.雄性親株Ｂの育成 Ｂの経済的な生産のために、雄性不稔親株は２つの異
なる不稔性DNAの使用を必要とする。第１のDNAは、植物
の雌器の細胞内で選択的に遺伝子発現を誘導するプロモ
ーターの制御下にあり、除草剤１に対する抵抗性を付与
する標識DNAに連結された雌性不稔性DNAである。第２の
ものは、植物の雄器細胞内で選択的に遺伝子発現を誘導
するプロモーターの制御下であり、除草剤２に対する抵
抗性を付与する第２の標識DNAに連結されている雄性不
稔DNA（雄性不稔DNA1とは異なるもので、「雄性不稔DNA
2」と呼ばれる）である。
1B a）少なくとも雌性親株内の雄性不稔DNA1が発現され
る同じ雄器細胞内で遺伝子発現を誘導する第１のプロモ
ーターの制御下にあり、雌性親株で発現される雄性不稔
DNA1の活性を特異的に中和する第１のRNA、タンパク質
又はポリペプチドをコードする本発明の外来性DNA配列
で、植物Ｂを形質転換する。こうしてＢRM1/rmが生み出
される。
1B b）ＢRM1/rmを自家受粉させて、25％のＢRM1/RM1を
得る。
1B c）（１）植物の雌器細胞内で選択的に遺伝子発現を
誘導するプロモーターの制御下にある雌性不稔DNA及び
除草剤１に対する抵抗性を付与する標識DNAを含むキメ
ラDNA配列で、ＢRM1/RM1を形質転換する。こうして雌性
不稔植物ＢRM1/RM1:FH1/fhが得られる。
（２）雄器特異的プロモーターの制御下にある雄性不稔
DNA2及び除草剤２に対する除草剤抵抗性を付与する標識
DNAを含むキメラDNA配列で、ＢRM1/RM1を形質転換す
る。こうして雄性不稔植物ＢRM1/RM1:M2H2/mnが得られ
る。
1B d）（１）ＢRM1/RM1:M2H2/mh×ＢRM1/RM1:mh/mhの交
配を行なうことにより、1B c）（２）の雄性不稔植物を
増殖させ、 50％ＢRM1/RM1:M2H2/mh：雄性不稔、除草剤抵抗性、
及び 50％ＢRM1/RM1:mh/mh：雄性不稔、除草剤感受性、 から成る子孫を得る。
（２）別々の畦に植栽されたＢRM1/RM1:M2H2/mh:fh/fh
×ＢRM1/RM1:mh/mh:FH1/fhの交配を行なうことにより、
1B c）（１）の雌性不稔植物を増殖させ、雄性不稔畦に
以下の遺伝子型を生み出す： 25％ＢRM1/RM1:M2H2/mh:FH1/fh：不稔で、除草剤１及
び２に対して抵抗性、 25％ＢRM1/RM1:mh/mh:FH1/fh：雌性不稔で除草剤１に
対して抵抗性、 25％ＢRM1/RM1:M2H2/mh:fh/fh：雄性不稔で除草剤２
に対して抵抗性、及び 25％ＢRM1/RM1:mh/mh:fh/fh：稔性で除草剤感受性。
1B e）この混合物は再び、さらなる増殖交雑において雄
性親株（ＢRM1/RM1:mh/mh:FH1/fh）として用いることが
でき、かくして各世代で除草剤１を噴霧することで雌性
稔性植物は除去され、雄性親株が維持される。この混合
物は、1B d（１）で得られた混合物と共に交互の畦又は
畦ブロックに植栽される。この1B d（１）の混合物は、
雄性稔性植物を除去すべく除草剤２で処理される。代替
的には、1B d）（２）で得られた混合物をこのようにし
て播き、交互の畦を除草剤１又は除草剤２のいすれかで
処理することもできる。このような状況下では、工程1B
d）（１）は不要である。
C.雑種種子ABの生産 工程1A d）及び1B e）で得た混合物を無作為に播く。
他家受粉が起こらないように、除草剤１を噴霧して望ま
しくない遺伝子型を全て除去する。
ARF/RF;rf/rf;M1H1/mh;fh/fh×B
RM1/RM1;rm/rm;mh/mh;FH1/fh で他上受粉が起こり、100％稔性雑種粒子を構成する、 25％ABRF/rf;M1H1/mh;rm/RM1;FH1/fh 25％ABRF/rf;M1H1/mh;rm/RM1;fh/fh 25％ABRF/rf;mh/mh;rm/RM1;FH1/fh 25％ABRF/rf;mh/mh;rm/RM1;fh/fh を生み出す。
2.育種される作物の特別な特性に応じて、前述の一般的
戦略を単純化することが可能である。このような特殊な
特性としては、以下のものがある： （2.1）作物が昆虫による適正な又は優れた他家受粉を
受ける場合、混合物中の親株Ｂの相対的割合は、作物の
収量に影響を及ぼすことなく下げることができる（例；
綿、Pisum（エンドウ）のようなマメ科植物、アルファ
ルファ、ナタネ及びトウモロコシ）。代替的には、雄性
不稔及び除草剤抵抗性にされた雌性親株及び雄性不稔の
ための稔性回復遺伝子を有する雄性親株が関与する作物
のためには、はるかに単純化された育種計画を用いるこ
とが可能である。
これにより以下の戦略が可能となる： 掛け合せ：同時的に着花しない作物について、畦状に
又は無作為にＡMH/mh×ＢRM/RMを播く。
無作為に播種した場合、受粉後に除草剤処理する。
収量:100％稔性雑種子孫を構成する、50％AB
MH/mh;RM/rm及び50％ABmh/mh;RM/rm。
（2.2）F2子孫が商業的種子産物である（例・綿）、以
下の派生戦略を用いることができる： ａ）親株Ａの雄性不稔植物を形質転換により生産し、Ａ
M/m;r/rを得る。
ｂ）生成物がａ）の雄性不稔植物内の雄性不稔遺伝子の
活性を特異的に中和するような稔性回復遺伝子をその核
ゲノムの２つの独立した遺伝子座内にもつ稔性回復植物
を、２回の独立した形質転換事象により生産し、自家受
粉によって同型接合形で両方の回復遺伝子を得、Ｂ
m/m;R1;R2/R2を生じさせる。
ｃ）ＡM/m;r/r×Ｂm/m;R1/R1;R2/R2のかけ合せを行な
い、 100％雑種稔性子孫を構成する50％ABM/m;R1/r;R2/r及
び50％ABm/m;R1/r;R2/rを生産する。そして、 ｄ）ｃ）で得た混合物を自家受粉させる。子孫の半数は
以下の表１に示されている通りであり、合計64本の植物
のうちわずか１本のみが雄性不稔である（表１）に＊で
示されているもの）、その他全ては稔性である。
この結果はこの方法を経済的に価値あるものにしてい
る。
（2.3）雄性不稔DNA2が除草剤２に対する抵抗性をコー
ドする遺伝子以外の標識DNA（例えば色遺伝子）に連結
される場合、この雄性不稔性DNAを有する植物は、その
他の植物に損傷を与えることなく容易に除去されうる。
代替的には、いかなる選択可能な標識DNAも無く、雄性
不稔DNA2を導入することができる。雄性不稔DNA2を担持
する植物の除去は、小規模でのみ行なう必要のある、手
