DK175585B1 - Hankönssteril plante, kultur af celler fra en plante, promoter, DNA samt celler, planter og planteceller indeholdende dette DNA og endvidere fremgangsmåde og moderplanter til produktion af frö - Google Patents

Description

i DK 175585 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hanskønssteril plante og forplantningsmate-riale deraf (fx frø), hvor cellerne er transformeret således, at en fremmed DNA-sekvens er stabilt integreret i kernegenomet. De hankønssterile planter ifølge den foreliggende opfindelse indeholder i alle deres celler en fremmed DNA-sekvens, 5 som indeholder mindst ét første fremmed DNA (i det følgende "hanskønssterili-tets-DNA"), der: 1) koder for et første RNA eller protein eller polypeptid, der, når det produceres eller overproduceres i en støvdragerceile i planten, væsentligt forstyrrer støvdragercellens metabolisme, funktion og/eller udvikling; og 2) er i den samme transkriptionelle enhed som og under kontrol af en første promotor, 10 der selektivt kan styre ekspression af det hankønssterile DNA i plantens støvdragerceller under forudsætning af at, hvis den første promotor er en promotor, som styrer selektiv ekspression af hankønssterilitets-DNA’et i mikrospore- og/eller pollenceller, si er det nukleære genom i plantens celler homomzygot. Opfindelsen angår især en sådan nukleær hankønssteril plante og forplantningsmateriale 15 deraf, hvor den fremmede DNA-sekvens ifølge opfindelsen er en fremmed, kimær DNA-sekvens, der også kan indeholde mindst ét andet fremmed DNA ("markør-DNA"), der: 1) koder for et andet RNA eller protein eller polypeptid, der, når det er ti! stede i det mindste i et specifikt væv eller specifikke celler i planten, gør hele planten nemt adskillelig fra andre planter, der ikke indeholder det andet RNA, 20 protein eller polypeptid i det mindste i det specifikke væv eller de specifikke celler; 2} er i den samme transkriptionelle enhed som og under kontrol af en anden promotor, der kan styre ekspression af markør-DNA'et i det mindste i det specifikke væv eller de specifikke celler i planten; og 3) er i det samme genetiske locus i plantecellernes kernegenom som hankønssterilitets-DNA'et.

25

Opfindelsen angår også en fremmed, kimær DNA-sekvens, der indeholder mindst ét hankønssterilitets-DNA under kontrol af den første promotor under forudsætning af, at den første promotor ikke er en mikrospore- og/eller pollen-specifik promotor, og som ved siden af hankønssterilitets-DNA'et også kan 30 indeholde mindst ét markør-DNA under kontrol af den anden promotor.

Opfindelsen angår yderligere en vektor, der indeholder den fremmede DNA-sekvens ifølge opfindelsen, og som er egnet til transformation af planteceller, hvorved den fremmede DNA-sekvens integreres stabilt i cellernes kernegenom DK 175585 B1 2 under forudsætning af at den første promotor ikke er en mikrospore- og/eller pollenspecifik promotor.

Opfindelsen angår yderligere planteceller og plantecellekulturer, hvor kerne-5 genomerne er transformeret med den fremmede DNA-sekvens.

Opfindelsen angår yderligere en fremgangsmåde til fremstilling af en kerne-hankønssteril plante og forplantningsmateriale deraf og cellekulturer deraf, der indeholder den fremmede DNA-sekvens, hvor hankønssterilitets-DNA'et: 1) er 10 under kontrol af den første promotor og eventuelt på det samme genetiske locus som markør-DNA'et under kontrol af den anden promotor; 2) er stabilt integreret i plantecellernes kernegenom; og 3) selektivt kan udtrykkes i plantens støvdrager-celler i form af det første RNA, protein eller polypeptid.

15 Opfindelsen angår yderligere en fremgangsmåde til fremstilling af hybride frø, der vokser til hybride planter, ved krydsning af: 1) den hankønsstenle plante ifølge opfindelsen, der i sit kernegenom omfatter markør-DNA'et, der fortrinsvis koder for et protein, der bibringer planten resistens mod et herbicid; og 2) en hankøns-fertil plante uden markør-DNA'et i genomet. Opfindelsen angår især en sådan 20 fremgangsmåde til fremstilling af hybride frø på kommerciel skala, fortrinsvis i en i det væsentlige tilfældig population, uden behov for omfattende manuelt arbejde.

Opfindelsen angår yderligere en tapetlagsspecifik promotor fra et plantegenom.

Denne promotor kan anvendes som den første promotor i den fremmede DNA-25 sekvens ifølge opfindelsen til transformering af planten for at gøre den kerne-hankønssteril.

OPFINDELSENS BAGGRUND

30 Hybridi5ering af planter er anerkendt som en vigtig proces til fremstilling af afkom med en kombination af moderplanternes ønskelige træk. Det resulterende hybridafkom har ofte evnen til at overgå moderplanterne med hensyn til forskellige træk såsom udbytte, tilpasning til miljømæssige forandringer og sygdomsresistens.

Denne evne betegnes "heterosis" eller "hybridvigør". Af den grund har 35 hybridisering været bredt anvendt til forbedring af hovedafgrøder såsom majs, 3 DK 175585 B1 sukkerroe og solsikke. Af forskellige grunde, der primært er relateret til den kendsgerning, at de fleste planter har evnen til både selvbestøvning og krydsbestøvning, har det været vanskeligt at opnå kontrolleret krydsbestøvning af planter uden betydelig selvbestøvning til fremstilling af en høst af hybride frø på 5 kommerciel skala.

I naturen producerer det overvældende flertal af afgrødeplanter hanlige og hunlige forplantningsorganer på samme plante, normalt i nærheden af hinanden i den samme blomst. Dette fremmer selvbestøvning. Nogen planter er imidlertid 10 undtagelser som resultat af deres forplantningsorganers særlige morfologi, der fremmer krydsbestøvning. Disse planter producerer hybride afkom med forbedret vigør og tilpasningsevne. Én sådan morfologi i Cannabis spp. (hamp) involverer hanlige og hunlige forplantningsorganer på hver sin plante. En anden sådan morfologi i Zea mays (majs) involverer hanlige og hunlige forplantningsorganer på 15 forskellige dele af samme plante. En anden sådan morfologi i Elaeis guineensis (oliepalme) involverer hanlige og fertile hunlige gameter, der bliver fertile på forskellige tidspunkter under plantens udvikling.

Visse andre plantearter såsom Ananas comosus (ananas) favoriserer krydsbestøv-20 ning via deres forplantningsorganers særlige fysiologi. Sådanne planter har udviklet et såkaldt "selv-inkompatibilitetssystem", hvorved én plantes pollen ikke kan befrugte den hunlige gamet i samme plante eller i en anden plante med samme genotype.

25 Visse andre plantearter begunstiger krydsbestøvning ved naturligt at udvise det såkaldte genomiske træk "hankønssterilitet". Ved dette træk degenererer planternes støvknapper, inden pollen, der fremstilles af støvknapperne, bliver modne.

Se: "Male-Sterility in Higher Plants", M.L.H. Kaul, 1987, i: "Monographs on Theoretical and Applied Genetics 10, udgivet af Springer Verlag. Et sådant 30 naturligt hankønssterilitetstræk formodes at være resultatet af en lang række naturlige mutationer, der som oftest involverer recessive mangler, og dette træk kan ikke nemt opretholdes i plantearter, der fortrinsvis selvbestøver, idet der ikke produceres frø under naturlige forhold.

4 DK 175585 B1 I naturen observeres 4 hovedtyper af hankønssterilitet. Samtlige 4 typer af hankønssterilitet anvendes i kommercielle forædlingsprogrammer til at sikre, at krydsbestøvning finder sted til fremstilling af hybride frø for afgrøder såsom majs, sukkerroe, raps og solsikke.

5

En type hankønssterilitet er kernekodet og formodes at være arvet som en recessiv allel. Til forædlingsformål vedligeholdes en recessiv hankønssteril moderplante ved at krydse den med en heterozygotisk hankønsfertil plante, der også omfatter den recessive hankønssterilitetsallel, således at afkommet er 50% io recessive hankønssterile planter. De andre 50% er hankønsfertile planter, der skal frasorteres i udavlsprogrammer, hvilket kun kan udføres effektivt, hvis den recessive hankønssterile allel er adskilt sammen med en markør, der kan selekteres eller screenes. I US 4,727,219 beskrives en fremgangsmåde til anvendelse af recessiv hankønssterilitet til fremstilling af hybrid majs.

15

En anden type hankønssterilitet er kernekodet, men arves som dominant allel. En fordel ved dominante, hankønssterile planter sammenlignet med recessive hankønssterile planter er, at de dominante, hankønssterile planter kan vedligeholdes ved krydsning med en hankønsfertil plante til fremstilling af afkom, der er 50% 20 dominante, hankønssterile planter. Anvendeligheden af denne dominante, kerne-hankønssterile plante er imidlertid begrænset, fordi dens dominante hankønssterilitetsallel i de fleste tilfælde ikke er tæt forbundet (dvs. inden for det samme genetiske locus) med en markør, der kan selekteres eller screenes.

25 En tredje type hankønssterilitet er cytoplasmatisk kodet. I de fleste tilfælde er den cytoplasmiske kode i plantens mitokondriegenom og kun i fa tilfælde er koden i plantens kloroplastgenom. Cytoplasmatisk kodet hankønssterilitetsarvelighed følger ikke Mendelske regler, men afhænger snarere af cytoplasmiske faktorer.

Afkommet opnået fra krydsninger mellem cytoplasmisk hankønssterile planter og 30 hankønsfertile planter bærer alle det cytoplasmiske hankønssterilitetsgen og er derfor sterile. Som resultat er afkommet af planter af denne type kun af kommerciel værdi, hvis afkommets økonomiske produkt ikke anvendes som frø, men snarere som planter såsom prydplanter og sukkerroer.

5 DK 175585 B1

En fjerde type hankønssterilitet er resultatet af en kombination af både kernekodet hankønssterilitet og cytoplasmatisk kodet hankønssterilitet. De hankønssterilitets-inducerende kernealleler er sædvanligvis recessive, og kun planter, der indeholder den hankønssterilitetscytoplasmiske alle!, og som er homozygotiske for 5 den hankønssterilitetsinducerende kerneallel, er fænotypisk hankønssterile. I denne type planter fører tilsvarende dominante, hankønsfertili-tetsinducerende alleler eller "fertilitetsgenvindere" til en hankønsfertil fænotype. Som resultat kan denne plantetypes hankønssterile afkom gøres hankønsfertile ved at bestøve de hankønssterile planter med pollen, der indeholder fertilitetsgenvindere. Som 10 resultat er afkommet af planter af denne type af kommerciel værdi, hvor det økonomiske produkt er frø, dvs. planter såsom majs, durra og solsikke.

Fremstilling af hybride frø er typisk blevet udført ved dyrkning i stor skala af cytoplasmisk hankønssterile planter og hankønsfertile planter og ved på én eller 15 anden måde (fx med en særpræget markør) at forhindre de resulterende hybride frø i at blive blandet med ikke-hybride frø. Ifølge US 3,842,538 adskilles hybride frø langsommeligt fra ikke-hybride frø på basis affarve. Ifølge US 4,351,130 undgås problemet med hensyn til at adskille hybride frø fra ikke-hybride frø ved at anvende korte, hankønssterile planter og høje, hankønsfertile planter og 20 efterfølgende ødelægge de høje, hankønsfertile planter efter bestøvning. Ifølge US 4,658,085, 4,517,763 og 4,658,084 forsynes cytoplasmisk hankønssterile planter med en herbicidtolerance, der mangler hos de hankønsfertile planter, der destrueres med herbicidet efter bestøvning. Ifølge US 4,305,225 sprøjtes hankønssterile risplanter med et væksthormon (fx gibberellin) for at forårsage en mere fuldstæn-25 dig vækst af blomsterbærende toppe fra risbladskeder, hvorved blomsternes evne til at modtage pollen fra hankønsfertile planter øges.

Ved alle sådanne fremgangsmåder til fremstilling af hybride frø ud fra hankønssterile planter er der søgt metoder til enkelt og billigt på kommerciel skala at opnå: 30 1) høj produktion af hybride frø fra hver hankønssteril plante; 2) en hybrid frøpopulation, der næsten udelukkende stammer fra pollen af hankønsfertil planter og æg af hankønssterile planter, og som i det væsentlige er fri for ikke-hybride frø fra hankønsfertile planter; 3) nem produktion af både de hankønssterile og hankønsfertile planter; og 4) den stort set fuldstændige 6 DK 175585 B1 fjernelse eller destruktion af enten de hankønsfertile planter, efter at de har bestøvet de hankønssterile planter, eller den selektive adskillelse af ikke-hybride frø fremstillet af de hankønsfertile planter fra de hybride frø fremstillet af de hankønssterile planter.

5

Man har ved genmanipulation gjort bestræbelser på at tilvejebringe nyttige hankønssterile karakteristika i planter. Se for eksempel: Advanced Genetic Sciences, EPO-A 0 198 288, som blandt andet beskriver: Transformation af nukleære hankønssterile planter med DIMA, der koder for en markør; og 10 anvendelsen af krydsformeringsteknikker til tilvejebringelse af planter, hvori markør DNA er nært bundet til endogent DNA, der koder for nukleær hankønssterilitet.

Paladin Hybrider, EP-A-0 329 308 som blandt andet beskriver: Transformation af 15 planter med en fremmed kimær DNA-sekvens, der omfatter: a) en pollenspecifik promotor koblet til et DNA der koder for cytotoxin; b) en promotor der er koblet til et antisense DNA-fragment af et gen, der er "kritisk for pollendannelse eller -funktion"; 20 c) en promotor fra et gen, der er "kritisk for pollendannelse eller -funktion", hvilken promotor er koblet til et antisense DNA-fragment af et gen, der også er til stede i planten og som påfører resistens over for et herbicid eller fysiologisk stress.

25 KORT BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

Opfindelsen tilvejebringer en hankønssteril plante, der indeholder et fremmed DNA som er inkorporeret i kernegenomet i dens celler, hvilket fremmed DNA omfatter: 30 (a) et hankønssterilitets-DNA, der koder for et første RNA, protein eller polypeptid, der, når det produceres eller overproduceres i støvdragerceller i planten, er i stand til at slå cellerne ihjel eller er i stand til at gøre dem ubrugbare for at 35 forhindre dannelsen af fertile hankønsgameter; og 7 DK 175585 B1 (b) en første promotor, der selektivt selektivt kan styre genekspression i plantens støvdragerceller, idet hankønssterilitets-DNA'et er i den samme transkriptionelle 5 enhed som og under kontrol af den første promotor, under forudsætning af, at hvis den første promotor er en promotor, som styrer ekspression af det hankønssterile DNA selektivt i mikrospore- og/eller pollenceller, så er det nukleære genom i plantens celler homozygot 10 Den første promotor styrer fortrinsvis ekspressionen i celler i støvknappen, særligt i tapetets eller støvknappens epidermisceller. Det hankønssterile DNA koder fortrinsvis for en ribonuklease, såsom barnase.

I yderligere overensstemmelse med denne opfindelse tilvejebringes et DNA, 15 såsom et nukleært DNA fra en celle eller en plante, hvilket DNA indeholder et første kimære DNA som omfatter: et hankønssterilitets-DNA, der koder for et første RNA, protein eller polypeptid, der, når det produceres i støvdragerceller i en plante, er i stand til at slå cellerne ihjel eller er i stand ti! at gøre dem ubrugbare for at forhindre dannelsen af fertile hankønsgameter; en første promotor, der 20 selektivt styrer genekspression i plantens støvdragerceller, idet hankønssterilitets-DNA'et er i den samme transkriptionelle enhed som og under kontrol af den første promotor, under forudsætning af at den første promotor ikke er en mikrospore-og/eller pollenspecifik promotor.

