CN101472607A - 禽流感血凝素的新型dna序列、载体和蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明提供了禽流感A病毒血凝素蛋白质的新型氨基酸序列(包括共有序列)。设计这些新构建的基因以提供跨血清型家族更广谱的活性谱从而为具有广泛异源性疾病的疫苗保护基础。还通过向其编码的氨基酸序列添加策略性的糖基化位点而改进该新型基因。这些基因也可以任选地针对植物表达而进行密码子优化，经插入到适合的载体和经克隆到植物而用于表达。通过重组宿主细胞或转基因植物产生的多肽也可以用作配制用于控制易感个体流感的疫苗的抗原来源。另外，转基因植物材料也可用作配制用于控制易感个体流感的疫苗的抗原来源。

Description

禽流感血凝素的新型DNA序列、载体和蛋白质

相关申请的交叉引用

本发明主张2006年6月16日递交的美国临时申请系列号No.60/814,241的权益，其公开内容，包括所有附图、表格和氨基酸或核酸序列通过整体引用作为参考。

发明背景

在亚洲和欧洲部分地区、近东和非洲爆发的禽流感A(H5N1)对于不期望该疾病在短期内明显减少的普通人群和科学家而言是一个关注。此外，禽类间的H5N1感染在某些区域很可能变成地方病且由直接接触感染的家禽而导致的人类感染将继续发生。人-人间传播的H5N1病毒很少见且超过一人以上就不会继续传播并且没有发现人与禽流感A病毒基因之间的基因重配的证据。然而，仍旧认为禽流感引起重大的公共健康威胁。

研究表明目前的H5N1病毒流行株在动物中比早前的H5N1病毒变得更加致病。已经发现动物(例如鸭子)更长时间地释放更多的病毒，但不显示疾病症状。这一发现暗示鸭子在将疾病传播至其它禽类以及也可能传播至人类中的作用。也已记载了在中国地区猪之间的H5N1感染和猫科动物中的H5N1感染，德国已经报道了石貂中的H5N1感染。

人类群体对H5N1感染几乎没有预先存在的天然免疫。因此，如果H5N1病毒获得在人类中有效且持续传播的能力，则可以产生流感流行。该流行可能引起高患病率和死亡率。此外发现流感A(H5N1)病毒可以显示出对抗病毒药物(例如金刚胺和甲金胺)的抗性。这两种药物通常用于治疗流感。因此，需要生产对禽流感A(H5N1)病毒有效的候选疫苗。

发明概述

本发明提供了禽流感A病毒血凝素(HA)蛋白的新型氨基酸序列(包括共有序列)。设计这些新构建的基因以提供总血清型家族更广泛的活性谱从而为具有广泛异源性疾病保护的疫苗提供基础。还通过向其编码的氨基酸序列中添加策略性的糖基化位点而改进该新型基因。这些基因也可以任选地针对植物表达而进行密码子优化，经插入到适合的载体并经克隆到植物而用于表达。通过重组宿主细胞或转基因植物产生的多肽也可以用作配制用于控制易感个体流感的疫苗的抗原来源。此外，转基因植物材料也可用作配制用于控制易感个体流感的疫苗的抗原来源。

附图简述

图1-3提供了预测为与MHC I和CTL(细胞毒性T淋巴细胞)(图1)、MHC II类(图2)或抗体分子(图3)相互作用的SEQ ID NO：14的多种肽片段。

图4阐明合成的HA基因在植物中的瞬时表达(使用双元载体pDAB4492-pDAB4498观察到)。柱表示从接种2天或3天后取自7个收集的样品制造的粗提物的两个重复的平均OD。取平均值后，从转基因样品OD中减去野生型植物叶的OD。“92”表示pDAB4492；“93”表示pDAB4493；“94”表示pDAB4494；“95”表示pDAB4405；“96”表示pDAB4496；“97”表示pDAB4497；“98”表示pDAB4498；“d2”表示第2天和“d3”表示第3天。

图5描述了(在NT1植物细胞培养物中)具有AIV HA稳定表达的细胞系中的HA含量。细胞系号码的前两个数字表示质粒构建体(pDAB44xx)。

图6阐明矮牵牛发根培养物中pDAB4498的表达：用ELISA筛选15个由pDAB4498转化的矮牵牛系，以及矮牵牛阴性对照的HA表达。将50μg总可溶蛋白质加入包被了山羊-抗HAv5的ELISA板。通过添加USDA鸡-抗AIV，然后加入兔-抗鸡，继而山羊-抗兔IgG HRP检测HA。

图7示出应答PR-8 HA的抗体并且通过用5μg的PR-8 HA/孔包被微量滴定板由标准ELISA技术检测。

图8示出来自DNA转染动物细胞的HA ELISA效价。结果表明祖先基因96(pDAB4496)、97(pDAB4497)和98(pDAB4498)表达与天然Turkey Wisconsin 68 HA基因93(pDAB4493)、94(pDAB4494)和95(pDAB4495)或天然基因衍生物类似或较多的HA。将收集的转染细胞加入到包被有山羊-抗HAv5的ELISA板。通过添加USDA鸡-抗AIV，然后加入兔-抗鸡，继而山羊-抗兔IgG HRP检测HA。

图9-15图解了多种植物靶向构建体的基因设计。图9A(HAv1)、9B(pDAB4492)和10(pDAB4493)图解了涉及SEQ ID No：1(HA5tw68 v3)的多种构建体。图11A(HAv2)和11B(pDAB4494)描述SEQ ID NO：3(HA5tw68 v4)的构建体。图12A(HAv3)和12B(pDAB4495)描述SEQ ID NO：5(HA5tw68 v5)的构建体。图13A(HAv4)和13B(pDAB4496)描述SEQ ID NO：7(HA5AH v1)的构建体。图14A(HAv5)和14B(pDAB4497)描述SEQ ID NO：9(HA5AH v2)的构建体。图15A(HAv6)和15B(pDAB4498)描述SEQ ID NO：11(HA5AH v3)的构建体。

序列简述

SEQ ID NO：1提供编码血凝素V1(HA原始turkey Wisconsin 68，无切割位点)的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：2对应于SEQ ID NO：1编码的多肽。

SEQ ID NO：3示出血凝素V2(在氨基酸239处含有糖基化位点)。

SEQ ID NO：4是由SEQ ID NO：3编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5提供编码血凝素V3的多核苷酸序列(包括天然turkeyWisconsin 68血凝素蛋白的RQKR切割位点)。

SEQ ID NO：6对应于SEQ ID NO：5编码的多肽。

SEQ ID NO：7示出血凝素V4(在第99、102和170位置提供氨基酸修饰)。

SEQ ID NO：8是由SEQ ID NO：7编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9提供编码血凝素V5的多核苷酸序列(在第99、102和239位置提供氨基酸修饰)。

SEQ ID NO：10对应于由SEQ ID NO：9编码的多肽。

SEQ ID NO：11示出编码血凝素V6(在99、102、170和239位置含有氨基酸修饰)的DNA。

SEQ ID NO：12是由SEQ ID NO：11编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是编码本发明的“祖先”HA多肽的植物优化核酸序列。术语“祖先HA多肽”指使用生物信息学推断的血凝素多肽。

SEQ ID NO：14是本发明提供的“祖先”序列。术语“祖先HA多肽”指使用生物信息学推断的血凝素多肽。

SEQ ID NO：15是扩增HA基因的引物。

SEQ ID NO：16是扩增HA基因的引物。

附表简述

表1a-1b详细说明SEQ ID NO：2、4、8、10和14的片段的N端和C端氨基酸位置。该片段可以是5至563(包括两者)之间的任何数目(整数)的连续氨基酸，N端氨基酸可以是1至560(包括两者)之间的任何整数(参见表1a)而C端氨基酸可以是选自由表1b鉴定的任何整数的任何位置(即5至564)。

表2a-2b详细说明SEQ ID NO：6的片段的N端和C端氨基酸位置。该片段可以是5至567(包括两者)之间的任何数目(整数)的连续氨基酸，N端氨基酸可以是1至564(包括两者)之间的任何整数(参见表2a)而C端氨基酸可以是选自由表2b鉴定的任何整数的任何位置(即5至568)。

表3a-3b详细说明SEQ ID NO：12的片段的N端和C端氨基酸位置。该片段可以是5至552(包括两者)之间的任何数目(整数)的连续氨基酸，N端氨基酸可以是1至549(包括两者)之间的任何整数(参见表3a)而C端氨基酸可以是选自由表3b鉴定的任何整数的任何位置(即5至553)。

表4、AIV HA在NT1植物细胞培养物中的稳定表达。细胞系号码的前两个数字表示质粒构建体(pDAB44xx)。

发明详述

本发明提供下述非限制性的物质组合物以及使用该物质组合物生产免疫原性多肽的方法以及诱导个体免疫应答的方法。因此，本发明提供多种物质组合物，包括：

a)包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的分离的、纯化的和/或重组的多肽；

b)与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽具有至少约20％-99.99％同一性，优选至少60-99.99％同一性，且具有至少一种与SEQID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽相关的生物学活性的变体多肽；

c)SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽(或变体多肽)的片段，SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的从“从Y到Z”的片段，其中Y是所述序列的N端氨基酸而Z是所述序列的C端氨基酸，该片段长度为至少5个氨基酸，且Y和Z是对表1-3中特定SEQ ID NO：所鉴定的那些整数中任何指定的整数(或选自那些整数)，或是多肽片段或如图1、2或3所示，其中所述多肽片段或所述变体多肽的片段具有至少一种与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽相应生物学活性基本上相同的生物学活性(本发明上下文中的其它示例性片段包括跨越SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14每个的氨基酸1-16的前导序列，包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14中每个的位置17至342(对应于血凝素多肽的H1区)或由它组成的一段氨基酸，以及包括下述或由下述组成的血凝素多肽的H2区：对应于SEQ ID NO：2、4、8、10或14的位置343至位置364的一段氨基酸；对应于SEQ ID NO：6的位置343至位置568的一段氨基酸；或对应于SEQ ID NO：12的位置343至位置553的一段氨基酸)；

d)选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12和14的多肽(或变体多肽)的表位；

e)包括至少一个如本文所列出表位的多表位构建体；或

f)根据实施方式a)、b)、c)、d)或e)任一种，还包括异源多肽序列的多肽；

g)根据实施方式a)、b)、c)、d)、e)或f)任一种的植物源多肽；

h)包括载体和如a)、b)、c)、d)、e)、f)或g)任一种所列多肽的组合物，其中所述载体是佐剂或可药用赋形剂；

i)编码包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽的或编码如(c)列出的SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的一或多种多肽片段的多核苷酸序列；

j)编码具有与包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽或者SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的一或多种多肽片段20％-99.99％序列同源性或同一性的多肽的多核苷酸序列，其中所述多肽具有至少一种与包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽或者SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的一或多种多肽片段相关的生物学活性；

k)具有与包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13的多核苷酸序列至少约20％至99.99％同一性的多核苷酸序列；