による選択によって行なうことが可能である［前記
（１）B d）参照のこと］。
（2.4）形質転換すべき親株の組織が一倍体物質で構成
されている場合、これはその後の育種を著しく減少さ
せ、同型接合形で不稔性をコードする優性遺伝子を与え
る。
（2.5）種子の価値又は手作業コストが、少なくとも雑
種生産前の最後の工程まで、望ましくない遺伝子型の手
による除去を可能にする場合、全体的システムも同様に
単純化できる。
3.本発明の稔性回復システムと組合わされた雄性及び雌
性不稔を用いた育種戦略のもう１つの例には、以下のよ
うな工程が含まれると考えられる： 3A.雌性親株Ａの育成 3A a）雄性親株で発現された雌性不稔DNAの生成物の活
性を特異的に中和する第１のDNA、タンパク質又はポリ
ペプチドをコードし；少なくとも雄性親株の雌性不稔DN
Aが中で発現されている細胞と同じ雌器細胞内で稔性回
復DNAの発現を誘導するような第１のプロモーターの制
御下にあり；除草剤２に対する抵抗性をコードする第１
の標識DNAに隣接している、本発明の稔性回復DNAを含む
外来性DNA配列で、系統Ａを形質転換する。これにより
ＡRFH2/rfhを生じさせる。
同様にこれと並行して、雄器特異的プロモーターの制
御下にあり、第１の標識DNAによりコードされたものと
は異なる除草剤抵抗性（すなわち除草剤１に対する抵抗
性）をコードする第２の標識DNAに隣接している雄性不
稔DNAを含むDNA配列で、系統Ａを形質転換する。これに
よりＡMH1/mhを生じさせる。
3A b）ＡRFH2/rfh×ＡMH1/mhのかけ合わせを行ない、 25％ＡRFH2/rfh:MH1/mh 25％ＡRFH2/rfh:mh/mh 25％Ａrfh/rfh:MH1/mh 25％Ａrfh/rfh:mn/mh を生じさせる。
除草剤１及び２を噴霧し、ＡRFH2/rfh:MH1/mhを選択
する。
3A c）ＡRFH2/rfh×ＡRFH2/rfhの自家受粉を行ない、自
家受粉により維持できる25％ＡRFH2/RFH2を生じさせ
る。
3A d）ＡRFH2/RFH2:mh/mh×ＡRFH2/rfh:MH1/mnをかけ合
せを行なう。
こうして 25％ＡRFH2/RFH2:MH1/mh 25％ＡRFH2/RFH2:mh/mh 25％ＡRFH2/rfh:MH1/mh 25％ＡRFH2/rfh:mh/mhを生じさせ、 かくして、同型接合形で稔性回復DNAを有する雄性不
稔植物を、除草剤１の噴霧及び親株Ａ系統とのテスト交
配により選択することができる。
3A e）ＡRFH2/RFH2:MH1/mh×ＡRFH2/RFH2:mh/mhの交配
を行なうことにより、雌性親株Ａを維持する。
B.雄性親株Ｂの育成 3B a）雌性親株で発現された雄性不稔DNAの生成物の
活性を特異的に中和する第１のRNA、タンパク質又はポ
リペプチドをコードし；少なくとも雄性不稔DNAが発現
されている細胞と同じ雄器細胞内で稔性回復DNAの発現
を誘導する第１のプロモーターの制御下にあり；除草剤
２に対する抵抗性をコードする第１の標識DNAに隣接し
ている、本発明の稔性回復DNAを含む外来性DNA配列で、
系統Ｂを形質転換する。これによりＢRMH2/rmhを生じ
る。
これと並行して同様に、雌器特異的プロモーターの制
御下にあり、除草剤１に対する抵抗性をコードする第２
の標識DNAに隣接する雌性不稔DNAを含むDNA配列で、系
統Ｂを形質転換する。これによりＢFH1/fhを生じさせ
る。
3B b）ＢRMH2/rmh:fh/fh×Ｂrmh/rmh:FH1/fhをかけ合わ
せ、 25％ＢRMH2/rmh:FH1/fh 25％ＢRMH2/rmh:fh/fh 25％Ｂrmh/rmh:FH1/fh 25％Ｂrmh/rmh:fh/fh を生じさせる。
除草剤１及び２を噴霧することにより、Ｂ
RMH2/rmh:FH1/fhを分離する。
3B c）ＢRMH2/rmh×ＢRMH2/rmhの自家受粉を行ない、自
家受粉を通じて維持されるうる約25％ＢRMH2/RMH2を生
じさせる。
3B d）ＢRMH2/RMH2×ＢRMH2/rmh:FH1/fhを掛け合わせ、 25％ＢRMH2/RMH2:FH1/fh 25％ＢRMH2/RMH2:FH/fh 25％ＢRMH2/rmh:FH1/fh 25％ＢRMH2/rmh:fh/fh を生じさせ、 かくして同型接合形の稔性回復DNAをもつ雌性稔性植
物は、除草剤１の噴霧及び親株Ｂ系統とのテスト交配に
より選択される。
3B e）ＢRMH2/RMH2:fh/fh×ＢRMH2/RMH2:FH1/fhの交配
を行なうことにより、雄性親株Ｂを維持する。
C.雄性又は雌性親株（Ａ又はＢを両方共Ｃと呼ぶ）の育
成のための代替的方法 3C a）もう一方の親株で発現された不稔性DNAの生成物
の活性を特異的に中和する第１のRNA、タンパク質又は
ポリペプチドをコードし；少なくとももう一方の親株の
不稔性DNAが発現されている細胞の中で稔性回復DNAの発
現を誘導する第１のプロモーターの制御下にあり；除草
剤２に対する抵抗性をコードする第１の標識DNAに隣接
している、本発明の稔性回復DNAを含む外来性DNA配列
で、系統Ｃを形質転換する。これによりＣMH2/rhを生じ
させる。
3C b）ＣRH2/rh×ＣRH2/rhの自家受粉を行ない、自家受
粉を通じて維持されうる25％ＣRH2/RH2を生産する。
3C c）雄器又は雌器特異的プロモーターの制御下にあ
り、除草剤１に対する抵抗性をコードする第２の標識DN
Aに隣接する不稔性DNAを含むDNA配列で、ＣRH2/RH2を形
質転換する。これにより、ＣRH2/RH2:SH1/shが生じる
（なお、ここで「ｓ」は雄性又は雌性不稔を意味す
る）。
3C d）ＣRH2/RH2:SH1/sh×ＣRH2/RH2:sh/shのかけ合わ
せにより系統Ｃを維持する。
3D.雑種種子ABの生産 工程3A e）及び3B e）で得ら混合物又は工程3C d）で
得られた混合物を無作為に播種する。自家受粉が起こる
前に、望ましくない全ての遺伝子型を除去するため除草
剤１及び２を噴霧する。この結果、次のかけ合せが導か
れる； こうして100％雑種稔性種子から成る、以下の子孫が
生じる： 25％ABRFH2/rf;RMH2/rm;MH1/mh;FH1/fh 25％ABRFH2/rf;RMH2/rm;MH1/mh;fh/fh 25％ABRFH2/rf;RMH2/rm;mh/mh;FH1/fh 25％ABRFH2/rf;RMH2/rm;mh/mh;fh/fh。
4.以前のシステムに比べて、欧州特許出願明細書894011