25 En sådan første promotor kontrollerer fortrinsvis ekspression i støvknapceller, særligt i tapetet eller i støvknappens epidermale celler. Hankønssterilitets-DNA'et koder fortrinsvis for en ribonuklease såsom barnase DNA ifølge den foreliggende opfindelse kan også indeholde et andet kimært DNA 30 som omfatter: (c) et markør-DNA, der koder for et andet RNA, protein eller polypeptid, som, når det er til stede i det mindste i et specifikt væv eller specifikke celler i planten, gør planten nemt 35 adskillelig fra andre planter, der ikke indeholder 8 DK 175585 B1 det andet RNA, protein eller polypeptid i det mindste i det specifikke væv eller de specifikke celler; og (d) en anden promotor, der kan styre ekspression af markør-DNA'et i 5 det mindste i det specifikke væv eller de specifikke celler, idet markør-DNA'et er i den samme transkriptionelle enhed som og under kontrol af den anden promotor.

Markør-DNA'et er fortrinsvis et herbicidresistensgen.

10 DNA'et ifølge den foreliggende opfindelse kan yderligere indeholde mindst ét yderligere DNA, der koder for et transit peptid, der kan transportere det første protein eller polypeptid eller det andet protein eller polypeptid ind i en kloroplast eller et mitokondrie af en plantecelle, hvor den fremmede, kimære DNA-sekvens 15 udtrykkes i cytoplasmaet.

I overensstemmelse med opfindelsen tilvejebringes yderligere: en celle fra en plante, en plantecellekultur, en plante, og et frø fra en plante der indeholder DNA'et ifølge den foreliggende opfindelse; og et par af moderplanter der omfatter 20 a) en hankønssteril moderplante indeholdende DNA'et ifølge den foreliggende opfindelse, og b) en hankønsfertil moderplante.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse tilvejebringes yderligere en fremgangsmåde til fremstilling af en hankønssteril plante og reproduktionsmateri-25 aler, fx frø, ved transformering af en celle fra en plante med et DNA, der omfatter det hankønssterile DNA under kontrol af den første promotor, regenerering af den hankønssterile plante fra den transformerede plantecelle og eventuelt tilvejebringelse af reproduktionsmaterialet eller afkommet af den hankønssterile plante.

30 I yderligere overensstemmelse med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af et frø fra en plante som er en frødannende og hankønssteril plante, hvilken fremgangsmåde omfatter: - krydsbestøvning af i) hankønssterile, frødannende planter ifølge den 35 foreliggende opfindelse, indføjelse af hankønssterilitets-DNA'et i det nukleære 9 DK 175585 B1 genom i alle deres celler under kontrol af den første promotor og et markør-DNA, som er et gen der påfører resistens over for et herbicid, eller som er et gen, der koder for et modificeret målenzym for et herbicid, under kontrol af den anden promotor, og ii) hankønsfertile planter uden markør-DNA'et og den anden 5 promotor, - påføring af herbicidet på planterne for at eliminere hankønsfertile planter, - indsamling af frøene fra de bestøvede hankønssterile planter.

I yderligere overensstemmelse med denne opfindelse tilvejebringes en 10 fremgangsmåde til dyrkning af en indavlet linie af hankønssterile, frødannende planter ifølge denne opfindelse, hvilke planter indeholder, inkorporeret i det nukleære genom i alle deres celler i heterocygot form, det hankønssterile DNA under kontrol af den første promotor og et markør-DNA, som er et gen der påfører resistens over for et herbicid eller et gen der koder for et modificeret 15 målenzym for herbicidet, og som er under kontrol af den anden promotor, hvilken fremgangsmåde omfatter: - krydsbestøvning af i) hankønssterile planter fra den indavlede line, og ii) hankønsfertile planter fra den indavlede linie uden markør DNA'et og den anden 20 promotor, og, efter krydsbestøvning, - opnåelse af frø fra de hankønssterile planter, - dyrkning af disse frø til planter og - påføring af herbicidet på planterne for at eliminere hankønssterile planter.

25 I endnu yderligere overensstemmelse med opfindelsen tilvejebringes en tapetlagsspecifik promotor.

Endelig tilvejebringes et par af moderplanter til produktion af frø omfattende: a) en hankønssteril moderplante, der indeholder DNA'et ifølge opfindelsen, og b) en 30 hankønsfertil moderplante.

35 10 DK 175585 B1

DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN

I overensstemmelse med opfindelsen fremstilles en hankønssteril plante ud fra en enkelt plantecelle ved transformation af plantecellen på velkendt måde, således at 5 den fremmede DNA-sekvens ifølge opfindelsen stabilt indsættes i cellens kernegenom. Den fremmede DNA-sekvens omfatter mindst ét hankønssteri)itets-DNA, der er under kontrol af og ved sin 5'-ende sammensmeltet med den første promotor og ved sin 3’-ende sammensmeltet med egnede signaler til transkrip-tionsregulation (herunder et polyadenylationssignal). Derved produceres eller 10 overproduceres selektivt det første RNA, protein eller polypeptid i plantens støvdragerceller, således at planten gøres hankønssteril. Den fremmede DNA-sekvens omfatter også fortrinsvis mindst ét markør-DNA, der er under kontrol af og ved sin 5’-ende sammensmeltet med den anden promotor og ved sin 3‘-ende sammensmeltet med egnede signaler til transkriptionsregulation (herunder et 15 polyadenylationssignal). Markør-DNA'et er fortrinsvis på det samme genetiske locus som hankønssteriliteten, hvorved det andet RNA, protein eller polypeptid fremstilles i det mindste i det specifikke væv eller de specifikke celler i planten, således at planten nemt kan kendes og/eller adskilles fra andre planter, der ikke indeholder det andet RNA, protein eller polypeptid i det specifikke væv eller de 20 specifikke celler. Dette garanterer med en høj grad af sikkerhed den fælles segregation af både hankønssterilitets-DNA’et og markør-DNA'et til plantens afkom.

Cellen af en plante (især af en plante, der kan inficeres med Agrobacterium) 25 tranformeres fortrinsvis i overensstemmelse med opfindelsen under anvendelse af en vektor, der er et svækket Ti-plasmid, der indeholder den fremmede DNA-sekvens og bæres af Agrobacterium. Denne transformation kan udføres under anvendelse af metoder, der fx er beskrevet i EP 0 116 718 og EP 0 270 822.

Foretrukne Ti-plasmidvektorer indeholder den fremmede DNA-sekvens mellem 30 grænsesekvenserne eller i det mindste til venstre for den højre grænsesekvens af Ti-plasmidets T-DNA. Naturligvis kan andre typer vektorer anvendes til at transformere plantecellen under anvendelse af metoder såsom direkte genoverførsel (som beskrevet i fx EP 0 223 247), pollenmedieret transformation (som beskrevet i fx EP 0 270 356, PCT WO85/01856 og EP 0 275 069), protoplasttrans-35 formation in vitro (som beskrevet i fx US 4,684,611), plante-RNA-virusmedieret 11 DK 175585 B1 transformation (som beskrevet i fx EP 0 067 553 og US 4,407,956) og liposom-medieret transformation (som beskrevet i fx US 4,536,475).

En kernehankønssteril plante ifølge opfindelsen tilvejebringes fortrinsvis ved 5 transformation af en plantecelle med en svækket Ti-plasmidvektor, der indeholder den fremmede DNA-sekvens med både et hankønssterilitets-DNA under kontrol af en første promotor og et markør-DNA under kontrol af en anden promotor. Markør-DNA’et kan være opstrøms eller nedstrøms fra hankønssterilitets-DNA'et i Ti-plasmidvektoren, men det foretrækkes, at de to ligger ved siden af hinanden 10 og befinder sig mellem grænsesekvenserne eller i det mindste befinder sig til venstre for Ti-plasmidvektorens højre grænsesekvens, således at de på ret vis sammen overføres til plantecellens kernegenom. Om ønsket kan cellen imidlertid først transformeres med en fremmed DNA-sekvens, der indeholder et hankønssterilitets-DNA og en første promotor, og kan efterfølgende transformeres med et 15 markør-DNA og en anden promotor, der sættes ind på det samme genetiske locus i cellens kernegenom som hankønssterilitets-DNA’et. Egnede vektorer til dette formål er de samme som sådanne, der er nævnt ovenfor til transformation af celler med den fremmede DNA-sekvens. Den foretrukne vektor er en svækket Ti-plasmidvektor.

20

Valget af hankønssterilitets-DNA’et er ikke afgørende. Et egnet hankønssterilitets-DNA kan vælges og isoleres på velkendt måde, således at det koder for det første RNA, protein eller polypeptid, der signifikant forstyrrer den rette metabolisme, funktion og/eller udvikling af en hvilken som helst støvdragercelle, hvor hankøns-25 sterilitets-DNA'et udtrykkes, hvilket fortrinsvis fører til, at en hvilken som helst sådan støvdragercelle dør. Foretrukne eksempler på hankønssterilitets-DNA'er er DNA’er, der koder for: RNaser såsom RNase TI (som nedbryder RNA-molekyler ved hydrolyse af bindingen efter en hvilken som helst guaninrest) og Barnase; DNaser såsom endonuclease (fx EcoRI); eller proteaser såsom et papain (fx 30 papainzymogen og papainaktivt protein).

Andre eksempler på hankønssterilitets-DNA'er er DNA’er, der koder for enzymer, der katalyserer syntesen af fytohormoner såsom: isopentenyltransferase, som er et enzym, der katalyserer det første trin i cytokininbiosyntese, og er kodet for af 35 gen 4 i Agrobacterium T-DNA; og de enzymer, der er involveret i auxinsyntesen, DK 175585 B1 12 og er kodet for af gen 1 og gen 2 i Agrobacterium T-DNA. Yderligere eksempler på hankønssterilitets-DNA'er er DNA'er, der koder for: glucanaser; lipaser såsom phospholipase A2 (Verheij et al. (1981) Rev. Biochem. Pharmacol. 91, 92-203); lipidperoxidaser; eller plante-cellevæginhibitorer. Yderligere eksempler på 5 hankønssterilitets-DNA’er er DNA'er, der koder for proteiner, der er toksiske for planteceller, såsom et bakterielt toksin (fx B-fragmentet af diphtheritoksin eller botulin).

Endnu et eksempel på et hankønssterilitets-DNA er et antisense-DNA, der koder 10 for en DNA-streng, der er komplementær til en DNA-streng, der naturligt bliver transkriberet i plantens støvdragerceller under kontrol af en endogen promotor som beskrevet fx i EP 0 223 399. Et sådant antisense-DNA kan transkriberes ind i en RNA-sekvens, der kan binde til den kodende og/eller ikke-kodende del af et RNA, der naturligt produceres i støvdragercellen, således at translation af det 15 naturligt producerede RNA hæmmes. Et eksempel på et sådant antisense-DNA er TA29-genets antisense-DNA (beskrevet i eksempel 2), som udtrykkes naturligt under kontrol af TA29-promotoren i tapetlagsceiler i planters støvknapper.

Et yderligere eksempel på et hankønssterilitets-DNA er et DNA, der koder for et 20 specifikt RNA-enzym (dvs. et såkaldt "ribozym"), der højt specifikt kan skære en given målsekvens, som beskrevet af Haseloff og Gerlach (1988) Nature 334, 585-591. Et sådant ribozym er fx det ribozym, der er rettet mod RNA'et, der er kodet for af TA29-genet.

25 Andre eksempler på hankønssterilitets-DNA'er er DNA'er, der koder for produkter, der kan gøre støvdragercellerne modtagelige over for specifikke sygdomme såsom svampeinfektioner. Et sådant hankønssterilitets-DNA kan anvendes i en plante, hvor alle andre celler, hvor hankønssterilitets-DNA'et ikke udtrykkes, er resistente over for den specifikke sygdom.

30

Med "fremmed" med hensyn til den fremmede DNA-sekvens ifølge opfindelsen menes, at den fremmede DNA-sekvens indeholder et fremmed hankønssterilitets-DNA og/eller en fremmed første promotor. Med "fremmed" med hensyn til et DNA såsom et hankønssterilitets-DNA og en første promotor samt et markør-DNA og 35 en anden promotor og et hvilket som helst andet DNA i den fremmede DNA- 13 DK 175585 B1 sekvens menes, at et sådant DNA ikke er i det samme genomiske miljø i en plantecelle, der er tranformeret med et sådant DNA ifølge opfindelsen, som et sådant DNA, der findes naturligt i cellen i den plante, den bakterie, det dyr, den svamp, det virus eller lignende, hvorfra et sådant DNA stammer. Dette betyder fx, 5 at et fremmed hankønssterilitets-DNA eller markør-DNA kan være: 1) et kerne-DNA i en stam- plante; 2) endogen til den transformerede plantecelle (dvs. fra en stamplante med den samme genotype som den plante, der transformeres); og 3) inden for den samme transkriptionelle enhed som dets egen endogene promotor og 3'-ende-signaler til transkriptionsregulation (fra stamplanten) i den fremmede 10 DNA-sekvens ifølge opfindelsen i den transformerede plantecelle; men 4) indsat et andet sted i den transformerede plantecelles kernegenom, end det var i stamplanten, således at det i den transformerede plantecelle ikke er omgivet af de gener, der omgav det naturligt i stamplanten. Et fremmed hankønssterilitets- eller markør-DNA kan fx også være: 1) et kerne-DNA i en stamplante; og 2) endogen 15 til den transformerede plantecelle; men 3) i den samme transkriptionelle enhed som en anden (dvs. ikke dets egen) endogen promotor og/eller 3'-endesignaler til transkriptionsregulation i en fremmed, kimær DNA-sekvens ifølge opfindelsen i en transformeret plantecelle. Et fremmed hankønssterilitets- eller markør-DNA kan fx også være: 1) et kerne-DNA i en stamplante; og 2) endogen til den transforme-20 rede plantecelle; men 3) i den samme transkriptionelle enhed som en heterolog promotor og/eller 3'-ende-signaIer til transkriptionsregulation i en fremmed, kimær DNA-sekvens ifølge opfindelsen i en transformeret plantecelle. Et fremmed hankønssterilitets- eller markør-DNA kan fx også være heterolog til den transformerede plantecelle og i den samme transkriptionelle enhed som en endogen 25 promotor og/eller 3' -signaler til transkriptionsregulation (fx fra kernegenomet af en plante med den samme genotype som den plante, der transformeres) i en fremmed, kimær DNA-sekvens ifølge opfindelsen i en transformeret plantecelle. Et fremmed hankønssterilitets-DNA kunne fx stamme fra kernegenomet af en plante med den samme genotype som den plante, der transformeres, og kode for et 30 katalytisk enzym såsom en protease eller ribonuclease, der er endogen til støvdragerceller i den plante, der transformeres, således at enzymet overproduceres i transformerede støv-dragerceller, hvorved cellernes metabolisme, funktion og/eller udvikling forstyrres signifikant. Hankønssterilitets-DNA'et og markør-DNA’et er hver især fortrinsvis heterologe til den plantecelle, der transformeres.

35 14 DK 175585 B1

Med "heterolog" med hensyn til et DNA såsom et hankønssterilitets-DNA, en første promotor, et markør-DNA, en anden promotor og et hvilket som helst andet DNA i den fremmede DNA-sekvens menes, at et sådant DNA ikke findes naturligt i kernegenomet i celler i en plante med den samme genotype som den plante, der 5 transformeres. Eksempler pa heterologe DNA'er er kloroplast- og mitokondrie-DNA'er vundet fra en plante med den samme genotype som den plante, der transformeres, men foretrukne eksempler er kloroplast-, mitokondrie- og kerne-DNA’er fra planter med en anden genotype end den plante, der transformeres, DNA'er fra dyr- og bakteriegenomer, og kromosom- og plasmid-DNA’er fra 10 svampe- og virusgenomer.

