HU214927B - Eljárás módosított virággal rendelkező növények előállítására - Google Patents

Eljárás módosított virággal rendelkező növények előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU214927B
HU214927B HU906172A HU617290A HU214927B HU 214927 B HU214927 B HU 214927B HU 906172 A HU906172 A HU 906172A HU 617290 A HU617290 A HU 617290A HU 214927 B HU214927 B HU 214927B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
promoter
dna
plant
cells
protein
Prior art date
Application number
HU906172A
Other languages
English (en)
Other versions
HU906172D0 (en
HUT58803A (en
Inventor
Willy Greef
Jan Leemans
Celestina Mariani
Original Assignee
Plant Genetic Systems N.V.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Plant Genetic Systems N.V. filed Critical Plant Genetic Systems N.V.
Publication of HU906172D0 publication Critical patent/HU906172D0/hu
Publication of HUT58803A publication Critical patent/HUT58803A/hu
Publication of HU214927B publication Critical patent/HU214927B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)
  • Structures Of Non-Positive Displacement Pumps (AREA)
  • Harvester Elements (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás idegen sterilitás-gént tartalmazó hím- vagynősteril növények termőképességének helyreállítására, melynek sőrán anövény nűkleáris genőmját idegen helyreállító g nt tartalmazó DNS-szekvenciával transzfőrmáljűk, ahől az idegen DNS-szekvencia adőttesetben egy marker DNS-t is tartalmaz. A találmány kiterjed atermőképesség helyreállítására alkalmas hím- vagy nőtermő növény, ahelyreállítőtt növénnyé növeszthető mag, és a helyreállítőtt növényelőállítására. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás transzgén nukleáris hímsteril vagy nősteril növények termőképességének helyreállítására a steril növény transzgén termőképesség-helyreállító növénnyel való keresztezésével. Az így kapott transzgén, termőképességében helyreállított növény olyan, a helyreállító növény nukleáris genomjából származó, idegen DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a helyreállított növény nukleáris genomjába stabilan integrálódik. Ez az idegen DNS-szekvencia egy olyan, idegen DNS-t (a továbbiakban „termőképesség-helyreállító DNS”) tartalmaz, amely
1) egy olyan RNS-t, fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely a termőképességében helyreállított növény virágsejtjében, elsősorban ennek hím vagy női szaporodószervében vagy mag- vagy embriósejtjében termelődve vagy túltermelődve megakadályozza egy olyan első RNS vagy második fehérje vagy polipeptid virág-, mag- vagy embriósejtben való aktivitását, amely egyébként a virág-, mag- vagy embriósejtben termelődve vagy túltermelődve jelentősen zavarná a virág-, mag- vagy embriósejt anyagcseréjét, működését és/vagy fejlődését; és
2) egy első promóterrel azonos transzkripciós egységben van, és e promoter irányítása alatt áll, amely a helyreállított növény legalább ugyanabban a virág-, mag- vagy embriósejtjében, amelyben az első RNS vagy második fehérje vagy polipeptid termelődik vagy túltermelődik, a termőképesség-helyreállító DNS kifejezésének vezérlésére képes.
Az első RNS-t vagy a második fehérjét vagy polipeptidet egy olyan idegen „sterilitás DNS” kódolja, amely a steril növény nukleáris genomjából származik, a helyreállított növény nukleáris genomjába is stabilan integrálódik, és egy olyan „sterilitás-promoter” irányítása alatt áll, amely képes
i) a növény mindegyik virágjának, elsősorban ezek legalább egy hím vagy egy nő szaporodószervének specifikus sejtjében vagy a helyreállított növény mindegyik mag- vagy embriósejtjében a sterilitás DNS szelektív kifejezésére; és ezáltal ii) a termőképesség-helyreállító DNS specifikus virág-, mag- vagy embriósejtben való kifejezése hiányában a helyreállított növény hím- vagy nősterillé tételére. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott, a helyreállító növényből a helyreállított növénybe transzferált idegen DNS-szekvencia adott esetben egy olyan kimér
DNS-szekvencia, amely tartalmazhat egy olyan, második idegen DNS-t (az „első marker DNS”), amely
1) egy második RNS-t vagy egy harmadik fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely, ha a növény legalább egy specifikus szövetében vagy specifikus sejtjében jelen van, az egész növényt könnyen elválaszthatóvá vagy megkülönböztethetővé teszi minden olyan egyéb növénytől, amely a második RNS-t vagy a harmadik fehérjét vagy polipeptidet a növény legalább egy specifikus szövetében vagy specifikus sejtjében nem tartalmazza;
2) egy második promóterrel azonos transzkripciós egységben van, és annak irányítása alatt áll, amely a növény legalább egy specifikus szövetében vagy specifikus sejtjében az első marker DNS kifejezésének vezérlésére képes;
3) a helyreállított növény nukleáris genomjának ugyanazon a genetikai helyén van, mint a termőképesség-helyreállító DNS.
A találmány tárgya tehát eljárás hímtermő növény előállítására, amely alkalmas termőképességében helyreállított növények előállítására, amelyek idegen sterilitás-gént tartalmaznak a nukleáris genomba beépülve, ahol az idegen sterilitás-gén tartalmaz
i) egy hímsterilitás DNS-t, amely egy sterilitás-fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely egy növény specifikus porzósejtjeiben termelődve képes annak elpusztítására vagy működőképességének felfüggesztésére, és így a termőképes hím ivarsejtek termelésének gátlására, és ii) egy sterilitás-promotert, amely a hímsterilitás DNS kifejeződését szelektíven a specifikus porzósejtekben vezérli, és ezáltal a sterilitás-fehérje vagy polipeptid szelektíven a specifikus porzósejtekben termelődik, oly módon, hogy egy olyan növényt állítunk elő, amely nukleáris genomjába beépülve egy idegen DNS-t tartalmaz, amely egy idegen helyreállító gént tartalmaz, ahol az idegen helyreállító gén tartalmaz
a) egy termőképesség-helyreállító DNS-t, amely olyan helyreállító fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely azokban a specifikus porzósejtekben termelődve, amelyek szelektíven termelik a sterilitás-fehérjét vagy polipeptidet, gátolják vagy semlegesítik a sterilitás-fehérje vagy polipeptid hatását, és
b) egy első promotert, amely a termőképesség-helyreállító DNS kifejeződését legalább a specifikus porzósejtekben vezérli.
A találmány tárgya továbbá eljárás nőtermő növény előállítására, amely alkalmas termőképességében helyreállított növények előállítására, amelyek idegen sterilitás-gént tartalmaznak a nukleáris genomba beépülve, ahol az idegen sterilitás-gén tartalmaz
i) egy nősterilitás DNS-t, amly egy sterilitás-fehéqét vagy polipeptidet kódol, amely egy növény női szaporodószervének specifikus sejtjeiben termelődve képes annak elpusztítására vagy működőképességének felfüggesztésére, és így a termőképes női ivarsejtek és/vagy életképes magok termelésének gátlására, és ii) egy sterilitás-promotert, amely a nősterilitás DNS kifejeződését szelektíven a specifikus sejtekben vezérli, és ezáltal a sterilitás-fehéije vagy polipeptid szelektíven a specifikus sejtekben termelődik, oly módon, hogy egy olyan növényt állítunk elő, amely nukleáris genomjába beépülve egy idegen DNS-t tartalmaz, amely egy idegen helyreállító gént tartalmaz, ahol az idegen helyreállító gén tartalmaz
a) egy termőképesség-helyreállító DNS-t, amely olyan helyreállító fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely a női szaporodószerv specifikus sejtjeiben termelődve, amelyek szelektíven termelik a sterilitás-fehéijét vagy polipeptidet, megfelelően gátolják vagy semlegesítik a sterilitás-fehéije vagy polipeptid hatását, és
HU 214 927 Β
b) egy első promotert, amely a termőképesség-helyreállító DNS kifejeződését legalább a női szaporodószerv specifikus sejtjeiben vezérli.
A találmány oltalmi köréhez tartozik a helyreállítónövény és szaporodó anyagai előállítására szolgáló eljárás is, amelyben a növény a növénysejtet az idegen DNS-szekvenciával transzformáljuk, miközben a termőképesség-helyreállító DNS:
1) az első promoter irányítása alatt és adott esetben a második promoter irányítása alatt lévő első marker DNS-sel azonos genetikai helyen van; és
2) stabilan integrálódik a növénysejtek nukleáris genomjába.
A találmány oltalmi köréhez tartoznak továbbá az olyan hibridmagok előállítására szolgáló eljárások, amelyeket az alábbi két növény keresztezésével állítunk elő:
1) a helyreállító-növény, amely előnyösen nukleáris genomjába stabilan integrálódva, a helyreállító-növénynek növényvédő szerrel szembeni rezisztenciát biztosító fehéijét kódoló, első marker DNS-t is tartalmaz, valamint
2) egy nukleáris hím- vagy nősteril növény, amely nukleáris genomjában stabilan integrálódva
a) a sterilitás DNS-t, amely a sterilitás-promoter irányítása alatt van, és a sterilitás DNS-sel szomszédosán, előnyösen a nukleáris genom ugyanazon genetikai helyén található,
b) egy második marker DNS-t, amely egy harmadik RNS-t vagy egy negyedik fehéijét vagy polipeptidet kódol, és előnyösen a steril növénynek egy növényvédő szerrel szembeni rezisztenciát biztosít, a második marker DNS legalább egy specifikus szövetben vagy specifikus sejtekben való kifejezésének irányítására képes harmadik promoter irányítása alatt van, és a második marker DNS kifejezése lehetővé teszi a növény ilyen kifejezéstől mentes növényektől való könnyű elválasztását vagy megkülönböztetését, tartalmaz. A találmány szerinti eljárással előállított hibridmagok előállítása ipari méretben, előnyösen véletlenszerű populációban, megnövekedett hatékonyságú keresztbeporzással és különösebb kézi munka nélkül történik.
A növényhibridizáció olyan fontos eljárás, amellyel a szülőnövények kívánt sajátosságait kombináló utódnövények állíthatók elő. Az előállított hibridutódok gyakran felülmúlják a szülők különböző tulajdonságait, mint például a terméshozamot, a környezeti változásokhoz való alkalmazkodóképességet, valamint a betegségekkel szembeni ellenállást. Ezt a képességet „heterózis”-nak vagy „hibrid életerő”-nek nevezzük. A hibridizációt emiatt széleskörűen alkalmazzák a legfontosabb növények, mint például a gabona, cukorrépa és a napraforgó javítására. A hibridmagok jelentős önbeporzás-nélküli, irányított keresztbeporzással megvalósított ipari méretű termesztése különböző okok miatt, elsősorban amiatt, mert a legtöbb növény ön- és keresztbeporzásra egyaránt képes, nagyon nehezen megvalósítható eljárás.
A természetben a gabonanövények óriási többsége ugyanazon a növényen, általában ugyanabban a virágban egymással szoros közelségben lévő hím és női szaporodószerveket termel. Ez az önbeporzásnak kedvez. Néhány növény azonban, szaporodószervei sajátos keresztbeporzásnak kedvező morfológiája következtében, kivételt képez. Az ilyen növények erősebb és alkalmazkodóképesebb utódokat termelnek. A kender (Cannabis spp.) morfológiájára például az jellemző, hogy a hím és női szaporodószervek különböző növényekben vannak. Egy másik jellemző morfológiájú növényben, a kukoricában (Zea mays) a hím és női szaporodószervek ugyanazon növény különböző részein találhatók. Az olajpálmára (Elaeis guineensis) pedig olyan morfológia jellemző, amelyben a hím és női ivarsejtek a növényi fejlődés különböző időszakaiban válnak termőképessé.
Más növényfajták pedig, mint például az ananász (Ananas comosus) szaporodószerveik sajátos fiziológiája következtében a keresztbeporzásnak kedveznek. Az ilyen növényeknek egy úgynevezett „önkompatibilitásrendszer”-e van, emiatt a növény pollenje nem képes a saját vagy egy ugyanolyan genotípusú, másik növény női ivarsejtjének megtermékenyítésére.
Más növényfajták természetes, úgynevezett „hímsteril” genom jellegük következtében a keresztbeporzásnak kedveznek. Emiatt a növény portokja az általa termelt pollen megérése előtt degenerálódik. Ezt a jelenséget ismerteti például Kául, M. L. H.: Monographs on Theoretical and Applied Genetics, 10. Edit. Springer Verlag irodalmi helyen 1987-ben, „Male-Sterility in Higher Plants” című közleményében. A feltételezések szerint az ilyen természetes hímsterilitási jelleg nagyszámú természetes mutációból, a leggyakrabban hibás mutációkból ered, és az elsődlegesen önbeporzó növényfajtákban, mivel természetes körülmények között magképződés nem jön létre, nehezen tartható fenn.
A természetben előforduló hímsteril típusú növények közül néhányan citoplazmatikusan kódoltak, míg mások nukleárisan kódoltak. Az egyik hímsterilitási típus a nukleárisan és a citoplazmatikusan egyaránt kódolt kombináció eredménye. A hímsterilitást indukáló nukleáris allélek általában lappangók, és fenotipikusan csak azok a növények hímsterilek, amelyek tartalmazzák a citoplazmatikus alléleket, és a hímsterilitást indukáló nukleáris allélekre homozigóták. Az ilyen típusú növényekben a domináns hím termőképességet indukáló allélek vagy „termőképesség-helyreállító”-k hímtermő fenotípust eredményeznek. Az ilyen típusú növények hímsteril utódja hímtermővé tehető, ha a növényt termőképesség-helyreállítókat tartalmazó pollennel porozzuk be. Emiatt az ilyen típusú növények utódai kereskedelmi értékűek, és a gazdaságos termék a mag (például kukorica, cirok, napraforgó).
A természetben előforduló, ismert hímsteril gének és az ezeknek megfelelő termőképesség-helyreállító gének legtöbbjét lényegében a következő két ok miatt nem alkalmazzák új fajták tenyésztésére vagy termelésére:
a) a hímsterilitásért és helyreállításért felelős gének nem megfelelő minősége; és
b) az előfordulási helyüknek megfelelő növények alacsony keresztbeporzó-képessége.
HU 214 927 Β
1. A gének minősége
A hímsterilitás/termőképesség-helyreállító rendszer teljes potenciáljának eléréséhez a következő minőségi igényeket kell kielégíteni:
a) A hímsterilitást kódoló géneknek a legkülönbözőbb környezeti körülmények között stabilaknak kell lenniük. A jelenleg ismert legtöbb rendszer, akár nukleárisan, akár citoplazmatikusan kódolt, nem elég stabil. Emiatt váratlan időjárási körülmények között a növényekben önbeporzás jön létre, és heterogén utódok jönnek létre. A magbizonyítvány előírásai szerint a legtöbb szabadföldi növény nem hibrid aránya legfeljebb 1% lehet.
b) A növényekben nem léphetnek fel mellékhatások. Sok citoplazmatikusan hímsteril gén a növény életerejét csökkenti. Ez, ha a hibridéleterő hatása a negatív hatásokhoz képest a növényben pozitív változásokat idéz elő, bizonyos mértékig tolerálható.
A hímsterilitás-géneket tartalmazó növényeknél megfigyelt másik mellékhatás, hogy az ilyen növények néhány növényi kórokozóval szemben érzékenyebbé válnak (például a T-citoplazmikus hímsterilitást hordozó kukoricanövények nagyon érzékenyek a Helminthosporium maydis-fertőzésre).
A helyreállító gének is gyakran mutatnak negatív mellékhatást, ezek azonban általában nem maguknak a géneknek, hanem az ezekhez szorosan kapcsolódó helyreállító géneknek köszönhetők. Ezek a mellékhatások többnyire fokozott betegség- vagy fertőzésérzékenységet jelentenek, vagy a termék minőségének romlásához vezetnek.
2. Keresztbeporzás hatékonysága
A hibridmagok elfogadható költséggel való előállításának lényeges feltétele a megfelelő hatékonyságú keresztbeporzás. A legtöbb keresztbeporzásra gyengén hajlamos szabadföldi növény kézi keresztbeporzása megoldhatatlan feladat. Emiatt a kereskedelmi termékeknél mérlegelik az FI hibrid helyett az önbeporzott F2 utód kibocsátását (például gyapot és búza). Az eljárás azonban a homogenitás csökkenése és a heterózis fellépése, valamint a specifikus hasznú génkombinációk elkülönülése miatt hátrányos. A mezőgazdász által elvárt terméshozam szempontjából az az előnyös, ha a hibridnövények teljesen termőképesek (a nagyon hatékony keresztbeporzásos fajták, mint például a kukorica vagy olajrepce kivételével). Ez elsősorban a nehéz vagy ragadós, ezért a széllel nem szállítható pollennel rendelkező növényeknél (például a gyapotnál) vagy a beporzó rovarok számára nem vonzó növényeknél (például búzánál), valamint a zárvatermő növényeknél (például szójababnál) fordul elő.
A találmány tárgya eljárás egy olyan transzgenikus és termőképességében helyreállított növény előállítására, amelyben a nukleáris genom stabilan integrálódva egy idegen DNS-szekvenciát, előnyösen egy idegen kimér DNS-szekvenciát tartalmaz, amely tartalmaz a) egy termőképesség-helyreállító DNS-t, amely egy olyan, első fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely valamely virágsejtben, elsősorban ennek hím vagy női szaporítószervében vagy a növény mag- vagy embriósejtjében termelődve vagy túltermelődve megakadályozza egy olyan első RNS vagy második fehérje vagy polipeptid virág-, mag- vagy embriósejtben való aktivitását, amely egyébként a virág-, mag- vagy embriósejtben termelődve vagy túltermelődve nagyon jelentősen zavarná a virág-, magvagy embriósejt anyagcseréjét, működését és/vagy fejlődését; az első RNS-t vagy a második fehéqét vagy polipeptidet egy olyan sterilitás DNS kódolja, amely szintén stabilan integrálódik a növény nukleáris genomjába, és egy olyan sterilitás-promoter irányítása alatt áll, amely képes a növény mindegyik virágjának, elsősorban ezek hím vagy női szervének és/vagy magjának és/vagy embriójának specifikus sejtjeiben a sterilitás DNS szelektív kifejezésére; és ezáltal a termőképesség-helyreállító DNS specifikus virág-, mag- és/vagy embriósejtben való kifejezése hiányában a növény hím- vagy nősterillé tételére; és
b) egy első promotert, amely alkalmas a termőképesség-helyreállító DNS-nek legalább ugyanabban a specifikus virág-, mag- és/vagy embriósejtben történő szabályozására, amelyben a sterilitás-promoter a sterilitás DNS génjeinek kifejezését irányítja; ahol a termőképesség-helyreállító DNS ugyanabban az átírási egységben található, mint az első promoter, és annak irányítása alatt áll.
A helyreállított növény nukleáris genomjában lévő idegen DNS-szekvencia előnyösen a termőképességhelyreállító DNS-sel azonos genetikai helyen tartalmazhat még
c) egy első marker DNS-t, amely egy második RNS-t vagy egy harmadik fehéqét vagy polipeptidet kódol, amely, ha a növény legalább egy specifikus szövetében vagy specifikus sejtjében jelen van, lehetővé teszi a növény elválasztását vagy megkülönböztetését minden olyan egyéb növénytől, amely a második RNS-t vagy a harmadik fehérjét vagy polipeptidet a növény legalább egy specifikus szövetében vagy specifikus sejtjében nem tartalmazza; és
d) egy második promotert, amely legalább a specifikus szövetben vagy a specifikus sejtekben az első marker DNS kifejezésének irányítására képes; az első marker DNS a második promoterrel azonos transzkripciós helyen van, és a második promoter irányítása alatt áll.
A találmány oltalmi köréhez tartozik továbbá egy eljárás a transzgenikus, termőképességében helyreállított növény előállítására, amelyben
- egy olyan transzgenikus hím- vagy nősteril növényt, amely nukleáris genomjában stabilan integrálódva a sterilitás-promoter irányítása alatt lévő sterilitás DNS-t és előnyösen egy harmadik promoter irányítása alatt lévő, második marker DNS-t tartalmaz;
- egy olyan transzgenikus termőképesség-helyreállító növénnyel keresztezünk, amely nukleáris genomjában stabilan integrálódva az első promoter irányítása alatt lévő, termőképességhelyreállító DNS-t és előnyösen a második
HU 214 927 Β promoter irányítása alatt lévő, első marker DNS-t tartalmazó idegen DNS-szekvenciát tartalmaz.