94.9号及び90402196.1号に記されている雄性又は雌性不
稔システムと組み合わせた本発明に基づく稔性回復シス
テムは、さらに以下のような利点を有する： ａ）品質を管理するため充分に識別及び選択可能な複数
の標識を用いるフールプルーフ生産； ｂ）信頼性の高い生産及び生産コストの低減にとって必
要不可欠なことである、最終種子増殖因子レベルでの複
雑性の著しい削減。
及び ｃ）商業的雑種種子の生産に必要な時間の縮減。
以下の例が本発明を明確に説明している。
例中で参照されている図は、以下のとおりである： 図１は、例１のベクターpTVE74の地図である。
図２は、例１で使用されているバルスター遺伝子のDN
A配列を示し、そのCla I部位の突然変異配列を表わして
いる。
図３は、例３のベクターpTVE73の地図を示す。
図４は、例３のベクターpTVE76の地図を示す。
例中に相反する記述のないかぎり、組換え型DNAを作
り、操作するための全ての手順は、Maniatis他著「分子
クローニング、−実験室マニュアル」、Cold Spring Ha
rbor Laboratory（1982年）に記されている標準化され
た手順により実施された。例中で用いられている以下の
プラスミド及びベクターは、ブタペスト条約の規定に基
づきドイツ連邦共和国Mascheroder Weg 1B,D−3300 Bra
unschweigのDeutsche Sammlung Fr Mikroorganismen
und Zellculturen（「DSM」）に寄託されている： 例１−PTA29及びバルスター遺伝子のキメラDNA配列の構
築 図１に示されている「pTVE74」という名のプラスミド
を、PTA29プロモーターと以下の周知のDNAフラグメント
を組合わせることによって構築する； 1.ペニシリナーゼ（β−ラクタマーゼ）遺伝子が欠失し
ているpGSC1700［Cornelissen及びVandewiele（1989
年）NAR 17（１）19−29］から誘導された、Ｔ−DNAボ
ーダー配列を含むベクターフラグメント；なおこれらの
ボーダー配列の間には以下のDNAフラグメント２及び３
が位置づけられている。
2.細胞外リボヌクレアーゼBarnase［Hartley他（1972
年）Preparative Biochemistry ２（３）243−250;Hart
ley及びSmeaton（1973年）J.Biol.Chem.248（16）,5624
−5626］の細胞抑制因子であるバルスターをコードする
Bacillus amyloliquefaciensの遺伝子とATG開始コドン
にてフレーム内で融合された、欧州特許出願明細書8940
1194.9号からのプロモーターカセットPTA29を含むキメ
ラ配列；なお、以下の工程が実施される： ａ）コード配列の第１のメチオニンコドンにおいて適当
なCla Iクローニング部位を得るため、第１のATGコドン
の上流の位置７〜10にあるヌクレオチド配列GCACを、ヌ
クレオチド配列ATCGへと突然変異させる（図２参照）；
これは、部位特異的突然変異誘発（欧州特許出願明細書
87402348.4）を用いて達成され、pMc5−TPBSCを生成す
る；酵素SIによりCla I突出末端を消化し、330ヌクレオ
チド（図２）のCla I−Hind IIIフラグメントとしてバ
ルスター遺伝子を単離する； そして ｂ）pMB3のSI処理を受けたNco I−Hind IIIフラグメン
ト（欧州特許出願明細書89401194.9号）及び、転写終結
及びポリアデニル化のためのノパリンシンセターゼ
（「NOS」）の３′末端シグナルを踏む制限フラグメン
ト［An他（1985年,EMBO J.４（２）,277］と、SI処理を
受けたpMc5−TPBSCのCla I−Hind IIIフラグメントを融
合させる；及び 3.Arabidopsis Rubisco SSUプロモーター（「PSSU」又
は「PSSUARA」）、カナマイシン抵抗性をコードするneo
遺伝子（欧州特許出願明細書87400,544.0号）、及びオ
クトピンシンターゼ（「OCS」）遺伝子の３′末端シグ
ナル［Dhaese他（1983年）EMBO J.２,419］を含むキメ
ラ配列。
pTVE74は、Ｔ−DNAボーダー配列内に、３つのキメラ
配列、すなわち；独自の第２のプロモーターの制御下に
ある第１の標識DNAを含むPNOS−neo及びPSSU−sfr;なら
びに、バルスターが、タペタム特異的PTA29第１プロモ
ーターの制御下で発現されたときに、そうでなければ雄
性不稔である植物のタペタム細胞の中で、欧州特許出願
明細書89401194.9号に記されているようにタペタム特異
的不稔性プロモーターの制御下で不稔性DNAによりコー
ドされたバルナーゼの活性を中和することになる稔性回
復DNAであるようなPTA29−バルスター、を含むバイナリ
ータイプのＴ−DNAベクターである。
例２−タバコ及びナタネへの例１のキメラDNA配列の導
入 E.coli（大腸菌）から、pMP90を含むAgro−bacterium
tumefaciens C58C1 RifR中にpVTE74（例１からのも
の）をを可動化（授動）することにより、組換え型Agro
bacterium菌株を構築する［Koncz及びSchell（1986年）
Mol.Gen.Genetics 204,383−396］。結果として得られ
たpMP90とpTVE74を宿したAgro−bacterium菌株は、例え
ば欧州特許出願明細書87400544.0号に記されているよう
な標準的手順を用いてタバコのリーフディスク（N.taba
cum Petite Havane SR1）を形質転換するため、及びLlo
yd他（1986年）Science 234,464−466及びKlimaszewska
他（1985年）Plant Cell Tissue Organ Culture ４,183
−197の手順に従ってナタネ（Brassica napus）を形質
転換するために用いられる。感染後、Agrobacterium菌
株を殺すためにはカルペニリシンが用いられる。
形質転換されたカルスを、100μg/mlのカナマイシン
を含む基質上で選択し、抵抗性のあるカルスを植物へと
再生させる。苗条（従長枝）及び根の誘導後、形質転換
体を温室に移し、着花するまで栽培する。花を検査した
ところ、完全に天然の形態を示していた。これらの花の
花粉は、欧州特許出願明細書89401194.9号の例13に記さ
れているタペタム細胞特異的PTA29不稔性プロモーター