Med "kimær" med hensyn til den fremmede DNA-sekvens ifølge opfindelsen menes, at mindst ét af dens hankønssterilitets-DNA’er: 1) ikke findes naturligt under kontrol af dens første promotor for det ene hankønssterilitets-DNA: og/eller 15 2) ikke findes naturligt på det samme genetiske locus som mindst ét af dens markør-DNA'er. Eksempler på fremmede, kimære DNA-sekvenser ifølge opfindelsen omfatter: et hankønssterilitets-DNA af bakteriel afstamning under kontrol af en første promotor af planteafstamning; og et hankønssterilitets-DNA af plante-afstamning under kontrol af en første promotor af planteafstamning og på det 20 samme genetiske locus som et markør-DNA af bakteriel afstamning.

For at hankønssterilitets-DNA'et kan udtrykkes selektivt i en plantes støvdragerceller, foretrækkes det, at den første promotor, der kontrollerer hankønssterili-tet5-DNA’et i den fremmede DNA-sekvens, er en promotor, der selektivt kan styre 25 genekspression i plantens støvdragerceller. (Med "støvdrager" menes det organ i blomsten, der producerer den hanlige gamet, og som omfatter en støvknap og en støvtråd). En sådan støvdragerspecifik promotor kan være en endogen promotor eller en eksogen promotor og kan stamme fra kernegenomet eller fra mitokondrie- eller kloroplastgenomet af en plantecelle. I alle tilfælde er den første 30 promotor fremmed over for kernegenomet i den plantecelle, der transformeres.

Den første promotor forårsager fortrinsvis, at hankønssterilitets-DNA'et kun udtrykkes i støvknap-, pollen- elfer støvtrådsceller, især i tapetlagsceller eller støvknapepidermisceller. Den første promotor kan vælges og isoleres på velkendt måde fra den planteart, der skal gøres hankønssteril, således at den første 35 promotor selektivt styrer ekspression af hankønssterilitets-DNA'et i støvdrager- 15 DK 175585 B1 celler, således at støvdrageren dræbes eller gøres uvirksom, og således at planten gøres ude af stand til at producere fertile, hanlige gameter. Den første promotor vælges og isoleres fortrinsvis også således, at den er effektiv til at forhindre ekspression af hankønssterilitets-DNA’et i andre plantedele, der ikke er involveret 5 i produktion af fertil pollen, især i plantens hunlige organer. Fx kan en egnet, endogen, støv-dragerspecifik første promotor identificeres og isoleres i en plante, der skal gøres hankønssteril, ved: 1. søgning efter et mRNA, der kun er til stede i planten under 10 udvikling af dens støvdrager, fortrinsvis dens støvknapper, pollen eller støvtråd; 2. isolering af dette støvdragerspecifikke mRNA; 15 3. fremstilling af et cDNA ud fra dette støvdragerspecifikke mRNA; 4. anvendelse af dette cDNA som probe til identificering af de regioner i plantegenomet, der indeholder DNA, der koder 20 for det støvdragerspecifikke mRNA; og derefter 5. identificering af den del af plantegenomet, der er opstrøms (dvs. 5‘) fra det DNA, der koder for det støvdragerspecifikke mRNA, og der indeholder dette DNA's promotor.

25

Eksempler på sådanne første promotorer er TA29-promotoren, TA26-promotoren og TA13-promotoren, der er beskrevet nedenfor i eksemplerne, hvilke promotorer er isoleret fra tobak og er tapetlagspecifikke promotorer. En anden tapetlagsspeci-fik, første promotor fra en anden planteart kan isoleres fra sit genom under an-30 vendelse af TA29-, TA26- og TA13-genet som probe som i trin 4 ovenfor. Under hybridiseringsbetingelser vil en sådan probe hybridisere til DNA, der koder for et tapetlagsspecifikt mRNA, i en blanding af DNA-sekvenser fra genomet af den anden planteart (Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual.

Cold Spring Harbor Laboratory). Derefter kan den anden tapetlagsspecifikke, 35 første promotor identificeres som i trin 5 ovenfor.

16 DK 175585 B1

Hvis mere end ét hankønssterilitets-DNA er til stede i den fremmede DNA-sekvens ifølge opfindelsen, kan samtlige hankønssterilitets-DNA’er være under kontrol af en enkelt første promotor, men det foretrækkes, at hvert hankønssterilitets-DNA 5 er under kontrol af sin egen separate første promotor. Når flere hankønssterili-tets-DNA'er er til stede i den fremmede DNA-sekvens, kan hankønssterilitets-DNA’et også kode for det samme eller forskellige første RNA'er, polypeptider og proteiner. Fx, når hankønssterilitets-DNA’et koder for en RNase såsom RNase TI, foretrækkes det, at mindst 3, fortrinsvis 4-6, kopier af hankønssterilitets-DNA’et 10 og dets første promotor tilvejebringes i den fremmede DNA-sekvens. I alle tilfælde er samtlige hankønssterilitets-DNA’er og den første promotor eller de første promotorer deraf fortrinsvis ved siden af hinanden i den fremmede DNA-sekvens og i en hvilken som helst vektor, der anvendes til transformation af planteceller med den fremmede DNA-sekvens.

15

Heller ikke valget af markør-DNA’et er afgørende. Et egnet markør-DNA kan vælges og isoleres på velkendt mide, således at det koder for et andet RNA, protein eller polypeptid, der muliggør, at planter, der udtrykker markør-DNA’et, nemt kan kendes og adskilles fra planter, der ikke udtrykker det andet RNA, protein eller 20 polypeptid. Eksempler på markør-DNA’er er markør-DNA’er, der koder for proteiner, der kan tilvejebringe en skelnelig farve i planteceller, fx Al-genet, der koder for dihydroquercetin-4-reductase (Meyer et al. (1987) Nature 330, 677-678)) og glucuronidasegenet (Jefferson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA ("PNAS") 83, 8447), eller som tilvejebringer et specifikt morfologisk træk til 25 planten såsom dværgvækst eller en anden bladform. Andre eksempler på markør-DNA'er er markør-DNA’er, der bibringer planten: stresstolerance såsom den tolerance, der tilvejebringes af det gen, der koder for superoxiddismutase som beskrevet i EP 88/402222.9; sygdoms- eller skadedyrsresistens såsom resistens tilvejebragt af et gen, der koder for et Bacillus thuringiensis-endotoksin, der 30 bibringer insektresistens, som beskrevet i EP 86/300291.1, eller et gen, der koder for et bakterielt peptid, der bibringer bakterieresistens, som beskrevet i EP 88/401673.4.

Foretrukne markør-DNA’er koder for andre proteiner eller polypeptider, der 35 hæmmer eller neutraliserer virkningen af herbicider, fx: s/r-genet og sfrv-genet, 17 DK 175585 B1 der koder for enzymer, der giver resistens over for glutaminsyntetaseinhibitorer såsom Biolaphos og phosphinothricin, som beskrevet i EP 87/400,544.0; gener, der koder for modificerede målenzymer for visse herbicider, hvilke enzymer har en lavere affinitet for herbiciderne end naturligt fremstillede endogene enzymer, 5 fx en modificeret glutaminsyntetase som mål for phosphinothricin som beskrevet i EP 0 240 792 og en modificeret 5-enolpyru-vylshikimat-3-phosphatsyntase som mål for glyphosat som beskrevet i EP 0 218 571.

Den anden promotor, der kontrollerer markør-DNA'et, kan også vælges og 10 isoleres på velkendt måde, således at markør-DNA'et udtrykkes enten selektivt i ét eller flere specifikke væv eller én eller flere specifikke celler eller konstitutivt i hele planten efter ønske afhængig af arten af det andet RNA, protein eller polypeptid, der kodes for af markør-DNA’et. Fx, hvis markør-DNA’et koder for en herbicidresistens, kan det være nyttigt, at markør-DNA’et udtrykkes i alle 15 plantens celler under anvendelse af en stærk konstitutiv anden promotor såsom en 35S-promotor (Odeli et al. (1985) Nature 313, 810-812), et 35S’3-promotor (Hull og Howell (1987) Virology 86, 482-493), promotoren af nopalinsyntetase-genet ("PNOS") af Ti-plasmidet (Herrera-Estrella (1983) Nature 303, 209-213) eller promotoren af octopinsyntasegenet ("POCS” [De Greve et al. (1982) J. Mol.

20 Appl. Genet. 1 (6), 499-511]), Hvis markør-DNA’et koder for et protein, der giver sygdomsresistens, kan det være nyttigt, at markør-DNA'et udtrykkes selektivt i sårvæv under anvendelse af fx en TR-promotor såsom ΤΊ-plasmidets TRI’- eller TR2'-promotor (Velten et al. (1984) EMBO J. 3, 2723-2730). Hvis markør-DNA’et koder for en herbicidresistens, kan det være nyttigt, at markør-DNA’et udtrykkes 25 selektivt i grønt væv under anvendelse af fx promotoren af det gen, der koder for Rubisco's lille underenhed (EP 87/400,544.0). Hvis markør-DNA’et koder for et pigment, kan det være nyttigt, at markør-DNA’et udtrykkes i specifikke celler såsom kronbladsceller, bladceller eller frøceller, fortrinsvis i frøskallens yderste lag.

30

En vævsspecifik anden promotor for en plante, der skal gøres hankønssteril og nemt skelnelig fra ikke-transformerede planter, kan på velkendt måde identificeres og isoleres ved: 35 1. søgning efter et mRNA, som kun er til stede i planten under 18 DK 175585 B1 udvikling af et bestemt væv såsom plantens kronblade, blade eller frø; 2. isolering af dette vævsspecifikke mRNA; 5 3. fremstilling af et cDNA ud fra dette vævsspecifikke mRNA; 4. anvendelse af dette cDNA som probe til identificering af plantegenomets regioner, der indeholder DNA, der koder for 10 det vævsspecifikke mRNA; og derefter 5. identificering af den del af plantegenomet, der er opstrøms fra det DNA, der koder for det vævsspecifikke mRNA, og der indeholder DNA'ets promotor.

15

Hvis mere end ét markør-DNA er til stede i den fremmede DNA-sekvens ifølge opfindelsen, kan samtlige markør-DNA'er være under kontrol af en enkelt anden promotor, men det foretrækkes, at hvert markør-DNA er under kontrol af sin egen separate anden promotor. Hvert markør-DNA er især under kontrol af sin egen 20 anden promotor og koder for et forskelligt andet RNA, protein eller polypeptid, der tilvejebringer forskellige skelnelige træk i en transformeret plante. I alle tilfælde bør markør-DNA'et eller markør-DNA'erne og den anden promotor eller de andre promotorer være nabo til hinanden og til ét eller flere hankønssterile DNA'er, der er indeholdt i den fremmede DNA-sekvens ifølge opfindelsen og i en hvilken som 25 helst vektor, der anvendes til transformation af planteceller med den fremmede DNA-sekvens.

Det foretrækkes normalt, at det første RNA, protein eller polypeptid, der kodes for af hankønssterilitets-DNA'et, signifikant forstyrrer støvdragercellernes metabolis-30 me, funktion og/eller udvikling ved påvirkning af støvdragercellernes cytoplasma eller kerne. Nar det ønskes, at det første protein eller polypeptid og/eller det andet protein eller polypeptid transporteres fra cytoplasmaet til de transformerede plan-tecellers kloroplaster eller mitokondrier, kan den fremmede DNA-sekvens imidlertid yderligere omfatte et yderligere fremmed DNA, der koder for et 35 transitpeptid. Det yderligere DNA ligger mellem hankønssterilitets-DNA'et og den 19 DK 175585 B1 første promotor, hvis det første protein eller polypeptid skal transporteres således, og det ligger mellem markør-DNA'et og den anden promotor, hvis det andet protein eller polypeptid skal transporteres således. Med '‘transitpeptid" menes et polypeptidfragment, der normalt er forbundet med et kloroplast- eller 5 mitokondrieprotein eller underenhed deraf og er fremstillet i en celle som et forstadieprotein, der kodes for af cellens kerne-DNA. Transitpeptidet er ansvarlig for translokationsprocessen af det kernekodede kloroplast- eller mitokondrieprotein eller underenhed deraf til kloroplasten eller mitokondriet, og under en sådan proces bliver transitpeptidet adskilt eller fjernet proteolytisk fra kloroplast-10 eller mitokondrieproteinet eller underenheden. Ét eller flere sådanne yderligere DNA’er kan tilvejebringes i den fremmede DNA-sekvens ifølge opfindelsen til transport af ét eller flere første eller andet proteiner eller polypeptider som generelt beskrevet i EP 0 189 707 og i: Van den Broeck et al. (1985) Nature 313, 358-363; Schatz (1987) Eur. J. of Bioch. 165, 1-6; og Boutry et al. (1987) Nature 15 328 340-342. Et eksempel på et egnet transitpeptid til transport ind i kloroplaster er transitpeptidet af den lille underenhed af enzymet RUBP-carboxylase (EP O 189 707), og et eksempel på et transitpeptid til transport ind i mitokondrier er transitpeptidet af enzymet Mn-superoxiddismutase (se eksempel 16).

20 I den fremmede DNA-sekvens ifølge opfindelsen kan 3'-signaler til transkriptions-regulation vælges blandt sådanne, der kan muliggøre korrekt transkriptionsaf-slutning og polyadenylation af mRNA i planteceller. Signalerne til transkriptions-regulation kan være de naturlige signaler fra det gen, der skal transkriberes, men kan også være fremmede eller heterologe. Eksempler på heterologe signaler til 25 transkriptionsregulation er signaler fra octopinsyntasegenet (Gielen et al. (1984) EMBO 3. 3, 835-845) og T-DNA-genet 7 (Velten og Schell (1985) Nucleic Acids Research ("NAR") 13, 6981-6998).

I overensstemmelse med opfindelsen kan plantecellekulturer såsom støvknap-30 cellekulturer, der indeholder den fremmede DNA-sekvens ifølge opfindelsen, hvor den første promotor bevirker ekspression af hankønssterilitets-DNA'et på et givet trin af pollenudvikling, især efter meiose, anvendes til at regenerere homozy-gotiske, dominante, hankønssterile planter ("Efficient isolation of microspores and the production of microspore-derived embryos from Brassica napus, E. B.

20 DK 175585 B1

Swanson, Μ. P. Coumans, S. C. Wu, T. L. Barby og W. D. Beversdorf, Plant Cell Reports (1987) 6: 94-97).

Ifølge opfindelsen tilvejebringes yderligere fremgangsmåder til fremstilling af 5 hybride frø, der kan dyrkes til hybride planter. Én fremgangsmåde involverer krydsning af en kernehankønssteril plante, der omfatter mindst ét markør-DNA, med en hankønsfertil plante uden markør-DNA’et. Bade hankønssterile og hankønsfertile planter plantes i adskilte rækker tæt på hinanden. En anden fremgangsmåde involverer krydsning af en kernehankønssteril plante, der omfatter 10 mindst to forskellige markør-DNA'er, med en hankønsfertil plante, der kun omfatter ét af de to forskellige markør-DNA'er i homozygotisk form. Både hankønssterile og hankønsfertile moderplanter kan dyrkes i en i det væsentlige tilfældig population, hvilket øger mulighederne for krydsbestøvning uden behov for præcise plantningsmønstre. Den hankønsfertile moderplante kan derefter nemt 15 fjernes fra populationen under anvendelse af det karakteristiske træk, der kodes for af det ikke-fælles markør-DNA, der ikke er omfattet af den hankønsfertile moderplante. Ved denne fremgangsmåde foretrækkes det, at det ikke-fælles markør-DNA i den hankønssterile plante er under kontrol af en konstitutiv promotor og koder for et protein eller polypeptid, der gør den hankønssterile 20 plante resistent over for et særligt herbicid. Den hankønsfertile plante kan derefter destrueres efter krydsbestøvning under anvendelse af det særlige herbicid.