l)包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13或者SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13至少8个连续核苷酸片段的多核苷酸序列；

m)与(i)、(j)、(k)或(l)中列出的多核苷酸互补的多核苷酸；

n)在低、中或高严谨性下与(i)、(j)、(k)、(l)或(m)中列出的多核苷酸序列杂交的多核苷酸；

o)包括(i)、(j)、(k)、(l)或(m)中列出的多核苷酸序列的遗传构建体；

p)包括(i)、(j)、(k)、(l)、(m)或(n)中列出的多核苷酸或遗传构建体的载体；

q)包括如(p)中列出的载体、如(o)中列出的遗传构建体或如(i)、(j)、(k)、(l)或(m)中任一项列出的多核苷酸的宿主细胞；

r)包括如(p)中列出的载体、如(o)中列出的遗传构建体或如(i)、(j)、(k)、(l)或(m)中任一项列出的多核苷酸的转基因植物、植物细胞或植物部分；或

s)包括根据(i)、(j)、(k)、(l)、(m)或(n)的多核苷酸及任选地标记或标签的探针。

本发明上下文中，术语“寡肽”、“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用；然而，应理解本发明并不涉及天然形式的多肽，也就是说它们并非处于其天然环境中而是从天然来源通过纯化所分离或获得的或从通过遗传操作所制备的宿主细胞中获得的多肽(例如由宿主细胞重组产生的或由化学合成产生的多肽或其片段)。如下面将描述，根据本发明的多肽也可含有非天然氨基酸。本说明书中也使用术语“寡肽”、“多肽”、“肽”和“蛋白质”来指通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键一个接一个连接的一系列通常是L-氨基酸的残基。如下所提及，可以通过肽键或通过化学键(例如异双功能化学接头元件)将接头元件与本发明的多肽接合。此外，术语“氨基酸”和“残基”可以互换使用。

根据本发明，“核苷酸序列”、“多核苷酸”或“核酸”可以互换使用并且应理解为指双链DNA、单链DNA或所述DNA的转录产物(例如RNA分子)。也应理解本发明并不涉及处于其天然环境中或天然状态的基因组多核苷酸序列。本发明的核酸、多核苷酸或核苷酸序列可以通过分离方法(包括但不限于离子交换色谱、分子大小排阻色谱)或通过遗传工程方法(例如扩增、扣除杂交、克隆、亚克隆或化学合成或这些遗传工程方法的组合)而分离、纯化(或部分纯化)。本文中术语“多核苷酸疫苗”和“DNA疫苗”也可以互换使用。

是根据其标准含义定义术语“包括”、“由……组成”和“基本上由……组成”。本说明书中术语可相互替代以结合与每个术语相关联的特定含义。短语“分离的”或“生物学纯的”指基本上或实质上不含有一般与所发现天然状态物质相伴随的组分的物质。因此，根据本发明，分离的肽优选不含有一般与处于原位环境下的肽相关联的物质。“连接”或“接合”指任何本领域已知的用于功能性连接肽的方法，包括但不限于重组融合、共价键键合、二硫键键合、离子键键合、氢键键合和静电键键合。

因此，本发明提供包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14和/或SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽片段(例如图1、2或3所示的那些)的血凝素多肽。本发明的一些实施方式中，由抗体或T-细胞受体所结合的本发明多肽片段指定为“表位”；本发明上下文中，认为“表位”是本发明的子集，指定为“SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的片段”。

根据本发明，多肽片段(和/或表位)包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的至少5个连续氨基酸的连续跨度片段(span)。本发明多肽片段的长度可以是从至少5个连续氨基酸到比SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的全长多肽少1个氨基酸的任何整数。因此，对于SEQ ID NO：2、4、8、10或14，多肽片段是从5至563个(包括两者)连续氨基酸的任何数目(整数)。对于SEQ ID NO：6，多肽片段是从5至567个(包括两者)连续氨基酸的任何数目(整数)。对于SEQ ID NO：12，多肽片段是从5至552个(包括两者)连续氨基酸的任何数目(整数)。本发明上下文中的其它示例性片段包括跨越SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14每个的氨基酸1-16的前导序列，包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14每个中的位置17至342(对应于血凝素多肽的H1区)或由其组成的一段氨基酸，以及包括下述或由下述组成的血凝素多肽的H2区：对应于SEQ ID NO：2、4、8、10或14的位置343至位置364的一段氨基酸；对应于SEQ ID NO：6的位置343至位置568的一段氨基酸；或对应于SEQ IDNO：12的位置343至位置553的一段氨基酸。

本发明的每个多肽片段也可以按其N端和C端位置而描述。例如，本发明包括SEQ ID NO：2的6个连续氨基酸至比全长多肽少1个氨基酸的N端到C端片段的组合。因此，6个连续氨基酸片段可占据选自1-6、2-7、3-8、4-9、5-10等的位置。此外，本文所述多肽片段的实施方式可能是“至少”、“等于”、“等于或小于”、“小于”、“至少……但不大于……”或“从Y到Z”，其中Y是所述序列的N端氨基酸而Z是所述序列的C端氨基酸，片段长度至少为5个氨基酸，且Y和Z是表1-3所鉴定的那些整数中给定的任何整数(或选自它们)。正如从表1明显看出，SEQ ID NO：2、4、8、10或14的片段的N端氨基酸(表1a所给定)可以是1和560之间的任何整数而C端氨基酸(表1b给指定)是5至564的任何整数(视片段长度将是5和563(包括两者)之间的连续氨基酸的任何数(整数)而定)。对于SEQ ID NO：6的片段，N端氨基酸(如表2a所给定)可以是1和564之间的任何整数而C端氨基酸(如表2b所给定)是5至568的任何整数(视片段长度将是5和567(包括两者)之间的连续氨基酸的任何数(整数)而定)。对于SEQ ID NO：12的片段，N端氨基酸可以是1和549之间的任何整数(如表3a所给定)而C端氨基酸(如表3b所给定)是5至553的任何整数(视片段长度将是5和552(包括两者)个氨基酸之间的连续氨基酸的任何数(整数)而定)。应注意除非具体提出，否则包括所有用于描述本发明任何实施方式的范围并且给定多肽的片段长度可以是任何整数，只要多肽片段的长度比SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14所鉴定的多肽至少短1个氨基酸。

本发明也提供跨越SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的特定残基的多种肽片段(包括至少5个连续氨基酸的持续跨度或连续跨度)，对于SEQ ID NO：2，优选的片段包括含有或跨越SEQ ID NO：2的氨基酸99的至少5个连续氨基酸的那些。对于SEQ ID NO：4，优选片段包括含有SEQID NO：4的氨基酸239的至少5个连续氨基酸的跨度片段。跨越SEQ IDNO：6至少5个连续氨基酸的优选片段包括含有或跨越下述的那些：氨基酸326；氨基酸327；氨基酸328；氨基酸329；氨基酸326和327；氨基酸327和328；氨基酸328和329；氨基酸326、327和328；氨基酸327、328和329；或氨基酸326、327、328和329。对于SEQ ID NO：8，优选的片段(跨越SEQ ID NO：8至少5个连续氨基酸)是含有或跨越下述的那些：氨基酸99；氨基酸102；氨基酸170；氨基酸99和102；氨基酸102和170；或氨基酸99、102和170。SEQ ID NO：10的优选片段是那些包括或含有下述氨基酸的至少5个连续氨基酸的跨度片段：氨基酸99；氨基酸102；氨基酸239；氨基酸99和102；氨基酸102和239；或氨基酸99、102和239。对于SEQ ID NO：12，优选片段是那些包括至少5个连续氨基酸的跨度片段，其包括：氨基酸99；氨基酸102；氨基酸170；氨基酸239；氨基酸99和102；氨基酸102和170；氨基酸170和239；氨基酸99、102和170；氨基酸102、170和239；或氨基酸99、102、170、和239。

如本文所述，可以通过用蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胶原酶)或用化学试剂(例如溴化氰(CNBr))切割本发明的多肽获得片段。或者，可以在强酸环境(例如pH2.5)下产生多肽片段。该多肽片段可通过化学合成或使用转化了本发明表达载体的宿主同样出色地制备。该转化的宿主细胞含有核酸，其在用于调控和/或表达多肽片段的适合元件的调控下允许这些片段表达。

某些优选实施方式中，本文公开的多肽片段保留产生该片段的全长多肽的至少一种特性或活性。因此，SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14所提供的全长多肽和多肽片段都具有一或多种下述特性或生物学活性：1)与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的特异抗体特异结合；2)与在感染了禽流感病毒的动物或人类中发现的抗体特异结合；与分离自或源自感染了禽流感病毒的动物或人类中在MHC I类或II类抗原的情况中的T-细胞受体(CTL(细胞毒性T淋巴细胞)和/或HTL(辅助性T淋巴细胞)受体特异结合或活化该受体的能力；3)诱导动物或人类抗禽流感病毒的免疫应答的能力；4)诱导动物或人类抗禽流感病毒的保护性免疫应答的能力。本发明的某些方面，该特性或生物学活性是针对于H5血清型禽流感病毒或禽流感A。

使用植物表达系统生产本申请提供的多肽、变体多肽或多肽或变体多肽的片段时，包括有纯化多肽的组合物可以包括植物细胞组分(例如，细胞壁、植物细胞膜的细胞性基质和碳水化合物等)或植物细胞基质组分。类似地，使用真核或原核表达系统生产本申请提供的多肽、变体多肽或多肽或变体多肽的片段时，每种各自的表达系统的细胞膜或细胞壁组分可存在于包括部分纯化多肽的组合物中。

本发明的多肽(或其片段)可能是单体或多聚体(例如，二聚体、三聚体、四聚体和更高的多聚体)。因此，本发明涉及本发明多肽的单体和多聚体、它们的制备及含有它们的组合物。本发明的多聚体多肽可以源自本文公开的相同多肽序列(“同多聚体”)或源自不同序列(“异多聚体”)。同多聚体可含有具有相同或不同氨基酸序列的多肽；但是这些序列源自相同来源的多肽(即SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14)。异多聚体指除了本发明多肽以外，还含有一或多个异源多肽(即不同蛋白质的多肽)的多聚体多肽。因此，本发明文中的异多聚体可以指含有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14(或其片段)的任何组合的多聚体多肽。或者，异多聚体多肽可包括与多肽或其它元件融合的SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14中任何一种，其形成疏水、亲水、离子和/或共价缔合。