の制御下で、不稔性DNAとしてバルナーゼ遺伝子を含む
核雄性不稔タバコ及びナタネ植物を受粉させるために用
いられる。これらの受粉した雄性不稔植物の子孫を分析
してみると、その花の75％は雄性不稔表現型（すなわ
ち、その花の雄ずい内の正常なタペタム層の欠如）を示
していない。
例３−PTA29及びEcoR Iメチラーゼ遺伝子のキメラDNA配
列の構築 PTA29プロモーターと以下の周知のフラグメントを組
立てることにより、図３に示されている「pTVE73」と呼
ばれるプラスミドを構築する： 1.ボーダー配列の間にDNAフラグメント２〜４がある状
態の、例１に記載のpGSC1700から誘導されたＴ−DNAボ
ーダー配列を含むベクターフラグメント； 2.neo遺伝子、及びOCS遺伝子の３′末端の発現を制御す
るpSSUプロモーターを含む、例１のキメラ配列（No.
3）； 3.ノパリンシンターゼプロモーター（「PNOS」）［欧州
特許出願明細書87400544.0号］、ハイグロマイシンに対
する抵抗性を付与するhph遺伝子［Van den Elzen他（19
85年）Plant Molecular Biology ５,299−302］及びNOS
遺伝子の３′末端（例１）を含むキメラ配列；及び 4.その発現生成物が、GAATTC部位で２本鎖DNAを切断す
るEcoR I制限エンドヌクレアーゼの活性を中和する［Wi
lson（1988年）TIG ４（11）,314−318］、EcoR Iメチ
ラーゼ遺伝子［Botterman及びZabeau（1985年）Gene 3
7,229−239］とフレーム内で融合された、例１からのPT
A29プロモーターカセットを含むキメラ配列； なお、以下の工程が実施される： ａ）EcoR Iメチラーゼのコード配列を含むpEcoR4からの
Bg1 II−Hind IIIフラグメント［Botterman及びZabeau,
1985年］を、pMa5−８内にクローニングする（欧州特許
出願明細書87402348.4号）；部位特異的突然変異誘発に
より、メチラーゼコード配列のＮ末端にFsp I部位を導
入する。
TTA,ATG,GCT,AGA,AAT TGC,GCA Fsp I ｂ）pMB3のプロモーターフラグメントを、その充てんさ
れたNco I部位で平滑Fsp I末端に連結し、 を生み出し、例１のNOS遺伝子の３′末端と融合させ
る。
pTVE73は、Ｔ−DNAボーダー配列内に、３つのキメラ
配列、すなわち；独自の第２プロモーターの制御下にあ
る第１の標識DNAであるPSSU−neo及びpNOS−hph;ならび
に、タペタム特異的PTA29第１プロモーターの制御下に
ある稔性回復DNAであるPTA29−EcoR Iメチラーゼ遺伝
子、を含むバイナリータイプのＴ−DNAベクターであ
る。PTA29プロモータの制御下にある稔性回復DNAの、そ
うでなければ雄性不稔である植物のタペタム細胞内での
発現は、欧州特許出願明細書89401134.9の例16に記され
ているようにタペタム特異的不稔性プロモーターの制御
下にある不稔性DNAによりコードされたEcoR Iのこのよ
うな細胞内での活性を中和することになる。
図４に示されている「pTVE76」という名のプラスミド
も、同様に、PTA29プロモーターと以下の周知のフラグ
メントを組立てることによって構築される； 1.ペニシリナーゼ遺伝子が欠失しているpGSC1700［Corn
elissen及びVandewiele（1989年）Nar 17（１）19−2
9］から誘導された、Ｔ−DNAボーダー配列を含み、その
ボーダー配列間には以下のDNAフラグメント２〜４があ
るような、ベクターフラグメント； 2.pSSUプロモーター、neo遺伝子、及びOCS遺伝子の３′
末端を含む、例１のキメラ配列（No.3）； 3.PNOSプロモーター、hph遺伝子、及びNOS遺伝子の３′
末端を含むキメラ配列；及び 4.Mn−スーパーオキシドジスムターゼ（「Mn−SOD」）
［Bowler他（1989年）EMBO J.８,31−38］のトランジッ
トペプチド（「TP」）をコードする遺伝子フラグメント
とフレーム内で融合された、例１からのpTA29プロモー
ターカセットを含むキメラ配列；欧州特許出願明細書87
402348.4号に記されているような部位特異的突然変異誘
発を用いてクローニングする目的でフラグメントを単離
するため、トランジットペプチド配列内に以下の変更を
行なう： i.ATG開始コドンの上流の位置−２及び−１にあるAAヌ
クレオチドをCCヌクレオチドに変更し、開始コドンにNc
o I部位を作り出し、以下のヌクレオチド配列、 −CCATGGCACTAC Nco I を生み出す： ii.トランジットペプチドのプロセッシング部位のすぐ
近くにあるCTTGヌクレオチドをGGTACに変更し、プロセ
ッシング部位にKpn I部位を作り出し、以下のヌクレオ
チド配列を生成する： なお、ここで矢印はトランジットペプチド配列のプロ
セッシング部位を示し、上線はMn−SODコード配列に対
応するアミノ酸配列を示す;KlenowDNAポリメラーゼでKp
n Iを処理した後、pTVE73の構築において用いられたよ
うなEcoR Iメチラーゼコード配列の平滑Fsp I Ｎ末端
に対してNcoR I−Kpn Iフラグメントをフレーム内で融
合させ、例１のNOS遺伝子の３′末端と融合さVE76は、
Ｔ−DNAボーダー配列内に、３つのキメラ配列、すなわ
ち：独自の第２プロモーターの制御下にある第１の標識
DNAであるPSSU−neo及びPNOS−hph、及びPTA29の第１プ
ロモーターの制御下にある稔性回復DNAであるPTA29−TP
−EcoR Iメチラーゼ遺伝子、を含むバイナリータイプの
Ｔ−DNAベクターである。そうでなければ雄性不稔であ
る植物のタペタム細胞内でのMn−SODのトランジットペ
プチドに融合されたEcoR Iメチラーゼの発現、及びこれ
らの細胞のミトコンドリアに対するタペタムタンパク質
のターゲティング（ミトコンドリアにタペタムタンパク
質を輸送させること）は、欧州特許出願明細書8940119
4.8号の例16に記されているようにトランジットペプチ
ドに融合されタペタム特異的プロモーターの制御下にあ
る相当する不稔性DNAによりコードされたEcoR Iのこの
ような細胞内での活性を中和することになる。
例４−タバコ及びナタネへの例３のキメラDNA配列の導
入 組換え型Agrobacterium菌株は、大腸菌からpMP90を含
むAgrobacterium C58C1 RifR［Koncz及びSchell（1986
