DE4315109A1

DE4315109A1 - Verfahren und Vektorkonstrukt zur Expressionssteigerung von Transgenen

Info

Publication number: DE4315109A1
Application number: DE19934315109
Authority: DE
Inventors: Robert-Matthias Dipl Bi Leiser; Lutz Plobner; Klaus Prof Dipl Biol Dr Muentz
Original assignee: Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Current assignee: Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Priority date: 1993-05-06
Filing date: 1993-05-06
Publication date: 1994-11-10
Also published as: AU6842394A; WO1994026912A1

Description

Stand der Technik

Es gibt eine Reihe von Zielen bei der gentechnischen Manipulation von Kulturpflanzen zur optimalen Ausprägung bestimmter Eigenschaften bzw. bei "protein farming", die ein hohes Expressionsniveau transferierte Gene erforderlich machen. In der Mehrheit der Fälle wurde versucht, durch Wahl eines starken Promotors, durch Optimierung des Promotors oder durch Verknüpfung von transkritionssteigernden Sequenzen (enhancer) mit dem Promotor des Expressionsniveau auf Transkriptionsebene zu erhöhen. Das chimäre Gen wurde dann durch Transformation in das Genom der Zielpflanze integriert. Durch Einfügen mehrerer Genkopien (Tandemkonstrukte oder Mehrfachinsertionen im Genom) konnte die Expression des gewünschten Produkts nicht in allen Fällen weiter gesteigert werden.

Eine Möglichkeit zur Genexpression ganz anderer Art stellt die Nutzung von Pflanzenviren als episoinale Vektoren dar. Nach Integration des Fremdgens im Virusgenom wird es bei der Replikation wie ein Virusgen exprimiert. Ein wesentlicher Vorteil eines solchen Systems ist, daß das Fremdgen zusammen mit dem Virusgenom durch Replikation amplifiziert wird, wodurch die Voraussetzungen für eine Hochexpression geschaffen werden (Joshi und Joshi, 1991).

1. DNA-Viren

Zu den ersten Pflanzenviren, die als episomale Vektoren attraktiv erschienen, gehörten DNA-Viren. Beim cauliflower mosaic virus (CaMV), das ein einteiliges Genom aus doppelsträngiger DNA besitzt, ist versucht worden, an verschiedenen Stellen im Genom zusätzliche Sequenzen einzufügen oder vorhandene auszutauschen. Kleine Insertionen wurden zwar an mehreren Stellen toleriert (Hull, 1985), bei längeren einzufügenden Sequenzabschnitten gab es strenge Limitierungen. Einerseits werden zu große DNA-Moleküle nicht mehr in Partikeln verpackt und andererseits wirkt sich der Austausch von Virusgenen gegen Fremdgene drastisch auf die Replikation oder den Virustransport aus. Lediglich die offenen Leserahmen II und VII lassen sich deletieren, ohne die Infektiosität dieser Konstrukte zu beeinflussen (Howarth et al., 1981; Dixon und Hohn, 1984). Bestimmte Mutationen im ORF VII sind lethal oder revertieren in vivo (Dixon et al., 1986). Deshalb sind nur Vektoren konstruiert worden, bei denen der Leserahmen II gegen das Fremdgen ausgetauscht wurde. Relativ kleine Gene, wie das der Dihydrofolatreduktase (Brisson et al., 1984), des Interferons (Gronenbom, 1987) und des Metallothioneins II (Levebvre et al., 1987) wurden mit Hilfe dieser Vektoren erfolgreich exprimiert. Das Expressionsniveau war sehr hoch.

Eine weitere Gruppe von DNA-Pflanzenviren, die als episomale Expressionsvektoren genutzt wurden, sind die Geminiviren. Ihre Genom besteht aus einem oder zwei Molekülen einzelsträngiger DNA. Sie sind als Expressionsvektoren vor allem auch deshalb interessant, weil einige Geminiviren Wirtspflanzen unter den Monocotyledonen haben.

Eines der am besten untersuchten Geminiviren ist das Tomaten Goldmosaic Virus (TGMV). Für die Replikation und die systemische Ausbreitung dieses Virus ist das Hüllprotein nicht notwendig und kann deshalb deletiert werden (Etessami et al., 1988; Gardiner et al., 1988; Hayes et al., 1988). Anstelle des offenen Leserahmens für das Hüllprotein wurden kodierende Regionen für das CAT-, GUS- oder das NPT II-Gen eingefügt (Hanley-Bowdoin et al., 1988; Hayes et al., 1988; Hayes et al., 1989; Kanievski et al. 1992). Die Infektion mit solchen Konstrukten erfolgte über Agroinokulation (Grimsley et al., 1986). Dabei wurden Kopien der Konstrukte als Dimere in die T-DNA eines Ti-Plasmids kloniert. Nach Inokulation von Wirtspflanzen mit den rekombinanten Agrobakterien entstehen monomere Virusgenome, die sich dann in primär infizierten Zellen replizieren und schließlich systemiscch in der Pflanze ausbreiten (Hayes et al., 1988). Durch die Replikation der veränderten Virusgenome bedingt wurden hohe Aktivitäten der Markerenzyme gemessen, die einem vielfachen der Aktivität in nicht replizierenden Kontrollen entsprachen (Hayes et al., 1988; Sunter und Bisaro, 1991; Kanievski et al., 1992). Während die Größe des Inserts beim TGMV nicht entschiedend die Replikation beeinflußte, ist beim cassava latent virus (CLV) die Insertgröße limitiert (Ward et al., 1988; Etessami et al., 1989). Wie beim TGMV wurden für rekombinante CLV-Genome ein hohes Expressionsniveau des insertierten Fremdgens und systemische Ausbreitung in Pflanzen beobachtet (Ward et al., 1988).

Bei anderen Viren der Geminivirus-Gruppe (wheat dwarf virus (WSV), maize streak virus (MSV) wurden ebenfalls die jeweiligen Hüllproteingene gegen unterschiedlich lange Fremdgene ausgetauscht und die Konstrukte in Pflanzenzellen übertragen. Fremdgene ließen sich über das MSV und WDV nur in agroinokulierten Blättern bzw. Protoplasten amplifizieren und exprimieren (Lazarowitz et al., 1989; Matzeit et al., 1991). Bei den Viren ist das Hüllprotein für den Virustransport erforderlich. Eine systemische Ausbreitung der Mutanten ohne Hüllproteingen ist deshalb nicht möglich. Der Austausch des Hüllproteingens gegen das CAT-Gen beim MSV wirkte sich nicht auf die Replikation aus. Durch die fehlende Ausbreitung war die festgestellte CAT-Aktivität jedoch gering (Lazarowitz et al., 1989). Bei Inokulation von Triticum monococcum-Zellkulturen mit WSV-Genaustausch-Mutanten konnten Replikationsraten wie bei Wildtyp-WSV erzielt werden (Matzeit et al., 1991). Selbst bei Austausch des Hüllproteingens gegen wesentlich größere Nukleinsäurefragmente, wie das β-Galaktosidasegen aus E. coli (Matzeit et al., 1991) oder ein Ac/Ds-Transposon (Laufs et al., 1990), replizierten die Viruskonstrukte dem Wildtyp entsprechend. Daraus wurde gefolgert, daß die Replikation nicht von der Insertgröße abhängt. Eine Verpackung der DNA in Partikel und Virustransport spielen in Zellkulturen keine Rolle. Die Aktivität der Markerenzyme, die von replizierenden WSV-Vektoren exprimiert wurden, war 20fach höher als bei nicht replizierenden Kontroll-Vektoren. Sie war vergleichbar mit den Werten, die in Zellen von T. monococcum durch ein 35S-Promotor getriebenes NPT II-Gen transient erreicht wurden (Matzeit et al., 1991).