如本文所提出，多聚体多肽可通过疏水、亲水、离子和/或共价缔合而形成和/或可通过例如脂质体形成而间接连接。因此，一个实施方式中，当本发明的多肽在溶液中相互接触时形成本发明的多聚体，例如同二聚体或同三聚体。另一个实施方式中，当本发明的多肽与本发明的多肽抗体(包括本发明融合蛋白质中的异源多肽序列的抗体)在溶液中接触时形成本发明的异多聚体，例如异三聚体或异四聚体。另一个实施方式中，本发明的多聚体通过与本发明多肽共价缔合和/或在本发明多肽之间共价缔合而形成。该共价缔合的一个非限制性实例是如本发明融合蛋白质所提供的免疫球蛋白重链之间二硫键的形成，该融合蛋白质包括与Ig重链融合的包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽或其片段(参见例如，US专利5,478,925，其公开内容于此处通过整体引用作为参考)。能形成共价缔合的多聚体的融合蛋白质的另一实例是oseteoprotegerin(参见例如，国际公开号：WO 98/49305，其内容被整体引用作为参考)。另一个实施方式中，两个或多个本发明的多肽通过肽接头接合。实例包括如美国专利No.5,073,627(通过引用作为参考)所述的那些肽接头。可使用常规重组DNA技术产生包括多个由肽接头分开的本发明多肽的蛋白质。

通过将本发明的多肽与亮氨酸拉链或异亮氨酸拉链多肽序列融合可以形成其它多聚体多肽。亮氨酸拉链和异亮氨酸拉链结构域是这样的多肽，其促进在其中发现该结构域的蛋白质的多聚。适于产生本发明的可溶多聚体蛋白质的亮氨酸拉链结构域的非限制性实例是PCT申请WO 94/10308所述的那些，其通过引用作为参考。使用本领域已知技术将包括在溶液中二聚或三聚化，与多肽序列融合的本发明多肽的重组融合蛋白质在适当的宿主细胞中表达，并且从培养物上清中回收生成的可溶多聚体融合蛋白质。

也可以使用本领域已知的化学技术产生多聚体多肽。例如，本发明多聚体中期望含有的多肽可以使用接头分子进行化学交联，且本领域已知接头分子长度优化技术(参见，例如美国专利5,478,925，其在此通过整体引用作为参考)。此外，通过在位于用于构建多聚体多肽的多肽序列内的半胱氨酸残基之间引入二硫键可以产生多聚体多肽(参见例如美国专利5,478,925，其在此通过整体引用作为参考)。此外，可通过向多肽的C端或N端加入半胱氨酸或生物素而常规修饰本发明的多肽，以及可应用本领域已知的技术产生含有一或多个这些修饰多肽的多聚体(参见例如美国专利5,478,925，其在此通过整体引用作为参考)。此外，可应用本领域已知的其它技术产生含有期望包括在本发明多聚体中的多肽组分的脂质体(参见，例如美国专利5,478,925，其在此通过整体引用作为参考)。

本文提供的多肽，以及其片段可还包括促进该片段与其它分子、氨基酸或多肽序列相连的接头元件(L)。也可以使用接头将多肽或其片段连接到亲和纯化方法中所使用的固体支持基质上。适于本发明实践的“接头”的非限制性实例包括化学接头(例如由Pierce，Rockford，IL出售的那些)或允许多肽连接组合的肽(参见，例如接头，例如美国专利6,121,424、5,843,464、5,750,352和5,990,275公开的那些，其通过整体引用作为参考)。

其它实施方式中，接头元件(L)可以是氨基酸序列(肽接头)。其它实施方式中，肽接头具有一或多个下述特征：a)其允许其连接的多肽(相对于彼此)自由转动；b)其对于蛋白酶的消化(切割)是抗性的或敏感的；和c)其不与和其接合在一起的多肽相互作用。多种实施方式中，根据本发明的多聚体构建体包括肽接头且该肽接头长度为5至60个氨基酸。更优选地，肽接头长度是10至30个氨基酸；甚至更优选地，肽接头长度是10至20个氨基酸。一些实施方式中，肽接头长度是17个氨基酸。

适合用于本发明的肽接头由选自Gly、Ser、Asn、Thr和Ala的氨基酸所组成。优选地，肽接头包括Gly-Ser元件。优选的实施方式中，肽接头包括(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)_y，其中y是1、2、3、4、5、6、7或8。其它实施方式提供的肽接头包括((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)_y-Ser-Pro)。某些优选实施方式中，y的值为3、4或5。其它优选实施方式中，肽接头包括(Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)_y或((Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)_y-Ser-Pro)，其中y是1、2、3、4、5、6、7或8。某些优选实施方式中，y的值为3、4或5。需要可切割的接头元件时，可以单独使用一或多个可切割的接头序列(例如因子Xa或肠激酶(Invitrogen，San Diego Calif.))或将其与前述接头组合使用。

本发明的多聚构建体也可以包括一系列重复元件，任选地与其它元件分散分布。如本领域技术人员所理解，多聚多肽中出现的重复元件的顺序并不严格且本发明可以提供任何本文提出的重复元件的排列。因此，根据本发明的“多聚构建体”可以提供多聚多肽，其包括一系列任选地通过接头元件(化学接头元件或氨基酸接头元件)接合的多肽、多肽片段或表位。

“变体多肽”(或多肽变体)应理解为指相对于天然多肽，展现出某些修饰的多肽。这些修饰可以包括至少一个氨基酸的缺失、添加或取代、截短、延伸、嵌合融合(融合蛋白质)、突变或展现出翻译后修饰的多肽。这些同源性变体多肽中，本发明的另一方面是包括与天然或天然发生的多肽全长展现出至少(或至少约)20.00％-99.99％(包括两者)同一性的氨基酸序列的那些。前述同一性百分数的范围应认为包括20.00％和99.99％，且提供对20.00％到至多99.99％之间以0.01％为间隔的任何组成的百分数的书面说明和支持。这些百分数是纯粹统计学的且两多肽序列间的差别可以随机地以及在整个序列长度上分布。因此，变体多肽可以与本发明的多肽序列具有20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的同一性百分数。优选的实施方式中，变体多肽或修饰多肽展现出与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14至少60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的同一性百分数。参照所鉴定的特定SEQ ID NO：的全长多肽或片段(例如如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14列出的那些多肽或其片段)长度计算同一性百分数。所有情况下，变体多肽保留与SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12或14所列出的多肽相关的至少一种生物学活性(例如，诱导个体免疫应答的能力或诱导个体保护性免疫应答的能力)。从“变体多肽”和“变体多肽片段”的定义中特别排除那些在公众可获得的数据库中提供的流感血凝素多肽。例如，作为变体多肽，特别排除流感A病毒(A/鸭/香港/698/79(H5N3))，保藏号No.AAD13571(AF082039)。

本发明的融合蛋白质包括一或多个异源多肽序列(例如促进本发明多肽纯化的标签(参见例如美国专利No.6,342,362，其通过整体引用作为参考；Altendorf等人，[1999-WWW，2000]“Structure and Function of the F_oComplex of the ATP Synthase from Escherichia Coli，”J.of ExperimentalBiology 203：19-28，The Co.of Biologists，Ltd.，G.B.；Baneyx[1999]“Recombinant Protein Expression in Escherichia coli，”Biotechnology10：411-21，Elsevier Science Ltd.；Eihauer等人，[2001]“The FLAG^TMPeptide，a Versatile Fusion Tag for the Purification of RecombinantProteins，”J.Biochem Biophys Methods 49：455-65；Jones等人，[1995]J.Chromatography 707：3-22；Jones等人，[1995]“Current Trends inMolecular Recognition and Bioseparation，”J.of Chromatography A.707：3-22，Elsevier Science B.V.；Margolin[2000]“Green FluorescentProtein as a Reporter for Macromolecular Localization in Bacterial Cells，”Methods 20：62-72，Academic Press；Puig等人，[2001]“The TandemAffinity Purification(TAP)Method：A General Procedure of ProteinComplex Purification，”Methods 24：218-29，Academic Press；Sassenfeld[1990]“Engineering Proteins for Purification，”TibTech 8：88-93；Sheibani[1999]“Prokaryotic Gene Fusion Expression Systems and Their Use inStructural and Functional Studies of Proteins，”Prep.Biochem.&Biotechnol.29(1)：77-90，Marcel Dekker，Inc.；Skerra等人，[1999]“Applications of a Peptide Ligand for Streptavidin：the Strep-tag”，Biomolecular Engineering 16：79-86，Elsevier Science，B.V.；Smith[1998]“Cookbook for Eukaryotic Protein Expression：Yeast，Insect，and PlantExpression Systems，”The Scientist 12(22)：20；Smyth等人，[2000]“Eukaryotic Expression and Purification of Recombinant ExtracellularMatrix Proteins Carrying the Strep II Tag”，Methods in Molecular Biology，139：49-57；Unger[1997]“Show Me the Money：Prokaryotic ExpressionVectors and Purification Systems，”The Scientist 11(17)：20，其每个都通过整体引用作为参考)，或者来自厂商的市售可得的标签，例如STRATAGENE(La Jolla，CA)、NOVAGEN(Madison，WI)、QIAGEN，Inc.，(Valencia，CA)或InVitrogen(San Diego，CA)。

其它实施方式中，本发明的多肽(例如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12和/或14或其片段)可以与具有佐剂活性的异源多肽序列(多肽佐剂)融合。该多肽非限制性实例包括热激蛋白(hsp)(参见例如，美国专利No.6,524,825，其公开内容通过整体引用作为参考)。

本发明的范围内也包括作为“表位”的至少一或多个SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽片段。本发明上下文中，术语“表位”用来指通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键一个接一个连接的一系列通常是L-氨基酸的残基。本发明中优选的CTL-(或CD8⁺T细胞)-诱导肽长13个残基或更短且通常由约8至约11个残基(例如8、9、10或11个残基)组成，优选9或10个残基。优选的HTL(或CD4⁺T细胞)-诱导肽长度少于约50个残基且通常由约6至约30个残基，更通常约12至25(例如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基)个残基，和经常约15至20(例如15、16、17、18、19或20)个残基组成。

本发明也提供根据本发明多肽的生物学活性片段(表位)且包括那些能够引发抗H5血清型流感病毒免疫应答的肽，所述免疫应答提供与所述多肽片段反应的成分(B-细胞、抗体和/或细胞免疫应答组分(例如辅助性、细胞毒性和/或抑制性T-细胞))；本文公开的完整的、全长未修饰的多肽；或本文公开的多肽片段和完整的、全长未修饰多肽两者。

本发明也提供一种组合物，其包括至少一种包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14(或其片段)的分离的、重组的或纯化的多肽和至少一种其它组分。本发明的多个方面，其它组分是固体支持物(例如，微量滴定孔、磁珠、非磁性珠、琼脂糖微珠、玻璃、纤维素、塑料、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、硝酸纤维素、尼龙或聚砜)。其它组分也可以是本领域技术人员已知的可药用赋形剂或佐剂。本发明的一些方面，固体支持物提供本发明多肽的阵列或包括本发明多种多肽组合的多肽阵列。

