DE60132473T2

DE60132473T2 - Auf viren basierende amplifikationsvektoren für pflanzen

Info

Publication number: DE60132473T2
Application number: DE60132473T
Authority: DE
Inventors: Yuri Gleba; Yurii Dorokov; Peter Moscow Ivanov; Joseph Atabekov
Original assignee: Icon Genetics AG
Current assignee: Icon Genetics AG
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2001-10-08
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2021-10-09
Also published as: WO2002029068A2; EP1325142B1; US20040055037A1; WO2002029068A3; JP4477824B2; US7763458B2; EP1325142A2; DE10049587A1; JP2004510438A; CA2421306A1; AU1400302A; ATE384132T1; MXPA03002186A; DE60132473D1; AU2002214003B2

Description

ALLGEMEINES GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens in einer Pflanze oder in Pflanzenzellen, insbesondere zur Expression eines pharmzeutischen Proteins oder zur Expression zweier oder mehrerer Gene in derselben Pflanze oder Pflanzenzelle.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Vektoren, die zur gentechnologischen Veränderung von Pflanzen verwendet werden, eignen sich ausgezeichnet zur Produktion von Proteinen in Pflanzen, zur Ausstattung einer Pflanze mit einem neuen Merkmal und zur Unterdrückung (Suppression) von Genen der Wirtspflanze. Darüber hinaus ist die Bestimmung von Genfunktionen möglich. Das gilt insbesondere für Gene, die mit Hilfe der Methoden der Genomforschung (Genomics) identifiziert wurden.
Vektoren, die zur gentechnologischen Veränderung von Pflanzen verwendet werden können, sind seit längerem bekannt. Dazu gehören insbesondere virale Vektoren. Diese müssen zur Infizierung, Amplifikation und zur Ausbreitung (sowie von Zelle zu Zelle also auch über lange Distanzen (long distant movement)) befähigt sein. Die Viren müssen zudem mindestens eine Sequenz zur Genexpression oder zur Gensuppression besitzen. Bereits vorhandene Vektoren basieren auf der Verwendung subgenomischer Promotoren als Elemente der Transkription. Der Effekt eines subgenomischen Promotors besteht darin, dass ein Teil von ihm als Startpunkt der Transkription die Generierung kürzerer RNA bewirkt, so dass die Translation eines Gens, das sich abwärts (downstream) des Promotors befindet, durch die pflanzliche Tranlationsmaschinerie ermöglicht wird. Die Translation kann CAP-abhängig fortgesetzt werden. Diese Art der multiplen Transkription ist allerdings kinetisch unvorteilhaft, da ein Teil der Replikaseaktivität verschwendet wird.
Solche Vektoren haben weitere Nachteile. Durch die Einführung eines subgenomischen viralen Promotors in eine Vektorsequenz wird diese verlängert, was zu einer Verringerung der Effizienz führt. Darüber hinaus führt die Anwesenheit mehrerer identischer oder ähnlicher subgenomischer Promotoren, die dem pflanzlichen Transkriptionsysstem angepaßt sind, häufig zu Rekombinationsereignissen und zu Sequenzinstabilität und zum Verlust von Sequenzbereichen. Die Verwendung von Promotoren, die sich in ihrer Sequenz signifikant unterscheiden, führt zu einer Verringerung der Rekombinationshäufigkeit. Indes werden solche Promotoren nicht effektiv vom Transkriptionssystem erkannt, was ebenfalls die Effizienz des Systems verringert. Zudem sind (diese) Vektoren im allgemeinen hochintegrierte Einheiten, die mehrere unabhängige Funktionselemente sowie eine hohe Gendichte aufweisen. Aufgrund dessen ist die Verwendung (dieser) Vektoren bei Benutzung heterologer Gene oder ähnlicher Sequenzen idiosynkratisch und führt regelmäßig zu unerwünschten Resultaten. Dies machte sich sowohl bei der Fähigkeit zur Pflanzeninfektion als auch bei der Effizienz der Genexpression bemerkbar. Darüberhinaus ist der verfügbare Sequenzraum für die Promotoren üblicherweise beschränkt, wenn Sequenzüberlappungen mit weiter aufwärts (upstream) gelegenen Genen vorliegen.
Deshalb ist es eine Aufgabe der Erfindung, einen Vektor zur gentechnologischen Manipulation von Pflanzen bereitzustellen, der seine Funktionen in Wirtspflanzen stabil und effektiv ausüben kann. Ein weiteres Ziel besteht darin, einen Vektor zur Verfügung zu stellen, der zur hohen Expression eines Gens in einer Pflanze in der Lage ist.
Entgegen den Erwartungen konnten diese Ziele gemäß Patentanspruch 1 gelöst werden.
Es wurde kürzlich vorgeschlagen ( WO 98/54342 ), ein Pflanzen-IRES-Element in einen rekombinanten DNA-Molekül zu verwenden, das (nach Integration in das Wirtsgenom) lediglich die Funktion der Genexpression ausübt. Die Expressionshöhe erwies sich jedoch als gering. Die genauen Gründe für diese niedrige Expression sind unklar. Auf jeden Fall ist die Expression auf die Zahl der transformierten Zellen beschränkt. Daraus folgt eine extrem geringe Expressionseffizienz in der gesamten Pflanze.
Entgegen den Erwartungen konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, einen Pflanzenvektor zu konstruieren, der nach Einführung in eine Pflanzenzelle nicht nur die Fähigkeit der Genexpression besitzt, sondern auch noch andere Fähigkeiten voreint, die zur Amplifikation sowie zur Ausbreitung des Virus in der Pflanze benötigt werden, so dass die resultierende Gesamteffizienz extrem hoch ist. Die Funktionen beinhalten die Infektion, Amplifikation und die Bewegung von Zelle zu Zelle und über eine größere Entfernung (long distance movement). Es ist erstaunlich, dass die große Integration der funktionalen und strukturellen Elemente des Vektors dessen Genexpression nicht beeinflusst.
Das IRES-Element des genannten Vektors liegt aufwärts (upstream) des zu exprimierenden nichtviralen Gens liegen, um dessen Translation direkt zu beeinflussen. Ferner kann das IRES-Element indirekt die Translation des Gens unterstützen, indem direkt die Translation eines anderen Gens unterstützt wird, das für die Funktion des Vektors wichtig ist, ausgewählt aus Infektion, Amplifikation, Virusassemblierung, Fähigkeit das Silencing (Unterdrücken) der Entwicklung einer viralen Infektion zu unterdrücken, Fähigkeit, den Metabolismus in Pflanzenzellen zu ändern, und Fortbewegung von Zelle zu Zelle oder über eine große Distanz (long distance movement). Ferner kann der Vektor mindestens einen Teil der Sequenzen des Wirtspflanzengenoms enthalten in anti-sense Orientierung, um ein Gen der Wirtspflanze zu unterdrücken.
Ein weiteres Ziel besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, das in der Lage ist, ein Gen in einer Pflanze effektiv zu inaktivieren (supprimieren). Dies kann durch das Verfahren von Anspruch 4 erreicht werden. Weitere bevorzugte Eigenschaften sind in den Unteranträgen/Ansprüchen definiert.
Hier werden erstmals Expressions- und Amplifikationsvektoren beschrieben, die auf IRES-Elementen beruhen, welche in Pflanzen aktiv sind. Bereits bekannte IRES-Elemente, die aus tierischen Viren isoliert wurden, unterstützen die Translation in Pflanzenzellen nicht. Das Wissen, das über tierische Expressionssysteme angesammelt wurde, kann somit nicht auf Pflanzen übertragen werden. Tierische IKES-Sequenzen wurden nie auf funktionale Eigenschaften wie verbliebene/überschüssige Promotoraktivität getestet. Diese Erfindung beschreibt somit die ersten Fälle für die Genexpression in Pflanzen, die ausschließlich auf der Translation beruhen anstatt auf der Transkription ausgehend von einem subgenomischen Promotor, welcher für die Expression eines abwärts (downstream) gelegenen Gens nötig ist.
Die Vektoren dieser Erfindung erlauben in Pflanzen bevorzugt die Regulation und die Expression eines gewünschten Gens, wobei die CAP-abhängige Translation unterdrückt wird. In einer anderen Ausführungsform werden sehr kurze oder künstliche IRES-Sequenzen verwendet, wobei die Stabilität der resultierenden Vektoren weiter erhöht wird.
Ein Vorteil dieser Strategie besteht darin, dass die IRES-Sequenzen abwärts (downstream) von einem viralen Gen bzw. von viralen Genen (z. B. des Gens für das Hüllprotein des Tabakmosaikvirus) inseriert werden können. Daher kann die Translation eines abwärts (downstream) gelegenen Fremd-gens (oder mehrerer Fremdgene) über einen Reaktionsweg verlaufen, der durch einen CAP-unabhängigen Eintritt der Ribosomen eingeleitet wird. Daher wird die CAP-unabhängige Translation eines Fremdgens (oder von Fremdgenen) von bicistronischen und/oder polycistronischen RNAs ausgehen.
ALLGEMEINE PROBLEME UND DEFINITIONEN
Im Anschluß an die Infektion einer Pflanze mit einem Virus kommt es zunächst zu den frühen Stadien der viralen Infektion (Eintritt des Virus in die Zelle und die Enthüllung des Genoms). Anschließend muß der Virus Aktivitäten entwickeln, die ihn zur Expression des Genoms sowie zur Replikation befähigen. Das virale Genom kann aus einem (monopartite) oder mehreren (multipartite) RNA- oder DNA-Segment(en) bestehen. Jedes dieser Segmente kann unter bestimmten Voraus-setzungen zur Replikation in der infizierten Zelle fähig sein. Ein virales Replikon wurde als „Polynucleotid einer viralen Sequenz, die in Wirtszellen während des viralen Replikationszyklus repliziert wird" definiert (Huisman et al., 1992, „Genetic engineering with Plant viruses", T.M.A. Wilson und J.W. Davies Hrsg., 1992, CRC Press, Inc.). Im Rahmen dieser Erfindung verwenden wir den Terminus amplifikationsbasiertes Expressionssystem (amplification based expression system), um entweder ein vollständiges virales Genom oder ein Fragment der viralen RNA oder DNA zu bezeichnen, das folgende Eigenschaften besitzt: zum einen muß es Fremd-sequenzen besitzen, die für den parentalen Wildtyp-Virus nicht nativ sind und die exprimiert werden können. Zum anderen muß es in der Lage sein, sich eigenständig oder über eine Komplementation mit einem Helfervirus oder einem Produkt der transgenen Wirtspflanze zu replizieren. Die Termini „amplifikationsbasiertes Expressionssystem" (amplification-based-expression-system) und „rekombinanter viraler Vektor" sind sehr ähnlich. Diese Systeme repräsentieren eine rekombinante Nukleinsäure, die zusätzliche Sequenzen enthält. Diese können im Verhältnis zum Wirtsgenom homolog (nativ) oder heterolog (nicht nativ) sein. Die Bezeichnung „nicht-nativ" bedeutet, dass diese Nukleinsäure nicht natürlicherweise im Genom des Wildtypvirus vorhanden ist, sondern von einem andern Virus abstammt oder eine synthetisch hergestellte Nukleinsäure ist. Ein solches amplifikationsbasiertes System, das von viralen Elementen abstammt, ist zur Replikation fähig. In vielen Fällen ist es zudem in der Lage, sich in normalen und/oder gentechnologisch modifizierten Pflanzen von einer Zelle zu einer anderen oder über eine größere Distanz (long distance movement) zu bewegen. In letzterem Fall sollte die transgene Pflanze fehlende Komponenten des Vektors komplementieren. Das Produkt bzw. die Produkte eines Transgens, das bzw. die zur Vektorreplikation und/oder der Expression von Vektorgenen oder zum Transport über größere Distanzen nötig ist bzw. sind, sollte somit von der transgenen Pflanze zur Verfügung gestellt werden. Weitere Beispiele von Funktionen die von der Pflanze bereitgestellt werden können sind: Amplifikation des Vektors, Virusassemblierung, Fähigkeit das Silencing (Unterdrücken) der Entwicklung einer viralen Infektion in Pflanzenzellen zu unterdrücken, Fähigkeit, den Metabolismus in Pflanzenzellen zu ändern, und Fortbewegung des Vektors von Zelle zu Zelle oder über eine große Distanz (long distance movement)
Es wurde gezeigt, dass Pflanzenviren, die auf Vermehrung beruhen und deren Grundlage ein einfaches Genom (monopartite, z. B. das des Tabakmosaikvirus, TMV) oder ein doppeltes Genom (bipartite, z. B. das von Mitgliedern der Bromoviridae Familie) ist, Fremdgenen in Wirtspflanzen exprimieren (Zusammenfassung in „Genetic engineering in plant viruses" T.M.A. Wilson and J.W. Davies Hrsg., 1992, CRC Press, Inc.).
Die Genome der meisten (ca. 80%) der bekannten Pflanzenviren bestehen aus plus-sense-einzelsträngiger RNA (ssRNA). Diese ist infektibs, wenn sie aus den Virionen in Form von freier RNA isoliert wird. Daraus folgt, dass als erster Schritt des viralen Replikationskreislaufes die genomische RNA translatiert werden muß, um die virusspezifische, RNA-abhängige RNA-Polymerase (Replikase) zu erzeugen, die nicht in uninfizierten Pflanzenzellen vorhanden ist und daher für die virale Replikation unentbehrlich (Zusammenfassung in: Y. Okada, 1999, Philosoph. Transact. of Royal Sec., B, 354, 569–582). Es sollte erwähnt werden, dass sich die plus Sense-ssRNA-Viren in den von ihnen verwendeten Translationsstrategien zur Expression des Genoms unterscheiden: Die Genome der sogenannten Picorna-ähnlichen Viren stellen ein einzelnes kontinuierliches offenes Leseraster (ORF) dar, das von den Ribosomen in ein großes Polyprotein translatiert wird. Dieses wird proteolytisch in aktive Virus-kodierte Proteine prozessiert. Die virusspezifischen Protease(n) sind an der Polyprotein-Prozessierung beteiligt. Eine zweite besondere Eigenschaft der Picorna-ähnichen Viren besteht darin, dass deren genomische RNA anstatt einer CAP-Gruppe (CAP-Strukur) ein kleines virales Protein enthält, das kovalent an das 5'-Ende des Genoms gebunden ist.
In dieser Erfindung konzentrieren wir uns hauptsächlich auf Viren, die der sogenannten Sindbis-ähnlichen Superfamilie zuzuordnen sind. Diese beinhaltet viele Pflanzenviren, insbesondere mehr als ein Dutzend Viren, die zum Genus der Tobamoviren gehören (Zusammenfassung in A. Gibbs, 1999, Philosoph. Transact. of Royal Sec., B, 354, 593–602). Die Technologie ermöglicht die Expression von Fremdgenen, die von der CAP-Struktur und von dem viralen Promotor unabhängig ist.
Das Genom der Tobamoviren (TMV U1 ist ein typischer Vertreter dieser Gruppe) beinhaltet vier große offene Leseraster (ORFs). Die beiden Komponenten der Replikase – das 130-kDa Protein sowie das durch Durchlesen (readthrough) entstehende 183 kDa Protein – werden von der 5' proximalen Region der genomischen RNA kodiert und werden, direkt von der genomischen RNA translatiert. Die fünfzehn 3'-endständigen Nukleotide des 180 kDa Proteins von TMV U1 überlappen mit dem offenen Leseraster des 30 kDa Proteins, das für die Ausbreitung der TMV-Infektion von einer Zelle zu einer anderen verantwortlich ist (movemnent Protein, MP). Im TMV U1-Virus endet dieses Gen zwei Nukleotide vor dem Initiationskodon des letzten Gens, welches für das 17-kDa Hüllprotein (coat Protein, CP) kodiert. Diese Region ist aufwärts (upstream) der (bei TMV U1) 204 Nukleotide großen 3 endständigen nichttranslatierten Region (3'-NTR) gelegen.
Die Translation der RNA des Tobamovirus erfolgt durch einen ribosomalen Absuchungsmechanismus (ribosome scanning mechanism), der für die Mehrzahl der eukaryotischen mRNAs zutrifft (zusammengefaßt in Kozak, 1989, J. Mol. Biol. 108, 229–241; Pain, 1996, Merrick und Hershey, 1996, in „Translational control", Hrsg. Hershey, Matthews and Sonenberg, Cold Spring Habour Press, S. 31–69, Sachs und Varanini, 2000, Nature Structural Biology 7, 356–360). In Übereinstimmung mit diesem Mechanismus ist die strukturell polycistronische Tobamovirus-RNA funktional monocistronisch, d. h. lediglich das 5' gelegene offene Leseraster, das für die Replikationsproteine (130 kDa-Protein und Produkt des Durchlesemechanismus) kodiert, kann von der vollständigen (fullength) genomischen RNA translatiert werden (zusammengefaßt in Palukaitis und Zaitlin, 1986, in „The Plant Viruses", van Regermortel und Fraenkel-Conrat Hrsg., Vol. 2, S. 105–131, Plenum Press, NY). Es sollte betont werden, dass der 68 Nuldeotide große 5'-terminale, nichttranslatierte Bereich (lender sequence) von TMV U1, der als Omega (Ω)-Leader bezeichnet wird, die Rolle eines effizienten Translationsverstärkers besitzt, indem er die Translation des 5' proximal liegenden offenen Leserasters stimuliert.
Die 5' distal liegenden Gene für MP und CP sind in der Vollängen-TMV U1 RNA translational inaktiv. Sie werden von separaten mRNAs, die als subgenomische RNA (sgRNA) bezeichnet werden, translatiert. Offenbar werden die subgenomische RNAs von Tobamoviren von in negativer Orientierung vorliegender genomischer RNA transkribiert und besitzen übereinstimmende 3'-Enden. Die Expression der TMV Gene, die von sgRNAs translatiert werden, ist sowohl zeitlich als auch quantitativ voneinander unabhängig reguliert: das MP wird durchgehend während den frühen Schritten der Infektion exprimiert und akkumuliert zu einer relativ geringen Proteinmenge, deren Gesamtanteil bei etwa 1% des gesamten Pflanzenproteins liegt. Im Gegensatz dazu beträgt der Anteil der Synthese des Hüllproteins bis zu 70% der gesamten pflanzlichen Proteinsynthese. Der Anteil des Hüllproteins an der Gesamt-Proteinmenge in der Pflanze kann bis zu 10% betragen (Fraser, 1987, in: Biochemistry of virus-infected plants", S. 1–7, Research studies Press Ltd., Letchworth, England).
Es ist offensichtlich, dass die Erzeugung jeder sgRNA von verschiedenen in cis wirkenden Elementen kontrolliert wird. Diese werden als „subgenomische mRNA-Promotoren" (sgPR) bezeichnet. Im allgemeinen bezeichnet dieser Terminus die Region des viralen Genoms (vermutlich innerhalb einer Minus-Sinn RNA-Kopie), das von dem Replikase-Komplex erkannt wird, um die Transkription von dem intern lokalisierten sgPR zu initiieren zur Erzeugung der sgRNA. Zur Vereinfachung bezeichnen wir gewöhnlich mit dem Terminus „subgenomischer Promotor" eine Nukleotidsequenz einer plus sense viralen RNA, die in der Regel aufwärts (upstream) der kodierenden Sequenz und des Startpunktes der sgRNA liegt und die bei der Initiation der sgRNA-Synthese eine funktionelle Rolle spielt. Es sollte allerdings in Betracht gezogen werden, dass einige virale sgPRs nicht ausschließlich aufwärts (upstream) von dem kontrollierten, viralen Gen liegen, sondern sogar mit diesen Genen überlappen können (Balmori et al., 1993, Biochimie (Paris) 75, 517–521).
Jeder subgenomische Promotor besetzt eine unterschiedliche Position im TMV-Genom. Keiner der subgenomischen Promotoren des TMV konnte bisher exakt kartiert werden. Es konnte aber gezeigt werden, dass die 250 Nukleotide große Region aufwärts (upstream) des CP-Gens die Synthese der CP-sgRNA unterstützt (Dawson et al., 1989, Virology 172, 285–292).
Lehto et al. inserierten 253 und 49 Nuldeotide lange Sequenzen in das TMV Genom (vor das MP-Gen; 1990, Virology 174, 145–157), die dem CP vorausgingen. Das Ziel war, die Größe der subgenomischen Promotoren (sgPR) abzuschätzen. Die Insertion zerstörte zwar nicht den ursprünglichen subgenomischen Promotor des MP-Gens, sondern entfernte ihn von dem offenen Leseraster des MP-Gens. Dieser mutierte Virus (genannt KK6), der eine 253 Nukleotid große Insertion in der Promotorregion besitzt, repliziert stabil und bewegt sich systemisch über die infizierte Pflanze. Es entspricht den Erwartungen, dass die in der Mutante KK6 vorliegende Insertion die Länge der subgenomischen Leader-Sequenz des MP ändert. (Lehto et al., Virology 174, 145–157. s. 9). Die subgenomische RNA der KK6 MP-Leader-RNA hat eine Größe von 24 Nukleotiden. Verglichen dazu beträgt die Größe der subgenomischen RNA des Hüll-Proteins lediglich 9 Nukleotide.
Im Gegensatz dazu repliziert die Mutante mit einem eingefügten 49 Nukleotide großem Fragment in der Promotorregion nur kurzzeitig. Nach dieser Phase überwiegen die Nachkommen von Wildtyp-Viren, die die Insertion deletiert haben. Zusätzlich konnte gezeigt werden (Meshi et al., 1987, EMBO 6, 2557–2563), dass die Produktion der subgenomischen Hüllprotein-RNA dann reduziert wurde, wenn eine 96 Nukleotide große Region verwendet wurde, die von der Hüllprotein-RNA abstammte. Es wurde daraus geschlossen, dass die 49 bis 96 Nukleotide großen Sequenzen, die sich aufwärts (upstream) des Gens für das Hüllprotein befinden, nicht die gesamte Region des subgenomischen Promotors des TMV U1 Hüllproteingens beinhalten. Die 250 bp große Nukleotid-Sequenz beinhaltet hingegen den kompletten subgenomischen Promotor.
Es liegen nur wenig Informationen über die Struktur und Lage des subgenomischen Promoters vor, der die Expression des MP des TMV kontrolliert. Weil die mutmaßliche Sequenz des subgenomischen Promotors des MP mit der Sequenz des 183-kDa Replikase Proteins überlappt, gestaltete sich die Analyse der Region mittels Mutationen als kompliziert. Vorläufige Ergebnisse, die von W. Dawson und Mitarbeitern kürzlich berichtet wurden, skizzieren die Grenzen des minimalen und kompletten subgenomischen Promoters des MP von TMV U1 (Grdzelishvili et al. 2000, Virology 276, im Druck). Durch computerunterstützte Strukturanalysen der Region, die sich aufwärts (upstream) des MP-Gens befindet, konnten zwei stem-loop-Strukturen identifiziert werden, die 5' proximal zur 75-Nukleotid-Region des MP-Gens liegen und dem AUG-Codon des MP-Gens vorausgehen.
Es wird angenommen, dass die subgenomische RNA des MP (der sogenannten I₂ sgRNA) im Gegensatz zur genomischen RNA und subgenomischen RNA des Hüllproteins keine CAP-Struktur aufweist (uncapped, zusammengefaßt in: Okada, 1999, Philosoph. Transact. Of Royal Soc., 354, 569–582). Die vorliegende Erfindung unterstützt diese Ergebnisse. Demnach hat die I₂sgRNA sowohl in TMV U1 als auch in crTMV kein CAP (uncapped, 7).
Von W. Dawson und Mitarbeitern konnte gezeigt werden, dass ein wichtiger Faktor, der die Expression eines Fremdgens in einem viralen Vektor beeinflußt, dessen relative Position zum 3'-Terminus des viralen Genoms ist: Die Effizienz der Expression stieg mit zunehmender Nähe des Fremdgens zum 3'-Terminus dramatisch an (Culver et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2055–2059). Das am stärksten exprimierte Gen ist das des Hüllproteins, das sich benachbart zur 3'-nichttranslatierten Region befindet. Diese besteht (in der TMV U1 RNA) aus drei Pseudoknoten, auf die eine tRNA-ähnliche Struktur folgt. Es wurde vorgeschlagen (Shivprasad et al. 1999, Virology 355, 312–323), dass die Nähe eines Gens zu den Pseudoknoten die Expression eines Fremdgens eher anhebt als dessen Nähe zum 3'-Terminus des Genoms. Viele wichtige Aspekte der Struktur des sub-genomischen Promotors des TMV wurden durch die Arbeit von W. Dawson und seiner Arbeitsgruppe geklärt. Die allgemeine Schlußfolgerung dieser Autoren lautete, dass sich die Forschung auf diesem Gebiet immer noch auf dem „empirischen Stand der Vektor-Herstellung" befindet (Shivprasad et al. 1999, Virology 335, 312–323).
Die bisherigen Ausführungen machen deutlich, dass die Synthese der subgenomischen RNA essentiell für die Synthese der 5'-endständigen Gene des TMV-Genoms ist, da. diese Gene sind in voll-Länge-RNA stillgelegt sind. Der Mechanismus der unabhängigen Ex-pression eines Gens durch „Subgenomisierung" kann als eine Strategie des TMV angesehen werden, die Unfähigkeit eukaryotischer Ribsomen zur Translationsinitiation von 5'-distalen Genen von polycistronischer mRNA zu überwinden. Nach dem traditionellen „Ribosomen-Scanning-Modell" (Kozak, 1999, Gene 234, 187–208) sind die internen Gene von polycistronischer, eukaryotischer mRNA für Ribosomen nicht zugänglich.
Kürzlich gelang es uns, aus Oleracia officinalis einen Tobamovirus zu isolieren, der in der Lage ist, Kreuzbluter zu infizieren (crucifer infecting tobamovirus, crTMV). Ein hervorstechendes Merkmal von crTMV ist seine Fähigkeit, Mitglieder der Familie der Brassicaceae systemisch zu infizieren. Zusätzlich ist der Virus in der Lage, Pflanzen der Solanaceae-Familie und andere Pflanzen, die mit TMV U1-infizierbar sind, systemisch zu infizieren. Das Genom von crTMV (6312 Nukleotide) wurde sequenziert (Dorokhov et al., 1994, FERS Letters 350, 5–8). Es konnte gezeigt werde, dass es vier traditionelle proteinkodierende offene Leseraster beinhaltet. Es handelt sich dabei um ein 122 kDa Protein (ORF1), ein 178 kDa Protein (ORF2), das Durchlese-(readthrough)-Produkt des 122 kDa-Proteins, ein 30 kDa MP (ORF3) sowie ein 17 kDa Hüllprotein (ORF4). Eine besondere strukturelle Eigenschaft der crTMV RNA ist, dass – anders als bei anderen Tobamoviren – die kodierenden Regionen des MP und des Hüllproteins eine Überlappung von 75 Nukleotiden ausweisen, d. h. der 5'-endständige Teil des Hüllproteins kodiert gleichzeitig den C-terminalen Teil des MP.
Um ein klares und stimmiges Verständnis der Aufzählungen und Anträge einschließlich der Abbildungen zu gewährleisten, werden die folgenden Definitionen gegeben:

