BRPI0701230B1 - Composições e métodos para modificar a expressão de genes usando o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de algodoeiro - Google Patents

Abstract

composições e métodos para modificar a expressão de genes usando o promotor do gene da proteina de conjugação à ubiquitina de plantas de algodoeiro. a presente invenção compreende a descrição de uma nova seqüência regulatória provida para melhorar a expressão de urna seqúência de nucleotídeo, tal como genes estruturais, em plantas, incluindo monocoti ledôneas e dicotiledôneas. mais especificamente a invenção refere-se a seqúências regulatórias de polinucleotídeos isoladas de plantas de algodoeiro que são capazes de inicial- e acionar a transcrição de polinucleotídeos, e ao uso destas seqúências regulatórias na modificação de transcrição de polinucleotídeos endógenos e/ou heterólogos e produção de polipeptídeos. a invenção descreve ainda construções de dna que contém o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de algodoeiro que está operacionalmente ligado a um gene heterólogo e/ou endógeno. além disso, a invenção diz respeito ao uso destas construções na forma de vetores de expressão, vetores recombinantes e em plantas, células vegetais ou protoplastos transgénicos. a invenção ainda descreve um método utilizando tais construções contendo o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de algodoeiro para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA MODIFICAR A EXPRESSÃO DE GENES USANDO O PROMOTOR DO GENE DA PROTEÍNA DE CONJUGAÇÃO À UBIQUITINA DE PLANTAS DE ALGODOEIRO (51) Int.CI.: C12N 15/29; C12N 15/62; C12N 15/10; C12N 15/82 (73) Titular(es): EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA - EMBRAPA (72) Inventor(es): MARIA DE FÁTIMA GROSSI DE SÁ; LUCIANE MOURÃO GUIMARÃES; JOÃO AGUIAR NOGUEIRA BATISTA; ANTONIO AMÉRICO BARBOSA VIANA; RODRIGO DA ROCHA FRAGOSO; THALES LIMA ROCHA » * » · · · · · • · · · » ♦ · t • · · · • * « » »

MODIFICAR A EXPRESSÃO DE DO GENE DA PROTEÍNA DE

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA GENES USANDO O PROMOTOR CONJUGAÇÃO À UBIQUITINA DE PLANTAS DE ALGODOEIRO

Campo da Invenção

Λ presente invenção está relacionada a uni novo promotor de expressão de gene^ d j.

em plantas. Mais especificamente a in\ençào refere-se a seqüências regulatórias de polinucleotídeos isoladas de plantas de algodoeiro que sào capazes de iniciar c acionar a transcrição de polinucleotídeos, e ao uso destas seqüências regulatórias na modificação de transcrição de polinucleotídeos endógenos e/ou heterólogos e produção de polipeptídeos. A invenção descreve ainda construções de DNA que contém o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de algodoeiro que está operacionalmente ligado a um gene heterólogo e/ou endógeno. Além disso, a invenção diz respeito ao uso destas construções na forma de vetores de expressão, vetores recombinantes e em plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos. A invenção ainda descreve um método utilizando tais construções contendo o promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de plantas de algodoeiro para produção de plantas, células vegetais ou protoplastos transgênicos.

Fundamentos da Invenção

A expressão de um gene é regulada, em parte, pelos processos celulares envolvidos na transcrição. Durante a transcrição, um RN A de filamento único, complementar à seqüência de DNA a ser transcrita é formado pela ação de polimerases de RN A. A iniciação de transcrição em células eucari óticas é regulada por interações complexas entre motivos de DNA cis-atuantes. localizados dentro do gene a ser transcrito, e fatores de proteína trans-atuantes. Dentre as regiões regulatórias cis25 atuantes estão as seqüências de DNA, chamadas promotores, às quais a RNA polimerase é primeiramente ligada, direta ou indiretamente. Para efeitos da presente invenção, o termo “promotor” se refere à seqüências específicas de DNA, usual mente à montante (5’) da região codificadora de um gene estrutural, que controla a expressão desta região codificadora devido a sua capacidade de prover um sítio de

2.37 • ♦ »«»*·«» · * 4 « « · · * · » » · · · · · « ««4 · · * · · ··»*··» · · « « reconhecí mento para a RN A polímerase e on outros fatores necessários para o início da transcrição, c que para esta se inicie no local correto do gene.

Tipicamente, um promotor possui um ‘NATA box e uma região de ativação à montante. Este TATA box é o responsável pela localização do início da transcrição.

aproximadamente 25 pares de base na direção do início da seqüência codifícadora do gene (3’).

Existem dois tipos básicos de promotores, os induzíveis e os não induzíves. também chamados constitutivos. Um promotor induzível é um promotor capaz de ativar (direta ou indiretamente) a transcrição de uma ou mais seqüências de DNA ou genes em resposta a um determinado indutor. Na falta deste indutor, as seqüências de DNA ou genes não serão transcritos. O indutor pode ser um componente químico (descrito, por exemplo, no documento de patente WO9519443), um estresse de origem fisiológica (como no caso de ferimentos, que é descrito, por exemplo, no documento de patente US6677505), ou um composto endógeno gerado em resposta à mudanças no desenvolvimento da planta.

Existem inúmeros promotores tecido-específicos descritos para plantas, como é o caso da expressão específica em semente (WO8903887), tubérculo (como mencionado no pedido de patente US2OO3O175783, Keil et al., 1989 EMBO J. 8; 1323:1330), folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783. Hudspeth et al.. 1989 Plant Mol Biol 12:579-589), fruta (Edwards and Coruzzi (1990) Annu.Rev.Genet. 24, 275 a 303 e US5753475), caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783. Keller et al., 1988 EMBO J. 7: 3625-3633), tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US2O03OJ 75783. Peleman et al., 1989 Gene 84: 359-369 e Schmülling et al. (1989) Plant Cell 1, 665-670), raiz (US20060143735 e como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller et al., 1989 Genes Devei. 3:1639-1646). estames (WO8910396, WO9213956). promotores específicos da zona de deiscêneia (WO9713865) e meristema (íto et al. (1994) Plant Molecular Biology, 24, 863 a 878).

Os promotores constitutivos, por sua vez, sao capazes de dirigir a expressão de seqüências de DNA durante todo o desenvolvimento de uma planta, além de não possuir uma especificidade quanto ao local de expressão desta seqüência. sendo esta, então, expressa em uma grande variedade de células e tecidos da planta. Apesar disso, o termo “constitutivo¹¹ não implica que a seqüência c expressa nos mesmos níveis em todas as células vegetais.

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Com as técnicas dc recombinaçao. é possível ativar o local de início da transcrição de uma seqüência nucleotídiea de interesse, como a de uma seqüência heteróloga ou de ocorrência nào natural· numa célula hospedeira vegetal.

Os promotores que causam a expressão constitutiva dos genes controlados por 5 eles podem ser utilizados, por exemplo, para selecionar as células vegetais transformadas, na expressão de um gene marcador de seleção em plantas transgênicas. na geração de células vegetais resistentes a antibióticos, ou para geração de vegetais tolerantes a herbicidas, tolerantes a inseticidas e resistentes e ao estresse de patogeno. visto que os produtos dos genes controlados por estes estão presentes em todas as partes > 10 do vegetal.

Os genes exógenos de importância agronômica, medicinal ou outra podem ser expressos em uma variedade de vegetais, por exemplo, para a geração de proteínas recombinantes heterólogas e para a geração de vegetais que contenham polipeptídeos de mamíferos. As quantidades do padrão de expressão no espaço e no tempo, de genes de vegetais endógenos, também podem ser vantajosamente alterados com 0 auxílio de promotores constitutivamente ativos.

Os primeiros promotores utilizados na expressão de genes em plantas foram de origem vi ral ou bacteriana, no caso, de bactérias do gênero Agrobacterium. Ambos os sistemas apresentam vantagens no caso de expressão heteróloga em plantas, pois esse princípio constitui a base de seu mecanismo de infecção. Muitos destes promotores vêm sendo amplamente utilizados na produção de plantas geneticamente modificadas, expressando proteínas de interesse.

Além dos promotores derivados do T-DNA de Agrobacterium como 0 responsável pela síntese de manopina (mas), octopina (oes) e de nopalina (nos), existem os promotores derivados de vírus, onde o mais amplamente utilizado é 0 CaMV35S. correspondendo ao fragmento promotor 35S do vírus mosaico da couve flor. Mais tarde, este mesmo promotor teve sua região regulatória duplicada e fundida a uma sequência cnhancer do vírus mosaico da alfafa, gerando um promotor de plantas recombinante bastante eficiente na indução da expressão de sequências codificadoras a ele associadas.

Outros promotores constitutivos de origem viral são, por exemplo, 0 promotor do vírus mosaico de escrofulária (PI 1101063-0). do badnavírus que infecta a banana australiana (US6391639) e o promotor do vírus bacilofonne da cana-de-açúcar (US6489462). No entanto, os promotores virais e de Agrobacterium possuem problemas • * * · · · · * · · · · · t » « · · » · · » · • · · » · »··»«· « · · . 1 Λ »·»«····»·»·

-+ > ♦«· ««««·'» « · · « • · · · « · » « 9 · » · · « • · · · · * · « · ·*«»»·» *· · · cm relação a sua capacidade regulatória. podendo ser particularmente instaxeis e propensas a transferência horizontal de genes e a rccombi nação getuea. ressaltando a importância da busca de promotores de origem \egetal.

Os promotores constitutivos intrínsecos de v egetais sào. por exemplo, o 5 promotor da alfa tubulina de café (1504412^3). o promotor da proteína trealosc 6tostato sintase de . J. thítliima (l 'S2OO2O1 1 5S5O). promotores da actma-2. enolase. ( ios2 e ! 41 dc milho (l 'S6670467), promotor da Y-ATPase de Meta valparts (P100135o 2). promotor hspSO de Brassica (PIO5OO2QO-5 >.

Apesar de muito desses promotores vegetais apresentarem uma forte expressão. * B) os dados mostrados dos presentes promotores se referem basicamente a uma analise qualitativa. .A presente invenção, no entanto, além de apresentar dados qualitativos também apresenta dados quantitativos através do ensaio tluorimétrico demonstrando.

através das análises, sua capacidade de alta expressão.

Os promotores acima descritos foram alinhados com a presente invenção, não 15 apresentando identidade significativa entre eles. O melhor alinhamento obtido foi com o promotor de alfa tubulina de café, com 44.3 % de identidade. Esse alinhamento pode ser feito utilizando softwares existentes na internet, um deles é o BLASTN. que está disponível na página do National Center for Bioteehnology Information/NC BI (\v_w \\ .nebLnJm.nihvgv).

O promotor da proteína trealose 6-fosfato sintase de .1. ihaliana (VS20020115850) mostra uma diminuição da atividade na raiz com o tempo de denvolvimento da planta. A presente invenção, no entanto apresentou uma alta atividade de expressão nos tecidos de plantas de Arahidopsis transgênicas com 3 meses, mostrando que a seqüência ueeA1.7 possui capacidade de expressão em altos níveis.

não apenas no período de desenvolvimento, mas também na planta madura, o que constitui um alto potencial tecnológico, já que a maioria das plantas são atacadas por insetos-praga ao longo de toda vida.

Para expressar os genes de seleção e os genes de resistência, é desejável ter promotores disponíveis que apresentem uma atividade constitutiva forte e uniforme e ao longo de todo período vegetativo, se possível, em todos os tecidos vegetais ou tipos de células que, além disso, apresentem atividade ainda maior ou que não sejam reprimidos sob condições de estresse.

Mesmo que os promotores supracitados tenham sido caracterizados como constitutivos, os padrões dc expressão temporal e espacial sc diferem, tomando-os • · · · • · * · · · · · ft <*·*»· · · · · inapropriados para determinadas aplicações Portanto, fa/-se neeessana a prospeeçàu e o estudo de outros promotores de plantas. Além disso, para determinadas aplicações na geração de plantas geneticamente modificadas. são desejáveis altos níveis de expressão, aumentando, assim, os níveis do produto protéieo de interesse. Altos níveis da expressão da proteína auxiliam na geração de plantas, exibindo propriedades tenotipieas importantes eomereialmente. tais como resistência a msetos-praga e doenças, tolerância a estresse ambiental (por exemplo, seca, altas temperaturas, frio, intensidade luminosa, comprimento do dia. químicos, entre outros), qualidade melhorada (por exemplo, alta produção de frutos, extensão do eielo de vida, uniformidade da torma e da cor. alto conteúdo de açúcar, alto conteúdo de vitamina C e A. baixa acidez, entre outros).

Promotores podem ser mais efetivos se isolados da mesma espécie da planta transgêniea gerada. A expressão da β-glucuronidase (GL'S). sob o controle do promotor da actina de arroz (Aetl) em protoplastos de arroz transformado, foi aproximadamente 6 vezes maior do que a expressão sob o controle do promotor constitutivo da álcool desidrogenase (Adhl) de milho (US6587O1). Portanto, além de poder ser utilizado como promotor constitutivo em diversas espécies vegetais, o promotor da presente invenção apresenta grandes vantagens com relação à produção de plantas transgeneias de algodão.

Ubiquitina é uma das proteínas mais conservadas em cucariotos. fina função fisiológica para ubiquitina é se conjugar com uma proteína alvo como um sinal de reconhecimento para degradação protéica. A degradação seletiv a de proteínas anormais c realizada em muitas proteínas regulatórias de vida curta, incluindo proteínas do ciclo celular, moduladores de crescimento celular e fatores de transcrição. Em organismos mais complexos, a ubiquitina tem sido codificada por duas pequenas famílias de genes, denominadas de “genes poliubiquitina e genes de fusão de ubiquitina. Genes poliubiquitina compreendem uma repetição em tandem da cabeça para cauda de 22<8pb. com cada repetição codificando 76 aminoáeidos de um monômero de ubiquitina. O número de repetições em tandem reportou variações entre genes dentro dos genomas e entre organismos, de 3 em Dictostylium a aproximadamente 50 em Tiypanosoma cruzi. Por outro lado, a família de gene de fusão de ubiquitina codifica uma repetição simples fusionada com um a dois polipeptídeos com 52 ou 76-80 aminoáeidos cada (Callis et al.. “Ubiquitin and Ubiquitin Genes in Higher Plants”, Oxford Surveys of Plant Molecular & Cell Biology, (1989). vol.6. pp. 1-30). Estudos de genes de ubiquitina em diferentes plantas mostram que os genes de ubiquitina são expressos em todos os •* *· * * > · * «««««» «·4 _ζ > -F · ♦ < t · · · · » · · · ¹ f), J / *♦·»«···♦<**»· b ·*«»·*······« fl ··♦ <* * «« ««·»«»» »* *» tecidos; no entanto, a expressão diferencial dos genes de ubiquitina também é visualizada entre a família gêniea de ubiquitina. Cada repetição em tandem ou gene de ubiquitina pode ser expresso diferencialmente em células ou tecidos.

