CN101578111A - 禽流感疫苗和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及流感疫苗且特别涉及禽流感疫苗(AIV)。本发明包括制备转基因植物细胞的方法，所述转基因植物细胞表达具有特定同源性的已知HA1多肽，所述已知HA1多肽用于制备疫苗组合物，本发明还包括在个体、动物、哺乳动物或人中诱导保护性免疫的方法。

Description

禽流感疫苗和使用方法
相关申请的交叉参考
本申请要求保护2006年4月21日提交的美国临时申请序列号60/793,804的利益，所述临时申请特此完整引入作为参考，包括所有的图、表和氨基酸或核酸序列。
背景技术
近期对已发表的来自越南H5N1菌株的血凝素(HA)序列的检测表明，这些高致病菌株比先前观察的菌株更易变异。因此不期望与攻击菌株具有低于90％同源性的疫苗在控制症状或减少散播(shedding)中有效。
我们已评估了完整氨基酸序列的公开资料，并发现H5血清型血凝素(HA)病毒蛋白的HA1片段与火鸡Wisconsin 68菌株在氨基酸水平上的序列同源性是100至83％同源。Swayne等(Vet Micro，2000，74：165-172)的近期出版物已显示基于AIV疫苗的禽痘载体HA能够在AIV菌株的异源型攻击试验中预防感染，所述AIV菌株包含与免疫疫苗相比具有87％或更高氨基酸同源性的HA1。该作者推断“与病原体HA1具有低于90％同源性的疫苗将很可能在AI攻击或野生病毒(field virus)从呼吸道散播中导致不一致的降低”。
发明概述
本发明提供在动物或人中诱导抵抗禽流感病毒(AIV)菌株的免疫保护性应答的方法，所述方法包括：
a)在植物细胞中表达核酸序列，表达产物包含已知HA1可变区多肽的，所述已知HA1可变区多肽与攻击菌株HA1可变区多肽具有约70％到约90％的同源性；
b)使用在所述植物细胞中表达的已知HA1可变区多肽来制备疫苗组合物，并；
c)对动物或人施用所述疫苗组合物，使得在所述动物或人中诱导保护性免疫应答。
本发明还提供用于实施上述方法的载体、宿主细胞和新疫苗组合物。此类疫苗组合物包含植物产生的已知HA1多肽序列，当向动物或人施用所述HA1多肽序列时，其与攻击菌株相比以低于90％的同源性水平提供保护性免疫。
序列简述
下面显示的是流感A/火鸡/Wisconsin/68的禽流感HA蛋白质序列。该HA蛋白质含有568个氨基酸并显示5个不同结构域，所述结构域包括：信号肽(氨基酸1-16)；片段H1的可变头区(氨基酸17-323[此处也称作HA1])；片段H2的恒定碱基区(氨基酸324-527)；跨膜结构域(氨基酸528-557)；和胞内硫酯脂类片段(氨基酸558-568)。
下面显示的是全长序列和上面鉴定的片段：
全长禽流感HA蛋白质(SEQ ID NO：1)：
MERIVIALAIISVVKGDQICIGYHANNSTKQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKEHNGKLC
SLKGVRPLILKDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKDNPTNGLCYPGDFNDY
EELKYLMSNTNHFEKIQIIPRNSWSNHDASSGVSSACPYNGRSSFFRNVVWLIKKSNA
YPTIKRTYNNTNVEDLLILWGIHHPNDAAEQTELYQNSNTYVSVGTSTLNQRSIPEIA
TRPKVNGQSGRIEFFWTILRPNDAISFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMRSELEYGN
CDTKCQTPVGAINSSMPFHNVHPLTIGECPKYVKSDKLVLATGLRNVPQRETRGLFG
AIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGITNKVNSIIDKMN
TQFEAVGKEFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSYVK
NLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEESRLNREE
IDGVKLESMGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSF WMCSNGSLQCRICI；
信号肽(SEQ ID NO：2)：MERIVIALAIISVVKG；
H1可变头区片段(HA1)(SEQ ID NO：3)：
DQICIGYHANNSTKQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKEHNGKLCSLKGVRPLILKDCSV
AGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKDNPTNGLCYPGDFNDYEELKYLMSNTNHFE
KIQIIPRNSWSNHDASSGVSSACPYNGRSSFFRNVVWLIKKSNAYPTIKRTYNNTNVE
DLLILWGIHHPNDAAEQTELYQNSNTYVSVGTSTLNQRSIPEIATRPKVNGQSGRIEFF
WTILRPNDAISFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMRSELEYGNCDTKCQTPVGAINSS
MPFHNVHPLTIGECPKYVKSDKLVLATGLRNVPQRETR；
H2碱基恒定片段(SEQ ID NO：4)：
GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGITNKVNSII
DKMNTQFEAVGKEFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFH
DSYVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEES
RLNREEIDGVKLESMGTY；
跨膜锚钩(SEQ ID NO：5)：QILSIYSTVASSLALAIMVAGLSFWMCS；和
胞内硫酯脂类片段(SEQ ID NO：6)：NGSLQCRICI。
下面显示的是另一禽流感蛋白质序列，A/绿头鸭(Mallard Duck)/Pensylvania/10218/84(H5N2；登录号AAF04720)。下面显示的是全长序列和上面鉴定的片段：
全长HA蛋白质(SEQ ID NO：7)：
MERIVIALAIISVVKGDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKEHNGKLC
SLKGVRPLILKDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKDNPVNGLCYPGDFNDY
EELKHLMSSTNHFEKIQIIPRSSWSNHDASSGVSSACPYNGRSSFFRNVVWLIKKNNA
YPTIKRTYNNTNVEDLLILWGIHHPNDATEQTKLYQNSNTYVSVGTSTLNQRSIPEIA
TRPKVNGQSGRMEFFWTILRPNDAISFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYG
NCNTKCQTPVGAINSSMPFHNVHPLTIGECPKYVKSDKLVLATGLRNVPQRETRGLF
GAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGITNKVNSIIDKM
NTQFEVVGKEFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNV
RNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEESRLNR
EEIDGVKLESMGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLSFWMCSNGSLQCRICI；
信号肽(SEQ ID NO：8)：MERIVIALAIISVVKG；
H1可变头区片段(HA1)(SEQ ID NO：9)：
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKEHNGKLCSLKGVRPLILKDCSV
AGWLLGNPMCDEFLNVPEWSYIVEKDNPVNGLCYPGDFNDYEELKHLMSSTNHFEK
IQIIPRSSWSNHDASSGVSSACPYNGRSSFFRNVVWLIKKNNAYPTIKRTYNNTNVED
LLILWGIHHPNDATEQTKLYQNSNTYVSVGTSTLNQRSIPEIATRPKVNGQSGRMEFF
WTILRPNDAISFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSELEYGNCNTKCQTPVGAINS
SMPFHNVHPLTIGECPKYVKSDKLVLATGLRNVPQRETR；
H2碱基恒定片段(SEQ ID NO：10)：
GLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGITNKVNSII
DKMNTQFEVVGKEFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFH
DSNVRNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTY；
跨膜锚钩(SEQ ID NO：11)：QILSIYSTVASSLALAIMVAGLSF；和
胞内硫酯脂类片段(SEQ ID NO：12)：NGSLQCRICI。
发明详述
对常规疫苗的期望是它们将提供保护免受流感菌株的感染，所述流感菌株与用于制备疫苗的多肽序列相比具有99％到100％的同源性。在植物产生的疫苗的情况下，控制具有约70％到90％同源性的广谱流感菌株的未预期性质导致控制更多异型流感类型并改善疫苗功效的能力。
据信因为植物产生的疫苗亚单位抗原整合到提供佐剂性质的植物的膜细胞基质和糖类组分中，所以所述抗原优于常规制备的亚单位抗原。植物产生的抗原与非植物产生的平台相比，还包含独特的糖类糖基化模式。
还相信此类植物聚糖结构有助于提高交叉保护的范围，并且使用植物细胞或植物细胞基质组分中未完全纯化的抗原也可以部分引起保护个体免受AIV感染的能力，所述AIV与此处公开的HA1多肽具有约90％到约70％的同源性。应当理解在约70.0％到约90.0％同源性间任何比例的同源性均清楚的涵盖于本发明中。因此，已知的HA1可变区多肽与攻击菌株HA1可变区多肽可以具有至少70％并低于Y％的同源性，其中Y选自87.0％、86.5％、86.0％、85.5％、85.0％、84.5％、84.0％、83.5％、83.0％、82.5％、82.0％、81.5％、81.0％、80.5％、80.0％、79.5％、79.0％、78.5％、78.0％、77.5％、77.0％、76.5％、76.0％、75.5％、75.0％、74.5％、74.0％、73.5％、73.0％、72.5％、72.0％、71.5％或71.0％。或者，已知的HA1可变区多肽与攻击菌株HA1可变区多肽可以具有70％到71.0％、71.5％、72.0％、72.5％、73.0％、73.5％、74.0％、74.5％、75.0％、75.5％、76.0％、76.5％、77.0％、77.5％、78.0％、78.5％、79.0％、79.5％、80.0％、80.5％、81.0％、81.5％、82.0％、82.5％、83.0％、83.5％、84.0％、84.5％、85.0％、85.5％、86.0％、86.5％或87.0％的同源性。
如US 2004/0268442和WO 2004/098533中描述，本发明HA1多肽可以从它们的表达系统中完全或部分纯化，所述US 2004/0268442和WO2004/098533完整引入本文作为参考。因此，部分纯化的HA1多肽可以存在于包括植物细胞表达系统(在其中制备多肽)多种部位或部分的组合物中。例如，如果植物表达系统用于产生HA1多肽，包含此处鉴定的纯化HA1多肽的组合物可以包括植物细胞组分(例如，细胞壁、植物细胞膜的细胞基质和糖类，等等)或植物细胞基质组分。
分离的植物匀浆中的重组的植物产生的抗原可以含有多种植物成分，所述植物成分包括但不局限于细胞壁物质、小糖类、膜、脂类组分、蛋白质、核酸及小的生物合成中间体和次级代谢产物。此类植物产生的疫苗制剂通常以比在常规系统中纯化至同质性的或制备的相同抗原更高的效价刺激免疫应答。与配制的原材料或常规制备的疫苗抗原相比，认为通过富集制备的植物细胞产生的抗原在引起抗体产生中未预料到的更高应答是由于抗原向免疫系统细胞的独特呈递以及抗原在处理、制备和储存过程中提高的稳定性。
植物基质或组分对抗原活性的协同或佐剂样影响是植物表达平台独特的性质。该改良性质提供了施用更少剂量抗原的能力并提供了免受疾病攻击的更好保护。