Die Ergebnisse zur extrachromosomalen Amplifikation und Expression von Fremdgenen mit Hilfe von DNA-Virusgenomen zeigen, daß der Austausch von viralen Genen gegen fremde Sequenzen prinzipiell möglich ist. Die Fremdsequenzen werden zusammen mit dem Virusgenom in Pflanzenzellen vermehrt und genau wie das entsprechende Virusgen exprimiert. Das Exressionsniveau der eingefügten Fremdgene wird als hoch eingeschätzt. Genaue Vergleiche mit pflanzlichen Promotoren sind bis auf Ausnahmen (z. B. Matzeit et al., 1991) nicht angestellt worden. Die Nutzung solcher Verfahren hat jedoch Nachteile, die zum einen spezifisch für das benutzte Virus sind und zum anderen generell bei DNA-Viren zum Ausdruck kommen.

Der Wirtskreis des CaMV beispielsweise ist sehr klein und Pflanzen außerhalb des Wirtskreises können mit chimären Konstrukten nicht infiziert werden. Bei allen Viren der Caulimovirus-Gruppe ist weiterhin die Insertionsgröße streng limitiert (maximal ∼ 1 kb). Selbst innerhalb dieser Grenzen kommt es relativ häufig zu Deletionen von Fremdsequenzen, was auf den retroviralen Replikationsmechanismus dieser Viren zurückzuführen ist (Grimsley et al., 1986). Virusgenome mit integriertem Fremdgen bleiben infektiös und induzieren in der Wirtspflanze Symtome. Der Austausch des ORF II gegen ein Fremdgen verhindert lediglich die Übertragung durch Blattläuse. Klonierte DNA ist aber auch mechanisch übertragbar (Fütterer et al., 1990).

Bei den Geminiviren mit zweiteiligem Genom (TGMV, CLV) ist ein Genomteil notwendig für die systemische Ausbreitung in Pflanzen. Wird das Hüllproteingen, das sich auf dem anderen Genomteil befindet gegen ein Fremdgen ausgetauscht, muß die zweite Komponente mit in die Pflanze gebracht werden, um ein hohes Expressionsniveau durch systemische Ausbreitung zu erzielen. Ein Weg solche Doppelinfektionen zu umgehen, ist die stabile Integration der fremdgentragenden Komponente als Tandemkopie im Genom der Pflanze (Hayes et al., 1988a; Kanievski et al., 1992).

Der Austausch des Hüllproteingens bei Geminiviren mit einteiligem Genom (MSV, WDV) ist in jedem Fall mit einem Verlust der Fähigkeit zur systemischen Ausbreitung verbunden. Eine Anwendung ist daher auf Pflanzenzellkulturen beschränkt (Matzeit et al., 1991). Die Größe der Insertion ist bei den Geminiviren zwar weniger limitiert als bei den Caulimoviren, über die Stabilität großer Insertionen gibt es jedoch widersprüchliche Ergebnisse (Stanley und Townsend, 1986; Ward et al., 1988). Um den Effekt eventuell auftretender Instabilität zu mindern, wäre die stabile Integration von Tandemkopien im pflanzlichen Genom ein Ausweg (Davies und Stanley, 1989).

Bei allen DNA-Viren ist es praktisch unmöglich eine gewebe- bzw. entwicklungsspezifische Expression der gewünschten Fremdgene zu erreichen. Die Expression findet hauptsächlich in grünen Pflanzenteilen statt. Gerade beim protein farming ist jedoch eine spezifische Expression im Samen, der sich durch höheren Proteinanteil an der Gesamtmasse auszeichnet und durch geringen Wassergehalt lagerfähig ist, anstrebenswert.

2. RNA-Viren

Bei den RNA-Viren, zu denen der größte Teil der Pflanzenviren gehört, gibt es bislang nur wenige Beispiele über die Verwendung ihrer Genome zur Expression von Fremdgenen. Erst die Klonierung von vollstängigen cDNA-Kopien einiger Virusgenome, von denen sich infektiöse RNA-Transkripte synthetisieren ließen, machten derartige Manipulationen möglich. RNA-Viren replizieren über eine viruskodierte RNA-abhängige RNA-Polymerase (Replikase). Das Enzym ist spezifisch für das entsprechende Virus und sichert eine hohe Vermehrungsrate. Die entstehenden Tochter-RNA-Moleküle mit (+)-Strang-Polarität können bei einigen Viren direkt als messenger-RNA fungieren. Je nach Expressionsstrategie des Virus werden von dieser RNA nur die 5′-gelegenen offenen Leserahmen translatiert oder es entsteht ein Polyprotein, welches später durch limitierte, ortsspezifische Proteolyse in die Einzelkomponenten zerlegt wird. Bei anderen Viren erfolgt die Expression der 3′-nahen Gene über die Bildung subgenomer RNA von (-)-Strang-Intermediat der genomischen RNA. Die subgenomische RNA ist als messenger-RNA aktiv. Die Hüllprotein-Gene bei einigen Pflanzenviren werden beispielsweise über subgenomische RNA exprimiert. In Anbetracht des hohen Expressionsniveaus waren es vor allem die sugenomischen Promotoren für die Hüllproteingene, die für die Steuerung der Expression von Fremdgenen genutzt werden sollten.

Die erste Publikation, in der von der erfolgreichen Hochexpression eines Fremdgens über ein RNA-Virus in Pflanzen berichtet wurde, erschien 1986 (French et al., 1986). Als Vektor diente das brome mosaic virus (BMV). Dieses Virus besitzt ein dreigeteiltes RNA-Genom. Zwei Genomteile kodieren für Replikationsfunktionen, die in trans auch die RNA3 vermehren, auf der sich 2 offene Leserahmen befinden (Ahlquist et al., 1981). Von der RNA3 wird eine subgenome RNA gebildet, die das Hüllprotein kodiert. Aus folgenden Gründen erschien das BMV als episomaler Vektor besonders geeignet zu sein (French et al., 1986):

- Durch das geteilte Genom und die in trans Wirksamkeit der Replikase steht die RNA3 zur gentechnischen Manipulation zur Verfügung, ohne den Replikationsprozeß als solchen negativ zu beeinflussen. Vorausgesetzt, daß die Replikase die veränderte RNA3 erkennt, wird diese einschließlich des eingefügten Fremdgens vermehrt.
- Das Virus vermehrt sich außerordentlich stark in Wirtspflanzenzellen. In infizierten Pflanzen akkumuliert das Hüllprotein in Milligramm-Mengen pro Gramm Gewebe.

Nach Deletion des größten Teils der kodierenden Region für das Hüllprotein wurden veränderte in vitro Transkripte der RNA3 zusammen mit RNA1 und 2 in Protoplasten (Hordeum vulgare) inokuliert. Dem molaren Verhältnis nach wurde ungefähr halbsoviel verkürzte subgenome RNA gebildet wie bei Inokulation mit Wildtyp-RNA.