A találmány szerinti eljárásban egy termőképességhelyreállító növényt állítunk elő a növény egy sejtjéből, amelynek során a sejtet ismert módon transzformálva a sejt nukleáris genomjába a találmány szerinti idegen DNS-szekvenciát ültetjük be. Az idegen DNS-szekvencia legalább egy olyan, termőképesség-helyreállító DNS-t tartalmaz, amely az első promoter irányítása alatt áll, és ennek 5’-végéhez kapcsolódik, és a 3’-végénél egy poliadenilező szignált tartalmazó, megfelelő transzkripciós terminációs (vagy regulációs) szignálokhoz kapcsolódik. Emiatt az első fehérje vagy polipeptid a helyreállító növény legalább mindegyik virágjának sejtjeiben, előnyösen ezek egy vagy több hím vagy női szaporodószerveinek és/vagy magjainak és/vagy embrióinak sejtjeiben termelődik vagy túltermelődik, és így, ha a helyreállító növényt nukleárisan hím- vagy nősteril növénnyel keresztezzük, hibrid hímtermő, nőtermő utódot kapunk. Az idegen DNS-szekvencia tartalmazhat még legalább egy első marker DNS-t, amely a második promoter irányítása alatt áll, és ahhoz az 5’-végen keresztül kapcsolódik, és a 3’-végénél egy poliadenilező szignált tartalmazó, megfelelő transzkripciós terminációs szignálhoz kapcsolódik. Az első marker DNS előnyösen a termőképesség-helyreállító DNS-sel azonos genetikai helyen van, és ezáltal a második RNS vagy a harmadik fehérje vagy polipeptid legalább a termőképesség-helyreállító növény specifikus szövetében vagy specifikus sejtjeiben termelődik, ami lehetővé teszi a növény minden olyan egyéb növénytől való megkülönböztetését és/vagy elválasztását, amely a specifikus szövetben vagy a specifikus sejtekben nem tartalmazza a második RNS-t vagy a harmadik fehérjét vagy polipeptidet. Ez nagy bizonyossággal garantálja a termelőképesség-helyreállító DNS és az első marker DNS-utódban való közös kiválasztódását.
A növényi sejt (elsősorban valamilyen, Agrobacteriummal fertőzhető növény sejtje) találmány szerinti transzformálását az idegen DNS-szekvenciát tartalmazó és az Agrobacterium által hordozott, legyengített Ti-plazmid vektorral végezzük. A transzformálást kivitelezhetjük például a 0 116 718 és 0270822 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett eljárással. Az előnyös Ti-plazmid vektorok az idegen DNS-szekvenciát a határszekvenciák között vagy legalább a Tiplazmid T DNS-ének jobboldali határszekvenciájától balra elhelyezkedve tartalmazzák.
A növényi sejttranszformáláshoz természetesen egyéb típusú vektorokat is alkalmazhatunk. Az alkalmazott eljárás lehet például közvetlen géntranszfer (mint például a 0 223 247 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett eljárásban); pollen-közvetítésű transzformáció (mint például a 0270 356 számú európai közrebocsátási iratban, a WO 85/01856 számon közrebocsátott PCT-bejelentésben és a 0275 069 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett eljárás); in vitro protoplaszt transzformáció (mint például a 4684 611 számú USAbeli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás); növényi RNS-vírus közvetítésű transzformáció (mint például a
0067553 számú európai közrebocsátási iratban és a 4407956 számú USA-beli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás); valamint a liposzóma közvetítésű transzformáció (mint például a 4 536 475 számú USA-beli szabadalmi leírásban ismertetett eljárás).
Termőképesség-helyreállító növényt a találmány szerinti eljárással előnyösen úgy állítunk elő, hogy egy növényi sejtet olyan legyengített Ti-plazmiddal transzformálunk, amely egy első promoter irányítása alatt lévő termőképesség-helyreállító DNS-ből és adott esetben egy második promoter ellenőrzése alatt lévő első marker DNS-ből álló idegen DNS-szekvenciát tartalmaz. A marker DNS a Ti-plazmidban a termőképességhelyreállító DNS felső részén vagy alsó részén helyezkedhet el, előnyös azonban, ha a kettő egymással szomszédosán a határszekvenciák között vagy legalább a Tiplazmidvektor jobboldali határszekvenciájától balra úgy helyezkedik el, hogy megfelelően és együtt transzformálódjanak a növényi sejt nukleáris genomjába. Kívánt esetben azonban úgy is eljárhatunk, hogy a sejtet először a termőképesség-helyreállító DNS-t és az első promotert tartalmazó, idegen DNS-szekvenciával transzformáljuk, és ezt követően a sejt nukleáris genomjába ugyanezen genetikai helyen beültetendő marker DNS-sel és a második promoterrel transzformáljuk, vagy ez utóbbi transzformálási sorrendet megfordítjuk. Erre a célra ugyanazok a vektorok alkalmasak, amelyeket a sejtek idegen DNS-szekvenciával megvalósított transzformálásánál a fentiekben ismertettük. Előnyös a legyengített Ti-plazmid vektor.
A találmány szerinti termőképesség-helyreállító DNS kiválasztása nem kritikus, de függ a sterilitás DNS - amely a helyreállítandó hím- vagy nősterilitásért felelős - kiválasztásáról, és ezzel összhangban kell lennie. A termőképesség-helyreállító DNS-sel kódolt első fehérje vagy polipeptid termelésnek vagy túltermelésnek semlegesítenie, blokkolnia, ellensúlyoznia, elfojtania vagy más módon gátolnia kell az első RNS-t vagy a második fehéqét vagy polipeptidet, amelyet a helyreállított növény virágsejtjeiben, előnyösen ezek legalább egy hím vagy női szaporodószervében vagy a mag- vagy embriósejtekben a sterilitás DNS kódol. A találmány szerinti termőképesség-helyreállító DNS-eknek megfelelő hím- vagy nősterilitás DNS-ek, és ezek ellenakciói ismertetését megtaláljuk például a 0344 029 és 0412006 számú európai közrebocsátási iratokban. Önmagában ismert módon szelektálható és izolálható olyan termőképesség-helyreállító DNS, amely alkalmas a sterilitás DNS hatásának minden olyan virág-, előnyösen hím vagy női szerv, mag- és/vagy embriósejtben történő legyőzésére, amely sejtben a sterilitás-promoter a sterilitás DNS kifejezését előidézi.
Előnyös termőképesség-helyreállító DNS-ek például a bamáz aktivitását semlegesítő barstar-t (amely a guanincsoport után lévő kötés hidrolizálásával elbontja az RNS-molekulákat); az EcoRI metilázt, amely az EcoRI endonukleáz-aktivitást akadályozza; vagy a proteáz inhibitorokat, amelyek a proteázok, mint például papain (például papain zimogén és papain aktív fehérje) aktivitását semlegesítik kódoló DNS-ek.
HU 214 927 Β
Egy másik termőképesség-helyreállító DNS például egy olyan antiszenz DNS (amelyet például a 0223 399 számú európai közrebocsátási iratban ismertetnek), amely egy olyan DNS-szálra komplementer DNS-szálat kódol, amely egy sterilitás-promoter irányítása alatt lévő, egyébként steril növény virág-, magvagy embriósejbe átírt sterilitás DNS-t kódol. Ez az antiszenz DNS egy olyan RNS-szekvenciába írható át, amely képes a sterilitás DNS kifejezésének eredményeként a virágokban, magokban és/vagy embriókban képződött „sterilitás-RNS” kódoló és/vagy nem kódoló részek megkötésére, és ezáltal az így kapott sterilitás-RNS transzlációjának semlegesítésére. Ilyen antiszenz DNSek a következő második fehéqeket kódoló sterilitás DNS antiszenz DNS-ei: bamáz; EcoRI; fitohormonok szintézisét katalizáló enzimek, például az izopentenil transzferáz, amely a citokinin bioszintézis első lépcsőjét katalizálja, és az Agrobacterium T-DNS 4 génnel kódolt enzim; az Agrobacterium T-DNS 1 és 2 génnel kódolt enzimek, amelyek az auxin szintézisében vesznek részt; glükanázok; lipázok, mint például az A2 foszfolipáz [Verheij és munkatársai: Rév. Biochem. Pharmacol., 91, 92-203. (1981)]; lipid peroxidázok; növényi sejtfal inhibitorok, mint például bakteriális toxinok (például diftéria toxin vagy botulin A-fragmens); valamint a sterilitás DNS-ek antiszenz DNS-ei, amelyek a természetes öninkompatibilis géneket kódolják.
A termőképesség-helyreállító DNS-ek további példái a specifikus RNS-enzimeket (azaz az úgynevezett ,,ribozimek”-et), amelyek egy adott célszekvencia ellen nagyon hasítóképesek, kódolják, amint azt Haseloff és Gerlach ismertetik a Natúré 334, 585-591. (1988) irodalmi helyen. Ilyen ribozim például a fentiekben ismertetett sterilitás DNS-ek ellen alkalmazandó ribozim.
További termőképesség-helyreállító DNS-ek lehetnek még a fentiekben ismertetett két vagy több, különböző termőképesség-helyreállító DNS kombinációi is.
A leírásunkban alkalmazott „idegen DNS-szekvencia” kifejezésben alkalmazott „idegen” jelző azt jelenti, hogy az idegen DNS-szekvencia egy idegen termőképesség-helyreállító DNS-t és/vagy egy idegen első promotert tartalmaz. A DNS, mint például a termőképesség-helyreállító DNS az első promoter, valamint az első marker DNS, a második promoter és az idegen DNS-szekvenciában lévő bármely egyéb DNS szó mellett lévő „idegen” jelző azt jelenti, hogy a DNS a találmány szerinti, ilyen DNS-sel transzformált növényi sejten belül nem ugyanabban a genomiális környezetben van, mint ha ez a DNS természetesen megtalálható lenne azokban a növény, baktérium, állat, gomba, vírus vagy hasonló szervezetek sejtjeiben, amelyekből ez a DNS származik. Ez azt jelenti például, hogy az idegen termőképesség-helyreállító DNS vagy első marker DNS lehet
1) egy eredeti növényben lévő nukleáris DNS;
2) endogén a transzformált növénysejtre (például ugyanolyan genotípusú eredeti növényt képez, mint a transzformálandó növény); és
3) a találmány szerinti transzformált növényi sejtben lévő idegen DNS-szekvencia ugyanabban a transzkripciós egységében van, mint az eredeti endogén promoter és 3’-végi transzkripciós regulációs szignáljai (az eredeti növényből); de
4) a transzformált növényi sejt nukleáris genomjában az eredeti növénytől eltérő helyen van beépítve azért, hogy a transzformált sejtben ne vegyék körül olyan gének, amelyek az eredeti növényben természetesen körülveszik.
Az idegen termőképesség-helyreállító vagy első marker DNS lehet továbbá például
1) egy eredeti növényben lévő nukleáris DNS; és
2) endogén a transzformált növénysejtre; de
3) ugyanazon transzkripciós egységben van, mint egy tőle eltérő (azaz nem saját) endogén promoter és/vagy 3’-végi transzkripciós regulációs szignál egy transzformált növénysejtben lévő, találmány szerinti idegen, kimér DNS-szekvenciában; vagy
1) egy eredeti növényben lévő nukleáris DNS; és
2) endogén a transzformált növénysejtre; de
3) ugyanazon transzkripciós egységben van, mint egy heterológ promoter és/vagy 3’-végi transzkripciós regulációs szignál egy transzformált növényi sejtben lévő, találmány szerinti idegen, kimér DNSszekvenciában; vagy lehetséges az is, hogy heterológ a transzformált növényi sejtre és egy transzformált növényi sejtben lévő találmány szerinti, idegen kimér DNS-szekvencián belül ugyanabban a transzkripciós egységben helyezkedik el, mint az endogén promoter és/vagy 3’ transzkripciós regulációs szignál (például egy ugyanolyan genotípusú növény nukleáris genomjából, mint amiből a növényt transzformáljuk). Ilyen termelőképesség-helyreállító DNS származhat például egy, a transzformálandó növénnyel azonos genotípusú növény genomjából, és kódolhat egy, a transzformálandó növényre endogén inhibitort, mint például proteáz vagy ribonukleáz inhibitort, abból a célból, hogy a transzformált sejtekben túltermelt enzim semlegesítse a proteáz vagy ribonukleáz (azaz a hím- és nősterilitás DNS által kódolt második fehéije) aktivitását, ami különben jelentős mértékben zavarná az ilyen enzim kifejezési helyéül szolgáló virágsejtek, elsősorban hím vagy női szervi sejtek vagy mag- vagy embriósejtek anyagcseréjét, működését és/vagy fejlődését. A termőképesség-helyreállító DNS és első marker DNS előnyösen heterológ a transzformálandó növényi sejtre.
A leírásban a DNS-sel, mint például termőképességhelyreállító DNS-sel, első vagy harmadik promoterrel, első marker DNS-sel és bármely, a találmány szerinti idegen DNS-szekvenciában található DNS-sel kapcsolatban alkalmazott „heterológ” kifejezés azt jelenti, hogy az ilyen DNS a transzformálandó növénnyel azonos genotípusú növényi sejt nukleáris genomjában természetesen nem fordul elő. Ilyen heterológ DNS-ekre példaként említhető a transzformálandó növénnyel azonos genotípusú növényből nyerhető kloroplaszt és mitokondriális DNS-ek, de előnyösek a transzformálandó növénytől eltérő genotípusú növényekből származó kloroplaszt, mitokondriális és nukleáris DNS-ek, az állat- és baktériumgenomokból származó DNS-ek, vala6
HU 214 927 Β mint a gomba- és vírusgenomokból származó kromoszomális és plazmidális DNS-ek.
A leírásban a találmány szerinti idegen DNS-szekvenciával kapcsolatban alkalmazott „kimér” kifejezés azt jelenti, hogy saját termőképesség-helyreállító DNSei közül legalább egy:
1) a természetben nem a termőképesség-helyreállító
DNS első promoterének ellenőrzése alatt fordul elő, és/vagy
2) a természetben nem fordul elő olyan genetikai helyen, ahol a saját marker DNS-ei közül legalább egy előfordul.
A találmány szerinti idegen kimér DNS-szekvenciákra példaként említhetők a baktériumból származó termőképesség-helyreállító DNS-ek, amelyek az eredeti növény első promoterének ellenőrzése alatt állnak, és az eredeti növény termőképesség-helyreállító DNS-ei, amelyek az eredeti növény első promoterének irányítása alatt állnak, és a baktériumból származó első marker DNS-sel azonos genetikai helyen vannak.
A „virág” kifejezés az egész hajtástengelyre, csészelevelekre, szirmokra, hím szaporodószervekre (vagy porzószálakra) és/vagy női szaporodószervekre (vagy termőlevelekre) vonatkozik; ezek részleges vagy teljes visszatartása vagy fékezése megakadályozza az életképes magok virágban való fejlődését és/vagy szaporodását, vagy hím ivarsejtjei fejlődését és/vagy szaporodását; a „hímszerv” vagy „hím szaporodószerv” kifejezés a virágnak a hím ivarsejtek termelésében résztvevő teljes szervére, valamint egy vagy több egyedi részére, mint például portokjára, pollenjére és porzószálára vonatkozik; a „női szerv” vagy „női szaporodószerv” kifejezés a virágnak a női ivarsejtek és/vagy életképes magok és/vagy életképes embriók termelésében résztvevő teljes szervére, valamint egy vagy több egyedi részére, mint például magházára, magkezdeményére, bibeszálára, bibéjére, pártájára, korongjára, belső rekeszfalára, kallixjára és maglécére vonatkozik; az „embrió” kifejezés pedig a növény teljes embriójára, valamint ennek egy vagy több egyedi részére, mint például embriótengelyére és embrió-sziklevelére vonatkozik.
Azért, hogy a termőképesség-helyreállító DNS legalább azokban a termőképességében helyreállított növény specifikus sejtjeiben kifejezésre kerüljön, amelyekben a sterilitás DNS kifejeződik, első promoterként előnyösen egy olyan promotert alkalmazunk, amely legalább abban a termőképességében helyreállított növényi sejtben (azaz a specifikus virágsejtben, előnyösen hím vagy női szervsejtben vagy magsejtben vagy embriósejtben) képes a génkifejezés irányítására, amelyben a sterilitás DNS a sterilitás-promoter ellenőrzése alatt szelektív kifejezésre kerül. Ilyen első promoter lehet egy endogén vagy egy exogén promoter, és származhat a növényi sejt nukleáris genomjából vagy a mitokondriális vagy kloroplaszt genomjából. Az első promoter a transzformálandó növényi sejt nukleáris genomájra minden esetben idegen. Az első promoter lehet egy konstitutív promoter, de lehet a sterilitás-promoterrel azonos szelektív promoter is. Az első promoter termőképesség-helyreállító hatása előnyösen abban nyilvánul meg, hogy szelektíven ugyanabban a virág-, mag- vagy embriósejtben, elsősorban ugyanabban a specifikus virágsejtben, amelyekben a sterilitás DNS kifejeződik, elegendő mennyiségű termőképesség-helyreállító első RNS termelődik.
A találmány szerinti első promoter valamilyen növényfajtából való, izolálása és szelektálása ismert eljárásokkal, mint például a 0 344 029 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett eljárással történhet. Ebben az iratban olyan hímsterilitás-promotert ismertetnek, amely egy sterilitás DNS porzószálban való szelektív kifejezését irányítja, és megakadályozza a sterilitás DNS egyéb növényrészekben való szelektív kifejezését. A 0 412 006 számú európai közrebocsátási iratban pedig olyan nősteril promotert ismertetnek, amely egy sterilitás DNS növény virágsejtekben, elsősorban női szervsejtekben (például bibében) vagy magsejtekben vagy embriósejtekben való szelektív kifejezését irányítja, és megakadályozza a sterilitás DNS egyéb növényrészekben való kifejezését.
Valamely növényben például megfelelő endogén szerv- vagy szövetspecifikus első promoter a következőképpen azonosítható és izolálható:
1) Keresünk egy olyan mRNS-t, amely csak a növény virágjainak, magjainak vagy embrióinak, előnyösen portokjainak, pollenjeinek, rostjainak, magházának, magkezdeményének, tokjának, termőjének, maglécének, kallixének, pajzsának, szeptumjának, magházának, magbelének vagy embrió-szíklevelének fejlődése alatt van jelen;
2) ezt a specifikus mRNS-t elválasztjuk;
3) ebből a specifikus mRNS-ből cDNS-t állítunk elő;
4) a cDNS-t a növényi genom azon régióinak azonosítására alkalmazzuk, amelyek a specifikus mRNS-t kódoló DNS-t tartalmazzák; és ezután
5) a növényi genomnak azt a részét azonosítjuk, amely a specifikus mRNS-t kódoló DNS-től felfelé (azaz 5’ irányban) van, és ennek a DNS-nek a promoterét tartalmazza.
Az ilyen első promoterek ellenőrzése alatt lévő gének mintaként alkalmazhatók továbbá a fenti 4. pontban ismertetett azonosításra. Az ilyen vizsgálóanyagok hibridizáló körülmények között egy másik növényfajtából származó genom DNS-szekvenciaelegyében valamely specifikus mRNS-t kódoló DNS hibridizálására alkalmasak [Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Az azonosítás után a fentiekben ismertetett 5. pont szerint egy másik növényfajtára specifikus első promoter azonosítható.
Hím szervre specifikus első promoter és sterilitáspromoter lehet például: a PTA29-promoter, a PTA26 promoter és a PTA13-promoter, amelyek a 0 344 029 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett eljárással dohányból előállított, tapétum-specifikus promoterek; valamint bármelyik olyan tapétumspecifikus mRNS-t kódoló gén promotere, amelyik a PTA29-, PTA26- és PTA13-promoterek izolálására alkalmazott génekből a 0 344 029 számú európai közrebocsátási irat szerinti TA29, TA26 és TA13 génekkel hibridizálódik.
HU 214 927 Β
Női szervre specifikus első promoterek és sterilitáspromoterek lehetnek például: a bibeszálra és/vagy bibére specifikus promoterek, mint például a PSTMGO7, PSTMGO8, PSTMG4B12 és PSTMG3C9 és magkezdemény-specifíkus promoter, amely a 0412006 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett pMON9608 cDNS-klónnak felel meg; valamint egy gén promotere, amely egy olyan
i) toktermő-specifikus; vagy ii) magházspecifikus mRNS-t kódol, amely
i) egy STMG típusú toktermő-sepcifikus génnel vagy ii) egy 0412 006 számú európai közrebocsátási irat szerinti pMON9608 cDNS-ldónnal hibridizálódik. Ha a találmány szerinti transzgenikus termőképesség-helyreállító növénnyel keresztezendő transzgenikus steril növényben egynél több nukleáris sterilitás DNS van, szükségessé válhat, hogy a helyreállító növény nukleáris genomjába több találmány szerinti termőképesség-helyreállító DNS-t ültessünk be, amelynek száma legalább a steril növény nukleáris genomjában lévő sterilitás DNS számának felel meg.