Promotores de genes da ubiquitina têm mostrado dirigir a expressão de genes. 5 usualmente GUS ou cloranfenieol aeetil transferase (C'AT). em células ou plantas transformadas. Tais promotores tèm sido isolados de Arabidopxis (Callis et al., Cbiquitm Extension Proteins of Λ .thaliana. The Journal of Biologieal Chemistry (1990), vol. 265.η^ι’21. pp. 12486-12493): girassol (Binet et al,, Anaíysis of a sunflower polyubiquitin promoter by transient expression (1991) Plant Science, vol 79, pp. 8710 94); fumo (Genschick et al., “Strueture and promotor activity of a stress and dcvelopmentallv regulated polyubiquitin encoding gene of Nicotiana tabaeum¹’, Gene, (1994) vok 148, pp. 195-202); milho (US20030066108; US6020190; US5614399; US5510474; Christensen et al., “Maize polyubiquitin genes: strueture, tbermal pertubation of expression and transcript splieing, and promoter activity following transfer to protoplasts by eleetroporation, Plant Molecular Biology, (1992) vol. 18, pp. 675-689); arroz (US652870I); cana-de-açúcar (US6706948); salsa (W02003102198); Pi nus e eucalipto (PI0309870-2). Tais promotores presentes foram alinhados no BLASTN com a presente invenção, não apresentando similaridade. Os documentos de patente US20030066108; US6020190; US5614399 e US5510474 descrevem versões engenheiradas do promotor da ubiquitina de milho para aumentar os níveis de expressão quando comparados aos níveis de expressão do promotor de ubiquitina nativo. A invenção relata que o promotor regula a expressão do gene poliubiquitina de milho contendo 7 repetições em tandem. A expressão deste gene de ubiquitina se mostrou constitutiva a 25°C. e foi induzida pelo calor a 42°C. O promotor foi utilizado com sucesso para transformar outras plantas monocotiledôneas além do milho, incluindo trigo, cevada e arroz. Porém o promotor da presente invenção apresentou ser um excelente promotor constitutivo, não sofrendo alterações no seu nível de expressão, quando submetido a diferentes temperaturas, além de possuir uma alta expressão ao longo de todo seu ciclo de vida,

O algodão (Gossypium spp) é uma das mais importantes culturas mundiais, considerada a mais importante das fibras têxteis. Entre os maiores produtores de algodão do mundo, o Brasil destaca-se pela sua produção, estando entre os principais produtores de algodão mundial. No entanto o aumento do custo da produção é ¹ / ' Λ ! ···»···»»·.»·* « ··***«····*·* ··· «· » ·· ♦···»·» ** «· influenciada por problemas na agricultura, como o controle de insetos praga, que gera custos de cerca de 25% dos custos totais de produção.

Visando o controle desses insetos-praga, a produção de plantas geneticamente modificadas expressando proteínas que confiram à planta resistência vem sendo utilizada com bastante sucesso. Porém, para a obtenção destas plantas, é necessário o controle e direcionamento da expressão das proteínas entorno tóxicas. Para a obtenção de plantas transgênicas com níveis adequados de proteínas que confiram resistência a insetos nas plantas, a escolha de promotores que direcionem a expressão é extremamente importante. No entanto, existem poucos promotores efetivos para expressão em plantas de algodão disponíveis no mercado atualmente, e nenhum tem demonstrado uma eficiência maior de expressão comparado com o promotor da presente invenção.

Sumário da invenção

A presente invenção compreende a descrição de uma nova seqüência regulatória provida para melhorar a expressão de uma seqüência de nucleotídeo, tal como genes estruturais, em plantas, incluindo monocotiledôneas e dicotiledôneas. De acordo com a presente invenção é descrito um promotor constitutivo de plantas de algodão (Gossypium hirsutum) denominado de uceA1.7 junto com um método para uso dessa região regulatória de poli nucleotídeo para modificação de expressão de polinucleotídeos endógenos e/ou heterólogos em plantas transgênicas.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma seqüência de polinucleotídeo isolada de plantas de algodão (G. hirsutum) que possua 403o. preferencialmente 60%, mais preferencial mente 75%, mais preferencialmente ainda 90% de identidade com a SEQ ID NO1; seqüência reversa de SEQ ÍD NO1; sondas e iniciadores correspondendo à SEQ ID NO1.

Em outro aspecto, a presente invenção provê genes quiméricos compreendendo o polinucleotídeo da presente invenção, ou sozinho, ou em combinação com um ou mais polinucleotídeos conhecidos, junto com células e organismos compreendendo estes genes quiméricos.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção provê vetores recombin antes compreendendo, na direção S¹-?'. uma seqüência de promotor de polinucleotídeo da presente invenção, um polinucleotídeo a ser transcrito, e uma seqüência de terminação de genes. () poiinueleotídeo a ser transcrito pode compreender uma annação de íeituia aberta de um poiinueleotídeo que codifica um polipeptídeo de mterc»c. ou pode ser uma região de não codificação. ou não traduzida. de um poiinueleotídeo de interesse. \ matriz tle leitura aberta pode ser orientada em uma direção sense ou aniisensc Preteriv cimente, a seqüeneia de terminação de genes e funcional em uma planta hospedeira. Mais preferivelmente, a seqiiêneia de terminação de genes e a do gene de interesse, mas podendo ser outras descritas no estado tia teemea (vide Benjamin l.cwin. (ienes \Ί]I . capitulo 9) como o tcrmmador da nopalina sintase de I mindhi nm. (b \etores reeombmantes podem ainda incluir um marcador para a identificação de células transformadas.

Em outro aspecto, as células de plantas transgênicas compreendendo o \etor recombinante da presente invenção são providas, junto com organismos, como plantas, compreendendo estas células transgênicas. e frutos, sementes e outros produtos, derivados, ou progênie destas plantas. Os propágulos das plantas transgênicas inventivas são incluídos na presente invenção.

Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para modificar a expressão de genes em um organismo, como uma planta, incluindo a incorporação estável no genoma do organismo contendo o v etor recombinante da presente invenção.

Em outro aspecto da presente invenção é provido um método para produzir um organismo transformado, como uma planta, tendo a expressão de um polipeptídeo modificada. Esse método compreende transformar urna célula de planta com o vetor recombinante da presente invenção para prover uma célula transgênicas sob condições que conduzem á regeneração e crescimento da planta madura.

Ainda em outro aspecto da presente invenção é provido um método para identificação de um gene responsável por uma função ou fenótipo desejado. O método compreende: 1) a transformação de uma célula de planta contendo um vetor recombinante compreendendo uma sequência de promotor de polinucleotídcos da presente invenção ligada operacionalmente a um poiinueleotídeo a ser testado. 2) cultivar a célula de planta sob condições que conduzem a regeneração e crescimento da planta madura de modo a prover uma planta transgêniea. e 3) comparar o fenótipo da planta transgêniea com o fenótipo de plantas não transformadas. ou de tipo selv agem.

Os aspectos acima mencionados e adicionais da presente invenção e o modo de obter os mesmos se tornarão evidentes, e a invenção será melhor compreendida por referência na “Descrição Detalhada da Invenção”.

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Breve Descrição das Figuras

Figura 1 - Gel de agarose mostrando resultado da amplificação com o primer arbitrário W4 produzindo um fragmento de aproximadamente Ikb. (A) reação com os primers VV4 c uce2; (B) reação controle apenas com o primer W4; (C) reação controle apenas com o primer ucc2; (D) marcador de massa molecular Ojííinó II l) indicado em kb. A seta indica o fragmento amplificado potencialmente positivo de aproximadamente I kb.

Figura 2 - Vetor pGEM-T ligado ao fragmento de Ikb.

Figura 3 -- Vetor pCAMBIA 1391 ligado ao mseilo de Ikb. A figura mostra uma representação esquemática do vetor pCAMBIA 1391. (a) contendo o Promotor 35S duplicado com a seqüência enhancer do AMV (Alfafa Mosaíc Vírus) junto ao gene gusA como controle positivo e (b) contendo o promotor do algodão uceA1.7 (SEQ ID NO1) dei kb junto ao gene gusA, para transformação de plantas A. thaliana.

Figura 4 -Gel de agarose da subelonagem do promotor de algodão (clone uceAl) no vetor pCAMBIA1391. Os números indicam o número dos clones analisados. Os clones

1. 6, 7 e 8 são positivos. O marcador de massa molecular (1 kb DNA-ladder, GibcoBRL) está indicado em kb

Figura 5 - Gel de agarose da digestão dos clones uceAl.l e uceA1.7 com Ηιηά III e Xba I, para análise da orientação do promotor de algodão (clone uceAl) subclonado no vetor pCAMBIA 1391. (A) clone uceAl.l; (B) clone uceA1.7. A seta indica o fragmento de aproximadamente 200 pb esperado da digestão para os clones na orientação sense. Ambos os clones tem o promotor na orientação correta (sense) em relação ao gene gusA presente no vetor. O clone uceAl.7 foi escolhido para as manipulações posteriores. O marcador de massa molecular (1 kb DNA-ladder, Gibco-BRL) está indicado em kb.

Figura 6 - Ensaio fluorimétrico da atividade específica de GUS em diferentes partes da planta de A. thaliana (folha, eaule e botão floral) sob controle dos promotores 35Sd e uceAl .7.

Descrição Detalhada da Invenção

No contexto dessa descrição, inúmeros termos serão utilizados e por isso serão melhor detalhados a seguir:

• · ( 'm gene quimérieo é um gene compreendendo um promotor e uma região eoditieadora de diferentes origens. No caso da presente mxenção. o gene quimeneo compreende o polinueleolideo da presente imenção ligado a regiões codiíicadoras de genes endogenos e ou exógenos.

ma seqüência consenso e uma seqüência artificial na qual a base em cada posição representa a base frequentemente mais encontrada na >eqüeneia atual comparando-se diferentes alelos. genes ou organismos.

Um promotor é aquela porção do DN \ acima da região codíHeadora que contem sítios de ligação para RN'A polimerase 11 para iniciar a transcrição do DN V

Expressão e a transcrição ou tradução de um gene estrutural, endogeno ou heterólogo.

GC box” ê um elemento comum no promotor que pode aumentar a atividade do promotor.

“TATA box” ê um elemento no promotor, localizado aproximadamente 50 bases acima do sítio de início da transcrição. O TATA box está associado com fatores de transcrição em geral, incluindo a RN A polimerase II.

O termo gene” significa uma unidade física e funcional da hereditariedade, representada por um segmento de DNA que codifica uma proteína funcional ou molécula de RN A,

Um gene endógeno” é um gene próprio da célula ou do organismo.

Um gene heterólogo” é um gene isolado de um organismo doador e recombinado no organismo receptor transformado. E um gene que não é próprio da célula ou do organismo.

Um gene repórter” é uma unidade eodifteadora cujo produto é facilmente testado, por exemplo, genes CAT. GUS. GAL. LUC e GFP. A expressão de um gene repórter pode ser usada para testar a função de um promotor ligado a esse gene repórter.

O termo “propágulo” como usado na presente invençào significa qualquer parte de uma planta que pode ser usada na reprodução ou propagação, sexual ou assexual. incluindo as mudas.

“Sense” significa que a seqüência de polinueleotídeo está na mesma orientação 5' -5' com relação ao promotor.

Antisense” significa que a seqüência de polinueleotídeo está na orientação contrária com relação a orientação 5'-5' do promotor.

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Como usado aqui, o termo \-mero”. como referência a um valor específico de ”x'. refere-se a uma seqüência compreendendo pelo menos um numero específico (”\’4 dc resíduos do polinucleotídeo identificado como SEQ II) \(>1. De acordo com formas de realização preferidas, o valor de \ e preferivelmente pelo menos 2o. mam preferivelmente pelo menos 40. mais preferivelmente ainda pelo menos 60 e mais preteri vel mente pelo menos NO. Assim, polinueleotídeos da presente invenção compreendem um polinucleotídeo de 2o meros. 40 meros. 60 meros. N0 meros. 100 meros. 120 meros. 150 meros. IN0 meros. 22o meros. 25o meros, 500 meros. 4oo meros. 500 meros ou 600 meros identificado como SEQ 1D NOI e variantes dos mesmos.

O termo “polinucleotídeo (s)” como usado aqui, significa um polímero de filamento único ou duplo de bases de deoxiribonueleotideo ou ribonucleotídeo e inclui moléculas correspondentes de RN A e DNA. incluindo moléculas de HnRNA e mRNA. de filamentos tanto “sense” como “antisense”. e compreende cDNA. DNA genômico. e • 15 DNA recombinante. assim como polinueleotídeos completamente ou parcialmente sintetizados. Uma molécula de HnRNA contém íntrons e corresponde a uma molécula de DNA em um modo geralmente um a um. Uma molécula de RN Am corresponde a uma molécula de DNA e HnRNA da qual os íntrons foram exeisados. Um polinucleotídeo pode consistir dc um gene completo, ou qualquer porção do mesmo. Os polinueleotídeos “antí senso” operãveis podem compreender um fragmento do polinucleotídeo correspondente, e a definição de “polinucleotídeo” inclui assim todos esses fragmentos antisense operáveis. Os polinueleotídeos antisense e técnicas envolvendo polinueleotídeos antisense são bem conhecidos no estado da técnica ml (Sambrook. J.; E.F.Fritsh and T. Maniatis - Molecular cloning. A laboratory manual. 2 ed.. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.)

Os polinueleotídeos descritos na presente invenção são preferencialmente cerca dc SO^wo puros, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90° ₀ puros, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% puro.

O termo “oligonueleotídeo” refere-se a um segmento reiativamente curto de uma seqüência de polinucleotídeo. geralmente compreendendo entre 6 a 60 nueleotídeos. Esses oligonueleotídeos podem ser usados como sondas ou inieiadores (“primers”). onde as sondas podem ser usadas para uso em testes de hibridização e inieiadores para uso na amplificação dc DNA por reação de cadeia polimerase.