本发明也提供引发个体中免疫应答的方法，包括向个体给予足以在该个体中诱导免疫应答的量的包括本发明多肽的组合物。一些实施方式中，在个体中诱导“保护性”或“治疗性免疫应答”。“保护性免疫应答”或“治疗性免疫应答”指预防、降低或至少部分阻止个体的疾病症状、副作用或病程的CTL(或CD8⁺T细胞)和/或HTL(或CD4⁺T细胞)和/或抗体应答。例如，相比于未免疫对照个体，在诱导了保护性免疫应答的个体中可以展现出降低的死亡率和/或展现出降低的病毒释放。保护性免疫应答也可包括由辅助性T细胞(或CD4⁺T细胞)激发所促进的抗体应答。美国专利No.6,419,931教导了其它在个体中诱导免疫应答的方法，其通过整体引用作为参考。贯穿本申请，术语CTL可以与CD8⁺T细胞互换使用而术语HTL可以与CD4⁺T细胞互换使用。

本申请上下文中，个体指鸟类和/或哺乳动物，例如但不限于猿、黑猩猩、猩猩、人类、猴子以及家畜(宠物)例如狗、猫、豚鼠、仓鼠、兔子、白鼬、牛、马、山羊和绵羊。在此定义禽或鸟类为鸟纲中通常前肢特化为翅膀，具有鳞状下肢、喙，使用卵生方式繁殖后代的温血脊椎动物。为了本说明书的目的，优选的鸟类组是家鸡、火鸡、鸵鸟、鸭子、鹅、天鹅和康沃尔郡游乐鸡(cornish game hens)。更优选的组是家鸡和火鸡。

将给予或给药定义为向个体的身体引入物质并且包括口服、经鼻、经眼、直肠、阴道和非经肠道途径。组合物可通过任何给药途径，包括但不限于皮下(SQ)、肌肉内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)、皮内(ID)、经鼻、经眼或口腔粘膜(IN)或口服单独给予或与其它试剂组合给予。

给予个体的组合物可以任选地含有佐剂并且可以本领域已知的向受试者递送免疫原的任何方式被递送。组合物也可在任何载体中配制，包括例如可药用载体，例如E.W.Martin′s Remington′s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，Easton，PA所述。优选的实施方式中，组合物可在不完全福氏佐剂、完全福氏佐剂或明矾中配制。

其它实施方式中，本发明提供诊断检测法，其基于本领域技术人员已知的Western印迹形式或标准免疫检测法并且其利用包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14，实质上由其组成或由其组成的多肽。例如，可使用基于抗体的检测法如酶联免疫吸附检测法(ELISA)、放射免疫检测法(RIA)、横流检测法(lateral flow assays)、逆流层析结合检测法(reversibleflow chromatographic binding assay)(参见例如美国专利No.5,726,010，其通过整体引用作为参考)、免疫层析条检测法(immu nochromatographicstrip assays)、自动流量检测法(automated flow assays)和利用含多肽生物传感器的检测法来检测与本发明提供的多肽(或其片段)结合的抗体。进行检测的检测法和方法是本领域已知的并且该方法可定性(抗体存在与否)或定量(比较样品与使用本发明的多肽制备的标准曲线)检验生物样品(例如血清、血浆或血液)中结合本发明多肽的抗体的存在。

可以认为基于抗体的检测法有四类：直接结合检测法、夹心检测法、竞争检测法和置换检测法。直接结合检测中，标记抗体或抗原，并且存在测量所形成的复合物数量的手段。夹心检测中，测量至少三种组分(例如抗体-抗原-抗体)的复合物的形成。竞争检测中，标记抗原和未标记抗原竞争结合抗体且测量结合的或游离的组分。置换检测中，标记抗原预结合抗体，而当未标记抗原置换受体上结合的标记抗原时测量信号的改变。

可以根据美国专利No.5,712,170和其引述的文献的教导进行横流检测法。美国专利No.5,712,170和其引述的文献通过整体引用作为参考。用于实现置换检测的置换检测法和流量免疫传感器描述于：(1)Kusterbeck等人，“Antibody-Based Biosensor for Continuous Monitoring”，出自Biosensor Technology，R.P.Buck等人编，Marcel Dekker，N.Y.第345-350页(1990)；Kusterbeck等人，“A Continuous Flow Immunoassay for Rapidand Sensitive Detection of Small Molecules”，Journal of ImmunologicalMethods，vol.135，第191-197页(1990)；Ligler等人，“Drug DetectionUsing the Flow Immunosensor”，出自Biosensor Design and Application，J.Findley等人编，American Chemical Society Press，第73-80页(1992)；和Ogert等人，“Detection of Cocaine Using the Flow Immunosensor”，Analytical Letters，vol.25，第1999-2019页(1992)，它们全部在此通过整体引用作为参考。置换检测法和流量免疫传感器也描述于美国专利No.5,183,740，其在此也通过整体引用作为参考。不同于大多数用于检测小分子的竞争性免疫检测法，置换免疫检测法可以产生抗原浓度增加的正信号。

本发明也提供将抗体与本发明多肽(例如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14，其抗体结合片段)结合的方法，包括将含有抗体的样品在允许形成抗体-抗原复合物的条件下与多肽接触。这些方法还可以包括检测所述抗体-抗原复合物形成的步骤。这一方法的多个方面，进行免疫检测来检测H5血清型流感病毒。该免疫检测方法的非限制性实例包括酶联免疫吸附检测法(ELISA)、放射免疫检测法(RIA)、横流检测法、免疫层析条检测法、自动流量检测法、Western印迹、免疫沉淀检测法、逆流层析结合检测法、凝集检测法和生物传感器法。本发明的其它方面提供多肽阵列在进行前述检测方法时的用途，该阵列可以含有至少一种SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14(或其片段)列出的多肽且也可以含有其它相同或不同流感血清型的多肽。

本发明也涉及与本发明多肽结合的抗体。特别考虑对于本文列出的多肽有免疫特异性的抗体。多种实施方式中，优选不与其它血凝素多肽交叉反应的抗体。尤其优选不与抗源自H5血清型流感病毒的血凝素多肽所产生的抗体交叉反应的抗体。可以使用标准材料和本领域已知的方法制备本发明的抗体(参见例如，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，1983；Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications，1982；Selected Methods in Cellular Immunology，1980；ImmunologicalMethods，Vol.II，1981；Practical Immunology，和Kohler等人，[1975]Nature256：495)。这些抗体还可以包括一或多种其它组分，例如固体支持物，载体或可药用赋形剂，或标记。

术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出期望的生物学活性，尤其是中和活性。“抗体片段”包括全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所使用的术语“单克隆抗体”指从基本上同源的抗体群体中获得的抗体，即包括该群体的单个抗体除了可能以小量存在的天然发生的突变以外是相同的。单克隆抗体针对于单个抗原位点是高度特异性的。此外，相比于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂，每个单克隆抗体都针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆的”指由基本上同源的抗体群体获得的抗体特征，而不应理解为需要任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明所使用的单克隆抗体可通过Kohler等人，[1975]Nature 256：495首先描述的杂交瘤方法而制备，或可通过重组DNA方法(参见例如U.S专利No.4,816,567)而制备。“单克隆抗体”也可使用例如Clackson等人，[1991]Nature 352：624-628和Marks等人，[1991]J.Mol.Biol.222：581-597描述的技术从噬菌体抗体文库分离。

本文描述的单克隆抗体特别地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体相应序列以及该抗体的片段相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体相应序列以及该抗体的片段相同或同源，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567和Morrison等人，[1984]Proc.Natl.Acad Sci.USA 81：6851-6855)。还包括与如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14提出的多肽或其片段特异性结合的人源化抗体(参见例如，美国专利No.6,407,213或6,417,337，其教授制作人源化抗体的方法，通过引用整体作为参考)。

“单链Fv”或“sFv”抗体片段包括抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链上。通常，Fv多肽还包括V_H和V_L结构域之间的多肽接头，其使sFv形成用于抗原结合的期望结构。对于sFv的综述参见Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies[1994]Vol.113：269-315，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其片段包括与同一多肽链(V_H-V_L)中轻链可变区结构域(V_L)相连的重链可变区结构域(V_H)。双抗体更详细地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人，[1993]Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448。术语“线性抗体”指Zapata等人，[1995]Protein Eng.8(10)：1057-1062描述的抗体。

“分离的”抗体是从其天然环境组分中被鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，且可包括酶、激素、和其它蛋白质的或非蛋白质的溶质。优选的实施方式中，将抗体纯化为(1)按重量计大于由Lowry法确定的抗体的95％，和最优选按重量计大于99％，(2)足以获得至少15个N端或中间氨基酸序列的残基的程度，这通过使用转杯式序列分析仪(spinning cup sequenator)，或(3)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染通过SDS-PAGE而鉴定为均质。分离的抗体包括重组细胞中的原位抗体，因为抗体天然环境的至少一种组分将不存在。然而通常，将通过至少一种纯化步骤制备分离的抗体。

如上所述，“核苷酸序列”、“多核苷酸”或“核酸”可以互换使用并且根据本发明应理解为指双链DNA、单链DNA或所述DNA的转录产物(例如RNA分子)。

认为20.00％和99.99％之间的同一性百分数范围包括20.00％和99.99％，且提供对20.00％到至多99.99％之间以0.01％为间隔的任何组成的百分数的书面说明和支持。这些百分数是纯粹统计学的且两条核酸序列间的差别可以随机地以及在整个序列长度上分布。例如，同源序列可以展示与本发明的序列20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的同一性百分数。通常，参照天然和/或天然发生的多核苷酸的全长计算同一性百分数。两个或多个核苷酸或多肽序列中使用的术语“相同的”或“同一性”百分数指当使用序列比较算法或通过手工比对和肉眼观察测量时，在比较窗中比较和比对最大一致性时，相同或具有指定百分数的相同核苷酸或氨基酸残基的两或多个序列或子序列。

可使用本领域已知的多种序列比较算法和程序中的任何一种来评价蛋白质和核酸序列同源性。该算法和程序包括但不限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)：2444-2448；Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215(3)：403-410；Thompson等人，1994，Nucleic Acids Res.22(2)：4673-4680；Higgins等人，1996，Methods Enzymol.266：383-402；Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215(3)：403-410；Altschul等人，1993，Nature Genetics 3：266-272)。通常使用厂商提供的缺省参数或使用上述参考中提出的那些参数进行序列比较，其通过引用整体作为参考。

如本文所使用的“互补”多核苷酸序列通常指起于双链核酸分子(DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA)中特定嘌呤和特定嘧啶之间的氢键的序列。主要的特异配对是鸟嘌呤和胞嘧啶以及腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶。“互补”多核苷酸序列也可指“反义”多核苷酸序列或“反义序列”。

也可以通过在高严谨性、中度严谨性和/或低严谨性下的杂交研究确定序列同源性和序列同一性。可以使用多种程度的杂交严谨性。条件越苛刻，双链体形成所需的互补性越高。条件的苛刻度可以通过温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间等来控制。优选地，在低、中度或高严谨性条件下利用本领域公知的技术(例如Keller，G.H.，M.M.Manak[1987]DNAProbes，Stockton Press，New York，NY.，第169-170页所述)来进行杂交。