A termőképesség-helyreállító DNS-ek mindegyike egyetlen első promoter ellenőrzése alatt állhat, azonban előnyösen mindegyik termőképesség-helyreállító DNS annak a saját külön első promoterének az ellenőrzése alatt áll, amely az első fehérje vagy polipeptid kifejezését legalább azokban a sejtekben irányítja, amelyekben a sterilitás-promoterek a sterilitás DNS-eket az első RNS vagy a második fehéije vagy polipeptid kifejezésére készteti. Mindegyik termőképesség-helyreállító DNS saját első promoterével szomszédos, és az összes termőképesség-helyreállító DNS és a hozzá tartozó első promotere előnyösen egymás szomszédságában helyezkednek el a találmány szerinti idegen DNS-szekvenciában és a növénysejtek ilyen idegen DNS-szekvenciákkal megvalósított transzformálására alkalmazott bármilyen vektorban. Az azonban nem szükséges, hogy a termőképesség-helyreállító DNS-ek az idegen DNSszekvenciában egymással szomszédosak legyenek, némely esetben ezek valamilyen független transzformáló lépéssel is bevihetők a helyreállító növény nukleáris genomjába.
A találmány szerinti első marker DNS kiválasztása sem kritikus. Jól ismert eljárásokkal olyan megfelelő első marker DNS szelektálható és izolálható, amely a harmadik RNS-t, fehérjét vagy polipeptidet kódolja úgy, hogy a növény az első maker DNS kifejezésével az első marker DNS-t ki nem fejező növényektől könnyen megkülönböztethető és elválasztható legyen.
Az első marker DNS számos esetben ugyanazt az RNS-t, fehérjét vagy polipeptidet kódolja, amelyet a második marker DNS kódol a nukleáris hím- vagy nősteril növényben, amelynek termőképességét a találmány szerint helyreállítjuk.
Ilyen első marker DNS-ekre példaként említhetők a 0 344 029 számú és 0412006 számú európai közrebocsátási iratokban ismertetett nukleáris hím- vagy nősteril növények nukleáris genomjában lévő marker DNS-ek, amelyek fehéijéket vagy polipeptideket kódolnak azért, hogy a növénysejteknek megkülönböztethető színt biztosítsanak, ilyen például a dihidrokvercetin-4-reduktázt [Meyer és munkatársai: Natúré, 330, 677-678. (1987)] kódoló Al gén és a glukoronidáz gén [Jeffferson és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA („PNAS”), 83, 8447 (1988)]; egy növénynek specifikus morfológiai tulajdonságokat, mint például törpenövést vagy különböző formájú leveleket biztosítsanak; a növényt stressztűrővé tegyék, ilyen hatású például a 0359617 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett, szuperoxid dizmutázt kódoló gén; a növényt betegséggel és kártevővel szemben ellenállóvá tegyék; ilyen hatású például a 0 193 259 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett, rovarral szembeni ellenállóságot eredményező, Bacillus thuringiensis endotoxint kódoló gént; vagy a növényt baktériummal szemben ellenállóvá tegyék, ilyen hatású például a 0 299 828 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett bakteriális peptid.
Előnyösek a herbicidek aktivitását gátló vagy semlegesítő harmadik fehéijéket vagy polipeptideket kódoló első marker DNS-ek, ilyenek például a glutamin szintetáz inhibitorok, mint például a bialafosz és foszfinotricin elleni rezisztenciát biztosító enzimeket kódoló sír gén és sfrv gén, amelyek ismertetését megtaláljuk a 0242 246 számú európai közrebocsátási iratban; bizonyos herbicidekre vonatkozó módosított cél enzimeket kódoló olyan gének, amelyek herbicidekre vonatkozó affinitása kisebb, mint a természetesen termelt endogén enzimeké, ilyen például a 0 240 792 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett foszfinotricin-célú módosított glutamin szintetáz és a 021 857 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett glifozát-célú módosított 5-enol-piruvil-sikimát-3foszfát-szinteáz. További harmadik fehéqét kódoló első marker DNS például a bromoxinil herbicid hatását semlegesítő fehérjét [Stalker és munkatársai: Genetic Improvements of Agriculturally important Crops. Ed. R. T. Fraley, Ν. M. és J. Schell, Cold Spring Harbor Laboratories (1988)], vagy a szulfonil-karbamid herbicidek hatását semlegesítő fehéijét [Lee és munkatársai: EMBO J., 7, 1241-1248. (1988)] vagy a 2,4-D herbicid hatását semlegesítő fehérjét (2nd International Symposium of Plánt Molecular Biology, Jerusalem, 13-18 November 1988) kódoló DNS.
Az első marker DNS ellenőrzésére alkalmas, találmány szerinti második promoter szelektálása és izolálása is jól ismert eljárásokkal történhet úgy, hogy a második RNS vagy a harmadik fehérje vagy polipeptid kívánt természetétől függően az első marker DNS egy vagy több specifikus szövetben vagy specifikus sejtben szelektíven vagy az egész növényben kerüljön kifejezésre. A második promoter számos esetben azonos a találmány szerint termőképességében helyreállítandó hím- vagy nősteril növényben a második marker DNS-t ellenőrző harmadik promoterrel. Abban az esetben például, ha az első marker DNS herbiciddel szembeni rezisztenciát kódol, egy erős konstitutív második promoter, mint például 353-promoter [Odell és munkatársai: Natúré, 313, 810-821. (1985)], 35S’3-promoter [Hull és Howell: Virology, 86, 482M93. (1987)], a Ti8
HU 214 927 Β plazmid nopalin szintetáz gén („PNOS”) promotere [Herrera-Estrella; Natúré, 303, 209-213. (1983)] vagy az oktopin szintetáz gén („POCS”) promotere [De Greve és munkatársai: J. Mól. Appl. Génét., 7(6), 499-511. (1982)] alkalmazásával az első marker DNS-t a növény összes sejtjében kifejezhetjük.
Ha az első marker DNS egy betegség elleni ellenállóságot biztosító fehéqét kódol, hasznos lehet az első marker DNS kötőszövetben való szelektív kifejezése, amelyet például valamilyen második promoterrel, amely egy TR-promoter, mint például Ti-plazmid TRI’- vagy TR2’-promotere [Velten és munkatársai: EMBO J., 3, 2723-2730. (1984)] végzünk.
Ha az első marker DNS herbiciddel szembeni rezisztenciát kódol, hasznos lehet az első marker DNS zöld szövetben való szelektív kifejezése, amelyet egy második promoter, például a Rubisco kis alegységet kódoló gén promoterének (0242 246 számú európai közrebocsátási irat) alkalmazásával végzünk.
Ha az első marker DNS egy pigmentet kódol, előnyös lehet a második promoter olyan módon való kiválasztása, hogy az első marker DNS kifejezése specifikus sejtekben, mint például sziromsejtekben, levélsejtekben vagy magsejtekben, előnyösen a magház külső rétegében történjen.
A találmány szerinti helyreállító növényben vagy helyreállított növényben lévő idegen DNS-szekvenciába való beépítésre alkalmas szövetspecifikus második promoter azonosítása és izolálása jól ismert eljárásokkal történik. Az ilyen, az első marker DNS-t a második promoter ellenőrzése alatt hordozó növény így könnyen megkülönböztethető. Az eljárás a következőképpen mehet végbe:
1) Keresünk egy olyan mRNS-t, amely csak a növény specifikus szöveteinek, mint például szirmainak, leveleinek vagy magjainak fejlődése alatt van jelen;
2) ezt a szövetspecifikus mRNS-t elválasztjuk;
3) ebből a szövetspecifikus mRNS-ből cDNS-t állítunk elő;
4) ezt a cDNSt- mintaként a növényi genom azon régióinak azonosítására alkalmazzuk, amelyek a szövetspecifikus mRNS-t kódoló DNS-t tartalmazzák; és ezután
5) a növényi genomnak azt a részét azonosítjuk, amely a szövetspecifikus mRNS-t kódoló DNS-től felfelé van, és ennek a DNS-nek a promoterét tartalmazza. Ha a találmány szerinti idegen DNS-szekvencia egynél több első marker DNS-t tartalmaz, az összes első marker DNS egyetlen második promoter irányítása alatt lehet, de előnyösen mindegyik első marker DNS a saját külön második promotere ellenőrzése alatt van. Még előnyösebben minden első marker DNS a saját külön második promotere ellenőrzése alatt van, és egy külön második RNS-t vagy harmadik fehérjét vagy polipeptidet kódol, és így a transzformált növénynek külön megkülönböztető jelleget ad. Az első marker DNS-(ek)nek és második promoter(ek)nek minden esetben szomszédosnak kell lenniük egymással, és találmány szerinti DNS-szekvenciában és bármelyik, a növénysejtek idegen DNS-szekvenciával való transzformálására alkalmazott vektorban lévő egy vagy több termőképesség-helyreállító DNS-sel.
Általában előnyös, ha a termőképesség-helyreállító DNS-sel kódolt első fehéije vagy polipeptid lényegében abban a növényisejt-citoplazmában vagy magban, amelyben a sterilitás DNS kifejezésre kerül, meggátolja a sterilitás DNS-sel kódolt első RNS vagy második fehérje vagy polipeptid aktivitását. Abban az esetben azonban, ha az első fehérje vagy polipeptid és/vagy harmadik fehérje vagy polipeptid citoplazmából a transzformált növény sejtjeinek kloroplasztjába vagy mitokondriumába való szállítása kívánatos, az idegen DNS-szekvencia egy tranzitpeptidet kódoló, további idegen DNS-t is tartalmazhat. Ha az első fehérjét vagy polipeptidet kell szállítani, a további DNS a termőképesség-helyreállító DNS és az első promoter között van, ha pedig a harmadik fehérjét vagy polipeptidet kell szállítani, a további DNS az első marker DNS és a második promoter között van.
A „tranzitpeptid” kifejezés olyan polipeptidfragmensre vonatkozik, amely normálisan a kloroplaszthoz vagy mitokondriális fehérjéhez vagy fehéije alegységhez kapcsolódik, és a sejtben a sejt nukleáris DNS-e által kódolt prekurzor fehéreként termelődik. A tranzitpeptid felelős a nukleárisan kódolt kloroplaszt vagy mitokondriumba való áthelyezési folyamatáért, és az eljárás alatt a tranzitpeptid a kloroplasztból vagy mitokondriális fehérjéből vagy alegységből elválasztódik vagy proteolitikusan eltávolítódik. A találmány szerinti idegen szekvencia egy vagy több ilyen további DNS-t tartalmaz, amelyek egy vagy több első vagy harmadik fehérje vagy polipeptid szállítására alkalmazhatók, mint azt megtaláljuk a 0189707 és 0359617 számú európai közrebocsátási iratban; Van den Broeck és munkatársai: Natúré, 313, 358-363. (1985) és Schatz; Eur. J. ofBioch., 165,1-6. (1987), valamint Bountry és munkatársai: Natúré, 328, 340-342, (1987) irodalmi helyen. A kloroplasztba való szállításra megfelelő tranzitpeptid például a RUBP karboxiláz enzim (0189 707 számú európai közrebocsátási irat) kis alegysége; a mitokondriumba való szállításra alkalmas tranzitpeptid például az Mn-szuperoxid-dizmutáz enzim tranzitpeptidje (0 344 029 számú európai közrebocsátási irat és a későbbiekben ismertetésre kerülő 3. példa).
A találmány szerinti idegen DNS-szekvencia 3’ transzkripciós terminációs szignálját azok közül választjuk ki, amelyek a növénysejtben az mRNS pontos transzkripciós terminációjára és poliadenilezésére képesek. A transzkripciós terminációs szignálok lehetnek az idegen gén vagy DNS természetes szignáljai, vagy lehetnek idegen gén vagy heterológ szignálok. Heterológ transzkripciós terminációs szignálok például az oktopin szintetáz gén szignálok [Gielen és munkatársai: EMBO J., 3, 835-845. (1984)] és a T-DNS-gén 7 szignálok [Velten és Schell: Nucleic Acids Research („NAR”), 73, 6981-6998.(1985)].
A találmány oltalmi köréhez tartozik az az eljárás is, amelyben a találmány szerinti idegen DNS-szekvenciát tartalmazó növényi sejtekből kialakított tenyészetet ho9
HU 214 927 Β mozigóta domináns termőképesség-helyreállító növények regenerálására alkalmazunk úgy, hogy egy haploid sejttenyészeten elvégezzük a szükséges átalakítást [Chuong és Beversdof: Plánt Sci., 39, 219-226. (1985)], majd a kromoszómákat valamilyen jól ismert eljárással, például Colchicin alkalmazásával megduplázzuk; vagy úgy járunk el, hogy egy diploid sejttenyészeten végezzük el a szükséges átalakítást, majd a regenerált növény portokját tenyésztjük, hogy igy olyan haploid utódokat termeljünk, amelyek azután diploiddá alakíthatók vissza [Plánt Tissue and Cell Culture, Plánt Biology, 3, A. R. Liss, Inc. N. Y. (1987)]. Az így átalakított tenyészet mindegyik sejtjének nukleáris genomjában lévő idegen DNS-szekvencia homozigóta formájú lesz.
Ez olyan növényi sejttenyészeteknél előnyös, amelyek első promoter irányítása alatt lévő termőképességhelyreállító DNS-t tartalmaznak; az első promoter irányítja a génkifejezést a következő részek adott fejlődési állapotában:
i) a növény hím ivarsejtjei, mint például pollen, elsősorban a meiózis utáni állapotban, ii) a növény női ivarsejtjei, mint például magkezdemény, elsősorban a meiózis utáni állapotban; vagy iii) a hím vagy női ivarsejtekből, mint példul mag- vagy embriósejtekből származó sejtek; azért, hogy a termőképesség-helyreállító DNS az összes hím vagy női ivarsejtben vagy az ezekből származó növényi sejtben kifejeződjön.
A találmány oltalmi köréhez tartozik a hibrid, termőképességében helyreállított növények által termelt hibridmagok előállítási eljárása is. Az eljárás egyik változatában egy nukleáris hímsteril nőtermő növényt, amely legalább egy harmadik promoter ellenőrzése alatt legalább egy második marker DNS-t tartalmaz, egy olyan homozigóta nukleáris hímsteril helyreállító növénnyel keresztezünk, amely legalább egy első promoter ellenőrzése alatt, de a második marker DNSsel azonos első marker DNS nélkül, legalább egy nukleáris hím-termőképességet helyreállító DNS-t tartalmaz. Ebben az eljárásban a hímsteril és nőtermő növények kialakulása véletlenszerű, és a beporzás után a második marker DNS-sel kódolt szelektálható markert alkalmazunk a termőképesség-helyreállító növények kiválasztására, biztosítva, hogy a magot csak a hímsteril növényekről takarítjuk be. Ez garantálja, hogy az összes betakarított mag hibrid, és ugyanakkor termőképes is. Az eljárás egy másik változatában egy nukleáris hímsteril nőtermő helyreállító növényt, amely egy második promoter ellenőrzése alatt álló nukleáris első marker DNS-t és egy olyan homozigóta nukleáris női termőképesség-helyreállító DNS-t tartalmaz, amely egy első promoter ellenőrzése alatt áll, egy olyan nukleáris hímtermő nősteril helyreállító növénnyel keresztezünk, amely legalább ugyanazt, a második promoter ellenőrzése alatt álló, nukleáris első marker DNS-t és egy első promoter ellenőrzése alatt álló, nukleáris első marker DNS-t és egy első promoter ellenőrzése alatt álló, homozigóta, nukleáris hím termőképesség-helyreállító DNS-t tartalmaz. Mindkét hímsteril és nőtermő szülőnövény lényegében véletlenszerű populációban növeszthető, ezáltal nő a keresztbeporzás lehetősége, nem szükséges pontos ültetési minta, és az első marker DNS-sel kódolt jellemző alkalmazásával 100%-ban a termőképes hibridmagok takaríthatok be. Előnyösen mindkét eljárásban az első marker DNS egy konstitutív második promoter ellenőrzése alatt van, és egy olyan harmadik fehéqét vagy polipeptidet kódol, amely a steril növényt valamely adott herbiciddel szemben ellenállóvá teszi. Ezáltal a nem kívánt genotípusok az adott herbicid alkalmazásával még a keresztbeporzás előtt elpusztíthatok.
A találmány szerinti eljárás során
1) termőképesség-helyreállító növényeket, amelyek a találmány szerint nukleáris genomjukban stabilan integrálódott és domináns alléiként generációkon keresztül átörökíthető termőképesség-helyreállító DNS-t tartalmaznak;
2) olyan hím- vagy nősteril növényekkel keresztezünk, amelyek nukleáris genomjukban stabilan integrálódott és domináns alléiként generációkon keresztül átörökíthető sterilitás DNS-t, előnyösen egy sterilitás DNS-t és egy második marker DNS-t egyaránt tartalmaznak (lásd a 89401 194.9 és 90 402 196.1 számú európai szabadalmi bejelentések). Ez az eljárás a hibridnövények nemesítésére és termesztésére eddig alkalmazott eljárások mellett olyan változatot jelent, amely a jelenlegi eljárásokhoz képest számos előnyt is nyújt:
1. Az olyan növények esetén, amelyek keresztbeporzása nehezen megy végbe, és a hasznos termék a mag, amelynek sokszorozódása kis hatásfokkal megy végbe, mint például a gabonaféléknél (például búzánál, árpánál és zabnál), rizsnél, gyapotnál és számos hüvelyesnél (például szójababnál és borsónál) a találmány szerinti eljárás 100%-ban hibrid, termőképes utód létrehozását teszi lehetővé, ami nagy magképződést és szokásos hozamot eredményez. Hibrid növények előállításakor tipikusan úgy járunk el, hogy hímsteril és nősteril növényeket, valamint egy, ezek előállításának megfelelő helyreállítót alkalmazunk, és a következő lépéseket folytatjuk le (az „FH1” az 1 herbiciddel szembeni rezisztenciához kapcsolódó nősterilitást, az „RF” a nősterilitás-helyreállítót, „MlHl” az 1 herbiciddel szembeni rezisztenciához kapcsolódó 1 hímsterilitást, „M2H2” a 2 herbiciddel szembeni rezisztenciához kapcsolódó 2 hímsterilitást, „RM1” az 1 hímsterilitás-helyreállítót, „A” a női szülővonalat és „B” a hím szülővonalat jelzi):
A „A” női szülőnövény kialakítása lAa)Egy A növényt egy olyan, találmány szerinti termőképesség-helyreállító DNS-sel transzformálunk, amely egy első fehérjét vagy polipeptidet kódol (amely a hím szülőben specifikusan a nősterelitás DNS kifejezésének termékét semlegesíti), és annak az első promotemek az irányítása alatt van, amely a génkifejezést legalább ugyanazokban a sejtekben irányítja,
HU 214 927 Β amelyekben a hím növényben a női sterilitás DNS kifejezésre kerül. így A™keletkezik.
lAb)Az ARF/rf önbeporzásával 25% ARF/RF növény keletkezik.
lAc)Az ARF/RFt kimér DNS-szekvenciával transzformáljuk, amely egy hímvszerv-specifíkus promoter ellenőrzése alatt lévő „1 hímsterilitás DNS”-t, valamint egy 1 herbiciddel szembeni rezisztenciát biztosító marker DNS-t tartalmaz. így ARR^NiHi/mh hímsteril növény keletkezik.
lAd)A hímsteril növényt az AR''F/RF:MIHI/rnh x y\RF/RF;tnh/mh keresztezéssel elszaporítjuk; és így következő összetételű utódot kapunk:
- 50% ARF/RFNiHi/mh; i hímsteril, herbicidrezisztens;
- 50% ARF/RF’mh/mh: hímtermő, herbicidérzékeny.
Ebben a keverékben a női szülő tulajdonságai az egymást követő generációkban fokozódnak, és az 1 herbicidet alkalmazva váltakozó sorokban vagy sorblokkokban létrehozzuk a tiszta női szülőtörzset. A herbiciddel nem kezelt sorokat vagy sorblokkokat pollenforrásként alkalmazzuk. A következő generáció létrehozásához csak a herbiciddel kezelt sorok vagy sorblokkok magjait takarítjuk be.