相信此处描述的制剂中所包含的植物产生的抗原和植物细胞基质通过优先靶定专职抗原呈递细胞(APC)而对动物中的细胞和体液免疫应答具有显著影响。该优先靶定通过植物基质和/或植物产生的抗原，尤其是植物糖基化(glycosolated)抗原直接与APC上的甘露糖受体和相关C型凝集素受体相互作用而发生。这些APC能够通过它们表面上的其它受体(例如II类主要组织相容性复合物)处理这些抗原并将这些抗原呈递到免疫系统的其它组分中，并可以驱动体液和细胞介导的免疫应答。当作为植物细胞基质的整体部分和/或植物糖基化抗原呈递时，可以直接与APC细胞相互作用的抗原显著增强1类和2类T辅助(Th)细胞的增殖。通过它们的MR或相关凝集素受体与这些APC的靶向相互作用引起强烈的细胞和体液免疫应答。与CD8+T细胞免疫相关的细胞免疫仅通过用活减毒病原体接种而实现。该免疫是控制类似利什曼原虫(Leshmania spp)和病毒的胞内病原体的重要条件。(D.M.Pardoll，Nat Med.1998.4，525-531.)
多种已知HA多肽可变区的氨基酸位置将不同于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7的HA1区的氨基酸位置；然而，本领域技术人员可以容易地辨别此类区域(见例如De BK；Brownlee GG；Kendal AP；Shaw MW.1988，Nucleic Acids Res.，16，4181-4182，特此完整并入作为参考)。在自然感染中，灭活的HA在细胞外通过一种或多种由支气管上皮细胞分泌的胰岛素样精氨酸特异的内切蛋白酶而加工成熟为HA1和HA2。参与该过程的一种确定的蛋白酶是克拉拉类胰蛋白酶。通过HA确定宿主生物的感染程度。流感病毒从极化上皮细胞(例如支气管上皮细胞)的上表面发芽进入肺腔(lumen of lung)并因此通常是亲肺性的。HA1片段结合细胞表面上含唾液酸的受体，致使病毒颗粒附着至细胞。它在确定宿主范围限制性和毒力中也起主要作用。HA1片段是1类病毒融合蛋白并负责通过介导内吞病毒颗粒的膜与内体膜的融合来使病毒侵入到细胞质中。内体中的低pH值诱导HA2不可逆的构象改变，释放融合疏水肽。需要若干三聚体形成活性融合孔。
短语“异源禽流感病毒”或“异源禽流感病毒菌株”将解释为表达异源或相关HA1多肽的禽流感病毒(或菌株)，所述HA1多肽与植物产生的亚单位疫苗抗原的氨基酸序列显示出约70％到约90％的序列同源性。
为了确定疫苗可能具有的用于保护免受流感异型菌株感染的活性谱，进行氨基酸序列同源性比较。使用氨基酸17到323的序列通过BLAST分析比较H1可变头部片段的同源性进行该同源性分析。如下进行blast分析：从ftp地址(ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/FASTA)将NCBI非冗余蛋白质数据库作为nr.gz.下载到在Linux(Red Hat Enterprise Linux 3.2)或UNIX(Solaris 8)下运行的电脑中。用gunzip程序将该压缩文件解压缩，然后用随BLAST安装产生的程序formatdb进行格式化用于BLAST。通过网页界面或在命令行上使用BLAST程序的本地实例，根据搜索是否返回超过500个显著结果(网页极限)和BLAST分析后待完成的分析来进行查询序列相对于格式化nr数据库的blastp搜索(UNIX上为版本2.2.4或Linux上版本为2.2.13)。登录序列数据库的流感病毒(数目)目前为数以千计的蛋白质。
所获分析报道了与参考序列具有统计学上显著的同源性的那些序列。统计学显著性依赖于参数的设置如所用的评分矩阵和所选的期望值及开放和扩展缺口的代价及错配罚分。所用参数是BLAST程序的默认参数。
也可以将包含此处描述的已知HA1片段的多肽融合到一种或更多异源多肽序列中(例如，促进本发明多肽纯化的标记物)(见，例如，美国专利号6,342,362，该专利完整引入本文作为参考；Altendorf等[1999-WWW，2000]″Structure and Function of the F0 Complex of the ATPSynthase from Escherichia CoIi，″J.of Experimental Biology 203：19-28，The Co.of Biologists，Ltd.，G.B.；Baneyx[1999]″Recombinant ProteinExpression in Escherichia coli，″Biotechnology 10：411-21，Elsevier ScienceLtd.；Eihauer等[2001]″The FLAGTM Peptide，a Versatile Fusion Tag forthe Purification of Recombinant Proteins，″J.Biochem Biophys Methods49：455-65；Jones等[1995]J.Chromatography 707：3-22；Jones等[1995]″Current Trends in Molecular Recognition  and Bioseparation，″J.ofChromatography A.707：3-22，Elsevier Science B.V.；Margolin[2000]″Green Fluorescent Protein as a Reporter for MacromolecularLocalization in Bacterial Cells，″Methods 20：62-72，Academic Press；Puig等[2001]″The Tandem Affinity Purification(TAP)Method：A GeneralProcedure of Protein Complex Purification，″Methods 24：218-29，Academic Press；Sassenfeld [1990]″Engineering Proteins forPurification，″TibTech 8：88-93；Sheibani[1999]″Prokaryotic Gene FusionExpression Systems and Their Use in Structural and Functional Studies ofProteins，″Prep.Biochem.&Biotechnol.29(l)：77-90，Marcel Dekker，Inc.；Skerra等[1999]″Applications of a Peptide Ligand for Streptavidin：theStrep-tag″，Biomoleculαr Engineering 16：79-86，Elsevier Science，B.V.；Smith[1998]″Cookbook for Eukaryotic Protein Expression：Y east，Insect，and Plant Expression Systems，″The Scientist 12(22)：20；Smyth等[2000]″Eukaryotic Expression and Purification of Recombinant ExtracellularMatrix Proteins Carrying the Strep II Tag″，Methods in Molecular Biology，139：49-57；Unger[1997]″Show Me the Money：Prokaryotic ExpressionVectors and Purification Systems，″The Scientist ll (17)：20，每一文献完整引入本文作为参考)，或来自售主如STRATAGENE(La Jolla，CA)、NOVAGEN(Madison，WI)、QIAGEN，Inc.，(Valencia，CA)或InVitrogen(San Diego，CA)的市售标记物。例如，异源序列包括转录非翻译序列，其在转录和mRNA加工，如mRNA核糖体结合和稳定性中起作用。异源序列或者可以包含提供其他功能性的其他编码序列。因此，可以将编码多肽的核苷酸序列融合到标记物序列，如利于融合多肽纯化或检测的肽的编码序列。在本发明该方面的某些实施方案中，标记物氨基酸序列是六组氨酸肽，如pQE载体(QIAGEN)或其他许多市售载体中任何一种提供的标记物。例如，六组氨酸提供了融合蛋白的便利纯化(见，Gentz等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA Feb；86(3)：821-4，其公开内容以其整体引入作为参考)。本发明多肽也可以与免疫球蛋白(IgA、IgE、IgG、IgM)的恒定结构域或其部分(CH1、CH2、CH3，包括整个结构域和其部分的其任何组合)融合，产生嵌合的多肽。这些融合蛋白方便纯化，并在体内显示增加的半寿期。在其它实施方案中，此处描述并使用的HA多肽可以融合到具有佐剂活性的异源多肽序列上(多肽佐剂)。此类多肽的非限制性实例包括热休克蛋白(hsp)(见，例如，美国专利号6,524,825，其公开内容特此完整并入作为参考)。
用于制备上述组合物的佐剂或免疫刺激组分包括但不局限于铝盐、矿物油、分枝杆菌产品(例如，弗氏完全佐剂或不完全佐剂)或载体如植物糖苷皂苷、胆固醇和磷脂酰胆碱的混合物，其提供载体用于若干拷贝蛋白质在笼形结构中呈现。为该说明书的目的，佐剂是强化、增加、调节或增强对免疫原或抗原的免疫应答的物质。佐剂通常对体液和细胞免疫应答都增强，但在缺少其中一项应答时，对另一项应答的增强也符合佐剂定义。此外，佐剂和其用途是免疫学家熟知的，通常在免疫原剂量受限、免疫原具弱免疫原性、或采用次最佳给药途径时用于增强免疫应答。因此，术语“佐剂量”是指能够增强对给定免疫原或抗原的免疫应答的佐剂量。等于“佐剂量”的量是变化的，取决于多种因素，包括(但不限于)免疫原的特征、免疫原的施用量、宿主物种、给药途径和免疫原的施用方案。在特定的一组环境中，“佐剂量”可以通过常规实验容易地确定。这在本领域技术人员的范围内，并通常使用针对改变的免疫原和佐剂给药量的常规剂量反应测定来实施。通过使用酶联免疫吸附测定、放射免疫测定、血细胞凝集试验等测定针对该免疫原产生的血清抗体效价或细胞介导的应答，从而测量应答。
接种定义为通过用免疫原性制剂、免疫保护性颗粒或致病因子的免疫原性制剂，或其无毒形式或部分接种宿主，以使宿主免疫系统受到刺激并防止或减轻与日后暴露于该病原体的宿主反应相关的有害病理，从而提供抗病原体的保护作用。在本发明的情况下，用本发明组合物接种导致死亡率或死亡和/或病毒从呼吸道散播的降低。
施用定义为向动物(包括人)体内引入物质，包括口服、鼻、眼、直肠、阴道和胃肠外途径。组合物可以通过任何给药途径单独地或与其它治疗剂联合施用，包括(但不限于)通过皮下(SQ)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)、皮内(ID)、通过鼻、眼或口粘膜(IN)或通过口服施用。
本发明也提供使用分离的、重组的和/或纯化的已知多核苷酸序列的方法，所述多核苷酸序列包含：
a)编码已知HA1可变区多肽的多核苷酸序列，所述多肽与攻击菌株HA1可变区多肽具有约70％到约90％的同源性；
b)与(a)中阐明的多核苷酸互补的多核苷酸；
c)包含如(a)或(b)中阐明的多核苷酸序列的遗传构建体；
d)包含如(a)、(b)或(c)中阐明的多核苷酸或遗传构建体的载体；或
e)包含如(a)、(b)、(c)或(d)中阐明的多核苷酸、遗传构建体或载体的宿主细胞。
术语“核苷酸序列”、“多核苷酸”或“核酸”可以互换使用并根据本发明理解为双链DNA、单链DNA或所述DNA的产物或转录本(例如，RNA分子)。也应理解本发明不涉及它们自然环境或自然状态中的多核苷酸序列。可以通过分离方法来分离、纯化(或部分纯化)本发明的核酸、核苷酸或核苷酸序列，所述分离方法包括但不局限于离子交换层析、分子大小排阻层析，或通过遗传工程方法如扩增、扣除杂交、克隆、亚克隆或化学合成或这些遗传工程方法的组合。
可以使用本领域已知并在公共可进入数据库中可得到的多种序列比较算法和程序中的任何一种来评估蛋白质和核酸序列的同源性(例如，见环球网址：ebi.ac.uk/fasta33/index.html(European Biotechnology Institute)；或ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/(National Center for BiotechnologyInformation))。此类算法和程序包括但决不局限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci USA，85(8)：2444-2448；Altschul等，1990，J.MoI.Biol，215(3)：403-410；Thompson等，1994，Nucleic Acids Res.，22(2)：4673-4680；Higgins等，1996，Methods Enzymol，266：383-402；Altschul等，1990，J MoIBiol，215(3)：403-410；Altschul等，1993，Nature Genetics，3：266-272)。通常使用由售主提供的默认参数或使用上述参考文献中阐明的那些参数来进行序列比较，所述参考文献特此完整并入作为参考。