12'31 • ♦ « » « · · « · · · * · * · «* · · · · • · · · ···»·· · · « • · · · · · · · · · · • · * * · · ·· · · · · · • · ··· * · · · · ·· · ·♦· »« * ·« ···«··· ·· ·

Ο termo “sonda” utilizado na presente invenção refere-se a um oligonueieotídeo. polinuclcotídeo ou acido nucleieo. sendo RNA ou DNA. se ocorrendo naturalmente cmiio em uma digestão de enzima de restrição purificada ou produzida sintetieamenle. que seja eapaz de se anelar com ou especitleamente hibridizando com um aeido nueléieo contendo sequências complementares ã sonda. Uma sonda pode ser ainda de cadeia simples ou cadeia dupta. O comprimento exato da sonda dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, origem da sonda e uso do método. Por exemplo, dependendo da complexidade da sequência alvo, a sonda de oligonueieotídeo tipicamente contém 15-25 ou mais nucleotídeos. embora ela possa conter menos nucleotídeos. As sondas aqui são selecionadas para serem complementares para diferenciar cadeias de uma seqüência de um ácido nueléieo particular. Isto significa que a sonda pode ser suficientemente complementar para ser eapaz de “hibridizar especificamente” ou anelar com suas respectivas cadeias-alvo sob uma série de condições pré-determinadas. Conseqüentemente, a seqüência da sonda não necessita . 15 refletir exatamente a seqüência complementar do alvo. Por exemplo, um fragmento de nueleotídeo nao complementar pode ser ligado ao final 5’ ou 3’ da sonda, com o restante da seqüência da sonda sendo complementar à cadeia alvo. Alternativamente, bases não complementares ou seqüências longas podem estar intercaladas dentro da sonda se esta tiver complementaridade suficiente com a seqüência do ácido nueléieo alvo para anelar especificamente com ele.

O termo “primer” como utilizado aqui refere-se a um oligonueieotídeo. sendo

RNA ou DNA, cadeia simples ou cadeia dupla, derivado de um sistema biológico, gerado através de digestão com enzimas de restrição, ou produzido sinteticamente que. quando colocado em um ambiente próprio, é capaz de agir funcionalmente como um inieiador de uma síntese de ácido nueléieo dependente de molde. Quando apresentado com um molde de ácido nueléieo apropriado, trifosfatos nucleosídeos adequados precursores de ácidos nucléicos. uma enzima polimerase. cofatores adequados e condições tais como temperatura e pH adequados, o primer pode ser extendido em seu terminal 3’ pela adição de nucleotídeos pela ação de uma polimerase ou com atividade similar para produzir uma primeira extensão do produto. O ‘primer’ pode variar cm comprimento dependendo de condições particulares e requerimentos para aplicação. Por exemplo, em aplicações de diagnósticos, o ‘primer’ oligonueieotídeo possui tipicamente de 15-25 ou mais nucleotídeos em comprimento. O ‘primer’ deve ter complementaridade suficiente com o molde desejado para iniciar a síntese da extensão

3 7 ··* ····*··· · · · · • · » · · · * · » · · · · · · · · ·· · »« ··*·«·» * · »· do produto desejado. Isso nào significa que a seqüência do ‘primer’ de\a representar um complemento exato do molde desejado. Por exemplo, uma seqüência de nueleotídeo nào complementar pode ser ligada ao final 5' de um ‘primer’ complementar.

Alternam amente, bases não complementares podem estar intercaladas dentro da seqüência dc oligonucleotídeo do ‘primer’. desde que o ‘primer’ tenha complementaridade suficiente com a seqüência da cadeia molde desejada para prover funcional mente um complexo molde-primer para a síntese da extensão do produto.

s·

O termo “hibridizando especificamente diz respeito a associação entre duas moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples que possuam seqüêneias sufi cientemente complementares para permitir tal hibridizaçào sob condições predeterminadas geralmente descritas no estado da técnica (apostila: Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo, Capitulo 1,2003)

Em particular, o termo se refere à hibridização de um oligonucleotídeo com uma seqüência substancialmente complementar contendo urna molécula de DNA ou RNA de cadeia simples da presente invenção. Condições apropriadas necessárias para realização da hibridizaçào específica entre moléculas de ácidos nucléicos de cadeia simples de complementaridade variada estão bem descritas no estado da técnica (apostila:

Tecnologia de DNA recombinante. Universidade de São Paulo. Capitulo 4. 2003). Uma fórmula comum para se calcular as condições de estringêneia requeridas para se ter uma hibridizaçào entre moléculas dc ácido nucléico segue abaixo (Sambrook et al..

Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2^nó ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press):

Tm Sl.sA' - 16.6 Log [Na - ] 0.41 (%G-C) 0.63 (% formam ida )-600 pb no duplex (sonda)

Como ilustração da fórmula acima, usando [Na⁴-] = [0.368] e 50% de formamida, com conteúdo de GC de 42% e um tamanho de sonda médio de 200 bases, a Tm será de 57°C.

Sondas ou primers são descritos como correspondendo ao polinucleotídeo da presente invenção identificado como SEQ ID NOI ou uma variante do mesmo, se a sonda de oligonucleotídeo ou primer. ou seu complemento, estiver contido dentro da seqüência especificada como SEQ ID NOI, ou uma variante desta.

O termo “oligonucleotídeo” é referido aqui como ‘primers¹ e ‘sondas¹ da presente invenção, e é definido como uma molécula de ácido nucléico compreendendo de dois ou mais ribo ou dcoxiribonueleotídeos. preferencialmente mais do que três. O !4 37 * * · · · · * · » · ♦ · · · 9 · • » ♦ ······ »· » ··*· · 9 · · · · 9 ♦ * · · ♦ · · 9 9 · 9 9 « • ·9 ♦· * ·9 ·····»· 99 + 9 tamanho exato dos oligonucleotídeos dependera de vários fatoro e na aplicação particular e uso dos oligonucleotídeos. Oligonucleotídeos preteridos compreendem 1550 pares de base consecutivas complementares a SEQ II) NO 1. As sondas podem ser facilmente selecionadas usando procedimentos bem descritos no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning. a laboratorv manual”. CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1989), levando em consideração estringêneias de hibridizaçào DNADNA. recombinação e temperaturas de fusão, e potencial para formação de laços e outros fatores, que são conhecidos no estado da técnica.

A definição dos termos “complemento”, complemento reverso” e “sequência reversa, como usados aqui, é ilustrada pelo seguinte exemplo. Para a seqüência 5’AGTGAAGT3\ o complemento é 3’TCACTTCA5¹. o complemento reverso é 3'AC Π CACT5' e a seqüência reversa é 5'TGAAGTGA3'.

Como usado aqui, o termo “variante” ou “substancialmente similar” compreende seqüências de aminoácidos ou nucleotídeos diferentes de seqüências especificamente identificadas, em que um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos é deletado. substituído ou adicionado. As variantes podem ser variantes alélieas, de ocorrência natural, ou variantes dc ocorrência não natural. As seqüências variantes ou substancialmente similares dizem respeito a fragmentos de ácidos nueléicos que podem ser caracterizados pela porcentagem de similaridade de suas seqüências de nucleotídeos com a seqüências de nucleotídeo descrita aqui (SEQ ID NO 1), como determinada por algoritmos comuns empregados no estado da técnica. Os fragmentos de ácidos nueléicos preferidos são aqueles cujas seqüências de nucleotídeos têm pelo menos cerca de 40 ou 45% de identidade de seqüência, prefereneialmente cerca de 50% ou 55% de identidade de seqüência. mais prefereneialmente cerca de 60% ou 65% de identidade de seqüência, mais prefereneialmente cerca de 70% ou 75% de identidade de seqüência, mais prefereneialmente cerca de 80% ou 85% de identidade de seqüência. mais prefereneialmente ainda com cerca de 90%. 91%, 92%, 93%, 94%. 95%, 96%. 97%. 98% ou 99% de identidade de seqüência quando comparada com a seqüência de referência. A identidade percentual é determinada por alinhamento de duas seqüências a serem comparadas, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividindo este número pelo número total de resíduos na seqüência pesquisada e multiplicando o resultado por 100. Esse alinhamento pode ser feito através de softwares existentes na internet, um deles é o BLASTN. que está disponível na página do National Center for Biotcehnology Information/NCBI (wwh.ncbi.nlni.nih.gtn).

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Ο termo vetor di/ respeito a um replicou, tal eomo plasmídeo. eosmtdeo, bacmideo. fago ou vírus, no qual outras seqüências genéticas ou elementos (seja DNA ou ΚΝΛ) possam ser ligadas para serem replicadas juntas com o vetor. Preferencialmente o vetor derivado de vírus e selecionado entre os baeteriófagos. vaceinias. retro vírus ou vírus do papiloma bovino. O “vetor reeombinante é resultante da combinação de um vetor comercial eom genes quimérieos. ou o polinueleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a um polinueleotídeo endógeno e'ou heterólogo de interesse que por sua ve/ está operacionalmente ligado a um sinal de terminação. 1 ais vetores podem ser obtidos comereialmente. incluindo Clontech Laboratories. Ine (Paio Alto. Calif). Stratagene (La Jolla. Calitj, Invitrogen (í arlsbad. Calif.), New England Biolabs (Bcverly. Mass.) e Promega (Madison. Wis.). Alguns exemplos de vetores utilizados na presente invenção, mas não limitados a. são os vetores pGEM-T. pCAMBIA 1391.

O termo seqüências aeentuadoras de expressão conhecidas eomo amplificadores (enhancers)- que podem estar muito distantes do promotor (antes ou depois, “upstream ou “downstream”) e que poteneiam a taxa de transcrição. Estes amplificadores não são específicos e poteneiam a transcrição de qualquer promotor que estiver na sua vizinhança. A eficiência da expressão de um gene em um tecido específico depende da adequada combinação e integração dos amplificadores, dos promotores e das seqüências adjacentes.

O primeiro intensifieador descoberto que estimulava a transcrição de genes eucariotos foi o SV40 (Presente no genoma do Vírus 40 de Símio) Após a descoberta do intensifieador SV40 foram identificados centenas de outros enhaneer como HSV-1. AMV. HPV-16 . em outros genomas virais no DNA de células eucariótieas. ( Lodish et al. Biologia celular e molecular. 4^a edição pág 368)

O termo “operacionalmente ligado significa que as seqüências regulatórias necessárias para expressão da seqüência eodifieadora são colocadas na molécula de DNA em posições apropriadas relativa à seqüência eodifieadora para efeito de expressão da seqüência eodifieadora . Essa mesma definição é às vezes aplicada para o arranjo de seqüências codificadoras e elementos controladores da transcrição (por exemplo, promotores, auxiliadores ou “enhancers e elementos ou seqüências de terminação) no vetor de expressão. Uma região eodifieadora exógena é tipicamente tlanqueada por regiões regulatórias operaeionalmente ligadas que regulam a expressão da região eodifieadora exógena em uma célula transformada (podendo ser « * · · · · « * .·

« microorganismo, vegetal ou animal). Lina região regulatória típica operacionalmentc ligada a uma região coditicadora exógena inclui um promotor, isto é. um fragmento de acido nucléico que pode causar transcrição de regiões codificadores exógena>. posicionado na região 5' da região coditicadora exógena. No caso da presente invenção a região regulatória diz respeito às regiões substancialmente similares à SEQ 1D NO 1. Para auxiliar no aumento da transcrição de um determinado polinueleotídeo. a sequência promotora da presente invenção poderá estar ligada a outras seqüências regulatórias já descritas, tais como: A IATT (elemento de forte expressão na raiz). AACAAAC c GCCACCTCAT (elementos relativa a expressão específica cm sementes). CACGTG c CCTACC (ambas seqüências podem ser estimuladas ao um fator de estresse), entre outros. (Ai-Min Wu et al. Isolation of a eotton reversibly glycosylated polypeptide (GhRGPl) promoter and its expression activity in transgenic tobaceo, Journal of Plant Physiology 163 (2006) 426—435)

Uma seqüência de terminação é uma seqüência de DNA que sinaliza o final da transcrição. São exemplos de seqüências de terminação, mas não estão limitados a sinal de terminação de SV40. sinal de adenilaçào de HSV TK. sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRLBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase. sinal de terminação do vírus que ataca o Trijolium subterrancan (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillits nidulans e outros semelhantes.A presente invenção provê uma região regulatória de polinueleotídeos isolados que podem ser empregadas na manipulação de fenótipos de plantas, junto com polinueleotídeos isolados compreendendo estas regiões regulatórias. Mais espeeificamente a presente invenção está relacionada ao promotor ou sequência regulatória que ocorre naturalmente em plantas dc algodão {Gossypium hirsutumj responsável pela expressão da proteína de conjugação à ubiquitina nessa espécie vegetal. O promotor de algodão foi isolado do gene responsável pela expressão da proteína de conjugação à ubiquitina foi denominado na presente invenção de uce Al .7 (SEQ ID NO1).

A quantidade de um polipeptídeo de interesse específico pode ser aumentada ou reduzida através da incorporação de cópias adicionais de genes, ou seqüências de codificação, codificando o polipeptídeo. ligado operacionalmentc a seqüência de

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promotor da presente invenção (SEQ ID NO I). no genoma de nm organismo, como uma planta. Simdarmcnte. um aumento ou uma diminuição na quantidade do polipeptídeo pode ser obtido por transformação tle planta eom copias antisense destes acues.

O polinueleotídeo da presente imenção foi isolado de plantas de algodão. mais especificamente de (r. htrsutttm. mas ele pode ser alternativamente sintetizado usando técnicas de síntese convencionais, Espeeifieamente o polinueleotídeo isolado da presente imenção inclui a seqüência identificada como SI Q ID N()I; o complemento reverso da seqüência identtlieada etano SEQ ID \()E complemento rexerso da

H) seqüência identificada como SEQ ID NOI.

Estudos da atividade do promotor da presente invenção são detalhados nos exemplos deste relatório. Dados experimentais feitos em plantas de Arabidopsis quantificando a atividade GUS demonstraram que o vetor reeombinante contendo o promotor uee A 1.7 possui maior atividade GUS quando comparado eom promotor

CaMV35Sd.