Β „ B ” hím szülőnövény kialakítása
A „B” gazdaságos előállításához a nősteril szülővonal két különböző sterilitás DNS alkalmazását igényli. Az első egy olyan promoter ellenőrzése alatt álló nősterilitás DNS, amely a gén kifejezését szelektíven a növény nőszervének sejtjeiben irányítja, és az 1 herbiciddel szembeni rezisztenciát biztosító marker DNS-hez kapcsolódik. A második egy olyan promoter ellenőrzése alatt álló hímsterilitás DNS (amely nem azonos az 1 hímsterilitás DNS-sel, és „2 hímsterilitás DNS”-nek nevezzük), amely a gén kifejezését szelektíven a növény hímszervének sejtjeiben irányítja, és a 2 herbiciddel szembeni második marker DNS-hez kapcsolódik.
lBa) A „B” növényt egy találmány szerinti idegen DNS-szekvenciával transzformáljuk, amely egy olyan első fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely specifikusan a női szülőben kifejezett 1 hímsterilitás DNS aktivitását semlegesíti, és egy olyan első promoter ellenőrzése alatt van, amely a kifejeződést legalább ugyanabban a hímszervsejtekben irányítja, amelyben az 1 hímsterilitás DNS a nőszülő növényben kifejezésre kerül. így BRMI/nn keletkezik.
lBb)A BRMI/mi önbeporzásával 25% Brmi/rmi keletkezik.
lBc) (1) A BRM1/BMI-t egy kimér DNS-szekvenciával transzformáljuk, amely a gén kifejezését szelektíven a növény nőszervének sejtjeiben irányító promoter irányítása alatt lévő nősterilitás DNS-t és egy 1 herbiciddel szembeni rezisztenciát biztosító marker DNS-t tartalmaz. így a BRM1/RM';FHi/fh nősteril növény keletkezik.
(2) A B^/RMi-t egy kimér DNS-szekvenciával transzormáljuk, amely egy hímszerv-specifikus promoter irányítása alatt lévő 2 hímsterilítás DNS-t és egy 2 herbiciddel szembeni rezisztenciát biztosító marker DNS-t tartalmaz. így a BRM1/RMI;M2H2/mh hímsteril növény keletkezik.
lBd)(l) A fenti lBc) (2) hímsteril növényt a BRMi/RMi;M2H2/mh x BRM1/RM1;mh/mh keresztezéssel sokszorozzuk, és így a következő összetételű utódokat kapjuk:
- 50% BRMF™FM2H2/mh; hímsteril, herbicid rezisztens;
- 50% BRMi/RMhmh/mh; hímtermő, herbicid érzékeny.
(2) A fenti lBc) (1) nősteril növényt a BRMl/RMl;M2H2/mh;fli/fh χ BRM1/RMFmh/m|FFHI/fh keresztezéssel sokszorozzuk úgy, hogy külön sorokba ültetjük.
így a hímsteril sorokban a következő genotípusokat kapjuk:
25% BRM1/RMFM2H2/mh;FH1/fl>: steril, 1 és 2 herbiciddel szemben rezisztens,
25% B^'/RMhmh/mnTHi/fh; nősteril, 1 herbiciddel szemben rezisztens,
25% BRMi«Mi:M2H2/mh;ft1/n1; hímsteril, 2 herbiciddel szemben rezisztens,
25% BRM1/RM1>mh/mh;fh/fh: termő és herbicidre érzékeny.
lBe)Ezt a keveréket hímszülőként BRM1/RM1 ;mh/mh;FHl/fh további sokszorozó keresztezésre alkalmazhatjuk, amelyben a generációk mindegyikét 1 herbiciddel permetezzük, és így a nőtermő növények eltűnésével a hím szülővonalat tartjuk fenn. Ezt a keveréket a fenti lBd(l) keverékkel váltakozó sorokba vagy sorblokkokba ültetjük.
Az lBd(l) keveréket a hímsteril növények eltüntetésére 1 herbiciddel kezeljük. Az lBd(2) keveréket is elültethetjük önmagában és váltakozó sorokban 1 vagy 2 herbiciddel kezelhetjük. Ilyen körülmények között nem szükséges az lBd(l) lépés lefolytatása.
C „AB ” hibridmag előállítása
Az 1 Ad) és lBe) keverékeket véletlenszerűen elvetjük. Az összes nem kívánt genotípus kiküszöbölésére a keresztbeporzás előtt 1 herbiciddel permetezést végzünk. A keresztbeporzás a következők szerint megy végbe:
^RF/RF.nn/rm.MlHl/mhJli/fli x BRMl/RMl;rf/rf;mh/mh;RHl/fh így a következő 100% termő hibridmagot tartalmazó genotípusokat kapjuk:
25% ABRF/rf;M1H1/mh;im/RM1;FH1/fh,
25% ABRF/rf;M1H1/mh'im/RM1;fh/fh,
25%
25% ABRR/rf-mL'mh;nn/RMl ;fh/fh.
HU 214 927 Β
2. A létrehozott növény speciális tulajdonságaitól függően a fentiekben ismertetett stratégia egyszerűsíthető. Ilyen speciális tulajdonságok:
(2.1) Ha a növény keresztbeporzása rovarok segítségével jól végbemegy, a keverék B szülővonal komponensének relatív mennyisége a terméshozam csökkenése nélkül csökkenthető. Ilyen növények például a gyapot, hüvelyesek, mint például borsó, lucerna, olajrepce és kukorica. Alkalmazhatunk egy sokkal egyszerűbb nemesítési eljárást is. Az ebben alkalmazott női szülőt hímsterillé és herbiciddel szemben rezisztenssé tesszük, és a hímszülő hordozza a hímsterilitásra vonatkozó termőképesség-helyreállító gént. így az eljárás a következő stratégia szerint folytatható:
Keresztezés: AMH/mh χ brm/rm, véletlenszerű vagy nem egyszerre virágzó növényeknél soros vetéssel.
Véletlenszerű vetésnél herbicides kezelést alkalmazunk a beporzás után.
Hozam: 50% ABMH/mh+M/™ és
50% ABmh/mh;RM/rm, amely 100% termőképes hibrid utódokból áll.
(2.2) Ha az F2 utód kereskedelmi magtermék, (például gyapot) a következő stratégiaváltozat szerint járhatunk el:
a) Az „A” szülővonal hímsteril növényeinek transzformálásával AM/m;r/r-t hozunk létre.
b) Két független transzformációs lépéssel termőképesség-helyreállító növényeket alakítunk ki úgy, hogy saját nukleáris genomjuk két független genetikai helyére bevisszük a termőké10 pesség-helyreállító gént, amelynek terméke specifikusan az a) hímsteril növényben lévő hímsterilitás-gén aktivitását semlegesíti, és önbeporzással mindkét helyreállító gént homozigóta formában állítjuk elő.
így Bm/m:R1/R1-R2/R2 keletkezik.
c) Az AM/'n:r,'r x Bm/m;Ri/Ri;R2/R2 keresztezéssel 50% ABM/m;RI/r-R2ír és 50% ABm/m;R1/r;R2/r képződik, amely 100% hibrid termőképes utódot alkot.
d) A c) pont szerinti keveréket önbeporzásnak vetjük alá. A kapott utódok felére vonatkozó,
1. táblázatban összefoglalt eredményekből láthatjuk, hogy az összesen 64 növényből csak egy hímsteril (a táblázatban *-gal jelölt), az összes többi termő. Ez az eredmény azt mutatja, hogy az eljárás gazdasági jelentőségű.
1. táblázat
AB\AB SR1R2 sRlr2 srlR2 srlr2
SR1R2 SR1R2/SR1R2 sRlr2/SRlR2 srlR2/SRlR2 srír2/SRlR2 SRlr2 sRlR2/SrlR2 sRlr2/SRlr2 srlR2/SRlr2 srlr2/SRlr2 SrlR2 sRlR2/SrlR2 sRlr2/SrlR2 srlR2/SrlR2 srlr2/SrlR2 Srlr2 sRlR2/Srlr2 sRlr2/Srlr2 srlR2/Srlr2 srlr2/Srlr2*
SR1R2 SR1R2/SR1R2 sRlr2/sRlR2 srlR2/sRlR2 srlr2/sRlR2 sRlr2 sRlR2/sRlr2 sRlr2/sRlr2 srlR2/sRlr2 srlr2/sRlr2 srlR2 sRlR2/srlR2 sRlr2/srlR2 srlR2/srlR2 srlr2/srlR2 srlr2 sR!R2/srlr2 sRlr2/srlr2 srlR2/srlr2 srlr2/srlr2 (2.3) Ha a 2 hímsterilitás DNS a 2 herbiciddel szembeni rezisztenciát kódoló marker DNS-től eltérő marker DNS-hez kapcsoljuk, például egy 50 szín-génhez, a fenti hímsterilitás DNS-t hordozó növények a többi növény károsítása nélkül megszüntethetők. A 2 hímsterilitás DNS bármilyen, szelektálható marker DNS nélkül is bejuttatható. A 2 hímsterilitás DNS-t hordozó 55 növények megszüntetése a kis mennyiségben végezhető kézi szelekcióval történhet (lásd a fenti lBd pontot).
(2.4) Ha a transzformálandó szülőnövény szövete haploid anyagot tartalmaz, ez jelentősen csők- 60 kenti a következő megtermékenyítést, és a sterilitást kódoló domináns géneket homozigóta formában eredményezi.
(2.5) Ha a mag értéke vagy a kézi munka költsége legalább a hibridtermelés utolsó fázisáig lehetővé teszi a nem kívánt genotípusok kézi megszüntetését, az általános eljárás egyszerűsíthető.
3. A nemesítési stratégia egy másik példája, amelyben a hím- és nősterilitás találmány szerinti termőképesség-helyreállító rendszerrel kombináljuk, a következő lépcsőkből áll:
HU 214 927 Β
A ,,Α ” női szülővonal kialakítása
Aa) „A” vonalat transzformálunk egy idegen DNSszekvenciával, amely egy olyan találmány szerinti termőképesség-helyreállító DNS-t tartalmaz, amely egy, specifikusan a hímszülőben kifejezett nősterilitás DNS termék aktivitását semlegesítő első fehérjét vagy polipeptidet kódol; egy olyan első promoter ellenőrzése alatt van, amely a termőképesség-helyreállító DNS kifejezését legalább ugyanabban a női szervsejtekben irányítja, amelyekben a hímszülő nősterilitás DNS-e kifejezésre kerül; és a 2 herbiciddel szembeni rezisztenciát kódoló első marker DNS-sel szomszédos. így ARFH2/rfh keletkezik. Ezzel párhuzamosan, az „A” vonalat egy olyan DNS-szekvenciával is transzformáljuk, amely egy olyan hímsterilitás DNS-t tartalmaz, amely egy hímszerv-specifikus promoter ellenőrzése alatt van; és egy olyan második marker DNS-sel szomszédos, amely az első marker DNS által kódolt herbicid rezisztenciától eltérő herbiciddel szembeni rezisztenciát (azaz 1 herbiciddel szembeni rezisztenciát) kódol. így AMHI/mh képződik.
Ab) Az ARFil2/rfl1 χ AMH1/mh keresztezéssel 25% ARFH2/rfl’iMHI/mh,
25% A^^21/rfh;mh/mh 25%
25% Arfh/rfl,;mh/mh képződik.
és 2 herbiciddel végzett permetezéssel ARFH2/rfh;MHl/mh_t választunk ki.
3Ac) ARFFI2/rfh χ ARFH2/rfh önbeporzásával olyan 25% ARFÍI2/RFH2 képződik, amely önbeporzással fenntartható.
3Ad)ARFH2/RFH2;mh/mh χ ARFH2/rfh;MHl/mh keresztézéssel
25% ARFH2/RFH2;MH1/mh,
25% ARFH2/RFH2;mh/mh,
25% ARFH2/rfli;MH1/mh,
25% ARFH2/rfli;mh/mh képződik, és így a homozigóta formájú termőképesség-helyreállító DNS-t tartalmazó hímsteril növények 1 herbiciddel végzett permetezéssel és az A szülővonallal való kísérleti keresztezéssel kiválaszthatók.
3Ae)Az A szülővonalat ARHF27RFH2;MH17mh x ARrH2,'RFH2;mh/mh keresztezéssel fenntarthatjuk.
3B „B” szülővonal kialakítása
3Ba) „B” vonalat transzformálunk egy idegen DNSszekvenciával, amely egy olyan, találmány szerinti termőképesség-helyreállító DNS-t tartalmaz, amely egy specifikusan a nőszülőkön kifejezett hímsterilitás DNS termék aktivitását semlegesítő első RNS-t, fehérjét vagy polipeptidet kódol; egy olyan első promoter ellenőrzése alatt van, amely a termőképességhelyreállító DNS kifejezését legalább ugyanabban a hím szervsejtekben irányítja, amelyekben a hímsterilitás DNS kifejezésre kerül; és a herbiciddel szembeni rezisztenciát kódoló első marker DNS-sel szomszédos. így BRM2/rmh képződik. Ezzel párhuzamosan a „B” vonalat egy olyan DNS-szekvenciával is transzformáljuk, amely egy olyan nősterilitás DNS-t tartalmaz, amely egy nőszerv-specifikus promoter ellenőrzése alatt áll; és egy olyan második marker DNS-sel szomszédos, amely 1 herbiciddel szembeni rezisztenciát kódol, így BFH1/fll képződik.
3Bb)BRMH2/rmh;fh/fh χ B™1’71™1*;™1711' keresztezéssel 25% BRMH2/rmlRFH1/fh,
25% BRMH2/rmh;fh/fh 25% βΗηΚ'ππΗΤΉΙ/ί'Η,
25% Brmll/r,Ill’;fl’7f1’ képződik.
és 2 herbiciddel végzett permetezéssel BRMH2/nnh;FHl/fh-t izolálunk.
3Bc) BRMH2/n,lh χ BRM[[2;rmh önbeporzásával 25% BRMH2/RMH2 képződik, amely önbeporzással fenntartható.
3Bd) BRMFI27RMH2 x BRMH2/rail+RH1/fll keresztezéssel 25% βΚΜΗ2®1*1112;™1^,
25% BRMH2/RMI12;fll7fh,
25% BRMH2/nnh;FH 1/111,
25% BRM1I2/nnh;,ll/fh képződik, és így 1 herbiciddel végzett permetezéssel és a B szülővonallal való kísérleti keresztezés! homozigóta formájú termőképesség-helyreállító DNS-t tartalmazó nősteril növényeket választhatunk ki.
3Be)A B szülővonalat BRMH27RMFI2;lll7fh x BRMH2/RMH2;FHi/fh keresztezéssel fenntartjuk.
3C Hím vagy női szülőnövények kialakításának alternatív eljárása (az A vagy B növényeket egyaránt C-vel jelöljük)
3Ca)„C” vonalat transzformáltunk egy idegen DNS-szekvenciával, amely egy olyan találmány szerinti termőképesség-helyreállító DNS-t tartalmaz, amely egy specifikusan a másik növényben kifejezett sterilitás DNS termék aktivitását semlegesítő első fehérjét vagy polipeptidet kódol; egy olyan első promoter irányítása alatt van, amely a termőképességhelyreállító DNS kifejezését legalább azokban a sejtekben irányítja, amelyekben a sterilitás DNS kifejezésre kerül; és a 2 herbiciddel szembeni rezisztenciát kódoló első marker DNS-sel szomszédos.
így CRH2/rh képződik.
Cb)CRH2/rh χ CRll2/rh önbeporzásával olyan 25% CRH2/RH2_t állítunk elő, amely önbeporzással fenntartható.
3Cc) A Ο012713112-! egy DNS-szekvenciával transzformáljuk, amely olyan sterilitás DNS-t tartalmaz, amely egy hím vagy női szerv-specifikus promoter irányítása alá esik, és szomszédos az 1 herbiciddel szembeni rezisztenciát kódoló második marker DNS-sel. Ez CRH2/RH2;SHi/sh_t eredményez (ahol S a hím- vagy nősterilitást jelöli).
HU 214 927 Β
3Cd) A C vonalat CRH2/RH2;SHi/sh x cRH2/RH2;sh/sh keresztezéssel fenntartjuk.
3D A „B” hibridmag előállítása
A 3Ae) és 3Be) vagy 3Cd) lépésekben kapott keverékeket véletlenszerűen elvetjük. Az összes nem kívánt genotípus kiküszöbölésére a keresztbeporzás előtt 1 és 2 herbiciddel permetezést végzünk.
A keresztbeporzás a következő keresztezéseket adja:
y\RFH2/RFII2;nn/nn;MII 1 /fh/fh
BRMH2/RMH2;r£'rf;FHl/fh;mh/mh így a következő 100% termőképes hibridmagot tartalmazó utódokat kapjuk:
25% ABRFH2/rf;RMH2/rm:MH1/mh;FH1/fh 25% ABRFH2/rf;RMH2/nn;MH1/mh;fh/fh,
25% ABR['fI2/rí;RMH2/rm>mll/mlRFII1,'fh,
25% AB^^2/rf;RMH2/nn;mh/mh;fb/fh<
4. A találmány szerinti termőképesség-helyreállító rendszer, a 0 344029 és 0412 006 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett hím- vagy nősterilitás-rendszerekkel kombinálva, a hasonló korábbi rendszerekhez viszonyítva a következő, további előnyökkel jár:
a) Üzembiztos termelési rendszer, amely a minőségellenőrzés érdekében számos jól megkülönböztethető és elválasztható markert tartalmaz.
b) A kész mag sokszorosításának bonyolultsága jelentős mértékben csökken, ami a megbízható termelés és a termelési költségek csökkentése szempontjából lényeges.
c) A kereskedelmi hibrid mag előállítási ideje csökken.
A következő példákat a találmány részletesebb bemutatására ismertetjük.
A példák illusztrálására bemutatott ábrák rövid ismertetése:
Az 1. ábrán az 1. példában alkalmazott pTVE74 vektor térképét mutatjuk be.
A 2. ábrán az 1. példában alkalmazott barstar gén DNS-szekvenciáját mutatjuk be, amelynek Cial helyén a megváltozott szekvencia látható.
A 3. ábrán a 3. példában alkalmazott pTVE73 vektor térképét mutatjuk be.
A 4. ábrán a 3. példában alkalmazott pTVE76 vektor téképét mutatjuk be.
A példákban, kivéve, ha másként ismertetjük, a rekombináns DNS előállítását és sokszorosítását Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) irodalmi helyen ismertetett, szabványosított eljárásokkal végezzük.
A példákban alkalmazott plazmidok és vektorok, amelyek a Budapesti Szerződés feltételei szerint a Német Szövetségi Köztársaság Deutsche Sammlung fiir Mikroorganismen und Zellculturen („DSM”), Mascheroder Weg IB, D-330 Braunschweig letéti helyén vannak, a következők:
Plazmid vagy vektor DSM-katalógus- szám Dátum
pMB3 4470 1988.03.21.
pGSC1700 4469 1988.03.21.
pGV2260 2799 1983. december
1. példa
PTA29 kimér DNS-szekvencia és barstar gén szerkesztése
Az 1. ábrán bemutatott, „pTVE74” nevű plazmidot szerkesztünk a következő, jól ismert DNS-fragmensek PTA29-promoterrel való összekapcsolásával:
1. Egy vektor-fragmens, amely T DNS határszekvenciákat tartalmaz, és olyan pGSC 1700-ból [Comelissen és Wanderwiele: NAR, 77(1), 19-21. (1989)] származik, amelyben a β-laktamáz gén ki van törölve; a határszekvenciák között a következő
2. és 3. pontok szerinti DNS-fragmensek helyezkednek el.
2. Egy kimér-szekvencia, amely a 0 344 029 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett PTA29promoter kazettát tartalmazza, az ATG iniciátor kodonnál egy barstar-t kódoló Bacillus amyloliquefaciens génnel van fuzionálva; a barstar a barnáz nevű extracelluláris ribonukleáz sejtinhibitora [Hartley és munkatársai: Preparative Biochemistry, 2(3) 243-250. (1972); Hartley és Smeaton: J. Bioi. Chem., 245(16), 5624-5626. (1973)], amellyel a következő lépéseket hajtjuk végre:
a) Az első ATG kodontól felfelé lévő 7-10 helyzetben lévő GCAC nukleotid-szekvenciát ATCG-szekvenciára változtatjuk, és így a kódoló szekvencia első metionin kodonjánál megfelelő Cial klónozó helyet alakítunk ki (2. ábra); ezt helyspecifikus mutációval végezzük (0319 353 számú európai közrebocsátási irat), és pMc5-TPBCS-t kapunk. A Cial kiálló végeket Sí enzimmel emésztjük, és a barstar gént a 330 nukleotidot tartalmazó Clal-HindlII fragmensként izoláljuk (2. ábra).
b) A pMc5-TPBSC Sl-kezelt Clal-HindlII fragmensét a pMB3 Sl-kezelt NcoI-HindlII fragmensével (0 344 029 számú európai közrebocsátási irat) és egy olyan restrikciós fragmenssel egyesítjük, amely a transzkripciós terminációhoz és poliadenilezéshez a napalinszinteáz („NOS”) gén 3’-végét [An és munkatársai: EMBO J„ 4(2), 277 (1985)] tartalmazza.