年）Mol.Gen.Genetics 204,383−396］へ例３のpTVE73
及びpTVE76を可動化（授動）することによって構築され
る。結果として得られる、それぞれpMP90及びpTVE73な
らびにpMP90及びpTVE76を宿す菌株は、例２に示されて
いるようにタバコのリーフディスクの形質転換及びナタ
ネの形質転換のために用いられる。形質転換されたカル
ス及び苗条は、100μg/mlのカナマイシンを含む基質上
で選択される。
形質転換された菌条を発根させ、室温の土壌に移し、
着花するまで栽培する。タバコ及びナタネの両方の花を
検査したところ、両方共天然の形態を示していた。これ
らの花の花粉は、それぞれベクターpTVE63及びpTVE62で
の形質転換により得られた（欧州特許出願明細書894011
94.9号の例17に記されているように）核雄性不稔のタバ
コ及びナタネ植物を受粉するのに用いられる。なおこれ
らのベクター内で、EcoR I遺伝子はPTA29不稔性プロモ
ーターの制御下にある不稔性DNAであり、pTVE62におい
てはEcoR I遺伝子は同様に、Mn−SODのトランジットペ
プチドをコードするDNAにも融合されている。これらの
雄性不稔性植物の子孫を分析したところ、その花の75％
が雄性不稔表現型（すなわち、その花の雄ずい内の正常
なタペート層の欠如）を示していなかった。
言うまでもないことであるが、本発明は、何らかの特
定の植物の形質転換に限られているわけではない。本発
明は、植物が自家受粉及び他家受粉の両方を受けうるよ
うに、植物の花、特に少なくとも１つのその雄器又は雌
器、及び／又は種子及び／又は胚の細胞内で選択的に稔
性回復DNAの発源を誘導できる第１のプロモーターの制
御下にある稔性回復DNAで形質転換されうる核ゲノムを
もつあらゆる植物に関する。例えば本発明は、トウモロ
コシ、ナタネ、小麦、米、ヒマワリ、テンサイ、トマ
ト、レタス、コショウ、モロコシ類、大豆、エンドウマ
メ、アルファルファ、イネ科牧草、クローバー、ニンジ
ン、キャベツ、ニラネギ、タマネギ、タバコ、ツクバネ
アサガオ（ペチュニア）、カカオ及びカンキツ属の木等
の植物に関する。
同様に、本発明は前述の例に記されている特定のプラ
スミド及びベクターに制限されるものではなく、むしろ
第１のプロモーターの制御下にある稔性DNAを含むあら
ゆるプラスミド及びベクターを包含する。
さらに、本発明は、PTA29プロモーター等の前述の例
に記されている特定の第１のプロモーターに制限され
ず、少なくとも、そうでなければ不稔性DNAの発現によ
り雄性又は雌性不稔になると思われる植物の花、種子及
び／又は胚の細胞内で、稔性回復DNAの発現を誘導する
ことのできる第１のプロモーターをコードするあらゆる
DNA配列を包括する。この点において、本発明は、雄性
不稔にされるべき植物の雄ずい細胞内で選択的に不稔性
DNAの発現を制御する上で使用するための欧州特許出願
明細書89401194.9号に記載のプロモーター、ならびに雌
性不稔にされるべき植物の花、種子又は胚の細胞内で選
択的に不稔性DNAの発現を制御する上で使用するための
欧州特許出願明細書90402196.1号に記載のプロモーター
を包含している。代替的には、第１のプロモーターは、
第１のRNA、タンパク質又はポリペプチドが、不稔性DNA
の発現が無い場合にそれが中で発現される細胞の機能、
代謝又は発生を不利な形で著しく妨げないことを条件と
して、その植物のための構成的プロモーターであっても
よい。
さらに、本発明は前述の例に記されている特定の稔性
回復DNAに制限されるものではなく、むしろ、不稔性プ
ロモーターの制御下にある不稔性DNAによりコードさ
れ、そうでなければその植物の花、種子又は胚の細胞の
代謝、機能及び／又は発生を不利な形で著しく妨げるよ
うな第２のRNA、タンパク質又はポリペプチドの活性
を、稔性回復植物の中で、中和、阻止、相殺、克服又は
その他の形で妨げる第１のRNA、タンパク質又はポリペ
プチドをコードするあらゆるDNA配列を包括している。
同様に、本発明は前述の例に記されている特定の第１
の標識DNAに制限されるものではなく、むしろ、少なく
ともそのDNA配列が発現される特定の植物組織又は特定
の植物細胞に対して、このようなDNA配列が発現されな
いかかる特定の植物組織又は植物細胞に比べて卓越した
形質を付与するような第３のRNA、タンパク質又はポリ
ペプチドをコードするあらゆるDNA配列を包括するもの
である。
フロントページの続き (72)発明者 ドゥ・グリフ，ウィリー ベルギー国、ビー‐9000 ゲント、クピ ュール・レヒツ 154 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A01H 5/00 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (82)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】その植物の細胞におけるリボヌクレアーゼ
    の選択的産生に起因して雄性不稔又は雌性不稔である雄
    性不稔又は雌性不稔植物との交配により、子孫植物の稔
    性を回復させるためのアブラナ科植物であって、 該植物が、 ａ）該リボヌクレアーゼの抑制因子であるタンパク質を
    コードする回復DNA; および ｂ）少なくとも該細胞において発現を指令する第１のプ
    ロモーター を含む第１のキメラ遺伝子を含む組換えDNAをその細胞
    の核DNA中に組み込まれた状態で含み、かつ 該回復DNAが該第１のプロモーターと同一の転写単位内
    にあってその制御下にある、アブラナ科植物。
  2. 【請求項２】雄ずい細胞におけるリボヌクレアーゼの選
    択的産生に起因して雄性不稔である植物との交配によ
    り、子孫植物の稔性を回復させるための請求項１記載の
    植物であって、 ａ）該リボヌクレアーゼの抑制因子であるタンパク質を
    コードする回復DNA; および ｂ）少なくとも該雄ずい細胞における発現を指令する第
    １のプロモーター を含む第１のキメラ遺伝子を含む組換えDNAをその細胞
    の核DNA中に組み込まれた状態で含み、かつ 該回復DNAが、該第１のプロモーターと同一の転写単位
    内にあってその制御下にある、植物。
  3. 【請求項３】前記抑制因子が、Bacillus amyloliquefac
    iensの細胞外リボヌクレアーゼであるバルナーゼの活性