如此处所用，“互补性”多核苷酸通常指产生于双链核酸分子(DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA)中特定嘌呤和特定嘧啶间氢键的序列。主要的特异配对是鸟嘌呤和胞嘧啶及腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶。“互补性”多核苷酸序列也可以称作“反义”多核苷酸序列或“反义序列”。
也可以通过杂交研究在高度严紧性、中度严紧性和/或低度严紧性下确定序列同源性和序列同一性。可以使用多种程度的杂交严紧性。条件越严格，双螺旋形成需要的互补性就越高。条件的严格程度可以通过温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间等等来控制。优选地，杂交在低度、中度或高度严紧性下通过本领域熟知的技术进行，例如在Keller，G.H.，M.M.Manak(1987)DNA Probes，Stockton Press，New York，NY.，169-170页中有描述。
例如，DNA印迹中固定的DNA与32P-标记的基因特异性探针的杂交可以通过标准方法进行(Maniatis等，1982，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。通常，杂交和后续的漂洗可以在可检测到与示例性多核苷酸序列具有同源性的靶定序列的中度至高度严紧性条件下进行。对于双链DNA基因探针，杂交可以在6X SSPE、5X Denhardt′s溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中以低于DNA杂化物解链温度20-25℃的温度进行过夜。解链温度由以下公式描述(Beltz等，1983，Methods of Enzymology，R.Wu，L.Grossman和K.Moldave编辑Academic Press，New York，100：266-285)。
Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/碱基对中双螺旋的长度。
漂洗通常如下进行：
(1)在室温下IX SSPE、0.1％SDS中15分钟，两次(低度严紧性漂洗)；
(2)在Tm-20℃下0.2X SSPE、0.1％SDS中15分钟，一次(中度严紧性漂洗)。
对于寡核苷酸探针，杂交可在6X SSPE、5X Denhardt′s溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中以低于杂交解链温度10-20℃的温度进行过夜。寡核苷酸探针的Tm可以由以下公式确定：
Tm(℃)＝2(T/A碱基对数)+4(G/C碱基对数)(Suggs等，1981，ICN-UCLA Symp.Dev.Biol.Using Purified Genes，D.D.Brown编辑，Academic Press，New York，23：683-693)。
漂洗通常如下进行：
(1)在室温下IX SSPE、0.1％SDS中15分钟，两次(低度严紧性漂洗)；
(2)在杂交温度下1X SSPE、0.1％SDS中15分钟，一次(中度严紧性漂洗)。
通常，可以改变盐和/或温度来改变严紧性。标记DNA片段长度＞70或长度为70个碱基左右，可以使用以下条件：
低：1或2X SSPE，室温
低：1或2X SSPE，42℃
中度：0.2X或IX SSPE，65℃
高：0.1X SSPE，65℃。
通过另一非限制性实施例，使用高度严紧性条件的方法也可以如下进行：含DNA的滤膜的预杂交在由6X SSC、50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％菲可、0.02％BSA和500μg/ml变性鲑精DNA组成的缓冲液中65℃进行8小时至过夜。滤膜于优选杂交温度65℃下在含100μg/ml变性鲑精DNA和5-20x 106cpm32P标记探针的预杂交混合物中杂交48小时。或者，杂交步骤可以于65℃，在SSC缓冲液存在下进行，IX SSC对应0.15M NaCl和0.05M柠檬酸钠。随后，可以在含2X SSC、0.01％PVP、0.01％菲可和0.01％BSA的溶液中于37℃下进行1小时来完成滤膜漂洗，接着在0.1X SSC中于50℃漂洗45分钟。或者，可以在含2X SSC和0.1％SDS，或0.5X SSC和0.1％SDS，或0.1X SSC和0.1％SDS中于68℃每间隔15分钟进行滤膜漂洗。在漂洗步骤后，通过放射自显影检测杂交探针。可以使用的其它高度严紧性条件为本领域所熟知并如在Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，9.47-9.57页；和Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.中引用，所述文献此处以其整体引入。
使用中度严紧性条件的方法的另一非限制性实施例如下：将含DNA的滤膜预杂交，并然后在5X SSC缓冲液和标记探针的存在下于温度60℃下杂交。随后，在含2X SSC的溶液中于50℃进行滤膜漂洗并通过放射自显影检测杂交探针。可以使用的其它中度严紧性条件为本领域所熟知并如在Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，9.47-9.57页；和Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.中引用，所述文献此处以其整体引入。
双链体的形成和稳定性依赖于杂化物两条链间的基本互补性，并如上指出，可以容许一定程度的错配。因此，本发明的探针序列包括所述序列的突变(单突变和多突变)、缺失、插入及其组合，其中所述突变、插入和缺失允许与靶定目的多核苷酸稳定杂化物的形成。可以以许多方法在指定多核苷酸序列中产生突变、插入和缺失，并且这些方法为普通技术人员已知。其它方法将来可能变为已知的。
本领域也熟知的是限制酶可以用于获得目标DNA序列的功能片段。例如，Bal3l核酸外切酶可以方便地用于DNA时控的限制性消化(通常称为“erase-a-base”方法)。见，例如，Maniatis等，1982，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Wei等，1983，J.Biol.Chem.，258：13006-13512。
本发明也提供遗传构建体，其包含：a)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含与攻击菌株HA1可变区多肽具有约70％至约90％同源性的已知HA1可变区多肽，或由该多肽组成。本发明的遗传构建体将还包含其他的调控元件如启动子和增强子和，任选地，选择标记。
含有如此处阐明的遗传构建体的载体或表达盒，或含有编码上文阐明的多肽并有效连接到调控元件上的多核苷酸的载体或表达盒也在本发明的范围内。载体和表达盒也可包含额外的转录控制序列。载体和表达盒还可以包含选择标记。表达盒可以包含至少一种额外的基因，所述基因有效连接到控制元件上，以共转化到生物中。或者，一种或多种额外的基因和控制元件可以提供在多个表达盒上。此类表达盒提供有大量限制性酶切位点用于插入本发明的序列，使其处于调节区的转录调节下。一种或多种表达盒可以额外地包含有效连接到控制元件的选择标记基因。
表达盒在转录的5′-3′方向将包括转录和翻译起始区、本发明的DNA序列及转录和翻译终止区。转录起始区、启动子对于宿主细胞而言可以是天然的或模拟的，或外来的或异源的。此外，启动子可以是天然序列或可选地是合成序列。“外来的”旨为在引入转录起始区的天然植物中没有发现转录起始区。如此处所用，嵌合基因包含有效连接到与编码序列异源的转录起始区的编码序列。
本发明的另一方面提供用于此处教导的多核苷酸序列克隆和/或表达的载体。本发明的载体，包括疫苗载体，也可以包含必需的元件，其允许所述核苷酸序列在指定宿主细胞中表达和/或选择。载体可以包含启动子、翻译起始和终止信号及调节转录的适当区域。在特定实施方案中，载体可以在宿主细胞中稳定维持，并可以任选地包含指导翻译蛋白质分泌的信号序列。根据所用的宿主细胞选择这些不同的元件。载体可以整合到宿主基因组中，或任选地是自主复制载体。
本发明也提供由此处公开的多核苷酸序列编码的多肽的表达，包括在允许多肽表达的条件下培养转化有本发明多核苷酸的宿主细胞，和任选地回收表达的多肽。
也可以通过第二种核酸序列调节公开的多核苷酸序列，使得蛋白质或肽在转化有重组DNA分子的宿主中表达。例如，可以通过本领域已知的任何启动子或增强子元件控制蛋白质或肽的表达。可以用于控制表达的启动子包括，但不局限于CMV-IE启动子、SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)、劳斯肉瘤病毒3′长端重复中包含的启动子(Yamamoto，等，1980，Cell，22：787-797)、单纯疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，1982，Nature，296：39-42)；原核载体，其包含启动子如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，75：3727-3731)或tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，80：21-25)；也见Scientific American，1980，242：74-94中的“Useful proteins from recombinant bacteria”；植物表达载体，其包含胭脂氨酸合成酶启动子区(Herrera-Estrella等，1983，Nature，303：209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等，1981，NuclAcids Res.，9：2871)，和光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等，1984，Nature，310：115-120)；来自酵母或真菌的启动子元件如Gal 4启动子、ADC(乙醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子和/或碱性磷酸酶启动子。
本发明载体是例如，质粒或病毒起源的载体。在特定实施方案中，使用这样的载体，其包含有效连接到编码蛋白质或肽的核酸序列(所述核酸序列包含在公开的多核苷酸序列中)的启动子、一个或多个复制起始位点和，任选一个或多个选择标记(例如抗生素抗性基因)。表达载体包含控制基因表达，包括在希望的宿主细胞中基因表达的调节序列。用于本发明多肽表达的示例性载体包括pET类型质粒载体(Promega)或pBAD质粒载体(Invitrogen)或以下实施例中提供的那些载体。此外，本发明载体用于转化宿主细胞以克隆或表达本发明的多核苷酸序列。
转基因植物
可用于产生上述组合物或免疫方案的多肽可来自或从转基因植物细胞中获得，所述转基因植物细胞已经过遗传改造来表达包含已知HA1可变区多肽或由已知HA1可变区多肽组成，所述HA1可变区多肽与攻击菌株HA1可变区多肽具有约70％到约90％的同源性。
此处将转基因植物定义为来源于转化的植物细胞或原生质体的植物细胞培养物、植物细胞系、植物组织培养物、低等植物、苔藓植物、单子叶植物、双子叶植物或它们的后代，其中转化的植物的基因组含有通过实验室技术引入的外源DNA，该外源DNA并非原初存在于相同物种的天然非转基因植物细胞中。术语“转基因植物”和“转化的植物”在本领域中有时作为定义其DNA中含有外来DNA分子的植物的同义词。转基因植物和转化植物还包括基因组已稳定转化重组病毒载体或瞬时表达重组病毒载体的方法和植物，所述重组病毒载体如在美国专利号5,550,360；5,846,795；4,885,248；5,173,410；5,602,242；5,627,060；5,804,439；WO 05/049839；WO 03/020938；WO 02/101006；WO 02/101060；WO 02/096192；WO02/088369；WO 02/08386；WO 02/29068；WO 02/46440和WO 02/068664中有描述。