Benachbart: Eine Position in einer Nukleinsäuresequenz unmittelbar 5' oder 3 einer definierten Sequenz gelegen.
Amplifikationsvektor: Ein Typ von Genvektor, der, nach Einführung in eine Wirtszelle, zur Replikation in dieser Wirtszelle fähig ist.
Anti-sense(Gegensinn-)Mechanismus: Eine Art der Genregulation, die darauf basiert, dass die Rate der Translation der mRNA zum Protein durch die Anwesenheit einer RNA in der Zelle kontrolliert wird, die zumindest in Teilen komplementär zur translatierten RNA ist.
Chimäre Sequenzen oder Gene: Eine Nukleotidsequenz, die aus mindestens zwei heterologen Bereichen gebildet wurde. Die Sequenz kann DNA oder RNA beinhalten.
Kodierende Sequenz: Eine Desoxyribonukleotidsequenz die, wenn sie transkribiert und translatiert wird, zur Bildung eines zellulären Polypeptids führt oder eine Ribonukleotidsequenz die, wenn sie transkribiert wird, zur Bildung eines zellulären Polypeptids führt.
Kompatibilität: Die Fähigkeit, mit anderen Komponenten eines Systems zu funktionieren. Ein Vektor oder die Nukleinsäure eines Pflanzenvektors, der kompatibel mit einem Wirt ist, kann sich in diesem Wirt replizieren. Ein Hüllprotein, das kompatibel mit einer viralen Nukleinsäure ist, ist in der Lage, diese Nukleinsäure einzukapseln.
Gen: Eine abgegrenzte Nukleinsäuresequenz, die für ein bestimmtes zelluläres Produkt verantwortlich ist.
Ein Gen, das exprimiert werden soll: Ein Gen, deren Expression von technologischem Interesse ist.
Wirt: Eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organismus, in dem sich ein Vektor oder Pflanzenvirus replizieren kann. Ein Wirt ist in der Lage, von einem Virus, der einen viralen Vektor oder Sequenzen von Pflanzenvektoren besitzt, infiziert zu werden. Der Terminus soll prokaryotische und eukaryotische Zellen, Organe, Gewebe oder Organismen einschließen.
Wirtspflanzengenom: Mit diesem Begriff wird v. a. das Kerngenom einer Wirtspflanze bezeichnet. Er beinhaltet aber daneben ggf. auch mitochondriale und Chloroplasten-DNA.
Infektion: Die Fähigkeit eines Virus oder eines amplifikationsbasierten Vektors, seine Nukleinsäuren auf einen Wirt zu übertragen oder seine Nukleinsäuren in einen Wirt zu übertragen, wo die virale Nukleinsäure oder der Vektor repliziert wird, virale Proteine synthetisiert werden und neue Viruspartickel zusammengesetzt werden. In diesem Zusammenhang werden die Begriffe „übertragbar" und „infektiös" gleichwertig verwendet.
Interne ribosomale Eintrittsstellen (IRES, Internal Ribosomal Entry Sites) oder IRES: Eine Nukleotidsequenz viralen, zellulären oder synthetischen Ursprungs, die auf der Ebene der Translation für die interne Initiation verantwortlich ist.
IRES-Elemente, die für die Translation eines abwärts (downstream) gelegenen Gens verantwortlich sind: IRES-Element, das in dem Sinne für die Translation des Gens wirksam ist, dass ohne das IHRES-Element keine Expression des Gens auftritt, die im technologischem Sinne interessant ist.
Nichtvirales Gen: Ein Gen, das im Lebenszyklus eines Virus keine Rolle spielt.
Phänotypisches Merkmal: Eine zu beobachtende Eigenschaft, die durch die Expression eines Gens hervorgerufen wird.
Pflanzenzelle: Die strukturelle und physiologische Einheit einer Pflanze, bestehend aus dem Protoplasten und der Zellwand.
Pflanzenorgan: Ein abgegrenzter und sichtbar zu differenzierender Teil einer Pflanze, wie z. B. Wurzel, Sproß, Blatt oder Embryo.
Pflanzengewebe: Jedes Gewebe einer Pflanze im Pflanzenkörper oder in Gewebekultur. Mit diesem Terminus soll die gesamte Pflanze, die Pflanzenzelle, Pflanzenorgane, Protoplasten, Zellkulturen oder jede andere Gruppe von Pflanzenzellen bezeichnet werden, die in einer strukturellen oder funktionellen Einheit organisiert sind.
Produktionszelle: Eine Zelle eines Gewebes oder eines Organs, die in der Lage ist, einen Vektor oder einen viralen Vektor zu replizieren, aber die nicht notwendigerweise ein Wirt des Virus ist. Mit diesem Begriff sollen prokaryotische und eukaryotische Zellen, Gewebe oder Organe wie Bakterien, Hefe, Pilze und Pflanzengewebe eingeschlossen werden.
Promotor: Der 5'-nichtkodierende Bereich der aufwärts (upstream) einer kodierenden Sequenz gelegen und funktionell mit dieser verbunden ist und an der Initiation der Transkription der kodierenden Sequenz beteiligt ist.
Protoplast: Eine isolierte Pflanzenzelle ohne Zellwand. Sie besitzt die Fähigkeit, sich zu einer Gewebekultur oder einer ganzen Pflanze zu regenerieren.
Rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure: Die Nukleinsäure eines Pflanzenvirus, die durch die Einführung von nichtviralen Nukleinsäuresequenzen modifiziert wurde.
Rekombinanter Pflanzenvirus: Ein Pflanzenvirus, der die rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure trägt.
Reportergen: Ein Gen, dessen Produkt einfach nachgewiesen werden kann.
Subgenomischer Promotor (sgPR): Ein Promotor einer subgenomischen mRNA eines Vektors oder einer viralen Nukleinsäure.
Wesentliche Sequenzhomologie: Bezeichnet Nukleotidsequenzen, die so homolog sind, dass sie im wesentlichen funktionell äquivalent sind. Unterschiede in den Nukleinsäuresequenzen von Sequenzen, die wesentliche Homologie aufweisen, sind bezüglich der Funktion der Genprodukte oder der von einer solchen Sequenz kodierten RNA unbedeutend.
Transkription: Produktion eines RNA-Moleküls durch die RNA-Polymerase als komplementäre Kopie einer DNA-Sequenz.
Translation: Erzeugung eines Polypeptids durch ein Ribosom (häufig im Sinne des Abtastens (scanning) einer RNA gemeint).
Vektor: Eine Nukleinsäure, die in der Lage ist, eine Wirtszelle genetisch zu modifizieren. Der Vektor kann einzelsträngig (ss) (+), ss (-) oder doppelsträngig (ds) sein.
Virus: Eine infektiöse Substanz, die aus einer Nukleinsäure besteht, welche in ein Protein eingehüllt ist. Ein Virus kann ein,- zwei-, drei- oder mehrteilig sein.

VORTEILE DER ERFINDUNG
Diese Erfindung liefert eine neue Strategie zur Herstellung eines amplifikationsbasierten Vektors zur Expression von Fremdgenen (heterolog, nicht nativ), so dass die Translation dieser Gene über einen durch einen IRES-vermittelten Mechanismus des internen Ribosomeneintritts vermittelt werden kann von einer polycistronischen RNA oder/und durch IHRES-vermittelten CAP-unabhängigen internen Ribosomeneintrittsmechanismus von bi- und multicistronischer sgRNA, die von dem Vektor in der infizierten Zelle erzeugt werden. In jedem Fall ist das IRES-Element zur Translation eines Gens nötig. Ein Vorteil dieser Strategie ist, dass es keine spezifischen Manipulationen der sgRNA erfordert: Die einzige Sequenz, die in den Vektor eingefügt werden sollte, ist die IRES-Sequenz bzw. sind die IRES-Sequenzen, die aufwärts (upstreamn) des zu translatierenden Gens liegen. Die IKES-Sequenzen können nativ oder nicht-nativ sein. Die Translation der abwärts (downstream) gelegenen Gene wird durch die insertierten IRES-Sequenzen gefördert und ist CAP-unabhängig. Der Sequenzbereich, der das IRES-Element beinhaltet, besitzt vorzugsweise keine Eigenschaft eines subgenomischen Promotors, die technisch eine Rolle spielen könnte. Dies bedeutet, dass der Sequenzbereich entweder keine nachweisbare Produktion korrespondierender, subgenomischer RNA bewirkt, oder dass für Alternativ kann die Translation einer subgenomischen RNA, die ein Ergebnis von restlicher subgenomischer Promotoraktivität der IRES-Sequenz ist, das IRES-Element für die Translation eines abwärts (downstream) gelegenen Gens benötigt wird. Folglich besitzt die primäre rekombinante RNA, die vom Vektor produziert wird, folgendes: ein oder mehrere Strukturgene (vorzugsweise viralen Ursprungs), die IRES-Sequenz, das gewünschte (Fremd-) Gen, das sich abwärts (downstream) der IRES-Sequenz befindet, und die 3 nichttranslatierte Region (3'-NTR). Es ist wichtig, dass diese Strategie die gleichzeitige Expression mehrerer Fremdgene ermöglicht durch die tandemartige Insertion von zwei oder mehreren Fremdgenen, von denen jedes von einer eigenen IRES-Sequenz kontrolliert wird. Die vorliegende Erfindung ist vorzugsweise auf Nukleinsäuren und rekombinante Viren ausgerichtet, die durch die CAP-unabhängige Expression des viralen Genoms oder der viralen sgRNA oder nicht-nativer (Fremd-) Nukleinsequenzen charakterisiert sind, und in der Lage sind, über weitere pflanzenspezifische IRES-Elemente solche Fremdsequenzen systemisch zu exprimieren.
In einer ersten Anwendungsform wird die Nukleinsäure eines Pflanzenvirus verwendet, in der die kodierende Sequenz für das native Hüllprotein und der native subgenomische Promotor von den viralen Nukleinsäure deletiert sind. Eine kodierende Sequenz eines nicht-natives Hüllprotein aus einem Pflanzenvirus mit einem aufwärts (upstream) gelegenem viralen IRES-Element wird inseriert, was die CAP-unabhängige Expression in der Wirtspflanze erlaubt. Die Verpackung der rekombinanten viralen Nukleinsäuren und die anschließende systemische Infektion des Wirts durch die rekombinante Nukleinsäure des Pflanzenvirus bleiben erhalten. Die rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure kann ein oder mehrere native oder nicht-native IRES-Elemente beinhalten, die als Translationselemente funktionieren und die keine transkriptionelle Aktivität besitzen, d. h. sie sind unfähig, als subgenomischer Promotor zu fungieren. Jedes native oder nicht-native IRES-Element ist in der Lage, CAP-unabhängige Expression von benachbarten Genen oder Nukleinsäuresequenzen in der Wirtspflanze zu fördern.
In einer zweiten Anwendungsform wird ein Amplifikations- und Expressionsvektor verwendet, in denn native oder nicht-native pflanzenvirale IRES-Elemente oder ein natives oder nicht-natives, pflanzenvirales IRES-Element, das aufwärts (upstream) von Fremdnukleinsäuresequenzen liegt, abwärts eines nativen Hüllproteingens inseriert sind bzw. ist. Das inserierte Pflanzenvirus-IRES-Element kann die CAP-unabhängige Expression von benachbarten Genen in Wirtspflanzen leiten. Nicht-native Nukleinsäuresequenzen können benachbart zu den IRES-Elementen inseriert werden, so dass diese Sequenzen in der Wirtspflanze unter der translationalen Kontrolle der IRES-Elemente exprimiert werden und das gewünschte Produkt synthetisiert werden kann. In einer dritten Anwendungsform wird eine rekombinante Vektornukleinsäure wie in der zweiten Anwendungsform verwendet, mit dem Unterschied, dass das native oder nicht-native, pflanzenvirale IRES-Element (oder die IRES-Elemente) mit den abwärts gelegenen Fremdnukleinsäuresequenzen aufwärts (upstream) des Hüllproteins und dessen nativen subgenomischen Promotors gelegen ist bzw. sind. In einer vierten Anwendungsform wird eine rekombinante Vektornukleinsäure verwendet, in der ein natives oder nicht-natives, pflanzenvirales IRES-Element (oder IRES-Elemente) am 5'-Ende des viralen Genoms oder der viralen subgenomischen RNA verwendet wird bzw. werden, so dass ein abwärts (downstream) gelegenes Gen CAP-unabhängig translatiert wird. In einer fünften Anwendungsform wird die Inhibition der CAP-abhängigen Translation ausgenützt, um das Niveau der CAP-unabhängigen Translation von Vektoren zu erhöhen.
Die auf Viren basierenden Amplifikationsvektoren werden vom Hüllprotein eingeschlossen, das von der rekombinanten, pflanzenviralen Nukleinsäure kodiert wird, um einen rekombinanten Pflanzenvirus zu erzeugen. Die rekombinante, pflanzenvirale Nuldeinsäure ist zur Replikation im Wirt fähig, zur systemischen Ausbreitung im Wirt fähig. Zusätzlich kann das gesamte Genom oder subgenomische RNAs CAP-unabhängig im Wirt produziert werden, um ein gewünschtes Produkt zu erzeugen. Solche Produkte schließen therapeutische und andere nützliche Polypeptide ein. Dazu gehören u. a. Enzyme, komplexe Biomoleküle oder Polypeptide oder Merkmale oder Produkte, die durch die Produktion von Gegensinn-RNA (antisense RNA) erzeugt werden.
Beispiele von zu produzierenden Proteinen sind Antikörper, Antigene, Rezeptorantagonisten, Neuropeptide, Enzyme, Blutfaktoren, Faktor VIII, Faktor IX, Insulin, Pro-insulin, Somatotropin, Serumalbumin, gewebsspezifischer Plasminogenaktivator, hämatopoietische Faktoren wie Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor, Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor, Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor, Interleukin 3, Interleukin 11, Thrombopoietin, Erythropoetin usw.
Beispiele für erwünschte eingeführte (input-) Eigenschaften sind Herbizidresistenz, Insektenresistenz, Pilzresistenz, Resistenz gegen Viren, Bakterien, abiotischen Stress, sowie eine verbesserte Energie- und Materialverwertung.
Beispiele für erwünschte Output-Eigenschaften sind modifizierte Kohlenhydrate, modifizierte Polysaccharide, modifiziere Fette, eine modifizierte Aminosäurezusammensetzung und -Ausbeute, modifizierte sekundäre Metaboliten und pharmazeutische Proteine, einschließlich Enzyme, Antikörper, Antigene u. ä.. Beispiele für Regulationsmechanismen, die Merkmale kontrollieren, sind Gen-Umschaltungen (Gene-switches), Kontrolle der Expression, Kontrolle der hybriden Samenproduktion und Kontrolle von Apomixis.
Die vorliegende Erfindung zielt zudem direkt auf die Herstellung künstlicher, nicht-natürlicher IRES-Elemente (im Gegensatz zu IRES-Elementen, die aus lebenden Organismen isoliert werden). Diese ermöglichen eine CAP-unabhängige und Promotor-unabhängige Expression eines gewünschten Gens in Pflanzenzellen (und evtl. zusätzlich in Hefe- oder Tierzellen). Künstliche IRES-Elemente können auf der Basis des Gehalts an bestimmten Basen, insbesondere dem Gehalt von Adenin- und Guaninbasen erzeugt werden (siehe Beispiel 14). Beispiele für lebende Organismen, aus denen die IRES-Elemente evtl. isoliert werden können sind der Hepatitus C Virus, infektiöse Bronchitis-Viren, Picornaviren wie Poliovirus und Encephalomiocarditisvirus sowie Retroviren wie Moloney Murine Leukemia Virus und Harvey Murine Sarcoma Virus. Beispiele für Pflanzenviren sind der Kartoffelvirus X, Potyviren wie der Kartoffelvirus Y und Rübenmosaikvirus, Tobamoviren wie z. B. solche, die Kruziferen infizieren und Comoviren, wie z. B. der Cowpea Mosaik Virus. Alternativ können natürliche IRES-Sequenzen aus zellulärer Boten-RNA isoliert werden. Dazu gehören RNAs wie die des homöotischen ANTENNAPEDIA-Gens oder des menschlichen Fibroblastenwachstums-faktors 2 und des Translationsinitiationsfaktors eIF-4G, oder N. tabacum Hitzeschockfaktor 1 (siehe Beispiel 14). Künstliche IRESs oder IRESs, die auf pflanzlichen oder tierischen IRES-Elementen beruhen, zeigen keine subgenomische Promoteraktivität in einem signifikanten Ausmaß. Solche IRESs können anstelle der pflanzenviralen IRES-Elemente in den oben beschriebenen Ausführungsformen verwendet werden. In einer sechsten Anwendungsform werden künstliche, nicht-natürliche IRES-Elemente auf der Basis der Komplementarität zur 18S rRNA von eukaryotischen Zellen, ein-schließlich Hefe, Tieren und Pflanzenzellen verwendet.
In einer siebten Anwendungsform werden künstliche, nicht-natürliche IRES-Elemente auf der Grundlage von kurzen Sequenzabfolgen von Adenosin/Guanosin-Basen verwendet.
In einer achten Anwendungsform dieser Erfindung wird eine Methode zur Herstellung und Verwendung von auf Viren basierenden Amplifikationsvektoren präsentiert, wobei die Expression des viralen Genoms in Pflanzenzellen unter der Kontrolle eines pflanzenspezifischen künstlichen Transkriptionspromotors auftritt. In einer weiteren Ausführungsform wird ein IRES-Element in dem Vektor und Verfahren der Erfindung verwendet, das (ein) Segment(e) einer natürlichen IRES pflanzlichen Ursprungs ist oder umfasst.
In einer neunten Anwendungsform der vorgelegten Erfindung wird eine Methode zur Herstellung und Verwendung von auf Viren basierenden Amplifikationsvektoren vorgestellt, die es erlaubt, eine vektorielle Expression von Replikons durchzuführen, die in der Pflanzenzelle als ein Ergebnis einer primären nukleären Transkriptprozessierung gebildet werden.
In einer zehnten Anwendungsform dieser Erfindung wird ein Verfahren beschrieben, bei dem ringförmige, einzelsträngige, auf Viren basierende Amplifikationsvektoren zur CAP-unabhängigen Expression von Fremdgenen in Pflanzen verwendet werden.
In einem elften Anwendungsform dieser Erfindung werden Methoden präsentiert, die die Expression eines gewünschten Gens unter Bedingungen in Zellen ermöglicht, die eine CAP-unabhängige Expression bevorzugt. In einer Beispiel werden Zellen, die mit einem Amplifkationsvektor infiziert wurden, mit einer Komponente behandelt, die die CAP-abhängige Translation inhibiert. In einem weiteren Beispiel beinhaltet der Vektor selber ein Gen, dessen Produkt einen inhibierenden Effekt auf die CAP-abhängige Translation im Wirt hat. Alternativ kann der Vektor auch eine Gegensinn (antisense)-Sequenz mit gleicher Funktion besitzen.