例如，Southern印迹中可以通过标准方法(Maniatis等人，[1982]Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)使用³²P-标记的基因特异性探针进行所固定DNA的杂交。通常，可以在允许检测与示例多核苷酸序列同源的靶序列的中度至高严谨性条件下进行杂交和随后的洗涤。对于双链DNA基因探针，可以在比DNA杂交体解链温度(Tm)低20-25℃，在6X SSPE，5X Denhardt′s溶液，0.1％SDS，0.1mg/ml变性DNA中过夜进行杂交。该解链温度由下述等式所述(Beltz等人，[1983]Methods of Enzymology，R.Wu，L.Grossman和K.Moldave编Academic Press，New York 100：266-285)。

Tm＝81.5℃+16.6Log[Na⁺]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/双链体的碱基对长度。

通常按下述进行洗涤：

(1)室温下在1X SSPE，0.1％SDS中洗涤15min，两次(低严谨性洗涤)；

(2)T_m-20℃，0.2X SSPE，0.1％ SDS中洗涤15min，一次(中度严谨性洗涤)。

对于寡核苷酸探针，可以在低于杂交体解链温度(T_m)10-20℃，于6X SSPE，5X Denhardt溶液，0.1％SDS，0.1mg/ml变性DNA中过夜进行杂交。可以通过下述等式确定寡核苷酸探针的T_m。

T_m(℃)＝2(T/A碱基对数)⁺4(G/C碱基对数)(Suggs等人，[1981]ICN-UCLA Symp.Dev.Biol.Using Purified Genes，D.D.Brown[编]，Academic Press，New York，23：683-693)。

按下述进行洗涤：

(1)室温下在1X SSPE，0.1％SDS中洗涤15min，两次(低严谨性洗涤)

2)杂交温度下，1X SSPE，0.1％SDS中洗涤15min，一次(中度严谨性洗涤)。

通常，可以改变盐和/或温度来改变严谨性。对碱基长度>70左右的标记DNA片段，可以使用下述条件：

低度：1或2X SSPE，室温

低度：1或2X SSPE，42℃

中度：0.2X或1X SSPE，65℃

高度：0.1X SSPE，65℃。

作为另一非限制性实例，可以按照下述进行使用高严谨性的程序：在由6X SSC，50mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA，0.02％ PVP，0.02％Ficoll，0.02％ BSA和500μg/ml变性鲑精DNA构成的缓冲液中于65℃进行含DNA的过滤物的预杂交8h至过夜。过滤物在65℃(优选的杂交温度)在含有100μg/ml变性鲑精DNA和5-20 x 10⁶cpm³²P-标记探针的预杂交混合物中杂交48h。或者可以在SSC缓冲液(相当于0.15M NaCl和0.05M柠檬酸钠的1X SSC)存在下于65℃进行杂交步骤。随后，在含有2X SSC，0.01％ PVP，0.01％ Ficoll和0.01％ BSA的溶液中于37℃进行过滤物洗涤1h，随后在0.1％ SSC中于50℃洗涤45min。或者可以在含有2X SSC和0.1％SDS，或0.5X SSC和0.1％SDS，或0.1X SSC和0.1％SDS的溶液中于68℃进行过滤物洗涤15min的区间。洗涤步骤后，可通过放射自显影检测杂交探针。可使用的其它高严谨性条件是本领域公知的且如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版Cold Spring Harbor Press，N.Y.，第9.47-9.57页；和Ausubel等人，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates andWiley Interscience，N.Y.所引述，其通过整体引用作为参考。

使用中度严谨性条件的程序的另一非限制性实例如下：将含有DNA的过滤物在温度为60℃，在5X SSC缓冲液和标记探针存在下预杂交，然后杂交。随后，在50℃于含有2X SSC的溶液中进行过滤物洗涤并且可通过放射自显影检测杂交探针。可使用的其它中度严谨性条件是本领域公知的并且如Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，N.Y.，第9.47-9.57页；和Ausubel等人，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associatesand Wiley Interscience，N.Y所引述，其整体引用作为参考。

如上所述，双链体形成和稳定性取决于杂交体的两条链之间的实质互补性以及一定的可以容忍的错配程度。因此，本发明的探针序列包括所述序列的突变(单个和多个)、缺失、插入及其组合，其中所述突变、插入和缺失允许与目的靶多核苷酸形成稳定杂交体。在给定多核苷酸序列中可以以多种方法产生突变、插入和缺失，并且这些方法是普通技术人员已知的。其它方法在今后可能成为已知的。

本领域也公知可以使用限制性酶获得本发明DNA序列的功能性片段。例如，Bal31核酸外切酶可以常规用于受时间控制的DNA限制性消化(通常指“删切碱基(erase-a-base)”程序)。参见例如，Maniatis等人，[1982]Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Wei等人，[1983]J.Biol.Chem.258：13006-13512。

本发明还包括本发明多核苷酸序列的片段。应理解，本发明多核苷酸序列的代表性片段指来自其所源自序列中具有至少5个持续核苷酸，优选至少12个持续核苷酸，和更优选至少15、18或至少20个持续核苷酸的任何核苷酸片段。该片段的上限是编码特定多肽(例如，如SEQ ID NO：2的多肽)的全长序列中发现的总核苷酸数。术语“持续”与术语“连续”或短语“连续跨度”可以互换。因此，一些实施方式中，多核苷酸片段可指“至少X个核苷酸的连续跨度片段，其中X是从5开始的任何整数；该片段的上限是比编码特定多肽(例如，如包括SEQ ID NO：2的多肽)的全长序列中发现的总核苷酸数少一个核苷酸的数目。

一些实施方式中，本发明包括能够在多种严谨性条件(例如高或中度或低严谨性)的条件下与本发明的核苷酸序列杂交的那些片段；任选地，与本发明的核苷酸序列杂交的片段可以按下述进行标记。

一个实施方式中，本发明提供用于鉴定在转化宿主细胞或从怀疑由禽流感感染的个体所分离的细胞中存在本发明核酸的方法。这些变化的实施方式中，本发明提供样品(获得自个体或细胞培养物)中核酸的检测，包括将样品与本发明的核酸(多核苷酸)(例如RNA、mRNA、DNA、cDNA或其它核酸)接触。优选的实施方式中，多核苷酸是探针，其任选地被标记且用于检测系统。许多检测核酸存在的方法及适宜的检测方法包含在本发明中。典型的利用核酸杂交的检测形式包括但不限于1)核连缀分析、2)狭缝印迹检测法、3)、northern印迹检测法(Alwine等人，Proc.Natl.Acad.Sci.74：5350)、4)磁珠分离、5)核酸或DNA芯片、6)反向Northern印迹检测法、7)斑点印迹检测法、8)原位杂交、9)RNA酶保护检测法(Melton等人，Nuc.Acids Res.12：7035且如描述于Ambion，Inc.，Austin，Tex.1998年的目录)、10)连接酶链式反应、11)聚合酶链式反应(PCR)、12)反转录酶(RT)-PCR(Berchtold等人，Nuc.Acids.Res.17：453)、13)差示RT-PCR(DDRT-PCR)或其它适合的技术和检测法的组合。适合用于这些检测方法的标记包括但不限于1)放射性标记，2)酶标记，3)化学发光标记，4)荧光标记，5)磁性标记或其它适合的标记，包括下述那些。这些方法和标记是本领域公知的且对于熟练技术人员是可广泛获得的。类似地，将标记整合入核酸的方法对于熟练技术人员也是公知的。

因此，本发明也提供用于与靶序列杂交或用于由靶序列产生的扩增子的检测探针(例如公开的多核苷酸序列的片段)。该检测探针将包括至少8、9、10、11、12、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸的不间断/连续跨度片段。标记的探针或引物由放射性化合物或由上述提出的另一类型标记(例如1)放射性标记，2)酶标记，3)化学发光标记，4)荧光标记，5)磁性标记)所标记。或者，未标记的核苷酸序列可直接用作探针或引物；然而，该序列通常用放射性元素(³²P、³⁵S、³H、¹²⁵I)或诸如生物素、乙酰氨基芴、地高辛、5-溴脱氧尿苷或荧光素的分子所标记以提供可以用于多种应用的探针。

本发明的多核苷酸也可以使用阵列或结合到固体支持物上的多核苷酸用于定性和定量分析基因表达。如本文所使用，术语阵列指全长多核苷酸或允许特异检测基因表达的足够长度的多核苷酸的一、二或多维排列。优选地，片段长度至少15个核苷酸。更优选，片段长度至少100个核苷酸。更优选，片段长度大于100个核苷酸。一些实施方式中，片段长度可大于500个核苷酸。

例如，可在如Schena等人(Science 270：467-470，1995；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：10614-10619，1996)所述的互补DNA微阵列中用本发明的全长多核苷酸或其片段进行基因表达的定量分析。由PCR扩增多核苷酸或其片段并且阵列化到硅烷化显微载片上。在湿度箱中孵育印刷的阵列以允许阵列元素的再水化并在0.2％SDS中漂洗1min一次，水中漂洗1min两次和硼氢化钠溶液中漂洗5min一次。于95℃将该阵列浸入水中2min，转移到0.2％ SDS中1min，用水漂洗两次，空气干燥并于25℃暗处储存。

从生物样品中分离mRNA并通过一轮反转录制备探针。在14 x 14mm玻璃盖片下探针于60℃杂交至1cm²微阵列6-12h。阵列在25℃于低严谨性洗涤缓冲液(1 x SSC/0.2％ SDS)中洗涤5min，然后室温下于高严谨性洗涤缓冲液(0.1 x SSC/0.2％ SDS)中洗涤10min。使用装有定制的过滤器装置的荧光激光扫描装置在0.1 x SSC中扫描阵列。通过取两个独立杂交的平均比率获得准确的差异表达测量值。

也可以在如Pietu等人(Genome Research 6：492-503，1996)所述的互补性DNA阵列中进行生物样品中存在的多核苷酸的定量分析。PCR扩增的本发明多核苷酸或其片段并且将其点在膜上。然后，用放射性核苷酸标记源自多种组织或细胞的生物样品中产生的mRNA。在受控条件下杂交并洗涤后，通过磷成像或放射自显影检测杂交的mRNA。进行重复实验且然后进行差异表达的mRNA的定量分析。

或者，本发明的多核苷酸序列也可用于分析系统，例如DNA芯片。DNA芯片及其使用是本领域公知的且(参见例如，US专利No.5,561,071；5,753,439；6,214,545；Schena等人，BioEssays，1996，18：427-431；Bianchi等人，Clin.Diagn.Virol.，1997，8：199-208；其每个通过整体引用作为参考)和/或由商业厂商提供，例如Affymetrix，Inc.(Santa Clara，CA)。此外，本发明的核酸序列可以用于核酸分析程序中的分子量标准。