3. Egy olyan kimér-szekvencia, amely egy Arabidopsis Rubisco SSU-promotert („PSSU” vagy „PSSUARA”), egy kanamicin rezisztenciát kódoló neogént (0 242 246 számú európai közrebocsátási irat) és az oktopin szintáz („OSC”) gén 3’-végi szignáljait [Dhaese és munkatársai: EMBO J., 2, 419, (1987)] tartalmazza.
HU 214 927 Β
A pTVE74 egy olyan bináris típusú T DNS vektor, amely a T DNS-határszekvenciák között a következő három kimér-szekvenciát tartalmazza: PNOS-neo-t és PSSU-sfrt-t, amelyek a saját második promoterük ellenőrzése alatt első marker DNS-eket tartalmaznak; és a PTA29-barstar-t, amelyben a barstar egy olyan termőképesség-helyreállító DNS, amelynek a tapétum-specifikus PTA29 első promoter ellenőrzése alatt, egy egyébként hímsteril növény tapétumsejtjeiben való kifejezése semlegesíti a tapétum-specifikus sterilitáspromoter ellenőrzése alatt a sterilitás DNS által kódolt bamáz aktivitását (0344 029 számú európai közrebocsátási irat).
2. példa
Az 1. példa szerinti kimér-szekvencia dohányvagy olajrepce növényekbe való beépítése Rekombináns Agrobacterium törzseket szerkesztünk az 1. példa szerinti E. coli PTVE74 pMP90-t tartalmazó Agrobacterium tumefaciens C58C1 Rifr-be való mobilizálásával [Koncz és Schell: Mól. Gén. Genetics, 204, 383-396. (1986)]. Az így kapott pMP90-t és PTVE74-et befogadó Agrobacterium törzset dohánylevél (N. tabacum Petite Havane, SRI) vagy olajrepce (Brassica napus) transzformálására alkalmazzuk. A dohánylevél transzformálását szabványos, például a 0 242 246 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett eljárással, az olajrepce transzformálását pedig Lloyd és munkatársai: Science, 234, 464-466. (1986) és Klimaszwesko és munkatársai: Plánt Cell Tissue Organ Culture, 4,183-197. (1985) irodalmi közleményekben ismertetett eljárással végezzük. Az Agrobacterium törzsek fertőzés utáni elpusztítására karbenicillint alkalmazunk.
A transzformált kalluszt 100 pg/ml kanamicin-tartalmú anyagon elválasztjuk, és a rezisztens kalluszt ismét növénnyé növesztjük. A szár és a gyökér megjelenése után a transzformánsokat üvegházba helyezzük, és azok teljesen természetes morfológiát mutatnak. A virágok pollenjét a sterilitás DNS-ként a 0344029 számú európai közrebocsátási irat 13. példájában ismertetett, tapétum-sejtekre specifikus PTA29 sterilitás-promoter ellenőrzése alatt lévő bamáz gént tartalmazó nukleáris hímsteril dohány- és olajrepce növények beporzására alkalmazzuk. Az így kapott hímsteril növények utódainak elemzése azt mutatja, hogy virágjaik 75%-a nem mutat hímsterilitás-fenotípust (azaz a virágjaik porzószálában nem hiányzik a normális tapétumréteg).
3. példa
PTA29 kimér DNS-szekvencia és EcoRI metiláz gén szerkesztése
A 3. ábrán bemutatott, „PTVE73” nevű plazmidot a következő, jól ismert fragmensek PTA29-promoterrel való összekapcsolásával állítjuk elő:
1) egy vektorfragmens, amely T DNS-határszekvenciákat tartalmaz, és az 1. példában ismertetett pGSC 1700-ból származik; a határszekvenciák között a következő 2-4. pontok szerinti DNSfragmensek helyezkednek el;
2) az 1. példa 3. pontja szerinti kimér-szekvencia, mely a neogén és az ocsgén 3’-vég kifejezését ellenőrző pSSU promotert tartalmazza;
3) egy kimér-szekvencia, amely tartalmazza a nopaline-szintetáz promotert („DNOS”) (0 242246 számú európai közrebocsátási irat), a higromicin rezisztenciát biztosító hph-gént [Van den Elzen és munkatársai: Plánt Molecular Biology, 5, 299-302. (1985)], és a NOS gén 3’-végét (1. példa); és
4) egy kimér-szekvencia, amely az EcoRI metilázgénnel keretben összeépült [Botterman és Zabeau: Gene, 37, 229-239. (1985)], 1. példa szerinti PTA29-promoter kazettát tartalmazza, amelynek kifejezett terméke semlegesíti az EcoRI restrikciós endonukleáz enzimet, amely a kettősszálú DNS-t a GAATTC helyen hasítja [Wilson; TIG, 4(11), 314-318 (1988)], amelyekkel elvégezzük a következő lépéseket:
a) pEcoR4-ből származó BglII-HindlIIfragmenst (Botterman és Zabeau, 1985), amely az EcoRI metiláz kódoló szekvenciáját tartalmazza, pMa5-8-ba (0319 353 számú európai közrebocsátási irat) klónozzuk; helyspecifikus mutációval a metiláz kódoló szekvencia N-termináljánál egy Fspl helyet ültetünk be:
TTA, ATG, GCT, AGA, AAT TGC, GCA Fspl
b) a pMB3-promoter fragmenst feltöltött Ncol helyén az Fspl tompa véghez ligáljuk, és így
PTA29 _ cc ATG, GCA, ...
metRI terméket kapunk, és ezt az 1. példa szerinti NOS gén 3’-véggel összeépítjük.
A pTVE73 egy olyan, bináris típusú T DNS vektor, amely a T DNS-határszekvenciák között a következő három kimér-szekvenciát tartalmazza:
PSSU-neo-t és pNOS-hph-t, amelyek saját második promoterük ellenőrzése alatt lévő első marker DNS-ek; és a PTA29-EcoRI metilázgént, amely a tapétum-specifikus PTA29 első promoter ellenőrzése alatt lévő termőképesség-helyreállító DNS.
A termőképesség-helyreállító DNS a PTA29promoter ellenőrzése alatt, egy egyébként hímsteril növény tapétum-sejtjeiben lejátszódó kifejezeése semlegesíti a tapétum-specifikus sterilitás-promoter ellenőrzése alatt lévő, sterilitás DNS által kódolt EcoRI sejtek aktivitását, amint azt a 0344 029 számú európai közrebocsátási irat ismerteti.
A 4. ábrán bemutatott „pTVE76” nevű plazmidot a következő jól ismert fragmensek PTA29-promoterrel való összekapcsolásával állítjuk elő:
1) egy vektor-fragmens, amely T DNS-határszekvenciákat tartalmaz, és olyan pGSC 1700-ból [Comelissen és Wanderwiele: NAR, 7 7(1), 19-21. (1989)] származik, amelyben a β-laktamáz gén ki van törölve; a határszekvenciák között a következők
HU 214 927 Β
2-4. pontok szerinti DNS-fragmensek helyezkednek el;
2) Az 1. példa 3. pontja szerinti kimér-szekvencia, amely tartalmazza a pSSU-promotert, a neogént és az OSC-gén 3’-végét;
3) egy kimér-szekvencia, amely tartalmazza a PNOSpromotert, a hph-gént és a NOS-gén 3 ’-végét; és
4) egy kimér-szekvencia, amely az Mn-szuperoxiddizmutáz („Mn-SOD”) tranzitpeptidet („TP”) [Bowler és munkatársai: EMBO J., 8, 31-38. (1989)] kódoló génfragmenssel keretben összeépült, 1. példa szerinti pTA29-promoterkazettát tartalmazza; a tranzitpeptidben, a fragmens klónozási célú elválasztására helyspecifikus mutációval a 0319 353 számú európai közrebocsátási irat szerint a következő módosításokat kell elvégezni:
i) az AA nukleotidokat, amelyek az ATG kezdő kodon -2 és -1 helyzetétől felfelé helyezkednek el, CC nukleotidokká változtatjuk úgy, hogy a kezdő kodonnál egy Ncol helyet alakítunk ki, és így a
- CCATGGCACTAC Ncol nukleotid-szekvenciát kapjuk;
ii) a tranzitpeptid feldolgozási helye melett elhelyezkedő CTTG nukleotidokat GGTAC-re változtatjuk úgy, hogy a feldolgozási helyen egy Knpl helyet alakítunk ki, és így
G |L Q T F CTC, CGC, GGC, I TTG, CAG, ACC, TTT,
S L
TCG, CTC
CTC, CGC, GGG, I GTA, CAG, ACC, TTC... \Kpnl V nukleotid-szekvenciákat kapunk, amelyekben a nyíl a tranzitpeptid-szekvencia feldolgozási helyét jelzi, és a felső vonal az Mn-SOD kódoló szekvenciának megfelelő aminosav-szekvenciát mutatja; a KpnI Klenow DNS polimerázzal való kezelése után az Ncol-Kpnlfragmentet a pTVE73 szekeresztésénél alkalmazotthoz hasonlóan keretben egyesítjük az EcoRI metiláz kódoló szekvencia tompa Fspl N-termináljával, és az 1. példa szerinti NOSgén 3’-véggel egyesítjük.
A pTVE76 egy olyan, bináris típusú T DNS vektor, amely a T DNS-határszekvenciák között a következő három kimér-szekvenciát tartalmazza:
PSSU-neo-t és pNOS-hph-t, amelyek saját második promoterük ellenőrzése alatt lévő első marker DNS-ek, és a PTA29-EcoRI metilázgént, amely a PTA29 első promoter ellenőrzése alatt lévő termőképesség-helyreállító DNS.
Az Mn-SOD tranzitpeptiddel egybeépült EcoRI metiláz egy egyébként hímsteril növény tapétumsejtjeiben való kifejezése, valamint a tapétumfehéqe ezeknek a sejteknek a mitokondriumába való irányítása semlegesíti a tranzitpeptiddel egybeépült és a tapétum-specifikus promoter ellenőrzése alatt lévő, megfelelő sterilitás DNS-sel kódolt EcoRI aktivitását, amint azt a 0 344029 számú európai közrebocsátási irat ismerteti.
4. példa
A 3. példa szerinti kimér DNS-szekvenciák dohány- és olajrepce növényekbe való beépítése Rekombináns Agrobacterium törzseket szerkesztünk a 3. példa szerinti E. coli pTVE73 és pTVE76 pMP90-t tartalmazó Agrobacterium C58C1 Rif-be való mobilizálásával [Koncz és Schell: Mól. Gén. Genetics, 204, 383-396. (1986)]. Az így kapott, pMP90-t és pTVE73-, illetve pMP90-t és pTVE76-t befogadó törzseket a 2. példában ismertetett eljárásokkal dohány levéllemez és olajrepce transzformálására alkalmazzunk. A transzformált kalluszt és rügyeket 100 pg/ml kanamicint tartalmazó anyagon elválasztjuk.
A transzformált rügyeket gyökereztetjük, üvegházi talajba ültetjük, és virágzásig neveljük. Az így kapott dohány és olaj repce természetes morfológiát mutatnak. A virágok pollenjeit a 0344 029 számú európai közrebocsátási irat 1. példájában ismertetett pTVEG3, illetve pTVE62 vektorokkal való transzformálással kapott nukleáris hímsteril dohány, illetve olajrepce porzására alkalmazzuk. A vektorokban az EcoRI gén egy, a PTA29 sterilitás-promoter ellenőrzése alatt lévő sterilitás DNS, a pTVEG2 vektorban lévő EcoRI gén az MnSOD tranzitpeptidet kódoló DNS-sel is egybeépül. Az így kapott steril növények utódainak elemzése azt mutatja, hogy virágjainak 75%-a nem hímsteril fenotípus (azaz virágjainak porzószálából nem hiányzik a normális tapétumréteg).
A találmány nem korlátozódik semmilyen speciális növény transzformálására. A találmány oltalmi köréhez tartozik minden olyan növény, amelynek nukleáris genomja egy olyan első promoter ellenőrzése alatt lévő termőképesség-helyreállító DNS-sel transzformálható, amely a termőképesség-helyreállító DNS kifejezését legalább a növény virágjainak, magjainak és/vagy embrióinak sejtjeiben vagy ezek legalább egy hím- vagy nőszervében szelektíven irányítja, és így a növény önbeporzásra és keresztbeporzásra egyaránt képes. A találmány oltalmi köréhez tartoznak például a következő növények: kukorica, olajrepce, búza, rizs, napraforgó, cukorrépa, paradicsom, uborka, bors, cirok, szójabab, borsó, lucerna, fufélék, lóherék, répa, káposztafélék, póréhagyma, hagyma, dohány, petúnia, kakaó és citrusfélék.
A találmány nem korlátozódik a fentiekben ismertetett példákban bemutatott specifikus plazmidokra és vektorokra sem; oltalmi köréhez tartozik minden olyan plazmid és vektor, amely az első promoter ellenőrzése alatt lévő termőképesség-helyreállító DNS-t tartalmazza.
A találmány nem korlátozódik a fenti példákban ismertetett specifikus első promoterekre, mint például PTA29 promoterre sem; oltalmi köréhez tartozik minden olyan első promotert kódoló DNS-szekvencia, amely legalább azokban a növényi virág-, mag- vagy embriósejtekben a termőképesség-helyreállító DNS kifejezésének irányítására képes, amelyekben különben a
HU 214 927 Β sterilitás DNS kifejezése a növényt hím- vagy nősterillé teszi. Ilyen vonatkozásban a találmány szerinti első promoterek köréhez tartoznak a 0 344 029 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett promoterek, amelyek a sterilitás DNS-nek a hímsterilezendő növények porzószál sejtjeiben való szelektív kifejezésére szolgálnak; valamint a 0412 006 számú európai közrebocsátási iratban ismertetett promoterek, amelyek a sterilitás DNS-nek a nősterilezendő növények virág-, mag- vagy embriósejtjeiben való szelektív kifejezésére szolgálnak. Első promoterként egy növényi konstitutív promótert is alkalmazhatunk, azzal a feltétellel, hogy az első RNS, fehérje vagy polipeptid nem zavaqa jelentős mértékben azoknak a sejteknek a működését, anyagcseréjét vagy fejlődését, amelyekben a sterilitás DNS hiányában expresszálódnak.
A találmány nem korlátozódik a fenti példákban ismertetett specifikus termőképesség-helyreállító DNS-re sem; oltalmi köréhez tartozik minden olyan első RNS-t, fehérjét vagy polipeptidet kódoló DNS-szekvencia, amelyik valamilyen termőképességében helyreállított növényben semlegesíti, blokkolja, leállítja, megszünteti vagy egyéb módon megakadályozza a sterilitáspromoter ellenőrzése alatt a sterilitás DNS-sel kódolt és a növény virág-, mag- vagy embriósejtjeinek anyagcseréjét, működését és/vagy fejlődését egyébként jelentős mértékben zavaró második RNS, fehérje vagy polipeptid aktivitását.
A találmány nem korlátozódik a fenti példákban ismertetett specifikus első marker DNS-ekre sem; oltalmi köréhez tartozik minden olyan harmadik RNS-t, fehérjét vagy polipeptidet kódoló DNS-szekvencia, amely legalább azokban a specifikus növényi szövetekben vagy specifikus növényi sejtekben, amelyekben ez a DNS-szekvencia kifejeződik, valamilyen megkülönböztető jelleget biztosít azokhoz a specifikus növényi szövetekhez vagy növényi sejtekhez képest, amelyekben ez a DNS-szekvencia nincs kifejezve.

Claims (124)

1. Eljárás hímtermő növény előállítására, amely alkalmas termőképességében helyreállított növények előállítására, amelyek idegen sterilitásgént tartalmaznak a nukleáris genomba beépülve, ahol az idegen sterilitásgén tartalmaz
i) egy hímsterilitás DNS-t, amely egy sterilitás-fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely egy növény specifikus porzósejteiben termelődve képes annak elpusztítására vagy működőképességének felfüggesztésére, és így a termőképes hím ivarsejtek termelésének gátlására, és ii) egy sterilitás-promotert, amely a hímsterilitás DNS kifejeződését szelektíven a specifikus porzósejtekben vezérli, és ezáltal a sterilitásfehérje vagy polipeptid szelektíven a specifikus porzósejtekben termelődik, azzal jellemezve, hogy egy olyan növényt állítunk elő, amely nukleáris genomjába beépülve egy idegen DNS-t tartalmaz, amely egy idegen helyreállító gént tartalmaz, ahol az idegen helyreállító gén tartalmaz
a) egy termőképesség-helyreállító DNS-t, amely olyan helyreállító fehéqét vagy polipeptidet kódol, amely azokban a specifikus porzósejtekben termelődve, amelyek szelektíven termelik a sterilitás-fehéijét vagy polipeptidet, gátolják vagy semlegesítik a sterilitás-fehéqe vagy polipeptid hatását, és
b) egy első promótert, amely a termőképesség-helyreállító DNS kifejeződését legalább a specifikus porzósejtekben vezérli.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hímsterilitás DNS egy ribonukleázt kódol, és a termőképesség-helyreállító DNS a ribonukleázt gátló fehéijét kódol.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termőképesség-helyreállító DNS barstart-t vagy egy fehérjét kódol, amely semlegesíti, blokkolja, kiegyenlíti, elfojtja vagy más módon gátolja a bamáz hatását.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hímsterilitás DNS bamázt kódol.
5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termőképesség-helyreállító DNS 2. ábra szerinti, barstar-t kódoló, és az első ATGkodonnál induló szekvenciát tartalmaz.
6. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy termőképesség-helyreállító DNS-ként 2. ábra szerinti Clal-HindlII-fragmenst alkalmazunk.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a kifejeződést szelektíven a növény porzósejtjeiben vezérlő promótert alkalmazunk.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a kifejeződést szelektíven a növény egy vagy több porzósejtjében, így portok-, pollen- és/vagy porzószál-sejtjeiben vezérlő promótert alkalmazunk.
9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a kifejeződést szelektíven a növény egy vagy több porzósejtjében, így tapétum és/vagy portok epidermális sejtjeiben vezérlő promótert alkalmazunk.
10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként PTA29, PTA13 és/vagy pTA26 promótert alkalmazunk.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként PTA29 promótert alkalmazunk.
12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az idegen DNS további komponensként tartalmaz
c) egy marker DNS-t, amely egy olyan marker-RNS-t, fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely, ha a növény legalább egy specifikus szövetében vagy legalább specifikus sejtjeiben jelen van, a növényt elválaszthatóvá teszi azoktól a növényektől, amelyek a marker-RNS-t, fehérjét vagy polipeptidet legalább a specifikus szövetükben vagy specifikus sejtjeikben nem tartalmazzák; és
HU 214 927 Β
d) egy második promotert, amely a marker DNS kifejeződését legalább a specifikus szövetben vagy specifikus sejtekben vezérli; a marker DNS a második promoterrel azonos transzkripciós egységben van, és enenk irányítása alatt áll.
13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az idegen DNS további komponensként kloroplaszt vagy mitokondrium tranzitpeptidet kódoló DNS-t tartalmaz.
14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább a specifikus szövetet vagy a specifikus sejteket megfestő fehéqét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növénynek stressztűrőképességet, betegséggel szembeni rezisztenciát vagy baktériummal, így Bacillus thuringiensis endotoxinnal vagy bakterális peptiddel szembeni rezisztenciát biztosító fehérjét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
16. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy herbicid hatását gátló vagy semlegesítő fehérjét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy herbicid módosított, és ezáltal a herbiciddel szemben a módosítatlan célenzimnél kisebb affinitást mutató célenzimjét kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glifozát herbicid célenzimjeként szolgáló, és módosított 5-enol-piruvil-sikimát-3-foszfát-szintázt és/vagy a glutamin szintetáz inhibitorok célenzimjeként szolgáló, és módosított glutamin-szintázt kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
19. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy foszfinotricinnel szembeni rezisztenciát biztosító fehérjét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy marker DNS-ként sff- vagy sfrv-gént alkalmazunk.