O polinueleotídeo da presente invenção pode ser identificado em seqüências de DNA genômieo de plantas para as quais a informação da seqüência de genoma é disponível ao público, ou isolado de várias bibliotecas de polinucieotídeos, ou pode ser sintetizado usando técnicas que são bem conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratorv manual”. CSEIL Press. Cold Spring Harbor, NY, 1Ü89) O polinueleotídeo pode ser sintetizado, por exemplo, usando sintetizadores automatizados de oligonueleotídeos (por exemplo, sintetizador de DNA OL1GO 1000M Beekman) para obter segmentos de polinucieotídeos de até 50 ou mais ácidos nueléieos. I ma pluraridade pluralidade destes segmentos de polinucieotídeos podem ser então ligados usando técnicas de manipulação de DNA padrões que sào bem conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning, a laboratorv manual”. CSHE Press. Cold Spring Harbor, NY. 1989). Uma técnica de síntese de polinueleotídeo convencional e exemplar envolve a síntese de um segmento de polinueleotídeo de filamento único, tendo, por exemplo. 80 ácidos nueléieos. e hibridizando este segmento a um segmento de 85 ácidos nueléieos complementar, sintetizados, para produzir um ‘overhang’ de 5 nucleotídeos. O próximo segmento pode ser então sintetizado de modo similar, como um ‘overhang’ de 5 nucleotídeos no filamento oposto. As extremidades “pegajosas” ou eoesivas asseguram uma ligação apropriada quando as duas porções são • · · » · » · hibrídi/adas. [Oeste modo, o polinueleotídeo desta invenção pode ser sintetizado completamente /'// viiro.

Como obsenado acima, a seqüência de promotor da presente invenção pode ser empregada em vetores recombinantes e ou de expressão para acionar a transcrição e ou expressão de um polinueleotídeo de interesse. O polinueleotídeo de interesse pode ser endógeno ou heterologo para um organismo, por exemplo, uma planta, a ser transformada. Os vetores recombinantes e ou de expressão da presente invenção podem ser assim empregados para modular níveis de transcrição eou expressão de um polinueleotídeo. por exemplo, um gene que está presente na planta de tipo selvagem, ou pode ser empregado para prover transcrição e ou expressão de uma seqüência de DNA que não é encontrada na planta de tipo selvagem, incluindo, por exemplo, um gene que codifica um gene repórter, como GUS.

Em algumas formas de realização da presente invenção, o polinueleotídeo de interesse compreende uma matriz de leitura aberta que codifica um poiipeptídeo de . 15 interesse. A matriz de leitura aberta é inserida no vetor cm uma orientação sense e a transformação corn essa construção genética/'vetor reeombinante irá geralmente resultar em super-expressão do poiipeptídeo selecionado. O poiipeptídeo de interesse, que será regulado pelo promotor da presente invenção, poderá ser inserido no vetor na orientação sense. antisense ou em ambas as direções. A transformação com um vetor reeombinante e/ou de expressão contendo o promotor da invenção regulando a expressão do polinueleotídeo de interesse na orientação antisense ou em ambas as orientações (sense e antisense) irá geralmente resultar na expressão reduzida do poiipeptídeo selecionado.

O polinueleotídeo de interesse, como uma seqüência de codificação, é ligado de modo operativo em uma seqüência do promotor de polinueleotídeo da presente invenção de modo que uma célula hospedeira é capaz de transcrever um RNA acionado pela seqüência do promotor ligada ao polinueleotídeo de interesse. A seqüência do promotor de polinueleotídeo está geralmente posicionada na extremidade 5’ do polinueleotídeo a ser transcrito. O uso de promotor constitutivo, como a seqüência do promotor do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de G hirsutum identificada como SEQ ID ΝΌ1, irá afetar a transcrição do polinueleotídeo de interesse em todas as partes da planta transformada.

O vetor reeombinante ou vetor de expressão da presente invenção também pode conter um marcador de seleção que é eficaz em células do organismo, como uma planta, para permitir a detecção de células transformadas contendo o vetor reeombinante

I 9 '' inventivo. Estes marcadores, que são bem conhecidos. tipicamente conterem resistência a uma ou mais toxinas lun exemplo deste marcador e o gene nptlf. cuja expressão icsulta em resistência a eanamieina ou neomiema. antibióticos que sào geralmente tóxicos para células tle plantas em uma concentração moderada. \s eelukv transformadas podem ser assim identificadas por sua capacidade de crescer em meio contendo o antibiótico em questão. Outros marcadores que podem ser utih/ados para construir vetores reeombmantes e ou de expressão contendo o polinueleotideo da presente invenção podem ser. mas não estão limitados a. gene ///v confere resistência ;m antibiótico htgromieina. gene tnanA e o gene bar.

O sistema que usa o gene /nanA (que codifica a enzima PMI - phosphomannose ísomerase) de Eschcrichia coli (Miles e Guest. 19X4. C omplete nueíeotide sequence of the tumarase gene fumA, of A. co/i. Nueleie Acids Res. 19X4 April 25; 12(8); 36313642). tendo a manose como agente seletivo, é um dos novos sistemas sugeridos como alternativos aos dois primeiros descritos acima (Joersbo et al., 1998 Parameters interacting vvith mannose selection employed for the produetion of transgenie sugar beet. Physiologia Plantarum Volume 105 Issue 1 Page 109 - January 1999 doi:10.1()34'j.1399-3054.1999.105117.x). As espécies vegetais que não metaboli/am manose sofrem severa inibição de crescimento quando esta é oferecida como única fonte de carbono em meio de cultura. Os efeitos adversos e inibitórios do uso da manose são eonseqüências do acúmulo de manose-6-fosfato. produto da fosforilação da manose por urna hexoquinase. PMI promove a intereonversão de manose-6-fosfato e frutose-6-fosfato. permitindo assim que a primeira possa ser catabolizada na via glieolítica (Ferguson e Street. 195X. Análise de sistemas gene marcador agente seletivo alternativos para seleção positiva de embriões somáticos transgênieos de mamoeiro. Rev. firas. Eisiol. feg., 2001, vol.13. no.3, p.365-372. ISSN 0103-3131. ; Malea et al.. 1967 Advances in the selection of transgenie plants using non-antibiotie marker genes. Physiologia Plantarum Volume 1 1 1 Issue 3 Page 269 - Mareh 2001 doi: 10.1034 j. 13993054.2001.1 110301 ,x).O gene bar (que codifica a enzima PAT - phosphinothriein-Naeetyltransferase) de Streptomyces hygroscopiens (Murakani et al.. 1986 l he bialaphos biosynthetic genes of Streptomyces hygroscopiens: molecular eloning and characterization of the gene eluster. Molecular and General Genetics., 205; 42-50.

986.). tendo o glufosinato de amônio (PPT) como agente seletivo, é. dentre os sistemas tipo gene de tolerância a herbicida, um dos mais amplamente empregados pela • · * · · · • «« engenharia genética no desenvolvimento de OGMs vegetais. PAI inativa herbicidas que apresentam o PPT como composto ativo mediante detoxiticaçào deste. Λ detoxiticaçào. que é resultante da acetilaçào do grupamento amino livre presente no PPT, toma este incapaz de competir de forma inibitóna com a glutanuna sinteta.se (GS).

possibilitando assim a remoção da amônia tóxica da célula vegetal pela conv ersão de glutamato em glutamina. reação esta catali/ada pela GS (Líndsey. 1902 Molecular cloning of ICAM-3. a third ligand for LEA-1. constitutively expressed on resíing lcukocytes. X-atitre 369. 481 - 484 (03 December 1992); doi:10.1088 36O481a0).

Alternativamente. a presença do gene quimérico em células transformadas pode ser determinada por meio de outras técnicas conhecidas no estado da técnica (Sambrook et al “Molecular Cloning. a laboratory manual”. CSHL Press. Cold Spring Harbor. NY. 1989), como Southern e PCR.

As técnicas para ligar de modo operativo os componentes dos vetores recombinantes ou de expressão inventivos sào bem conhecidas no estado da técnica e incluem o uso de ligadores sintéticos contendo um ou mais sítios de endonuclease de restrição, como descrito, por exemplo, em Sambrook et al (“Molecular Cloning. a laboratory manual”, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Genes quiméricos da presente invenção podem ser ligados a um vetor tendo, pelo menos um sistema de replicaçào, por exemplo, E.colb assim após cada manipulação, as construções resultantes podem ser clonadas e seqüenciadas.

Vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção podem ser usados para transformar uma variedade de organismos incluindo, mas não limitando a plantas. As plantas que podem ser transformadas usando vetores recombinantes e'ou de expressão da presente invenção incluem angiospermas monoeotiledôneas (por exemplo gramíneas. milho, grãos, aveia, trigo e cevada...), angiospermas dieotiledôneas (por exemplo Arabidopsis, tabaco, legumes, alfafa. aveia, eucalipto, bordo...), e gimnospermas (por exemplo pinheiro, espruee branco, lariço...). Os protocolos de transformação de plantas já são bem conhecidos no estado da técnica (Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPA30 CENARGEM. Capitulo 3 e 7, 1998). Em uma forma de realização preferida, os vetores recombinantes e/ou de expressão da presente invenção são empregados para transformar plantas dieotiledôneas. Preferivelmente, a planta é selecionada da família das Malvaeeae, mais preferivelmente da espécie (iossypium hirsutum. Outras plantas podem • · · · · ·

37 ser transformadas de modo útil com o vetor recombinante e. ou de expressão da presente invenção incluem, mas não são limitadas a: Anacardium. Aaona, Arachis. Artocarpas. Asparagus, Alropa. Avena. Prassica, Carica, Citrac Citrallus. Capsicam. Cardunmts. Cocos, Coffcu, Cucumis, Cucurbita. Daucus, Klacis, bragaria. Glyanc. Gossvpium.

Hclianthus. Heterocaílis, Hordcum. Hyoscyamus. Laetuca, Limtm. Lolium, Lupinus. Lycopersicon, Malas, Manihot, Alajorana, Aledicago, .Xicotiana, Olea, Oryza. Punieum. Parmesetum. Passijlora, Pcrsca, Phaseolus. Pistachia, Pisam, Pyras, Prunus, Psidiam. Raphanas, Ricinus, Sccalc. Senecio, Sinapis. Solamtm. Sorgham, Lhcobrontus. Trigonella, Triticam, li cia. li tis. Cigna, c /ca.

O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invenção inclui, mas não está limitado a. sinal de terminação de SV40. sinal de adenilaçâo de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de A. tumefasciens (aos), sinal de terminação do gene RNA 35S do CaMV. sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do . 15 gene trpC de Aspergillus nidulans. e outros semelhantes. Preferivelmente o terminador utilizado na presente invenção é o terminador do gene que codifica para a proteína de conjugação à ubiquitina de algodão.

Os vetores recombinantes eou de expressão da invenção podem ser introduzidos dentro do genoma da planta hospedeira desejada através de uma variedade de técnicas convencionais. Por exemplo, introdução mediada por A. tumefasciens; eletroporação; fusão de protoplasto; injeção em órgãos reprodutivos; injeção em embriões imaturos; microinjeção de protoplastos de células de plantas; utilizando-se métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com DNA e outros. A escolha da técnica irá depender da planta a ser transformada. Por exemplo, plantas dicotiledôneas e algumas monocotiledôneas e gimnospermas podem ser transformadas por tecnologia de plasmídeo Ti de Agrobacteriam. Os vetores recombinantes e/ou de expressão podem ser combinados com regiões flanqueadoras de T-DNA apropriadas e introduzidas dentro de vetor convencional hospedeiro A. tumefasciens. A função de virulência do hospedeiro .1. tumefasciens dirccionará a inserção das construções gênicas e marcador adjacente dentro do DNA da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas por Λ. tumefasciens. incluindo desarmamento e o uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica (como mencionado no pedido de patente US 20020152501. Horsch et al. Science 233:496-498, 1984; e Fralev et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803, 1983).

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Técnicas dc mieroinjeção sào conhecidas no estado da técnica e bem descritas cm literatura científica c patcntána. A introdução de vetores recombinantes c ou dc expressão utilizando-sc precipitações dc poüetileno glicol é descrita em Paszkowski ct ai. Embo J. 3:2717-2722. 1984 (como mencionado no pedido dc patente

US2OO2OI52501). Técnicas de eletroporação são descritas cm From et al. Proc. Natl. Aead. Sei. USA 82:5824. 1985 (como mencionado no pedido de patente

US2OO2O152501). Técnicas de transformações balísticas são descritas em Klein et al. Nature 327:70-73. 1987 (como mencionado no pedido de patente US2OO2O152501). A introdução dos v etores recombinantes e ou dc expressão da presente invenção pode ser feita em tecidos, como tecido de folha, células dissociadas, protoplastos. sementes, embriões. regiões meristemáticas. eotilédones. hipocotilédones. e outros. Prefereneialmente a presente invenção utiliza a transformação através da introdução mediada por A. tumefasciens utilizando a A. thciliana com planta modelo (Clough at al. Floral dip: a simplifted method for /ígroõucmrúíw-mediated transformation of J.

thaliana. Plant J. 1998 Dec; 16(6):735-43.). No entanto outros métodos de transformação podem ser utilizados para inserir vetores recombinantes c ou de expressão da presente invenção, tais como a biobalístiea. que consiste em uma técnica de transformação direta do DNA que utiliza microprojéteis impulsionados em alta velocidade para carrear o DNA para dentro das células [Reeh, E.L; Aragào, F.J.L.

Biobalístiea. In: Manual de Transformação Genética de Plantas (Brasileiro, A.C.M. & Carneiro. V.T.C. eds.). EMBRAPA Serviço de Produção de Informações -SP1. 1998. 106pp]. e via tubo polínico. O método dc transformação via tubo polínico foi div ulgado pela primeira vez por Zhou et al (Zhou. G., Wang. J., Zeng. Y.. Huang, J.. Qian. S., and Liu. G. Introduetion of exogenous DNA into cotton embryos. Meth. in En/vmol.

101:433-448, 1983) e consiste na aplicação de uma solução de DNA na parte superior da maçã jovem após a polinização. Utilizando esta técnica, o DNA exógeno pode alcançar o ovário através da passagem deixada pelo tubo polínico e integrar as células zigótieas já fertilizadas, porém não divididas.

Uma vez que as células foram transformadas, por qualquer uma das técnicas mencionadas acima, as células tendo o vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção incorporado em seu genoma podem ser selecionadas por meio de um marcador, como o marcador de resistência a higromieina ou a canamicina. As células de plantas transformadas podem então ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e. ti nal mente, o fenótipo desejado. Tais técnicas de

• · · · ·

23-37 • · ··· * · • · · .

• · · · • · · · • · · · _a ··« ·· ·· regeneração contam com a manipulação de certos fitoliormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida c ou Herbicida, que deve ser introduzido junto com a seqüência dc nucleotídeos desejada. Regeneração dc plantas a partir dc cultura dc protoplastos é descrita cm Evans et al.