Bei anderen Konstrukten wurde die deletierte Region durch ein CAT-Gen ersetzt. Die chimäre RNA akkumulierte 5-15fach schwächer als Wildtyp-RNA. Die CAT-Enzymaktivität, die in inokulierten Protoplasten gemessen wurde, war jedoch außerordentlich hoch. Im Vergleich zu transgenen Pflanzen mit Expression des CAT-Gens unter Kontrolle von einem Rubisco- oder Nos-Promotor (Herrera-Estrella et al., 1984), war die gemessene Aktivität 7 bzw. 23 mal so hoch.

Jupin et al., (1990) suchten nach cis-aktiven Elementen, die für die Replikation der RNA3 des beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) wichtig sind. Das Virus besteht wie das BMV aus mehreren (4) Genomteilen, von denen nur die RNA1 und 2 für die Replikation in Pflanzen erforderlich sind. Ungefähr 75% des internen Bereichs der RNA3 konnten ohne Verlust der Replizierbarkeit der RNA3 deletiert werden. Anstelle des vorhandenen Leserahmens wurde das GUS-Gen insertiert. Transkripte solcher cDNA-Mutante wurden nach Coinokulation mit RNA1 und 2 in Chenopodium quinoa vermehrt. In Blättern solcher Pflanzen wurde hohe GUS-Aktivität nachgewiesen. Die Schaffung eines veränderten Replikons ist demzufolge möglich. RNA3 und RNA4 des BNYVV sind jedoch variable Bestandteile des Virus. In Abhängigkeit von der Art und Weise der Übertragung und vom Vermehrungswirt können diese RNAs Deletionen tragen oder völlig aus den Isolaten verschwinden (Koenig et al., 1986). Aufgrund fehlender Selektion wird es daher kaum möglich sein das Fremdgen über längere Zeit zu stabilisieren.

Die Vorteile von RNA-Viren mit geteiltem RNA-Genom nutzend wurde auch das barley stripe mosaic virus (BSMV) als episomaler Expressionsvektor für Fremdgene verwendet (Joshi et al., 1990). Das Hüllprotein-Gen der RNAβ wurde gegen das Luziferase-Gen ausgetauscht und Transkripte zusammen mit Transkripten der RNAα und γ in Protoplasten transfiziert. Im Vergleich zu transfizierter Luziferase-mRNA wurde so eine 42fach höhere Enzymaktivität in Tabakprotoplasten gemessen. In Maisprotoplasten betrug die Aktivitätssteigerung durch Virusamplifikation 60 h nach Transfektion sogar das 123fache.

Am Tabakmosaik Virus (TMV) wurden neben der Expression von Fremdgenen auch grundlegende Untersuchungen zur Stabilität chimärischer Virusgenome angestellt. Takamatsu et al., (1987) fanden, daß die Deletion des Hüllproteingens beim TMV keinen bzw. nur geringfügigen Einfluß auf die Replikation solcher Mutante hatte. In Tabakpflanzen, in denen sich der TMV-Wildtyp systemisch ausbreitet und typische Mosaiksymptome erzeugt, replizierte die hüllproteinlose Mutante nur in inokulierten Blättern und induzierte keine Symptome.

Transkripte, die das CAT-Gen unter Kontrolle des subgenomischen Promotors für das Hüllprotein-Gen enthielten, replizierten in inokulierten Tabakblättern. Es ist jedoch deutlich weniger RAN nachweisbar gewesen (genomische und subgenomische), als in parallelen Versuchen mit der Wildtyp-RNA oder der hüllproteinlosen Mutante. Auf das fehlende Hüllprotein, welches eine Rolle beim Ferntransport in Pflanzen spielt (Atabekov und Dorokhov, 1984), ist zurückzuführen, daß CAT-Aktivität nicht systemisch nachweisbar war.

Die in diesen Versuchen gemessene CAT-Aktivität im inokulierten Blattgewerbe war geringer, als auch der Hüllproteinexpression zu erwarten war. Dies wird auf die schwache Replikation der Chimären zurückgeführt.

Mit der Nachkommenschaft der CAT-Mutanten wurden erneut Tabakpflanzen inokuliert. Auch in diesem Fall wurde CAT-Aktivität in inokulierten Blättern gefunden. Obwohl die Homogenität der RNA-Nachkommenschaft auf Sequenzebene nicht bestimmt worden ist, folgerte man aus den Aktivitätswerten, daß die Mutationsrate während der RNA-Replikation nicht so hoch ist wie vermutet wurde (Van Vloten Doting et al., 1985).

Neben dem Austausch des Hüllproteingens gegen ein Fremdgen versuchten Takamatsu et al., (1990) Fusionsproteine aus Hüllprotein und Enkephalin, einem Hirnpeptid, über einen TMV-Vektor in Pflanzen zu produzieren. Die Veränderungen in der TMV-RNA beschränkten sich auf eine kurze (18 Basen) 3′-Extension des Hüllprotein-ORF. Dennoch breiteten sich die Hybridviren in systemischen TMV-Wirten nicht systemisch aus, sondern riefen auf inokulierten Blättern Lokalläsionen hervor. Analyse der Proteinsynthese in Protoplasten, die mit Hybrid-Viren inokuliert wurden, ergab, daß die Syntheserate für das Fusionsprotein zunächst wie beim unveränderten Hüllprotein war, später (22-24 h p. i.) jedoch drastisch abnahm.

Dawson et al., (1989) konstruierten ein Hybrid-Virus, bei dem in ein vollständiges TMV-Genom ein CAT-Gen unter Kontrolle eines Duplikats des subgenomischen Hüllproteingen-Promoters eingefügt wurde. Das zusätzliche Gen befand sich entweder vor oder hinter dem Hüllproteingen. Auf diese Weise wurde erreicht, daß die chimärische RNA in Viruspartikel verpackt wurde.

Das Hybridvirus mit der CAT-Gen-Insertion vor dem Hüllprotein-ORF replizierte in Tabak wie Wildtyp-TMV. Es breitete sich systemisch aus und erzeugte schwache Mosaiksymptome in jungen Blättern. Hohe CAT-Aktivität war in inokulierten Blättern vorhanden. In systemisch infizierten Blättern konnte jedoch nur geringe bzw. keine Enzymaktivität nachgewiesen werden. Geringe Aktivität korrelierte mit einer Abnahme der Konzentration subgenomischer RNA in Northern-Blots. Nach längerer Infektion kam es zur Rekonstitution der Wildtyp-RNA. Letzteres wird auf homologe Rekombination an duplizierten Sequenzabschnitten zurückgeführt (subgenomischer Promotor).

Insertion des CAT-Gens unmittelbar vor dem 3′-Ende der Virus-RNA wirkte sich drastisch auf die Replikation dieses Hybrid-Virus in Pflanzen aus. Daraus resultierten schwache Symptomausprägung und geringe Expression des CAT-Gens.

In weiterführenden Arbeiten (Donson et al., 1991) wurde das zu insertierende Fremdgen (NPTII, DHFR) mit einem heterologen subgenomischen Promotor aus dem odontoglossum ringspot virus (ein Tobamo-Virus mit nur 45% Sequenzhomologie zum Ul-Stamm des TMV) gekoppelt. Auf diese Weise sollte die Häufigkeit der homologen Rekombination auf ein Minimum beschränkt werden. Die Chimären breiten sich systemisch in Tabakpflanzen aus. Die Replikation und schließlich die Ausbeute an Viruspartikeln entsprachen der beim TMV-Wildtyp. Auch nach mehreren Passagen in Nicotiana benthamiana blieb die insertierte Sequenz des DHFR-Gens erhalten. Klonale Populationen konnten sogar über 10 Passagen in einem Lokalläsionswirt ohne merkliche Veränderung der Sequenz vermehrt werden. Das größere NPTII-Insert war nicht so stabil. Nach 1-3 Passagen in einem systemischen Wirt wurden Teile des Inserts deletiert. In Western-Blots konnte nachgewiesen werden, daß weniger NPTII-Protein extrahierbar war als Hüllprotein.