利用众所周知的方法，如在Sambrook等(1989)和Ausubel等，(1987)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York，NY中公开的那些方法容易完成基因表达盒的构建，所述基因表达盒用于在植物中表达免疫保护性抗原。本发明也包括与公开的编码保护性抗原的序列具有基本序列同源性的DNA序列，使得它们能对表达具有所公开的影响。如本申请中所用，术语“基本序列同源性”用于表明核苷酸序列(DNA或RNA的情况下)或氨基酸序列(蛋白质或多肽的情况下)与另一核苷酸或氨基酸序列显示出基本的、功能的或结构的等同。具有基本序列同源性的序列间任何功能或结构的差异将是微小的；即它们将不影响序列行使如本申请中指出的功能的能力。与此处公开的序列具有基本序列同源性的序列通常是公开序列的变体，如突变，但也可以是合成的序列。
在制备本发明构建体时，可以操作多种DNA片段，以提供具有正确取向和适当时处于正确阅读框的DNA序列。衔接子或接头可以用于连接DNA片段，或可以包括其它操作以提供方便的限制性位点、除去多余DNA、除去限制性位点等等。
在实施各个步骤时，使用克隆以扩增含有目的启动子/基因的载体以便随后引入期望的宿主细胞。可以获得多种克隆载体，其中克隆载体包括在大肠杆菌(E.coli)中起作用的复制系统和允许选择转化细胞的标记物。示例性载体包括pBR322、pUC系列、pACYC184、Bluescript系列(Stratagene)等。因此，可以将序列插入载体的适当限制性位点处，用所得质粒转化大肠杆菌宿主(例如大肠杆菌HB101、JM101和DH5α株)，在适当营养培养基中生长大肠杆菌，收获并裂解细胞，回收质粒。分析可能涉及序列分析、限制性分析、电泳等。在每一操作之后，用于最终构建体中的DNA序列可以进行限制性消化并与下一序列连接，其中每一个部分构建体均可以克隆在相同或不同质粒中。
可以获得或可以容易地制备载体以用于转化植物细胞。一般地，质粒或病毒载体应含有在给定宿主中维持和表达外源DNA序列序列所必需的所有DNA控制序列。这些控制序列一般包括前导序列、编码翻译起始信号密码子的DNA序列、翻译终止密码子和编码控制信使RNA加工的3’UTR信号的DNA序列。本领域普通技术人员利用本公开的教导能选择适当元件以优化在任何特定物种中的表达。最后，载体应按需要具有标记基因，该标记基因能够提供允许鉴别含有载体的宿主细胞的表型性状。
插入植物细胞的外来编码序列的活性依赖于临近该插入物的内源植物DNA的影响。一般的，使用任何转化技术时，外源基因的插入似乎是随机的；但是目前存在制备在植物细胞中位点专一重组DNA的植物的技术(见WO91/09957)。任何导致一个或多个目的序列在启动子控制下表达的方法或方法组合均是可以接受的。
本发明不限于任何特定的转化植物细胞的方法。将DNA引入植物细胞的技术是本领域技术人员熟知的。用于将外源DNA递送至植物细胞中的四种基本方法已有描述。化学方法(Graham和van der Eb，Virology，54(02)：536-539，1973；Zatloukal，Wagner，Cotten，Phillips，Plank，Steinlein，Curiel，Birnstiel，Ann.N Y.Acad.Sci.，660：136-153，1992)；物理方法包括显微注射(Capecchi，Cell，1980，22(2)：479-488)、电穿孔(Wong和Neumann1982，Biochim.Biophys.Res.Commun.，107(2)：584-587；Fromm，Taylor，Walbot，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)：5824-5828；美国专利号5,384,253)和基因枪(Johnston和Tang，1994，Methods Cell.Biol，43(A)：353-365；Fynan，Webster，Fuller，Haynes，Santoro，Robinson，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(24)：11478-11482)；病毒方法(Clapp，1993，Clin.Perinatal.，20(l)：155-168；Lu，Xiao，Clapp，Li，Broxmeyer，1993，J.Exp.Med，178(6)：2089-2096；Eglitis和Anderson，1988，Biotechniques，6(7)：608-614；Eglitis，Kantoff，Kohn，Karson，Moen，Lothrop，Blaese，Anderson，1988，Avd.Exp.Med.Biol.，241：19-27)；和受体介导的方法(Curiel，Agarwal，Wagner，Cotten，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88(19)：8850-8854；Curiel，Wagner，Cotten，Birnstiel，Agarwal，Li，Loechel，Hu，1992，Hum.Gen.Ther.，3(2)：147-154；Wagner等，1992，Proc.Natl.Acad Sci.USA，89(13)：6099-6103)。
通过电穿孔将DNA引入植物细胞是本领域技术人员熟知的。植物细胞壁降解酶，例如果胶降解酶用于使受体细胞比未处理细胞更易于通过电穿孔转化。为了通过电穿孔进行转化，可以直接使用易碎组织，例如细胞的悬浮培养物、胚胎发生愈伤组织或未成熟胚或其他有机组织。一般必需以控制的方式通过果胶降解酶部分降解或机械损伤部分降解靶植物材料的细胞壁。这种经处理的植物材料易于通过电穿孔接受外来DNA。
将外来转化DNA递送至植物细胞的另一方法是微粒轰击。在该方法中，用外来DNA包被微粒并通过推进力将微粒递送入细胞。该微粒通常由钨、金、铂和类似金属制成。微粒轰击的优点在于无需分离原生质体(Cristou等，1988，Plant Physiol.87：671-674)和对农杆菌感染敏感。通过加速将DNA递送至玉米细胞的一个示例性方法的实施方案是生物轰击微粒递送系统(Biolistics Particle Delivery System)，该系统可以用于推动包被有DNA的颗粒或细胞通过过滤器表面的筛子，其中所述过滤器表面覆盖有悬浮培养的玉米细胞。筛子将颗粒分散，这样颗粒不会以大集成物的形式被递送至受体细胞。为了进行轰击，优选将悬浮细胞浓缩在滤器或固体培养基上。或者，可以将未成熟胚或其它靶细胞排列在固体培养基上。将待轰击的细胞放置在大轰击粒子终止板(macroprojectile stoppi ngplate)下适当距离处。对于轰击转化，可以优化轰击前培养条件以及轰击参数以便得到最大数目的稳定转化体。用于轰击的物理和生物学参数在该技术中均是重要的。物理因素是涉及操作DNA/微粒沉淀的因素或影响微粒的飞行或速度的因素。生物因素包括涉及在轰击前和临轰击后操作细胞的所有步骤、靶细胞的渗透压调节以帮助缓解轰击相关的创伤，以及转化DNA的性质，例如线性DNA或完整的超螺旋质粒。
农杆菌介导的转移是将外源DNA引入植物细胞的广泛适用的系统，因为DNA可以被引入整个植物组织，从而消除了从原生质体再生全株植物的需要。利用农杆菌介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞是本领域熟知的。见例如，Fraley等1985，Biotechnology，3：629；Rogers等，1987，Meth.in Enzymol.153：252-277中描述的方法。而且，Ti-DNA整合是导致非常少重排的相对准确方法。待转移的DNA区由边界序列限定，并通常如Spielmann等，1986，Mol.Gen.Genet.，205：34；Jorgensen等，1987，Mol.Gen.Genet.，207：471所述通常将间插DNA插入植物基因组。
现代农杆菌转化载体能够在大肠杆菌和农杆菌中复制，允许方便的操作。而且，近来对于用于农杆菌介导的基因转移载体的技术发展已经改善了基因和限制性位点在载体中的排列，以利于构建能够表达多种蛋白质或多肽的载体。方便的多接头区的两侧为用于指导插入的多肽编码基因表达的启动子和多腺苷酸化位点，该多接头区适用于本发明目的。此外，可以使用含有武装的(armed)和去武装的(disarmed)Ti基因的农杆菌实施转化。
植物原生质体转化可以使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合的方法来实现(见，例如，Potrykus等，1985，Mol.Gen.Genet.，199：183；Marcotte等，1988，Nature，335：454)。将这些系统应用于不同植物物种取决于从原生质体再生该特定物种的能力。
一旦植物细胞被转化、选择并检测抗原表达后，在一些情况下可以再生全株能育植物。这极大地取决于所选的植物物种。文献中已经记载了再生多种植物物种的方法，这些方法是本领域技术人员熟知的。为了本发明的实施，优选转化可以通过避免一般冗长的再生步骤进行快速培养和扩大规模的植物细胞系。此外，应用植物细胞培养物可以避免户外生产，极大地降低基因逃逸和食物污染的机会。优选烟草悬浮细胞培养物，例如NT-1和BY-2(An，G.，1985，Plant Physiol.79：568-570)，因为这些细胞系尤其易于在培养中操作、易于转化、产生稳定整合事件并适于冷冻保存。
烟草悬浮细胞系NT-1适用于本发明的实施。NT-1细胞最初从烟草栽培品种嫩黄2(Nicotiana tabacum L.cv.bright yellow 2)开发产生。NT-1细胞系被广泛应用并易于获得；虽然，任何烟草悬浮细胞系均适用于本发明。适用于以下实施例的NT-1细胞可以从美国典型培养物保藏中心以保藏号ATCC 74840获得。也参见美国专利6,140,075，特此完整并入作为参考。
从实验室级别的摇瓶至数千升的生物反应器，许多植物细胞培养技术和系统均已有描述并是植物细胞培养领域所熟知的。见例如Fischer，R.等，1999，Biotechnol.Appl.Biochem.30，109-112和Doran，P.，2000，CurrentOpionions in Biotechnology，11，199-204。将转化的植物细胞培养至所需质量后，收获细胞，温和洗涤并放置在适宜的缓冲液中进行破碎。许多不同的缓冲液与本发明相容。一般地，缓冲液是中性或接近中性pH值的等渗缓冲盐水溶液，不含有可以用于溶解膜的强去污剂。优选的缓冲液包括含有1mM EDTA的PBS和Dulbecoo磷酸缓冲盐水。
在一个实施方案中，可以超声破碎细胞。将洗涤后的细胞以大约0.01gm/ml至大约5.0gm/ml，优选大约0.1gm/ml至大约0.5mg/ml(洗涤后湿重细胞/缓冲液体积)置于缓冲液中。许多市售超声仪器均可以用于本发明，超声时间从大约5秒至大约20秒，优选大约15秒至大约20秒。所得物的大小可以从几微米至数百微米，并暴露HA1多肽或其免疫原片段。
术语“包含”、“由......组成”和“基本由......组成”根据它们的标准含义来定义。为与每一术语相关的具体含义相适，这些术语可在整个本申请中互相替换。短语“分离的”或“生物纯的”指物质实质上或基本上不含当其以天然状态发现时通常伴随的物质。因此，分离肽按照本发明优选不含有在它们的原环境中通常与其结合的物质。
此处涉及或引用的所有专利、专利申请和出版物完整引入作为参考，包括所有图和表，直至它们不与本说明书的明确教导相矛盾的程度。应当理解此处描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，且其多种修改或改变将建议给本领域技术人员，并包括在本申请的精神和范围及所附权利要求的范围内。此外，此处公开的任何发明或其实施方案的任何元素或限制可与此处公开的任何和/或所有其他元素或限制(单独或以任何组合)或任何其他发明或其实施方案组合，且所有此类组合无限制地涵盖于本发明的范围。
尽管较常规制备的疫苗，本说明书描述了对多种禽流感异型菌株更广的交叉保护，此处描述的植物产生的疫苗平台和概念适用于控制由具有改变它们抗原决定簇能力的其他病原体导致的疾病。
此处涉及或者引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物，以与本说明书的明确教导相一致的程度，通过引用的方式，整体地(包括所有的附图和表格)并入本申请。
下文是举例说明用于实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应被解释为限制本发明。如无另行说明，所有的百分比是重量百分比，并且所有的溶剂混合物的比例是体积比。
实施例1-在小鼠异源攻击过程中植物细胞产生的H5的保护效率
为确定并进一步理解植物细胞产生的禽流感病毒(AIV)H5抗原保护免受异源(＜90％同源性)攻击的能力，完成了鼠的接种及AIV攻击研究。基本上按照美国专利号7,132,291的指导(此处完整并入作为参考)，将AIV的火鸡Wisconsin 68菌株中的H5抗原基因进行植物密码子优化，转化到NT-1植物细胞中并进行培养。
细胞裂解
在含200mM Tris(pH 8)、5mM EDTA(pH 8)、2mM二硫苏糖醇和2％脱氧胆酸钠(Doc)的100g等分试样(冰上使用BiospecTM小珠破碎器)中裂解用于表达H5抗原的转化NT-1植物细胞。4℃下过夜搅动裂解物以助于H5的提取，然后通过离心及过滤(0.45μm)进行澄清，随后如下描述进一步纯化。一部分进行H5定量、冷冻干燥并保存于-20℃。