    を中和することができる、請求項２記載の植物。
  4. 【請求項４】前記抑制因子が、ヌクレオチド配列： によりコードされるアミノ酸配列を有するバルスター、
    またはバルナーゼを中和することができるその変異体で
    ある、請求項３記載の植物。
  5. 【請求項５】前記回復DNAが、ヌクレオチド配列： を含む、請求項４記載の植物。
  6. 【請求項６】前記回復DNAが、次のDNA配列を有するCla1
    −Hind IIIフラグメントである、請求項３記載の植物。
  7. 【請求項７】前記第１のプロモーターが、構造プロモー
    ターである、請求項２〜６のいずれか１項記載の植物。
  8. 【請求項８】前記第１のプロモーターが、植物の雄ずい
    細胞において選択的に発現を指令する、請求項２〜６の
    いずれか１項記載の植物。
  9. 【請求項９】前記第１のプロモーターが、葯、花粉及び
    花糸細胞よりなる群から選択される１種以上の雄ずい細
    胞において発現を指令する、請求項８記載の植物。
  10. 【請求項１０】前記第１のプロモーターが、葯細胞にお
    いて発現を指令する、請求項９記載の植物。
  11. 【請求項１１】前記第１のプロモーターが、タペタム細
    胞において発現を指令する、請求項10記載の植物。
  12. 【請求項１２】前記第１のプロモーターが、TA29遺伝子
    プロモーターである、請求項11記載の植物。
  13. 【請求項１３】前記第１のプロモーターが、プラスミド
    pMB3、DSM4470のNco I−Hind IIIフラグメント中に含ま
    れるTA29プロモーターである、請求項12記載の植物。
  14. 【請求項１４】前記抑制因子を前記雄ずい細胞の葉緑体
    又はミトコンドリアに輸送することができるトランジッ
    トペプチドをコードし、前記回復DNA及び前記第１のプ
    ロモーターと同じ転写単位内にあって、そして該回復DN
    Aと該第１のプロモーターとの間に存在する第１のDNAを
    も含む、請求項２〜13のいずれか１項記載の植物。
  15. 【請求項１５】前記組換えDNAが、 （ｃ）標識RNA、タンパク質又はポリペプチドをコード
    し、それが植物の少なくとも特定の組織中又は少なくと
    も特定の細胞中に存在する場合、該植物を、該標識RN
    A、タンパク質又はポリペプチドを該特定の組織又は特
    定の細胞中に含まない他の植物から容易に分離できるよ
    うにする標識DNA;及び （ｄ）少なくとも該特定の組織又は特定の細胞において
    該標識DNAの発現を指令することができる第２のプロモ
    ーター を含む第２のキメラ遺伝子をさらに含み、該標識DNA
    が、該第２のプロモーターと同一の転写単位内にあって
    その制御下にある、請求項２〜14のいずれか１項記載の
    植物。
  16. 【請求項１６】前記標識DNAが、少なくとも前記特定の
    組織又は特定の細胞に色を付与するタンパク質又はポリ
    ペプチドをコードするか、又は前記植物にストレス抵抗
    性、疾病又は害虫抵抗性、又は細菌抵抗性を付与するタ
    ンパク質又はポリペプチドをコードする、請求項15記載
    の植物。
  17. 【請求項１７】前記標識DNAが、害虫抵抗性を付与するB
    acillus thuringiensis内毒素をコードするか；又は細
    菌抵抗性を付与する殺菌性ペプチドをコードする、請求
    項16記載の植物。
  18. 【請求項１８】前記標識DNAが、改変されていない標的
    酵素よりも低い除草剤親和性を有する改変された除草剤
    標的酵素をコードする、請求項15記載の植物。
  19. 【請求項１９】前記標識DNAが、除草剤グリホセートの
    標的としての改変５−エノールピルビルシキメート−３
    −ホスフェートシンターゼ、およびホスフィノトリシン
    のようなグルタミンシンセターゼ抑制因子の標的として
    の改変グルタミンシンセターゼよりなる群から選択され
    るタンパク質又はポリペプチドをコードする、請求項18
    記載の植物。
  20. 【請求項２０】前記標識DNAが、除草剤の活性を阻害又
    は中和するタンパク質又はポリペプチドをコードする、
    請求項15記載の植物。
  21. 【請求項２１】前記標識DNAが、ホスフィノトリシンの
    ようなグルタミンシンセターゼ抑制因子に対する抵抗性
    を付与するタンパク質又はポリペプチドをコードする、
    請求項20記載の植物。
  22. 【請求項２２】前記標識DNAが、sfr又はsfrv遺伝子であ
    る、請求項21記載の植物。
  23. 【請求項２３】前記第２のプロモーターが、構造プロモ
    ーター、傷誘導性プロモーター、光合成活性を有する植
    物組織において選択的に発現を指令するプロモーター、
    又は葉細胞、花弁細胞若しくは種子細胞において選択的
    に遺伝子発現を指令するプロモーターである、請求項15
    〜22のいずれか１項記載の植物。
  24. 【請求項２４】前記第２のプロモーターが、35Sプロモ
    ーター、35S′３プロモーター、ノパリンシンターゼ遺
    伝子のプロモーター、TR1′若しくはTR2′プロモータ
    ー、又はSSUプロモーターである、請求項23記載の植
    物。
  25. 【請求項２５】前記標識タンパク質又はポリペプチド
    を、少なくとも前記特定の組織若しくは特定の細胞の葉
    緑体若しくはミトコンドリアに輸送することができるト
    ランジットペプチドをコードし、前記標識DNAおよび前
    記第２のプロモーターと同一の転写単位内にあって、そ
    して該標識DNA及び該第２のプロモーターとの間に存在
    する第２のDNAを更に含む、請求項15〜24のいずれか１
    項記載の植物。
  26. 【請求項２６】請求項２〜25のいずれか１項記載の植物
    に成長させ得る種子。
  27. 【請求項２７】（ａ）請求項２〜25のいずれか１項記載
    の植物である雄性稔性親植物；及び （ｂ）不稔性DNAの発現を指令する不稔性プロモーター
    の制御下にある、リボヌクレアーゼをコードする不稔性
    DNAを含む第２の組換えDNAを、その全ての細胞の核ゲノ
    ム中に組み込まれた状態で含む雄性不稔性親植物からな