Ähnliche Versuche wie am TMV wurden am potato virus X (PVX) vorgenommen (Chapman et al., 1992). Ein Fremdgen (GUS) ist zum einen gegen das Hüllprotein ausgetauscht und zum anderen zusätzlich in das Genom des PVX eingefügt worden. Austauschmutanten replizierten nach Elektroporation in Protoplasten schwächer als der Wildtyp. Die Northem-Analyse zeigte, daß auch weniger subgenomische RNA gebildet wurde. Inokulierte ganze Pflanzen blieben symptomlos und RNA-Nachkommenschaft konnte in solche Pflanzen nicht nachgewiesen werden. Konstrukte mit zusätzlichem GUS-Gen unter Kontrolle eines Duplikats des subgenomischen Promotors für das Hüllprotein replizierten in Protoplasten wie Genaustausch-Mutanten. Bei Inokulation ganzer Pflanzen kommt es jedoch zur Symptomausbildung und systemischer Ausbreitung. Hohe GUS-Aktivität wurde in inokulierten und nicht inokulierten Blättern gemessen. Wie bei adäquaten TMV-Mutanten (Dawson et al., 1989) zeigte die Northern-Analyse der sich systemisch ausbreitenden Chimären-Population, daß das GUS-Gen teilweise oder vollständig deletiert wurde. Die am häufigsten auftretende RNA-Population comigrierte mit Wildtyp-RNA, d. h. die Insertion wurde durch homologe Rekombination der duplizierten Sequenzen eliminiert.

Dolja et al., (1992) fügten das GUS-Gen als zusätzliche Sequenz in das tobacco etch virus (TEV) ein. Die Expressionsstrategie dieses Virus (Potyvirus) unterscheidet sich von allen bisher genutzten dadurch, daß von der genomischen RNA ein Polyprotein transliert wird, welches durch spezifische, kodierte Proteinase-Funktionen in funktionelle Proteine prozessiert wird. Die Art und Weise der GUS-Insertion führte zu einem Fusionsprotein, welches NH₂-terminal das GUS-Peptid und COOH-terminal eine viruskodierte Proteinase enthielt. Beide Proteine blieben trotz der Fusion biologisch aktiv. Das chimärische Virus breitete sich systemisch in Tabakpflanzen aus, erzeugte jedoch schwächere Symptome als das Wildtyp-Isolat. Hohe Enzymaktivität konnte in inokulierten und nichtinokulierten Blättern nachgewiesen werden. Die GUS-Sequenz blieb über mehrere Passagen (4-7) stabil. Häufige Passagen, führten letztlich jedoch zu teilweiser Deletion des GUS-Gens.

3. Vorteile und Probleme

Transiente Expressionssysteme auf der Basis von Virusgenomen, d. h. ohne Integration des gewünschten Fremdgens im pflanzlichen Genom, haben Vorteile gegenüber den üblichen stabilen Expressionsverfahren. Da es möglich ist mit hoher Effizienz Protoplasten, Zellkulturen oder intakte Pflanzen mit Virus-RNA-Transkripten bzw. Derivaten zu transfizieren, besteht ein Vorteil darin, daß teils langwierige teils schwierige Regenerationsverfahren umgangen werden können. Einige RNA-Viren (z. B. das TMV) haben zudem ein außerordentlich breites Wirtsspektrum, wodurch viele Pflanzenarten für derartige Manipulationen zugänglich sind. Im Falle der uneingeschränkten Ausbreitung der transfizierten Konstrukte können Pflanzen in jedem beliebigen Entwicklungsstadium eingesetzt und nach Erreichen des maximalen Expressionsniveaus des Fremdproteins geerntet werden.

Der wohl wesentlichste Vorteil solcher Systeme ist die theoretisch erzielbare Expressionshöhe. Nach Transfektion weniger Ausgangsmoleküle repliziert sich die RNA mit Hilfe der eigens kodierten Replikase und von Wirtskomponenten bis zu hoher Kopienzahl pro Zelle. Durch Nutzung von viralen subgenomischen Promotoren für die Initiation der Synthese von Fremdgen-mRNA entsteht eine große Anzahl von Matrizen für die Fremdproteinsynthese. Bei natürlichen Virusinfektionen ist meistens das Hüllprotein das am häufigsten synthetisierte Virusprotein. Es kann in Milligramm-Mengen aus einem Gramm Frischmasse isoliert werden. Gelingt es Fremdproteine mit ähnlicher Effizienz von Pflanzenzellen produzieren zu lassen, so liegt das Expressionsniveau um Größenordnungen über dem durch starke pflanzliche Promotoren erreichbare Niveau. Die Expression ist außerdem unabhängig von sogenannten Positionseffekten. Letzteres ist eine Erscheinung bei stabil im Genom integrierten Fremdgenen, die es erforderlich macht, viele unabhängige Transformanden zu erzeugen und zu testen, um schließlich solche mit hoher Fremdgenexpression auszuwählen.

Den beschriebenen Virussystemen zur Expression von Genen in Pflanzen sind noch eine Reihe von Problemen eigen, die eine Anwendung derzeit noch behindern. Erstens sind replizierte RNA-Virussysteme autonom. Gelangt die RNA in die Pflanzenzelle, kann die Replikation nicht mehr gesteuert werden. Zum einen ist dadurch gewebespezifische Expression ausgeschlossen. Das Fremdprotein entsteht dort, wo sich auch das Virus replizieren kann. Zum anderen wirft dies Sicherheitsbedenken auf. Denn zusammen mit leichter Übertragbarkeit der RNA (mechanisch) auf andere Pflanzen könnten solche Konstrukte außer Kontrolle geraten. Zweitens ist man, wie die Beispiele zeigen, auf intakte Virusgenome angewiesen, um eine maximale Expression in ganzen Pflanzen zu erreichen. Fehlen oder Behinderung einer Funktion ist mit absinkender Replikationsrate per se oder geringerer Expression durch inhibierte Ausbreitung verbunden. Deshalb ist es schwierig, einen geeigneten Insertionsort für Fremdsequenzen zu finden. Drittens wird darauf hingewiesen, daß RNA-Replikasen keine proof reading-Mechanismen besitzen, was nach wenigen Replikationszyklen zu Fehlern insbesondere im Insert führt, weil hier die Selektion fehlt. Viertens können durch Rekombination insbesondere an duplizierten viralen Sequenzen in relativ kurzer Zeit große Teile bzw. die gesamte insertierte Sequenz deletiert werden. Die Deletion des Inserts führt schnell zur Einstellung der Fremdproteinsynthese, weil die entstehenden RNA-Spezies besser replizieren und mit inserttragenden Formen effektiv konkurien.

Für einige dieser Probleme gibt es bereits Lösungen, die, wenn auch nicht in jedem Fall praktisch umgesetzt, in Übersicht von Ahlquist und Pacha (1990), Leiser (1990) und Joshi und Joshi (1991) theoretisch begründet werden.