单克隆抗体层析
如下从裂解的转化NT-1植物细胞中制备纯化的大量H5抗原。用Milli-QTM水将上面制备的植物细胞裂解物按4比1稀释，使Doc浓度降低至0.5％。稀释后的植物细胞裂解物经过用50mM Tris(pH 8)平衡的约125ml H5单克隆抗体亲和柱。用50mM Tris(pH 8)洗涤柱子至基线并用50mM Tris(pH 8)、2M NaSCN洗脱结合的蛋白质。冷冻干燥前用两份大体积的10.5mM碳酸氢铵(挥发性缓冲液)对洗脱的H5蛋白质进行透析。
抗原制备
1.实验疫苗：用3.5ml无菌水再水化冷冻干燥的转化NT-1细胞裂解物饼(含约129.5μg H5抗原)，获得具有浓度为37μg/ml大量H5抗原贮存液的植物细胞裂解物贮存液。通过6000X G离心20分钟使大量H5抗原贮存液澄清，然后经0.22微米滤器进行无菌过滤。随后保存该无菌过滤后的大量H5抗原用于最后的实验疫苗装配。
2.纯化疫苗：使用单克隆抗体层析纯化的H5抗原冷冻干燥瓶制备纯化疫苗。每个冷冻干燥瓶装有500μg的H5抗原。每瓶用5ml无菌水再水化来产生100μg/ml的终浓度。该材料无需澄清或无菌过滤，然后保存用于最后的纯化疫苗装配。
3.NT-1空白对照：除使用未转化的NT-1植物细胞代替表达H5抗原的转化NT-1细胞，使用如上用于实验疫苗(1)的相同方法来制备NT-1空白对照。
配制
使用以下方法装配每种最终疫苗至H5终浓度为26.7ng/ml。将实验疫苗抗原、纯化疫苗抗原或NT-1空白对照裂解物加入无菌的50ml锥形底离心管。将无菌过滤的Quil A贮存液(无菌水中50mg/ml，Brenntag，DK)所需量加入管中至终浓度为40ug/剂，并使用无菌转头-定子式匀浆器混合一分钟。将胆固醇贮存液(乙醇中18mg/ml)所需量加入管中至终浓度为10ug/剂，并使用无菌转头-定子式匀浆器混合一分钟。加入先前制备且高压灭菌的卵磷脂和丙烯酸类(acrylic)聚合物的混合物(卵磷脂∶carbopol 3∶2)所需体积至终浓度为1mg/剂，并匀浆一分钟。将无菌水所需量加入管中并混合。
然后将装配的疫苗无菌转移至无菌血清瓶内，密封并标记。装配疫苗瓶保存于4℃直至按所需运送至临床试验点。
接种
六十五只BALB/c小鼠(雌性；5-6周龄)如表1描述分配至处理组1、处理组2、处理组3或处理组4。在研究的第0天、14天和21天，如表1描述，用150μl剂量(建议处理)接种小鼠。经皮下实施接种。组4中的小鼠不进行接种。
接种后分析
在第35天，将所有小鼠移至ABSL3实验室中并使其适应新实验室1周。在第42天，从组1、组2和组3每组中随机选择5只小鼠并在镇静状态下放血。将血液处理成血清并于≤-20℃保存用于血清分析。此外，在第42天，用50uL约1.5x103 TCID50禽流感病毒A/越南(菌株)/1203/04攻击组1、组2和组3每组中其余15只小鼠。用磷酸缓冲盐溶液(PBS)模拟攻击组4中的5只小鼠。所有攻击在用氯胺酮麻醉下进行。
在研究第45天，将来自组1的5只动物、组2的5只动物、组3的5只动物和组4中的所有小鼠(5只小鼠)处死并摘取肺和脑。将肺和脑匀浆并通过TCID50定量检验活病毒。
监测组1、组2和组3中其余10只小鼠的临床病征直至研究结束的第56天。
血清试验
用研究的第42天从组1和组2小鼠采集的血液进行抗AIV的火鸡Wisconsin 68菌株的血凝抑制和抗A/越南(菌株)/1203/04的血清中和。
血凝抑制试验
用抵抗在尿囊液中制备的灭活AIV火鸡Wisconsin 68菌株的第42天采集的血清样品进行血凝抑制(HAI)血清试验。将灭活病毒稀释产生每50μl中8至16血细胞凝集(HA)单位。血清样品用PBS两倍连续稀释。将等体积稀释的病毒加入至稀释的血清样品中。血清病毒混合物在室温温育60分钟。随后向该血清病毒混合物中加入1％的鸡红细胞(cRBC)溶液并在2-7℃温育24小时。然后目视检查该平板的血细胞凝集(阳性结果)或片状cRBC(阴性结果)。HAI效价代表血清的稀释度的倒数，其可抑制病毒导致cRBC血细胞凝集的能力。
血清中和试验
在ABSL-3实验室进行血清中和试验。如下测定血清样品的中和剂量50效价(ND50)。使用Eagle′s极限必需培养基(EMEM)配制每份样品的2倍系列稀释物。将禽流感病毒(越南/1203/04)加入到稀释的血清样品中并将该混合物在37℃温育1小时。随后用Hank′s平衡盐溶液(HBSS)漂洗MDCK细胞至少90％汇合的九十六孔板，并用100μl每种血清病毒稀释物一式五份对孔进行接种。随后将平板在湿润培养箱内约37℃和5％CO2中温育96±6小时。在显微镜的帮助下为平板的细胞病理学效应(CPE)分级。ND50报告为导致在50％的已接种孔中缺少CPE的稀度并使用Spearman
Figure A20078001363800281
方法计算。
来自肺和脑的活病毒滴定
摘取组1、组2和组3每组中5只小鼠的脑和肺并在CMF-PBS中匀浆。将匀浆等分至微量离心管中并保存于≤-70℃。用TCID50s检测脑和肺匀浆样品的活病毒。摘取肺和脑并在≤-70℃完整地冷冻于配制有1％抗生素(青霉素和链霉素)的1ml磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。解冻后，将肺和脑匀浆并通过组织培养感染剂量50(TCID50)检测活病毒。简言之，用EMEM配制每种样品的5倍系列稀释物。也配制阳性对照样品(PC，具有已知TCID50效价的阳性样品)和阴性对照样品(NC，已知为天然病毒)的稀释系列。随后用Hank′s平衡盐溶液(HBSS)漂洗MDCK细胞至少90％汇合的九十六孔板，并用100ml每种样品稀释物一式五份对孔进行接种。随后用100ml EMEM接种一系列至少5个细胞培养对照(CC)孔。随后将PC和NC样品的稀释系列以一式五份接种至独立的96孔板。阳性和阴性对照板每板都包括最少5个CC孔。随后将平板在湿润培养箱内约37℃和5％CO2中温育96±6小时。技术人员在显微镜的帮助下为平板的细胞病理学效应(CPE)分级。为使试验认为有效，不可有污染且每板中至少5个CC孔需为健康的汇合(＞80％)单层。TCID50为导致在50％的接种孔中CPE的稀度并使用Spearman
Figure A20078001363800291
方法计算。
结果
将组1、组2和组3每组中五只小鼠放血用于血清学检测。血清学结果(血凝抑制和血清中和)示于表2中。通过血凝抑制血清学(HAI)证明，组1(实验疫苗)中五只小鼠中的五只产生抗火鸡Wisconsin 68(与疫苗中的H5抗原同源)的抗体。组1的几何平均效价(GMT)为388。组2(纯化疫苗)中五只小鼠中的三只产生HAI效价。组2的GMT为60.7。
来自组3(NT-1空白对照)中的五只小鼠均未产生抗火鸡Wisconsin68的HAI抗体。通过血清中和血清学(SN)证明，来自组1(实验疫苗)中五只小鼠的三只产生抗越南/1203/04(与疫苗中的HA异源)的抗体。组1的几何平均效价(GMT)为34.0。来自组2中五只小鼠的一只产生SN效价(GMT＝3.1)且来自组3中的五只小鼠均未产生抗越南/1203/04的SN抗体。
在研究的第45天(攻击后3天)从组1、2、3和4每组5只小鼠的肺和脑中分离活禽流感病毒。组4中所有五只小鼠如上所述处死且因此其不出现在表4中。病毒分离结果示于表3中。在所有四组中，从脑组织中没有分离到活病毒。在组1(实验疫苗)中，5只小鼠中的1只具有无菌的肺组织(未分离到病毒)。来自组1小鼠肺的活病毒的GMT为3.31x103TCID50/mL。在组2小鼠(纯化疫苗)中，从5只小鼠中的5只中均能分离到活病毒。来自组2小鼠肺中活病毒的GMT为2.19x104TCID50/ml。组3(NT-1空白对照)中小鼠肺组织较组1小鼠具有大于1log更高的活禽流感病毒。在组3中，五只小鼠中的五只具有阳性分离且该组的GMT为8.72x104TCID50/ml。组4中的小鼠(未接种且仅用PBS攻击)肺组织中的无病毒分离。
从攻击日(第42天)至攻击后2周(第56天)临床监测组1、组2和组3每组中的十只小鼠。表4提供组1、组2和组3的攻击后死亡日。至研究的生活期结束(研究的第56天；攻击后14天)，组1(实验疫苗)中100％小鼠从攻击中存活。在组2(纯化疫苗)中10％小鼠从攻击中存活。在组3(空白对照)中100％小鼠死于攻击。
Figure A20078001363800301
＊对于HAI GMT计算＜8表示为7
＊＊对于SN GMT计算0表示为1
Figure A20078001363800311
应当理解此处描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，且其多种修改或改变将建议给本领域技术人员，并将包括在本申请的精神和范围内及所附权利要求的范围内。此外，此处公开的任何发明或其实施方案的任何元素或限制可与此处公开的任何和/或所有其他元素或限制(单独或以任何组合)或任何其他发明或其实施方案组合，且所有此类组合无限制地涵盖于本发明的范围。
序列表
<110>美国陶氏益农公司
<120>禽流感疫苗和使用方法
<130>DAS-132XC1
<150>US 60/793,804
<151>2006-04-21
<160>12
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>548
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<400>1
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val
1               5                   10                  15
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
            20                  25                  30
Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg
        35                  40                  45
Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
    50                  55                  60
Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
65                  70                  75                  80
Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
                85                  90                  95
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu
            100                 105                 110
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser
        115                 120                 125
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe
    130                 135                 140
Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile
145                 150                 155                 160
Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp
                165                 170                 175
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln
            180                 185                 190
Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
        195                 200                 205
Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
    210                 215                 220
Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser
225                 230                 235                 240
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
                245                 250                 255
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
            260                 265                 270
Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser
        275                 280                 285
Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
    290                 295                 300
Tyr Val  Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val
305                 310                 315                 320
Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
                325                 330                 335
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
            340                 345                 350
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
        355                 360                 365
Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
    370                 375                 380
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu
385                 390                 395                 400
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
                405                 410                 415
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
            420                 425                 430
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
        435                 440                 445
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu
    450                 455                 460
Glu Phe Ser His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn
465                 470                 475                 480
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg
                485                 490                 495
Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile
            500                 505                 510
Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met
        515                 520                 525
Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
    530                 535                 540
Arg Ile Cys Ile
545
<210>2
<211>16
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<400>2
Met Glu Arg Ile Val Ile Ala Leu Ala Ile Ile Ser Val Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>3
<211>326
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<400>3
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val
1               5                   10                  15
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
            20                  25                  30
Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg
        35                  40                  45
Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
    50                  55                  60
Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
65                  70                  75                  80
Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
                85                  90                  95
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu
            100                 105                 110
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser
        115                 120                 125
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe
    130                 135                 140
Arg Asn Val Val Trp LeuIle Lys Lys Ser Asn Ala Tyr Pro Thr Ile
145                 150                 155                 160
Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp
                165                 170                 175
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln
            180                 185                 190
Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
       195                 200                 205
Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
    210                 215                 220
Arg Ile Glu Phe Phe Trp ThrIle Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser
225                 230                 235                 240
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
                245                 250                 255
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
            260                 265                 270
Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser
        275                 280                 285
Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
    290                 295                 300
Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val
305                 310                 315                 320
Pro Gln Arg Glu Thr Arg
                325
<210>4
<211>184
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<400>4
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly
1               5                   10                  15
Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser
            20                  25                  30
Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Ile
        35                  40                  45
Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu
    50                  55                  60
Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu
65                  70                  75                  80
Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala
                85                  90                  95
Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp
            100                 105                 110
Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp
        115                 120                 125
Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys
    130                 135                 140
Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro
145                 150                 155                 160
Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val
                165                 170                 175
Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr
            180
<210>5
<211>28
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<400>5
Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser
            20                  25
<210>6
<211>10
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<400>6
Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
1               5                   10
<210>7
<211>564
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<400>7
Met Glu Arg Ile Val Ile Ala Leu Ala Ile Ile Ser Val Val Lys Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
            20                  25                  30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
        35                  40                  45
Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg
    50                  55                  60
Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65                  70                  75                  80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
                85                  90                  95
Glu Lys Asp Asn Pro Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
            100                 105                 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Met Ser Ser Thr Asn His Phe Glu
        115                 120                 125
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Ser Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser
    130                 135                 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe
145                 150                 155                 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile
165                 170                 175
Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp
            180                 185                 190
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Thr Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
        195                 200                 205
Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
    210                 215                 220
Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225                 230                 235                 240
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp AlaIle Ser
                245                 250                 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
            260                 265                 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
        275                 280                 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser
    290                 295                 300
Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305                 310                 315                 320
Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val
                325                 330                 335
Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
            340                 345                 350
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
        355                 360                 365
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
    370                 375                 380
Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
385                 390                 395                 400
Met Asn Thr Gln Phe Glu Val Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu
                405                 410                 415
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
            420                 425                 430
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
        435                 440                 445
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Arg Asn Leu Tyr Asp Lys Val
    450                 455                 460
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe
465                 470                 475                 480
Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn
                485                 490                 495
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg
            500                 505                 510
Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile
        515                 520                 525
Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met
    530                 535                 540
Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
545                 550                 555                 560
Arg Ile Cys Ile
<210>8
<211>16
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<400>8
Met Glu Arg Ile Val Ile Ala Leu Ala Ile Ile Ser Val Val Lys Gly
1               5                   10                  15
<210>9
<211>326
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<400>9
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
1               5                   10                  15
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
            20                  25                  30
Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg
        35                  40                  45
Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
    50                  55                  60
Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
65                  70                  75                  80