(Evans et al. Protoplasts Isolation and Culture. Handbook of Plant Cell Culture. pp. 124176. MaeMillilan Publishing Company. New York, 1983; e Binding. Regcneration of Plants. Plant Protoplasts. pp. 21-73. CRC Press. Boca Raton. 1985. como mencionado no pedido de patente US20929152501 1. Λ regeneração pode ser também obtida através de calos de planta, ex plantes, orgàos. ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são bem descritas no estado da técnica, tais como cm Leelavathi et al. [Leelavathi et al. A stmple and rapid Jg/OOoc/erm/H-mediated transformation protocol for cotton (62 hirsutum L.): Embryogcnic cal li as a source to generate large numbers of transgenie plants. Plant Cell Rep (2004) 22:465 -470]. Esse trabalho descreve um protocolo para transformação e regeneração do algodão onde o calo embriogênico corn Agrobacteríum.

.15 é cultivado sob estresse de desidratação e seleção de antibiótico por 3 a 6 meses para a regeneração de diversos embriões transgênicos. uma média de 75 embriões globular. Sendo observado sobre a seleção de placas esses embriões são cultivados e multiplicados no meio, seguido pelo desenvolvimento de embriões cotiledonares sobre o meio de maturação do embrião. Para se obter uma media de 12 plantas por placas de petri de calos co-cultivados. Aproximadamente 83% dessas plantas sao transgênicas. As plantas transformadas resultantes podem ser reproduzidas de modo sexual ou assexual. usando métodos conhecidos no estado da técnica [Leelavathi et al. A simple and rapid Tg/OÓí/eZerium-mediated transformation protocol for cotton (Gossipium hirsutum /,.): Embryogcnic calli as a source to generate large numbers of transgenie plants. Plant Ccll

Rcp. 2994. 22: 465 -479 ], para dar gerações sucessivas dc plantas transgênicas.

A produção dc RNA em células pode scr controlada por escolha da seqüência do promotor, por seleção do número de cópias funcionais ou atrav és do sítio de integração de poli nucleotídeos incorporados no genoma hospedeiro. Um organismo pode ser transformado utilizando um vetor recombinante e/ou de expressão da presente invenção contendo mais de urna matriz de leitura aberta de codificação para um polipeptídeo de interesse.

O polinucleotideo isolado da presente invenção também tem utilidade no mapeamento do genoma. em mapeamento físico e em clonagem posicionai de genes. A seqüência identificada como SEQ ID NO1 e suas variantes podem ser usadas para

24· 3 7 ι ·· · «a • ·· ···· · * · · · · · • · · · • · · · .

• · · · · 9 • ·· · ». · projetar sondas e iniciadores de oligonueleotideos. As sondas de oligonucleotídeos projetadas usando o polinueleotídeo da presente invenção podem ser usadas paru detectar a presença do promotor da proteína de conjugação à ubiquitina em qualquer organismo tendo seqüências de DNA suficienlemente similares em suas células usando técnicas bem conhecidas no estado da técnica, como as técnicas de hibridízaçâo de DNA dot blot (Sambrook. J.. Iritseh. Ε.Γ.. Maniatís. T. Molecular eloning a laboratorv manual. 2^lkl edition [Mj. New York: Cold Spring Harbor Laboratorv Press. 19S9)

Os iniciadores de oligonucleotídeos projetados usando o polinueleotídeo da presente invenção podem ser usados para amplificações de PCR. O polinueleotídeo da * 10 presente invenção também pode usado para etiquetar ou identificar um organismo ou material reprodutivo do mesmo. Esta etiqueta pode ser obtida, por exemplo, por introdução estável de um identificador de polinueleotídeo heterologo. não funcional, não disruptivo. em um organismo, sob o controle do polinueleotídeo da presente invenção.

-15 Exemplos

A presente invenção é ainda definida nos seguintes exemplos. Deve ser entendido que esses Exemplos, enquanto indicam parte da invenção, são colocados como forma dc ilustração somente, não tendo, portanto, qualquer cunho limitante do escopo das presentes invenções.

Técnicas usuais de biologia molecular tais como transformação de bactérias e eletroforese em gel de agarose de ácidos nueleicos são referidos através de termos comuns para descrevê-los. Detalhes da prática dessas técnicas, bem conhecidos no estado da técnica, são descritos em Sambrook, et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratorv Press). Várias soluções utilizadas nas manipulações experimentais são referidas por seus nomes comuns tais como “agarose, “TBE, “miniprep. etc. As composições dessas soluções podem ser encontradas na referência Sambrook. et al. (supracitada).

Exemplo 1

Isolamento da seqüência de DNA promotora do gene da proteína de conjugação à ubiquitina dc Gossypium hirsutum

A extração do DNA em algodão foi realizado através do Kit DNcasy plant mini Kit 50 da QUIAGEN. A seqüência dc DNA responsável pela expressão do gene da proteína de conjugação à ubiquitina foi isolada de plantas de algodão utilizando a ··· ·· · * ♦ » * * • · · * · · ·

37 técnica de Tai 1-PCR”. O “Tai 1-PC R” ( fhermal Asymmetric IinterLaced PCR) consiste numa aplicação da técnica de PCR (Reação da Polimerase cm Cadeia) que permite o isolamento de segmentos de DN.\ adjacentes a sequências conhecidas utilizando iniciadores específicos sequenciais junto com pequenos inieiadores arbitrários degenerados de modo a controlar termicamente a eficiência de amplificação relativa de produtos específicos e inespeeífieos (Liu. λ’. & Whittier. R.F. (1005). Thermal asymmetric interlaced PCR: Automatable amplification and sequencing of inserí end tragments from PI and λ AC clones for chromossome vvalking. Genomics 25. 674-681.)

Intercalando-se ciclos de alta c baixa cstringência. produtos específicos são 10 preferencial mente amplificados sobre produtos não específicos. Foram feitas sequencialmente três reações de PCR (reação primária, reação secundária e reação terciária) utilizando três iniciadores sequenciais específicos de um lado e um inieiador arbitrário do outro.

*

í) Reação primária:

J5 Foram colocados 200ng do DNA genômíco.do algodão cv. IAC 98/708. em 20

μ] de uma reação de PCR contendo 20 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, pH 8.4, (Gibeo PCR buffer) 2 mM MgCF. 200 μΜ dNTPs. 400 nM primer UCF1 (5' GCTfGCCAATGGAACAT 3'). 3 μΜ primer AD3 (5' WGTGNAGWANCANAG 3‘). 1 U Taq DNA polimerase (Gibeo). A reação foi realizada em termociclador (Eppendorf.

Mastercycler gradient) programado para 38 ciclos, com uma etapa inicial de 1 min a 93 ⁽’C, seguindo as seguintes etapas: lmin a 95 °C , 94 °C, 55 °C, 2,5 min 72 °C, voltar para o passo 3 ( 1 min a 94 °C) repetir 4 vezes, 3min a 25 °C , 2,5 min a 72 °C, 30 segundos a 94 °C, 1 min a 60 °C. 2,5 min a 72 °C, voltar ao passo de 30 segundos a 94 °C repetir I vez. 30 segundos a 94 °C. 1 min a 44 °C. 2.5 min a 72 °C, voltar ao passo de 30 segundos a 94 °C e repetir 14 vezes, finalizando a 72 °C por 5 min 2) Reação secundária:

f oi adicionado 1 μΐ do produto da reação primária a 20 μΐ de uma reação de PCR contendo 20 mM Tris-HCl. 50 mM KC1. pH 8.4. (Gibeo PCR buffer) 2 mM MgCF. 200 μΜ dNTPs. 400 nM primer UCE2 (5’ AGRTCCTTIAGCTCCTT 3'). 2 μΜ primer AD3 (5' WGTGNAGWANCANAG 3’). 0.6 U Taq DNA polimerase (Gibeo). A reação foi realizada em termociclador ( Eppendorf, Mastercycler gradient) programado para 13 ciclos, com uma etapa inicial de 30 segundos a 94 °C. seguindo as seguintes etapas: 1 min a 55 °C . 2.5 min 72 °C. voltar para o passo inicial e repetir 1 vez, 94 °C • · · * * · *·r • · » » * · • · · a » * · · · · · · • » · · · · a * · a a a • · · a · a

37 por 30 segundos. 44 ^l’C por 1 min. 72 V por 2.5 min. voltar para o passo inicial c repetir 1 1 v ezes, finalizando a 72 C por 5 min.

3) Reação terciária:

Foi adicionado 1 μΐ do produto da reação secundaria a 2Ο μΐ de uma reação de 5 PCR contendo 20 mM Tris-HCL 50 mM KCI. pH 8.4. (Gibco PCR buífer) 2 mM MgCE. 200 μΜ dNTPs. 400 nM primer \V4 (5‘ AGWGNAGWANC 'ANAGA 3') 0.6 l¹ Taq DNA polímerase (Gibeo). A reação foi realizada em termoeielador (Eppendorf. Mastercvcler gradient) programado para 13 ciclos, com uma etapa inicial de 3<> segundos a 94 ’C„ seguindo as seguintes etapas: 1 min a 55 C , 2.5 min 72 C. voltar para o passo inicial e repetir 1 vez, 94 °C por 30 segundos, 44 C por 1 min, 72 °C por 2.5 min. voltar para o passo inicial e repetir 11 vezes, finalizando a 72° C por 5 min.

A amplificação com o primer arbitrário W4 produziu um fragmento de aproximadamente 1.0 kb poteneialmente positivo. Baseado nos controles do TAIL-PCR foram feitas como controle reações apenas com os primers arbitrários e outra apenas com o primer UCE2. Foram considerados como poteneialmente positivos os produtos amplificados na reação com os dois primers (W4 e UCE2) e que não estavam presentes nos controles apenas com um dos primers (Figura 1).

O produto do PCR foi submetido a eletroforese em agarose-TBE e o fragmento amplificado de 1.0 kb foi purificado com o kit ‘Gene Clean’ (QIAGEN) e ligado ao vetor pGEM-T (Promega). O vetor recombinante resultante (Figura 2) foi usado para transformar células de E. co/i por eletroporaçào (Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA-SPLEMBRAPA-CENARGEM, 1998. 101. p.). Doze clones foram selecionados e o seu DNA purificado através de preparação de DNA plasmidial em pequena escala (miniprep) [Sambrook. et al. (Molecular Cloning. A

Eaboratory Manual, 2^ntl ed. (1989). Cold Spring Harbor Laboratory Press]. Os 12 clones foram seqüenciados em um seqüeneiador automático ABI usando os primers T7 e SP6. O sequenciamento foi feito na plataforma de sequeneiamento da Embrapa-Cenargen e continuados como positivos através da análise das seqüências. Seis clones apresentavam o promotor na orientação ‘antisense* em relação ao gene ÍacZ presente no vetor e seis apresentavam o promotor na orientação ‘sense’ em relação ao lacZ do vetor.

As seqüências resultantes geraram uma seqüência consenso à SEQ ID NO 1, com base no alinhamento das seqüências dos clones positivos com a seqüência do promotor do algodão.

• ο · ·

A analise da seqüência do gene de algodão isolado correspondente a fanuiia do gene Teubc4 revelou a existência de segmento similar ao consenso 1 ATA box presente usualmente em promotores de eueanotos. Adicionalmente. a comparação da seqüência obtida com outras sequências depositadas nos bancos de dados não revelou qualquer similaridade significativa, assim como também não foram detectadas seqüêneias abertas de leitura significativas, indicando que a região não corresponde a uma seqüência eoditieadora.

Exemplo 2

A análise comparativa da seqüência promotora ueeA1.7 do gene da proteína de conjugação de ubiquitina de algodão com outros promotores constitutivos de plantas, mostrou que o promotor uceA 1.7 é signifieativamente diferente dos promotores descritos na literatura, como mostra o alinhamento abaixo:

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubulin_Coffea_l ílce_0ryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase^Zea

Actin-2_Zea tJce_Oryza_2

UceAl.Ί

A-Tubulin_Coffea_2 3 5Sd AMV

AAAAGTTGTAGCGGGA 16

CTGCAGAAATGCAAATTTCATAAAACAAACTACTAGTACTGTTTGTTCATTGGTCTTATC 60

Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

ATubulin Coffea 1

Uce_Oryza_4

UEI9 Saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_0ryza_2

UceAl.7

A-Tubulin Coffea_2

35Sd AMV

GGGCTGGACGATGCGTGGAGCGGAAAATGCTGGAGTATTGGACCACCAACCAAACAAAAT 76

CAAAACTTAGCCACTGCAACAAGTTCTTGAACCTTAGCACAATCATATTGTGCATGCACT 1 2 0

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gcs-2_Zea

Uce_Oryza_l

A Tubulin_Coffea 1

Uce_0ryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_0ryza_2

UceAl.7

A-Tubulin_Coffea 2 35Sd AMV

AGTTTTAGTATATGGGOTTTCGAACTTTCCAGTCAACCTACAACAATCTGCTTCTATAAA 13 6

TGTTTATTGCAAAGAATGGTGCGTAGGGAACACGCATGATTTTTGAATTGCTGGCACATA 18 0

Arabidopsis

4 4 t 4 4

4 *

H · 9 «

28.37

ÍO

Jcc; Oryza 3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza 1

A-Tubulin_Cof£ ea_l

Uce_Oryza_4

UB.T 9_Saccharum

Enolase Zea

Act in-2_Zen

Uce_Oryza_2

UceAl.7

A-Tubulin Coffea_2 3 5Sd AMV

Arabidopsis

Uce Oryza 3

Gcs-2 Zea

Uce_0ryza_1

A-Tubulin_Coffea_l

Uce_0ryza_4

UB19_S accharum

Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_Oryza_2

UceAl.7

A-Tubulin_Colfea_2 35Sd AMV

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubulin_Coffea_l

Uce_Oryza_4

UBI S_Saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_Oryza_2

UceAl.7

A-Tubulin_Coffea_2 35Sd AMV

Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubu1i n_Co f f ea_1

Uce_0ryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase_Sea

Actin-2_Zea

Uce_0ryza_2

UceAl.7

A-Tubu1i n_Co f f ea_2 35Sd AMV

Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubu1i n_Co f f ea_1

Uce_Oryza_4

UB 19_Sa c cha rum

Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_0ryza_2

UceAl.7

A-Tubulin_Coffea_2 35Sd_AMV

CAATAATAAAAGAGTAATTAAATTACTGGTAGCGTTGGTGTATTTGGATTTGCCAGCTTT 1 90

ATTTTATGATTAGAAACTGGAATOCAACATGTACCCTTTGTCATGGTTTOTTTCCGAGAC 2 4 ü

GCTTCCAAACTCATATCATCAATTTGATAGCACTTGGATACGGAGATCGCTTTTGTCTGC 2 5 6

ATTGCACTGTTTTTTTTAATCCTATCATTATCATAATGCCAAGAACTGGTCACCAACC AG 3 0 0

CTTAGTATGATATGATTGCTCACCCGCTGTAGACATGATTTAAAGGAAAATAACACAAAT 3 16

CATTTTGCATCATGGTTAGTTGAGCTGTCCCCATGTATCAATAGGTGCATTGTATTGGTC 3 60

ATATATATATAAGACCAACAAATTATAACTGAAAACTTTTCAGTAATGTTAATTCTAACA 3 76

CAAAATATAAATGCAGTGGATGCAACCTATCTCATGGCCGTCAACAAAAGAAATCAAAAG 4 2 0

CATGTGACTAGACCTGCTATCATCAGCTGCAATTCTAGAGGAAACTTGGACCAGATCAGA 4 3 6

GGAAATGCACCATCTTATATCTCCAGTTTATATGAACAGATTGGATAAGATCATAAGATC 4 8 0

Arabidopsis • · · * • * ·

57 • » · · · • · · · · · · · · · · • · · · · «· ncH 2_Zea’ - - -- -- - Gce Oryza J .... _ . _ . ....