本发明也提供遗传构建体包括：a)编码包括SEQ ID No：2、4、6、8、10、12或14的多肽或其片段的多核苷酸序列；b)与编码包括SEQ ID No：2、4、6、8、10、12或14多肽或SEQ ID No：2、4、6、8、10、12或14的片段的多核苷酸序列具有至少约20％-99.99％同一性的多核苷酸序列，其中所述多肽具有包括SEQ ID No：2、4、6、8、10、12或14多肽或其片段的至少一种生物学活性；c)编码与包括SEQ ID No：2、4、6、8、10、12或14的多肽或SEQ ID No：2、4、6、8、10、12或14的片段具有至少约20％-99.99％同一性的多肽的多核苷酸序列，其中所述多肽具有包括SEQ ID No：2、4、6、8、10、12或14的多肽或其片段的至少一种生物学活性；d)编码包括SEQ ID No：2、4、6、8、10、12或14的多肽的片段的多核苷酸序列，其中所述片段具有SEQ ID No：2、4、6、8、10、12或14多肽的至少一种活性；e)包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13的多核苷酸序列；f)与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13的多核苷酸序列具有约20％-99.99％同一性的多核苷酸序列；g)编码SEQ ID No：2、4、6、8、10、12或14的多肽变体(例如变体多肽)的多核苷酸序列，其中所述变体具有至少一种与SEQ ID No：2、4、6、8、10、12或14多肽相关的生物学活性；h)编码如(g)所列出变体多肽的片段的多核苷酸序列，其中所述变体多肽的片段具有至少一种与该多肽相关的生物学活性；i)编码多聚构建体的多核苷酸序列；或j)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)列出的多核苷酸互补的多核苷酸。本发明的遗传构建体也可以含有其它调控元件例如启动子和增强子和任选地，选择标签。

含有如本文所提出的遗传构建体或上文提出的编码多肽的多核苷酸(有效连接至调控元件)的载体和表达盒也包括在本发明的范围内。该载体和表达盒也可含有其它转录调控序列。该载体和表达盒还可包括选择标签。表达盒可含有至少一种待共转化至生物的有效连接至调控元件的其它基因。或者，可以在多表达盒中提供其它基因和调控元件。提供的表达盒具有多个限制性位点用于插入本发明序列，以使其受调控区域的转录调控。该表达盒可另外含有有效连接至调控元件的选择标签基因。

表达盒在转录的5′-3′方向上将包括转录和翻译起始区，本发明的DNA序列以及转录和翻译终止区。转录起始区、启动子可能是宿主细胞天然的或类似的或者是其外源的或异源的。此外，启动子可能是天然序列或者是合成序列。“外源”意指转录起始区所导入的天然植物中未发现该转录起始区。如本文所使用，嵌合基因包括与编码序列异源的转录起始区有效连接的编码序列。

本发明的另一方面提供用于克隆和/或表达本文教导的多核苷酸序列的载体。本发明的载体，包括疫苗载体，也可以包括允许所述核苷酸序列在特定宿主细胞中表达和/或分泌所需的元件。该载体可以含有启动子、用于起始和终止翻译的信号、以及用于调控转录的适宜区域。某些实施方式中，载体可以稳定保持在宿主中并且任选地，可以含有引导翻译的蛋白质分泌的信号序列。根据所用的宿主细胞选择这些不同的元件。载体可以整合到宿主基因组中或者任选地是自主复制载体。

本发明也提供由本文公开的多核苷酸序列所编码的多肽、肽、片段或变体的表达，包括在允许多肽表达的条件下培养由本发明多核苷酸转化的宿主细胞，和任选地回收该表达的多肽。

公开的多核苷酸序列也可以由第二核酸序列调控以便在转化有重组DNA分子的宿主中表达蛋白质或肽。例如，蛋白质或肽的表达可由任何本领域已知的启动子/增强子元件调控。可用于调控表达的启动子包括但不限于CMV-IE启动子、SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)、劳斯肉瘤病毒的3’长末端重复中含有的启动子(Yamamoto等人，1980，Cell 22：787-797)、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445)、金属硫蛋白基因调控序列(Brinster等人，1982，Nature 296：39-42)；含有诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)或tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)的启动子的原核生物载体；也参见“Useful proteinsfrom recombinant bacteria”出自Scientific American，1980，242：74-94；植物表达载体，其包括胭脂碱合成酶启动子区(Herrera-Estrella等人，1983，Nature 303：209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等人，1981，Nucl.Acids Res.9：2871)和光合酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等人，1984，Nature 310：115-120)；来自酵母或真菌的启动子元件例如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子和/或碱性磷酸酶启动子。

根据本发明的载体例如是质粒或病毒源的载体。特定实施方式中，使用包括有效连接至公开的多核苷酸序列中所含蛋白质或肽编码核酸序列的启动子、一或多个复制原点和任选地，一或多个选择标记(例如抗生素抗性基因)。表达载体包括调控基因表达(包括在期望宿主细胞中的基因表达)的调控序列。用于本发明多肽表达的示例性载体包括pET型质粒载体(Promega)或pBAD质粒载体(Invitrogen)或下述实施例中提供的那些。另外，本发明的载体用于转化宿主细胞从而克隆或表达本发明的多核苷酸序列。

本发明也包括由本发明载体所转化的宿主细胞。这些细胞可通过将插入到上面限定的载体中的核苷酸序列导入宿主细胞，然后在允许本发明的多核苷酸序列复制和/或表达的条件下培养所述细胞而获得。

宿主细胞可选自原核或真核生物系统，例如细菌细胞(革兰氏阴性或革兰氏阳性)、酵母细胞(例如酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)或毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris))、动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)、植物细胞和/或使用杆状病毒载体的昆虫细胞。一些实施方式中，用于表达多肽的宿主细胞包括但不限于美国专利No.6,319,691、6,277,375、5,643,570或5,565,335中教导的那些，其每个通过整体引用作为参考，包括各自每个专利中引述的所有参考文献。

此外，可选择调节插入序列表达或以所需特定形式修饰及加工基因产物的宿主细胞株。从某些启动子的表达可以在某些诱导物存在下被升高；因此，可调控遗传改造的多肽的表达。此外，不同宿主细胞具有用于蛋白质翻译和翻译后加工及修饰(例如糖基化、磷酸化)的特性及特异机制。可以选择适宜的细胞系或宿主系统来保证表达了的外源蛋白质的期望的修饰和加工。例如，可以使用在细菌系统中表达来产生未糖基化的核心蛋白质产物。酵母中的表达将产生糖基化的产物。可以使用在哺乳动物细胞中表达以保证异源蛋白质的“天然”糖基化。此外，不同载体/宿主表达系统可不同程度地影响加工反应。

也提供转化的植物细胞、转基因种子、转基因植物部分和转基因植物，其含有与调控元件有效连接的一或多个核苷酸序列、遗传构建体、载体，或包括本文公开的多核苷酸中一或多种的表达盒，或其生物学活性片段。如本文所使用，术语“植物”包括藻类和高等植物(包括但不限于树)。因此，可用本发明的遗传构建体、表达盒或本发明的载体转化藻类、单子叶和双子叶植物。某些优选实施方式中，用本发明的遗传构建体转化烟草植物或烟草细胞系。

因此，本申请中讨论的用于生产组合物的多肽或免疫方法可以源自或获得自转基因植物细胞，其已被遗传改造来表达包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14(实质上由其组成或由其组成)的多肽、其片段、其变体多肽、或前述多肽的片段。参见，例如，美国专利公开号：2004/0268442 A1，其公开内容通过整体引用作为参考。

本文将转基因植物限定为植物细胞培养物、植物细胞系、植物组织培养物、低等植物、单子叶植物、双子叶植物或源自转化的植物细胞或原生质体的后代或其部分，其中转化的植物基因组含有通过实验室技术导入、并未原始存在于相同物种的天然，非转基因植物细胞中的外源DNA。术语“转基因植物”和“转化的植物”有时在本领域用作同义术语来定义其DNA含有外源DNA分子的植物。适宜的时候，编码如本文提出的多肽的多核苷酸可以被优化以在转化的植物、植物细胞或植物部分中表达。也就是说，可以使用对应于目的物种的物种偏好密码子来合成基因。本领域可获得用于合成诸如植物偏好基因的方法。参见例如，美国专利No.5,380,831和5,436,391和Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，此处通过引用作为参考。

易于利用公知的方法来实现用于在植物中表达多肽的基因盒的构建，例如Sambrook等人，(1989)；和Ausubel等人，(1987)Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York，NY公开的那些。

制备本发明的构建体时，可操作多种DNA片段以便提供以适合的方向和需要时在适合的读码框中的DNA序列。可使用连接头或接头来接合DNA片段或者可包括其它操作以提供方便的限制性酶剪切位点，除去多余DNA，除去限制性酶剪切位点等。

使用克隆进行多个步骤，以便扩增含有用于随后导入期望宿主细胞的目的启动子/基因的载体。可获得多种克隆载体，其克隆载体包括在大肠杆菌中起作用的复制系统和允许选择已转化细胞的标签。说明性的载体包括pBR322、pUC系列、pACYC184、Bluescript系列(Stratagene)等。因此，该序列可在适合的限制性酶剪切位点插入载体，生成的质粒用于转化大肠杆菌宿主(例如大肠杆菌株系HB101、JM101和DH5α)，大肠杆菌在适合的营养培养基中生长且收获细胞并裂解及回收质粒。分析可包括序列分析、限制性酶剪切分析、电泳等。每个操作后，用于最终构建体的DNA序列可被限制性酶剪切并接合下一序列，每个部分构建体可克隆入相同或不同的质粒中。

可获得载体或可以容易地制备载体用于转化植物细胞。通常，质粒或病毒载体应含有所有在给定宿主中维持和表达异源DNA序列所需的DNA调控序列。该调控序列通常包括前导序列和编码翻译起始信号密码子、翻译终止密码子的DNA序列，以及编码调控信使RNA加工的3’UTR信号的DNA序列。在任何特定物种中选择适合的元件以优化表达是本领域普通技术人员利用本文公开的教导的任务。最终，期望载体应具有能够提供允许鉴定含有该载体的宿主细胞的表型特性的标记基因。

插入到植物细胞的外源编码序列的活性取决于与该插入物相邻的内源性植物DNA的影响。通常，使用任何转化技术的异源基因的插入似乎是随机的；然而，存在产生具有在植物细胞中位点特异性重组DNA的植物的技术(参见WO 91/09957)。产生所期望序列或者在启动子调控下的序列的表达的任何方法或方法的组合是可接受的。