Glu Lys Asp Asn Pro Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
                85                  90                  95
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Met Ser Ser Thr Asn His Phe Glu
            100                 105                 110
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Ser Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser
        115                 120                 125
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe
    130                 135                 140
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile
145                 150                 155                 160
Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp
                165                 170                 175
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Thr Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
            180                 185                 190
Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
        195                 200                 205
Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
    210                 215                 220
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser
225                 230                 235                 240
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
                245                 250                 255
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
            260                 265                 270
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser
        275                 280                 285
Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
    290                 295                 300
Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val
305                 310                 315                 320
Pro Gln Arg Glu Thr Arg
                325
<210>10
<211>157
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<400>10
Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly
1               5                   10                  15
Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser
            20                  25                  30
Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Ile
        35                  40                  45
Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu
    50                  55                  60
Val Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu
65                  70                  75                  80
Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala
                85                  90                  95
Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp
            100                 105                 110
Ser Asn Val Arg Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp
        115                 120                 125
Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys
    130                 135                 140
Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr
145                 150                 155
<210>11
<211>24
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<400>11
Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala
1                 5                   10                   15
Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Phe
            20
<210>12
<211>10
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<400>12
Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile
1               5                   10

Claims (9)

1.在动物或人中诱导抗禽流感病毒(AIV)菌株的免疫保护性应答的方法，所述方法包括：
a)在植物细胞中表达DNA序列，所述DNA序列包含与攻击菌株HA1可变区多肽具有约70％到约90％同源性的已知HA1可变区多肽；
b)使用在所述植物细胞中表达的已知HA1可变区多肽制备疫苗组合物；并
c)对动物或人施用所述疫苗组合物，使得在所述动物或人中诱导保护性免疫应答。
2.制备植物产生的AIV疫苗的方法，其包括：
a)用重组载体转化植物细胞，所述重组载体包含编码已知HA1可变区多肽的多核苷酸，所述已知HA1可变区多肽与攻击菌株HA1可变区多肽具有约70％到约90％同源性；
b)在适合所述已知多肽表达的条件下培养所述植物细胞；
c)回收所述已知多肽；并
d)将所述已知多肽与可药用赋形剂和稀释剂混合。
3.植物产生的AIV疫苗，其包含与攻击菌株HA1可变区多肽具有约70％到约90％同源性的已知血凝素1(HA1)可变区多肽，所述植物产生的疫苗施用给动物或人后，在所述动物或人中引起抗所述约70％到约90％同源的攻击菌株的保护性免疫应答。
4.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述已知HA1可变区多肽与攻击菌株HA1可变区多肽具有至少70％并低于87.0％、86.5％、86.0％、85.5％、85.0％、84.5％、84.0％、83.5％、83.0％、82.5％、82.0％、81.5％、81.0％、80.5％、80.0％、79.5％、79.0％、78.5％、78.0％、77.5％、77.0％、76.5％、76.0％、75.5％、75.0％、74.5％、74.0％、73.5％、73.0％、72.5％、72.0％、71.5％或71.0％的同源性。
5.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述已知HA1可变区多肽与攻击菌株HA1可变区多肽具有约70％到约71.0％、71.5％、72.0％、72.5％、73.0％、73.5％、74.0％、74.5％、75.0％、75.5％、76.0％、76.5％、77.0％、77.5％、78.0％、78.5％、79.0％、79.5％、80.0％、80.5％、81.0％、81.5％、82.0％、82.5％、83.0％、83.5％、84.0％、84.5％、85.0％、85.5％、86.0％、86.5％或87.0％的同源性。
6.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述已知HA1可变区多肽与攻击菌株HA1可变区多肽具有70％到71.0％、71.5％、72.0％、72.5％、73.0％、73.5％、74.0％、74.5％、75.0％、75.5％、76.0％、76.5％、77.0％、77.5％、78.0％、78.5％、79.0％、79.5％、80.0％、80.5％、81.0％、81.5％、82.0％、82.5％、83.0％、83.5％、84.0％、84.5％、85.0％、85.5％、86.0％、86.5％或87.0％的同源性。
7.根据权利要求3的植物产生的AIV疫苗，其中所述已知HA1可变区多肽与攻击菌株HA1可变区多肽具有至少70％并低于87.0％、86.5％、86.0％、85.5％、85.0％、84.5％、84.0％、83.5％、83.0％、82.5％、82.0％、81.5％、81.0％、80.5％、80.0％、79.5％、79.0％、78.5％、78.0％、77.5％、77.0％、76.5％、76.0％、75.5％、75.0％、74.5％、74.0％、73.5％、73.0％、72.5％、72.0％、71.5％或71.0％的同源性。
8.根据权利要求3的植物产生的AIV疫苗，其中所述已知HA1可变区多肽与攻击菌株HA1可变区多肽具有约70％到约71.0％、71.5％、72.0％、72.5％、73.0％、73.5％、74.0％、74.5％、75.0％、75.5％、76.0％、76.5％、77.0％、77.5％、78.0％、78.5％、79.0％、79.5％、80.0％、80.5％、81.0％、81.5％、82.0％、82.5％、83.0％、83.5％、84.0％、84.5％、85.0％、85.5％、86.0％、86.5％或87.0％的同源性。
9.根据权利要求3的植物产生的AIV疫苗，其中所述已知HA1可变区多肽与攻击菌株HA1可变区多肽具有70％到71.0％、71.5％、72.0％、72.5％、73.0％、73.5％、74.0％、74.5％、75.0％、75.5％、76.0％、76.5％、77.0％、77.5％、78.0％、78.5％、79.0％、79.5％、80.0％、80.5％、81.0％、81.5％、82.0％、82.5％、83.0％、83.5％、84.0％、84.5％、85.0％、85.5％、86.0％、86.5％或87.0％的同源性。
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