A-TubuJin Uotfea 1 AGTTGTAAAGGGCTGCAGyUUÀTTV:·. GiKACrATTGAGTTTGCAGGTAGATGUGTGGAC: i₃. ? Gce Oryza 4 - -- - - - - - -- --- ----GE 1 9 Saccbarum ....... . _ _

Ene?; asf- Zea - - ... .....- - - -......_. . _ _ _ ........

-Act. Zea - ....

Gce Oryza 2 AAGTGGTTTATATTATTTTGAGGAATATAACATGGATTCATGCTAATCAt. 'TCGTÜTAGGí' 54'!

to uceAl.',· - --------- -- ----A-Tubulin Coffea 2 - - - - - - - -•5Sd AR7 >5

Arabidopsis ice Oryza 1

Gce Oryza_ 1

Uce_ Oryza_4 GET ÇSatchdi u>i!

Επο1ase_Zea Act in-2_Zea [Jce_0ryza_2 UceAl.Ί

A-Tubul in_Cof fea_2 í5Sd AMV

r.TT.AAATGGA^cTGGTCCAGÇrrrGAATGCAGTTGTAGTAAAGACATGTTGGAVTTGTTAT aGAGTATGTGTATTCATGATGGATATGGTACTATACTACGGAGTTTTTTCTTCACAAAATAA 6 G 0 .---- --------- . ---- ----- -AGTGAAGTAGCAGAGATAATAG 22

Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gcs-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubulin_Coffea_l

Uce_Oryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_2ea

Uce_Oryza_2

UceAl.7

A-Tubulin_Coffea_2 3 5Sd AMV

GGATCAAACTACTACTAGTAGGGAAATGCTTCAAAGACTTCTCTTGTGATTTTCTCCCAG 616

-----GAATTCCGGCGTGGGCGCTGGGCTAGTGCTCCCGCAGCGA 4 0

CCTGTTATTTTGACCTCCAACCAAACACGAATTATACCAAAAATTGGGTTATTTCATCTA 66 0 TTATTACAGTAGCAGTAATAAAATAAAATACATTTTATTACAAAAAAACGTACAAGAGGT 8 2

Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubulin_Co£fea_l

Uce_0ryza_4

UEI9 Êaccharum

Enolase_Sea

Actin- 2~2ea

Uce_Oryza_2

UceAl.7

A-Tubo1i n_Co f f ea_2 36Sd AMV

CCGAATGGTCCAAGTACACTAGCAAAAGAAGCACAAACGGTACC AATGACTCGAGCGAGC 6 76

GCGATCTGAGAGAACGGTAGAGTTCCGGCCGGGCGCGCGGGAGAGGAGGAGGGTCGGGCG 10 0

TAGTACAACTCTATTATAAACATGCAGTAAATTATCCTACACATATACCAAAATTCAAGT 72 0 CCGCGAAGATAGCCAATGAGAACGCAAGAAGACAACCCAATTCT-CCTATTTTTTTATTA 141

Arabidopsis

Uce_Oryza_3

Gcs-2_Zea

Uce_Oryza 1

A-Tubulin_Coffea_l

Uce_0ryza_4

UBI9_Saccharmii

F.nolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_Oryza_ 2

UceAl.7

A-Tubulin_Cof£ea_2 35Sd AMV

TGACATTTTGGGCTTCAGATTAGCACAAGACAAAAGGATTTTTCACTTTTCTTCTGTAGG 7 3 6 gggaggatccgatggccgggaacgagtggatcaatgggtacctggaggcgatcctcgaca 1 6 0

GTAATAATCCTAATACACAGACTTAAAAATCAAACTATTTCCTTTTTAAGATATGGAAAA 7 8 0

AATATTTCTAGAAGAAAGGGTAAATTACGCCCCACGGTCACAAAACTATTAATAAGATCA 2 01 ___--------------CATTTCTTGCCAGAAAGCACTAGTGAATATTCTATCCCTGTCAG 4 4

Arabidopsis • · • · · • ♦ « » · » · * • · ♦

37

..'Ct.- Oryzuç V; I Zíu Cf :'ry/,i 1

A, 7·.ibul i n Col í ea Ucp Oryz<j 4 ^[T7' Saediai':!! Un._;! ase Zea Act i ii - 2 Z.ea Uce Üryza 2 UceAl.7

A-Tubul i ii Co !' f f‘â VSd AMV . - ;yçGA·: '(TGATGATTATTTTí iTTGATCATGATTnCTi ':' < p

TG.*·*. l ·.. CT* .iA.C77 O·' JCAG^f: ZTGGC AT ce ι c.A**. 1 I c A< iGA.GC 1 lITGAoATI*. 7τATA· JGG7 ¹ * j

GO-AnAOOTCOTOOCCCOOTGroíXyyioeGOCOGCGGCGGGGOGGAoeCOAGGTOGOOGA 2 2

CCATTTTTTTAACGGAAGüAAAACAAATICGGGTCAAGGCGGAAG-UCAGCGCGCCACCC'·'’ 5 4·.' TATATTTATCAUTCAACTTCCAAAAGTTÀUAAAATGATTATTAAACTATTCAAAAGTTTT 2 6.? TCAOTÀTAGATTCTGGAAGTOCATGTAATCTAAAAATGTTTCtCAGGAAGAGTTGAGCCAC 1 0?

7>S

Arabi.dops.is

Uce Gryza 3

Gcs 2 Zea

Uce Οιγζ,ι Ί

A. CiíoI ío Uoí : i. ã_ :

Uce üryza 4

UEI9 Sacctiar am

Enolase_ Zea

Actin-2_Zea

Uce_ Oryza_2

UceAl.7

A-Tubulin Coffea 2 3 5Sd AM¹;

-GTGTTCATTTGATAGAGTCTAAAATCACCACTTACATTGACTAACCCCAA 7 0

TGGCTATTTGATTTTTTGAAAGATATTTTTTTCCCTGGGAAGACACCTATGGGACGAAGA ;9 T^GTTATUAATGVACCU^AGGTVGCATGCTVAATTÇAGAGCÇCTTOACATGTAACCGTG Un

CGAAGGCGGCGAGCCCCCGCGGC GCGCACATGAACTTCAACCCCTCGCAOTACTTCGTC .V *

ACGTCAGCGAATACGGAGGCGCGGGGTTGACGGCGTCACCCGGTCCTAACGGCGACCAAC 90 0 ATTTCAAGTCATTGGATTGTTAAAATAGCATTTGTATGGATTTCCCTGTTCACATTGCCT 3 2 1 CTGTTTGGTTGTG AAGGGGTGAGCT AAGGCAAGCAAATGACCTACTTTGGACAACCT ATC 16 4

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gos-2_Zea

Ucc_Oryza_l

A-Tubulin_Cof fea_l

Uce_Oryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase_Zea

Act in-2_Zea

Uce_Oryza_2

UceAl.7

A-Tubulin Cof fea_2 35Sd AMV

AAATTTGTCCTAAACACTAATCAATCCGAAGATTATAAAATGTCGACAAAGAAAATAAAA 110

TATTATGTTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATA 15 9 TGT AGCCC AGGCCCAAATGCCCCGG AAYTTTAAACTGAAATCTCGG AAY AGC AG ATGGC A 916

GAGGAGGTGGTCAAGGGCGTCGACGAGAGCGACCTCCACCGGACGTGGATCAAGGTCGTC 3 3 9

------------ ----------------------------------TCATATATTTATG 13

------------------ -------------- ----------------------TCAGT 5

AAACCAGCCAGAAGAAATTACAGTAAAAAAAAGTAAATTGCACTTTGACCCACCTTTTAT 96 0 ACATCAATCGAAGCCTCTCATTCCCCTTCTTTTTTATAGATTAAGTTTTTTTTTATAAAA 3 81 AATCACGTATTATATCCTTGAGATTCTGGAAGGCTCTCTATGAAGTCCATGGTTAGGTGA 224 ----------------- -----------------------------GGTCCGATCTGAG 13

Arabidopsis

Uce_0ryza_3

Gos- 2 Zea

Uce_Qryza_l

A-Tubulin_Coffea_l

Uce_0ryza_4

UBI9_Saccharum

Enolase_Zea

Actin-2_Zea

Uce_Oryza 2

UceAl.7

A-Tubulin_Coffea_2 35Sd AMV

TAAAATAGGAGTCTATGAGTCGATGGAACTTATCCAACTAAACTTTAATAAGAATGAACC 17 0

TATATATCACATCAGTCTCTGCACAAAGTGCATCCTGGGCTGCTTCAATTATAAAGCCCC 2 19 ACGGTCGTAATTCGTCAAGCAATCCGAAACGTCGCCACACCCCCACGCCAGCTGGAAAAT 976

-- .-------------------- ----AAGCTTGTCTGTCTCTACTAGATACCAGGGTTTC 34

GCCACCCGCAACGCCCGCGAGCGCAGCACCAGGCTCGAGAACATGTGCTGGCGGATCTGG 3 9 9 AACGGAGATAGTGCATCTATCATGCGATTCTTCGACGGAGTCGACGTCTGATTGGACCAG 73 ATGATTGCTTTCAATATAGGCTGATGGAGCCTATGAATGATCTATAACTATGTGATTGGA 6 5 TACCCAAAGTTTC AATTTGGACC ACCCTTAAACCTATCTTTTCAAATTGGGCCGGGTTGT 102 0 CAATTTTAAACATCATGAATCTCTGAACTAAAATTTAAATAACTTTTTTCTTCGATCTTT 4 41 GTCCAAGCTAAACGAGGAATAGGTGATGGTTGTAGCAGTCCAAGGTAGGGTCCATGCTTT 284 ACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGT 7 3

Arabi dops is

Uce_Oryza_3

Gos-2_Zea

Uce_Oryza_l

A-Tubulin_Cof fea_l

Uce_Oryza_4

UBIÇSaccharum

Enolase_Zea

Act in-2_Zea

UceOryza 2

UceAl.7

A-Tubul m_Cof fea_2 35Sd AMV

AAACTCAATTTT- -GTAATAATATTTAAAATACGTT---TTTACTCTCTCCCAGA---AT 2 22

--- ------ATTATTGGCTGTAGGAT- - -TCTAAACCGAGCCTAA---AT 35

ATTCACCACATT--TGCGAGATAGTCGAAAAGCACCA- -TCAATATTGAGCTTCAGGTAT 275 CAGTTCAAAATT - - CAAAATTCATTTTGGAGCCGTTC - -AAACAAAATTGTTTCAGTTTT 10 3 2 ATCTTTCGGTTT- GGTCATTTGGACCAGGGTGCCCG- -AAATATCGAAATTTCAGAAAT 90 CACCTCGCGCGCAAGAAGAAGCAGCTGGAGCTGGAGG - -GCATCCAGAGAATCTCGGCAA 4 5 7 AATTTCAGATGGTGAGCAAAAGTGCCACTTGCCTGCC- -TCCTTTTCTCGTGCCTGCCTC 131 TGTCTTAACTTGCGTAGCCAAGCTCGTATGAGCCTCT - TTTACTGGGTACCACTAATTT 12 3 GGTTTGGACTACCATGAACAACTTTTCGTCATGTCTAACTTCCCTTTCGGCAAACATATG 108 0 GACATTGAATGTTAAATTAACTTGAATCTAAGGTATG - TTCTACTTGTTGATAAATACAG 50 0 GACTTAAATCTTTGGCATATGTCACAAGCATGAATATACCTGATGATTTTCCCCAAATGT 344 CACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCACCTACAAATGCCATCATTGCGAT 13 3

Arabidopsis

ATCCCATCTCTCTGATTCCAATTCCTCCTCTCTCTCT---TTCGTCTCTCTAC- - 2 72 • ♦ · • ♦

3137

7S • · · ♦ · • · · · · • · » · · · <»♦*··· · · ·

Ί

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U c' (	2 Zea Uryza 1	ÀGCTGGAATAGCT- -CTATAGCCCTCAATCCAAACTA TTTTGGTTGTGTTGTGGTTGGATTGA·' ÍTCXUATATAT -	-ATGATATCTATAC- ACC'AAATCA„AJATA		8.3
A-bibulm Coiiea i	GCCCCTCGCCTC.CTGCCCTAAieTTACCCCGCCATTG -	GGGCTTGGATTACTG	G:'	1 0 ri
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UP Ί '	3 Saccharum;	GÀAGGAAGGAACAGGÀGCAGGTGCGTCGTGAGGCGAC-	-GGAGGACCTGGCCGA	- - G·'. í	c 1
Em:	i asp /ea	AAGGATAGAAAGAAAGGAGAAACAATATACTATTTAA- -	-GATCAGATAAAATAT	- - TA	186
Ad	iu-2 Zea	CTATATATTAGATACAGTTAAATA- AGTCTAAATTA -	CATCGGTGCGTGCG
Cc?e	0ryza_2	AACCATATATAGAGGAGATCGGCCGTATÀCTAGAGCT- -	GATGTGTTTAAGGTC	- -GT	] 1

UceAl.Ί

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Λ-Tubulί η Cof f sa 8 5.5d AMV

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Arabidopsis

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CCCGAATTGATTGTTTTAACCCCCGOTGATCGGAGCAAACTCT--CTGACGGTGACCGCC 3 3 0 AC - - ACGGACCAGCCCAATAGCCAGAAGCCTGT - AGCTCT - CC - ATGG - - - GCC 7 ⁿ