In einer zwölften Anwendungsform dieser Erfindung ist eine Methode beschrieben, die es erlaubt, mittels in vivo-genetischer Selektion eine IRES-Sequenz zu identifizieren, die die CAP-unabhängige Expression eines gewünschten Gens oder eines Reportergens in einem Expressionsvektor vermittelt. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1	Darstellung der Vektoren T7/crTMV und SP6/crTMV.
Fig. 2	Darstellung der Vektoren T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS, T7/crTMV/IRES_MP,75 ^U1-GUS, T7/crTMV/IRES_MP,228s^CR-GUS, T7/crTMV/IRE_SCP,148 ^CR-GUS, T7/crTMV/SPACER_CP148 ^U1-GUS und T7/crTMV/PL-GUS.
Fig. 3	Kartierung des 5' Endes der TMV I₂sgRNA durch Primer-Verlängerung (A) und mutmaßliche Sekundärstruktur von I₂ sgRNA 5' NTR (B).
Fig. 4	Die crTMV I₂sgRNA 5' NTR beinhaltet eine die Translation inhibierende Haarnadelstruktur (A) stellt die künstlichen Transkripte, die für die in vitro Translation mit Hilfe von Weizenkeimextrakten (WGE) verwendet wurden, dar; (B) zeigt die Translationsprodukte, die in WGE synthetisiert wurden.
Fig. 5	Tobamoviren beinhalten eine Haarnadelstruktur aufwärts (upstream) des MP-Gens, die vermutlich Translation inhibiert.
Fig. 6	Methode der spezifischen Detektion von getappter (capped) RNA. A, B. Eine RNA-Markierung (RNA-tag) mit einer bekannten Sequenz wird spezifisch an die CAP-Struktur einer zu testenden RNA (tested RNA) ligiert. C. Reverse Transkription mit 3' spezifischen Primern und cDNA Erststrangsynthese. Die Markierung wird in die Sequenz der cDNA eingeführt. D. PCR mit markierungsspezifischen (tag-specific) und 3'-spezifischen Primern. Das Auftreten der entsprechenden PCR-Bande deutet auf die Anwesenheit einer CAP-Struktur in der getesteten RNA hin. E. PCR mit 5'-spezifischen und 3'-spezifischen Primern. Das Auftreten der PCR-Bande dient als Kontrolle der PCR-Reaktion und deutet auf die Anwesenheit der spezifischen getesteten RNA in dieser Reaktion hin. F. Relativer Längenvergleich der erhaltenen PCR-Banden.
Fig. 7a und 7b	Detektion der CAP-Strukturen am 5'-Ende der viralen RNA in einem 2%igem Agarosegel. Pfeile weisen auf die entsprechenden PCR-Fragmente hin.
Fig. 8	Abbildung des auf KK6 basierenden TMV-Vektoren
Fig. 9	Nukleotid-Sequenz der 5' NTR von KK6 und KK6-IRES_MP75 ^CRI₂sgRNA.
Fig. 10	Zeitverlauf der Hüllprotein- und MP-Akkumulation in Blättern, die mit KK6- IRES_MP,75 ^CR (K86), KK6 und TMV U1 infiziert wurden.
Fig. 11	Akkumulation des Hüllproteins in Tabak, der mit KK6, KK6-IRES_MP,75 ^CR, KK6-IRES_MP,125 ^CR und KK6-H-PL und KK6-PL infiziert wurde.
Fig. 12	Multimerstruktur von crTMV IRESmp und Komplementarität zu 18S rRNA aus A. thaliana.
Fig. 13	Dargestellt sind bicistronische Transkripte, die die IRES_MP,75 ^CR beinhalten, sowie die Tetramere von 18-nt Segmenten von IRES_cp,148 ^CR, 19-nt Segment von IRES_MP,75 ^CR, Polylinker (PL) als intercistronischer „Spacer" und Produkte ihrer Translation in RRL.
Fig. 14	Stellt die Struktur von IRES_cp,148 ^CR dar.
Fig. 15	Zeigt Konstrukte, die zum Test von IRES_cp,148 ^CR-Sequenzelementen in vitro und in vivo verwendet wurden.
Fig. 16	GUS-Aktivitätstest in WGE nach der Translation der Transkripte, die in Fig. 21 dargestellt sind.
Fig. 17	GUS-Aktivitätstest in Tabak-Protoplasten, die mit 35S-Promqotor-basierten Konstrukten (analog zu den Konstrukten in Fig. 21) transfiziert wurden.
Fig. 18	Schematische Darstellung der Klonierung zweier infektiöser TMV-Vektoren, die IRES_mp,75 ^CR in der 5' nichttranslatierten Region beinhalten.
Fig. 19	Darstellung von Vektor Act2/crTMV.
Fig. 20	Zeigt den auf UC-basierenden Vektor Act2/crTMV/IRES_mp,75 ^CR-GUS.
Fig. 21	Darstellung des zirkulären, einzelsträngigen Vektors KS/Act2/crTMV/IRES_mp,75 ^CR-GUS.
Fig. 22	Darstellung des Vektors KS/Act2/crTMV/IRES_mp,75 ^CR-GUS.
Fig. 23	Darstellung des Konstruktes 35S/CP/IRES_mp,75 ^CR-GUS.
Fig. 24	Darstellung des Konstruktes 35S/GUS/IRES_mp,75 ^CR-GUS.
Fig. 25	Darstellung des Konstruktes 35S/CP/-VPg/IRES_mp,75 ^CR-GUS.
Fig. 26	Darstellung eines Konstruktes, das zur genetischen in vivo-Selektion verwendet werden kann. Es dient der Identifizierung eines viralen, subgenomischen Promotors oder einer IRES-Sequenz, die CAP-unabhängige Expression eines Gens von Interesse in einem Expressionsvektor bewirkt.
Fig. 27	zeigt die Restriktionskarte des TMV-U1 cDNA Klons ^IRESMP,75^CR-eGFP Insertionen enthalten.
Fig. 28	zeigt eine Klonierstrategie zweier infektiöser TMV-U1-Vektoren, die IRES_MP,75 ^CR-GUS bzw.
Fig. 29	zeigt Vektoren SP6/TMV-U1/IRES_MP,75 ^CR-GUS, SP6/TMV-U1/IRES_MP,75 ^U1-eGFP.
Fig. 30	zeigt eine Klonierstrategie für die SP6/TMV-U1/GUS-Vektoren, die eine IRES pflanzlichen Ursprungs (NtHSF) bzw. eine künstliche IRES ((GAAA)×16) enthalten.
Fig. 31	zeigt die Ergebnisse einer GUS-Expression von den viralen Vektoren SP6/TMV-U1/ IRES_MP,75 ^CR-GUS, SP6/TMV-U1/NtHSF-GUS und SP6/TMV-U1/(GAAA)×16-GUS.

DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das vorrangige Ziel dieser Erfindung ist die Etablierung einer neuen Strategie zur Konstruktion von amplifikationsbasierten Vektoren für die Expression von fremden (heterologen, nicht-nativen) Genen, so dass die Translation dieser Gene durch einen IRES-vermittelten, CAP-unabhängigen Mechanismus, des internen Ribosomeneintritts von polycistronischen genomischen Virus-RNAs und/oder bi- und multicistronische sgRNAs, die von einem Amplifikationsvektor produziert werden, elreicht. Vorzugsweise sollen diese von viralen Vektoren in einer Pflanzenzelle erfolgt.
Die Konstruktion von rekombinanten pflanzenviralen RNAs und die Herstellung von Amplifikationsvektoren für die Einführung und Expression von fremden Genen in Pflanzen wurde bereits von zahlreichen Autoren gezeigt, die zu diesem Zweck die Genome von verschiedenen taxonomischen Virus-Gruppen verwendeten (Review, siehe „Genetic Engineering With Plant Viruses", 1992, eds. Wilson and Davies, CRC Press, Inc.). Als geeignete Gruppe für die Konstruktion von viralen Vektoren wurden dabei die Tobamoviren angesehen. Donson et al.
( U.S. Patents Nos. 5,316,931 ; 5,589,367 und 5,866,785 ) erfanden TMV-basierende Vektoren, mit deren Hilfe man verschiedene fremde Gene in einer Wirtspflanze exprimieren konnte. So wurden auf diese Weise das Neomycin-Phosphotransferase-Gen, das α-Trichosantin-Gen und mehrere andere fremde Gene angrenzend zu dem subgenomischen Promotor (sgPR) des TMV-Hüllprotein-Gens inseriert. Donson et al., (1993, PCT WO 93/03161 ) entwickelten auf der Basis eines Tobamoviruses „eine rekombinante Pflanzenvirus- Nukleinsäure, die einen nativen, subgenomischen Pflanzenvirus-Promotor, wenigstens einen nicht-nativen, subgenomischen Pflanzenvirus-Promotor und die kodierende Sequenz eines Pflanzenvirus-Hüllproteins umfaßte. Der erwähnte nicht native, subgenomische Pflanzenvirus-Promotor ist dabei in der Lage, die Transkription der angrenzenden Nukleinsäuresequenz in einer Wirtspflanze zu initiieren, wobei er nicht mit subgenomischen Promotoren der rekombinanten Pflanzenvirus-Nukleinsäure rekombiniert. Die erwähnte Pflanzenvirus-Nukleinsäure kann eine systemische Infektion einer Wirtspflanze hervorrufen".
Im Gegensatz zu der Technologie von Donson et al., bezieht sich die vorgelegte Erfindung nicht auf subgenomische Promotoren (sgPRs), mit deren Hilfe auf viralen Replikons basierende Pflanzenexpressionssysteme konstruiert werden. Statt sgPRs benutzt unsere Technologie IRES-Sequenzen (für den Virus native oder nicht native) verschiedensten Ursprungs, die effektiv keine sgPR-Aktivität aufweisen, d. h. sie sind effektiv nicht in der Lage, die Produktion von sgRNAs zu initiieren. Deshalb sollten diese IRES-Squenzen nicht als sgPRs angesehen werden, obwohl sie in manchen Fällen nichtfunktionale Segmente von sgPRs darstellen.
Es wird im allgemeinen angenommen, daß nach in vitro Transkription erhaltene voll-Länge Virus-RNA, die nicht mit einer CAP-Gruppe versehen ist, nicht infektiös für intakte Pflanzen und isolierte Protoplasten ist. Aus diesem Grund wird die Modifizierung eines RNA-Transkripts mit einer CAP-Gruppe ausgehend von einen viralem Vektor generell als Voraussetzung dafür angesehen, daß ein in vitro Transkript infektiös ist. Getappte (capped) RNA-Transkripte werden normalerweise benutzt, um virale Vektor-RNA in Pflanzen einzubringen. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, daß in einigen Fällen virale RNA mit Hilfe einer einfachen Prozedur in vitro durch Hüllproteine verpackt werden kann. Auf diese Weise können ausgehend von Hüllpropteinen und in vitro Transkripten oder von aufgereinigter, authentischer viraler RNA sowohl TMV-Virione als auch Pseudovirione, die Vektor-RNA enthalten, leicht hergestellt werden. Vor fünfzehn Jahren konnte von Meshi et al. (1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 5043–5047) gezeigt werden, daß in einem in vitro Ansatz ohne CAP-Analoge hergestellte, ungeschützte (uncapped) Transkripte der voll-Länge TMV-RNA infektiös waren, wobei deren spezifischer Infektionsgrad sehr gering war.
In der vorliegenden Erfindung kann ungecappte (uncapped) Expressionsvektor-RNA, die mit TMV-Hüllprotein verpackt ist, für Pflanzeninokulierungen benutzt werden, um den geringen Infektionsgrad zu kompensieren. Wenigstens eine der zusätzlichen Strategien, die in dieser Erfindung beschrieben werden, eröffnet eine technische Möglichkeit für Pflanzeninfektionen mit einem CAP-unabhängigen viralen Pflanzen-Vektor. Dies ist die Methode der Insertion einer voll-Länge Einzelstrang-(ss)DNA-Kopie eines viralen Vektors unter der Kontrolle eines geeigneten DNA-Promotors. Nach der Inokulation einer Wirtspflanze mit einer rekombinanten Virus-DNA wird die infektiöse voll-Länge RNA des viralen Pflanzenvektors produziert. Diese ist in der Lage, sich zu replizieren und sich in der Pflanze auszubreiten.
Die Tatsache der CAP-unabhängigen Expression von fremden Genen mit Hilfe der IRES-Sequenzen, sowie die genannten Prozeduren machen somit die Prozesse der Pflanzen-inokulation und der Expression eines fremden Gens gänzlich CAP-unabhängig.
Ein wichtiges und bevorzugtes Ziel der vorlegenden Erfindung ist die Entwicklung einer Serie von viralen Vektoren, die auf dem crTMV-Genom basieren und in denen der „IRES-Fremdgen"-Block zwischen dem Hüllprotein und dem 3'-NTR inseriert ist. Zahlreiche IRES- und Kontrollsequenzen wurden in Kombination mit zwei verschiedenen Reportergenen (GUS und GFP) verwendet (siehe 2). Ein einzigartiger Aspekt dieser Erfindung liegt darin, daß fremde Gene, die ausserhalb der viralen sgPR-Sequenzen liegen, in infizierten Pflanzen CAP-unabhängig vom 3'-proximalen Ende der genomischen RNAs und sgRNAs, die wiederum von dem Vektor produziert werden, exprimiert werden. Insbesondere die IRES_MP,75 ^CR-Sequenz, die den 3'-terminalen Teil der 5'-nicht translatierten Präsequenz (leader sequence) der crTMV-I₂ sgRNA repräsentiert, vermittelte in Pflanzen, die mit dem viralen Vektor infiziert wurden, effizient die CAP-unbhängige Expression des 3'-proximalen Fremdgens. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß erwähnte, auf dem crTMV basierende virale Vektoren drei verschiedene Arten der viralen, plus-sense ssRNAs in infizierten Pflanzen prodzieren: i) voll-Länge genomische RNA, ii) tricistronische I₂ sgRNA (unsere Daten zeigen, daß die spätere sgRNA im Gegensatz zu der voll-Länge RNA nicht gecappte (uncapped) ist) und iii) bicistronische sgRNA, die das erste Hüllprotein-Gen und das zweite Fremdgen enthält. Aus diesem Grund sind all diese RNAs 3'-coterminal, und die CAP-unabhängige Translation des dem 3'-Ende nächstgelegenen Gens wird mit Hilfe der vorangestellten IRES-Sequenz vermittelt. Dabei liegt diese RNAs entweder als geschützte (capped, voll-Länge oder bicistronisch) oder nicht geschützte (uncapped, tricistronisch) RNA vor.
Eine wichtige Eigenschaft der viralen Vektoren ist deren Stabilität. Die auf dem TMV-basierenden Vektoren, die Fremdgene enthalten, verbreiten sich jedoch gewöhnlich nicht effizient innerhalb des Phloems von Pflanzen, die normalerweise systemisch von Wildtyp-Viren infiziert werden. Dies kann zum einen durch die große Länge der rekombinanten, viralen RNA und/oder durch die Anwesenheit von sich wiederholenden Sequenzen, die zu Rekombinationen bzw. Deletionen führen können, woraus letztendlich eine Reversion zum Wildtyp-Virus resultiert, erklärt werden. Die Umwandlung der nachfolgenden Population zu Wildtyp-Viren tritt dann in systemisch infizierten Blättern auf. Eine Möglichkeit, solche Rekombinationen zu unterdrücken, ist die Verwendung von Sequenzelementen verschiedener Herkunft wie z. B. viraler Herkunft (siehe Beispiel 13). Eine weitere wichtige Eigenschaft der viralen Vektoren ist das Niveau der Genexpression der Fremdgene und die Akkumulation des entsprechenden Proteins. Der Vektor erzielt im Fall des GUS-Proteins Banden, die ohne weiteres mit Hilfe einer SDS-PAGE sichtbar sind.
Die Technologien, die sich für die Konstruktion von amplifikationsbasierten Vektoren für die Expression von fremden Sequenzen in Wirtspflanzen geeignet sind, sind auf der Basis von verschiedenen viralen Genomen entwickelt worden (z. B. siehe G. Della-Cioppa et al., 1999, PCT WO 99/36516 ). Die zentrale Eigenschaft von solchen Erfindungen war, dass die rekombinante pflanzenvirale Nukleinsäure „eine oder mehrere nicht native subgenomische Promotoren enthält, die in der Lage sind, die angrenzenden Nukleinsäuresequenzen in Wirtspflanzen zu transkribieren bzw. zu exprimieren. Die rekombinanten pflanzenviralen Nukleinsäuren können weiter modifiziert werden, um die gesamte oder Teile der kodierenden Sequenz des nativen Htillproteins zu deletieren, so daß man eine nicht-nativ kodierende Htillproteinsequenz unter der Kontrolle eines nativen Promotors oder eines der nicht nativen pflanzenviralen subgenomischen Promotoren erhält. Oder die native Hüllproteinsequenz wird unter die Kontrolle eines nicht nativen pflanzenviralen subgenomischen Promotors gestellt". In anderen Worten ausgedrückt, stellt oder stellen die nativen und nicht nativen sgPR-Sequenzen, die für die Herstellung von künstlichen sgRNAs mit Hilfe der viralen Vektoren benutzt wurden, die wichtigsten Element(e) dieser Erfindung dar. Eine wichtige Eigenschaft, die unsere Erfindung von anderen unterscheidet, ist, dass gemäß WO 99/36516 das fremde Gene zwangsläufig stromab (downstream) der sgPR-Sequenzen lokalisiert sein muss, d. h. sie sollte am 5'-proximaler Position der chimären sgRNA, die von dem viralen Vektor in den Wirtspflanzen produziert wird, lokalisiert sein. Im Gegensatz dazu schlägt unsere Erfindung vor, daß das fremde Gen von einen sgPR (wenn vorhanden) wenigstens durch ein (oder mehrere) virale Gen(e) getrennt ist, so daß das fremde Gen 3'-proximal oder innerhalb der aktiven, chimären sgRNA, die von dem Vektor produziert wird, lokalisiert ist. So wird auf diese Weise die Fremdgenexpression durch eine native oder nicht native IRES-Sequenz vermittelt.
Das nächste bevorzugte Ziel dieser Erfindung ist die Konstruktion eines neuen Typs der nicht nativen IRES-Sequenzen, der sogenannten künstlichen, nicht natürlichen, synthetischen IRES-Sequenzen, die in der Lage sind, eine CAP-unabhängige Translation 5'-distaler Gene von eukaryotischen, polycistronischen mRNAs zu vermitteln. Wir zeigen, daß intercistronische Spacer, die komplementär zu der 18S rRNA verschiedener Länge und Zusammensetzung sind, in der Lage sind, die CAP-unabhängige Translation des 3'-proximalen GUS-Gens in bicistronischer H-GFP-IRES-GUS mRNA zu vermitteln (13). Weitherin wird die Genexpression unter Translationskontrolle eines künstlichen IRES-Elements mit einem hohen Adeninnukleotidgehalt anhand eines IRES-Elements, das aus 16 Kopien des GAAA-Segments besteht, gezeigt (Beispiel 14).
Ferner stellt die Möglichkeit, Wiederholungen von zwei oder mehreren fremden Genen, denen jeweils eine native oder nicht native IRES-Sequenz in dem amplifikationsbasierten Vektorgenom vorangeht, zu kombinieren, einen Vorteil der vorliegenden Erfindung dar. Die Expression einer solchen Kassette eines „IRES-Fremdgens" wird die gleichzeitige Produktion von zwei oder mehreren fremden Proteinen mit Hilfe des Vektors ermöglichen. Viren, die zu verschiedenen taxonomischen Gruppen gehören, können zur Konstruktion von viralen Vektoren gemäß den Prinzipien dieser Erfindung genutzt werden. Das gilt sowohl für RNA- als auch für DNA-Viren, für die im folgenden Beispiele gegeben werden (durchlaufend ist in diesem Dokument jedem Artspeziesnamen der Name der Ordnung, der Familie und der Gattung, zu dem dieser gehört, vorangestellt. Namen der Ordnungen, Familien und Gattungen sind in kursiv gesetzt, wenn sie von der ICTV bestätigt sind. Namen der Taxa in Anführungszeichen (und nicht in kursiv gesetzt) zeigen an, daß dieses Taxon keinen von der ICTV international bestätigten Namen hat. Trivialnamen der Spezies sind in normaler Schreibweise aufgeführt. Viren mit keiner formalen Zuordnung zu einer Gattung oder Familie sind angezeigt):
DNA-Viren:
Zirkuläre dsDNA-Viren:

Familie: Caulimoviridae, Gattung: Badnavirus, Artspezies: commelina yellow mottle virus, Gattung: C'aulimovirus, Artspezies: cauliflower mosaic virus, Gattung: „SbCMV-ähnliche Viren", Artspezies: Soybean chloroticmottle virus, Gattung: „CsVMV-ähnliche Viren", Artspezies: Cassava vein mosaicvirus, Gattung: „RTBV-ähnliche Viren", Artspezies: Rice tungro bacilliformvirus, Gattung: „Petunia vein clearing-like vires", Artspezies: Petunia vein clearing virus;

Zirkulare ssDNA-Viren:

Familie: Geminiviridae, Gattung: Mastrevirus (Untergruppe I Geminivirus), Artspezies: maize streck virus, Gattung: Curtovirus (Untergruppe II Geminivirus), Artspezies: beet curly top virus, Gattung: Begomovirus (Untergruppe III Geminivirus, Artspezies: bean golden mosaic virus;

RNA-Viren:
ssRNA-Viren:

Familie: Bromoviridae, Gattung: Alfamovirus, Artspezies: alfalfa mosaic virus, Gattung: Ilarvirus, Artspezies: tobacco streck virus, Gattung: Bromovirus, Artspezies: brome mosaic virus, Gattung: Cucumovirus, Artspezies: cucumber mosaic virus;
Familie: Closeroviridae, Gattung: Closterovirus, Artspezies: beet yellow virus, Gattung: Crinivirus, Artspezies: Lettuce infectious yellows virus,
Familie: Comoviridae, Gattung: Comovirus, Artspezies: cowpea mosaic virus, Gattung: Fabavirus, Artspezies: broad bean wilt virus 1, Gattung: Nepovirus, Artspezies: tobacco ringspot virus;
Familie: Potyviridae, Gattung: Potyvirus, Artspezies: potato virus Y, Gattung: Rynmovirus, Artspezies: ryegrass mosaic virus, Gattung: Bymovirus, Artspezies: barley yellow mosaic virus;
Familie: Sequiviridae, Gattung: Sequivirus, Artspezies: parsnip yellow fleck virus, Gattung: Waikavirus, Artspezies: rice tungro spherical virus;
Familie: Tombusviridae, Gattung: carmovirus, Artspezies: carnation mottle virus, Gattung: Dianthosvirus, Artspezies: carnation ringspot virus, Gattung: Machlomovirus, Artspezies: maize chlorotic mottle virus, Gattung: Necrovirus, Artspezies: tobacco necrosis virus, Gattung: Tombusvirus, Artspezies: tomato bushy stunt virus;

Nicht zugeordnete Genera der ssRNA-Viren:

Gattung: Capillovirus, Artspezies: apple stem grooving virus, Gattung: Carlavirus, Artspezies: carnation latent virus, Gattung: Enamovirus, Artspezies: pea enation mosaic virus, Gattung: Furovirus, Artspezies: soil-borne wheat mosaic virus, Gattung: Hordeivirus, Artspezies: barley stripe mosaic virus, Gattung: Idaeovirus, Artspezies: raspberry bushy dwarf virus, Gattung: Luteovirus, Artspezies: barley yellow dwarf virus, Gattung: Marafivirus, Artspezies: maize rayado find virus, Gattung: Potexvirus, Artspezies: potato virus X,Gattung: Sobemovirus, Artspezies: Southern bean mosaic virus, Gattung: Tenuivirus, Artspezies: rice stripe virus, Gattung: Tobamovirus, Artspezies: tobacco mosaic virus, Gattung: Tobravirus, Artspezies: tobacco rattle virus, Gattung: Trichovirus, Artspezies: apple chlorotic leaf spot virus, Gattung: Tymovirus, Artspezies: turnip yellow mosaic virus, Gattung: Umbravirus, Artspezies: carrot mottle virus;

Negative ssRNA-Viren:

Ordnung: Mononegavirales, Familie: Rhabdoviridae, Gattung: Cytorhabdovirus, Artspezies: lettuce necrotic yellows virus, Gattung: Nucleorhabdovirus, Artspezies: potato yellow dwarf virus; Familie: Bunyaviridae, Gattung: Tospovirus, Artspezies: tomato spotted wilt virus;

DsRNA Viren:

Familie: Partitiviridae, Gattung: Alphacryptovirus, Artspezies: White clover cryptic virus!, Gattung: Betacrvptovirus, Artspezies: White clover cryptic virus 2,
Familie: Reoviridae, Gattung: Fijivirus, Artspezies: Fiji disease virus, Gattung: Phytoreovirus, Artspezies: wound tumor virus, Gattung: Oryzavirus, Artspezies: rice ragged stunt virus;

Nicht zugeordnete Viren:

Genom ssDNA: Spezies banana bunchy top virus, Spezies: coconut foliar decay virus, Spezies subterranean clover stunt virus,
Genom dsDNA: Spezies cucumber vein yellowing virus,
Genom dsRNA: Spezies tobacco stunt virus,
Genom ssRNA, Spezies Garlic viruses A, B, C, D, Spezies grapevine fleck virus, Spezies maize White line mosaic virus, Spezies olive latent virus 2, Spezies ourmia melon virus, Spezies Pelargonium zonate spot virus;

Satelliten und Viroide:

Satelliten: ssRNA Satelliten Viren: Untergruppe 2 Satellitenviren, Artspezies: tobacco necrosis satellite, Satelliten RNA, Untergruppe 2 B Typus mRNA Satelliten, Untergruppe 3 C Typus lineare RNA Satelliten, Untergruppe 4 D Typus zirkuläre RNA Satelliten, Viroide, Artspezies: potato spindle tuber viroid.