    る種子生産用アブラナ科親植物対であって、 該雄性不稔性親植物及び該雄性稔性親植物を交配して、
    該組換えDNA及び該第２の組換えDNAを含む雄性稔性子孫
    植物を生み出すことができる、種子生産用アブラナ科親
    植物対。
  28. 【請求項２８】前記リボヌクレアーゼが、バルナーゼで
    あり、前記回復DNAが、バルスター、又はバルナーゼの
    活性を中和することができるその変異体をコードする、
    請求項27記載の親植物対。
  29. 【請求項２９】前記不稔性プロモーターが、雄ずい細胞
    において選択的に発現を指令する、請求項27又は28記載
    の親植物対。
  30. 【請求項３０】前記不稔性プロモーターが、葯、花粉及
    び花糸細胞よりなる群から選択される１種以上の雄ずい
    細胞において発現を指令する、請求項29記載の親植物
    対。
  31. 【請求項３１】前記不稔性プロモーターが、タペタム及
    び葯表皮細胞よりなる群から選択される１種以上の雄ず
    い細胞において発現を指令する、請求項30記載の植物
    対。
  32. 【請求項３２】前記不稔性プロモーターが、タバコから
    のTA29遺伝子のプロモーターである、請求項31記載の植
    物対。
  33. 【請求項３３】前記不稔性プロモーターが、プラスミド
    pMB3、DSM4470のNco I−Hind IIIフラグメント中に含ま
    れるTA29プロモーターである、請求項32記載の植物対。
  34. 【請求項３４】前記第１のプロモーター及び前記不稔性
    プロモーターが、同じである、請求項27〜33のいずれか
    １項記載の植物対。
  35. 【請求項３５】前記雄性稔性親植物が、前記組換えDNA
    について同型接合性である、請求項27〜34のいずれか１
    項記載の植物対。
  36. 【請求項３６】前記雄性稔性親植物及び前記雄性不稔性
    親植物が異なり、前記種子が雑種種子である、請求項27
    〜35のいずれか１項記載の植物対。
  37. 【請求項３７】請求項27〜36のいずれか１項記載の植物
    対を交配し、その雄性不稔植物から種子を採取すること
    を含む、アブラナ科種子の生産方法。
  38. 【請求項３８】前記種子が、前記回復DNA及び前記不稔
    性DNAを含み、そして雄性稔性植物に成長させ得る、請
    求項37記載の方法によって得られるアブラナ科種子。
  39. 【請求項３９】請求項38記載の種子から成長させ得る雄
    性稔性アブラナ科植物。
  40. 【請求項４０】その雌性器官の細胞におけるリボヌクレ
    アーゼの選択的産生に起因して雌性不稔である植物との
    交配により、子孫植物の稔性を回復させるための請求項
    １記載の植物であって、 該植物が、 （ａ）リボヌクレアーゼの抑制因子であるタンパク質を
    コードする回復DNA; 及び （ｂ）少なくとも雌性器官の細胞において発現を指令す
    る第１のプロモーターを含む第１のキメラ遺伝子を含む
    組換えDNAを、その細胞の核DNA中に組み込まれた状態で
    含み、かつ 該回復DNAが、該第１のプロモーターと同一の転写単位
    内にあってその制御下にある、植物。
  41. 【請求項４１】前記抑制因子が、Bacillus amyloliquef
    aciensの細胞外リボヌクレアーゼであるバルナーゼの活
    性を中和することができる、請求項40記載の植物。
  42. 【請求項４２】前記抑制因子が、ヌクレオチド配列： によりコードされるアミノ酸配列を有するバルスター、
    又はバルナーゼを中和することができるその変異体であ
    る、請求項41記載の植物。
  43. 【請求項４３】前記回復DNAが、ヌクレオチド配列： を含む、請求項42記載の植物。
  44. 【請求項４４】前記回復DNAが、次のヌクレオチド配列
    を有するCla1−Hind IIIフラグメントである、請求項43
    記載の植物。
  45. 【請求項４５】前記第１プロモーターが、構造プロモー
    ターである、請求項40〜44のいずれか１項記載の植物。
  46. 【請求項４６】前記第１プロモーターが、植物の雄性器
    官の細胞において発現を指令する、請求項40〜44のいず
    れか１項記載の植物。
  47. 【請求項４７】前記第１プロモーターが、子房、胚珠、
    花柱、柱頭及び隔膜細胞よりなる群から選択される１種
    以上の雌性器官の細胞において発現を指令する、請求項
    46記載の植物。
  48. 【請求項４８】前記第１のプロモーターが、花柱及び／
    又は柱頭細胞において発現を指令するプロモーターであ
    る、請求項47記載の植物。
  49. 【請求項４９】前記抑制因子を雌性器官の細胞の葉緑体
    又はミトコンドリアに輸送することができるトランジッ
    トペプチドをコードし、前記回復DNA及び前記第１のプ
    ロモーターと同じ転写単位内にあって、そして該回復DN
    Aと該第１のプロモーターとの間に存在する第１のDNAを
    更に含む、請求項40〜48のいずれか１項記載の植物。
  50. 【請求項５０】前記組換えDNAが、 （ｃ）標識RNA、タンパク質又はポリペプチドをコード
    し、それが植物の少なくとも特定の組織又は少なくとも
    特定の細胞中に存在する場合、該植物を、前記標識RN
    A、タンパク質又はポリペプチドを該特定の組織又は特
    定の細胞中に含まない他の植物から、容易に分離できる
    ようにする標識DNA;及び （ｄ）少なくとも該特定の組織又は特定の細胞において
    該標識DNAの発現を指令することができる第２のプロモ
    ーター を含む第２のキメラ遺伝子を更に含み、該標識DNAが、
    該第２のプロモーターと同一の転写単位内にあってその
    制御下にある、請求項40〜49のいずれか１項記載の植
    物。
  51. 【請求項５１】前記標識DNAが、少なくとも前記特定の
    組織又は特定の細胞に色を付与するタンパク質又はポリ
    ペプチドをコードするか、あるいは前記植物にストレス
    抵抗生、疾病もしくは害虫抵抗性又は細菌抵抗性を付与
    するタンパク質又はポリペプチドをコードする、請求項
    50記載の植物。
  52. 【請求項５２】前記標識DNAが、害虫抵抗低を付与するB