TTATGCAACTCTAAATTCTTATTCTAAAACTAATATTTCATTT TTGTGAACCAGATTG ! 4 TCACTACGGAATATACCATAGCCATCACAACTTTATTAATTTTGGTAGCTTAAGATGGTA 3 8ri TCf’AGTCTATATATATAACTrC('TCr\Y;CATT4OT-( 'ACCACACGACCCCAAGTCCTCTíL 3 4 R TATTATCAGATTTGCAAAAAATATGAAAAAAAAATCGGTCGAAATAATGTCGTATCTGGG 2 04 ATCTGTCAGAA- GGCGAGAAGGGAGACACCATGGGCGAGC1’TGCGGCGGTTGAGA('-GAC 5 6'< TAAGTCAAGGATÀGAAAGAAAGGAGAAACAATATACTATTTAAGATCAGATAAAAAAAGA 24 5 CCAGTACGACTAGATGTAGTGAACTAAACACAGGTTAAGCTGTGATCAATGTA- - TGTA 2 3J TGATTGCACGAGAAAAAAAAATCCAAATCGCAACAATAGCAAATTTATCTAGTTCAAAGT 1174 AAAAACCTTAACAACCTAGTGACTTAAATAAAACTTTTGAATAGTTTACTGACTATTTTG 616 TCCCCTAAGAATTTCTGGCAAAAGTTCAAGCGGTTCCAAAGTGCCCCAATGGGACCTCTC 4 64 CCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTG 2 50

GGTGATC - - ATTT - TTTGTGAACTTCACTTT TGGTAAGCAGCTT - - TGACTTT - TGT .3 81

CGTACTC- -GTGC-CACGTG----TCAATCC TGTGGTTCGGTTTCGTGGCGGT-TGC 126

TCTACTCT-ATTC -CACAATCTTTTGAAGCTATATTTACCTTAAATCTGTACTCTA-TAC 198 TATATAAT-AACC-AATTAACAACTGATTCTAATTTTACTACGGCCCAGTATCTAC-CAA 44 5 CTTCTTCTCCTTT - CCCAGATCTCGGAGGTCTCTCACTCTTCCGATCCAGAGACGT - CTT 12 04 TTCGATCCGAAAT-TTTGAACCCATGCTAGCTGCCAGGCTTTGGATTCTGAGCGTCACGT 26 3 CAAGAAGAAGTTC - CAGAGGAACTTCTCTGACCTTACCGTCTGGTCTGACGACAAT - AAG 6 2'' GCT AATA - - ATTT - TTTGGGACACATATACTGGTTACATTGTTATAATCTGTATATATCA 3 0 2 GAGAGTCTGACTC - TTTATATGCGGACAACTAAACACACGATAAGTGTCGAGAATGATTG 2 90

GAAAAGATATGTT - TAAAGGTAGTCCAAAGTA---AAACTTAGGGGCTGTTTGGTTCCCA 12 5 0

TAACTTTTTAAAG - TTAAGTGACTAAAACGTGAACATACTAATAGTTTAGTGACCTCGGA 6 7 5 CAAAAAAGGTGCCCCGGGGACAAGTTGTGCTCAGTTCGGCGCGTTTCAAGACAGGTTTTG 524 GATTGATGTGATGGTCCGATCTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCGGGAAACCTCCT 310

TC - ATAATCCT - TCACTTTTACTTT----TCAATTTT - GCTTTTTCC- TCTG----ATCT 4 2 9

GT- TTCCTCCTCTCTCTTTTCTTTT-- --TCATCTTT-TTTTTTTCT-TACG----ACAT 17 5

CA - ATAATCAT- - ATATTCTATTAT - - -TTATTTTTATCTCTCTCC-TAAGGAGCATCC 2 50 TACAAAACAACGAGTATGTTTTCTT- - - CCGTCGTAATCGTACACAGTACAAAAAAACC 501 TGTATACGCCTCTGGTATCTCCATT-- -CCTCCTTTTTCCCTCTCTTCCAAAAATCTCC 1260

CAGGCACAATAAAATATTTGGGCCT----CTAACTCTTCGTGGGCTGATCTGGGCCGTAG 319

GAGAAGAAGCTTTACATTGTGCTCA--- -TCAGCGTG-CATGGTCTTGTTCGTGGAGAAA 682 CG · TTGTTCGAATATATTCCAAATT - -TTTACTATGATTCGTGCTCTACCGGAACTAC 3 5 7

AGGAAATATTGGTCGTTCCACGTGA- - TTGAGTAAGAATGAGAGGGAAATAAAAGGAT 346

GCCATACTTTACCATTACTTGCCAA----CAAAAGTTGCCACACCTTGTCTAAGGTGAGG 13 06

TGATTTTACCCAAAAAATTATTATT- - - CAACCTCTCGTCCTCTCCTTTTTACACCTTT 731 GCCAGAAAGCAAAGGGGTTCCAAAGGG- -TGTCAGAGGGTCCATGTTTCAAAACTCCGGG 5 8 2 CGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCAAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGG 3 70

GATCTTAGTT-----ATTAAGCTGTTGAATCGCATGATCCTTTC----TTCTCTGATTGA 4 8 0

T-TATAGGTT-- --TCGTAGCGGCTGCGTTTCCTATTTTCCTT----TTCTTTTTCTAT 225

CCCTATGTCT-----GCATGGCCCCCGGGTCGGGTCCCAATCTC----TTGCTCTGCTAG 301

TGGCCAGCCT-----TTCTTGGGCTGGGGCTCTCTTTCGAAAGG---TCACAAAACGTA 552

TATTCATTTC-----TCAAAACATCGCGAAAATGAGAGAGTGCA- - --TCTCCATCCATA 1311

CAGACGAGAG-----ACGCCATGACACGATCTCATCAATTCCGTAG - - TGG CCACGGAAC 3 7 2

ACATGGAACT-----AGGTCGTGATTCTGATACAGGTGGCCAGGTGAAATATGTGGTCGA 7 37

TTCTAGATTT-----TGAAAACTTTATGAGAATTTTCTTATTTAG---ATACACTAAGGC 4 09

TTGGTGCGTTG---GTTTTGAAGGCAGGATTTGGTTAGGATGGGTGGACGTTTGAAGTGA 4 0 3

TGATCAAATTGTTAGCCACAACTTACTAAGCCTAAGGGAATCTTGCCACACTTTTTTGAG 13 66

TTATTATTTTTT ATTTTTTCTCTTTACTTTGTTTTTTTAGCTATTTCCAGCGACTAC 7 8 8

TGTCTTGGTCCCCCATAATTGACTTCGGCTAAGTAAAGGAAAACCT --TAGCCGAGGCTG 640 CACCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCGTTCAAGATGCCTCTGCCGA 4 3 0

Arabidopsis

TTATTTCTAATCCTTC- - ATGGGTT- TTATGACGAA-TCGTGTGTTAGGGATTCGTTT 534

999 99 *999 • 9 • · * • · * • ·

32.· 57 í 4 ’* • · • * • · • · • · * · ' A'¹ ·.; t v Zd 7 Cios 2 Zea Uce i >r y/.a_~! A-TuL)i.,i m_Cot fr,i Uce Oi yza_4 UB 19 S a c clia ϊ-' >. Lir Eno.dsr Zea Ac!, .ii 2 Zea

A-Tuhulin Ccfíoa 3 5Sd AMV ϊ TA íutttatgggata tagcacagaagggaca

C/ACGíi('AGTAA(3GC< 'C i - 22. i < 'AGGCCGCTÍ A I ICACGTAGCGCAAATG ACTTGGAAGAGCGATG TAATTTTGGTTGGTTT·· TGAGTTTTTCAAGCGT CCATTGACACGTGGGA T AAA ί1 AAAA T ΑΑΑΑ/’ι 1' TAATTAAGCCGAAGTCCTAGA ------AATGAC -TTGCTTGACTTAGAGTATCAG

TTTGCTGCGTGTTAACGG GCACCAACCCCGCí 'GTGACGÀ -CCAGGTCGGAAATGÍ2CT2- ctgggagctctactgcctcga -CCGCTCCCGTTTCí 'GCATC - GTGCGATTTATCTi'('TTTCTG

- TCÍGATGAFGCGTGGAGTGT - ACAGGGTGGACCTí 'TTCACTC -TTGGCTCGCTAGCTACCA--TTACCTCCTGCATf 'TAGACAT

ATAGATTTTCTATTTGTCC TTTTTAATTAACTTTCTCCCA GTGAATTTGTTAGAGGGAA-AT CTTGCCACAAí 'TGTGGCT TÀGCCCÂ2GACAG2AGGAT - CTCTCAGCTACTTTTTCTCTC

- CTAACGCGATGGCGAACGG-CCGAGGTGGTCGGAGCCTAAG

CAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCGACCCACGAGGAGCA TCGTGGAAAAAGAAGACGTTC

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A-Tubulin_Coffea 2 35Sd_AMV

Arabidopsis Uce_Oryza_3 Gos-2 Zea Uce Oryza_l A-Tubulin_Cof fea_l Uce_0ryza_4 UBI9_Saccharum Enolase Zea Actin2_Zea Uce Gryza 2 UceAl.7

A-Tubu1in_Coffea 2 35Sd AMV

TTTCTGGGTTGGGTTTCTAAATTTG^TGGT - CTAAGAACAGTGAAAT ATATAAGAGCGGGTGACCACGACTGC - GGGGCGGGGCA------ATA AACATCATGTTTAOTTAACTT^r:’AAAT TTGTATCGGTTTCTAC-- A- ACGGCATCAGCTTTCCACCTCCTCGATA - TCTCCGCGGCGCCGTC - TGTTGTTT

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TGGACCCG

GCACGGCATCCAGGTAAATTGCCTTCTATC-TAACCTCTTATATTTC---- AGATCTGC

TTTCCGAATTTTATTAGTAGTTGCGATATTATTAATACAGGTCTCGT-- - AGCGGCCG GTCAAGTGTCATCTCCTGACGTGGACTGGAGCTACGGTGAGCCAÀCCG AGATGTTA TACAAATTTACAATAAATAAAGTTCCTAGATTTTGAACGAAACCAGC----AGAGCGCA

GCCGGGATGCGCGTATAAAAACCGOCGAAACCCTTGGCTCTCCTCATT- - -CGGCCTAT

ACAACCAAACACCTGTCAAATTTGCCTAACCTTAGGCGTGGCAAACTG----TGGCAAAG

A---AAATTTCTCCAATTAGCTCTGTAATTTTCTATTTTGTTTCTCTT----TATTTTAG

AGACATAGGCGGGACCCCAGCTCTGCCGACCTGGAAATACCCTCCTCA----TATACCAT

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582 i 1 8 4D. ύ G U 14 22

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CACCACCA--CCA-- CCA-CCACTCC-A- -CCGATCGGCGAGA-GCG-----------C 3 5''

TAATATTT - - TTGTCTCTATAGATACT - ACGTGCAACAGTATAA - TCAA ---CCT 4 5 0

CCCCCTTT- - CCGTTCCTTTCTTTCCT- TCTCGCGTTTGCGTGG - TGGGGACGGACTCCC 710 TGTTTCTC- -TCATTTTTGTTCAAGGA-AATGATTCATCTTTGG-TTTGATTTTGGGTGT 14 76 CGTCTCCT - - CCTCCCTTATATAAAGG - CAGCGTTTCTGCAAGT - TATTACCCAATCTAC 5 3 9 TGCGCCGG - -TTCCAATGATGGAGAGG -GGATGGGTGAGAGTGG - CGGAGCCTACATTGT 90 4 CACCGTCC- -TTG -CCCCACGGAACAA-GAAAAATGGAATATGC - TCCCGCAGCCCTCGT 5 74 CACAACCG--CTT -ACTCTCGTGCGCT-CTCCGTGGGAGCGAGG-ACCCGCGGCCG- -GC 568 TGTGGCTT--ACAACCAAACACACCCTTAGATAATAAAATGTGG-TCCAAAGCGTAATTC 15 34 ATTTTTTT - - TGGTCCGTGTTAATCTTCGTTGAAGGCGATCTAGCTTTGATTTGAATTTC 9 5 5 TACTAGTTAGTAGTCACCACTGCTACTGCTTCAGTTCCTTTTATCACTTGCTTTACATGA 812 CACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGG 6 0 9

A - GTG AAATTGTTGTTTCAGT - GATCCCAG------------------------------- 66 0

G - GGGAGATCGTT - CGACGGC - GGCAAGATGC----------------------------- 3 86

T-ATAATATTTTTGTCTCTATAGATACTACG----------------------------- 48 0

C - AAACCGCCTCTCCCTCTCTTTATTTGTCTATATTCTCACTGGGCCCCACCCACCGCAC 7 7 5 T-GTGGAATAGCCTGATGGACAAATGCCGAGCGACCACACCGTCGGAGGCGGAGACGACG 153 5

ACGAGAGAGAGATCGTTCGACGCATATAGAGAGAGAGAGAGATAGGGCAAGATGC-----5 94

GCGCATACCGTGTGGGCCGCGGGATAAATACCTCAAGAAGGAAGCGTTGTGGCCTTACCT 96 5

GGAAACCAAGGGCGGACCTTCCCCTC----- -------- ------- - --- 60 0

GGCAGCGGCAGCTTCTCCTAGATCTCCGGCATCATCAGTGGATCC------- ------61 3

ACTAAAAAAAAAT - CAACGAGACGTGTACCAAACGGAGAGCAACGGCATCTTCTCGAAAT 15 93 ATTTTTTTTCTTTTTTCCTTTTAAGATACTTTTTTGTTTGTTTTAGGGTTTAGGCGATGG 1015 ATTAAGTCGATGCTCTTCCTTGAATAACTAGCGATTAGTTTCGTGGTGACCTATCTAGCC 8 72 AGAGGAGATCTTTTTATTTTTAATTTTCTTTCAAATACTTCCAC------- ------ 6 5 Ϊ

CCCTGGGCCCACTCACGAGTCCCCCCCTCCCGACCT------------------------- 811

CTTTCAACACCTTCTTCAGCGAAACCGGAGCCGGCAAACACGTTCCTCGTGCCGTGTTCG 1 5 95

CCAAGAGTTTGTCGATGGAGCCCTTGCGCATATCCTGAACATGTCCAAGGCTCTGGGAGA 10 2 5

TTCCCAACCGCTGGCTGGCCCGCCTCGTCTTCCCGGAAACCGCGGTGGTTTCAGCGTGCC t 6 5 3

CTTCAAAGCGGATCTTGAAGGAGCTCAAGGACCT- ---------- --------- ------ 1049

ATTTTTCTGTTTGGGTGGCATCAATCCTGAACACAGAAAGCTGCAAG-------------- 919

Arabidopsis

-» Λ ^-ί <1 Ί /

TCGATGTCGAGCGCAGTGTGATCGATGAAGTCGGAAGyGGGACCTACCG'.'CAAGTCTTGí »«· ··» · * · · · · · · * · · · · · · · · • · ·«» ··»»·· · · · • ♦ · · » * * * · · · · » * · · · · · » · · · · · · • « · · · · » · · · · · · · « · · · · · · · · ··»«··« ♦ · · ♦ ^! '-'ϊ _G; yza *

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GCAGGTTGGAAATÜGGAGGGCAGTACTGGCTTAGGTGATAeATGGC.eAGTATGCC·. - í 0 í; G

GGATTCTCCAAGCAGACGGAGACGVCAGGGGAÍ 'GGAGTeCTGCCAGeACACAACAGC·:/,

A r abidopsis - - - --IJt-e Oryza i

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Jfχ_ Oryza ;

A Tubui in Onffaa_l AOOrTGAGf'AGOTCAT Ucp_Oryza_4 --GI-. 1 á-Sdcciurm

Enolase Zea — ---- - Act. in-2_Zea --- - --- ·-Uce_Oryza_ 2 --- -------- ---- UceAl .Ί -- ---- ------- - A-Tubul in Coffea 2 ----------- ---- 3SSd AMV

A tabela 1 indica identidades relativamente baixas entre os principais promotores constitutivos descritos na literatura e o promotor da presente invenção (uee A 1.7). Os promotores foram escolhidos atrav és da maior identidade, de acordo com as buscas no bancos de dados do NC BI (www.nebi.i)l.m.itih.go\).