Planter, der er transformeret med hankønssterilitets-DNA'et, fortrinsvis med både 25 hankønssterilitets-DNA'et og markør-DNA'et, der koder for herbicidresistens, hvilket DNA er stabilt integreret og kan overføres til efterfølgende generationer som dominante alleler ifølge opfindelsen, er alternativer til og indebærer adskillige fordele i forhold til fortiden anvendte cytoplasmiske hankønssterilitetssystemer til avl og produktion af hybridafgrøder. Sådanne fordele omfatter: 30 1. Til krydsbestøvning af afgrøder er avlsstrategien meget simplificeret, fordi det ikke er nødvendigt at indføre et genvindingsgen ("restorer gene") i den hankønsfertile moderlinje i den krydsning, der producerer det kommercielt solgte hybride frømateriale. Det er endda sådan, at en 35 heterozygotisk, kernehankønssteril moderlinje, der krydses med en 21 DK 175585 B1 anden hankønsfertil moderlinje til kommerciel frøproduktion, producerer 50% hankønssterile afkom og 50% hankønsfertile hybride afkom, hvilket resulterer i, at den kommercielle afgrøde producerer pollen nok til at sikre en fuldstændig frødannelse og derfor et normalt 5 udbytte. Eksempler pi sådanne afgrøder er majs og raps.

2. Til afgrøder, hvor frøene ikke udgør den økonomiske høst, er avlsstrategien også meget simplificeret uden behov for et genvindingsgen, der udtrykkes i den hankønsfertile moderlinje. Det er 10 endda sådan, at det for disse afgrøder er ligegyldigt, at 50% af de kommercielt solgte hybride frø er hankønssterile. Eksempler på sådanne afgrøder er sukkerroe og lucerne.

3. Systemet muliggør produktion af kernehankønssterile linjer og vedlige- 15 holdelseslinjer fra eksisterende indavlede linjer på én gang, hvilket eliminerer behov for tilbagekrydsning. Dette reducerer tidsforsinkelsen mellem planlægning og kommercialisering af en hybrid med mindst 6-8 generationer. Et eksempel på en typisk strategi til fremstilling af hybride planter under anvendelse som moderplante af de planter, hvor 20 hankønssterilitets-DNA’et er indsat og udtrykkes, kan bestå af følgende trin : 1) testhybrider fremstilles manuelt ved krydsning af indavlede linjer, og der testes for kombinationsevne og udvalgte træk (2 25 år).

2) én moderlinje fra hver af de udvalgte hybrider gøres kernehankønssteril ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen (1 år).

30 3) den kernehankønssterile moderplante opnået ifølge denne fremgangsmåde, i det følgende betegnet "As", og dens vedligeholdelseslinje, i det følgende betegnet "A", og den bestøvende, hankønsfertile moderplante, i det følgende betegnet 35 "B", af den fremtidige kommercielle afgrøde mangfoldiggøres (3 22 DK 175585 B1 år), I løbet af samme periode indføres de udvalgte hybrider i officielle udbytteforsøg (3 år).

4) det godkendte hybride frømateriale fremstilles og sælges (1 år).

5 4. Kombineret med et markør-DNA, der koder for herbicidresistens, muliggør et sådant kernehankønssterilitetssystem produktion af 2-, 3-og 4-vejshybrider i en hvilken som helst nødvendig kombination. Det antages at være tilstrækkeligt at indføre hankønssterilitets-DNA'et og 10 som nabo dertil markør-DNA'et i kernegenomet i en plante, som anvendes som én af bedsteforældreavlslinjerne til opnåelse af 2- eller 3-vejshybrider, og i kernegenomet i to planter, som anvendes som de to bedsteforældrelinjer til 4-vejshybrider. Hver avlslinje kan vedligeholdes ved følgende to krydsningseksempler, hvor "SH" 15 betegner de dominante alleler for henholdsvis hankønssterilitet (S) og herbicidresistens (H), og sh betegner de recessive allelerfor henholdsvis hankønsfertilitet (s) og herbicidfølsomhed (h): a. SH/sh x sh/sh giver 50% SH- og 50% sh-afkom, og efter sprøjtning 20 med herbicidet, hvortil H giver resistens, opnås 100% sterile småplanter.

b. sh/sh x sh/sh giver 100% fertile afkom.

25 5. Der tilvejebringes en beskyttelse for ejeren af det markør-DNA, der er integreret i hankønssterilitetssystemet, ved at gøre det vanskeligere for konkurrenter at avle markør-DNA’et ind i deres egne avlslinjer.

Til illustrative formål vises 2 forædlingsskemaer ifølge opfindelsen som følger: 30 35 23 DK 175585 B1 SKEMA 1

Avl af en plante, der indeholder hankønssterilitets-DNA og markør-DNA, der koder for herbicid resistens, ved siden af hinanden 5 IA) dyrkning af hankønssterilitetslinjen As: linje ASH/sh x linje Ash/Sh giver 50% ASH/sh (fænotype: hankønssteril, herbicidresistent) 10 50% Ash/sh (fænotype: hankønsfertil, herbicidmodtagelig) IB) fremstilling af den hybride frøafgrøde: a) frø af Bsh/sh (hanplanter) og de frø, der er vundet ved krydsningen 1A), og som består af ASH/sh og Ash/sh ("hun”planter) sås i 15 adskilte rækker.

b) genotypen Ash/sh elimineres ved sprøjtning af de hunlige rækker med herbicidet, 20 c) krydsbestøvning finder sted: ^SH/sh χ gsh/sh Qg gsh/sh χ gsh/sh giver i de hunlige rækker: 50% ABSH/sh (fænotype: hybrid, hankønssteril, herbicidresistent) 50% ABsh/sh (fænotype: hybrid, hankønsfertil, herbicidmodtagelig) 25 og i de hanlige rækker: 100% Bsh/sh.

d) genotypen Bsh/st1, der findes i de hanlige rækker, elimineres ved sprøjtning med herbicidet eller ved mekaniske midler.

30 e) hybride frø i de hunlige rækker, hvor krydsbestøvningen under c) fandt sted, høstes. Disse er de kommercielt solgte frø.

35 24 DK 175585 B1 SKEMA 2

Avl af en plante, der indeholder hankønssterilitets-DNA og to markør-DNA'er, der koder for hver sin herbicide resistens (Hl og H2), ved S siden af hinanden 2A) vedligeholdelse af den hankønssterile linje As: ^S.^SHlH2/shih2 ^shlti2/sh|h2 giver 10 50% A SHIH2/shlh2 (fænotype: hankønssteril, resistent over for begge herbicider).

50% Ashlh2/shlh2 fænotype: hankønsfertil, modtagelig over for begge herbicider).

15 2B) vedligeholdelse af bestøvningslinje B: gSh]H2/ShlH2 χ gShlH2/sblH2 giver 100% gshlH2/shlH2 (fænotype: hankønsfertil, modtagelig over for herbicid 1 og resistent over for herbicid 2).

20 2C) fremstilling af den hybride frøafgrøde: a) frøene vundet ifølge 2A) og frøene vundet ifølge 2B) sås tilfældigt.

25 b) genotypen Ashlh2/shltl2 elimineres ved sprøjtning af marken med herbicid 2.

c) krydsbestøvning finder sted: 3Q ^SH1H2/Shlh2 χ gShlH2/ShlH2 giver 50% ABSH5H2/sh5H2 50% ABshlh2/shlH2 og selvbestøvning finder sted: 35 gShlH2/ShlH2 χ gShlH2/ShlH2 25 DK 175585 B1 giver 100% BshlH2'shlH2 d) planter med genotype BsblH2/shlH2, vundet fra forældrelinjen 5 B, hvor selvbestøvning fandt sted, elimineres ved sprøjtning af marken med herbicid 1.

e) hybride frø af de resterende planter ASH1H2/sblH2, vundet ved krydsbestøvning ifølge c), høstes.

10 Følgende eksempler illustrerer opfindelsen. De figurer, der er refereret til i eksemplerne, er følgende:

Figur 1 viser restriktionskort for TA29 cDNA og dets Clal-fragment i 15 pTA29S3 fra eksempel 1.

Figur 2 viser cDNA-sekvensen for Pstl-fragmentet af TA29-genet fra eksempel 2.

20 Figur 3A viser DNA-sekvensen og aminosyresekvensen af TA29-genet fra dets Clal-sted til dets Hind III-sted. Oven over sekvenserne er de vigtige restriktionssteder vist, og under sekvenserne er vist den aminosyresekvens, der kodes for af ORF’et.

25

Også vist er; fra nudeotidet ("nt") 1446-1452: TATA-kasse (stjerner), 30 - ved nt 1477: TA29 mRNA's sted for indledning af transkription (stjerne), fra nt 1514-1537: 3'- til S’-sekvensen af en syntetisk oligomer som beskrevet i eksempel 2, og fra nt 1940-2296 (mellem pile); sekvensen af TA29 35 cDNA opstillet på linje.

26 DK 175585 B1

Figur 3B viser opstillingen af TA13 cDNA (øverste linje) og TA29 cDNA (nederste linje) som nævnt i eksempel 4.

Homologe nucleotider er vist ved lodrette linjer.

5

Figur 3C viser sekvensen af TA26 cDNA som nævnt i eksempel 4; ORF’et er understreget.

Figur 4A viser skematisk konstruktionen af vektoren pMB2 fra 10 eksempel 3.

Figur 4B viser et kort over vektoren pMB3 fra eksempel 3.

Figur 5 viser et kort over vektoren pTTM3 fra eksempel 5.

15

Figur 6 viser et kort over vektoren pTTM4 fra eksempel 7.

Figur 7 viser et kort over vektoren pTTM6 fra eksempel 9.

20 Figur 7B viser et kort over vektoren pTTM6A' fra eksempel 11.

Figur 8 viser et kort over vektoren pTTM8 fra eksempel 12.

Figur 9A viser et kort over vektoren pTVEPl fra eksempel 14.

25

Figur 9B viser et kort over vektoren pTVEP2 fra eksempel 14.

Figur 10 viser et kort over vektoren pTVE63 fra eksempel 16.

30 Figur 10B viser et kort over vektoren pTVEP62 fra eksempel 16.

Figur 11 viser et fotografi af blomster af normale tobaksplanter sammenlignet med blomster af tobaksplanter, der er transformeret med hankønssterilitets-DNA'et fra eksempel 9.

35 27 DK 175585 B1

Figur 12 viser et fotografi af et tværgående snit i en normal tobaksplantes støvknap sammenlignet med støvknappen i en tobaksplante transformeret med hankønssterilitets-DNA'et fra eksempel 9 (forstørrelse: x 250).

5

Medmindre andet er anført i eksemplerne, blev samtlige fremgangsmåder til fremstilling og manipulering af rekombinant DNA udført ved de standardiserede fremgangsmåder beskrevet i Maniatis et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manualt Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Følgende plasmider og vektorer, 10 der blev anvendt i eksemplerne, er deponeret i den Deutsche Sammlung Fur Mikroorganismen und Zellculturen ("DSM"), Mascheroder Weg IB, D-3300 Braunschweig, Vesttyskland ifølge Budapesttraktaten:

Plasmid eller vektor DSM adgangsnr. Dato pMB3 4470 21. marts 1988 pGSC1600 4467 ’ 21. marts 1988 PGCC1700 4469 21. marts 1988 PGV2260 2799 december 1983 ~ pGSC1701A ""4286 22. oktober 1987 pTTM4 4471 21. marts 1988 "pMACS^ 4566 25. april 1988 pTTM6 4468 21. marts 1988 15 EKSEMPEL 1

Subkloning af et støvknapspecifikt gen ("TA29-genet") 20 Fra professor Robert Goldberg fra University of California, Los Angeles (UCLA), USA blev leveret: et Nicotiana fabacum-støvknapspecifikt cDNA (”TA29 cDNA”) klonet som et Pstl-fragment i pBR329 (Covar-rubias og Bolivar (1982) Gene 17, 79 ved påsætning af GC-hale; og den tilsvarende genomklon ("lambda TA29"), der blev isoleret fra et N. tabacum "Samsun''-genombibliotek under anvendelse af 25 Ta29 cDNA som probe, og som blev indsat i ftoRI-stedet af lambdafagvektoren cH32 (Loenen og Blattner (1983) Gene 26, 171). TA29 cDNA’et var 365 basepar 28 DK 175585 B1 langt (± 0,4 kb) og hybridiserede til et tapetlagsspecifikt mRNA på 1100 nucleotider, hvilket udgør 0,24% af poly A+ mRNA'et fra støvknapper fra N. tabacum. Som vist i figur 1 indeholder lambda TA29 2 EcoRI-fragmenter, idet den totale insert måler 13,2 kb.

5

Et internt 7,5 kb C/al-fragment som vist i figur 1, hvilket fragment indeholder TA29-genet, blev subklonet fra lambda TA29 i pLK31 (Botterman og Zabeau (1987) DNA 6, 6), som producerede et plasmid betegnet '‘pTA29S3". Nitrocel-lulosebundne fragmenter af lambda TA29, der blev skåret med kombinationen 10 EcoRl/Clal/Hindlll/Hindlll-EcoM og kombinationen C/al-fcoRI og hybridiseret mod TA29 cDNA, viste tilstedeværelsen af sekvenser, der var homologe med TA29 cDNA.

EKSEMPEL 2 15

Nudeotidsekvensbestemmelse af TA29 cDNA og dets homologe sekvens fra pTA29S3; kortlægning af TA29-gen og dets promotor

Pstl-inserten fra TA29 cDNA i pBR329 blev fuldstændigt sekventeret (Maxam og 20 Gilbert (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA ("PNAS") 74, 560). cDNA-sekvensen er vist i figur 2. Den viser tilstedeværelsen af én åben læseramme over hele cDNA-sekvensen (som vist).

Derefter blev sekvensen af C/al-inserten i pTA29S3 bestemt fra C/al-stedet til 25 H/ndIII-stedet (3261 basepar fra hinanden). Sammenligning af TA29 cDNA-sekvensen og pTA29S3-sekvensen viste i pTA29S3 tilstedeværelsen af en sekvens, der var fuldstændig homolog med TA29 cDNA-sekvensen.

Figur 3 viser sekvensen af TA29-genet i pTA29S3. Den sekvens i pTA29S3, der er 30 identisk med TA29 cDNA-sekvensen, findes mellem pilene i figur 3. En formodet åben læseramme afsløres af den tilsvarende aminosyresekvens i figur 3. Dette viser, at TA29-genet koder for et protein med 321 aminosyrerester, og at der ikke findes introns i den kodende region. Den åbne læserammes længde på 964 ( + ledesekvens) nucleotider passer til størrelsen af en transkription, der findes i 35 støvknap-mRNA fra tobak fremstillet ud fra støvknapper isoleret fra unge (12-20 29 DK 175585 B1 mm lange) tobaksblomsterknopper, og som ikke findes i mRNA'et isoleret fra blade og ældre blomster (når knopperne er åbne, og kronbladene har vist sig). Størrelsen af dette mRNA er ca. 1100 nudeotider.

5 Der er 2 ATG-kodoner 33 nudeotider fra hinanden, én ved nucleotid ("nt") 1527 og den anden ved nt 1560, hvilke kodoner kunne fungere som startkodon for den åbne læseramme. Der er en sammenstemmende sekvens TATA ved nt 1446, som er 81 nudeotider 5' opstrøms fra den første ATG-kodon (vist ved stjerne i figur 3).

For at bekræfte at denne "TATA"-kasse er en del af TA29-genets promotor, blev 10 TA29 mRNA'ets 5’-ende bestemt. Dette blev udført ved primerekstension (Me Knight et al. (1981) Cell 25, 385). Til dette formål blev anvendt en oligomer på 24 nudeotider med sekvensen: 5' GGA GCT ACC A7TTTA GCT AAT TTC 3’, idet denne sekvens er komplementær til TA29-genet fra nt 1514 til nt 1537 som vist i figur 3.

15

Dette nucleotid blev 32p-mærket ved kination ved 5’-enden. Efter hybridisering med støvknap-mRNA blev oligonudeotidet forlænget ved omvendt transkriptase.