本发明不限于任何转化植物细胞的特定方法。将DNA导入植物细胞的技术是本领域技术人员公知的。已经描述了四种将外源DNA递送到植物细胞的基本方法。化学方法(Graham和van der Eb，Virology，54(02)：536-539，1973；Zatloukal，Wagner，Cotten，Phillips，Plank，Steinlein，Curiel，Birnstiel，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660：136-153，1992)；包括微注射的物理方法(Capecchi，Cell，1980，22(2)：479-488)、电传孔(Wong和Neumann，1982，Biochim.Biophys.Res.Commun.，107(2)：584-587；Fromm，Taylor，Walbot，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)：5824-5828；美国专利No.5,384,253)和基因枪(Johnston和Tang，1994，Methods Cell.Biol.，43(A)：353-365；Fynan，Webster，Fuller，Haynes，Santoro，Robinson，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(24)：11478-11482)；病毒方法(Clapp，1993，Clin.Perinatol.，20(1)：155-168；Lu，Xiao，Clapp，Li，Broxmeyer，1993，J.Exp.Med.，178(6)：2089-2096；Eglitis和Anderson，1988，Biotechniques，6(7)：608-614；Eglitis，Kantoff，Kohn，Karson，Moen，Lothrop，Blaese，Anderson，1988，Avd.Exp.Med.Biol.，241：19-27)；和受体介导方法(Curiel，Agarwal，Wagner，Cotten，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88(19)：8850-8854；Curiel，Wagner，Cotten，Birnstiel，Agarwal，Li，Loechel，Hu，1992，Hum.Gen.Ther.，3(2)：147-154；Wagner等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(13)：6099-6103)。

利用电穿孔向植物细胞中导入DNA是本领域技术人员公知的。使用植物细胞壁降解酶(例如果胶降解酶)来提供比未处理的细胞更易于用电穿孔转化的受体细胞。为了使通过电穿孔的转化有效，可直接使用脆弱的组织，例如细胞悬浮培养物或胚发生愈伤组织、或幼胚或其它器官化组织。通常需要用果胶降解酶或以受控方式机械损伤对靶植物材料的细胞壁进行部分降解。该处理后的植物材料易于通过电穿孔接受外源DNA。

向植物细胞中递送外源转化DNA的另一方法是通过微粒轰击。这一方法中，微粒包被外源DNA并通过推动力递送到细胞。该微粒通常由钨、金、铂和类似金属制成。微粒轰击的优点是不需要分离原生质体(Cristou等人，1988，Plant Physiol.，87：671-674)，也不需要对农杆菌感染的易感性。通过加速向玉米细胞中递送DNA的方法的说明性实例是生物射弹粒子递送系统(Biolistics Particle Delivery System)，其可以用于推动包被DNA的颗粒或细胞穿过屏到覆盖有悬浮培养的玉米细胞的过滤膜表面。该屏分散颗粒以便使颗粒不以大的聚集体形式递送至受体细胞。对于轰击，优选悬浮细胞浓缩到过滤膜或固体培养基上。或者幼胚或其它靶细胞可排列在固体培养基上。待轰击的细胞定位在低于微弹停止板的适当距离上。轰击转化中，可优化预轰击培养条件和轰击参数来产生最大数目的稳定转化体。用于轰击的物理和生物参数在这一方法中都是重要的。物理因素是涉及操作DNA/微弹沉淀的那些或影响任一微弹飞行和速度的那些。生物因素包括在轰击前和轰击后立即操作细胞的所有步骤，以帮助减轻与轰击相关的创伤的靶细胞的渗透调整，以及转化DNA的性质，例如线性DNA或完整超螺旋质粒。

农杆菌介导的转移是向植物细胞中导入外源DNA的广泛应用的系统，因为可以将DNA导入整个植物组织，消除从原生质体再生完整植物的需要。用于向植物细胞中导入DNA的农杆菌介导的植物整合载体是本领域公知的。参见例如，Fraley等人，1985，Biotechnology，3：629；Rogers等人，1987，Meth.in Enzymol.，153：253-277所述的方法。此外，Ti-DNA的整合是产生很少重排的相对精确的方法。待转移的DNA区由边界序列所限定，且干涉DNA通常插入植物基因组，如Spielmann等人，1986，Mol.Gen.Genet.，205：34；Jorgensen等人，1987，Mol.Gen.Genet.，207：471所述。

当今农杆菌转化载体能够在大肠杆菌以及农杆菌中复制，以允许方便的操作。而且，近来在用于农杆菌介导的基因转移的载体方面的技术进展改进了载体中基因的排列和限制性位点以促进能够表达多种蛋白质或多肽的载体的构建。以用于直接表达插入的多肽编码基因，以启动子和多聚腺苷酸化位点为侧翼的方便的多接头区适于本发明的目的。另外，含有臂和去臂的Ti基因的农杆菌可以用于转化。

可以使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔及这些处理的组合的方法实现植物原生质体的转化(参见例如Potrykus等人，1985，Mol.Gen.Genet.，199：183；Marcotte等人，1988，Nature，335：454)。这些系统在不同植物物种中的应用取决于从原生质体再生特定物种的能力。

一旦转化了植物细胞、选择并检查了抗原表达，一些情况下能够再生整个可育植物。这将极大取决于所选植物物种。用于再生多种植物物种的方法已经在文献中报道且是熟练技术人员公知的。为了实践本发明，优选转化植物细胞系，其通过避免通常的冗长的再生步骤可以快速培养并扩大化。另外，植物细胞培养物的使用避免露天生产并极大降低基因逃逸和食品污染的机会。优选诸如NT-1和BY-2(An，G.，1985，Plant Physiol.，79：568-570)的烟草悬浮细胞培养物，因为这些系尤其易于在培养中处理、易于转化、产生稳定的整合事件和适于冷藏。

烟草悬浮细胞系NT-1适于实践本发明。NT-1细胞原始产生自烟草(Nicotiana tabacum L.cv.)黄化叶片2。NT-1细胞系被广泛使用且易于获得；当然任何烟草悬浮细胞系都符合于本发明的实践。适合用于下面实施例的NT-1细胞获得自美国典型培养物保藏中心，保藏号ATCC No.74840。也参见U.S.专利No 6,140,075，其通过整体引用作为参考。

已经描述了从实验室规模摇瓶到几千升生物反应器容器范围内的许多植物细胞培养技术和系统且这是植物细胞培养领域公知的。参见例如Fischer，R.等人，1999，Biotechnol.Appl.Biochem.，30，109-112和Doran，P.，2000，Current Opinions in Biotechnology，11：199-204。在将转化的植物细胞培养至所需量后，收集它们，温和地洗涤并放于适合的缓冲液中破碎。许多不同的缓冲液适合本发明。通常，缓冲液是中性pH值或该值附近的水性等渗缓冲盐溶液，其不含有可以用于溶解膜的强去污剂。优选的缓冲液包括Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水和含有1mM EDTA的PBS。

一个实施方式中，可以通过超声波破坏细胞。将洗涤过的细胞以约0.01gm/ml至约5.0gm/ml，优选约0.1gm/ml至约0.5gm/ml(每体积缓冲液中洗后湿重细胞)放于缓冲液中。许多市售可得的超声仪器适合本发明且超声时间为约5至约20秒，优选约15至约20秒。生成物的大小可在几微米至几百微米的范围内且暴露HA1多肽或其免疫原性片段。

本发明也涉及DNA疫苗组合物，其可以用于引发免疫应答或保护性免疫应答。本发明的这一方面，包括编码本文提供多肽(或其片段)的重组DNA或mRNA的组合物的量以足以引发所述个体中免疫应答或保护性免疫应答的量给予个体。可从编码目的抗原的核酸中删除信号序列且可根据本领域已知的方法监控个体免疫应答的诱导。“保护性免疫应答”或“治疗性免疫应答”指CTL(或CD8⁺T细胞)、HTL(或CD4⁺T细胞)，和/或对抗原的保护性体液免疫应答，其以某种方式预防或至少部分抑制疾病症状、副作用或病程。这一发明的上下文中，该保护性或治疗性应答提供经免疫个体相比于未免疫个体增加的存活率(降低的死亡率)或受到禽流感病毒攻击的经免疫个体中降低的病毒释放。

另一个实施方式中，本发明还包括结合多肽抗原给予本发明的多核苷酸(DNA)疫苗或其组合物。优选的实施方式中，抗原是由作为多核苷酸疫苗给予的多核苷酸所编码的多肽。具体的优选实施方式中，多肽抗原作为加强剂在最初给予多核苷酸疫苗后给予。

本发明的再一实施方式提供使用本领域技术人员已知的“引发-加强”(prime-boost)接种疫苗方案对本文公开的新型血凝素抗原(参见例如，所附序列表中列出的多肽和肽片段)免疫应答的诱导。本发明的这一方面，本发明的DNA疫苗或多肽抗原以足以“引发”个体免疫应答的量给予个体。然后个体的免疫应答通过给予下述而“加强”：1)本发明的肽、多肽和/或全长多肽抗原(任选地结合免疫刺激性分子和/或佐剂)之一或组合；或2)含有编码一或多个相同或任选地不同的本文所列抗原、多表位构建体和/或肽抗原的核酸的病毒载体。本发明的一些替换的实施方式中，编码免疫刺激性分子的基因可整合到用于“加强”个体免疫应答的病毒载体中。示例性免疫刺激性分子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-15、Il-16、Il-18、IL-23、IL-24、促红细胞生成素、G-CSF、M-CSF、血小板源性生长因子(PDGF)、MSF、FLT-3配体、EGF、成纤维细胞生长因子(FGF；例如aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6或FGF-7)、胰岛素样生长因子(例如，IGF-1、IGF-2)；血管内皮生长因子(VEGF)、干扰素(例如，IFN-γ、IFN-α、IFN-β)；白血病抑制因子(LIF)；睫状神经营养因子(CNTF)；抑瘤素M；干细胞因子(SCF)；转化生长因子(例如TGF-α、TGF-β1、TGF-β1、TGF-β1)或趋化因子(例如但不限于，BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、嗜酸粒细胞趋化蛋白-1(Eotaxin-1)、Eotaxin-2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、CXXXC趋化因子/神经趋化因子、GRO  α/MGSA、HCC-1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1、ABCD-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α/GROβ、MIP-3α/Exodus/LARC、MIP-3β/Exodus-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1α、TARC或TECK)。编码这些免疫刺激性分子的基因是本领域技术人员已知且编码序列可获自多种来源，包括多种专利数据库、公共可获得的数据库(例如美国国立医学图书馆或欧洲分子生物实验室建立的核酸和蛋白质数据库)、科学文献或诸如Genzyme，Inc.，R&DSystems，Inc或InvivoGen，Inc公司生产的目录中引用的科学文献。(参见例如，1995 Cytokine Research Products catalog，Genzyme Diagnostics，Genzyme Corporation，Cambridge MA；2002或1995 Catalog of R&DSystems，Inc(Minneapolis，MN)；或2002 Catalog of InvivoGen，Inc(SanDiego，CA)，其每个通过整体引用作为参考，包括此中引述的所有参考)。

向个体中导入DNA疫苗的方法是熟练技术人员公知的。例如，可以将DNA注入骨骼肌或其它体细胞组织(例如肌内入射)。阳离子脂质体或生物射弹装置，例如基因枪可以用于递送DNA疫苗。或者可以使用离子电渗疗法和其它经皮传递方法来向个体中导入DNA疫苗。