Promotores constitutivos	Organismos	UceA1.7 (Identidade
Treaiose 6-fosfato	Arabidopsis thaliana	líí 7
sintase de 4. thaliana
Uce_Oryza_3	Oryza sativa	20,0
Gos-2Zea	Zea mays	27,2
Uce_Oryza_l	Oriza sativa	40,7
A-Tubulin Coffea 1	Coffea	37,1
Lce_Oryza_4	Oryza sativa	33,2
LBI9_Saccharum	Saccharum	38,8
EnolaseZea	Zea mays	33,5
Actin-2_Zea	Zea mays	33,3
Uce Oryza 2	Oryza sativa	35,3
A-Tubulin Coffea 2	Coffea	44,3
35Sd AMV	Alfafa mosaic virus	34,1

Tabela I. Identidade entre o promotor uceAI.7 de soja e os diferentes promotores constitutivos existentes.

A análise foi feita pelo alinhamento múltiplo de seqüèncias gerado pelo programa CLUSTAL_W e o pareamento pelo programa PAIRWISE.

A análise foi feita através do alinhamento múltiplo de seqüèncias pelo software CLUSTALW e o pareamento pelo PAIRWISE.

«·« ·· ···« ·· · ·· ···· ·· « · » ·····* ···

34·37 • · · · · · · · · · » · ··· · · · · · · · • ·· ·· · ·· ······· ·· ««

Exemplo 3

Clonagem da seqüência promotora uce Λ /. 7. do gene da proteína de conjugação ã ubiquitina de algodão em vetor de plantas jpCAMRlA /391).

O DNA da bactéria transformada contendo o vetor recombinante. ou seja, o promotor UCE de algodão clonado no vetor pGEM-T. foi digerido com as enzimas de restrição Nco I e Spe. Em geral, foram utilizados 5U de enzima para cada pg de DNA, no tampão OPA (One-Phor-All) da pharmacia biotech numa concentração final de 2x, a 37 C por 3 horas. As enzimas não cortam o inserto. mas flanqueiam o sitio de clonagem no vetor, e o inserto de 1.0 kb purificado com o kit Gene Clean (Bio 101 Systema). O vetor pCAMBIA1391 (Figura 3) foi digerido com Nco I e Spe 1 e purificado com o kit Gene Clean (Bio 101 Systema). O inserto de 1.0 kb foi ligado ao vetor pCAMBIA1391 com T4 DNA ligase (Figura 3). A concentração de DNA (vetor Pcambia: promotor uceA1.7) utilizadas no sistema dc ligação foi efetuada através de uma razão molar de 1:3. A reação de ligação foi realizada em tampão ligase lx contendo 51J de T4 DNA ligase. O vetor recombinante contendo o polinueleotídeo da presente invenção foi usado para transformar células competentes de E. coli por eletroporação (Manual de transformação genética dc plantas. Brasília: EMBRAPASPI/EMBRAPA-CENARGEM, 1998. 101. p.). De um total de aproximadamente 400 clones de bactérias transformadas, oito foram selecionados e analisados por PCR, com os primers W4 e UCE2, para verificar a presença do inserto. Os clones 1, 6, 7 e 8 foram positivos, conforme mostra a Figura 4. Para confirmar a clonagem e a orientação do inserto, o DNA plasmidial dos clones 1 e 7 foi obtido por preparação de DNA píasmidial em pequena escala com o kit miniprep 250 (Quiagen) e digerido com Hind III e Xba I. Em geral, foram utilizados 5U de enzima para cada pg de DNA, no tampão OPA (One-Phor-All) da pharmacia biotech numa concentração final de lx, à 37 °C por 3 horas. Hind III não corta o inserto, mas está presente no polilinker do vetor e Xba I corta o inserto na posição 148. Ambos os clones foram confirmados como positivos conforme mostra a Figura 5. O vetor pCAMBIA1391 foi selecionado para que o fragmento correspondente a extremidade 5’ do gene UCE presente no clone uceAl.7 (uceA refere-se a Ubiquitin conjugating enzyme de algodão; o 1.7 refere-se ao número dos clones positivos obtidos em cada etapa de clonagem. O 1 corresponde ao clone número 1 da amplificação do promotor e o 7 ao clone número 7 da clonagem do clone 1

35/37 no vetor pCAMBIA 1391.) fosse elonado em fase com a região coditicadora do gene gusA presente no vetor.

Exemplo 4

Caracterização funcional da sequência de DNA promotora do gene da proteína de conjugação à ubiquitina de algodão - uccAl. 7.

Para validar o potencial da seqüência de DNA isolada, o vetor contendo a seqüência promotora SEQ ID NOI foi introduzido em células de Agrobacterium tumcfascicns LBA 4404 por choque térmico. Para essa transformação foi adicionado 1 pg de DNA plasmidial (vetor pCAMBIA 1391, contendo o promotor da presente invenção) em lOOpL de suspensão de célula competente de A. tumefàsciens LBA 4404, a reação foi então incubada no gelo por 30 minutos. As células permaneceram em nitrogênio liquido até a solidificação, e foram transferidas imediatamente para 37°C para então serem incubadas por 5 minutos. Foi adicionado à reação 1 mL de meio YEB (5g de Extrato de Carne, lg de Extrato de levedura, 5g de Peptona, 5g de Sacarosc e 240mg de MgSCfo completar o volume eom água deionizada para l litro e ajustar o pH do meio para 6,8), e as células ficaram incubadas por 2 horas a 28°C. A solução foi plaqueada em meio YEB sólido (Meio YEB acrescido de ágar 1,6% p/v). Foi selecionada uma colônia positiva, crescida no meio YEB com o antibiótico de seleção (canamicina). Essas células transformadas foram utilizadas para a transformação de plantas de A. thalianaColumbia pela técnica de infiltração de botões florais. Esta técnica consiste no encharcamento de botões florais de A. thaliana com uma cultura de Agrobacterium contendo 50 g/L (w/v) sacarose e 300 pL/L Silwet L-77. Para tal, as plantas de A. thaliana foram submersas de ponta-cabeça, por cinco minutos, na cultura de Agrobacterium transformada com o vetor reeombinante da presente invenção, de forma a atingir apenas os botões florais. Em seguida, as plantas foram cultivadas em casa de vegetação até a coleta de sementes.

As sementes coletadas foram desinfestadas em álcool 70%, por 1 minuto e em hipoclorito de sódio 1% por 15 minutos e lavadas 4 vezes com água estéril. Em seguida, foram semeadas em meio de cultura MS (murashige, T. & skoog, F. Physiol. Plant., 15:

473-497, 1962) contendo higromicina na concentração de 20 pg/ml. visando a seleção de transformantes (Anexo la). As plântulas germinadas e enraizadas foram transferidas para copos com terra estéril e cobertas de forma a preservar a umidade, e transferidas para casa de vegetação (Anexo lb).

Apos algumas semanas, dependendo do desenvolvimento das plantas aclimatadas, cortes dc raí/es. caules, folhas e botões florais foram realizados e θ'mesmo foram incubados em solução de X-gluc preparado de acordo com Brasileiro X. C arneiro (Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA5 SPI EMBRAPA-CEX ARGEM. 1998. 131. p.f com o objetivo de verificar a indução da expressão do gene gnx.

O vetor recombinante contendo o promotor CaMV35S (Cauliflower Mosaic Vírus 35S prometer) duplicado com a seqüência enhancer do AM\ (Altatã Mosaic Vírus) (CaMV35SdAM V) foi capaz de promover a expressão do gene gus. nas (a) folhas, (b) Caule, (c) raiz e (d) botão floral em A.thalianu (Anexo 2 Λ-D). como o esperado, já que esse promotor tem sido descrito na literatura cientifica como um forte promotor constitutivo. Assim quando comparamos a presente invenção que contém a construção sense do promotor de algodão uceA1.7 com CaMV35SdAMV observar-se que o promotor U uccA1.7 é uma excelente ferramenta biotecnológica, já que esse promotor também possui uma forte expressão constitutiva promovendo uma grande atividade enzimática da β-glucoronidase, (e) nas folhas, (fj caule, (g) raízes e (h) botão floral de A. thaliana, (Anexo 2 E-H).

A estratégia utilizada na presente invenção para a caracterização funcional das seqüências de DNA, previamente isoladas do algodão, foi eficiente para se av aliar o potencial desta seqüência. Os resultados obtidos mostram que a seqüência uceA1.7 é capaz de direcionar a expressão de β-glucoronidase em níveis elevados, representando, assim, uma seqüência reguladora com potencial uso constitutivo na produção de plantas geneticamente modificadas.

Com o intuito de se determinar quantitativamente a expressão dirigida pela seqüência de DNA em estudo, foi realizado um ensaio fluorimétrico da atividade específica da enzima β-glucoronidase usando extratos protéicos das plantas de Arabidopsis contendo construções (vetores reeombinantes) com promotor CaMV35S (controle positivo) e o promotor do algodão uceAl. 7. Para tal. os extratos protéicos (foram obtidos de acordo com o Manual de transformação genética de plantas. Brasília:

EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CENARGEM. 1998. 133. p). Foram quantificados pelo método dc Bradford (foram obtidos de acordo com o Manual de transformação genética dc plantas. Brasília: EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CENARGEM, 1998. 255. p) e submetidos ao substrato MUG (methyl-umbelliferone-glucoronide) 2mM e. após 30

37-37

4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 ♦ 4 » · ♦♦»· • 4 « 4 · 4

4 »4 · 4 · 4

4 4 4 4 4 4 444 ·4 4 44 4 minutos de reação à 37C, a atividade tluorimétrica da reação foi determinada através do ensaio espeetrolbtométrieo. O cálculo dti atividade específica do GUS foi realizado de acordo com Manual de transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPASP1 EMBRAPA-CENARGEM. 1998. 136. p (Figura 6).

Pode-se observar que a seqüência de DNA contendo a região promotora ueeA

1.7 é capaz de dirigir a expressão de GUS em folhas em níveis similares ao promotor de plantas comercial mais forte e utilizado atualmente (CaMV35S duplicado com o enhancer do AMV). Além disso, a expressão dirigida por este fragmento em caule e. principalmente em botões florais de plantas de .4. thaliana é consideravelmente superior àquela do promotor CaMV35Sd+AMV, tornando o promotor da presente invenção mais adequado para produção de plantas transgênicas expressando genes de interesse nesses tecidos vegetais.

A'

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Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Um gene quimérico compreendendo um polinueleotídeo com atividade constitutiva caracterizado por o dito polinucleotídeo ser definido pela SEQ ID N°01, opcionalmente ligado: (i) a sequências acentuadoras de expressão, ou (ii) promotores de interesse, ou (iii) a uma sequência de polinucleotídeo de interesse, sendo pelo menos uma das opções de ligação uma sequência heteróloga.
2. 2. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato da sequência de polinucleotídeo de interesse poder ser uma região de codificação ou uma região de não codificação.
3. 3. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato da região de codificação ser isolada de um gene endógeno ou heterólogo, sendo o gene endógeno ligado a pelo menos uma sequência heteróloga.
4. 4. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato da sequência de polinucleotídeo de interesse poder estar na orientação sense ou antisense.
5. 5. Um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato das sequências acentuadoras de expressão serem selecionadas do grupo consistindo de SV40, HSV-1, AMV, HPV-16, entre outros.
6. 6. Um vetor recombinante caracterizado por conter um gene quimérico de acordo com a reivindicação 1 a 5.
7. 7. Um vetor recombinante caracterizado por compreender:

   a. A SEQ ID N°01, opcionalmente ligada a sequências acentuadoras de expressão ou promotores de interesse; operacionalmente ligados a

   b. Uma sequência de polinucleotídeo de interesse; e

   c. Uma sequência de terminação;

   sendo pelo menos uma dessas sequências uma sequência heteróloga.
8. 8. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo fato da sequência de polinucleotídeo de interesse poder ser uma região de codificação ou uma região de não codificação.
9. 9. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo fato da sequência de polinucleotídeo de interesse ser isolada de um gene endógeno ou

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   2/2 heterólogo, sendo o dito gene endógeno ligado a pelo menos uma sequência heteróloga.
10. 10. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo fato da sequencia de terminação ser selecionada do grupo consistindo de sinal de terminação SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desigrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans e outros semelhantes.
11. 11. Um vetor recombinante de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pelo fato das sequências acenturadoras de expressão serem selecionadas do grupo consistindo de SV40, HSV-1, AMV, HPV-16, entre outros.
12. 12. Método para modificar a expressão de genes em um organismo caracterizado por incorporar estavelmente no genoma do organismo um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11 ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 12 caracterizado pelo fato do organismo ser uma planta.
14. 14. Método para produzir uma planta tendo a expressão de um gene modificada caracterizada pelo fato de compreender as seguintes etapas:

    a. Transformar uma célula de planta, tecido órgão ou embrião um vetor recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11 ou um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5;

    b. Selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes;

    c. Regenerar plantas maduras de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionadas na etapa (b);

    d. Selecionar plantas maduras da etapa (c) tendo a expressão do gene modificada quando comparada com uma planta não transformada.

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    FIGURA 1

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    FIGURA 4 *

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    35sd uceA1.7

    FIGURA 6