Det resulterende, forlængede otigonucleotid blev analyseret på en sekventeringsgel ved siden af en sekventeringsstige til bestemmelse af dets 20 eksakte størrelse. Fragmentet viste sig at være 61 nudeotider langt. Dette viser, at transkriptions-indledningen af TA29 mRNA fandt sted ved nt 1477 (vist ved stjerne i figur 3). TA29-genet har således en TATA-kasse, der befinder sig 31 nudeotider opstrøms fra stedet for transkriptionsindledning. mRNA’et indeholder en 51 nudeotider lang ledesekvens fra nt 1477 til nt 1527, en kodende region på 25 964 nudeotider fra nt 1527 til nt 2491 og en 3’ ikke-kodende region på ca. 100 nudeotider fra nt 2492 til nt 2590. Som det er tilfældet i ca. 92% af de for tiden karakteriserede plantegener (loshin (1987) Nucleic Acids Research ("NAR")" 15 (16), 6643) formodes det, at mRNA’ets første AUG-kodon anvendes til at indlede translation. TA29-promotoren synes således at befinde sig mellem Clal-30 restriktionsstedet og nt 1477.

35 EKSEMPEL 3 30 DK 175585 B1

Konstruktion af en promotorkassette ("PTA29") stammende fra TA29-genet S For at konstruere kimære DNA-sekvenser, der indeholder de 5’-regulerende sekvenser, herunder promotoren, af TA29-genet i den samme transkriptionelle enhed som, og som kontrollerer, et første heterologt hankønssterilitets-DNA, blev en kassette konstrueret som vist i figur 4 ved subkloning af et 2,5 kb Clal/Accl-fragment fra pTA29S3 i polylinker-AccI-stedet af pMAC 5-8 (EP 87/402348.4).

10 Denne resulterede i en vektor betegnet "pMB2", der er vist i figur 4, hvilken vektor kunne anvendes til isolering af enkeltstrengs-DNA til anvendelse ved steddirigeret mutagenese.

Derefter blev den sekvens, der omgiver den første ATG-kodon AAAATGGTA, 15 modificeret til ACG4TGGTA ved erstatning af 2 adeninrester med cytosinrester.

Denne mutation gav sekvensen CCATGG, som er genkendelsesstedet for restriktionsenzymet Ncol. Denne steddirigerede mutagenese i pMB2 blev udført under anvendelse af et syntetisk oligonucleotid på 24 nucleotider med følgende sekvens: 20 3'GTT TAA TCG ATG GTA CCA TCG AGG 5'

Det resulterende plasmid, der indeholdt det nydannede Λ/coI-sted, blev betegnet "pMB3" og er vist i figur 4. Den præcise nucleotidsekvens, der dækker Ncol-stedet, blev bestemt for at bekræfte, at den kun var forskellig fra TA29-genets 5'-25 sekvens ved AA -- CC-substitution, hvilket gav Λ/coI-stedet. Fragmentet på 1507 nucleotider, Clal -- Ncol, blev betegnet "PTA29".

EKSEMPEL 4 30 Identificering af cDNA-kloner opnået fra andre støvdragerspecifikke mRNA'er

For at påvise at andre støvknapspecifikke mRNA'er kunne identificeres og derefter anvendes til isolering af cDNA-kloner med egenskaber svarende til TA29-genet, 31 DK 175585 B1 blev 2 andre N. tabacum-støvknapspecifikke cDNA'er ("TA13 cDNA" og "TA26 cDNA") fremskaffet fra professor Goldberg fra UCLA).

TA13 cDNA er en klon på 1100 bp, der hybridiserede til 2 mRNA-arter på 5 henholdsvis ca. 1100 og 1200 nucleotider, hvilke mRNA-arter er specifikke for tapetlagsceller og findes i stort omfang på et meget tidligt stadium i støvknapudvikling. TA13 cDNA blev sekventeret under anvendelse af fremgangsmåden fra eksempel 2 og derefter sammenlignet med TA29 cDNA's sekvens som vist i figur 3B. Denne sekvenssammenligning viser, at TA13 cDNA og TA29 cDNA har en 10 homologi på 92%, og at ORF'et har et meget højt glycinindhold.

TA26 cDNA blev klonet som en Pstl-insert i pBR 329 ved påsætning af poly-G/C-hale. Det er en klon på 519 bp, der hybridiserede til et tobaks-mRNA på 580 nucleotider, hvilket mRNA er specifikt for tapetlagsceller og findes i stort 15 omfang på et vist stadium i støvknapudvikling. Hele TA26 cDNA’et blev sekventeret under anvendelse af fremgangsmåden fra eksempel 2, og der var ingen homologi, når det blev sammenlignet med TA29 cDNA’s sekvens. TA26 cDNA's sekvens er vist i figur 3C.

20 EKSEMPEL 5

Konstruktion af en kimær DNA-sekvens fra PTA29 og et giucuronidasegen

Et plasmid betegnet "pTTM3", vist i figur 3, blev konstrueret ved samling af 25 følgende velkendte DNA-fragmenter: 1. et vektorfragment, der omfatter T-DNA-grænsesekvenser, hvilket fragment stammer fra pGSC1600; 30 2. en kimær sekvens, der indeholder promotorkassetten PTA29 fra eksempel 3 sammensmeltet i læseramme med et pMB3 Ncolf-EcoRI-fragment, der indeholder et E. co//'-gen, der koder for betaglucuronidase ("GUS" [Jefferson et al. (1986) PNAS 83, 8447; Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6, 3901]) og 3'-endesignaleme af et octopin-syntasegen ("OCS" 35 [Dhaese et al. (1983) EMBO J. 2, 419]); 32 DK 175585 B1 3. en kimær sekvens, der indeholder en Arabidopsis SSU-promotor ("PSSU” eller "PSSUARA"), et herbicidresistensgen sfr (EP 87/400,544.0) og 3'-endesignalerne af et T-DNA-gen 7 (Velten og Schell (1985) NAR 13, 6981); 5 og

4. en kimær sekvens, der indeholder EcoRI/SacI-fragmentet fra pGSFR401, der indeholder en nopalin-syntasepromotor ("PNOS"), et neogen, der koder for kanamycinresistens, og et octopin-syntasegens 3'-endesignaler (EP

10 87/400 544.0, hvor pGSFR401 betegnes "pGSR4‘‘).

pTTM3 er en T-DNA-vektor, der inden for T-DNA-grænsesekvenserne indeholder 2 kimære sekvenser: PSSU-sfr, hvor sfr er et markør-DNA (EP 87/400,544.0) under kontrol af PSSU som anden promotor; og PTA29-GUS, hvor GUS er et rappor-15 teringsgen, hvis ekspression i planter og planteceller under kontrol af TA29-promotoren nemt kan lokaliseres og kvantificeres.

EKSEMPEL 6 20 Indførelse af den kimære DNA-sekvens fra eksempel 5 i tobak

En rekombinant Agrobacterium-stamme blev konstrueret ved mobilisering af pTTM3 (fra eksempel 5) fra E. coli ind i Agrobacterium C58C1 Rif’Λ R, der indeholder pGV2260 (De Biaere et al. (1985) NAR 13, 4777). Mobilisering blev 25 udført under anvendelse af E. coli HB101, der indeholder pRK2013 (Figurski et al.

(1979) PNAS 76, 1648) som hjælper som beskrevet i EP 0 116 718. Den resulterende Agrobacterium-stamme indeholdt et hybrid Ti-plasmid, der omfatter pGV 2260 og pTTM3.

30 Denne stamme blev anvendt til at transformere bladskiver af tobak (N. tabacum Petite Havane SRI) under anvendelse af standardfremgangsmåder som beskrevet fx i EP 87/400,544.0. Transformeret kallus og transformerede skud blev udvalgt under anvendelse af 5 mg/l af herbicidet phosphinothricin i substratet (De Block et al. (1987) EMBO J. 6, 2513). Der blev ikke påvist nogen betaglucuronidase- 33 DK 175585 B1 enzym-aktivitet i det transformerede herbicidresistente kallus og de transformerede herbicidresistente skud.

Derefter blev der dannet rødder på de transformerede skud, skuddene blev 5 overført til jord i væksthuset og dyrket til blomstring. Blomsterne blev undersøgt, og kun tapetlagscellerne i støvdragernes støvknapper viste sig at indeholde betaglucuronidaseaktivitet. Dette viser, at TA29-promotoren selektivt kan styre ekspression af et heterologt gen såsom betaglucuronidasegenet i planternes tapetlagsceller.

10 EKSEMPEL 7

Konstruktion af en kimær DNA-sekvens fra PTA29 og et gen 4 15

Et plasmid betegnet "pTTM4", vist i figur 6, blev konstrueret ved samling af følgende velkendte DNA-fragmenter med PTA29: 1. et vektorfragment, der omfatter T-DNA-grænsesekvenser, 20 hvilket fragment stammer fra pGSC1700 (Cornelfisen og

Vandewiele (1989) NAR 17(1), 19-29); 2. den kimære sekvens (nr. 3) fra eksempel 5, hvilken sekvens indeholder PSSU-promotoren, der styrer ekspression af 25 herbicidresistensgenet sfr, og 3'-enden af et T-DNA-gen 7; 3. den kimære sekvens (nr. 4) fra eksempel 5, hvilken sekvens indeholder PNOS-promotoren, der styrer ekspressionen af neogenet, og octopin-syntesegenets 3'-ende; og 30 4. en kimær sekvens, der indeholder PTA29-promotorkassetten fra eksempel 3, sammensmeltet i læseramme med et Agrobacterium T-DNA-gen 4, der koder for isopentenyltransferase (Akiyoshi et al. (1984) PNAS 76, 5994; Barry et al. (1984) 34 DK 175585 B1 PNAS 81, 4776), hvilken sekvens indeholder sine egne 3'-endesignaler til transkriptionsregulationsafslutning.

pTTM4 er en binær type T-DNA-vektor, der inden for T-DNA-grænsesekvenserne 5 indeholder følgende kimære sekvenser: PSSU-sfr og PNOS-neo, hvor sfr- og neogenerne er markør-DNA'er, der koder for dominante, selekterbare markører for planter, og som er under kontrol af henholdsvis PSSU og PNOS som anden promotor; og PTA29-gen 4, hvor gen 4 er et hankønssterilitets-DNA, der er under kontrol af PTA29 som første promotor, og 10 som koder for enzymet isopentenyltransferase, hvilket forårsager øget produktion af cytokinin. Øget cytokininproduktion i tapetlagsceller under kontrol af TA29-promotoren forstyrrer tapetlagscellernes metabolisme og organogenese.

EKSEMPEL 8 15

Indførelse af den kimære DNA-sekvens fra eksempel 7 i tobak

Som beskrevet i eksempel 6 blev pTMM4 (fra eksempel 7) indført under mobilisering fra E. coli i Agrobacterium C58C1 RifR. Den resulterende Agrobacterium-20 stamme indeholdt et binært type Ti-plasmid, der omfatter pGV2260 og pTTM4.

Som det også er beskrevet i eksempel 6 blev denne stamme anvendt til transformation af bladskiver fra tobak, og transformeret kallus og transformerede skud blev udvalgt under anvendelse af 5 mg/l phosphinothricin. Der blev dannet rødder 25 på transformerede, herbicidresistente skud, hvilket viser, at gen 4 endnu ikke blev udtrykt i de transformerede planter.

Planterne blev derefter overført til jord i væksthuset og dyrket til blomstring.

Blomsterne undersøges, og der findes ingen funktionelle tapetlagsceller i støv-30 dragernes støvknapper. Dette viser, at TA29-promotoren selektivt kan styre ekspression af det heterologe gen 4 i planternes tapetlagsceiler.

35 35 DK 175585 B1 EKSEMPEL 9

Konstruktion af en kimær DNA-sekvens fra PTA29 og et RNAse Ti-gen 5 Et plasmid betegnet "pTTM6", vist i figur 7 A, blev konstrueret ved samling af følgende DNA-fragmenter: 1. et vektorfragment, der omfatter T-DNA-grænsesekvenser, hvilket fragment stammer fra pGSC1600; 10 2. den kimære sekvens (nr.3) fra eksempel 5, hvilken sekvens indeholder PSSU-promotoren, herbicidresistensgenet sfr og 3'-enden af T-DNA-genet 7; og 15 3. en kimær sekvens, der indeholder pTA29-promotorkassetten fra eksempel 3, sammensmeltet i læseramme med et syntetisk gen, der koder for RNAse TI fra A. orhyzae, (Quaas et al., "Biophosphates and their Analogues-Synthese, Structure,

Metabolism and Activity" (1987) Elsevier Science Publisher 20 B.V., Amsterdam; Quaas et al. (1988) Eur. J. Biochem. 173, 617-622), og et nopann-syntase("NOS")gens 3‘-endesignaler (An et al. (1985) EMBO J. 4 (2), 277).

pTTM6 er en T-DNA-vektor, der inden for T-DNA-grænsesekvenserne indeholder 2 25 kimære sekvenser: PSSU-sfr, som er et markør-DNA under kontrol af PSSU som anden promotor; og PTA29-RNase Tl-gen, som er et hankønssterilitets-DNA under kontrol af PTA29 som første promotor. Ekspression i tapetlagsceller af hankønssterilitets-DNA’et under kontrol af TA29-promotoren producerer RNase TI, der er dødeligt for cellerne, idet RNase TI nedbryder RNA-molekylerne, som 30 er uundværlige for disse cellers metabolisme.

35 EKSEMPEL 10 36 DK 175585 B1

Indførelse af den kimære DNA-sekvens fra eksempel 9 i tobak 5 Som beskrevet i eksempel 6 blev en rekombinant Agrobacterium-stamme konstrueret ved mobilisering af pTTM6 (fra eksempel 9) fra E. coli til Agrobacterium C58C1 Rif1/4R. Den resulterende Agrobacterium-stamme, der bærer et co-integreret Ti-plasmid bestående af pGV2260 og pTTM6, blev anvendt til transformation af bladskiver fra tobak. Transformeret kallus og transformerede 10 skud blev udvalgt under anvendelse af 5 mg/l phosphinothricin. Vækst af den transformerede herbicidresistente kallus og de transformerede herbicidresistente skud viste, at RNase Tl-genet ikke blev udtrykt.

De transformerede skud dannede rødder, blev overført til jord i væksthuset og 15 dyrket til blomstring. De transformerede tobaksplanter udviklede normale blomster med undtagelse af støvknapperne. På trods af støvknappernes normale form sprang de op på et senere tidspunkt sammenlignet med støvknapper fra de ikke-transformerede tobaksplanter (se figur 11). Ved opspringning blev lidt eller ingen pollen frigjort fra de transformerede planter, og de pollenkorn, der blev 20 dannet af de transformerede planter, var ca. 50-100 gange mindre i volumen end normale pollenkorn og havde en uregelmæssig form. Ydermere spirede de fleste pollenkorn fra transformerede planter ikke, og spiringseffektiviteten af pollen fra transforme-rede planter var ca. 0-2% af normale pollenkorns spiringseffektivitet. Ydermere producerede de transformerede planter ingen frø ved selvbestøvning -25 hverken ved naturlig selvbestøvning eller ved manuelt udført selvbestøvning.

Mikroskopisk evaluering ved tyndtlagstværsnit af en transformeret plante viste, at der ikke blev dannet et normalt tapetlag, og at pollensækken forblev tom (se figur 12). Dette viser, at TA29-pro-motoren selektivt kan styre ekspression af det hete-30 rologe RNase Tl-gen i transformerede planters tapetlagsceller, og at RNase TI kan forstyrre tapetlagscellernes funktion tilstrækkeligt, således at planterne gøres hankønssterile.