Um Insertionsorte für Fremdgene zu schaffen, können viruskodierte Funktionen als chimärische Gene im Genom von Zielpflanzen stabil integriert und exprimiert werden. Aus Untersuchungen des Virustransports ist bekannt, daß in transgenen Pflanzen exprimierte Gene für Transportproteine Defekte im Virusgenom komplementieren (Deom et al., 1987; van Dun et al., 1988). Genaustausch-Mutanten von RNA-Viren, bei welchen ein Fremdgen gegen ein Transportprotein ausgetauscht wurde, könnten auf diese Weise komplementiert werden (Joshi und Joshi, 1991). So lassen sich "containment"-Bedingungen schaffen, da sich das fremdgentragende Viruskonstrukt nur in entsprechenden transgenen Pflanzen ausbreiten kann. Dieselbe Strategie wurde für Replikase-Gene (van Dun et al., 1988) und für Hüllprotein-Gene verfolgt.

Noch einen Schritt weiter gehen Überlegungen von Ahlquist und Pacha (1990) und Leiser (1990). Der Grundgedanke besteht darin, einerseits virale Geninformation für die Bildung der Replikase stabil in Pflanzen zu exprimieren und andererseits die mRNA, die für das interessierende Genprodukt kodiert, mit Erkennungssequenzen für die Virusreplikase auszustatten, so daß es zu der gewünschten mRNA-Amplifikation kommt. Prädestiniert für diesen Zweck scheinen RNA-Viren mit geteiltem Genom zu sein (BMV, BNYVV u. a.). Erstens wirken die Replikasen dieser Viren natürlicherweise in trans, d. h. sie amplifizieren nicht nur die RNA-Genome auf denen sie selbst kodiert sind sondern auch andere. Zweitens sind die regulatorischen Sequenzen für die Amplifikation größtenteils auf die unmittelbaren 5′- und 3′-Enden der zu amplifizierenden RNA beschränkt. Ein Fremdgen kann zwischen solche Bereiche eingefügt werden, wie für das BNYVV gezeigt wurde (Jupin et al., 1990). Bei der stabilen Integration solcher Konstrukte im Genom tauchen jedoch Schwierigkeiten auf, die damit zusammenhängen, daß primäre Transkripte mit exakten Enden auszustatten sind. Andernfalls werden diese RNA′s nicht von der Virusreplikase als Template akzeptiert (Leiser, 1990).

Beispiele

Aus cDNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge, die in der Summe teilweise überlappend die gesamte BWYV-Sequenz enthalten, wurde ein Klon voller Länge des Virus konstruiert (siehe Veidt et al., 1992). Der Klon ermöglichte die Synthese von (⁺)RNA unter Kontrolle des Bacteriophagen T7-RNA-Polymerase Promotors. Die in vitro Transkripte replizierten sich wie Virus-RNA nach Elektroporation in Protoplasten aus Chenopodium quinoa. Die Synthese des Hüllproteins wurden nachgewiesen.

Nach dem Überprüfen der biologischen Aktivität der in vitro Transkripte, wurde die cDNA am 5′-Ende mit dem 35S-Promotor des CaMV und am 3′-Ende mit dem nos- Polyadenylierungssignal verbunden. Zwischen dem 3′-Ende der Virussequenz und dem Polyadenylierungssignal wurde eine Ribozymsequenz eingefügt, die nach der Transkription autokatalytisch das exakte 3′-Ende der Virus-RNA kreiert (methodische Details siehe Leiser et al., 1992). Auf diese Weise entstand eine Expressionskassette, die es erlaubte, über Elektroporation oder Agroinokulation in Pflanzenzellen BWYV-RNA zu produzieren. Solche in vivo Transkripte replizierten genau wie Virus-RNA.

Nach Bestätigung der Identität und biologischen Aktivität (Leiser et al., 1992) bildete das Konstrukt in Abb. 1 den Ausgangspunkt für alle weiteren Modifikationen und Klonierungsschritte (GRN).

Beispiel 1

Um die Translation einzelner Leserahmen durch in vitro Mutagenese auszuschalten, wird ein Eco RV-Fragment und ein Bam HI-Fragment entsprechend in den Phagemiden pBluescript⁽⁺⁾ und pBS⁽⁺⁾ subkloniert (SK Eco RV; SK Bam HI). Als Wirtsstamm für alle Klonierungen dient der Bakterienstamm TG 1 (Amersham). Nach Bestimmung der Orientierung der subklonierten Fragmente durch Restriktionsanalyse wird über Infektion der phagemidtragenden Bakterien mit dem Helferphagen K07 die Synthese einzelsträngiger DNA induziert. Die einzelsträngige DNA enthält die "sense"-Stränge der subklonierten DNA-Fragmente. Nach Reinigung der einzelsträngigen DNA werden in vitro Mutagenesen mit spezifischen Oligonukleotiden durchgeführt. Grundlage bilden ein Kit der Firma Amersham und die enthaltenen Vorschriften.

Die Sequenz des Eco RV-Fragments im Bereich des Startkodons des ORF I wird durch die Mutagenese so geändert, daß anstelle des AUG-Kodons der Restriktionsort Sna BI entsteht (siehe Abb . 2 (A). Die Zerstörung des Startkodons soll bewirken, daß dieser Leserahmen nicht mehr in das entsprechende Virusprotein unbekannter Funktion translatiert werden kann. Nach der Mutagenese, bei der am Ende wiederum doppelsträngige Phagemid-DNA entsteht, wird das mutierte Eco RV-Fragment gegen das Originalfragment im Ausgangsklon ersetzt.

Beim Bam HI-Fragment wird durch in vito Mutagenese das Startkodon des Leserahmens IV, der für das Hüllprotein kodiert, zerstört (SK BamHI MUTA). Dabei wird ein Xho I Restriktionsort geschaffen, der später als Insertionsort für Fremdgene zur Verfügung steht. Das verwendete Oligonukleotid und die dazugehörige Originalsequenz des Virus sind in Abb. 2 (B) aufgeführt.

Abb. 2

Originalsequenz des antisense-Strangs der Virus-cDNA um das ATG-Kodon von ORF I (A.I.) und von ORF IV (B.I.) und die Sequenz der zur Mutagenese verwendeten Oligonukleotide (A.II. und B.II.)

Das Bam HI-Fragment mit der Mutation wird so gegen das originale Bam HI-Fragment im Klon MUTA ORF I ausgetauscht, daß neben der Mutation im Bereich des AUG des ORF IV keine weiteren Sequenzveränderungen auftreten (MUTA ORF I + IV). Der entstandene Klon dient als Matrize für die Synthese von RNA-Molekülen, die sich anschließend in Zellen durch die kodierte RNA-abhängige RNA-Polymerase-Funktion replizieren. Auf dem Konstrukt sind alle für die Replikation erforderlichen Funktionen enthalten. Es kann einerseits zur Komplementation anderer Konstrukte, auf denen Replikationsfunktionen fehlen, eingesetzt werden oder andererseits als Vektor für fremde Sequenzen dienen, die in die durch Mutagenese entstandenen Restriktionsorte einligiert werden.

Die Konstrukte sind durch Elektroporation in intakte Zellen transfizierbar. Ihre Replikation wird in Northern-Experimenten durch Hybridisierung mit virusspezifischen Sonden verfolgt.