Insbesondere können die Methoden der vorliegenden Erfindung vorzugsweise für die Konstruktion von viralen replikonbasierten Vektoren angewendet werden, indem die rekombinanten Genome der plus sense ssRNA-Viren, die vorzugsweise zu der Gattung Tobamovirus oder zu der Familie Bromoviridae oder Potyviridae aber auch zu den DNA-enthaltenen Viren gehören, eingesetzt werden. Im letzteren Fall sollte das fremde Gen möglichst abwärts (downstream) eines viralen Gens lokalisiert sein, so daß dessen Expression mit Hilfe der IRES-Sequenz von einer bicistronischen oder polycistronischen mRNA, die von einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase mit Hilfe eines genomischen Promotors transkribiert wurde, vermittelt werden kann.
Die Methoden dieser Erfindung können für die Konstruktion von auf ssDNA-basierenden Vektoren angewandt werden. Die auf dem Geminivirus basierenden Vektoren, die das fremde Gen bzw. die fremden Gene unter der Kontrolle einer IKES-Sequenz exprimieren, können für diesen Aspekt als Beispiel dienen. Die Geminiviren repräsentieren eine Gruppe von Pflanzenviren mit einer einteiligen (monopartite) oder zweiteiligen (bipartite), zirkulären ssDNA, die gepaarte quasi-icosahedrale Partikel hat (Übersichtsartikel siehe Hull und Davies, 1983, Adv. Virus Res. 28, 1–45; Mullineaux et al., 1992, „Genetic engineering with plant viruses", Wilson und Davies, Hrsg., 1992, CRC Press, Inc.). Die zwei ssDNA-Komponenten des zweiteiligen (bipartite) Geminivirus werden als A und B bezeichnet und kodieren für 4 bzw. 2 Proteine. Die DNA A enthält das Hüllproteingen und drei weitere Gene, die an der Replikation der DNA beteiligt sind. Im Gegensatz dazu kodiert die DNA B für zwei Proteine, die für die Ausbreitung des Virus essentiel sind. Es konnte gezeigt werden, daß die Genome von zweiteiligen (bipartite) Geminiviren, die zur Gattung Begomovirus gehören wie der tomato golden mosaic virus (TGMV) und der bean golden mosaic virus (BGMV), replizieren und sich trotz einer Deletion im Hüllproteingen innerhalb einer bestimmten Wirtspflanze ausbreiten können (Gardiner et al., 1988, EMBO J. 7, 899–904; Jeffrey et al., 1996, Virology 223, 208–218; Azzam et al., 1994, Virology 204, 289–296). Es ist bemerkenswert, daß einige Begomoviren einschließlich des BGMV eine Phloem-Limitierung aufweisen und auf die Zellen des vaskulären Systems beschränkt sind. Somit bleibt der BGMV phloemlimitiert, während der TGMV in der Lage ist, in das Mesophyllgewebe von systemisch infizierten Blättern einzudringen (Petty und Morra, 2000, Abstracts of 19^1h Annual meeting of American Society for Virology, S. 127).
Es wird hier vorgeschlagen, das fremde Gen auf zwei Wegen in ein zweigeteiltes (bipartite) Geminivirus-Genom einzufügen: (i) stromabwärts (downstream) von einem der Gene (z. B. im Fall des BGMV), insbesondere abwärts (downstream) des Hüllproteingens, so daß das offene Leseraster des Hüllproteins intakt oder vom 3'-Ende verkürzt wird, und die IKES-Sequenz wird aufwärts (upstream) des fremden Gens eingefügt. Folglich kann die mRNA-Transkription von dem nativen DNA-Promotor ablaufen, wobei eine bicistronische, chimäre mRNA erzeugt wird, die das erste virale Gen (oder einen Teil hiervon), die IRES-Sequenz und das 3'-proximale fremde Gen umfasst, dessen Expression durch die IRES-Sequenz vermittelt wird. Alternativ (ii) kann die voll-Länge DNA-Kopie des RNA-Genoms des viralen Vektors in die DNA eines Hüllprotein-defizienten, zweiteiligen (bipartite) Geminivirus unter die Kontrolle des Hüllproteingen-Promotors inseriert werden. Das RNA-Genom des RNA-Vektor-Virus wird dann als Resultat der Transkription der DNA A in der Pflanzenzelle, die mit einer Mischung der rekombinanten DNA A und nicht modifizierter DNA B inokuliert wurde, erzeugt. Ein Vorteil dieser Methode liegt darin, daß der Geminivirus-Vektor nur als ein Vehikel benutzt wird, um den Vektor zu den primär inokulierten Zellen zu bringen. Alle anderen Schritte werden von einem Tobamovirus-Vektor selbst durchgeführt. Dies umfaßt die Erzeugung der IRES-tragenden Vektor-RNA, nachdem die Geminivirus-Vektor-DNA mit Hilfe einer zellulären RNA-Polymerase transkribiert wurde, ihre Replizierung, Translation, die systemische Verbreitung innerhalb der Wirtspflanze und die Fremdgenexpression.
Als eine zusätzliche Möglichkeit für die Herstellung eines ssDNA-Vektors kann die Klonierung der viralen cDNA und des fremden Gens in einen Phagemid-Vektor mit anschließender Erzeugung der ssDNA nach Standardmethoden angegeben werden.
Wenn man in Betracht zieht, daß vom Tobamovirus abgeleitete IRES-Sequenzen auch in tierischen Zellen funktional aktiv sind (unsere vorhergehende Patentanmeldung), kann die Methode der vorliegenden Erfindung für die Herstellung von rekombinanter, viraler RNA und von viralen Vektoren auf der Basis von tierischen Viren wie z. B. der Viren, die zu den Familien Togaviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Picornaviridae, Flaviviridae gehören, benutzt werden. Auf diese Weise werden neue Vektoren erzeugt, die fremde Gene unter der Kontrolle von IRES-Sequenzen, die von Pflanzenviren abgeleitetet sind, exprimieren. Solche auf tierischen Viren basierende Vektoren für Pflanzen und Tiere können nützlich bei der Impfstoffherstellung oder für die Gentherapie sein. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, daß die stabförmigen Virionen der Tobamoviren und besonders die flexiblen und langen Virionen der filamentösen Potexviren, Carlaviren, Potyviren und Closteroviren die besten Modelle für die Realisierung der Methoden dieser vorliegenden Erfindung darstellen. In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung wird die IRES-Sequenz in der Art verwendet, daß die viralen Amplifikationsvektoren innerhalb des 5'-NTR die IRES-Sequenz enthalten. Es wird dabei angenommen, daß die Insertion einer IRES-Sequenz nicht die virale Replikation verhindert, sondern in der Lage ist, eine effiziente CAP-unabhängige Translation der Transkripte der genomischen Vektor-RNA sicherzustellen. Deswegen könnte das Konstrukt folgendes umfassen: (i) Ein IRES-Element innerhalb oder abwärts (downstream) der 5'-untranslatierten Leader-Sequenz, die nativ oder nicht-nativ für den virlen Vektor ist und die eine CAP-unabhängige Translation des viralen 5'-proximalen Gens (RdRp-Gen) vermittelt; des weiteren (ii) wenigstens eine native oder nicht-native IRES-Sequenz, die abwärts (downstream) von einem oder mehreren viralen Strukturgenen und aufwärts (upstream) des fremden Gens bzw. der fremden Gene lokalisiert ist, um deren CAP-unabhängige Translation zu vermitteln. Gemäß dieser Methode wird der spezifische Infektionsgrad des ungecappten (uncapped) voll-Länge Vektortranskripts auf Grund der effizienten 5'-IRES vermittelten Translation der elterlichen RNA Moleküle in den ersten inokulierten Zellen erhöht.
Ein anderes bevorzugtes Ziel der vorliegenden Erfindung ist eine Methode, ein oder mehrere gewünschte Protein(e) in Pflanzenzellen auf der Basis der Einführung und der CAP-unabhängigen (uncapped) Expression eines fremden Gens von einer mono- oder polycistronischen mRNA Sequenz zu produzieren, die durch eine pflanzenspezifischen IRES-Sequenz, die aufwärts (upstream) der Fremdgen-Sequenz lokalisiert ist, vermittelt wird. Eine besondere Eigenschaft dieser Methode liegt darin, daß die Technologie eine Prozedur beinhaltet, die die selektive Abschaltung der zellulären CAP-abhängigen mRNA-Translation mittels bestimmter chemischer Verbindungen erlaubt. Diese Prozedur beeinflusst jedoch nicht die CAP-unabhängige IRES-vermittelte Translation von mRNAs, die künstlich in die Pflanzenzellen eingeführt wurden. Auf diese Weise wird die Kontrolle und die Verstärkung der CAP-unabhängigen Expression erreicht.
Alternativ kann die Inhibierung der Translation der zellulären getappten (capped) RNA auf Pflanzen angewendet werden, die mit dem viralen Vektor selbst infiziert wurden, der das Fremdgen bzw. die Fremdgene in einer CAP-unabhängigen Weise exprimiert. Bedingungen, die die Translation der zellulären, getappten (capped) RNA unterdrücken, ermöglichen die selektive Expression des(r) Fremdgens(e) mit Hilfe des Virus-Vektors.
Der Vektor dieser Erfindung kann ein RNA- oder DNA-Vektor sein. Er kann ss(+), ss(-) oder ds sein. Er kann irgendeine Art der Amplifikation, die von Viren bekannt sind, zeigen. Dies beinhaltet die Multiplikation der Vektor-Nukleinsäure, optional die Erzeugung des Hüllproteins und optional die Erzeugung von Proteinen, die für die Ausbreitung von einer Zelle zu der anderen Zelle oder für die Ferndistanzausbreitung (long distance mnovement) benötigt werden. Die Gene, die für die Replikation und/oder die Umhüllung und/oder für die Ausbreitung notwendig sind, können ganz oder teilweise in entsprechend veränderten Wirtspflanzen exprimiert werden. Auf diese Weise wird ein System geschaffen, das aus einem Vektor und einer Wirtspflanze besteht, die wechselseitig aufeinander angepasst sind.
Der Vektor kann durch Modifizierungen von einem Virus abgeleitet oder de novo synthetisiert werden. Er kann nur IRES-Elemente enthalten, die keine subgenomsiche Aktivität aufweisen. Der Vektor kann jedoch einen oder mehrere subgenomische Promotoren mit einem oder mehreren IRES-Elementen, die effektiv keine subgenomische Promotoraktivität ausfweisen, kombinieren, so daß die Anzahl der Cistrone größer als die Anzahl der Promotoren ist.
Wenn man den einfachsten Fall mit einem IRES-Element betrachtet, kann dieses Element aufwärts (upstream) von dem gewünschten (fremden) Gen lokalisiert sein, so daß es von dem IRES-Element direkt exprimiert wird. Oder das IRES-Element wird optional abwärts (downstream) von einem (viralen) Gen lokalisiert, so daß dieses IRES-unabhängig exprimiert wird. Alternativ kann das gewünschte Gen auch aufwärts (upstream) von einem IRES-Element lokalisiert sein und IRES-unabhängig exprimiert werden, und das IRES-Element dient dann zur Expression eines viralen Gens, das abwärts (downstream) davon lokalisiert sind. Diese einfachen Fälle können natürlich einfach oder mehrmals in einen komplexeren Vektor verwirklicht werden.
Der Vektor kann eine Sequenz in antisense Orientierung enthalten, um die Expression eines Wirtsgens zu unterdrücken. Diese Funktion der Suppression kann alleine oder in Kombination mit der Expression eines gewünschten fremden Gens existieren. Ein besonders bevorzugter Fall beinhaltet die Suppression eines Gens, das essentiell für die CAP-abhängige Translation ist. Als Beispiele können Gene für einen Translationsinitiationsfaktor wie z. B. dem elF4-Initiationsfaktor angesehen werden, der mit der CAP-abhängigen Translation verknüpft ist, so dass die Translationsmaschinerie in der Wirtspflanze nur noch der Vektortranslation dient. In diesem Fall muss die Translation der Vektor-RNA gänzlich CAP-unabhängig sein. Natürlich kann der Vektor auch in einer Pflanzenzelle von einem Vor-Vektor (Pro-vektor) durch die pflanzliche Nukleinsäureprozessierungsmaschinerie, wie z. B. dem Intron-Splicing, erzeugt werden.
Es ist möglich, das Expressionniveau eines fremden oder viralen Gens, das über ein IRES exprimiert wird, zu erhöhen durch Inhibierung des posttranskriptionalen Gen-Silencings (PTGS). Eine Möglichkeit besteht in der Coexpression von sogenannten Anti-Silencing Proteinen zusammen mit dem gewünschten Protein (z. B. HC-Pro aus tobacco etch virus oder das 19K Protein, das vom tomato bushy stunt virus kodiert wird, siehe Kasschau and Carrington, 1998, Cell, 95, 461–470; Voinnet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, n24, 14147–14152. Inhibitoren des PTGS können entweder stabil (transgene Pflanze) oder transient (viraler Vektor, Agroinokulation) exprimiert werden.
Proteine, die von IRES-basierten Vektoren exprimiert werden, können auch mittels posttranslationaler Modifikationen, die von einer Wirtspflanze unterstützt werden, wie Glycosylierung, proteolytischer Spaltung und anderen modifiziert werden.
Das IKES-Element kann aus einem Pflanzenvirus stammen. Alternativ hierzu kann es auch aus irgendeinem Virus stammen, solange es den funktionalen Bedürfnissen in der Pflanzenzelle genügt. Weiterhin kann ein IRES-Element, das in einer Pflanzenzelle wirksam ist, synthetisch oder künstlich sein. Die Synthese kann sich hierbei an die Sequenz der 18S rRNA der Wirtspflanze anlehnen, nämlich das für die IRES-Bindung operative Segment. Dieses sollte ausreichend komplementär sein. Ausreichende Komplementarität kann leicht durch Testen auf IRES-Funktionalität verfolgt werden. Komplementär bezieht sich in diesen Zusammenhang auf die GC-, die AU- und im weiteren Sinne auf die GU-Basenpaarung. Weiter können solche IRES-Elemente Multimere von diesen komplementären Sequenzen sein, um die Effizienz zu erhöhen. Das Multimer kann aus identischen bzw. unterschiedlichen, komplementären Sequenzeinheiten bestehen. Darüber hinaus können künstliche IRES-Elemente mit hoher Translationseffizienz und effektiv keiner subgenomischen Promotoraktivität auch mit Hilfe des Prozesses der gezielten Evolution – wie in den Patenten US 6,096,548 oder US 6,117,679 beschrieben – erzeugt werden. Dieses kann mit einer Population von Vektoren, die randomisierte IRES-Sequenzen enthalten, in Zellkulturen umgesetzt werden. Die Klone, die ein Reportergen exprimieren, das funktional mit einem potentiellen IRES-Element verknüpft ist, können auf bekannte Weise selektiert werden. Von diesen wiederum werden. diejenigen eliminiert, die eine subgenomische Promotoraktivität ausfweisen. Weitere Runden der Randomisierung und Selektion können folgen.
Das IRES-Element des Vektors dieser Erfindung kann effektiv ohne Promotoraktivität sein. Das bedeutet, daß die Expression eines Gens, das funktional mit einem IRES-Element verknüpft ist, nicht durch eine restliche subgenomische Promotoraktivität auftritt. Diese Wirkungsweise kann mit Hilfe von Standardmethoden der Molekularbiologie wie dem Northern-Blot, der Primer-Verlängerung (Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. F. Ausubel et al., 1999, John Wiley & Sons), der 5' RACE-Technologie (Gibco BRL, USA) und ähnlichen Methoden bestimmt werden. Es sollte hinzugefügt werden, daß IRES-Elemente, die detektierbare subgenomische Promotoraktivität aufweisen aber im wesentlichen als translationale denn als transkriptionale Elemente operieren, auch Gegenstand dieser Erfindung sind. Diese Unterscheidung könnte zum Beispiel mit Hilfe der quantitativen Messung der relativen Mengen von zwei Arten von mRNAs (der kurzen mRNA und der langen mRNA) in Northern-Analysen erreicht werden, wobei die kurze mRNA mit Hilfe von subgenomischer Promotoraktiviät und die lange mRNA ohne subgenomische Promotoraktiviät erzeugt wird. Wenn das IRES-Element nicht im wesentlichen als ein viraler subgenomischer Promotor agiert, sollte die relative Menge der korrespondierenden kurzen RNA kleiner als 20%, vorzugsweise kleiner als 10% und am besten kleiner als 5% der Summe der kurzen und langen mRNA sein.
Somit stellen wir bevorzugt einen Vektor bereit, der in der Lage ist, in einer Pflanze ein Gen zu amplifizieren, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die eine Sequenz für wenigstens ein nicht-virales Gen und ein IRES-Element ist oder dafür kodiert, das für die Translation des Gens in der Pflanze notwendig ist, wobei die Expression dieses Gens leitet sich dabei im wesentlichen von den translationalen als von den transkriptionalen Eigenschaften des IRES-Elementes ab, was mit Standard Prozeduren der Molekularbiologie nachgewiesen werden kann.
Die neuen Vektoren, die in der Erfindung verwendet werden, eröffnen neue Wege für die genetische Modifikation von Pflanzen. Als eine der ersten Möglichkeiten schlagen wir den Gebrauch dieser Vektoren für die Bestimmung der Funktion eines Strukturgens in Pflanzen vor. Dieses ist von beträchtlichem Interesse für die Genomforschung (Genomics). Deswegen ist eine Pflanze, deren Genom sequenziert wurde, von speziellem Interesse. Dies ist eine Anwendung in einem kleinem Maßstab (Pflanze für Pflanze). Der Vektor dieser Erfindung ist sehr wirkungsvoll für diese Applikation, weil er die Unterdrückung (Suppression) von gewünschten Genen und/oder die Überexpression von Genen erlaubt, um die Genfunktionen, die effizient aufgeklärt werden soll, zu ermitteln.
In einer Großanwendung kann der Vektor benutzt werden, um eine Eigenschaft oder ein Protein in einer Wirtspflanze zu erzeugen. Infektionen von Pflanzen mit dem Vektor können auf einer landwirtschaftlichen Fluche durchgeführt werden, auf der zuvor nicht modifizierte Pflanzen angezogen worden sind. Dieses erlaubt zum ersten Mal eine genetische Modifizierung von Feldpflanzen, wobei der Landwirt größte Freiheiten in der Selektion aus einer Vielfalt von Samen und Vektoren hat, um eine gewünschtes Protein oder Eigenschaft zu erzeugen.
Beispiele für gewünschte Pflanzenspezies für diese Anwendung sind monokotyle Pflanze wie Weizen, Mais, Reis, Gerste, Hafer, Hirse und ähnliche oder dikotyle Pflanzen wie Rapssaat, Canola, Zuckerrübe, Sojabohne, Erbse, Luzern, Baumwolle, Sonnenblume, Kartoffel, Tomate, Tabak und ähnliche.
Im Folgenden wird die Erfindung weiter anhand von Beispielen beschrieben. Molekularbiologische Standardtechniken wurden gemäß Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) durchgeführt. Alle Plasmide, die in der Erfindung benutzt werden, können gemäß den Anweisungen dieser Beschreibung von einer Person mit durchschnittlicher Qualifikation mit normalen, experimentellen Hilfsmitteln hergestellt werden.
BEISPIEL 1
Konstruktion eines Tobamovirus-Vektors zur Infektion von Pflanzen aus der Familie der Kruziferen
Virione eines bekannten Tombaviruses, der Crucifer-Tombavirus (crTMV) genannt wird und der in der Lage ist, Kreuzblütler systemisch zu infizieren, wurden von Olearacia. officinalis L.-Pflanzen, die Mosaik-Symptome auswiesen, isoliert. Die Resultate der Überprüfung der Wirtsspezifität sind in Tabelle 1 gezeigt.
Plasmid-Konstruktionen
crTMV-cDNA wurde mit Hilfe der Didesoxynukleotid-Sequenzierung charakterisiert (Dorokhov et al., 1994 FERS Letters 350, 5–8). Infektiöse voll-Länge T7-Polymerasepromoterbasierte cDNA-Klone wurden mittels RT-PCR mit crTMV-RNA als Template erzeugt. Folgende Oligonukleotide wurden dabei benutzt:
crTMV 1-Kpn (upstream):

5'-gcatggtaccccttaatacgactcactataGTTTTAGTTTTATTGCAACAACAACAA

Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die KpnI-Restriktionsstelle dar, unterstrichen und klein geschrieben sind die Nukleotide der T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 5'-Ende der crTMV-cDNA-Sequenz abgeleitet;
crTMV2 (downstream):

5'-gcatgcggccgcTGGGCCCCTACCCGGGGTTAGGG

Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die NotI-Restriktionsstelle dar, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 3'-Ende der crTMV-cDNA-Sequenz abgeleitet; dieses RT-PCR-Produkt wurde in den pUC19-Vektor zwischen die KpnI- und BamHI-Restriktionstelle kloniert (1). Infektiöse voll-Länge SP6-RNA-Polymerasepromotorbasierte crTMV cDNA-Klone wurden mittels RT-PCR von crTMV-RNA als Templat erzeugt, wobei folgende Oligonukleotide benutzt wurden:
crTMV1-SP6 (upstream):

5'-gcatggtacc atttaggtgacactatagaactcGTTTTAGTTTTATTGCAACAACAACAA

Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die KpnI-Restriktionsstelle dar, unterstrichen und klein geschrieben sind die Nukleotide der SP6-RNA-Polymerase-Promotorsequenz, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 5'-Ende der crTMV-cDNA-Sequenz abgeleitet;
crTMV2-SP6 (downstream):

5'-gcatgcggccgcTGGGCCCCTACCCGGGGTTAGGG

Kursiv lind fett geschriebene Nukleotide stellen die NotI-Restriktionsstelle dar, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 3'-Ende der crTMV-cDNA-Sequenz abgeleitet; dieses RT-PCR-Produkt wurde in den pUC19-Vektor zwischen die KpnI- und BamHI-Restriktionstelle kloniert (1).

Die voll-Länge crTMV-cDNA-Klone wurden mit Hilfe der Didesoxynukleotid-Sequenzierung charakterisiert. Die Fähigkeit von infektiösen crTMV-Transkripten systemisch Nicotiana- und Kreuzblütler-Arten zu infizieren, konnte in Infektions-experimenten mit Nicotiana tabacum var. Samsun bzw. Arabidopsis thaliana bestätigt werden. Tabelle 1. Virus-Detektion und Virussymptome, die durch crTMV in mechanisch infizierten Pflanzen verursacht werden.

Spezies	Inokulierte Blätter		Nicht inokulierteobere Blätte
Spezies	Symptome*	Virus**	Symptome*	Virus**
Nicotiana tabacum L. cv. Samsun cv. Samsun NN.	C L	, + +	M s	+ -
Nicotiana clevelandii L.	L+N	+	M	+
Nicotiana glutinosa L.	L+N	+	s	-
Nicotiana sylvestris L.	L+N	+	s	+
Nicotiana benihamiana L.	L+N	+	M	+
Nicotiana rustica L.	C	+	M	+
Lycopersicuin esculentum L.	L+N	+	s	-
Solanum tuberosum L.	s		s	-
Capiscum frutescens L.	L+N	+	M	+
Brassica chinensis L.	C	+	M	+
Brassica rapa L.	C	+	M	+
Brassica napus L.	C	+	M	+
Brassica oleracea L.	L	+	s	-
Brassica compestris L.	C	+	M	+
Brassica cauliflora L.	C	+	s	-
Arabidopsis thaliana L.	L+N	+	M	+
Chenopodium amciranticolor L Coste und Reyn.	L+N	+	s	+
Chenopodium quinoa L. Willd.	L+N	+	s	-
Chenopodium murale L.	L+N	+	s	-
Datura stramonium L.	L+N	+	s	-
Plantago major L.	L+N	+	M	+
Tetragonia expansa L.	L+N	+	s	-
Beta vulgaris L.	L+N	+	s	-
Petunia hybrida L.	C	+	M	+
Cucumis saticvus L.	L+N	+	s	-
Phaseolus vulgaris L.	s		s	-
Raphanus sativus L.	s	-	M	+
Sinapis alba L.	C	+	M	+

*C, Chlorosis; L, lokale Verwundung; M, Mosaik; N, Nekrose; s ohne Symptome
**Virus detektiert (+) oder nicht (-) mit ELISA