21. A 12-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második promoterként egy konstitutív promotert, sérüléssel indukálható promotert, a kifejezést szelektíven a fotoszintetikus aktivitással rendelkező növényi szövetekben vezérlő promotert vagy a génkifejeződést szelektíven levélsejtekben, sziromlevélsejtekben vagy magsejtekben vezérlő promotert alkalmazunk.
22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második promoterként 35S promotert, 35S3 promotert, PNOS promotert, TRI’ vagy TR2’ promotert vagy SSU promotert alkalmazunk.
23. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényként kukoricát vagy olajrepcét alkalmazunk.
24. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényként búzát, rizst, napraforgót, cukorrépát, paradicsomot, salátát, dohányt, szójababot, borsót, lucernát, sárgarépát vagy káposztát alkalmazunk.
25. Eljárás termőképességében helyreállított növénnyé növeszthető mag előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) keresztezünk
i) egy hímsteril növényt, amely sejtjeinek nukleáris genomjába beépülve egy első idegen DNS-t tartalmaz, amely egy sterilitást-gént tartalmaz, ahol a sterilitás-gén tartalmaz
- egy hímsterilitás DNS-t, amely egy sterilitás-fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely egy növény specifikus porzósejtjeiben termelődve képes annak elpusztítására vagy működőképességének felfüggesztésére, és így a termőképes hím ivarsejtek termelésének gátlására, és
- egy sterilitás-promotert, amely a hímsterilitás DNS kifejeződését szelektíven a specifikus porzósejtekben vezérli, és ii) egy hím termőképességet helyreállító növényt, amely sejtjeinek nukleáris genomjába beépülve egy második idegen DNS-t tartalmaz, amely egy helyreállító gént tartalmaz, ahol a helyreállító gén tartalmaz
- egy termőképesség-helyreállító DNS-t, amely olyan helyreállító fehéqét vagy polipeptidet kódol, amely azokban a specifikus porzósejtekben termelődve, amelyek szelektíven termelik a sterilitásfehéijét vagy polipeptidet, gátolják vagy semlegesítik a sterilitásfehérje vagy polipeptid hatását, és
- egy első promotert, amely a termőképesség-helyreállító DNS kifejeződését legalább a specifikus porzósejtekben vezérli; és
b) a hímsteril növényről begyűjtjük az első idegen
DNS-t és a második idegen DNS-t tartalmazó magokat.
26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a helyreállító gént homozigóta formában tartalmazó hím termőképességet helyreállító növényt alkalmazunk.
27. A 25. vagy 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hímsterilitás DNS egy ribonukleázt kódol, és a termőképesség-helyreállító DNS a ribonukleázt gátló fehéqét kódol.
28. A 25-27. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termőképesség-helyreállító DNS barstar-t vagy egy fehéqét kódol, amely semlegesíti, blokkolja, kiegyenlíti, elfojtja vagy más módon gátolja a bamáz hatását.
29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hímsteril növényben található hímsterilitás DNS bamázt kódol és a bamázt szelektíven a specifikus porzósejtekben termeli.
30. A 25-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termőképesség-helyreállító DNS 2. ábra szerinti, barstar-t kódoló, és az első ATGkodonnál induló szekvenciát tartalmaz.
31. A 25-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy termőképesség-helyreállító DNS-ként 2. ábra szerinti Clal-HindlII-fragmenst alkalmazunk.
HU 214 927 Β
32. A 25-31. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a kifejeződést szelektíven a növény porzósejtjeiben vezérlő promotert alkalmazunk.
33. A 25-32. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a kifejeződést szelektíven a növény egy vagy több porzósejtjében, így portok-, pollen- és/vagy porzószál-sejtjeiben vezérlő promotert alkalmazunk.
34. A 25-32. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a kifejeződést szelektíven a növény egy vagy több porzósejtjében, így tapétum- és/vagy portok epidermális sejtjeiben vezérlő promotert alkalmazunk.
35. A 32-34. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként PTA29, PTA13 és/vagy PTA26 promotert alkalmazunk.
36. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként PTA29 promotert alkalmazunk.
37. A 25-36. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sterilitás-promoterként a kifejeződést egy vagy több porzósejtben, így tapétum és/vagy portok epidermiálís sejtekben vezérlő promotert alkalmazunk.
38. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sterilitás-promoterként PTA29 promotert alkalmazunk.
39. A 25-38. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként és sterilitás-promoterként azonos promotert alkalmazunk.
40. A 25-39. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második idegen DNS további komponensként tartalmaz
c) egy marker DNS-t, amely egy olyan marker-RNS-t, fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely, ha a növény legalább egy specifikus szövetében vagy legalább specifikus sejtjeiben jelen van, a növényt elválaszthatóvá teszi azoktól a növényekből, amelyek a marker-RNS-t, fehérjét vagy polipeptidet legalább a specifikus szövetükben vagy specifikus sejtjeikben nem tartalmazzák; és
d) egy második promotert, amely a marker DNS kifejezését legalább a specifikus szövetben vagy specifikus sejtekben vezérli; a marker DNS a második promoterrel azonos transzkripciós egységben van, és ennek irányítása alatt áll.
41. A 25-40. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az idegen DNS további komponensként kloroplaszt vagy mitokondrium tranzitpeptidet kódoló DNS-t tartalmaz.
42. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább a specifikus szövetet vagy a specifikus sejteket megfestő fehérjét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
43. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növénynek stressz-tűrőképességet, betegséggel szembeni rezisztenciát vagy baktériummal, így Bacillus thuringiensis endotoxinnal vagy bakteriális peptiddel szembeni rezisztenciát biztosító fehérjét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
44. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy herbicid hatását gátló vagy semlegesítő fehérjét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
45. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy herbicid módosított, és ezáltal a herbiciddel szemben a módosítatlan célenzimnél kisebb affinitást mutató célenzimjét kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
46. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glifozát herbicid célenzimjeként szolgáló, és módosított 5-enol-piruvil-sikimát-3-foszfát-szintázt és/vagy a glutamin szintetáz inhibitorok célenzimjeként szolgáló, és módosított glutamin-szintázt kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
47. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy foszfinotricinnel szembeni rezisztenciát biztosító fehérjét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
48. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy marker DNS-ként sfr- vagy sfrv-gént alkalmazunk.
49. A 40-48. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második promoterként egy konstitutív promotert, sérüléssel indukálható promotert, a kifejezést szelektíven a fotoszintetikus aktivitással rendelkező növényi szövetekben vezérlő promotert vagy a génkifejeződést szelektíven levélsejtekben, sziromlevél-sejtekben vagy magsejtekben vezérlő promotert alkalmazunk.
50. A 49. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második promoterként 35S promotert, 35S3 promotert, PNOS promotert, TRI’ vagy TR2’ promotert vagy SSU promotert alkalmazunk.
51. A 25-50. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényként kukoricát vagy olajrepcét alkalmazunk.
52. A 25-50. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényként búzát, rizst, napraforgót, cukorrépát, paradicsomot, salátát, dohányt, szójababot, borsót, lucernát, sárgarépát vagy káposztát alkalmazunk.
53. A 25-52. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy magként hibrid magokat gyűjtünk be.
54. Eljárás termőképességében helyreállított növény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 25-53. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított magból növényt növesztünk.
55. Eljárás nőtermő növény előállítására, amely alkalmas termőképességében helyreállított növények előállítására, amelyek idegen sterilitás-gént tartalmaznak a nukleáris genomba beépülve, ahol az idegen sterilitásgén tartalmaz
i) egy nősterilitás DNS-t, amely egy sterilitás-fehérjét vagy politpeptidet kódol, amely egy növény női szaporodó szervének specifikus sejtjeiben termelődve képes annak elpusztítására vagy működőképességének felfüggesztésére, és így a termőképes női ivar19
HU 214 927 Β sejtek és/vagy életképes magok termelésének gátlására, és ii) egy sterilitás-promotert, amely a nősterilitás DNS kifejeződését szelektíven a specifikus sejtekben vezérli, és ezáltal a sterilitás-fehérje vagy polipeptid szelektíven a specifikus sejtekben termelődik, azzal jellemezve, hogy egy olyan növényt állítunk elő, amely nukleáris genomjába beépülve egy idegen DNS-t tartalmaz, amely egy idegen helyreállító gént tartalmaz, ahol az idegen helyreállító gén tartalmaz
a) egy termőképesség-helyreállító DNS-t, amely olyan helyreállító fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely a női szaporodó szerv specifikus sejtjeiben termelődve, amelyek szelektíven termelik a sterilitás-fehérjét vagy polipeptidet, megfelelően gátolják vagy semlegesítik a sterilitás-fehérje vagy polipeptid hatását, és
b) egy első promotert, amely a termőképesség-helyreállító DNS kifejeződését legalább a női szaporodó szerv specifikus sejtjeiben vezérli.
56. Az 55. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nősteril DNS egy ribonukleázt kódol, és a termőképesség-helyreállító DNS a ribonukleázt gátló fehérjét kódol.
57. Az 55. vagy 56. igénypont szerinti szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termőképesség-helyreállító DNS barstart-t vagy egy fehérjét kódol, amely semlegesíti, blokkolja, kiegyenlíti, elfojtja vagy más módon gátolja a bamáz hatását.
58. Az 57. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nősterilitás DNS bamázt kódol.
59. Az 55-58. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termőképesség-helyreállító DNS 2. ábra szerinti, barstar-t kódoló, és az első ATGkodonnál induló szekvenciát tartalmaz.
60. Az 55-58. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy termőképesség-helyreállító DNS-ként 2. ábra szerinti Clal-HindlII-fragmenst alkalmazunk.
61. Az 55-60. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a kifejeződést szelektíven a növény női szaporodó szervének sejtjeiben vezérlő promotert alkalmazunk.
62. Az 55-61. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a kifejeződést szelektíven a növény női szaporodó szervének egy vagy több sejtjében, így magház, magrügy, bibeszál, bibe és/vagy belső rekeszfal sejtjeiben vezérlő promotert alkalmazunk.
63. Az 55-61. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a kifejeződést szelektíven a növény női szaporodó szervének egy vagy több sejtjében, így bibe- és/vagy bibeszál-sejtjeiben vezérlő promotert alkalmazunk.
64. A 61-63. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a dohány endogén STMG4B12 promoterét, a dohány endogén STMG3C9 promoterét, a dohány endogén STMG07 promoterét és/vagy a dohány endogén STMG08 promoterét alkalmazzuk.
65. Az 55-64. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az idegen DNS további komponensként tartalmaz
c) egy marker DNS-t, amely egy olyan marker-RNS-t, fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely, ha a növény legalább egy specifikus szövetében vagy legalább specifikus sejtjeiben jelen van, a növényt elválaszthatóvá teszi azoktól a növényektől, amelyek a marker-RNS-t, fehérjét vagy polipeptidet legalább a specifikus szövetükben vagy specifikus sejtjeikben nem tartalmazzák; és
d) egy második promotert, amely a marker DNS kifejezését legalább a specifikus szövetben vagy specifikus sejtekben vezérli; a marker DNS a második promoterrel azonos transzkripciós egységben van, és ennek irányítása alatt áll.
66. Az 55-65. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az idegen DNS további komponensként kloroplaszt vagy mitokondrium tranzitpeptidet kódoló DNS-t tartalmaz.
67. A 65. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább a specifikus szövetet vagy a specifikus sejteket megfestő fehérjét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
68. A 65. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növénynek stressztűrőképességet, betegséggel szembeni rezisztenciát vagy baktériummal, így Bacillus thuringiensis endotoxinnal vagy bakteriális peptiddel szembeni rezisztenciát biztosító fehérjét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
69. A 65. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy herbicid hatását gátló vagy semlegesítő fehéqét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
70. A 69. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy herbicid módosított, és ezáltal a herbiciddel szemben a módosítatlan célenzimnél kisebb affinitást mutató célenzimjét kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
71. A 70. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glifozát herbicid célenzimjeként szolgáló, és módosított 5 - enol-piruvil-sikimát-3 -foszfát-szintázt és/vagy a glutamin szintetáz inhibitorok célenzimjeként szolgáló, és módosított glutamin-szintázt kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
72. A 69. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy foszfinotricinnel szembeni rezisztenciát biztosító fehérjét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
73. A 72. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy marker DNS-ként sír vagy sffv gént alkalmazunk.
74. A 65-73. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második promoterként egy konstitutív promotert, sérüléssel indukálható promotert, a kifejezést szelektíven a fotoszintetikus aktivitással rendelkező növényi szövetekben vezérlő promotert vagy a génkifejeződést szelektíven levélsejtekben, sziromlevélsejtekben vagy magsejtekben vezérlő promotert alkalmazunk.
HU 214 927 Β
75. A 74. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második promoterként 35S promotert, 35S3 promotert, PNOS promotert, TR1’ vagy TR2’ promotert vagy SSU promotert alkalmazunk.
76. Az 55-75. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényként kukoricát vagy olajrepcét alkalmazunk.
77. Az 55-75. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényként búzát, rizst, napraforgót, cukorrépát, paradicsomot, salátát, dohányt, szójababot, borsót, lucernát, sárgarépát vagy káposztát alkalmazunk.
78. Eljárás termőképességében helyreállított növénnyé növeszthető mag előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) keresztezünk
i) egy nősteril növényt, amely sejtjeinek nukleáris genomjába beépülve egy első idegen DNS-t tartalmaz, amely egy sterilitást-gént tartalmaz, ahol a sterilitás-gén tartalmaz
- egy nősterilitás DNS-t, amely egy sterilitás-fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely egy növény női szaporodó szervének specifikus sejtjeiben termelődve képes annak elpusztítására vagy működőképességének felfüggesztésére, és így a termőképes női ivarsejtek és/vagy életképes magok termelésének gátlására, és
- egy sterilitás-promotert, amely a nősterilitás DNS kifejeződését szelektíven a specifikus porzósejtekben vezérli, és ii) egy női termőképességet helyreállító növényt, amely sejtjeinek nukleáris genomjába beépülve egy második idegen DNS-t tartalmaz, amely egy helyreállító gént tartalmaz, ahol a helyreállító gén tartalmaz
- egy termőképesség-helyreállító DNS-t, amely olyan helyreállító fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely a növény női szaporodó szervének specifikus sejtjeiben termelődve, amelyek szelektíven termelik a sterilitás-fehérjét vagy polipeptidet, gátolják vagy semlegesítik a sterilitás-fehérje vagy polipeptid hatását, és
- egy első promotert, amely a termőképességhelyreállító DNS kifejeződését legalább a növény női szaporodó szervének specifikus sejtjeiben vezérli; és
b) a nőtermő növényről begyűjtjük az első idegen
DNS-t és a második idegen DNS-t tartalmazó magokat.
79. A 78. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a helyreállító gént homozigóta formában tartalmazó női termőképességet helyreállító növényt alkalmazunk.
80. A 78. vagy 79. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nősterilitás DNS egy ribonukleázt kódol, és a termőképesség-helyreállító DNS a ribonukleázt gátló fehérjét kódol.
81. A 78-80. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termőképesség-helyreállító DNS barstar-t vagy egy fehérjét kódol, amely semlegesíti, blokkolja, kiegyenlíti, elfojtja vagy más módon gátolja a bamáz hatását.
82. A 81. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nősteril növényben található sterilitás DNS bamázt kódol és a bamázt szelektíven a női szaporodó szerv specifikus sejtjeiben termeli.
83. A 78-82. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termőképesség-helyreállító DNS 2. ábra szerinti, barstar-t kódoló, és az első ATG kodonnál induló szekvenciát tartalmaz.
84. A 78-82. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy termőképesség-helyreállító DNS-ként 2. ábra szerinti Clal-HindlII-fragmenst alkalmazunk.
85. A 78-84. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a kifejeződést szelektíven a növény női szaporodó szervének sejtjeiben vezérlő promotert alkalmazunk.
86. A 78-85. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a kifejeződést szelektíven a növény női szaporodó szervének egy vagy több sejtjében, így magház-, magrügy-, bibpszál-, bibe- és/vagy belső rekeszfal-sejtjeiben vezérlő promotert alkalmazunk.
87. A 78-85. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a kifejeződést szelektíven a növény női szaporodó szervének egy vagy több sejtjében, így bibe- és/vagy bibeszál-sejtjeiben vezérlő promotert alkalmazunk.
88. A 85-87. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként a dohány endogén STMG4B12 promoterét, a dohány endogén STMG3C9 promoterét, a dohány endogén STMG07 promoterét és/vagy a dohány endogén STMG08 promoterét alkalmazzuk.
89. A 78-88. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sterilitás-promoterként a kifejeződést szelektíven a növény női szaporodó szervének egy vagy több sejtjében, így magház-, magrügy-, bibeszál-, bibe- és/vagy belső rekeszfal-sejtjeiben vezérlő promotert alkalmazunk.
90. A 78-88. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy sterilitás-promoterként a kifejeződést szelektíven a növény női szaporodó szervének egy vagy több sejtjében, így bibe- és/vagy bibeszálsejtjeiben vezérlő promotert alkalmazunk.
91. A 78-90. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként és sterilitás-promoterként azonos promotert alkalmazunk.
92. A 78-91. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az idegen DNS további komponensként tartalmaz
c) egy marker DNS-t, amely egy olyan marker-RNS-t, fehérjét vagy polipeptidet kódol, amely, ha a növény legalább egy specifikus szövetében vagy legalább specifikus sejtjeiben jelen van, a növényt elválaszthatóvá teszi azoktól a növényektől, amelyek a marker-RNS-t, fehéqét vagy polipeptidet legalább a specifikus szövetükben vagy specifikus sejtjeikben nem tartalmazzák; és
HU 214 927 Β
d) egy második promotert, amely a marker DNS kifejeződését legalább a specifikus szövetben vagy specifikus sejtekben vezérli; a marker DNS a második promoterrel azonos transzkripciós egységben van, és ennek irányítása alatt áll.
93. A 78-92. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az idegen DNS további komponensként kloroplaszt vagy mitokondrium tranzitpeptidet kódoló DNS-t tartalmaz.
94. A 92. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább a specifikus szövetet vagy a specifikus sejteket megfestő fehéijét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
95. A 92. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növénynek stressztűrőképességet, betegséggel szembeni rezisztenciát vagy baktériummal, így Bacillus thuringiensis endotoxinnal vagy bakteriális peptiddel szembeni rezisztenciát biztosító fehérjét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
96. A 92. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy herbicid hatását gátló vagy semlegesítő fehérjét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
97. A 96. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy herbicid módosított, és ezáltal a herbiciddel szemben a módosítatlan célenzimnél kisebb affinitást mutató célenzimjét kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
98. A 97. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glifozát herbicid célenzimjeként szolgáló, és módosított 5-enol-piruvil-sikimát-3-foszfát-szintázt és/vagy a glutamin szintetáz inhibitorok célenzimjeként szolgáló, és módosított glutamin-szintázt kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
99. A 96. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy foszfinotricinnel szembeni rezisztenciát biztosító fehéijét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
100. A 99. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy marker DNS-ként sfr vagy sffv gént alkalmazunk.
101. A 92-100. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második promoterként egy konstitutív promotert, sérüléssel indukálható promotert, a kifejezést szelektíven a fotoszintetikus aktivitással rendelkező növényi szövetekben vezérlő promotert vagy a génkifejeződést szelektíven levélsejtekben, sziromlevélsejtekben vagy magsejtekben vezérlő promotert alkalmazunk.
102. A 101. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második promoterként 35S promotert, 35S3 promotert, PNOS promotert, TRI’ vagy TR2’ promotert vagy SSU promotert alkalmazunk.
103. A 78-102. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényként kukoricát vagy olajrepcét alkalmazunk.
104. A 78-102. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényként búzát, rizst, napraforgót, cukorrépát, paradicsomot, salátát, dohányt, szójababot, borsót, lucernát, sárgarépát vagy káposztát alkalmazunk.
105. A 78-104. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nőtermő növényként hímsteril növényt alkalmazunk.
106. A 78-105. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy magként hibrid magokat gyűjtünk be.
107. Eljárás termőképességében helyreállított növény előállítására, azzal jellemezve, hogy a 78-106. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított magból növényt növesztünk.
108. Eljárás egy ribonukleáz hatásának gátlására egy növény legalább virág-, mag- és/vagy embriósejtjeiben, azzal jellemezve, hogy nukleáris genomjában egy első kimér DNS-t tartalmazó rekombináns DNS-t hordozó transzformált növényt állítunk elő, ahol az első kimér DNS tartalmaz
a) egy helyreállító DNS-t, amely a ribonukleázt gátló inhibitor fehérjét kódol, és
b) egy első promotert, amely a kifejeződést legalább a növény virág-, mag- és/vagy embriósejtjeiben vezérli, és ahol a helyreállító DNS az első promoterrel azonos transzkripciós egységben van, és ennek irányítása alatt áll.