Beispiel 2

In das DNA-Konstrukt MUTA ORF I + IV wird das Gen für das screenbare Markerenzym β-Glukuronidase (GUS) eingefügt. Dazu wird zunächst die kodierende Sequenz des Gens ohne Promotor und Polyadenylierungssignal über eine Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Als Grundlage für die Amplifikation dient ein Plasmid (z. B. pRT103 GUS), das das GUS-Gen enthält. Es werden Oligonukleotide benutzt, die neben der spezifischen GUS-Sequenz am 5′-Ende einen Xho I- (Oligonukleotid 1) bzw. einen Bam HI-Schnittort (Oligonukleotid 2) besitzen. Nach der Amplifikation werden die Nukleinsäurefragmente der entsprechenden Größe gereinigt und mit den Restriktionsenzymen Xho I und Bam HI geschnitten, um kompatible überhängende Enden zu kreieren. Das so vorbereitete Fragment wird dann über mehrere Klonierungsschritte gegen einen Abschnitt der Virussequenz im Konstrukt MUTA ORF I + IV ausgetauscht, der von dem durch Mutagenese eingefügten Xho I-Ort bis zum nächsten stromabwärts gelegenen Bam HI-Ort (am Ende des Hüllproteingens) reicht. Das GUS-Gen befindet sich in dem als GRN-GUS bezeichneten Klon anstelle des Hüllproteins und wird durch den viralen, subgenomischen Promotor kontrolliert. Während der Replikation wird von der genomischen RNA subgenomische RNA synthetisiert an deren 5′-Ende sich die kodierende Region des GUS-Gens befindet.

Das Konstrukt GRN-GUS wird als DNA in Protoplasten elektroporiert oder mit Hilfe einer Partikel-Kanone in Zellen intakter Gewebe (z. B. Pflanzenblätter) eingebracht. In den Zellen erfolgt die transiente Expression. Eines der translatierten Produkte ist das GUS-Enzym. Die Enzymaktivität, die chemisch bzw. histochemisch leicht zu bestimmen ist, ist proportional zur Menge des synthetisierten Enzyms. Auf diese Weise wird das relative Expressionsniveau im Vergleich zu einem GUS-Gen ermittelt, welches direkt unter Kontrolle eines 35S-Promotors gestellt ist und in Parallelversuchen ebenfalls als DNA in Zellen eingebracht wird. Die Ergebnisse geben Aufschluß über das durch RNA-Amplifikation erreichte Expressionsniveau.

Beispiel 3

In das Konstrukt MUTA ORF I + IV wird die kodierende Sequenz für ein 2S-Samenspeicherprotein-Gen aus Bertholetia excelsa eingefügt. Die kodierende Sequenz des Gens wird dazu in einem Vektor (z. B. pBluescript KS^±) kloniert und nach Vermehrung in Bakterien und Plasmidpräparation mit den Restriktionsenzymen Xho I und Bam HI herausgeschnitten. Das entstehende Fragment wird gereinigt und in mehreren Schritten in das DNA-Konstrukt MUTA ORF I + IV so kloniert, daß die kodierende Sequenz einschließlich eigener Start- und Terminatorkodone das Hüllproteingen des BWYV ersetzt. Dabei wird der durch Mutagenese geschaffene Xho I-Ort und ein Bam HI-Ort der Virus cDNA stromabwärts am Ende des Hüllproteingens genutzt. Das Samenspeicherprotein-Gen in dem als GRN-BNG bezeichneten Klon wird durch den viralen, subgenomischen Promotor kontrolliert. Während der Replikation wird von der genomischen RNA subgenomische RNA synthetisiert an deren 5′-Ende sich die kodierende Region des Samenspeicherprotein-Gens befindet.

Das Konstrukt GRN-BNG wird als DNA in Protoplasten elektroporiert und in den Zellen transient exprimiert. Die Amplifikation der RNA und die Bildung subgenomischer RNA durch die Virusreplikase, die auf dem Konstrukt kodiert ist, kann in Northern-Experimenten mit virusspezifischen oder Samenspeicherprotein-Gen-spezifischen Sonden verfolgt werden. Die subgenomische RNA, auf deren 5′-terminalen Teil das Samenspeicherprotein kodiert ist, ist translationsaktiv. Es entsteht in den Protoplasten ein Proteinprodukt, welches serologisch mit Antikörpern gegen das natürliche Protein nachweisbar ist.

Beispiel 4

Zur Herstellung von spezifischen Antikörpern in pflanzlichen Protoplasten oder Zellkulturen wird ein chimäres Gen, das für einen Einzelketten-Antikörper kodiert, in einem Plasmidvektor kloniert. Das klonierte Fragment ist ein intakter Leserahmen mit eigenen Start- und Stopkodons. Ein derartiger künstlicher Antikörper besteht nicht aus Peptiduntereinheiten (den leichten und schweren Ketten), und muß nach der Synthese nicht prozessiert werden. Die Translation eines offenen Leserahmens ist ausreichend. Die Klonierung des Antikörpergens wird so gestaltet, daß wie im Falle des GUS-Gens (Beispiel 2) und des Samenspeicherprotein-Gens (Beispiel 3) die kodierende Region mit den Restriktionsendonukleasen Xho I und Bam HI aus dem Vektor herausgeschnitten werden kann. Alternativ dazu können Restriktionsorte verwendet werden, die durch die Restriktasen glatt geschnitten werden (z. B. Eco RV oder Sma I). Letzteres ist dann vorzuziehen, wenn das Antikörpergen interne Schnittorte für Xho I und/oder Bam HI besitzt. Nach Reinigung des Nukleinsäurefragments, auf welchem sich das Gen befindet, wird es anstelle des Hüllproteingens in das Viruskonstrukt MUTA ORF I + IV einligiert. Dazu wird der durch Mutagenese geschaffene Xho I-Schnittort und der Bam HI-Ort am Ende des Hüllproteingens genutzt. Bei dem als GRN-AB bezeichneten Klon befindet sich das Antikörpergen unter Kontrolle des subgenomischen Promotors für das Virushüllprotein-Gen. Nach Transfektion der DNA in Protoplasten oder Zellkulturen (z. B. durch Elektroporation bzw. durch Beschluß mit DNA-geladenen Wolframpartikeln) wird gesteuert durch einen entsprechenden Promotor RNA transkribiert. Auf der RNA sind alle für die Replikation wichtigen Funktionen kodiert, so daß die RNA repliziert wird. Während der Replikation wird subgenomische RNA gebildet, von welcher der Leserahmen für den Antikörper translatiert wird. Der produzierte Antikörper wird affinitätschromatographisch gereinigt.

Beispiel 5

Zur Expression von Fremdgenen innerhalb der Virus-cDNA in transgenen Pflanzen werden Konstrukte aus den Beispielen 1 bis 4 (unter Kontrolle des 35S-Promotors) verwendet. Alternativ sind andere Konstrukte zu erstellen, bei denen die Bildung der Primärtranskripte durch einen gewebespezifischen (z. B. samenspezifischen) Promotor reguliert wird. Bei der Erstellung solcher Konstrukte ist darauf zu achten, daß das erste Nukleotid des Transkripts dem ersten Nukleotid der Virus-RNA entspricht. Extranukleotide beeinträchtigen die folgende Replikation der RNA und werden durch Oligonukleotid-gerichtete in vitro Mutagenese entfernt.