    acillus thuringiensis内毒素をコードするか、又は細
    菌抵抗性を付与する殺菌性ペプチドをコードする、請求
    項51記載の植物。
  53. 【請求項５３】前記標識DNAが、改変されていない標的
    酵素よりも低い除草剤親和性を有する改変された除草剤
    標的酵素をコードする、請求項50記載の植物。
  54. 【請求項５４】前記標識DNAが、除草剤グリホセートの
    標的としての改変５−エノールピルビルシキメート−３
    −ホスフェートシンターゼ、およびホスフィノトリシン
    のようなグルタミンシンセターゼ抑制因子の標的として
    の改変グルタミンシンセターゼよりなる群から選択され
    るタンパク質又はポリペプチドをコードする、請求項53
    記載の植物。
  55. 【請求項５５】前記標識DNAが、除草剤の活性を阻害又
    は中和するタンパク質又はポリペプチドをコードする、
    請求項50記載の植物。
  56. 【請求項５６】前記標識DNAが、ホスフィノトリシンの
    ようなグルタミンシンセターゼ抑制因子に対する抵抗性
    が付与するタンパク質又はポリペプチドをコードする、
    請求項55記載の植物。
  57. 【請求項５７】前記標識DNAが、sfr又はsfrv遺伝子であ
    る、請求項56記載の植物。
  58. 【請求項５８】前記第２のプロモーターが、構造プロモ
    ーター、傷誘導性プロモーター、光合成活性を有する植
    物組織において選択的に発現を指令するプロモーター、
    又は葉細胞、花弁細胞若しくは種子細胞において選択的
    に遺伝子発現を指令するプロモーターである、請求項50
    〜57のいずれか１項記載の植物。
  59. 【請求項５９】前記第２のプロモーターが、35Sプロモ
    ーター、35S′３プロモーター、ノパリンシンターゼ遺
    伝子プロモーター、TR1′若しくはTR2′プロモーター、
    又はSSUプロモーターである、請求項58記載の植物。
  60. 【請求項６０】前記標識タンパク質又はポリペプチドを
    少なくとも前記特定の組織又は特定の細胞の葉緑体若し
    くはミトコンドリアに輸送することができるトランジッ
    トペプチドをコードし、前記標識DNAおよび前記第２の
    プロモーターと同一の転写単位内にあって、そして該標
    識DNAと該第２のプロモーターとの間に存在する第２のD
    NAを更に含む、請求項50〜59のいずれか１項記載の植
    物。
  61. 【請求項６１】請求項40〜60のいずれか１項記載の植物
    に成長させ得るアブラナ科種子。
  62. 【請求項６２】（ａ）請求項40〜60のいずれか１項記載
    の植物である雌性稔性親植物；及び （ｂ）不稔性DNAの発現を指令する不稔性プロモーター
    の制御下にある、前記リボヌクレアーゼをコードする不
    稔性DNAを含む第２の組換えDNAを、その全ての細胞の核
    ゲノム中に組み込まれた状態で含む雌性不稔性親植物か
    らなる種子生産用アブラナ科親植物対であって、前記雌
    性不稔性植物及び雌性稔性親植物を交配して、該組換え
    DNA及び該第２の組換えDNAを含む雌性稔性子孫を生み出
    すことができる、種子生産用アブラナ科親植物対。
  63. 【請求項６３】前記リボヌクレアーゼがバルナーゼであ
    り、前記回復DNAがバルスター、又はバルナーゼの活性
    を中和することができるその変異体をコードする、請求
    項62記載の植物対。
  64. 【請求項６４】前記不稔性プロモーターが、前記雌性不
    稔性植物の雌性生殖器官細胞において発現を指令する、
    請求項62又は63記載の植物対。
  65. 【請求項６５】前記第１のプロモーターが、子房、胚
    珠、花柱、柱頭及び隔膜細胞よりなる群から選択される
    １種以上の雌性器官の細胞において発現を指令する、請
    求項64記載の植物対。
  66. 【請求項６６】前記第１のプロモーターが、花柱及び／
    又は柱頭細胞において発現を指令するプロモーターであ
    る、請求項64記載の植物対。
  67. 【請求項６７】前記第１のプロモーター及び前記不稔性
    プロモーターが同じである、請求項62〜66のいずれか１
    項記載の植物対。
  68. 【請求項６８】前記雌性稔性親植物は、前記組換えDNA
    について同型接合性である、請求項62〜67のいずれか１
    項記載の植物対。
  69. 【請求項６９】前記雌性稔性親植物及び前記雌性不稔性
    親植物が異なり、前記種子が雑種種子である、請求項62
    〜68のいずれか１項記載の植物対。
  70. 【請求項７０】請求項62〜69のいずれか１項に記載の植
    物対を交配し、その雌性稔性植物から種子を採取するこ
    とを含む、アブラナ科種子の生産方法。
  71. 【請求項７１】前記種子が、前記回復DNA及び前記不稔
    性DNAを含み、雌性稔性植物に成長させ得る、請求項70
    記載の方法において得られるアブラナ科種子。
  72. 【請求項７２】請求項71に記載の種子から成長させ得る
    雌性稔性アブラナ科植物。
  73. 【請求項７３】ナタネである、請求項２〜25のいずれか
    １項に記載のアブラナ科植物。
  74. 【請求項７４】前記外来性DNAを含有する、請求項73記
    載のアブラナ科植物の種子。
  75. 【請求項７５】ナタネである、請求項26記載のアブラナ
    科種子。
  76. 【請求項７６】ナタネである、請求項27〜36のいずれか
    １項記載のアブラナ科親植物対。
  77. 【請求項７７】前記アブラナ科植物がナタネである、請
    求項37記載の方法。
  78. 【請求項７８】ナタネである、請求項40〜60のいずれか
    １項記載のアブラナ科植物。
  79. 【請求項７９】前記外来性DNAを含有する、請求項78記
    載のアブラナ科植物の種子。
  80. 【請求項８０】ナタネである、請求項61記載のアブラナ
    科種子。
  81. 【請求項８１】ナタネである、請求項62〜69のいずれか
    １項記載のアブラナ科親植物対。
  82. 【請求項８２】前記アブラナ科植物がナタネである、請
    求項70記載の方法。
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