109. A 108. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Bacillus amyloliquefaciens extracelluláris ribonukleáz bamáz enzimjének hatását semlegesítő inhibitort kódoló helyreállító DNS-t alkalmazunk.
110. A 109. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy inhibitorként barstar-t kódoló helyreállító DNS-t alkalmazunk, amelyben a barstar aminosavszekvenciáját 2. ábra szerinti, és az első ATG kodonnál induló szekvencia kódolja.
111. A 110. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy helyreállító DNS-ként 2. ábra szerinti, és az első ATG kodonnál induló szekvenciát tartalmazó DNS-t alkalmazunk.
112. A 111. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy helyreállító DNS-ként 2. ábra szerinti Clal-HindlII-fragmenst alkalmazunk.
113. A 108-112. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS további komponensként egy második kimér-gént tartalmaz, amely tartalmaz
c) egy marker DNS-t, amely egy olyan marker-RNS-t, fehéijét vagy polipeptidet kódol, amely, ha a növény legalább egy specifikus szövetében vagy legalább specifikus sejtjeiben jelen van, a növényt könnyen elválaszthatóvá teszi azoktól a növényektől, amelyek a marker-RNS-t, fehéqét vagy polipeptidet legalább a specifikus szövetükben vagy specifikus sejtjeikben nem tartalmazzák; és
d) egy második promotert, amely a marker DNS kifejezését legalább a specifikus szövetben vagy specifikus sejtekben vezérli; a marker DNS a második promoterrel azonos transzkripciós egységben van, és ennek irányítása alatt áll.
114. A 113. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább a specifikus szövetet vagy a specifikus sejteket megfestő fehéqét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
HU 214 927 Β
115. A 113. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy herbicid módosított, és ezáltal a herbiciddel szemben a módosítatlan célenzimnél kisebb affinitást mutató célenzimjét kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
116. A 115. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a glifozát herbicid cél enzimjeként szolgáló, és módosított 5-enol-piruvil-sikimát-3-foszfátszintázt és/vagy a glutamin szintetáz inhibitorok, így foszfinotricin célenzimjeként szolgáló, és módosított glutamin szintázt kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
117. A 113. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy herbicid hatását gátló vagy semlegesítő fehéqét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
118. A 117. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glutamin szintáz inhibitorral, így foszfinotricinnel szembeni rezisztenciát biztosító fehéijét vagy polipeptidet kódoló marker DNS-t alkalmazunk.
119. A 118. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy marker DNS-ként sfr vagy sfrv gént alkalmazunk.
120. A 113-119. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második promoterként egy konstitutív promotert, sérüléssel indukálható promotert, a kifejezést szelektíven a fotoszintetikus aktivitással rendelkező növényi szövetekben vezérlő promotert vagy a génkifejeződést szelektíven levélsejtekben, sziromlevél-sejtekben vagy magsejtekben szereplő promotert alkalmazunk.
121. A 120. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második promoterként 35S promotert, 35S3 promotert, PNOS promotert, TR1’ vagy TR2’ promotert vagy SSU promotert alkalmazunk.
122. A 108-121. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS további komponensként kloroplaszt vagy mitokondrium tranzitpeptidet kódoló DNS-t tartalmaz.
123. A 108-122. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy első promoterként konstitutív promotert alkalmazunk.
124. A 108-123. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további komponensként ribonukleázt kódoló DNS-t tartalmazó transzformált növényt állítunk elő.
HU906172A 1989-08-10 1990-08-09 Eljárás módosított virággal rendelkező növények előállítására HU214927B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP89402270 1989-08-10

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU906172D0 HU906172D0 (en) 1991-07-29
HUT58803A HUT58803A (en) 1992-03-30
HU214927B true HU214927B (hu) 1998-07-28

Family

ID=8202984

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU906172A HU214927B (hu) 1989-08-10 1990-08-09 Eljárás módosított virággal rendelkező növények előállítására

Country Status (17)

Country Link
US (1) US6046382A (hu)
EP (2) EP1090999B1 (hu)
JP (3) JP3105242B2 (hu)
AT (2) ATE496135T1 (hu)
CA (1) CA2039165C (hu)
DE (2) DE69034268D1 (hu)
DK (1) DK0412911T3 (hu)
ES (1) ES2161681T3 (hu)
FI (1) FI120156B (hu)
GR (1) GR3036893T3 (hu)
HK (1) HK1014738A1 (hu)
HU (1) HU214927B (hu)
IE (2) IE20020884A1 (hu)
IL (3) IL95337A (hu)
PT (1) PT94964B (hu)
WO (1) WO1991002069A1 (hu)
ZA (1) ZA906344B (hu)

Families Citing this family (228)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992001799A1 (en) * 1990-07-20 1992-02-06 Paladin Hybrids Inc. Binary cryptocytotoxic method of hybrid seed production
EP0570422B1 (en) * 1991-02-07 2007-12-19 Bayer BioScience N.V. Stamen-specific promoters from corn
US5770718A (en) * 1991-05-23 1998-06-23 University Of Waterloo Gene for APRT from plant tissue
EP0537399A1 (en) * 1991-10-16 1993-04-21 Plant Genetic Systems, N.V. A novel ribonuclease and its inhibitor
RU2143000C1 (ru) * 1991-11-20 1999-12-20 Моген Интернэшнл Н.В. Способ получения растения с пониженной восприимчивостью к растительным паразитическим нематодам (варианты), рекомбинантная днк (варианты), трансформирующий растение вектор, штамм agrobacterium и способ снижения ущерба урожаю
CA2108666A1 (en) * 1992-01-16 1993-07-17 Geoffrey Frank Smart Genetically modified wheat plants and progeny and method for production of hybrid wheat
ATE255639T1 (de) * 1992-03-20 2003-12-15 Max Planck Gesellschaft Auf fungus reagierendes chimaeres gen
US5750867A (en) * 1992-06-12 1998-05-12 Plant Genetic Systems, N.V. Maintenance of male-sterile plants
DE69333880T2 (de) * 1992-06-12 2006-06-22 Bayer Bioscience N.V. Erhaltung von männlichen sterilen pflanzen
CA2146113A1 (en) * 1992-10-15 1994-10-15 Adrianus Johannes Van Tunen Genetic moderation of restoration or plant phenotypes
FR2703561B1 (fr) * 1993-02-15 1995-08-04 Centre Nat Rech Scient Plantes transgeniques incluant un transgene constitue par une sequence d'acide nucleique hybride, comportant au moins un fragment de gene mitochondrial non edite de vegetaux superieurs et preparation.
GB9401780D0 (en) * 1994-01-31 1994-03-23 Nickerson Biocem Ltd Modified plants
US5837850A (en) * 1994-04-21 1998-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Regulatory element conferring tapetum specificity
CA2191441A1 (en) * 1994-06-06 1995-12-21 Enno Krebbers Use of anthocyanin genes to maintain male sterile plants
US7262055B2 (en) 1998-08-25 2007-08-28 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US7285416B2 (en) 2000-01-24 2007-10-23 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
DE4433975A1 (de) * 1994-09-23 1996-03-28 Teves Gmbh Alfred Stirnisolation
US5717129A (en) * 1995-02-16 1998-02-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for maintaining sterility in plants
US6008437A (en) * 1995-06-06 1999-12-28 Plant Genetic Systems Use of anthocyanin genes to maintain male sterile plants
EP0757102A1 (en) 1995-08-04 1997-02-05 Plant Genetic Systems N.V. Genetic transformation using a PARP inhibitor
GB9607517D0 (en) 1996-04-11 1996-06-12 Gene Shears Pty Ltd The use of DNA Sequences
FR2751347B1 (fr) * 1996-07-16 2001-12-07 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides
WO1998010081A2 (en) * 1996-09-03 1998-03-12 Plant Genetic Systems, N.V. Improved barstar-gene
HUP0002390A3 (en) * 1997-03-03 2002-08-28 Syngenta Participations Ag Method of hybrid seed production using conditional female sterility
US6815577B1 (en) 1997-03-03 2004-11-09 Syngenta Participations Ag Method of hybrid seed production using conditional female sterility
US6037523A (en) * 1997-06-23 2000-03-14 Pioneer Hi-Bred International Male tissue-preferred regulatory region and method of using same
DK1054985T3 (da) 1998-02-20 2012-07-16 Syngenta Ltd Produktion af hybridfrø
KR20010042069A (ko) 1998-03-20 2001-05-25 베니텍 오스트레일리아 리미티드 유전자 발현 조절방법
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
US20040214330A1 (en) 1999-04-07 2004-10-28 Waterhouse Peter Michael Methods and means for obtaining modified phenotypes
US8598332B1 (en) 1998-04-08 2013-12-03 Bayer Cropscience N.V. Methods and means for obtaining modified phenotypes
WO1999053050A1 (en) 1998-04-08 1999-10-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods and means for obtaining modified phenotypes
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US6509516B1 (en) 1999-10-29 2003-01-21 Plant Genetic Systems N.V. Male-sterile brassica plants and methods for producing same
US6506963B1 (en) 1999-12-08 2003-01-14 Plant Genetic Systems, N.V. Hybrid winter oilseed rape and methods for producing same
US6646186B1 (en) * 2000-07-26 2003-11-11 Stine Seed Farm Inc. Hybrid soybeans and methods of production
CA2445291A1 (en) * 2002-02-07 2003-08-14 Hybrigene, Inc Prevention of transgene escape in genetically modified perennials
US20100031387A1 (en) * 2002-02-07 2010-02-04 Hybrigene, Inc. Prevention of transgene escape in genetically modified perennials
US20030208789A1 (en) * 2002-05-03 2003-11-06 Stefan Jansens Wound-inducible expression in plants
AU2003246404A1 (en) * 2002-06-06 2003-12-22 Bayer Bioscience N.V. Female gametophyte specific promoter (zmea1)
JPWO2004113537A1 (ja) * 2003-06-18 2006-08-24 日本たばこ産業株式会社 稔性回復遺伝子を複数の遺伝子座に配置させることを含むハイブリッド植物の稔性を向上させる方法
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
WO2007039454A1 (en) 2005-09-20 2007-04-12 Basf Plant Science Gmbh Methods for controlling gene expression using ta-siran
EA023885B1 (ru) 2005-10-13 2016-07-29 МОНСАНТО ТЕКНОЛОДЖИ, ЭлЭлСи Конструкция рекомбинантной днк для индуцирования стерильности в трансгенном растении, стерильные трансгенные растения и способы получения гибридных семян
US8946511B2 (en) 2006-10-12 2015-02-03 Monsanto Technology Llc Plant microRNAs and methods of use thereof
CL2007003744A1 (es) 2006-12-22 2008-07-11 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende un derivado 2-piridilmetilbenzamida y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos.
CL2007003743A1 (es) 2006-12-22 2008-07-11 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende fenamidona y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos.
EP1969929A1 (de) 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience AG Substituierte Phenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
EP1969930A1 (de) 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience AG Phenoxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
WO2008110281A2 (de) 2007-03-12 2008-09-18 Bayer Cropscience Ag 3,4-disubstituierte phenoxyphenylamidine und deren verwendung als fungizide
WO2008110279A1 (de) 2007-03-12 2008-09-18 Bayer Cropscience Ag Dihalogenphenoxyphenylamidine und deren verwendung als fungizide
EP1969934A1 (de) 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience AG 4-Cycloalkyl-oder 4-arylsubstituierte Phenoxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
JP2010524869A (ja) 2007-04-19 2010-07-22 バイエル・クロツプサイエンス・アクチエンゲゼルシヤフト チアジアゾリルオキシフェニルアミジンおよび殺菌剤としてのこれらの使用
DE102007045955A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045953B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045920B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Synergistische Wirkstoffkombinationen
DE102007045957A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akarziden Eigenschaften
DE102007045922A1 (de) 2007-09-26 2009-04-02 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045919B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045956A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombination mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
EP2090168A1 (de) 2008-02-12 2009-08-19 Bayer CropScience AG Methode zur Verbesserung des Pflanzenwachstums
US8158850B2 (en) * 2007-12-19 2012-04-17 Monsanto Technology Llc Method to enhance yield and purity of hybrid crops
EP2072506A1 (de) 2007-12-21 2009-06-24 Bayer CropScience AG Thiazolyloxyphenylamidine oder Thiadiazolyloxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
EP2168434A1 (de) 2008-08-02 2010-03-31 Bayer CropScience AG Verwendung von Azolen zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress
JP2011530548A (ja) 2008-08-14 2011-12-22 バイエル・クロップサイエンス・アーゲー 殺虫性４−フェニル−１ｈ−ピラゾール類
DE102008041695A1 (de) 2008-08-29 2010-03-04 Bayer Cropscience Ag Methoden zur Verbesserung des Pflanzenwachstums
EP2201838A1 (de) 2008-12-05 2010-06-30 Bayer CropScience AG Wirkstoff-Nützlings-Kombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
EP2198709A1 (de) 2008-12-19 2010-06-23 Bayer CropScience AG Verfahren zur Bekämpfung resistenter tierischer Schädlinge
EP2204094A1 (en) 2008-12-29 2010-07-07 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants Introduction
EP2039770A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
EP2039771A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
EP2039772A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants introduction
KR20110106448A (ko) 2009-01-19 2011-09-28 바이엘 크롭사이언스 아게 사이클릭 디온 및 살충제, 살비제 및/또는 살진균제로서의 그의 용도
EP2227951A1 (de) 2009-01-23 2010-09-15 Bayer CropScience AG Verwendung von Enaminocarbonylverbindungen zur Bekämpfung von durch Insekten übertragenen Viren
JP5592398B2 (ja) 2009-01-28 2014-09-17 バイエル・クロップサイエンス・アーゲー 殺菌剤ｎ−シクロアルキル−ｎ−二環式メチレン−カルボキサミド誘導体
AR075126A1 (es) 2009-01-29 2011-03-09 Bayer Cropscience Ag Metodo para el mejor uso del potencial de produccion de plantas transgenicas
BRPI1006006B1 (pt) 2009-02-17 2018-05-22 Bayer Intellectual Property Gmbh Compostos, composição fungicida e método para o controle de fungos fitopatogênicos de culturas
EP2218717A1 (en) 2009-02-17 2010-08-18 Bayer CropScience AG Fungicidal N-((HET)Arylethyl)thiocarboxamide derivatives
TW201031331A (en) 2009-02-19 2010-09-01 Bayer Cropscience Ag Pesticide composition comprising a tetrazolyloxime derivative and a fungicide or an insecticide active substance
DE102009001469A1 (de) 2009-03-11 2009-09-24 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
DE102009001681A1 (de) 2009-03-20 2010-09-23 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
DE102009001728A1 (de) 2009-03-23 2010-09-30 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
DE102009001732A1 (de) 2009-03-23 2010-09-30 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
DE102009001730A1 (de) 2009-03-23 2010-09-30 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
CN102448305B (zh) 2009-03-25 2015-04-01 拜尔农作物科学股份公司 具有杀昆虫和杀螨虫特性的活性成分结合物
US9012360B2 (en) 2009-03-25 2015-04-21 Bayer Intellectual Property Gmbh Synergistic combinations of active ingredients
EP2232995A1 (de) 2009-03-25 2010-09-29 Bayer CropScience AG Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
MX2011009830A (es) 2009-03-25 2011-10-06 Bayer Cropscience Ag Combinaciones de principios activos con propiedades insecticidas y acaricidas.
WO2010108505A1 (de) 2009-03-25 2010-09-30 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden eigenschaften
EP2410847A1 (de) 2009-03-25 2012-02-01 Bayer CropScience AG Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden eigenschaften
EP2239331A1 (en) 2009-04-07 2010-10-13 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
BRPI1015543A8 (pt) 2009-05-06 2016-05-24 Bayer Cropscience Ag Compostos de ciclopentanodiona e seu uso como inseticidas, acaricidas e/ou fungicidas.
AR076839A1 (es) 2009-05-15 2011-07-13 Bayer Cropscience Ag Derivados fungicidas de pirazol carboxamidas
EP2251331A1 (en) 2009-05-15 2010-11-17 Bayer CropScience AG Fungicide pyrazole carboxamides derivatives
EP2255626A1 (de) 2009-05-27 2010-12-01 Bayer CropScience AG Verwendung von Succinat Dehydrogenase Inhibitoren zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress
BRPI1011983A2 (pt) 2009-06-02 2015-09-22 Bayer Cropscience Ag utilização de inibidores de succinato desidrogenase para o controle sclerotinia ssp.