35 EKSEMPEL 11 37 DK 175585 B1

Indførelse af et derivat af den kimære DNA-sekvens fra eksempel 9 i raps 5

En rekombinant Agrobacterium-stamme blev konstrueret ved mobilisering af pTTM6A~ fra E. coli til Agrobacterium C58 RifR indeholdende pMP90 (Koncz og Schell (1986) Mol. Gen. Genetics 204, 383-396). pMP90 tilvejebringer vir- og transfunktioner og bærer ikke et gen, der koder for ampicillinresistens. Som vist i 10 figur 7B er pTTM6A‘ et derivat af pTTM6 (fra eksempel 9), hvor β-lactamasegenet, der koder for ampicillinresistens, er blevet inaktiveret ved indførelse af en DNA-sekvens i β-lactamasegenets Scal-sted.

Den resulterende Agrobacterium-stamme (betegnet "A3144"), der bærer pMP90 15 og pTTM6A~, blev anvendt til transformation af Brassica napus ifølge fremgangsmåden beskrevet af Lloyd et al. (1986) Science 234, 464-466 og Klimaszewska et al. (1985) Plant Cell Tissue Organ Culture 4, 183-197.

Carbenicillin blev anvendt til at slå A3144 ihjel, efter at cc-dyrkning fandt sted. Transformeret kallus blev udvalgt på 5 mg/l phosphinothricin og 100 ng/ml 20 kanamycin, og resistent kallus blev regenereret til planter. Efter induktion af skud og rødder blev transformanterne overført til væksthuset og dyrket til blomstring. Blomsterne undersøges, og de udviser i det væsentlige den samme fænotype, som blev observeret for de transformerede tobaksplanter beskrevet i eksempel 10. Dette viser, at TA29-promotoren selektivt kan styre ekspression af det 25 heterologe RNase Tl-gen i tapetlagsceller i andre planter end tobak, således at sådanne andre planter gøres hankønssterile.

EKSEMPEL 12 30 Konstruktion af en kimær DNA-sekvens fra PTA29 og et Barnasegen

Et plasmid betegnet "pTTM8", vist i figur 8, blev konstrueret ved samling af følgende velkendte fragmenter: 35 1. et vektorfragment, der omfatter T-DNA-graensesekvenser 38 DK 175585 B1 stammende fra pGSC1700 (Cornelissen og Vandewiele (1989) NAR 17 (l) 19-29), og hvor [Mactamasegenet (Γ fra figur 8) er blevet inaktiveret ved indførelse af en DNA-sekvens i Scal-stedet; 5 2. den kimære sekvens (nr. 3) fra eksempel 5, hvilken sekvens indeholder PSSU-promotoren, herbicidresistensgenet sfr og 3’-enden af T-DNA-genet 7; 10 3. den kimære sekvens (nr. 4) fra eksempel 5, der indeholder PNOS-promotoren, neogenet og octopin-syntasegenets 3-'ende; og 4. en kimær sekvens, der indeholder PTA29-promotorkassetten 15 fra eksempel 3, sammensmeltet i læseramme med Barnasegenet fra Bacillus amiloliquefaciens (Hartley og Rogerson (1972)

Preparative Biochemistry 2, (3), 243-250), og 3'-enden af nopalin-syntasegenet fra eksempel 9.

20 pTTM8 er en binær type T-DNA-vektor, der inden for T-DNA-grænsesekvenserne indeholder 3 kimære sekvenser: PSSU-sfr og PNOS-neo, som er markør-DNA'er med henholdsvis PSSU og PNOS som anden promotorer; og PTA29-Barnasegenet, som er et hankønssterilitets-DNA under kontrol af PTA 29 som første promotor. Ekspression i tapetlagsceller af hankønssterilitets-DNA'et under kontrol af TA29- 25 promotoren producerer Barnase selektivt i tapetiagscellerne, således at Barnase forstyrrer disse cellers metabolisme.

EKSEMPEL 13 30 Indførelse af den kimære DNA-sekvens fra eksempel 12 i tobak og raps

Som beskrevet i eksempel 11 blev en rekombinant Agrobacterium-stamme konstrueret ved mobilisering af pTTM8 (fra eksempel 12) fra E. coli til Agrobacterium C58C1 RifR indeholdende pMP90 (Koncz og Schell (1986) Mol. Gen.

35 Genetics 204, 383-396). Den resulterende stamme (betegnet "A3135"), der bærer 39 DK 175585 B1 pMP90 og pTTM8, anvendes til transformation af bladskiver fra tobak og til transformation af raps. Transformeret kallus og transformerede skud vælges under anvendelse af 5 mg/l phosphinothricin og 100 pg/ml kanamycin. At Barnasegenet ikke udtrykkes i den transformerede, herbicidresistente kallus og de transfor-5 merede, herbicidresistente skud vises ved vækst deraf.

De transformerede skud danner rødder, overføres til jord i væksthuset og dyrkes til blomstring. Blomsterne af både tobak og raps undersøges, og for de transformerede planter observeres en fænotype, der i det væsentlige er den 10 samme som fænotypen af de transformerede tobaksplanter beskrevet i eksempel 10. Dette viser, at TA29-promotoren selektivt kan styre ekspression af det heterologe Barnasegen i planters tapetceller, hvorved planterne gøres hankønssterile.

15 EKSEMPEL 14

Konstruktion af en kimær DNA-sekvens fra pTA29 og et gen, der koder for papain 20 Et plasmid betegnet "pTVEPl", vist i figur 9A, konstrueres ved samling af følgende velkendte fragmenter: 1. et vektorfragment, der omfatter T-DNA-grænsesekvenser stammende fra pGSC1700, og hvor β-lactamasegenet (1' i 25 figur 9A) er blevet inaktiveret ved indføjelse af en DNA-sekvens i

Scal-stedet; 2. den kimære sekvens (nr. 3) fra eksempel 5, hvilken sekvens indeholder PSSU-promotoren, herbicidresistensgenet sfr og 30 3’-enden af T-DNA-gen 7.

3. den kimære sekvens (nr. 4) fra eksempel 5, hvilken sekvens indeholder PNOS-promotoren, neogenet og octopin-syntasegenets 3’-ende; og 35 40 DK 175585 B1 4. en kimær sekvens, der indeholder PTA29-promotorkassetten fra eksempel 3, sammensmeltet i læseramme med: a) et papaingen fra frugten af Carica papaya, hvilket gen 5 koder for det papainzymogen, der er en planteendopeptidase (Cohen et al. (1986) Gene 48, 219-227), der kan angribe peptid- samt esterbindinger; følgende modifikationer udføres i DNA-sekvensen af Cohen et al. (1986) under anvendelse af steddirigeret mutagenese som beskrevet i eksempel 3: 10 i. nucleotidet A, der befinder sig i position 1 opstrøms fra den første ATG-kodon, muteres til nucleotid C for at opnå et egnet Λ/coI-kloningssted; og 15 ii. de GAA-kodoner, der koder for glutaminsyre ved henholdsvis positioner 47, 118 og 135, muteres til CAA-kodoner, der koder for glutamin; og b) 3’-enden af nopalin-syntasegenet fra eksempel 9.

20 pTVEPl er en binær type T-DNA-vektor, der inden for T-DNA-grænsesekvenserne indeholder 3 kimære sekvenser: PSSU-sfr og PNOS-neo, som er markør-DNA’er, der koder for dominante, selekterbare markører for plantetransformationer, og som er under kontrol af henholdsvis PSSU og PNOS som anden promotor; og 25 PTA29-papaingenet, som er et hankønssterilitets-DNA under kontrol af PTA29 som første promotor. Ekspression i tapetlagsceller af hankønssterilitets-DNA’et under kontrol af TA29-promotoren producerer en endopeptidase (papainzymogenet), der spalter proteiner i tapetlagscellerne, hvilket fører til disse cellers død.

30 Et plasmid betegnet pTVEP2", vist i figur 9B, konstrueres også ved samling af følgende velkendte fragmenter: 1. et vektorfragment, der omfatter T-DNA-grænsesekvenser stammende fra pGSCl700, og hvori (3-lactamasegenet (1' i 41 DK 175585 B1 figur 9B) er blevet inaktiveret ved indføjelse af en DNA-sekvens i Scal-stedet; 2. den kimære sekvens (nr. 3) fra eksempel 5, hvilken sekvens 5 indeholder PSSU-promotoren, herbicidresistensgenet sfr og 3’-enden af T-DNA-genet 7; 3. den kimære sekvens (nr, 4) fra eksempel 5, hvilken sekvens indeholder PNOS-promotoren, neogenet og octopin-syntasegenets 10 3'-ende; og 4. en kimær sekvens, der indeholder PTA29-promotorkassetten fra eksempel 3, sammensmeltet i læseramme med: 15 a) et papaingen fra frugten af Carica papaya, hvilket gen koder for papainzymogenets aktive protein; følgende modifikationer udføres i DNA-sekvensen af Cohen et al. (1986) under anvendelse af steddirigeret mutagenese som beskrevet i eksempel 3: 20 i. den AAT-kodon, der koder for Asn, og som findes opstrøms af det aktive proteins første Ile-rest, muteres til en GAT-kodon, der tilvejebringer et egnet EcoRV-kloningssted (GAT ATC). Det fremstillede EcoRV-sted sammensmeltes direkte til pTA29-kassetten 25 for at opnå en i læseramme direkte sammensmeltning af promotoren med den sekvens, der koder for papainzymogenets aktive protein; og ii. de GAA-kodoner, der koder for glutaminsyre ved henholdsvis 30 positioner 47, 118 og 135, muteres til CAA-kodoner, der koder for glutamin; og b) 3’-enden af nopalinsyntasegenet fra eksempel 9.

35 pTVEP2 er ligesom pTVEPl en binær type T-DNA-vektor, der inden for 42 DK 175585 B1 T-DNA-grænsesekvenserne indeholder 3 kimaere gener: PSSU-sfr og PNOS-neo, der koder for dominante, selekterbare markører for plantetransformationer; og PTA29-papaingen, der koder for en endopeptidase, der spalter proteiner i tapetlagsceller, hvilket fører til disse cellers død.

5 EKSEMPEL 15

Indførelse af de kimære DNA-sekvenser fra eksempel 14 i tobak og raps 10 Som beskrevet i eksempel 11 mobiliseres pTVEPl og pTVEP2 hver især fra E. coli til hver sin Agrobacterium C58C1 Rif**, der bærer pMP90.

De resulterende stammer, der bærer pMP90 med pTVEPl og pMP90 med pTVEP2, anvendes til tranformation af tobak og raps ifølge fremgangsmåderne fra 15 eksemplerne 11 og 13. At papaingenerne ikke udtrykkes i transformeret herbicid-og kanamycinresistent kallus og transformerede herbicid- og kanamycinresistente skud og rødder, vises ved vækst heraf.

De transformerede planter overføres til væksthuset og dyrkes i jord til blomstring.

20 Blomsterne af både tobak og raps undersøges, og for de transformerede planter observeres fænotyper, der i det væsentlige er de samme som fænotypen af de transformerede tobaksplanter beskrevet i eksempel 10. Dette viser, at TA29-promotoren selektivt kan styre ekspression af de heterologe papaingener i pTVEPl og pTVEP2 i planters tapetlagsceller, hvorved planterne gøres hankønssterile.

25 EKSEMPEL 16

Konstruktion af en kimær DNA-sekvens fra pTA29 og et gen, der koder for EcoRI 30

Et plasmid betegnet "pTVE63", vist i figur 10A, blev konstrueret ved samling af følgende velkendte fragmenter: 1. et vektorfragment, der omfatter T-DNA-grænsesekvenser 35 stammende fra pGSC1701A2 (EP 0 270 822); 43 DK 175585 B1 2. den kimære sekvens (nr. 3) fra eksempel 5, hvilken sekvens indeholder PSSU-promotoren, herbicidresistensgenet sfr og 3’-enden af T-DNA-genet 7; 5 3. den kimære sekvens (nr. 4) fra eksempel 5, hvilken sekvens indeholder PNOS-promotoren, neogenet og octopin-syntasegenets 3'-ende; og 10 4. en kimær sekvens, der indeholder PTA29-promotorkassetten fra eksempel 3, sammensmeltet i læseramme med: a) et gen, der koder for EcoRI-restriktionsendonudease fra E. coli (Green et al. (1981) 3. Biol. Chem. 256, 2143-2153; 15 Botterman og Zabeau (1985) Gene 37, 229-239), og som kan genkende og spalte målsekvensen GAATTC på et dobbeltstrenget DNA; følgende modifikationer blev udført i DNA-sekvensen af Green et al. (1981) under anvendelse af steddirigeret mutagenese som beskrevet i eksempel 3:

20 i· ATG-startkodonens nucleotider blev erstattet af ATGCA

til dannelse af et Nsil-sted ved startkodonen, hvilket gav følgende nucleotidsekvenser: A7GCA,TCT,AAT...; og 25 ti. W/ndll-W/ndlll-fragmentet af EcoRI-genet klonet i pEcoR12 (Botterman og Zabeau, 1985) blev klonet i den pMAC5-8-steddirigerede mutagenesevektor; og 30 b) 3’-enden af nopalinsyntasegenet fra eksempel 9.

et gen, der koder for en EcoRI-methylase under kontrol af sin naturlige promotor (Botterman og Zabeau (1985) Gene 37, 229-239), hvilken methylase kan hæmme aktiviteten af EcoRl i E. coli etter Agrobacterium for 35 at overvinde eventuel utæt ekspression af EcoRI-genet i mikroorganismer.

44 DK 175585 B1 pTVE63 er en binær type T-DNA-vektor, der inden for T-DNA-grænsesekvenserne indeholder 3 kimære sekvenser: PSSU-sfr og PNOS-neo, som er markør-DNA'er under kontrol af henholdsvis PSSU og PNOS som anden promotor; og PTA29-5 EcoRI-gen, som er et hankønssterilitets-DNA under kontrol af PTA29 som første promotor. Ekspression af hanskønssterilitets-DNA'et under kontrol af TA29-promotoren i tapetlagsceller producerer den fcoRI-restriktionsendonuclease, der spalter dobbeltstrenget DNA ved GAATTC-steder (for en gennemgang af type II-restriktionsmodifikationssystemer (se: Wilson (1988) TIG 4(11), 314-318) af 10 tapetlagscellerne, hvilket fører til disse cellers død.

Et plasmid betegnet pTVE62, vist i figur 10B, blev også konstrueret ved samling af følgende kendte fragmenter med PTA29: 15 1. et vektorfragment, der omfatter T-DNA-grænsesekvenser stammende fra pGSC1701A2; 2, den kimaere sekvens (nr. 3) fra eksempel 5, hvilken sekvens indeholder PSSU-promotoren, herbicidresistensgenet sfr og 20 3’-enden af T-DNA-genet 7; 3. den kimære sekvens (nr. 4) fra eksempel 5, hvilken sekvens indeholder PNOS-promotoren, neogenet og octopin-syntasegenets 3'-ende; 25 4. en kimær sekvens, der indeholder pTA29-promotorkassetten fra eksempel 3, sammensmeltet i læseramme med et genfragment, der koder for transitpeptidet af Mn-superoxiddismutase ("Mn-SOD"), som er et Λ/coI-PstI-fragment af et Hpal-HincfiU-fragment fra pSODl (Bowler et al.

(1989) Embol. 8, 31-38); følgende modifikationer blev udført i DNA-30 sekvensen af Bowler et al. under anvendelse af steddirigeret mutagenese som beskrevet i eksempel 3: i. de AA-nucleotider, der befinder sig opstrøms ved position -2 og -l af ATG-startkodonen, blev ændret til CC-nucleotider til dannelse af et 45 DK 175585 B1 /Vcol-sted ved startkodonen, hvilket gav følgende nudeotidsekvenser: - CCATGGCACTAC 5 H. nucleotiderne T,TCG,CTC, der befinder sig umiddelbart nedstrøms af transitpeptidets behandlingssted, blev ændret til C,TGC,AGC til dannelse af et Pstl-sted bag ved behandlingsstedet, hvilket gav følgende nudeotidsekvenser: 10

L Q T F S L CTC, CGC, GGC -, TTG.CAG.ACC.TTT.TCG.CTC

CTC,CGC,GGC, TTG,CAG,ACC,TTC,TGC,AGC...