Am 5′-Ende des in Pflanzen aktiven Promotors und am 3′-Ende des nos-Polyadenylierungssignal befinden sich Restriktionsorte die in der internen Sequenz nicht vorkommen (entsprechend Kpn I und Sal I). Das chimäre Konstrukt "pflanzlicher Promotor → mutierte Virus-cDNA einschließlich des zu exprimierenden Gens hinter dem subgenomischen Viruspromotor → Ribozym → nos-Polyadenylierungssignal" wird mit entsprechenden Restriktionsenzymen aus dem Klonierungsvektor herausgeschnitten und das entstehende Fragment in einen Binärvektor umkloniert (z. B. pBIN 19). Der Binärvektor wird dazu vorher im Polylinker mit denselben Restriktionsendonukleasen linearisiert, um kompatible Enden für die Ligation mit dem zu klonierenden chimären Konstrukt zu schaffen. Mit Binärvektor-Klonen, die das chimäre Konstrukt zwischen rechter und linker T-DNA-Bordersequenz enthalten, werden Agrobakterien durch Elektroporation transformiert. Die verwendeten Agrobakterienstämme (A. tumefaciens 2260 oder EHA 101 für die Transformation von Tabak und EHA 101 für die Transformation von Vicia narbonensis) enthalten ein residentes Plasmid auf dem die Virulenz-Funktionen enthalten sind. Nach Selektion der Agrobakterienkolonien, die das Binärvektorkonstrukt enthalten, werden mit den Bakteriensuspensionen Pflanzenzellen transformiert. Zur Transformation von Tabak (N. tabacum cv. Samsun) wird die Blattscheiben-Methode verwendet (siehe Horsch et al., 1985). Die Transformation von Vicia narbonensis erfolgt nach einer Methode von Pickert et al. ( ). Nach der Transformation werden transgene Gewebe, Sprosse und regenerierte Pflanzen mit Kanamycin im Medium selektiert. Ein entsprechendes Resistenzgen befindet sich zwischen den T-DNA-Bordern im Binärvektor pBIN19 und wird bei der Transformation zusammen mit dem chimären Konstrukt im Genom der Pflanzen integriert.

In Abhängigkeit vom verwendeten Promotor wird RNA von im Genom integrierten Konstrukten im Blattgewebe (35S-Promotor) oder im Samen (z. B. Phaseolin-Promotor) transkribiert. Durch die korrekte Verbindung zwischen Promotor und Virus-cDNA beginnt die Transkription genau am 5′-Ende der Virus-Sequenz. Die integrierte Ribozymsequenz kreiert auf autokatalytischem Wege ein 3′-Ende, das dem der Virus-RNA entspricht. Von solchen Transkripten werden zunächst die Leserahmen für die Replikase translatiert. Das synthetisierte Enzym beginnt dann zusammen mit Wirtsfaktoren die RNA zu replizieren. Es entstehen minus-Strang Intermedieate, die wiederum als Matrizen für neue plus-Stränge dienen. Von der RNA mit minus-Polarität wird auch subgenomische RNA gebildet, auf der sich das zu exprimierende Fremdgen befindet. Die Expression des Fremdgens im Blatt oder im Samen kann auf RNA-Ebene (in Northern-Blots) oder auf Protein-Ebene (serologisch in Western-Blots oder durch Bestimmung der Enzymaktivität des zu exprimierenden Proteins) nachgewiesen werden.

Claims

1. Ein Verfahren zur Expressionssteigerung von Transgenen, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine spezifische Nukleotidsequenz, nachfolgend Sequenz genannt, nach Einbau in das Vektorkonstrukt in den vorzugsweise eukaryotischen Rezipientenorganismus transferiert und mindestens ein Teil dieser Sequenz transkribiert wird, wobei die entstehenden Transkripte durch ein RNA-Replikationssystem vorzugsweise phytoviralen Ursprungs amplifiziert werden.

2. Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz in das Kern- oder Organellengenom des Rezipienten integriert wird oder ohne Integration persistiert und dadurch nur transient exprimiert wird.

3. Ein Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkription von transferierten Sequenzen in der Rezipientenzelle durch einen konstitutiven oder regulierbaren Promotor, vorzugsweise einen gewebe- oder ontogenesespezifischen Promotor, gesteuert wird.

4. Ein Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die betreffende Sequenz in ein Vektorkonstrukt eingebaut ist, das unter anderem für mindestens einen Teil der für die Amplifikation des Transkripts notwendigen Virusreplikase kodiert, oder daß die Virusreplikase oder ein Teil von ihr von Sequenzen exprimiert wird, die im Kern- oder Organellengenom des Rezipienten integriert sind, oder daß virusreplikasekodierende Gene episomal persistieren oder durch natürliche oder künstliche Infektion oder durch Cotransformation mit mindestens einem weiteren Vektorsystem zugeführt werden.

5. Ein Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Rezipienten eukaryotische Organismen, insbesondere Pflanzen, insbesondere Gefäßpflanzen, oder Gewebe oder Zellen von diesen dienen.

6. Ein Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der betreffenden Sequenz um ein proteinkodierendes Gen oder/und um eine nichtproteinkodierende Sequenz handelt, insbesondere solche, die für antisense RNA, Ribozyme, Competitorsequenzen oder Pseudoknots kodieren, wobei die betreffende Sequenz bezüglich des Rezipienten entweder homologer oder heterologer Herkunft sein kann.

7. Ein Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verselbständigung, d. h. unkontrollierte Ausbreitung der Transkripte ausgeschlossen wird, indem mindestens eine, für die Ausbreitung innerhalb eines mehrzelligen Wirtsorganismus oder zwischen verschiedenen Wirtsorganismen essentielle, viruskodierte Funktion auf dem verwendeten Konstrukt durch vorzugsweise in-vitro-Mutagenese oder Deletion inaktiviert wird.

8. Ein Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das virale RNA-Amplifikationssystem von dem Genom eines RNA-Pflanzenvirus, vorzugsweise von dem Genom eines RNA- Pflanzenvirus mit Plus-Polarität abgeleitet wird.

9. Ein Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das virale RNA- Amplifikationssystem von dem Genom eines Luteovirus oder eines taxonomisch der Luteovirusgruppe nahestehenden Virus abgeleitet wird, insbesondere von dem Genom des beet western yellows virus oder beet mild yellowing virus oder potato leaf roll virus oder barley yellow dwarf virus oder bean leaf roll virus oder pea enation mosaic virus oder parsnip yellow fleck virus oder anthriscus yellows virus oder carrot red leaf virus oder soybean dwarf virus oder groundnut rosette assistor virus oder cucurbit aphid-borne yellows virus oder einer Kombination davon.

10. Ein Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression des betreffenden Transgens im Verlauf der RNA-Amplifikation so erfolgt, daß die betreffende Sequenz entweder zumindest einem Teil der primär transkribierten Sequenz oder ihrem Komplementärstrang entspricht oder, daß der Expression der betreffenden Sequenz die Bildung einer entsprechenden subgenomischen RNA vorausgeht.

11. Vektorkonstrukte zur Verwendung in einem Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest einen vorzugsweise eukaryotischen Promotor enthalten, der die Transkription der transferierten Sequenz in der Rezipientenzelle steuert und daß sie Erkennungs- und Regulationssequenzen besitzen, die für die Interaktion zwischen dem bei der Transkription entstehenden RNA-Produkt und der Virusreplikase notwendig sind, und daß sie mindestens einen geeigneten Ort zur Insertion der betreffenden Sequenz enthalten.

12. Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Promotor um einen konstitutiven oder regulierbaren Promotor, im zweiten Falle vorzugsweise um einen gewebe- oder ontogenesespezifischen Promotor handelt.

13. Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Promotor von der Sequenz eines caullimovirus abgeleitet wurde, vorzugsweise von der des 35S-Promotors des caulliflower mosaic virus.

14. Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Promotor um einen samenspezifischen Promotor, vorzugsweise Phaseolin-, Legumin-, oder USP-Promotor handelt.

15. Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen Promotor handelt, der durch eine Infektion oder durch Induktoren aktiver Prozesse der Krankheitsabwehr eingeschaltet werden kann, vorzugsweise um einen PR-Proteinpromotor.

16. Vektorkonstrukte gemäß mindestens einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich für mindestens einen Teil von Proteinen kodieren, die für die RNA-Replikation in der Rezipientenzelle notwendig oder förderlich sind, wobei es sich vorzugsweise um zumindest einen Bestandteil des Replikasekomplexes handelt.

17. Vektorkonstrukte gemäß mindestens einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Teile des viralen RNA-Amplifikationssystems, die durch das Vektorkonstrukt beigesteuert werden, von dem Genom eines RNA- Pflanzenvirus, vorzugsweise von dem Genom eines RNA-Pflanzenvirus mit Plus- Polarität abgeleitet werden.

18. Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das virale RNA-Amplifikationssystem von dem Genom eines Luteovirus oder eines taxonomisch der Luteovirusgruppe nahestehenden Virus abgeleitet wird, insbesondere von dem Genom des beet western yellows virus oder beet mild yellowing virus oder potato leaf roll virus oder barley yellow dwarf virus oder bean leaf roll virus oder pea enation mosaic virus oder parsnip yellow fleck virus oder anthriscus yellows virus oder carrot red leaf virus oder soybean dwarf virus oder groundnut rosett assistor virus oder cucurbit aphid-borne yellows virus.

19. Vektorkonstrukte gemäß mindestens einem der Ansprüche 11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertion der betreffenden Sequenz so erfolgt, daß sich ihre Kodierung auf zumindest einem Teil der primär transkribierten Sequenz oder deren Komplementärstrang befindet oder, daß ihre Expression durch einen viralen subgenomischen Promotor gesteuert wird.

20. Vektorkonstrukte gemäß mindestens einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine, für die Ausbreitung innerhalb eines mehrzelligen Wirtsorganismus oder zwischen verschiedenen Wirtsorganismen essentielle, viruskodierte Funktion inaktiviert wird, wodurch eine Verselbständigung, d. h. unkontrollierte Ausbreitung der Transkripte, ausgeschlossen wird.

21. Vektorkonstrukte zur Verwendung in einem Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest einen vorzugsweise eukaryotischen Promotor enthalten, der die Transkription der transferierten Sequenz in der Rezipientenzelle steuert, und daß sie für mindestens eines der Proteine kodieren, die für die RNA-Replikation in der Rezipientenzelle notwendig oder förderlich sind, wobei es sich vorzugsweise um zumindest einen Bestandteil des Replikasekomplexes handelt.

22. Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Promotor um einen konstitutiven oder regulierbaren Promotor, im zweiten Falle vorzugsweise um einen gewebe- oder ontogenesespezifischen Promotor handelt.

23. Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Promotor um einen Promotor eines caulimovirus, vorzugsweise um den 35S- Promotor des cauliflower mosaic virus handelt.

24. Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Promotor um einen samenspezifischen Promotor, vorzugsweise Phaseolin-, Legumin-, oder USP-Promotor handelt.

25. Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Promotor um einen Promotor handelt, der durch eine Infektion oder durch Induktoren aktiver Prozesse der Krankheitsabwehr, vorzugsweise Resistenzinduktoren, eingeschaltet werden kann, vorzugsweise PR-Protein- Induktoren.

26. Vektorkonstrukte gemäß mindestens einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Teile des viralen RNA-Amplifikationssystems, die durch das Vektorkonstrukt beigesteuert werden, von dem Genom eines RNA- Pflanzenvirus, vorzugsweise von dem Genom eines RNA-Pflanzenvirus mit Plus- Polarität abgeleitet werden.

27. Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das virale RNA-Amplifikationssystem von dem Genom eines Luteovirus oder eines taxonomisch der Luteovirusgruppe nahestehenden Virus abgeleitet wird, insbesondere von dem Genom des beet western yellows virus oder beet mild yellowing virus oder potato leaf roll virus oder barley yellow dwarf virus oder bean leaf roll virus oder pea enation mosaic virus oder parsnip yellow fleck virus oder anthriscus yellows virus oder carrot red leaf virus oder soybean dwarf virus oder groundnut rosett assistor virus oder cucurbit aphid-borne yellows virus oder einer Kombination davon.

28. Vektorkonstrukte gemäß mindestens einem der Ansprüche 21 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertion der betreffenden Sequenz so erfolgt, daß sich ihre Kodierung auf entweder zumindest einem Teil der primär transkribierten Sequenz oder deren Komplementärstrang befindet oder, daß ihre Expression durch einen viralen subgenomischen Promotor gesteuert wird.

29. Vektorkonstrukte gemäß mindestens einem der Ansprüche 21 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine, für die Ausbreitung innerhalb eines mehrzelligen Wirtsorganismus oder zwischen verschiedenen Wirtsorganismen essentielle, viruskodierte Funktion inaktiviert wird, wodurch eine Verselbständigung, d. h. unkontrollierte Ausbreitung der Transkripte ausgeschlossen wird.

30. Verwendung des Verfahrens und der Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 1 und mindestens einem der Ansprüche 2 bis 30, um eukaryotische Organismen, vorzugsweise Gefäßpflanzen, oder Gewebe oder Zellen von diesen, mit veränderten Eigenschaften zu erzeugen, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest Teile der auf einem der Vektorkonstrukte gemäß mindestens einem der Ansprüche 21 bis 29 kodierten Funktionen exprimieren.

31. Verwendung des Verfahrens und der Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 1 und mindestens einem der Ansprüche 2 bis 30 zur Expressionssteigerung von Transgenen, um bestimmte Eigenschaften des Rezipienten im Sinne seiner "Verbesserung" zielgerichtet zu verändern oder um den Rezipienten zur Herstellung fremder Produkte auszunutzen.

32. Verwendung des Verfahrens und der Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 31, um die Qualität von Samenspeicherproteinen zu verbessern, indem man vorzugsweise die Aminosäurezusammensetzung des Gesamtsamenproteins verändert durch die Hochexpression von in der kodierenden Sequenz veränderten oder heterologen Samenproteingenen in transgenen Pflanzen.

33. Verwendung des Verfahrens und der Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 31, um die Widerstandsfähigkeit von Pflanzen gegenüber biotischen Schadfaktoren zu erhöhen durch Hochexpression von vorzugsweise Resistenzgenen oder pathogenabgeleiteten Sequenzen.

34. Verwendung des Verfahrens und der Vektorkonstrukte gemäß Anspruch 31, um in eukaryotische Organismen, vorzugsweise Gefäßpflanzen, oder Geweben oder Zellen von diesen wirtschaftlich interessante proteinogene Produkte herzustellen, vorzugsweise pharmakologisch relevante Proteine.