AU2010272872B2 (en) 2009-07-16 2014-08-28 Bayer Intellectual Property Gmbh Synergistic active substance combinations containing phenyl triazoles
WO2011015524A2 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Bayer Cropscience Ag Fungicide heterocycles derivatives
EP2292094A1 (en) 2009-09-02 2011-03-09 Bayer CropScience AG Active compound combinations
EP2343280A1 (en) 2009-12-10 2011-07-13 Bayer CropScience AG Fungicide quinoline derivatives
BR112012012107B1 (pt) 2009-12-28 2019-08-20 Bayer Cropscience Ag Composto, composição fungicida e método para controlar fungos fitopatogênico de culturas
CN105399666A (zh) 2009-12-28 2016-03-16 拜尔农科股份公司 杀真菌剂肟基-杂环衍生物
TW201141381A (en) 2009-12-28 2011-12-01 Bayer Cropscience Ag Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
RS55986B1 (sr) 2010-01-22 2017-09-29 Bayer Ip Gmbh Akaricidne i/ili insekticidne kombinacije aktivnih supstanci
EP2353387A1 (de) 2010-02-05 2011-08-10 Bayer CropScience AG Verwendung von Succinat-Dehydrogenase (SDH)-Inhibitoren in der Behandlung von Pflanzenarten der Familie der Süßgräser
WO2011107504A1 (de) 2010-03-04 2011-09-09 Bayer Cropscience Ag Fluoralkyl- substituierte 2 -amidobenzimidazole und deren verwendung zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
BR112012023551A2 (pt) 2010-03-18 2015-09-15 Bayer Ip Gmbh aril e hetaril sulfonamidas como agentes ativos contra estresse abiótico em plantas
WO2011124554A2 (de) 2010-04-06 2011-10-13 Bayer Cropscience Ag Verwendung der 4-phenylbuttersäure und/oder ihrer salze zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
CN102933083B (zh) 2010-04-09 2015-08-12 拜耳知识产权有限责任公司 (1-氰基环丙基)苯基次膦酸或其酯的衍生物和/或其盐提高植物对非生物胁迫耐受性的用途
EP2377397A1 (de) 2010-04-14 2011-10-19 Bayer CropScience AG Verwendung fungizider Wirkstoffe zur Kontrolle von Mykosen an Palmengewächsen
JP2013525400A (ja) 2010-04-28 2013-06-20 バイエル・クロップサイエンス・アーゲー 殺菌剤ヒドロキシモイル−複素環誘導体
US20130116287A1 (en) 2010-04-28 2013-05-09 Christian Beier Fungicide hydroximoyl-heterocycles derivatives
WO2011134911A2 (en) 2010-04-28 2011-11-03 Bayer Cropscience Ag Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
US8999956B2 (en) 2010-06-03 2015-04-07 Bayer Intellectual Property Gmbh N-[(het)arylalkyl)] pyrazole(thio)carboxamides and their heterosubstituted analogues
CA2796191A1 (en) 2010-06-03 2011-12-08 Bayer Cropscience Ag N-[(het)arylethyl)] pyrazole(thio)carboxamides and their heterosubstituted analogues
UA110703C2 (uk) 2010-06-03 2016-02-10 Байєр Кропсайнс Аг Фунгіцидні похідні n-[(тризаміщений силіл)метил]-карбоксаміду
UA111593C2 (uk) 2010-07-07 2016-05-25 Баєр Інтеллекчуел Проперті Гмбх Аміди антранілової кислоти у комбінації з фунгіцидами
CA2803083A1 (en) 2010-07-20 2012-01-26 Bayer Cropscience Ag Benzocycloalkenes as antifungal agents
AU2011281679B2 (en) 2010-07-20 2015-09-03 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of anthranilic acid amide derivatives for controlling insects and spider mites by watering, mixing with soil, drench treatment, droplet application, injection into the soil, stems or blossoms, in hydroponic systems, by treating the planting hole or immersion application, floating or seed box application or by the treatment of seeds, and for increasing the stress tolerance in plants to abiotic stress
RU2013114710A (ru) 2010-09-03 2014-10-10 Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх Замещенные конденсированные пиримидиноны и дигидропиримидиноны
WO2012038480A2 (en) 2010-09-22 2012-03-29 Bayer Cropscience Ag Use of biological or chemical control agents for controlling insects and nematodes in resistant crops
EP2460406A1 (en) 2010-12-01 2012-06-06 Bayer CropScience AG Use of fluopyram for controlling nematodes in nematode resistant crops
WO2012045798A1 (en) 2010-10-07 2012-04-12 Bayer Cropscience Ag Fungicide composition comprising a tetrazolyloxime derivative and a thiazolylpiperidine derivative
CA2815114A1 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Juergen Benting 1-(heterocyclic carbonyl) piperidines
UA107865C2 (ru) 2010-10-21 2015-02-25 Байєр Інтелекчуал Проперті Гмбх Гетероциклические карбоксамиды
WO2012059497A1 (en) 2010-11-02 2012-05-10 Bayer Cropscience Ag N-hetarylmethyl pyrazolylcarboxamides
WO2012065947A1 (en) 2010-11-15 2012-05-24 Bayer Cropscience Ag 5-halogenopyrazolecarboxamides
AR083874A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Bayer Cropscience Ag 5-halogenopirazol(tio)carboxamidas
BR112013012080A2 (pt) 2010-11-15 2016-07-19 Bayer Ip Gmbh n-aril pirazol (tio) carboxamidas
EP2460407A1 (de) 2010-12-01 2012-06-06 Bayer CropScience AG Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe
EP3372081A3 (en) 2010-12-01 2018-10-24 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Use of fluopyram for controlling nematodes in crops
EP2474542A1 (en) 2010-12-29 2012-07-11 Bayer CropScience AG Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
US20130289077A1 (en) 2010-12-29 2013-10-31 Juergen Benting Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
EP2471363A1 (de) 2010-12-30 2012-07-04 Bayer CropScience AG Verwendung von Aryl-, Heteroaryl- und Benzylsulfonamidocarbonsäuren, -carbonsäureestern, -carbonsäureamiden und -carbonitrilen oder deren Salze zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen
EP2494867A1 (de) 2011-03-01 2012-09-05 Bayer CropScience AG Halogen-substituierte Verbindungen in Kombination mit Fungiziden
CA2823999C (en) 2011-03-10 2020-03-24 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of lipochito-oligosaccharide compounds for safeguarding seed safety of treated seeds
BR112013023502A2 (pt) 2011-03-14 2016-08-02 Bayer Ip Gmbh composto fórmula (i), composição fungicida, método para o controle de fungos fitopatogênicos de culturas, utilização dos compostos de fórmula (i) e processo para a produção das composições
US20140051575A1 (en) 2011-04-08 2014-02-20 Juergen Benting Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
AR090010A1 (es) 2011-04-15 2014-10-15 Bayer Cropscience Ag 5-(ciclohex-2-en-1-il)-penta-2,4-dienos y 5-(ciclohex-2-en-1-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas, usos y metodos de tratamiento
EP2511255A1 (de) 2011-04-15 2012-10-17 Bayer CropScience AG Substituierte Prop-2-in-1-ol- und Prop-2-en-1-ol-Derivate
AR085585A1 (es) 2011-04-15 2013-10-09 Bayer Cropscience Ag Vinil- y alquinilciclohexanoles sustituidos como principios activos contra estres abiotico de plantas
AR085568A1 (es) 2011-04-15 2013-10-09 Bayer Cropscience Ag 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-penta-2,4-dienos y 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas
DK2997825T3 (en) 2011-04-22 2019-03-11 Bayer Ip Gmbh COMPOSITIONS OF ACTIVE COMPOUNDS CONTAINING A (THIO) CARBOXAMIDE DERIVATIVE AND A FUNGICID COMPOUND
AR088133A1 (es) 2011-07-01 2014-05-14 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para la regulacion selectiva de la expresion de proteinas
EP2729007A1 (de) 2011-07-04 2014-05-14 Bayer Intellectual Property GmbH Verwendung substituierter isochinolinone, isochinolindione, isochinolintrione und dihydroisochinolinone oder jeweils deren salze als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress
WO2013020985A1 (en) 2011-08-10 2013-02-14 Bayer Intellectual Property Gmbh Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives
JP2014524455A (ja) 2011-08-22 2014-09-22 バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー 殺真菌性ヒドロキシモイル−テトラゾール誘導体
EP2561759A1 (en) 2011-08-26 2013-02-27 Bayer Cropscience AG Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth
JP2014530173A (ja) 2011-09-09 2014-11-17 バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー 植物の収量を改善するためのアシル−ホモセリンラクトン誘導体
US9090600B2 (en) 2011-09-12 2015-07-28 Bayer Intellectual Property Gmbh Fungicidal 4-substituted-3-{phenyl[(heterocyclylmethoxy)imino]methyl}-1,2,4-oxadizol-5(4H)-one derivatives
AR087874A1 (es) 2011-09-16 2014-04-23 Bayer Ip Gmbh Uso de acilsulfonamidas para mejorar el rendimiento de las plantas
US20140378306A1 (en) 2011-09-16 2014-12-25 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of 5-phenyl- or 5-benzyl-2 isoxazoline-3 carboxylates for improving plant yield
CN103781352A (zh) 2011-09-16 2014-05-07 拜耳知识产权有限责任公司 苯基吡唑啉-3-甲酸酯类用于提高植物产量的用途
JP2014527973A (ja) 2011-09-23 2014-10-23 バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー 非生物的な植物ストレスに対する作用剤としての４−置換１−フェニルピラゾール−３−カルボン酸誘導体の使用
AU2012320554B2 (en) 2011-10-04 2017-11-09 Bayer Intellectual Property Gmbh RNAi for the control of fungi and oomycetes by inhibiting saccharopine dehydrogenase gene
WO2013050324A1 (de) 2011-10-06 2013-04-11 Bayer Intellectual Property Gmbh Abiotischen pflanzenstress-reduzierende kombination enthaltend 4- phenylbuttersäure (4-pba) oder eines ihrer salze (komponente (a)) und eine oder mehrere ausgewählte weitere agronomisch wirksame verbindungen (komponente(n) (b)
MX2014005976A (es) 2011-11-21 2014-08-27 Bayer Ip Gmbh Derivados de n-[(silil trisustituido)metil]-carboxamida fungicidas.
EP2784158A4 (en) * 2011-11-25 2015-08-05 Nat Inst Of Agrobio Sciences PLANT TRANSFORMANT, TRANSFORMATION PROCESS FOR PLANTS AND VECTOR USED IN THIS PROCEDURE
CN105906567B (zh) 2011-11-30 2019-01-22 拜耳知识产权有限责任公司 杀真菌的n-二环烷基和n-三环烷基(硫代)羧酰胺衍生物
BR112014015002A2 (pt) 2011-12-19 2017-06-13 Bayer Cropscience Ag uso de derivados de diamida de ácido antranílico para o controle de pragas em culturas transgênicas
BR112014015993A8 (pt) 2011-12-29 2017-07-04 Bayer Ip Gmbh composto, composição, método para o controle dos fungos, utilização dos compostos e processo para a produção das composições
KR102028903B1 (ko) 2011-12-29 2019-10-07 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 살진균 3-[(피리딘-2-일메톡시이미노)(페닐)메틸]-2-치환-1,2,4-옥사디아졸-5(2h)-온 유도체
PT2816897T (pt) 2012-02-22 2018-04-02 Bayer Cropscience Ag Utilização de fluopiram para controlar doenças da madeira em uvas
EP2819518B1 (en) 2012-02-27 2017-09-06 Bayer Intellectual Property GmbH Active compound combinations containing a thiazoylisoxazoline and a fungicide
WO2013139949A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield
WO2013153143A1 (en) 2012-04-12 2013-10-17 Bayer Cropscience Ag N-acyl- 2 - (cyclo) alkylpyrrolidines and piperidines useful as fungicides
CN104428294B (zh) 2012-04-20 2017-07-14 拜尔农科股份公司 N‑环烷基‑n‑[(杂环基苯基)亚甲基]‑(硫代)羧酰胺衍生物
US20150080337A1 (en) 2012-04-20 2015-03-19 Bayer Cropscience N-cycloalkyl-n-[(trisubstitutedsilylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives
EP2847170B1 (en) 2012-05-09 2017-11-08 Bayer CropScience AG Pyrazole indanyl carboxamides
EP2662364A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides
EP2662362A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole indanyl carboxamides
EP2662363A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides
EP2662361A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazol indanyl carboxamides
EP2662360A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides
WO2013167544A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Bayer Cropscience Ag 5-halogenopyrazole indanyl carboxamides
EP2662370A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides
AR091104A1 (es) 2012-05-22 2015-01-14 Bayer Cropscience Ag Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
CA2883574A1 (en) 2012-09-05 2014-03-13 Bayer Cropscience Ag Use of substituted 2-amidobenzimidazoles, 2-amidobenzoxazoles and 2-amidobenzothiazoles or salts thereof as active substances against abiotic plant stress
US9668480B2 (en) 2012-10-19 2017-06-06 Bayer Cropscience Ag Method for treating plants against fungi resistant to fungicides using carboxamide or thiocarboxamide derivatives
PL2908642T3 (pl) 2012-10-19 2022-06-13 Bayer Cropscience Ag Sposób wzmacniania tolerancji roślin na stres abiotyczny z zastosowaniem pochodnych karboksyamidowych lub tiokarboksyamidowych
US9801374B2 (en) 2012-10-19 2017-10-31 Bayer Cropscience Ag Active compound combinations comprising carboxamide derivatives
CN105357967B (zh) 2012-10-19 2019-02-19 拜尔农科股份公司 使用羧酰胺衍生物促进植物生长的方法
EP2735231A1 (en) 2012-11-23 2014-05-28 Bayer CropScience AG Active compound combinations
BR112015012473A2 (pt) 2012-11-30 2017-07-11 Bayer Cropscience Ag misturas binárias pesticidas e fungicidas
WO2014082950A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Bayer Cropscience Ag Ternary fungicidal mixtures
BR112015012519A2 (pt) 2012-11-30 2017-07-11 Bayer Cropscience Ag misturas ternárias fungicidas e pesticidas
UA117820C2 (uk) 2012-11-30 2018-10-10 Байєр Кропсайєнс Акцієнгезелльшафт Подвійна фунгіцидна або пестицидна суміш
WO2014083088A2 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Bayer Cropscience Ag Binary fungicidal mixtures
EP2740356A1 (de) 2012-12-05 2014-06-11 Bayer CropScience AG Substituierte (2Z)-5(1-Hydroxycyclohexyl)pent-2-en-4-insäure-Derivate
EP2928296A1 (de) 2012-12-05 2015-10-14 Bayer CropScience AG Verwendung substituierter 1-(arylethinyl)-, 1-(heteroarylethinyl)-, 1-(heterocyclylethinyl)- und 1-(cyloalkenylethinyl)-cyclohexanole als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress
EP2740720A1 (de) 2012-12-05 2014-06-11 Bayer CropScience AG Substituierte bicyclische- und tricyclische Pent-2-en-4-insäure -Derivate und ihre Verwendung zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen
WO2014090765A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Bayer Cropscience Ag Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops
AR093996A1 (es) 2012-12-18 2015-07-01 Bayer Cropscience Ag Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias
WO2014095677A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Bayer Cropscience Ag Difluoromethyl-nicotinic- tetrahydronaphtyl carboxamides
JP2016515100A (ja) 2013-03-07 2016-05-26 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト 殺菌性３−｛フェニル［（ヘテロシクリルメトキシ）イミノ］メチル｝−ヘテロ環誘導体
MX2015014365A (es) 2013-04-12 2015-12-07 Bayer Cropscience Ag Derivados de triazol novedosos.
US9550752B2 (en) 2013-04-12 2017-01-24 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Triazolinthione derivatives
CA2909725A1 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
US9554573B2 (en) 2013-04-19 2017-01-31 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Binary insecticidal or pesticidal mixture
TW201507722A (zh) 2013-04-30 2015-03-01 Bayer Cropscience Ag 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類
WO2014177514A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Bayer Cropscience Ag Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides
CN105636939B (zh) 2013-06-26 2018-08-31 拜耳作物科学股份公司 N-环烷基-n-[(二环基苯基)亚甲基]-(硫代)甲酰胺衍生物
AR096827A1 (es) 2013-07-09 2016-02-03 Bayer Cropscience Ag Uso de piridoncarboxamidas seleccionadas o sus sales como ingredientes activos contra estrés abiótico en plantas
EP2837287A1 (en) 2013-08-15 2015-02-18 Bayer CropScience AG Use of prothioconazole for increasing root growth of Brassicaceae
PL3041355T3 (pl) 2013-09-03 2017-10-31 Bayer Cropscience Ag Zastosowanie grzybobójczych substancji czynnych do kontrolowania Chalara fraxinea w drzewostanie jesionu
AU2014359208B2 (en) 2013-12-05 2018-10-04 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft N-cycloalkyl-N-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives
CN105873907B (zh) 2013-12-05 2019-03-12 拜耳作物科学股份公司 N-环烷基-n-{[2-(1-取代的环烷基)苯基]亚甲基}-(硫代)甲酰胺衍生物
EP2865267A1 (en) 2014-02-13 2015-04-29 Bayer CropScience AG Active compound combinations comprising phenylamidine compounds and biological control agents
EP2865265A1 (en) 2014-02-13 2015-04-29 Bayer CropScience AG Active compound combinations comprising phenylamidine compounds and biological control agents
AR101214A1 (es) 2014-07-22 2016-11-30 Bayer Cropscience Ag Ciano-cicloalquilpenta-2,4-dienos, ciano-cicloalquilpent-2-en-4-inas, ciano-heterociclilpenta-2,4-dienos y ciano-heterociclilpent-2-en-4-inas sustituidos como principios activos contra el estrés abiótico de plantas
AR103024A1 (es) 2014-12-18 2017-04-12 Bayer Cropscience Ag Piridoncarboxamidas seleccionadas o sus sales como sustancias activas contra estrés abiótico de las plantas
BR112017022000A2 (pt) 2015-04-13 2018-07-03 Bayer Cropscience Ag derivados de n-cicloalquil-n-(biheterocicliletileno)-(tio)carboxamida.
AU2017247937A1 (en) 2016-04-06 2018-10-04 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Combination of nuclear polyhedrosis virus and diamides
CA3032030A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Active compound combinations and methods to protect the propagation material of plants
US20190281828A1 (en) 2016-09-22 2019-09-19 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Novel triazole derivatives
BR112019005668A2 (pt) 2016-09-22 2019-06-04 Bayer Ag novos derivados de triazol
US20190261630A1 (en) 2016-10-26 2019-08-29 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Use of pyraziflumid for controlling sclerotinia spp in seed treatment applications
RU2755433C2 (ru) 2016-12-08 2021-09-16 Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт Применение инсектицидов для борьбы с проволочниками
EP3332645A1 (de) 2016-12-12 2018-06-13 Bayer Cropscience AG Verwendung substituierter pyrimidindione oder jeweils deren salze als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress
WO2018108627A1 (de) 2016-12-12 2018-06-21 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Verwendung substituierter indolinylmethylsulfonamide oder deren salze zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
WO2019025153A1 (de) 2017-07-31 2019-02-07 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Verwendung von substituierten n-sulfonyl-n'-aryldiaminoalkanen und n-sulfonyl-n'-heteroaryldiaminoalkanen oder deren salzen zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
BR112020024615A2 (pt) 2018-06-04 2021-03-02 Bayer Aktiengesellschaft benzoilpirazóis bicíclicos de ação herbicida
US11492642B2 (en) 2018-06-27 2022-11-08 Seminis Vegetable Seeds, Inc Restorer factor for the baccatum cytoplasmic male sterility system in pepper
US11516987B2 (en) 2018-06-27 2022-12-06 Seminis Vegetable Seeds, Inc. Baccatum cytoplasmic male sterility with female fertile flowers in Capsicum annuum
EP3826466A1 (en) 2018-07-26 2021-06-02 Bayer Aktiengesellschaft Use of the succinate dehydrogenase inhibitor fluopyram for controlling root rot complex and/or seedling disease complex caused by rhizoctonia solani, fusarium species and pythium species in brassicaceae species
WO2020057939A1 (en) 2018-09-17 2020-03-26 Bayer Aktiengesellschaft Use of the fungicide isoflucypram for controlling claviceps purpurea and reducing sclerotia in cereals
CN112714613A (zh) 2018-09-17 2021-04-27 拜耳公司 琥珀酸脱氢酶抑制剂氟吡菌酰胺用于在谷物中防治麦角菌和减少菌核的用途

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4956282A (en) * 1985-07-29 1990-09-11 Calgene, Inc. Mammalian peptide expression in plant cells
FI875467A (fi) * 1986-12-19 1988-06-20 Agricultural Genetics Co Dna-molekyler, som aer nyttiga vid vaextskydd.
GB8901677D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Hybrid seed production
NZ224787A (en) * 1987-05-26 1990-08-28 Calgene Inc A dna construct for specifically modifying the phenotype of fruit as distinct from other plant tissue
NZ227835A (en) * 1988-02-03 1992-09-25 Paladin Hybrids Inc Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
US5356799A (en) * 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
DE3810286A1 (de) * 1988-03-25 1989-10-12 Max Planck Gesellschaft Transgene pflanze mit modifizierter physiologie, morphologie und modifiziertem hormonmetabolismus, gewebekulturen dieser pflanze und verfahren zu ihrer herstellung
GB8810120D0 (en) * 1988-04-28 1988-06-02 Plant Genetic Systems Nv Transgenic nuclear male sterile plants
ATE195218T1 (de) * 1988-06-20 2000-08-15 Novartis Erfind Verwalt Gmbh Verfahren zur bekämpfung von pflanzenschädlingen mit nicht-pflanzlichen proteinase-inhibitoren
EP0456706B1 (en) * 1989-02-02 2005-05-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular methods of hybrid seed production
EP0412676B1 (en) * 1989-08-07 1995-06-07 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Method for producing the spiroplasma SP. DNA methylase
CA2071943C (en) * 1989-12-22 2007-04-24 Joan Tellefsen Odell Site-specific recombination of dna in plant cells

Also Published As

Publication number Publication date
AU625509B2 (en) 1992-07-16
EP1090999A3 (en) 2001-07-18
EP0412911A1 (en) 1991-02-13
IL95337A0 (en) 1991-06-30
HU906172D0 (en) 1991-07-29
PT94964A (pt) 1991-05-22
CA2039165A1 (en) 1991-02-21
IL121301A0 (en) 1998-01-04
HK1014738A1 (en) 1999-09-30
JP3720497B2 (ja) 2005-11-30
FI120156B (fi) 2009-07-15
EP0412911B1 (en) 2001-07-18
DK0412911T3 (da) 2001-10-29
AU6068890A (en) 1991-03-11
JP3105242B2 (ja) 2000-10-30
DE69033764D1 (de) 2001-08-23
IL121301A (en) 2001-01-11
PT94964B (pt) 1997-04-30
DE69034268D1 (de) 2011-03-03
JP3609654B2 (ja) 2005-01-12
ATE203276T1 (de) 2001-08-15
JPH03503004A (ja) 1991-07-11
JPH09182597A (ja) 1997-07-15
HUT58803A (en) 1992-03-30
DE69033764T2 (de) 2002-05-23
WO1991002069A1 (en) 1991-02-21
EP1090999A2 (en) 2001-04-11
ATE496135T1 (de) 2011-02-15
EP1090999B1 (en) 2011-01-19
CA2039165C (en) 2005-10-25
IE902911A1 (en) 1991-02-27
ZA906344B (en) 1991-06-26
IL95337A (en) 1998-01-04
JP2000050755A (ja) 2000-02-22
US6046382A (en) 2000-04-04
FI911728A0 (fi) 1991-04-10
GR3036893T3 (en) 2002-01-31
IE20020884A1 (en) 2003-07-23
ES2161681T3 (es) 2001-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU214927B (hu) Eljárás módosított virággal rendelkező növények előállítására
US5792929A (en) Plants with modified flowers
US5767374A (en) Plants with modified flowers seeds or embryos
EP0412006B1 (en) Plants with modified flowers, seeds or embryos
US6627799B1 (en) Plants with modified stamen cells
IE83457B1 (en) Plants with modified flowers
CA2223454A1 (en) Molecular methods of hybrid seed production
AU642454B2 (en) Expression of S-locus specific glycoprotein gene in transgenic plants
AU625509C (en) Plants with modified flowers