Pstl hvor pilen viser transitpeptidsekvensens behandlingssted, og den øvre linje 20 viser aminosyresekvensen svarende til den Mn-SOD-kodende sekvens; Λ/coI-EsfI-fragmentet blev også sammensmeltet i læseramme med et gen, der koder for EcoRI-restriktionsendonucleasen fra E. coli (Greene et al.

(1981) 3. Biol. Chem. 256, 2143-2153; Botterman og Zabeau (1985) Gene 37, 229-239), og som kan genkende og spalte målsekvensen GAATTC på et 25 dobbeltstrenget DNA som fundet i pTVE63; og b) 3’-enden af nopalinsyntasegenet fra eksempel 9; og 5. et gen, der koder for EcoRI-methylase under kontrol af sin egen naturlige promotor (Botterman og Zabeau, 1985), hvilken methylase kan hæmme 30 aktiviteten af EcoRI i E. coli eller Agrobacterium, for at overvinde eventuel utæt ekspression af EcoRI-genet i mikroorganismer, idet dette gen indføjes i vektorfragmentet uden for grænsesekvenserne.

pTVE62 er en binær type T-DNA-vektor, der inden for grænsesekvenserne inde-35 holder 3 kimære sekvenser: PSSU-sfr og PNOS-ΝΡΠΙ, som er markør-DNA’er 46 DK 175585 B1 under kontrol af henholdsvis PSSU og PNOS som anden promotor; og pTA29-transitpeptid-EcoRI-endonucleasegenet, som er et hankønssterilitets-DNA med pTA29 som første promotor og en transitpeptidkodende sekvens mellem dem. Ekspression af hankønssterilitets-DNA'et under kontrol af TA29-promotoren i 5 tapetlagsceller producerer en restriktionsendonuclease, som er rettet mod tapetlagscellernes mitokondrier, og som spalter det dobbeltstrengede DNA ved GAATTC-stederne i sådanne celler. Dette fører til disse cellers død.

EKSEMPEL 17 10

Indførelse af de kimære DNA-sekvenser fra eksempel 16 i tobak og raps

Som beskrevet i eksemplerne 11 og 15 blev pTVE62 og pTVE63 mobiliseret fra E. coli til Agrobacterium C58C1 RifR, der bærer pMP9Q. De resulterende stammer, 15 der bærer pTVE62 med pMP90 og pTVE63 med pMP90, blev anvendt til transformation af tobak og anvendes derefter til transformation af raps ifølge fremgangsmåderne beskrevet i eksemplerne 11 og 13. At £coRI-endonuclease-generne ikke blev udtrykt i transformeret herbicid- og kanamycinresistent kallus og transformerede herbicid- og kanamycinresistente rødder vises ved vækst 20 heraf.

De transformerede planter overføres til væksthuset og dyrkes i jord til blomstring. Blomsterne af både tobak og raps undersøges, og for de transformerede planter observeres fænotyper, der i det væsentlige er de samme som fænotypen af de 25 transformerede tobaksplanter beskrevet i eksempel 10. Dette viser, at TA29-promotoren selektivt kan styre ekspression af det heterologe fcoRI-endonucle-asegen i tapetlagscellerne transformeret med pTVE62 og pTVE63, hvorved planterne gøres hankønssterile.

30 Det er klart, at opfindelsen ikke er begrænset til transformation af en specifik plante eller specifikke planter. Opfindelsen angår en hvilken som helst plante, hvor kernegenomet kan transformeres med et hankønssterilitets-DNA under kontrol af en første promotor, der selektivt kan styre ekspression af hankønssterilitets-DNA’et i plantens støvdragerceller, hvorved 35 planten bide kan blive selvbestøvet og krydsbestøvet. Fx angår opfindelsen 47 DK 175585 B1 planter såsom kartoffel, tomat, raps, lucerne, solsikke, bomuld, selleri, løg, majs, sojabønne, tobak, kålarter og sukkerroe.

Opfindelsen er heller ikke begrænset til de specifikke plasmider og vektorer, der 5 er beskrevet i de foregående eksempler, men omfatter derimod et hvilket som helst plasmid og en hvilken som helst vektor, der indeholder hankønssterilitets-DNA’et under kontrol af den første promotor.

Desuden er opfindelsen ikke begrænset til de specifikke promotorer, der er 10 beskrevet i de foregående eksempler, såsom TA29-promotoren, men omfatter derimod en hvilken som helst DNA-sekvens, der koder for en promotor, der selektivt kan styre ekspression af hankønssterilitets-DNA'et i støvdragerceller. I denne henseende omfatter opfindelsen DNA-sekvensen af TA29-promotoren i figur 3A samt en hvilken som helst tilsvarende DNA-sekvens, fx sekvensen af 15 TA13-promotoren i figur 3B og TA26-promotoren i figur 3C, som kan anvendes til selektivt at kontrollere ekspression af hankønssterilitets-DNA'et i en plantes tapetlagsceller. Det formodes endda, at DNA-sekvenserne af TA29-, TA26- og TA13-promotorerne kan modificeres ved: 1) erstatning af nogle kodoner med andre, der enten koder for de samme aminosyrer eller for andre aminosyrer; 20 og/eller 2) fjernelse eller tilføjelse af nogle kodoner; forudsat at sådanne modifikationer ikke i det væsentlige ændrer den kodede promotors egenskaber med hensyn til kontrol af tapetlagsspecifik ekspression af hankønssterilitet.

Desuden er opfindelsen ikke begrænset til de specifikke hankønssterilitets-DNA’er, 25 der er beskrevet i de foregående eksempler, men omfatter derimod en hvilken som helst DNA-sekvens, der koder for et første RNA, protein eller polypeptid, der signifikant forstyrrer metabolisme, funktion og/eller udvikling af en støvdragercelle, hvori det produceres, hvilken DNA-sekvens er under kontrol af den første promotor.

30

Opfindelsen er heller ikke begrænset til de specifikke markør-DNA’er, der er beskrevet i de foregående eksempler, men omfatter derimod en hvilken som helst DNA-sekvens, der koder for et andet RNA, protein eller polypeptid, der bibringer i det mindste et specifikt plantevæv eller specifikke planteceller, hvor en sådan 35 DNA-sekvens udtrykkes, et ejendommeligt træk sammenlignet med et sådant

Claims (85)