BEISPIEL 2
Konstruktion von tobamoviralen Vektoren für die Expression von GUS-Genen in Pflanzen der Gattung Nicotiana und der Familie der Kruziferen über virale IRESs
Eine Serie von IRES-vermittelten Expressionsvektoren T7/crTMV/GUS wurden wie folgt konstruiert. Erstens, RindIII- und XbaI-Restriktionsstellen wurden in das CP-Gen des SacII/NotI-Fragment des T7/crTMV-Vektors (1) mit Hilfe einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) und zwei Paaren von spezifischen Primern Inseriert. Zweitens IRES_MP,75 ^CR-GUS-, IRES_MP,75 ^U1-GUS-, IRES_MP,228 ^CR-GUS-, IRES_CP,148 ^CR-GUS-, GUS-, PL-GUS-cDNA, die in Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139–154) beschrieben sind, wurden in die RindIII- und XbaI-Restriktionsstellen des SacII/NotI-Fragmentes des T7/crTMV-Vektors inseriert, so daß Sac II-IRES_MP,75 ^CR-GUS-NotI-, SacII-IRES_MP,75 ^UI-GUS-NotI-, SacII-IRES_MP,228 ^CR-GUS-NotI-, SacII-IRES_CP,148 ^CR-GUS-NotI-, SacII-IRES_CP,148 ^UI-GUS-NotI- bzw. SacII-PL-GUS-NotI-cDNA erhalten wurde. Drittens wurde ein SacII-NotI-cDNA-Fragment des T7/crTMV-Vektors durch ein SacII-IRES_MP,75 ^CR-GUS-NotI- oder ein SacII-IRES_MP,75 ^UI-GUS-NotI- oder ein SacII-IRES_MP,228 ^CR-GUS-NotI- oder ein SacII-IRES_CP,148 ^_CR-GUS-NotI- oder ein SacII-IRES_CP,148 ^UI-GUS-NotI- oder ein SacII-PL-GUS-NotI-cDNA-Fragment ersetzt, um die Vektoren T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS (2), T7/crTMV/ IRES_MP,75 ^UI-GUS (2), T7/crTMV/IRES_MP,228 ^CR-GUS (2), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS (2), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^UI-GUS (2) bzw. T7/crTMV/PL-GUS (2) zu erhalten.
BEISPIEL 3
Expression des GUS-Gens in transfizierten Pflanzen der Gattung Nicotiana und der Familie der Kruziferen
Dieses Beispiel demonstriert die Tobamovirus IRES-vermittelte Expression des GUS-Gens in Nicotiana henthamiana- und Arabidlopsis thaliana-Pflanzen, die mit den auf dem crTMV-basierenden Vektoren – Vektor T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS, (2), Vektor T7/crTMV/IRES_MP,75 ^UI-GUS (2), Vektor T7/crTMV/IRES_MP228 ^CR-GUS (2), Vektor T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS (2), Vektor T7/crTMV/IRES_CP,148 ^UI-GUS (2) bzw. Vektor T7/crTMV/PL-GUS (2) – infiziert wurden.
In vitro Transkription
Die Plasmide T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS (2), T7/crTMV/IRES_MP,75 ^UI-GUS (2), T7/crTMV/IRES_MP,228 ^CR-GUS (2), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS (2), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^UI-GUS (2) bzw. T7/crTMV/PL-GUS (2) wurden mit NotI linearisiert. Die rekombinanten Plasmide wurden gemäß Dawson et al. (1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1832–1836) in vitro transkribiert. Agarosegelelektrophorese der RNA-Transkripte bestätigte, daß diese intakt waren. Die RNA-Konzentration wurde mittels Agarosegelelektrophorese und Spektrophotometrie quantifiziert.
GUS-Detektion
Inokulierte Blätter wurden 10–14 Tage nach der Transfektion mit gecappten (capped) voll-Länge-Transkripten geerntet. IRES-Aktivität wurde mittels histochemischer Detektion der GUS-Expression wie bei Jefferson beschrieben verfolgt (1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387–405). Die Proben wurden mit dem kolorimetrischen GUS-Substrat infiltriert, wobei die Methode von De Block und Debrouwer (1992, Plant J. 2, 261–266) folgendermaßen modifiziert wurde, um die Diffusion der intermediären Produkte der Reaktion zu limitieren: 0,115 M Phosphatpuffer, pH 7,0 versetzt mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (x-Gluc) 600 μg/ml; 3 mM Kaliumhexacyanoferrat; 10 mM EDTA. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Blätter mit 70% Ethanol entfärbt und unter dem Lichtmikroskop untersucht.
BEISPIEL 4
IRES_MP,75 ^CR ist nicht als subgenomischer Promotor des MP-Gens funktional, sondern vermittelt die MP-Gen-Expression über die CAP-unabhängige interne Initiation der Translation in TMV-infizierten Pflanzen
Dieses Beispiel zeigt verschiedene Ansätze, um die Möglichkeit der Verwendung des IRES_MP,75 ^CR-Elementes in einem viralen Vektor für die CAP-unabhängige Expression eines gewünschten Gens zu untermauern.
CrTMV MP subgenomische RNA hat eine 125-nt lange 5'-untranslatierte Region (5'NTR) und enthält eine die Translation behindernde sekundäre Struktur (stem-loop).
Um die Länge und die Nukleotidsequenz der 5'-untranslatierten Region des TMV UI und der crTMV MP subgenomischen RNA (I₂sgRNA) zu bestimmen, wurde das Protokol für die Primer-Verlängerungsexperimente nach Letho et al. (1990, Virology 174, 145–157) auf folgende Art und Weise geändert: (i) AMV reverse Transkriptase (RT); (ii) RT-Reaktion bei 45°C; (iii) die GC-reichen Primer; (iv) erhöhte dNTP-Konzentration; (v) dITP um die Ausbildung von Sekundärstrukturen zu verhindern. Es wurde gezeigt (3), daß die 5' UTR-Sequenz der crTMV 1₂ sgRNA aus 125 Nukleotiden besteht. Dieses Ergebnis wurde mittels direkter 5' UTR RT-Sequenzierung bestätigt. 3B zeigt, daß die crTMV 5'NTR eine stabile hairpin-loop-Struktur enthält. Wenn man diese in einem künstlichen Transkript aufwärts (upstream) von dem MP-Gen plaziert, wird die MP-Gen-Translation in vitro inhibiert (4). Dieses wiederum bedeutet, daß das IRES_MP,75 ^CR-Element, das zwischen 5'HI₂ und dem MP-Gen lokalisiert ist, eine effiziente CAP-unabhängige, interne Inititiation der Translation vermitteln kann. 5 zeigt, daß auch in anderen Tobamoviren zu 5'HI₂ homologe, putative hairpin-loop-Strukturen, die die Translation inhibieren, in den 125-nt Sequenzen aufwärts (upstream) des MP-Gens gefunden werden konnten.
CrTMV und TMV UI MP subgenomische RNA ist nicht getappt (non-capped)
Um die Struktur des 5'-Terminus der subgenomischen RNA zu studieren, die für das 30K Bewegungsprotein (MP) von crTMV kodiert, wurde die „Jump-Start"-Methode, die von Active Motif angeboten wird, benutzt. Jump-Start^TM ist die Methode der spezifischen, chemischen Ligation einer RNA-Markierung an das 5'-Ende von gecappten (capped) RNA. Während der reversen Transkription wird die Ribooligonukleotid-Markierung einer bekannten Sequenz in das 3'-Ende der Erststrang-cDNA eingebaut. Diese erzeugt eine bekannte Priming-Stelle, die für die PCR geeignet ist.
Anfänglich werden die 5'-terminalen 2'-3'-cis-Glykol-Gruppen der gecappten (capped) RNA in reaktive di-Aldehyde mittels Natriumperjodate-Oxidation umgewandelt. 1–2 μl einer getesteten RNA (1 μg/ml) wurde mit 14 μl reinem Wasser und 1 μl Natriumacetat-Puffer (pH 5,5) gemischt. Dann wurden 4 μg einer 0,1 M Natriumperjodat-Lösung hinzugefügt und das Reaktionsgemisch für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurde ein 3'-Aminoalkyl-derivatisiertes synthetische Ribooligonukleotid-Markierung (-tag) chemisch an die di-Aldehyd-Enden der oxidierten RNA mittles reduktiver Aminierung in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid ligiert. 5 μl Natriumhyphosphit wurde hinzugefügt und das Reaktionsgemisch für 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 23 μ Wasser, 1 μl Natriumacetat-Puffer (pH 4,5) und 2 μl der ribo-Oligonukleotid-Markierung 5'-CTAATACGACTCACTATAGGG (28,5 pmol/μl) zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt und 15 Minuten inkubiert. Dann wurden 10 μl Nätriumcyanoborhydrid zugesetzt und 2 Stunden inkubiert. Anschließend wurden 400 μl einer 2% Lithiumperchlorat-Aceton-Lösung zugesetzt, 15 Minuten bei – 20°C inkubiert und 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde mit Aceton zweimal gewaschen und in 20 μl Wasser aufgenommen.
Um überschüssige RNA-Markierung zu entfernen, wurde eine CTAB-Prezipitation in Gegenwart von 0,3 M NaCl durchgeführt. CTAB ist ein starkes kationisches Detergens, das an Nukleinsäuren bindet und unlösliche Komplexe bildet. Die Komplexbildung ist von der Salzkonzentration abhängig: wenn die Salzkonzentration oberhalb von 1 M liegt, wird kein Komplex gebildet; im Gegensatz dazu werden bei einer Salzkonzentration unterhalb 0,2 M alle Nukleinsäuren effizient komplexiert. Bei einer Salzkonzentration zwischen 0,3 M und 0,4 M ist die Komplexierung von kleinen Einzelstrangnukleinsäuren sehr ineffizient (Belyavsky et al., 1989 Nucleic Acids Res. 25, 2919–2932; Bertiolo et al., 1994, BioTechniques 16, 1054–1058). 10 μl einer 1,2 M NaCl-Lösung (bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M) und 3 μl einer 10% CTAB-Lösung (bis zu einer Endkonzentration von 1%) wurden hinzugefügt, das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann für 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 μl einer 1,2 M NaCl- Lösung resuspendiert, 20 μl Wasser und 3 μl einer 10%ige CTAB-Lösung zugesetzt. Der Ansatz wurde anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 30 μl einer 1,2 M NaCl-Lösung gelöst, 80 μl 96% Ethanol zugesetzt und der Ansatz über Nacht bei –20°C inkubiert. Dann wurde wiederum für 5 Minuten zentrifugiert und das Pellet mit 70% Ethanol gewaschen. Zuletzt wurde das Pellet der markierten RNA in 24 μl Wasser gelöst.
Am Ende resultierte die Transkription mit spezifischen Primern für das 3'-Gen in dem Einbau der 5'-Markierungssequenz am 3'-Terminus der Erststrang-cDNA. Für die reverse Transkription wurden 12 μl der markierten RNA, 1 μl der spezifischen Primer vom 3'-Ende, 4 μl des 5 × Puffers für die SuperScript^TMII (Gibco BRL Life Technologies, 250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂) gemischt, für 30 Sekunden bei 95°C inkubiert und auf Eis abgekühlt. Anschließend wurde zu dem Reaktionsgemisch 0,5 μl einer DTT-Lösung (Endkonzentration 1 mM), 2 μl einer 10 mM dNTP-Lösung, 0,5 μl RNAsin, 0,5 μl SuperScript^TMII-Enzym zugesetzt und für 15 Minuten bei 42°C inkubiert. Die Anwesenheit von MgCl₂ in dem Reaktionsansatz erlaubt dem SuperScriptll^TM die CAP-Struktur während der reversen Transkription effizienter zu überwinden. Wenn 3 mM MgCl₂ und 2 mM MnCl₂ benutzt wurde, konnte in der reversen Transkription eine außergewöhnlich hohe CAP-abhängige Transferase-Aktivität nachgewiesen werden. Typischerweise fügte das Enzym vorzugsweise in der Anwesenheit von 5'-geschützter (capped) RNA als Template drei oder vier Cytosinreste an (Chenchik et al., 1998, Gene cloning and analysis by RT-PCR, herausgegeben von Paul Siebert und James Larrik, BioTechniques Books, Natick, MA; Schmidt und Mueller, 1999, Nucleic Acids Res. 27, 331). Für die PCR-Reaktion wurden zwei Sätze von Primern für jede getestete RNA benutzt: 3'-spezifische/5'-spezifische Primer und 3'-spezifische/Markierung- spezifische Primer (6).

Als positive Kontrolle für die Methode der spezifischen, chemischen Ligation einer Markierung mit bekannter Sequenz an die CAP-Struktur einer viralen RNA, wurde die genomische RNA des Tabak Mosaik-Viruses (TMV, Stamm U1), von der man weiß, daß sie mit einer CAP-Struktur versehen ist (Dunigan und Zaitlin, 1990, J. Biol. Chem. 265, 7779–7786), eingesetzt. Die zugehörigen PCR-Banden wurden detektiert, wenn spezifische Printer wie U1-Spn und der RNA-Makierung entsprechende Primer 779 in der PCR-Reaktion benutzt wurden (Tabelle 2, 7). Tabelle 2. Template und Primer, die in der PCR benutzt wurden

Template	Forward Primer	Reverse Primer	entsprechende PCR-Bande und Erkennung der CAP-Struktur
genomische TMV (U1)-RNA		U1-Spn	+
genomische TMV (U1)-RNA	779	U1-Spn	+ (gecappt)
nicht-gecapptes RNA-Transkript von TMV		U1-Spn	+
nicht-gecapptes RNA-Transkript von TMV	779	U1-Spn	- (non-capped)
kompletter cDNA-Klon von TMV (U1)		U1-Spn	+
genomische crTMV-RNA	K5	2PM	+
genomische crTMV-RNA	779	2PM	+
nicht-gecapptes RNA-Transkript von crTMV	K5	2PM	+
nicht-gecapptes RNA-Transkript von crTMV	779	2PM	- (nicht gecappt)
kompletter cDNA-Klon von crTMV	K5	2PM	+
subgenomische TMV (U1) RNA für MP	2211	UM50-54	+
subgenomische TMV (U1) RNA für MP	779	UM50-54	- (nicht gecappt) (non-capped)
kompletter cDNA-Klon von TMV (U1)	2211	UM50-54	+
subgenomische crTMV RNA für MP	1038	CPF25	+
subgenomische crTMV RNA für MP	779	CPF25	- (nicht gecappt)
kompletter cDNA-Klon von crTMV	1038	CPF25	0

Als eine Kontrolle wurde das nichtgeschützte (non-capped) RNA-Transkript des kompletten cDNA-Klons von TMV (U1) eingesetzt. Wie erwartet wurde keine CAP-Struktur gefunden (Tabelle 2, 7).
Dann wurde die Anwesenheit einer CAP-Struktur am 5'-Ende der genomischen RNA von crTMV ausgetestet. Für diese Experiment wurden die spezifischen PCR-Primer K5, 2PM und der Primer 779, der der RNA-Makierung entspricht, verwendet (Tabelle 2, 7). Interessanterweise war die Mobilität der PCR-Bande, die mit den Primern 779 und 2PM beobachtet wurde, größer als erwartet (7). Dieses könnte die Anwesenheit einer starken, Sekundärstruktur am 5'-Ende der genomischen RNA von crTMV (Dorokhov et al., 1994, FERS Letters 350, 5–8) reflektieren. Diese Sekundärstruktur fehlt an den 5'-terminalen Teilen von verwandten TMVs (Goelet et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5818–5822). In Kontrolexperimenten mit nicht geschützten (non-capped) Transkripten des kompletten cDNA-Klons von crTMV wurde wie erwartet keine entsprechende PCR-Bande beobachtet.
Für subgenomische RNA, die für das TMV (U1) MP-Gen kodiert, wurde angenommen, das sie keine CAP-Struktur am 5'-Ende aufweist. Wir testeten die entsprechende sgRNA mit den spezifischen Primern 2211, UM50-54 und Primer 779, der der RNA-Markierung entspricht. Es wurde keine CAP-Struktur gefunden Tabelle 2, 7).
Die gleichen Resultate wurden mit der entsprechenden subgenomischen RNA von crTMV (Tabelle 2, 7) erhalten. Dies zeigt, daß auch im Fall dieser subgenomischen RNA des Tobamovirus keine CAP-Struktur am 5'-Ende vorhanden ist.
Insertion des IRES_MP,75 ^CR-Elementes in einen auf dem TMV U1 basierenden Vektor, der defizient für die MP-Genexpression ist, KK6 liefert eine effiziente CAP-unabhängige MP-Genexpression.
Der KK6-Vektor (Lehto et al., 1990, Virology 174, 145–157) enthält zwei subgenomische Promortoren (sgPr) für das CP-Gen. Der erste CP-sgPr-1 liegt aufwärts (upstream) des CP-Gen an einer passenden Stelle, während der zweite CP-sgPr-2 aufwärts (upstream) des MP-Gens angeordnet ist. Es konnte gezeigt werden, daß das MP-Gen mit Hilfe des CP-sgPr-2 anstelle des nativen MP-sgPr exprimiert wurde. Resultierend aus dieser Insertion verlor der KK6-Vektor seine Fähigkeit sich effizient von einer Zelle zur anderen zu bewegen. Analysen zeigten, daß die I₂ sgRNA kein IRES_MP,75 ^CR-Element in der 5'-untranslatierten Region enthielt. Es wurde deswegen angenommen, daß von der I₂ sgRNA des KK6-Vektors das MP-Gen ohne IRES_MP,75 ^CR-Element nicht effizient exprimiert werden kann. Um diese Annahme zu überprüfen, wurde das IRES_MP,75 ^CR-Element zwischen den CP sgPr-2 und dein MP-Gen in den KK6-Vektor inseriert, so daß ein KK6-IRES_MP,75-Vektor erzeugt wurde, der in der Nachkommenschaft stabil propagiert werden konnte (8). Es konnte gezeigt werden, daß der KK6-IRES_MP,75-Vektor für die Synthese einer I₂ sgRNA verantwortlich ist, die das crTMV-IRES_MP,75-Element enthält (9). Es konnte ebenfalls gezeigt werden, daß der Transkriptionsstart der I₂ sgRNA aus dem KK6-IRES_MP,75-Vektor im Vergleich zum KK6-Vektor ohne IRES_MP,75 ^CR-Element nicht verändert ist. Dieses bedeutet, daß das ^IRESMP,75^CR-Element nicht als sgPr für das MP-Gen dient.
Diese Insertion verbesserte drastisch die Verbreitung des Virus von Zelle zu Zelle. Der KK6-Vektor infizierte Nicotiana tabacum L. cv Samsun-Pflanzen systemisch. Die Pflanzen zeigten allerdings im Vergleich zum Wildtyp-TMV (TMV 304), bei dem ungefähr nach sieben Tagen die ersten Symptome sichtbar waren, erst nach 15 bis 17 Tagen erste Infektionssymptome. Die Symptome in den oberen Blättern der mit dem KK6-Vektor infizierten Pflanzen waren deutlich als gelbe Flecken sichtbar, während der Wildtyp-TMV Mosaik-Symptome erzeugte.
Die KK6-Virus Nachkommenschaft erzeugte zahlreiche Verletzungen in N. glutinosa, die sich langsamer entwickelten als die Verletzungen des Wildtyp-TMV UI. Die durchschnittliche Größe der lokalen Verwundungen, die durch den KK6-Virus verursacht wurden, war 0,1 mm. Im Vergleich dazu erreichten die lokalen Verwundungen des Wildtyp-TMV UI eine Größe von 1,1 mm.
Pflanzen, die mit dem KK6-IRES_MP75-Vektor inokuliert wurden, sahen wie Pflanzen aus, die mit dem KK6-Vektor infiziert wurden. Sie unterschieden sich aber dahingehend, daß (i) sich die ersten systemischen Symptome schneller entwickelten (ungefähr nach 10 Tagen) und (ii) sie wesentlich heller in Bezug auf die gelben Flecken und das Mosaik waren. Im Gegensatz zu dem KK6-Vektor war die durchschnittliche Größe der lokalen Verwundungen, die durch K86 in N. glutinosa erzeugt wurden, auf 0,6–0,7 mm erhöht. Die Überprüfung des zeitlichen Verlaufs der MP-Akkumulation zeigte, daß das KK6-IRES_MP75-MP früher als das KK6-MP in den inokulierten Blättern detektiert werden konnte (10). Dieses Resultat erlaubte den Schluss, daß die Insertion des IRLS_MP,75 ^CR-Elementes aufwärts (upstream) des KK6-MP-Gens teilweise die Ausbreitungseigenschaften des KK6-Virus, der in dem Transport von Zelle zu Zelle und in dem Langdistanztransport Defekte zeigte, wiederherstellt.
Um weitere Beweise für die essentielle Rolle der IRES-Elemente in der CAP-unabhängigen MP-Gen Expression in den TMV-cDNA-Vektoren und in dem Lebenszyklus von Tobamoviren zu erhalten, wurden Serien von zusätzlichen auf dem KK6-Vektor basierende Vektoren konstruiert (8). Der KK6-IRES_MP125-Vektor enthält eine natürliche Haarnadel-Loop-Struktur, die in der Lage ist, die Translation des MP-Gens in vitro in der Gegenwart der 5' untranslatierten Region der I₂ sgRNA von WTcrTMV zu inhibieren. Desweiteren enthält der IRES_MP75-KK6-H-PL-Vektor eine natürliche Hairpin-Loop-Struktur und eine 72-nt lange, künstliche Polylinkersequenz. KK6-PL enthält nur die Polylinker-Region. Die Resultate der Infektionsexperimente mit Nicotiana tabacum cv. Samsun (systemischer Wirt) sind in Tabelle 3 gezeigt.
11 zeigt die Resultate der Western-Analysen in bezug auf die CP-Akkumulation in den Tabak-Blättern, die mit den KK6-basierenden Vektoren infiziert wurden. Ersatz des IRES_MP,75 ^CR-Elementes durch eine nicht funktionale PL-Sequenz blockierte drastisch die Vektor-Multiplikation. Tabelle 3. Virus-Akkumulation in Tabak, der systemisch mit KK6-basierenden Vektoren infiziert wurde

cDNA-Kopien Virus-Akkumulation

TMV 304 (WT) +++

KK6 +

KK6-IRES_MP,75 ++

KK6- IRES_MP,125 ++

KK6-H-PL +/–

KK6-PL +/–
BEISPIEL 5
Die Herstellung von künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementen ohne subgenomische Promotoraktivität bewirkt in eukaryotischen Zellen die CAP-unabhängige Expression von gewünschten Genen
Das Ziel dieses Beispiels ist es, die Ansätze für die Herstellung von künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementen, die keine subgenomische Promotor-Aktivität aufweisen und die in eukaryotischen Zellen die CAP-unabhängige Expression von gewünschten Genen ermöglichen, zu zeigen.
Konstruktion eines künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementes auf der Basis des 18-nt Segmentes aus dem IRES CR-Element
Die Analyse des IRES_MP,75 ^CR-Nukleotidsequenz zeigt, daß dieses Element eine multimere Struktur hat und vier Nukleotidsequenz-Segmente mit einer Variation des Elementes (-72)GUUUGCUUUUUG(-61) enthält, die komplementär zu der 18S rRNA aus Arabidopsis thaliana ist (12).
Um ein künstliches, nicht natürliches IRES-Element zu gestalten, wurde die 18-nt Sequenz CGUUUGCUUUUUGUAGUA ausgewählt. Vier Oligonukleotide wurden synthetisiert:
Primer MP1(+) und MP1(–) wurden hybridisiert, so daß das dsDNA-Fragment A enstand:
Primer MP2(+) und MP2(–) wurden hybridisiert, so daß das dsDNA-Fragment B enstand:
Beide Fragmente wurden mit PstI verdaut und miteinander ligiert. Dann wurde das Ligationprodukt A+B mittels Agarosegelelektrophorese extrahiert und mit HindIII und EcoRI verdaut. Anschließend wurde dieses Fragment in den hGFP-GUS Vektor, der bei Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139–154) beschrieben ist, mit Hilfe der HindIII- und EcoRI-Klonierungstellen subkloniert (13).
Resultate
Die Transkripte, die in 13 dargestellt sind, wurden in dem Lysat von Kaninchen Reticulozyten (RRL) wie bei Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139–154) beschrieben translatiert. Die Syntheseprodukte wurden mittels Gelelektrophorese analysiert. Die Resultate, die in 13 dargestellt sind, zeigen, daß eine künstliche, nicht natürliche Sequenz, die auf dem 18-nt Segment des IRES_MP,75 ^CR-Elementes basiert, die Expression des 3'-proximal lokalisierten GUS-Gens vermittelt. Dies bedeutet, daß zwei Eigenschaften, zum einen die zu der 18S rRNA komplementäre Sequenz und zum anderen die multimere Struktur, notwendig für die IRES_MP,75 ^CR-Funktion sind. Ein Tetramer von 18-nt Segmenten erreicht nicht das Aktivitätsniveau des IRES_MP,75 ^CR-Elements. Es gibt aber einen Weg, die Aktivität des künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementes zu verbessern, indem man das 12-nt Segment GCUUGCUUUGAG, das komplementär zu der 18S rRNA ist, verwendet.
Konstruktion eines künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementes auf der Basis des 12-nt Segmentes aus dem IRES_MP,75 ^CR-Element
Analysen der Strukturelemente, die notwendig für die IRES_CP,148 ^CR-Aktivität (14–17) sind, zeigen, daß ein Polypurin(PP)-Segment entscheidend für die IRES_CP,148 ^CR-Funktion ist. Als ein markantes Element dieses PP Segmentes wurde eine direkte Wiederholung einer 9-nt-Sequenz in der 19-nt Sequenz gefunden: AAAAGAAGGAAAAAGAAGG (direct repeat (DR)).
Diese Sequenz wurde für die Konstruktion eines künstlichen IRES-Elementes benutzt. Um ein Tetramer der DR-Sequenz zu erhalten, wurden folgende Primer benutzt:
Gemäß der zuvor beschriebenen Methode wurde folgendes IRES-Element als intercistronischer Spacer verwendet:
Resultate
Die Transkripte, die in 13 dargestellt sind, wurden in dem Lysat von Kaninchen Reticulozyten (RRL) wie bei Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139–154) beschrieben translatiert. Die Syntheseprodukte wurden mittels Gelelektrophorese analysiert. Die Resultate, die in 13 dargestellt sind, zeigen, daß eine künstliche, nicht natürliche Sequenz, die auf den sich wiederholenden 19-nt Segmenten des IRES_CP,148 ^CR-Elementes basiert, die Expression des 3'-proximal lokalisierten GUS-Gens vermittelt.
Beispiel 6
Konstruktion eines TMV-cDNA-Transkriptionsvektors, der das Replikasegen in infizierten Zellen CAP-unabhängig exprimiert
Das Hauptziel dieses Beispiels war die Erzeugung von zwei neuen auf dem TMV U1-basierende Viren mit einer modifizierten 5'UTR, die die CAP-unabhängige Expression des Replikasegens erlaubt:

1) Der Omega-Leader des TMV wurde komplett durch das IRES_MP,75 ^CR-Element ersetzt:
2) Weil man davon ausgeht, daß die ersten 8 Nukleotide der TMV 5'UTR notwendig für die Virusreplikation sind (Watanabe et al., 1996, J. Gen. Virol. 77, 2353–2357), wurde das IRES_MP,75 ^CR-Element in die TMV 5'UTR inseriert, wobei die ersten 8 Nukleotide intakt gelassen wurden:

Die folgenden Primer wurden verwendet:

a) SP6-IRES-1 (im Fall der ersten Variante)
b) SP6-IRES-2 (im Fall der zweiten Variante)
c) IRES-NcoI (reverse Primer, um IRES mit einer Nco I-Restriktionstelle am 3'-Ende zu erhalten)
d) nTMV-NcoI (direkter Primer zur Gewinnung der TMV-Polymerase; Start: NCOI-Schnittstelle):
e) TMV-Xho (reverser Primer zur Gewinnung des 5'-Bereiches der Replikase; vom AUG-Codon bis zur SphI-Schnittstelle)

Klonierungsstrategie: Das PCR-Fragment A wurde durch die Verwendung der Primer SP6-IRES1 und IRES-NcoI auf dem Vektor crTMV als Templat hergestellt. Das PCR-Fragment B wurde durch die Verwendung der Oligonukleotide TMV-NcoI und TMV-XhoI sowie dem Klon TMV-304L erzeugt. Die Fragmente A und B wurden (unter Verwendung von XbaI und XhoI-Schnittstellen) gleichzeitig in den Vektor pBlueskript SK+ kloniert. Die Ligation der Fragmente erfolgte durch eine Nco I-Schnittstelle. Derselbe Ansatz wurde angewandt, um die zweite Variante des Virus durch die Verwendung des Oligonukleotids SP6-IRES2 zu erhalten. Im nächsten Schritt wurde die gesamte TMV cDNA in den erhaltenen Vektor kloniert. SphI und KpnI-Schnittstellen wurden dazu verwendet, das virale Genom wieder-herzustellen (18).
Beispiel 7
Auf Actin-2-Transkriptionspromotoren basierende tobamovirale Vektoren Act2/cRTMV und Act2/crTMV IRES_MP,75 ^CR-GUS
Das wichtigste Ziel dieses Beispiels ist es, die Klonierungsstrategie eines neuen crTMV-basierenden Vektors, mit dem virale Genexpression in Pflanzenzellen unter der Kontrolle eines effizienten Actin 2 Promoters auftritt, zu demonstrieren. Die Verwendung des Vektors Act2/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS zur Genexpression in Pflanzen wird damit möglich.
Die Klonierung von Act2 in pUC19
Der Act2 Transkriptionspromotor (ca. 1000 bp) wurde aus dem Plasmid pACRS029 durch Restriktion mit den Enzymen KpnI und PstI geschnitten.
Herstellung einer PstI-Schnittstelle im Plasmid T7/crTMV (1) aufwärts (upstream) des Beginns des crTMV-Genoms
Ein 334-Nukleotide großes Fragment des 5'-endständigen Teils des crTMV-Genoms wurde durch PCR hergestellt. Dabei wurden der in direkter Orientierung vorliegende Primer ATGCTGCAGGTTTTAGTTTTATTGCAACAACAA (Pst I-Schnittstelle ist unterstrichen) und der in reverser Orientierung vorliegende Primer ATGCGATCGAA GCCACCGGCCAAGGAG TGCA (Pvu I-Schnittstelle ist unterstrichen) verwendet. Das Fragment wurde mit PvuI und PstI geschnitten und in pUC 19Act2 zusammen mit dem Teil des crTMV Genoms eingefügt (Pvu I-Spe I-Fragment).
Fusion des 5'-Endes von crTMV an den Transkriptionsstart von Act2 ohne zusätzliche Sequenzen
Dieser Schritt wurde mittels ortsgerichteter (site-directed) Mutagenese ausgeführt. Dabei wurden Oligonucleotid-Primer verwendet, die spezifisch für Act2 und crTMV sind. Mit ihnen konnte das endgültige Konstrukt Act2/crTMV (19) hergestellt werden. Um den Vektor Act2/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS zu erhalten (20), wurde das SpeI-NotI cDNA-Fragment des Plasmids Act2/crTMV (19) durch das SpeI-NotI DNA-Fragment aus T7crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS ersetzt (2). Dieses beinhaltet das GUS-Gen unter der Kontrolle von IRES_MP,75 ^CR.
Beispiel 8
Herstellung eines zirkulären Einzelstrang-tobamoviralen Vektors KS/Act2/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS (21)
Das wichtigste Ziel dieses Beispiels ist es, die Möglichkeit aufzuzeigen, unter Verwendung von DNA-Vektoren, die aus ringförmiger Einzelstrang DNA bestehen, Fremdgene in Pflanzen zu exprimieren. Um das Konstrukt KS/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS (21) herzustellen, wurde ein 9,2 kb großes KpnI-NotI cDNA-Fragment des Vektors" Act2/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS in das Plasmid pBluescipt II KS+ (Stratagene) inseriert. Der Zielvektor wurde mit KpnI-SalI gespalten und beinhaltet den Replikationsstartpunkt (origin) des Phagen f1. Einzelstrang-DNA des Vektors KS/Act2/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS wurde nach Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York) hergestellt. GUS-Expression wurde über übliches histochemisches Anfärben 2 bis 3 Tage nach dem Beschuss detektiert.
Beispiel 9
Herstellung eines tobamoviralen Vektors KS/Act2/crTMV-Int/IRES_MP,75 ^CR-GUS, der ein Oleosin-Intron von Arabidopsis thaliana beinhaltet.
Das wichtigste Ziel dieses Beispiels ist die Herstellung des Vektors KS/Act2/crTMV/ IRES_MP,75 ^CR-GUS, der das Oleosingen-Intron aus Arabidopsis thaliana besitzt. Dieses Intron soll nach dem Trankriptionsprozess entfernt werden (22).
Die Klonierung setzt sich aus folgenden Schritten zusammen:
1. Klonierung des A. thaliana Oleosingen-Introns
Das Intron des Oleosin-Gens aus A. thaliana wurde mittels PCR amplifiziert. Hierzu wurden folgende spezifische Primer verwendet: A.th./Int (direct) ATGCTGCAGgttttagttCAGTAAGCACACATTTATCATC (die Pst I-Schnittstelle ist unterstrichen, kleine Buchstaben markieren die crTMV 5'-endständige Sequenz). Beim zweiten verwendeten Primer handelt es sich um A.th/Int (reverse): ATGAGGCCTG GTGCTCTCCCGTTGCGTACCTA (Stu I-Schnittstelle ist unterstrichen).
2. Insertion des A. thaliana Oleosin-Introns in das 334-Nukleotid große 5'-terminale Fragment der crTMV cDNA.
cDNA, die das Intron des Oleosin-Gens von A. thaliana besitzt, wurde mit Pst I/Stu I restringiert und mit einem PCR-Fragment ligiert, das über PCR-Amplifikation durch die Verwendung folgender Primer gewonnen wurde:

Primer 1: atgAGGCCTTTATTG CAACAACAACAACAAATTA (Die Stu I-Schnittstelle ist unterstrichen).
Primer 2: ATGCGATCGAAGCCACC GGCCAAGGAGTGCA (Die Pvu I-Schnittstelle ist unter-strichen). Die

Primer entsprechen den Positionen 10–334 des crTMV Genoms.
Die nächsten Schritte sind im Beispiel 7 beschrieben (siehe auch Beispiel 18).
Beispiel 10
Einfluss von Rapamycin als Inhibitor der CAP-unabhängigen Initiation der Translation auf die GUS-Genexpression in Tabak-Protoplasten, die mit 35S/CP/IRES_MP,75 ^CR beinhaltenden bicistronischen Transkriptionsvektoren 35S/CP/IRES_MP,75 ^CR/GUS (23) und 35S/GUS/IRES_MP,75 ^CR/CP (24) transfiziert wurden
Mit diesem Beispiel soll demonstriert werden, dass es grundsätzlich möglich ist, Inhibitoren der CAP-abhängigen Translation einzusetzten, um die Effizienz der IRES-vermittelten CAP-unabhängigen Translation eines Gens von Interesse zu erhöhen.
Als Inhibitor der CAP-abhängigen Initiation der Translation wurde Rapamycin ausgewählt. Kürzlich wurde ein neuartiger Repressor der CAP-vermittelten Translation, der als 4E-BP1 (eIF-4E-bindendes Protein) oder PHAS-1 bezeichnet wurde, charakterisiert (Lin et al., 1994, Science 226 653–656; Pause et al., Nature 371, 762–767). 4E-BPI ist ein Hitze- und Säurestabiles Protein, dessen Aktivität durch Phosphorylierung reguliert wird (Lin et al. 1994 Science 226, 653–656; Pause et al., Nature 371, 762–767). Die Wechselwirkung von 4EBP1 mit eIF-4E führt zu einer spezifischen Inhibierung von CAP-abhängiger Translation, sowohl in vitro als auch in vivo; Pause et al., Nature 371, 762–767). Es wurde gezeigt, dass Rapamycin die Dephosphorylierung und damit die Aktivierung von 4E-BP1 (Beretta et al. 1996, EMBO J. 15, 658–664) induziert.
Die Herstellung der Vektoren 35S/CP/IRES_MP,75 ^CR/GUS (23) und 35S/GUS/IRES_MP,75 ^CR/CP (24), die IRES- und GUS-Sequenzen beinhalten, und eine Methode zur Transfektion von Protoplasten mit einer 35S-basierenden cDNA wurden von Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139–154) beschrieben. Der Vergleich der Expression der GUS-Gene in Tabak-Protoplasten, die mit Rapamycin behandelt wurden und mit bicistronischer cDNA transfiziert wurden, die ein GUS-Gen in 3'- und 5'-proximalen Positionen besitzen, verdeutlicht, dass es möglich ist, die IRES-vermittelte, CAP-unabhängige Translation zu erhöhen.
Beispiel 11
Einfluß des Potyvirus VPg als ein Inhibitor der CAP-abhängigen Initiation der Translation bei GUS-Genen in Tabak-Protoplasten, die mit 35S/CP/IPRES_MP,75 ^CR beinhaltenden bicistronischen Transkriptionsvektoren 35S/CP/IRES_MP,75 ^CR/GUS (23) und 35S/CP-VPg/IRES_MP,75 ^CR/GUS transfiziert wurden
Dieses Beispiel verdeutlicht die grundsätzliche Möglichkeit der Verwendung eines Genproduktes zur Inhibierung der CAP-abhängigen Translation (25). Kürzlich wurde über die Wechselwirkung zwischen dem viralen Protein, das an das Genom des Rübenmosaikvirus und dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor eIF (iso)4E von Arabidopsis thaliana gekoppelt ist, berichtet (Wittman et al., 1997, Virology 234, 84–92). Die Interaktions-Domäne von VPg wurde in einen Bereich von 35 Aminosäuren kartiert. Der Austausch von Asparaginsäureresten in dieser Region verhinderte den Prozeß vollständig. Das CAP-Analogon m⁷GTP, jedoch nicht GTP, inhibiert die Bildung des Komplexes aus VPg und eIF(iso)4E. Dies deutet darauf hin, dass VPg und die zellulären mRNAs um die Bindungen an eIF(iso)4E konkurrieren (Leonard et al., 2000, J. Virology 74, 7730–7737).
Die Fähigkeit von VPg, an eIF(iso)4E zu binden, kann zur Inhibition der CAP-abhängigen Translation verwendet werden. Wir schlagen vor, den Vektor 35S/CP-VPg/IRES_MP,75 ^CR/GUS (25) zu verwenden. In diesem Vektor ist das Hüllprotein mit VPg des Potyvirus Kartoffevirus A fusioniert. Der Vergleich der Expression des GUS-Gens in Protoplasten, die mit 35S/CP-VPg/IRES_MP,75 ^CR/GUS oder 35S/CP/IRES_MP,75 ^CR/GUS transfiziert wurden erlaubt die Erhöhung der IRES-vermittelten und CAP-unabhängigen Expression des GUS-Gens.
Beispiel 12
Genetische in vivo-Selektion einer IRES Sequenz oder eines subgenomischen Promoters unter Verwendung des TMV-Vektors
In diesem Beispiel wird die Möglichkeit aufgezeigt, genetische in vivo-Selektionen oder die systematische Entwicklung von Liganden durch exponentielle Anreicherung (SELEX, Systematic Evolution of Ligants by Exponential enrichment) eines subgenomischen Promotors oder einer IRES-Sequenz, die CAP-unabhängige Expression eines Gens von Interesse in einem Vektor gewährleistet, durchzuführen. In diesem Ansatz wird eine side-by-side-Selektion einer großen Anzahl von zufälligen Sequenzen ebenso wie die Erzeugung von Sequenzen angewandt (Ellington und Szostak, 1990, Nature 346, 818–822; Tuerk and Gold, 1990, Science 249, 505–510; Carpenter und Simon, 1998, Nucleic Acids Res. 26, 2426–2432). Das Projekt schließt ein:

1. In vitro-Synthese von crTMV-basierenden defective-inteifering (DI) Trans-kripten, die folgende Elemente beinhalten (5'-3'-Richtung): (i) Ein T7 Transkriptionspromoter, (ii) ein 5'-endständiger Teil des crTMV-Genoms mit einer Sequenz, die für die Synthese des komplementären (minus-) Strang des viralen Genoms verantwortlich ist, (iii) eine Sequenz die für einen N-endständigen Teil der viralen Replikase kodiert, (iv) eine Sequenz, die 75 zufällige Basen beinhaltete, (v) ein Gen für die Neomycinphosphotransferase II (NPTII), (vi) ein crTMV Startpunkt des viralen Zusammenbaus (origin of assembly, Ca), und (vii) ein 3'-endständiger Teil des crTMV-Genoms mit einer Promotersequenz für den Minus-Strang (26).
2. Kotransfektion von Tabak-Protoplasten mit einem Transkript und genomischer RNA von crTMV ( 1). Die Protoplasten wachsen und regenerieren auf einem Kanamycinhaltigen Medium.
3. Selektion und Isolierung einer IKES-Sequenz oder eines subgenomischen Promotors, die es den Protoplasten ermöglicht zu überleben und in Anwesenheit von Kanamycin zu regenerieren.