1. 5 PATENTKRAV
2. 1. Hankønssteril plante indeholdende et fremmed DNA, som er inkorporeret i kernegenomet i alle plantens celler, kendetegnet ved, at det fremmede DNA omfatter: 10 a) et hankønssterilitets-DNA, der koder for et første RNA, protein eller polypeptid, der, når det produceres i støvdragerceller i planten, er i stand til at slå cellerne ihjel eller er i stand til at gøre dem ubrugbare for at forhindre dannelsen af fertile hankønsgameter; og b) en første promotor, der selektivt styrer genekspression i plantens 15 støvdragerceller, idet hankønssterilitets-DNA'et er i den samme transkriptionelie enhed som og under kontrol af den første promotor, under forudsætning af, at hvis den første promotor er en promotor, som styrer ekspression af hankønssterilitets-DNA’et selektivt i mikrospore- og/eller pollenceller, så er kernegenomet i plantens celler homozygot. 20
3. 2. Plante ifølge krav 1,kendetegnet ved, at den første promotor styrer ekspression af hankønssterilitets-DNA'et i celler i støvknapperne.
4. 3. Plante ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den første promotor styrer 25 ekspression af hankønssterilitets-DNA’et i celler i plantens tapetlag eller i plantens epidermale celler i støvknapperne.
5. 4. Plante ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den første promotor er promotoren fra TA29-genet i Figur 3A. 30
6. 5. Plante ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den første promotor er promotoren fra det endogene TA26-gen fra tobaksplanten, hvilket gen koder for et mRNA, fra hvilket et cDNA, der omfatter nukleotidsekven-sen i Figur 3C, kan fremstilles, promotoren fra det endogene TA13-gen fra 35 tobaksplanten, hvilket gen koder for et mRNA, fra hvilket et cDNA, der omfatter DK 175585 B1 nukleotidsekvensen i Figur 3B, kan fremstilles, eller en promotor fra et endogent plantegen, som koder for et tapetlagsspecifikt mRNA, som kan hybridisere til TA26-genet, TA26-genet eller TA13-genet.
7. 6. Plante ifølge krav 1, hvilken plante er en homozygot plante, og i hvilken plante den nævnte første promotor selektivt styrer ekspressionen af hankønssterilitets-DNA'et i pollenceller fra den homozygote plante.
8. 7. Plante ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at 10 hankønssterilitets-DNA'et koder for: en RNase, især RNase TI.
9. 8. Plante ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at hankønssterilitets-DNAet koder for en barnase.
10. 9. Plante ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at hankønssterilitets-DNA’et koder for: en DNase, især en endonuklease, specifikt EcoRI; en protease, især et papain, specifikt papainzymogen eller papainaktivt protein; en glucanase; en lipase, især phospholipase A2; en lipidperoxidase; en cellevægsinhibitor; et bakterielt toxin, særligt A-fragmentet af difteriatoxin; eller 20 et ribozym, især ribozymet mod mRNA, for hvilket der kodes af TA29-genet i figur 3A, ribozymet mod mRNA fra TA26-genet, fra hvilket et cDNA omfattende sekvensen fra Figur 3C kan fremstilles, eller ribozymet mod mRNA, fra hvilket et cDNA omfattende sekvensen fra Figur 3B kan fremstilles; eller DNA der er et antisense-DNA, som koder for et RNA, som er komplementært til mRNA'et fra 25 TA29-genet, fra TA26-genet eller fra TA13-genet.
11. 10. Plante ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at hankønssterilitets-DNA'et koder for et enzym, som katalyserer syntesen af et fytohormon, især det enzym, der kodes for af gen 4 fra Agrobacterium T-DNA, 30 eller et enzym, der kodes for af gen 1 og/eller gen 2 fra Agrobacterium T-DNA.
12. 11. Plante ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, kendetegnet ved, at det fremmede DNA yderligere omfatter: (e) et første DNA, der koder for et transitpeptid, der er i stand til at 35 transportere det nævnte første protein eller polypeptid ind i en kloroplast eller et DK 175585 B1 mitokondrie i nævnte støvdragerceller; idet det første DNA er i samme transkriptionelle enhed som hankønssterilitets-DNA'et og den nævnte første promotor og mellem det nævnte hankønssterilitets-DNA og den nævnte første promotor. 5
13. 12. Plante ifølge et hvilket som helst af kravene 1- 11, hvilken plante er valgt fra gruppen af majs, kartoffel, tomat, raps, lucerne, solsikke, bomuld, selleri, løg, kløver, sojabønne, tobak, kålarter og sukkerroe.
14. 13. Plante ifølge et hvilket som helst af kravene 1- 12, kendetegnet ved, at det fremmede DNA også omfatter: (c) et markør-DNA, der koder for et andet RNA, protein eller polypeptid, som, når det er til stede i det mindste i et specifikt væv eller i det mindste i 15 specifikke celler i planten, gør planten nemt skelnelig fra andre planter, der ikke indeholder det andet RNA, protein eller polypeptid i det specifikke væv eller de specifikke celler; og (d) en anden promotor, der kan styre ekspression af markør-DNA'et i det mindste i det specifikke væv eller de specifikke celler; idet markør-DNA'et 20 er i den samme transkriptionelle enhed som og under kontrol af den anden promotor
15. 14. Plante ifølge krav 13, kendetegnet ved, at markør-DNA'et koder for et protein, der hæmmer eller neutraliserer virkningen af et herbicid. 25
16. 15. Plante ifølge krav 14, kendetegnet ved, at markør-DNA'et er et herbicidresistensgen, især et gen, der påfører resistens over for en glutamin-synthaseinhibitor såsom phosphinothricin.
17. 16. Plante ifølge krav 15, kendetegnet ved, at markør-DNA'et er et sfr-eller sfrv-gen.
18. 17. Plante ifølge krav 14, kendetegnet ved, at markør-DNA'et koder for et modificeret målenzym for et herbicid med lavere affinitet for herbicidet, især en 35 modificeret 5-enolpurovylshikimat-3 phosphatsynthase som mål for glyphosat, DK 175585 B1 eller en modificeret glutaminsynthetase som mål for en glutaminsynthaseinhi-bitor såsom phosphinotricin.
19. 18. Plante ifølge krav 13, kendetegnet ved, at markør-DNA'et er: et gen, 5 der koder for et protein eller et polypeptid, der tilføjer en farve tit i det mindste det nævnte specifikke væv eller de nævnte specifikke celler, især genet Al eller GUS-genet; eller et gen, der koder for et protein eller et polypeptid, der påfører resistens over for en sygdom eller over for et skadedyr, især et gen, der koder for et Bacillus thuringiensis-endotox'm, som påfører insektresistens, eller et gen, der 10 koder for et bakterielt peptid, der påfører en bakteriel resistens.
20. 19. Plante ifølge et hvilket som helst af kravene 13-18, kendetegnet ved, at den anden promotor er: en konstitutiv promotor, især en PNOS-promotor eller en POCS-promotor; en sårinducerbar promotor, især en TRI'- eller TR2'- 15 promotor; en promotor, som selektivt styrer genekspression i plantevæv med fotosyntetisk aktivitet, især en SSU-promotor; eller en promotor, som selektivt styrer genekspression i bladceller, kronbladceller eller frøceller, især celler i frøkappen.
21. 20. Plante ifølge krav 19, kendetegnet ved, at den anden promotor er en 35S-promotor eller en SSU-promotor.
22. 21. Plante ifølge et hvilket som helst af kravene 13 -20, kendetegnet ved, at det fremmede DNA yderligere omfatter: 25 (f) et andet DNA, der koder for et transitpeptid, der kan transportere det andet protein eller polypeptid ind i en kloroplast eller et mitokondrie af i det mindste det specifikke væv eller de specifikke celler; idet det andet DNA er i den samme transkriptionelle enhed som markør-DNA'et og den anden promotor og mellem markør-DNA’et og den anden promotor. 30
23. 22. Plante, kendetegnet ved, at den kan inficeres af Agrobacterium og som indeholder, inkorporeret i kernegenomet i alle dens celler, T-DNA'et fra pTTM4 i Figur 6, pTTM6 fra Figur 7A, pTTM6A' fra Figur 7B, pTTM8 fra Figur 8, pTVEPl fra Figur 9A, pTVEP2 fra Figur 9B, pTVE62 fra Figur 10B eller pTVE63 fra
24. 35 Figur 10A. DK 175585 B1
25. 23. Kultur af celler fra en plante ifølge et hvilket som helst af kravene 1 - 22.
26. 24. Promotor fra TA29-genet i Figur 3A. 5
27. 25. DNA, som indeholder et første kimaert DNA, der omfatter: a) et hankønssterilitets-DNA, der koder for et RNA, protein eller polypeptid, der, når det produceres i støvdragerceller i planten, er i stand til at slå cellerne ihjel eller er i stand til at gøre dem ubrugbare for at forhindre 10 dannelsen af fertile hankønsgameter; og b) en første promotor, der selektivt styrer genekspression i plantens støvdragerceller, idet DNA-sekvensen er i den samme transkriptionelle enhed som og under kontrol af den første promotor, under forudsætning af, at den første promotor ikke er en mikrospore-15 og/eller pollenspecifik promotor.
28. 26. DNA ifølge krav 25, kendetegnet ved, at den første promotor styrer ekspressionen af hankønssterilitets-DNA'et i celler i støvknappen.
29. 27. DNA ifølge krav 26, kendetegnet ved, at den første promotor styrer ekspressionen af hankønssterilitets-DNA'et i tapetlagsceller eller i epidermale celler i støvknappen i planten.
30. 28. DNA ifølge krav 27, kendetegnet ved, at den første promotor er 25 promotoren fra TA29-genet i Figur 3A.
31. 29. DNA ifølge krav 27, kendetegnet ved, at den første promotor er promotoren fra det endogene TA26-gen i tobaksplanten, hvilket gen koder for et mRNA, fra hvilket et cDNA, der omfatter nukleotidsekvensen i Figur 3C, kan 30 fremstilles, eller promotoren fra det endogene TAl3-gen fra tobaksplanten, hvilket gen koder for et mRNA, fra hvilket et cDNA, der omfatter nukleotidsekvensen i Figur 3B, kan fremstilles, eller en promotor fra det endogene gen fra en plante, hvilket gen koder for et tapetlagsspecifikt mRNA, der kan hybridisere til TA29-genet i Figur 3A, TA26-genet eller TA13-genet. 35 DK 175585 B1
32. 30. DNA ifølge et hvilket som helst af kravene 25 - 29, kendetegnet ved, at hankønssterilitets-DNA'et koder for en ribonuklease såsom RNase TI.
33. 31. DNA ifølge et hvilket som helst at kravene 25 - 29, kendetegnet ved, 5 at hankønssterilitets-DNA’et koder for en barnase.
34. 32. DNA ifølge et hvilket som helst at kravene 25 - 29, kendetegnet ved, at hankønssterilitets-DNA'et koder for: en DNase, især en endonuklease, specifikt EcoRl; en protease, isæret papain, specifikt papainzymogen eller papainaktivt io protein; en glucanase; en lipase, især phospholipase A2; en lipidperoxidase; en cellevægsinhibitor; et bakterielt toxin; eller et ribozym, især ribozymet mod mRNA, der kodes for af TA29-genet i Figur 3A, ribozymet mod mRNA fra TA26-genet, fra hvilket et cDNA, der omfatter sekvensen i Figur 3C, kan fremstilles, eller ribozymet mod mRNA, fra hvilket et cDNA, der omfatter sekvensen i Figur 15 3B, kan fremstilles; eller er et antisense-DNA, som koder for et RNA, som er komplementært til mRNA fra TA29-genet, TA26-genet eller TAl3-genet.
35. 33. DNA ifølge et hvilket som helst at kravene 25 - 29, kendetegnet ved, at hankønssterilitets-DNA’et koder for et enzym, som katalyserer syntesen af et 20 fytohormon, især det enzym, der kodes for af gen 4 fra Agrobacterium T-DNA, eller et enzym, der kodes for af gen 1 og eller gen 2 fra Agrobacterium T-DNA.
36. 34. DNA ifølge et hvilket som helst at kravene 25 - 33, hvilket DNA også omfatter: 25 (e) et første DNA, der koder for et transitpeptid, der er i stand til at transportere det nævnte første protein eller polypeptid ind i en kloroplast eller et mitokondrie i nævnte støvdragerceller,· idet det første DNA er i samme transkriptionelle enhed som det nævnte hankønssterilitets-DNA og den nævnte første promotor og mellem nævnte hankønssterilitets-DNA'et og den 30 første promotor og imellem hankønssterilitets-DNA'et og den første promotor.
37. 35. DNA ifølge et hvilket som helst at kravene 25 - 34, hvilket DNA også omfatter et andet kimært DNA, der omfatter: (c) et markør-DNA, der koder for et andet RNA, protein eller polypeptid, som, 35 når det er til stede i det mindste i et specifikt væv eller i det mindste i speci- DK 175585 B1 fikke celler i planten, gør planten nemt skelnelig fra andre planter, der ikke indeholder det andet RNA, protein eller polypeptid i det specifikke væv eller de specifikke celler; og (d) en anden promotor, der kan styre ekspression af markør-DNA'et i det 5 mindste i det specifikke væv eller de specifikke celler; idet markør-DNA'et er i den samme transkriptionelle enhed som og under kontrol af den anden promotor
38. 36. DNA ifølge krav 35, kendetegnet ved, at markør-DNAet koder for et 10 protein, der hæmmer eller neutraliserer virkningen af et herbicid.
39. 37. DNA ifølge krav 36, kendetegnet ved, at markør-DNAet er et herbicidresistensgen, især et gen, der påfører resistens over for en glutaminsynthetasehæmmer såsom phosphinothricin. 15
40. 38. DNA ifølge krav 37, kendetegnet ved, at markør-DNAet er et sfr- eller sfrv-gen.
41. 39. DNA ifølge krav 36, kendetegnet ved, at markør-DNAet er et gen, der 20 koder for et modificeret målenzym for et herbicid, især en modificeret 5- enolpyruvylshikimat-3 phosphatsyntase som mål for gfyphosat, eller en modificeret glutaminsynthetase som mål for en glutaminesynthetasehæmmer såsom phosphinocitricin, hvilket målenzym har en lavere affinitet for herbicidet.
42. 40. DNA ifølge krav 35, kendetegnet ved, at markør-DNAet er et gen, der koder for et protein eller et polypeptid, der påfører en farve i det mindste til det specifikke væv eller de specifikke celler, især genet Al eller GUS-genet; eller et gen, der koder for et protein, der påfører resistens over for en sygdom eller over for et skadedyr, især et gen, der koder for et Bacillus thuringiensis endotoxin, 30 som påfører resistens over for insekter, eller et gen, der koder for et bakterielt peptid, der påfører en bakteriel resistens.
43. 41. DNA ifølge krav 35, kendetegnet ved, at den anden promotor er: en konstitutiv promotor, især en PNOS-promotor eller en POCS-promotor; en 35 sårinducerbar promotor, især en TRI’- eller TR2‘-promotor; en promotor, der DK 175585 B1 selektivt styrer genekspression i plantevæv med fotosyntetisk aktivitet, eller en promotor, som selektivt styrer gegnekspression i bladceller, støvdragerceller eller frøceller, især celler i frøkappen.
44. 42. DNA ifølge krav 41, kendetegnet ved, at den anden promotor er en 35S eller en SSU-promotor.
45. 43. DNA ifølge et hvilket som helst af kravene 35 - 42, hvilket DNA yderligere omfatter: 10 (f) et andet DNA, der koder for et transitpeptid, der kan transportere det andet protein eller polypeptid ind i en kloroplast eller et mitokondrie i det mindste i det specifikke væv eller de specifikke celler; idet det andet DNA er i den samme transkriptionelle enhed som markør-DNA'et og den anden promotor og mellem markør-DNA'et og den anden promotor. 15
46. 44. DNA, som er T-DNA’et fra pTTM4 i Figur 6, pTTM6 fra Figur 7A, pTTM6A' fra Figur 7B, pTTM8 fra Figur 8, pTVEPl fra Figur 9A, pTVEP2 fra Figur 9B, pTVE62 fra Figur 10B eller pTVE63 fra Figur 10A.
47. 45. DNA ifølge et hvilket som helst af kravene 25 - 44, hvilket DNA er et kerne-DNA fra en celle fra en plante eller fra et frø.
48. 46. Vektor, som omfatter DNA'et ifølge et hvilket som helst af kravene 25 - 44.
49. 47. Celle fra en plante, hvilken celle indeholder DNA'et ifølge et hvilket som helst af kravene 25 - 44.
50. 48. Celle fra en plante, hvilken celle indeholder DNA'et ifølge et hvilket som helst af kravene 25 - 44 stabilt integreret i sit kerne-DNA. 30
51. 49. Celle ifølge krav 47 eller krav 48, hvilken celle kan regenereres til en plante som er hankønssteril.
52. 50. Celle ifølge et hvilket som helst af kravene 47 - 49, kendetegnet ved, 35 at DNA’et omfatter et hankønssterilitets-DNA. der koder for en ribonuklease. DK 175585 B1
53. 51. Celle ifølge et hvilket som helst af kravene 47 - 49, kendetegnet ved, at DNA’et omfatter et hankønssterilitets-DNA, der koder for en barnase.
54. 52. Celle ifølge et hvilket som helst af kravene 47-51, kendetegnet ved, at DNA'et omfatter en første promotor, som styrer ekspressionen i støvknapceller.
55. 53. Celle ifølge et hvilket som helst af kravene 47 - 52, kendetegnet ved, at DIMA'et omfatter en første promotor, som styrer ekspressionen i tapetlagsceller. 10
56. 54. Celle ifølge et hvilket som helst af kravene 47- 53, kendetegnet ved, at DNA'et omfatter en første promotor, som er promotoren fra TA29-genet i Figur 3A.
57. 55. Celle ifølge et hvilket som helst af kravene 47 - 54, kendetegnet ved,' at DNA'et omfatter et herbicidresistensgen, der er under kontrol af en anden promotor, som er en konstitutiv promotor, eller af en promotor, som selektivt styrer genekspression i plantevæv med fotosyntetisk aktivitet.
58. 56. Celle ifølge krav 55, kendetegnet ved, at herbicid resistensgenet påfører resistens over for en glutaminsynthetaseinhibitor såsom phosphinothricin.
59. 57. Celle ifølge krav 56, kendetegnet ved, at herbicidresistensgenet er sfr-eller sfrv-genet. 25
60. 58. Celle ifølge et hvilket som helst af kravene 55 - 57, kendetegnet ved, at den anden promotor er en 35S-promotor eller en SSU-promotor.
61. 59. Plante, som indeholder DNA’et ifølge et hvilket som helst af kravene 25 - 45. 30
62. 60. Plante, som indeholder DNA'et ifølge et hvilket som helst af kravene 25 - 45 i alle dens celler.
63. 61. Plante tfølge 59 eller 60, hvilken plante er hankønssteril. 35 DK 175585 B1
64. 62. Plante ifølge et hvilket som helst af kravene 59 - 61, hvilken plante er en hybridplante.
65. 63. Plantefrø, som indeholder DNA'et ifølge et hvilket som helst af kravene 25 -5 45.
66. 64. Fremgangsmåde til fremstilling af en hankønssteril plante og reproduktions-materialer, fx frø fra den hankønssterile plante, hvilken fremgangsmåde omfatter introduktion af DNA'et ifølge et hvilket som helst af kravene 35 - 44 i kerne- 10 genomet i en plantecelle for derved at opnå en transformeret plantecelle, regenerering af den hankønssterile plante fra den transformerede plantecelle, og eventuelt fra denne hankønssterile plante opnåelse af reproduktionsmaterialerne eller afkommet, som indeholder det fremmede DNA.
67. 65. Fremgangsmåde til fremstilling af et frø fra en plante, som er en frødannende og hankønssteril plante, hvilken fremgangsmåde omfatter: - krydsbestøvning i) af planter ifølge et hvilket som helst af kravene 14 - 22, eller planter, der indeholder DNA’et ifølge et hvilket som helst af kravene 36 - 44 stabilt integreret i kerne-DNA'et i alle deres celler, hvilke planter er 20 frødannende planter og er hankønssterile, kendetegnet ved, at markør-DNA'et er et gen, der påfører resistens over for et herbicid, eller et gen, der koder for et modificeret målenzym for dette herbicid, og ii) hankønssterile planter uden markør-DNA'et og den anden promotor, - påføring af herbicidet på planterne for at eliminere hankønsfertile planter, 25. opnåelse af frø fra de bestøvede hankønssterile planter.
68. 66. Fremgangsmåde ifølge krav 65, hvilken fremgangsmåde omfatter påføring af herbicidet forud for krydsbestøvningen.
69. 67. Fremgangsmåde »følge krav 65, hvilken fremgangsmåde omfatter påføring af herbicidet efter krydsbestøvningen.
70. 68. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 65 - 67, DK 175585 B1 kendetegnet ved, at markør-DNA’et er et gen, der er i stand til at påføre resistens over for en glutaminsynthetaseinhibitor såsom phosphinotricin, især sfr-eller sfrv-genet, og omfatter påføring af synthetaseinhibitoren på planterne.
71. 69. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 65 - 68, kendetegnet ved, at de hankønssterile planter ud over markør-DNA'et indeholder et andet markør-DNA stabilt integreret i kernegenomet i alle deres celler i samme genetiske locus som hankønssterilitets-DNA’et, især et andet herbicidresistensgen eller et gen, der koder for et modificeret målenzym for et 10 andet herbicid; og hvori de hankønsfretile planter, der anvendes til krydsbestøvning kun indeholder det andet markør-DNA stabilt integreret i kernegenomet i deres celler.
72. 70. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 65 - 69, 15 kendetegnet ved, at de hankønssterile planter og de hankønsfertile planter kan føre til hybridplanter, og hvilken fremgangsmåde omfatter opnåelse af hybride frø fra de hankønssterile planter.
73. 71. Fremgangsmåde til dyrkning af en indavlet linie af planter, der indeholder 20 DNA'et ifølge et hvilket som helst af kravene 35 - 44 stabilt integreret i kernegenomet i alle deres celler, hvilke planter er frødannende hankønssterile planter, som er heterozygote for DNA’et, og i hvilke planter markør-DNA'et er et gen, der påfører resistens over for et herbicid, eller er et gen, der koder for et modificeret målenzym for dette herbicid, hvilken fremgangsmåde omfatter: 25. krydsbestøvning af i) hankønssterile planter af den indaviede plantelinie, og ii) hankønsfertile planter fra denne indavlede linie uden markør-DNA’et og den anden promotor, og, efter denne krydsbestøvning, - opnåelse af frø fra de hankønssterile planter, 30. dyrkning af frøene til planter og - påførelse af herbicidet på planterne for at eliminere hankønsfertile planter.
74. 73, Et par moderplanter til produktion af frø omfattende: a) en hankønssteril moderplante, der indeholder DNA'et ifølge et hvilket som helst af kravene 25 - 45, 35 og b) en hankønsfertil moderplante. DK 175585 B1
75. 74. Et par moderplanter ifølge krav 73,kendetegnet ved, at den hankønssterile moderplante og den hankønsfertile moderplante tilhører forskellige linier. 5
76. 75. Et par moderplanter ifølge krav 73,kendetegnet ved, at den hankønssterile moderplante og den hankønsfertile moderplante er afledt af den samme indavlede linie.
77. 76. Et par moderplanter ifølge et hvilket som helst af kravene 74 - 76 , kendetegnet ved, at DNA'et omfatter et hankønssterilitets-DNA, som koder for en ribonuklease.
78. 77. Et par moderplanter ifølge et hvilket som helst af kravene 74 - 76 , 15 kendetegnet ved, at DNA’et omfatter et hankønsterilitets-DNA, som koder for en barnase.
79. 78. Et par moderplanter ifølge et hvilket som helst af kravene 74 - 78, kendetegnet ved, at DNA'et omfatter en første promotor, som styrer 20 ekspression i celler i støvknappen.
80. 79. Et par moderplanter ifølge et hvilket som helst af kravene 74 - 79, kendetegnet ved, at DNA’et omfatter en første promotor som styrer ekspression i tapetlagsceller. 25
81. 80. Et par moderplanter ifølge et hvilket som helst af kravene 74 - 79, kendetegnet ved, at DNA'et omfatter en første promotor, som er promotoren fra TA29-genet i Figur 3A.
82. 81. Et par moderplanter ifølge et hvilket som helst af kravene 74 - 81, kendetegnet ved, at DNA'et omfatter et herbicidresistensgen, som er under kontrol af en anden promotor, som er en konstitutiv promotor eller er under kontrol af en promotor, som selektivt styrer genekspression i plantevæv, der har fotosyntetisk aktivitet. 35 DK 175585 B1
83. 82. Et par moderplanter ifølge krav 82, kendetegnet ved, at herbicidresistensgenet påfører resistens over for en giutaminsynthetaseinhibitor såsom phosphinothricin.
84. 83. Et par moderplanter ifølge krav 83, kendetegnet ved, at herbicidresistensgenet er sfr- eller sfrv-genet.
85. 84. Et par moderplanter ifølge et hvilket som helst af kravene 82 - 84, kendetegnet ved, at den anden promotor er en 35S-promotor eller en 10 SSU-promotor.