Beispiel 13
Konstruktion eines TMV-U1-basierten Vektors, der eine heterologe virale IRES enthält
Der in Beispiel 2 beschriebene crTMV-basierte Satz an Vektoren enhält homologe virale IRES-Sequenzen, die aus demselben crTMV-Genom stammen. Dies erzeugt direkte Wiederholungen (direct repeats) verschiedener Länge, die oft zu Vektorinstabilität bei der Pflanzeninfektion führen (siehe Chapman et al., 1992, Plant J. 2(4), 549–557, Shivprasad et al., 1999, Virology 255, 312–323). Um dies zu vermeiden, wurde das TMV-U1 Genom mit der heterologen IRES_MP,75 ^CR Sequenz kombiniert. Ein weiterer Grund dafür, einen anderen Tobamovirus für die Vektorkonstruktion zu verwenden, ist, dass, im Gegensatz zu crTMV, TMV-U1 ein begrenzteres Wirtsspektrum aufweist (siehe Tabelle 1), jedoch in Nicotiana Spezies virulenter ist. Zum Beispiel akkumuliert er zu einem höheren Level und zeigt stärkere Symptome in N.benthamiana und N.tabacum.
Plasmid TMV304 (27) (Dawson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1832–1836; Lehto et al., 1990, Virology 174, 145–157) wurde als Startmaterial benutzt. Vier Primer wurden bestellt, um weitere HindIII und XbaI Restriktionsstellen in das virale Genom einzuführen:

1.TMVvect1Nco
2.TMVvect2Hind
3.TMVvect3Xba
4.TMVvect4Kpn

Oligonukleotide 1 und 2 wurden für die PCR-Amplifiation des CP und des C-terminalen Teils des MP Gens verwendet. Oligonukleotide 3 und 4 wurden verwendet, um die 3'-nichttranslatierte Region (28) zu amplifizieren. Dann wurden beide PCR-Produkte mit NcoI/HindIII oder XbaI/KpnI verdaut und in TMV304 zwischen unique Ncol und KpnI Restriktionsstellen zusammen mit entweder einem IRES_MP,75 ^CR-GUS Insert (aus pICH766, HindIII/XbaI) oder einen IRES_MP,75 ^CR-eGFP (pICH1041, HindIII/XbaI) Insert (Vier-Fragment-Ligation) (28) kloniert. Im Ergebnis wurden Konstrukte pICH1865 (mit GFP) und pICH1871 (mit GUS) erhalten (29). Zur Pflanzeninfektion wurden diese Plasmide linearisiert mit KpnI, in vitro mit dem SP6- Promotor transkribiert und in Nbenthamiana Pflanzen inokuliert wie zuvor beschrieben. GUS-Färben wurde 7 Tage nach der Inokulation (dpi=days post inoculation) (siehe Beispiel 3) durchgeführt. 31A zeigt GUS-Expression in den inokulierten, jedoch nicht in systemischen Blättern. Ähnliche Ergebnisse wurden mit GFP enthaltenden viralen Konstrukten erhalten.
Beispiel 14
TMV-U1-basierter vektor: ein Fremdgen kann über eine IRES pflanzlichen Ursprungs oder über eine synthetische IRES, die frei von subgenomischer Promotoraktivität sind, exprimiert werden
Zwei weitere TMV-U1-basierte Vektoren wurden konstruiert. Verschiedene nichtvirale IRES-Sequenzes wurden zum Klonieren verwendet: erstens, die 453-nt 5'-nichttranslatierte Leadersequenz aus dem Nicotiana tabacum Hitzeschockfaktor 1 (NtHSF-1, EMBL/Genbank Nukleotiddatenbank, Zugangsnummer ABO14483) und, zweitens, die künstliche Sequenz (GAAA)×16. Beide Sequenzen zeigten IRES Aktivität in vitro (Kaninchen-Retikulozyten-Lysat=RRL und Weizenkeimextrakt=WGE) und in vivo (Tabakprotoplasten, HeLa-Zellen).
Um die neuen Versionen der TMV-U1 basieren Vektoren herzustellen, wurde das pICH1871 (TMV-U1-GUS) Plasmid (siehe 29 und das vorherigen Beispiel) mit Ncol und SalI verdaut und mit zwei Inserts: dem NcoI/HindIII-Fragment (aus demselben Konstrukt, CP und teilweises MP gen) und dem HindIII/Sal-Fragment (IRES-GUS) aus dem Plasmiden hGFP-NtHSF-GUS und hGFP-(GAAA)×16-GUS (unveröffentlicht) (30) ligiert.
Die Inokulation der Transkripte, die mit pICH4235 (mit NtfSF-Sequenz) und pICH4246 (mit künstlicher IRES GAAA×16) erhalten wurden, wurde in N. benthamiana Pflanzen wie üblich durchgeführt (siehe voriges Beispiel). Die GUS-Expression wurde 7dpi analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass das GUS-Expressionslevel in beien Fällen demjenigen mit einer IRES viralen Ursprungs vergleichbar ist (zum Beispiel IRES_MP,75 ^CR oder IRES_CP,148 ^CR, 31B, 31C). Es ist klar, dass IRES-Sequenzen, die in diesen Konstrukten verwendet werden (aus dem Pflanzengenom oder künstlich), mit Sicherheit frei von jeglicher subgenomischer Promotoraktivität sind. Infektion mit pICH4246 zeigte auch eine Vektorinstabilität – wie all die anderen viralen Konstrukte, die das GUS-Gen enthalten, wandelte sich dieses zu wildtyp um und Symptome einer systemischen Infektion erschienen bald (7–8 dpi). Im Fall von pIC4235 (NtHSF-Sequenz) waren die Symptome in den oberen Blättern selbst 14 dpi nicht sichtbar und zeigten sich erst 20–21 dpi. Dies zeigt, dass 4235, der eine lange (453 b. p.) und hochstrukturierte nichtvirale IRES-Sequenz aufweist, wesentlich stabiler als die anderen verwandten Vektoren ist und eine gute Möglichkeit zur stabilen Genexpression von Genen bietet, die kleiner als GUS sind (1.8 kb) wie z. B. GFP.
Beispiel 15
Agroinfiltration bietet ein schnelles, günstiges lind effizientes Verfahren, Fremdproteine über IRES-basierte virale Vektoren in Pflanzen zu exprimieren
Als ersten Schritt wurde das Act2/crTMV/IRES_CP,148 ^_CR-GFP-Konstrukt (Plasmid pICH3011) in den binären Vektor pICBV10 (Icon Genetics GmbH) kloniert. pICBV10 wurde mit KpnI und HindIII verdaut und mit dem KpnI/NotI-Fragment von pICH3011 und dem nos-Transkriptionsterminator (NotI/HindIII-Fragment desselben Konstrukts) ligiert. Das erhaltene Plasmid (pICH4471) wurde in Agrobacterium tumefaciens (strain GV3101) transformiert. Kolonieen wurden über Nacht gezogen in 5 ml einer Flüssigkultur, und Agroinfiltration in Nicotiana benthamiana Pflanzen wurde wie üblich durchgeführt. GFP-Expression in den inokulierten Blättern war mit der UV Lampe 6–7 Tage nach der Infiltration detektierbar.
Beispiel 16
Expression pharmazeutischer Proteine von dem tobamoviralen Vektor Act2/crTMV/IRES_CP,148 ^CR
Für die Expression pharmazeutischer Proteine in Pflanzenblättern wurde ein crTMV-basierter viraler Vektor unter der Kontrolle des Arabidopsis Actin 2 Promotors verwendet (An et al., 1996, Plant J. 10, 107–121). Der Vektor pIC3011 kann über interne Translationsinitiation die Fremdgene (zum Beispiel GFP), die stromab von IREScp148 inseriert sind, exprimieren.
Um das Hepatitis B Protein in Pflanzen zu exprimieren, wurden entsprechende crTMV-basierte virale Vektoren konstruiert. Das Hepatitis B Proteingen wurde in pIC3011 inseriert. Dann wurde ein zusätzliches IREScp148 zwischen das CP-Gen und die 3'-terminale nichttranslatierte virale Sequenz eingebaut. Das resultierende Plasmid wurde pICP1260 (#62C, Arab.Act2promoter: crTMV: IREScp148cr: hepatitis B Protein) genannt. Es wurde auf Wolframpartikeln präzipitiert und für die Partikelbomardierung verwendet Eine Partikelbomardierung losgelöster Blätter von Nicotiana benthamiana wurde mit der "flying disk"-Methode mit einem Hochdruckhelium-PDS-1000-Apparat (Bio-Rad) wie von Morozov et al. (1997, Journal of General Virology 78, 2077–2083) beschrieben durchgeführt. pICP1260-bombardierte N.benthamiana Blätter wurden mittels Western Blotting 4 Tage nach der Bombardierung (d. p. b.) getestet. Sie zeigten einige Expression des Hepatitis B Proteins (weiniger also 0,05% des Gesamtproteins).
Für die Expression humaner Antikörper (FAT und OAT schwere und leichte Ketten; von Sunol), wurde ein anderer pIC3011-basierter Vektor konstruiert. Schwere Ketten (HC) des humanisierten anti-TF Mega IgG1 (FAT) und IgG4(OAT), fusioniert mit einem pflanzlichen Signalpeptide, wurden in crTMV Arab. Act2-getriebenen Vektor kloniert, um pICP1284 (#101 C, Arab. Act2promoter: crTMV: IREScp148(cr): pspFAT-HC) und pICP1283 (#89C, Arab.Act2promoter.: crTMV: IREScp148(cr): pspOAT-HC) zu erhalten. Die leichte Kette (LC) pspLCIgGE:E wurde mit einem pflanzlichen Signalpeptid fusioniert und in crTMV Arab.Act2-getriebenen Vektor kloniert, um pICP1288 (#208C, Arab.Act2promoter: crTMV: IREScp148(cr): pspLCIgGE:E) zu ergeben. Dann wurden die HC- und LC-Konstrukte in losgelöste N. benthamiana Blätter bombardiert. Zusätzlich wurde das HC:LC-Verhältnis der Kunstrute bei der Kobombardierung variiert (1:1, 2:1, 3:1), und die bombardierten Blätter wurden 5, 6, 7, 8 Tage nach der Bombardierung getestet. ELISA auf assemblierte IgG und Western Bluts zeigten die Bildung gut messbarer Proteinmengen (sowohl HC- als auch LC-Fragmente). Jedoch wurde eine signifikante Überexpression von LC im Vergleich zu HC auf Western Bluts festgestellt. Die stärkste Expression wure 7 d. p. b. mit einem HC/LC-Verhältnis von 1:2 beobachtet (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 17
Konstruktion einesTMV cDNA Transkriptionsvektors, der ein Replikasegen in infizierten Zellen cap-unabhängig primiert
Das Hauptziel dieses Beispiel bestand in der Herstellung von sechs neuen TMV U1-basierten Viren mit modifizierten 5'UTR, die das Replikasegen cap-unabhängig exprimieren (Teile der TMV-U1 Omega-Sequenz sind untersrichen):

1) Kontrollmutante des wildtyp TMV-U1 – eine Ncol Stelle wird am Initiationscodon des Replicasegens eingeführt:
2) Der Omega-leader des TMV-U1 wurde vollständig durch IRES_MP,75 ^CR ersetzt:
3–4) Da angenommen wurde, dass die ersten 8 Nukleotide der TMV-U1 5'UTR für die Virusreplikation notwendig sind (Watanabe et al., 1996, J. Gen. Virol. 77, 2353–2357), wurde IRES_MP,75 ^CR anstatt des TMV-U1 Omega-Leaders eingefügt, wobei die ersten 8 Nukleotide intakt gelassen wurden:
oder die ersten 18 Nukleotide wurden intakt gelassen:
5) IRES_MP,75 ^CR wurde zwischen die Nukleotide 8 und 18 des Omega-Leaders inseriert:
6) IRES_MP,75 ^CR wurde zwischen die Nukleotide 18 und 19 des Omega-Leaders inseriert:

Die folgenden Primer wurden verwendet:

1) H3-T7-omega (im Fall der ersten Variante):
2) H3-T7-IRESmp (im Fall der zweiten Variante):
3) H3-T7-8U1-IRESmp (im Fall der dritten Variante):
4) H3-T7-18U1-IRESmp (im Fall der vierten Variante):
Für die Omegaversionen 5 und 6 wurden zwei weitere Oligonukleotide in Auftrag gegeben, zusätzlich zu den Primern 3 und 4:
5) IRESmp-19U1-plus:
6) 19U1-IRESmp-minus:
Weitere Primer, die zur Herstellung der Omegamutanten verwendet wurden:
7) IRESmp-NcoI (Reversprimer zur Herstellung einer IRES mit NcoI-Stelle am 3'-Ende):
8) U1-Repl-Nco-plus (Vorwärtsprimer, um die TMV-U1-Polymerase zu erhalten, ausgehend von der NcoI-Stelle):
9) U1-Repl-Sph-minus (Reversprimer zur Herstellung des 5'-Teils der Replikase vom AUG bis zur SphI-Stelle)
10) Omega-Nco-minus (Reversprimer zur Herstellung des 3'-Endes der Omegasequenz mit der NcoI-Stelle am Replikase AUG Codon)

Klonierstrategie:
Der TMV304 Klon (27) (Dawson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1832–1836; Lehto et al., 1990, Virology 174, 145–157) wurde als Templat für alle PCR-Reaktionen mit omegaspezifischen Primern verwendet; IRES_MP,75 ^CR wurde vom Plasmid pICH766 amplifiziert.
Das PCR-Fragment 1 wurde mit Primern 1 und 10 erhalten; Fragment 2 mit Primern 2 and 7. Für die Fragmente 3 und 4 wurden die Oligonucleotidkombinations 3+7 und 4+7 verwendet.
Die PCR-Fragmente 5 und 6 wurden in zwei Schritten amplifiziert. Zuerste wurden die Zwischenfragmente 5a, 6a (Primer 3+6 und 4+6) und 5b (5+10) erhalten. Dann wurden die Fragmente 5a/5b und 6a/5b anniliert und für die Amplifikation mit den folgenden Primerkombinations: 3+10 und 4+10 verwendet, um die PCR-Produkte 5 und 6 zu erhalten. Der N-terminale Teil der TMV-U1-Replikase (PCR Fragment 7, Nucleotidpositionen im Genom 68–450) wurde mit den Oligonucleotiden 8 und 9 amplifiziert, um eine NcoI-Stelle am Beginn des Replicasegens einzuführen. Fragment 1 wurde zusammen mit Fragment 7 simultan in pUC19 an HindIII und SphI-Stellen kloniert (Fragmente wurden über die NcoI-Stelle ligiert, was Plasmid pICH4552 ergab). Das gleiche Klonierverfahren wurde angewandt, um die anderen (PCR-Produkte 2–6) des Zwischenkonstrukts (HindIII-T7-Promoter-omega Mutante-NcoI-Replikase-SphI, Plasmide pICH4565, pICH4579, pICH4584, pICH4597, pICH4602) zu erhalten.
In der nächsten Stufe wurde das HindIII/SphI-Fragment von jedem der Zwischenkonstrukte zusammen mit dem EheI/HindIII-Fragment von pUC18 in das TMV304 Plasmid (siehe 27) zwischen die Ehe I- und SphI- Restriktionsstellen kloniert, um die cDNA-Konstrukte voller Länge der TMV-U1-Mutanten zu erhalten (6 verschiedene Versionen der Omegaregion mit und ohne IREScrmp75, Plasmide pICH 4735, 4744, 4752, 4765, 4771, 4788).
Diese Konstrukte wurden transkribiert in vitro und in Nicotiana benthamiana (systemischer Wirt) und Nicotiana tabacum Samsun NN (necrotischer Wirt) zusammen mit dem TMV-U1 wildtyp Klon (TMV304) auf Infektivität getestet. Wildtyp Virus und pICH4735 (Kontrollmutante, NcoI-Stelle ist zu Anfang des Replikasegens eingeführt) zeigten systemische Infektion in N. benthamiana und typische nekrotische Läsionen in Samsun NN Pflanzen 3–4 Tage nach der Inokulation (dpi). Keiner der anderen Mutanten verursachte lokale Läsionen in NN Pflanzen. Zumindest ein Konstrukt pICH 4771 (Omega 1–8 b. p./IRESmp75/omega 18–67 b. p.) verursachte eindeutige Symptome einer systemischen Ausbreitung; die Entwicklung dieser Symptome war im Vergleich zu einer Infektion mit wildtyp TMV-U1 und pICH 4735 später (7dpi). Dies zeigt die grundsätzliche Möglichkeit, das virale Replicasegen cap-unabhängig zu exprimieren, z. B. um Pflanzen mit nichtgecappten RNA-Transkripten zu infizieren, die mittels IRES_MP,75 ^CR oder einer anderen IRES, die in Pflanzenzellen funktionell ist, zu translatieren.
Beispiel 18
Konstruktion der tobamoviralen Vektoren Act2/crTMV und Act2/crTMV IRES_MP,75 ^CR(IRES_CP,148 ^CR)-GFP beruhend auf Actin 2-Transkriptionspromotoren
Das Hauptziel dieses Beispiels ist es, eine Strategie zur Konstruktion eines neuen crTMV-basierten Vektors zu zeigen, mit dem die Expression viraler Genome in Pflanzenzellen unter der Kontrolle eines effizienten Actin 2-Transkriptionspromotors von Arabidopsis thaliana erfolgt (An et al., 1996, Plant J., 10, 107–121. Dies erlaubt die Verwendung der Vektoren Act2/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GFP und Act2/crTMV/IRES_CP148 ^CR-GFP für die Genexpression in Pflanzen.
1. Act2-Promoterklonierung in pUC19
Der Act2-Transkriptionspromotor wurd aus dem Plasmid pACRS029 (pIC04) durch Verdau mit KpnI und Pst herausgeschnitten und in pUC19, das mit KpnI und PstI verdaut worden war, kloniert (Konstrukt pICH1364).
2. Fusion des 5'-Terminus des crTMV-Genoms zum Act2-Transkriptionsstart ohne zusätzliche Sequenzen.
Für diesen Schritt wurden die folgenden Primer verwendet:

1) BsrGI-Act2:
2) PvuI-cr:
3) Act2-cr-plus:
4) cr-Act2-minus:

PCR-Fragment 1 wurde mit Primern 1 und 4 erhalten, Fragment 2 wurde amplifiziert mit Oligonucleotiden 2 und 3. Beide Fragmente wurden anniliert und für die zweite Amplifikationsrunde mit den Primern 1 und 2 verwendet, um PCR-Produkt 3 zu erhalten, das in den pGEM-T Vektor (Promega) kloniert wurde. Es wurde Konstrukt pICH1823 erhalten, das das 3'-Ende des Actin2-Promotors (von der BsrGI-Stelle zum Transkriptionsstart) und den 5'-terminalen Teil des crTMV-Genoms (bis zur einzigen PvuI-Stelle) enhält. In diesem Konstrukt liegt das erste Nukleotid des viralen Genoms (G) direkt stromabwärts des angenommenen Transkriptionsstarts (A) des Actin2-Promotors, so dass das erwartete virusspezifische Transkript ein zusätzliches Nukleotid (A) am 5'-Ende enthalten sollte, was normalerweise nicht die effiziente Replikation des viralen Genoms beeinträchtigt.
3. Klonieren des übrigen Genoms
Konstrukt pICH1364 wurde mit BsrGI/HindIII verdaut und mit den folgenden Fragmenten ligiert: BsrGI/PvuI aus pICH1823, PvuI/SacI und SacI/BamHI aus dem crTMV cDNA Klon und das BamHI/HindIII Insert aus dem Plasmid pICO2 (nos Transkriptionsterminator). Das Endkonstrukt (pICH1983) wurde mittels Partikelbombardierung in Nicotiana benthamiana Blättern wie zuvor beschrieben getestet (Morozov et al., 1997, Journal of General Virology 78, 2077–2083). Die Infektivität wurde nach Reinokulation von Nicotiana tabacum Samsun NN Pflanzen (nekrotischer Wirt) mit dem Blattmaterial von N.benthamaina 3 Tage nach der Bombardierung geprüft.
4. Klonieren der Vektoren mit Actin2-Promotor und GUS- und GFP Genen.
Um die fertigen Konstrukte zu erhalten, wurden die XhoI/NotI Fragmente entweder von T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS und T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS (2) oder T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GFP und T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GFP in das pIC1823 Konstrukt kloniert. Die erhaltenen Plasmide wurden mittels Partikelbombardierung getestet und zeigten GUS- und GFP-Expression Nicotiana benthamiana Blättern.

Claims

Verfahren zur Expression eines gewünschten Gens in Pflanzenzellen oder in Pflanzen, umfassend das Einführen eines Vektors in Pflanzenzellen oder in Zellen der Pflanze, wobei der Vektor eine primäre rekombinante RNA produziert, die sich in den Pflanzenzellen oder in den Zellen der Pflanze repliziert, wobei die RNA (i) eine Nukleinsäure mit einer Sequenz für mindestens ein zu exprimierendes nichtvirales Gen umfasst, (ii) mindestens ein IRES-Element besitzt, das für die Translation des nichtviralen Gens, das stromabwärts vom IRES-Element liegt, notwendig ist, (iii) für eine Replikase zur Replikation des RNA-Vektors in Pflanzenzellen kodiert, (iv) ein Gen enthält, das für ein Hüllprotein kodiert, und ein Gen, das für ein Protein zur Ausbreitung von Zelle zu Zelle oder zur Ausbreitung über lange Distanzen kodiert, und (v) ein 3'-NTR.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Vektor zusätzlich mindestens einen Teil einer Sequenz des Wirtspflanzengenoms in antisense-Orientierung zur Suppression eines Gens in der Wirtspflanze enthält.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Sequenz in antisense-Orientierung ein Gen supprimiert, das für die CAP-abhängige Translation in Pflanzen essentiell ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Vektor eine Nuldeinsäure umfasst, die für mindestens ein IRES-Element kodiert oder mindestens ein solches aufweist, das für die Translation eines Gens, das für die Amplifikation des Vektors notwendig ist und stromabwärts des IRES-Elements gelegen ist, benötigt wird, wobei der Vektor weiterhin mindestens einen Teil einer Sequenz des Wirtspflanzengenoms in antisense-Orientierung umfasst, um ein Gen der Wirtspflanze zu supprimieren.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Vektor von einem Pflanzenvirus abstammt.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Vektor für ein Protein oder für Proteine kodiert, das/die eine Funktion bei der Amplifikation hat/haben.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das IRES-Element von einem Pflanzenvirus abstammt.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das IRES-Element ein Multimer von mindestens einer Sequenz ist oder ein solches Multimer umfasst, wobei die Sequenz komplementär zu einem IRES-bindenden Segment einer natürlichen 18S rRNA ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Translation von einem oder mehreren Genen, die von dem Vektor kodiert werden, CAP-unabhängig ist.