用于本发明的病毒载体可以缺失病毒基因组的一部分以导入新基因而不破坏病毒的感染性。本发明的病毒载体通常是非病原性病毒。在医师的选择中，可以选择病毒载体以便感染特定的细胞类型，例如专门的抗原呈递细胞(例如巨噬细胞或树突状细胞)。或者，可以选择能够感染个体的任何细胞的病毒载体。适合用于本发明的示例性病毒载体包括但不限于痘病毒，例如痘苗病毒、禽痘病毒、鸡痘病毒(fowlpox virus)、高度减毒痘苗病毒(例如Ankara或MVA[Modified Vaccinia Ankara])、逆转录病毒、腺病毒、杆状病毒等。优选的实施方式中，病毒载体是Ankara或MVA。

用于构建痘苗病毒表达载体的一般策略是本领域已知的(参见例如Smith和Moss Bio Techniques Nov/Dec，306-312，1984；U.S.专利No.4,738,846(通过整体引用作为参考)。Sutter和Moss(Proc.Nat′l.Acad.SciU.S.A.89：10847-10851，1992)和Sutter等人，(Vaccine，12(11)：1032-40，1994)公开了非复制重组Ankara病毒(MVA)的构建和作为载体的应用，其可用作本发明的病毒载体。

包括本发明多核苷酸的组合物可以包括市售可得的适合的核酸疫苗载体(质粒)(例如Vical，San Diego，CA)或也是市售可得的其它核酸载体(质粒)(例如，Valenti，Burlingame，CA)。或者本发明提供包括病毒载体和本发明多核苷酸的组合物。另外，该组合物可以包括可药用载体，例如生理盐水。该可药用载体是本领域公知的且也是市售可得的。例如，该可药用载体描述于E.W.Martin′s Remington′s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，Easton，PA。

实施例1-载体构建

贯穿这些实施例，可使用下面的标识指如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13所鉴定的序列：

SEQUENCE ID NO：1：HA5TW68 v3：禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)H5 Turkey/Wisconsin/68；无切割位点；按植物密码子进行了优化；SEQUENCE ID NO：3：HA5TW68 v4：禽流感病毒(AIV)HA H5Turkey/Wisconsin/68；无切割位点且丝氨酸239改变为天冬酰胺；按植物密码子进行了优化；SEQUENCE ID NO：5：HA5TW68 v5：禽流感病毒(AIV)HA H5 Turkey/Wisconsin/68天然序列；植物密码子优化的包括蛋白酶切割位点；

SEQUENCE ID NO：7：HA5AH v1：禽流感病毒(AIV)HA H5902755祖先共有杂交体，其氨基酸在位置99、102和170有修饰；无切割位点；植物密码子优化的；SEQUENCE ID NO：9：HA5AH v2：禽流感病毒(AIV)HA H5 902755祖先共有杂交体，其氨基酸在位置99、102和239有修饰；无切割位点；按植物密码子进行了优化；和

SEQUENCE ID NO：11：HA5AH v3：禽流感病毒(AIV)HA H5902755祖先共有杂交体，其氨基酸在位置99、102、170和239进行修饰；无切割位点；按植物密码子进行了优化。

这些实施例中也讨论下述包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9和11的HA基因/载体构建体：

pDAB4492 v1 Ubi10-PAT：CSVMV-HA5tw68 v3(载体含有SEQ IDNO：1)；

pDAB4493 v1 Ubi10-PAT：dMas-HA5tw68 v3(载体含有SEQ ID NO：1)；

pDAB4494 v2 Ubi10-PAT：dMas-HA5tw68 v4(载体含有SEQ ID NO：3)；

pDAB4495 v3 Ubi10-PAT：dMas-HA5tw68 v5(载体含有SEQ ID NO：5)；

pDAB4496 v4 Ubi10-PAT：dMas-HA5AH v1(载体含有SEQ ID NO：7)；

pDAB4497 v5 Ubi10-PAT：dMas-HA5AH v2(载体含有SEQ ID NO：9)；和

pDAB4498 v6 Ubi10-PAT：dMas-HA5AH v3(载体含有SEQ ID NO：11)。

出于这些实施例的目的，使用CSVMV指美国专利No.7,053,205(其通过整体引用作为参考)中公开的木薯叶脉花叶病毒启动子；使用PAT指美国专利No.5,633,434；5,879,903；5,637,489；5,276,268；5,273,894(其各自通过整体引用作为参考)公开的膦丝菌素乙酰转移酶选择标记，dMas指美国专利No.5,001,060；5,573,932和5,290,924(其各自通过整体引用作为参考)中公开的嵌合组成型启动子4OCS Δ MAS。

下面也提供在每个构建体中各自进行基因/氨基酸修饰的总结：

构建体和基因                    99     102      170     239    343

pDAB4492 v1 HA5tw68 v3          D      T        SNA     S      ----

pDAB4493 v1 HA5tw68 v3          D      T        SNA     S      ----

pDAB4494 v2 HA5tw68 v4          D      T        SNA     N      ----

pDAB4495 v3 HA5tw68 v5          D      T        SNA     S      RQKR

pDAB4496 v4 HA5AH v1     A    V      NST     S    ----

pDAB4497 v5 HA5AH v2     A    V      SNA     N    ----

pDAB4498 v6 HA5AH v3     A    V      NST     N    ----

pDAB4492的构建

含有HA5tw68 v3的植物密码子优化的序列(SEQ ID NO：1；血凝素H5 Turkey Wisconsin 68 #3型)的质粒DASPICO69获自PicoScript，8080North Stadium，Suite 2100，Houston，TX 77054。HA5tw68 v3 DNA编码序列通过BbsI和SacI限制性酶酶切分离自DASPICO69，并克隆到pDAB3912的相应NcoI和SacI限制位点。生成的构建体pDAB4485含有CsVMV启动子v2(木薯叶脉花叶病毒启动子#2型)-HA5tw68 v3编码序列-Atu ORF23 3’UTR v1(农杆菌开放读码框23 3’未翻译区#1型)，其侧翼加有Gateway attL限制位点(Gateway克隆系统和att位点来自Invitrogen Corporation，Carlsbad CA)。通过限制性酶酶切确认pDAB4485。

CsVMV启动子v2-HA5tw68 v3--Atu ORF23 3’UTR v1表达盒通过Gateway Clonase的酶反应固定到目的双元载体pDAB3736的attRGateway重组位点(Cat # 11791-019，Invitrogen Corporation，CarlsbadCA)。通过限制性酶酶切鉴定阳性克隆并通过测序反应确认。完整的双元载体含有T-DNA边界B-RB7 MARv3(拟南芥(Arabidopsis thaliana)基质结合区#3型)-CsVMV启动子v2-HA5tw68 v3-Atu ORF23 3’UTRv1-At Ubi10启动子v2(拟南芥多聚遍在蛋白10启动子#2型)-PAT v3(膦丝菌素乙酰转移酶#3型)-Atu ORF1 3’UTR v3(根瘤农杆菌开放读码框13’非翻译区#3型)-T-DNA边界A。获得的载体被标记为pDAB4492。

pDAB4493的构建

含有HA5tw68 v3的植物密码子优化的序列(血凝素H5 TurkeyWisconsin 68 #3型)的质粒DASPICO69获自PicoScript，8080 NorthStadium，Suite 2100，Houston，TX 77054。HA5tw68 v3 DNA编码序列通过BbsI和SacI限制性酶酶切分离自DASPICO69，并克隆到pDAB3914的相应的NcoI和SacI限制位点。生成的构建体pDAB4486含有ΔMAS启动子v1(ΔMAS 4 OCS启动子#1型)-HA5tw68 v3编码序列-Atu ORF233’UTR v1(根瘤农杆菌开放读码框23 3’非翻译区#1型)，其侧翼加有Gateway attL重组位点(Gateway克隆系统和att位点来自InvitrogenCorporation，Carlsbad CA)。通过限制性酶酶切确认pDAB4486。

ΔMas启动子v1-HA5tw68 v3--Atu ORF23 3’UTR v1表达盒通过Gateway Clonase的酶反应固定到目的双元载体pDAB3736的attRGateway重组位点(Cat # 11791-019，Invitrogen Corporation，CarlsbadCA)。通过限制性酶酶切鉴定阳性克隆并通过测序反应确认。完整的双元载体含有T-DNA边界B-RB7 MARv3(拟南芥基质结合区#3型)-ΔMas启动子v1-HA5tw68 v3-Atu ORF23 3’UTR v1-At Ubi10启动子v2(拟南芥多聚遍在蛋白10启动子#2型)-PAT v3(膦丝菌素乙酰转移酶#3型)-Atu ORF1 3’UTR v3(根瘤农杆菌开放读码框13’非翻译区#3型)-T-DNA边界A。获得的载体标记为pDAB4493。

pDAB4494的构建

含有HA5tw68 v4的植物密码子优化的序列(SEQ ID NO：3；血凝素H5 Turkey Wisconsin 68#4型)的质粒DASPICO70获自PicoScript，8080North Stadium，Suite 2100，Houston，TX 77054。HA5tw68 v4 DNA编码序列通过BbsI和SacI限制性酶酶切分离自DASPICO70，并克隆到pDAB3914的相应NcoI和SacI限制位点。生成的构建体pDAB4487含有ΔMAS启动子v1(ΔMAS 4 OCS启动子#1型)-HA5tw68 v4编码序列-Atu ORF23 3’UTR v1(根瘤农杆菌开放读码框23 3’非翻译区#1型)，其侧翼加有Gateway attL重组位点(Gateway克隆系统和att位点来自Invitrogen Corporation，Carlsbad CA)。通过限制性酶酶切确认pDAB4487。

ΔMas启动子v1-HA5tw68 v4--Atu ORF23 3’UTR v1表达盒通过Gateway Clonase的酶反应固定到目的双元载体pDAB3736的attRGateway重组位点(Cat# 11791-019，Invitrogen Corporation，CarlsbadCA)。通过限制性酶切鉴定阳性克隆并通过测序反应确认。完整的双元载体含有T-DNA边界B-RB7 MARv3(拟南芥基质结合区#3型)-ΔMas启动子v1-HA5tw68 v4-Atu ORF23 3’UTR v1-At Ubi10启动子v2(拟南芥多聚遍在蛋白10启动子#2型)-PAT v3(膦丝菌素乙酰转移酶#3型)-Atu ORF1 3’UTR v3(根瘤农杆菌开放读码框1 3’非翻译区#3型)-T-DNA边界A。获得的载体标记为pDAB4494。

pDAB4495的构建

含有HA5tw68 v5的植物密码子优化的序列(SEQ ID NO：5；血凝素H5 Turkey Wisconsin 68 #5型)的质粒DASPICO71获自PicoScript，8080North Stadium，Suite 2100，Houston，TX77054。HA5tw68 v5 DNA编码序列通过BbsI和SacI限制性酶酶切分离自DASPICO71，并克隆到pDAB3914的相应NcoI和SacI限制位点。生成的构建体pDAB4488含有ΔMAS启动子v1(ΔMAS 4 OCS启动子#1型)-HA5tw68 v5编码序列-Atu ORF23 3’UTR v1(根瘤农杆菌开放读码框23 3’非翻译区#1型)，其侧翼加有Gateway attL重组位点(Gateway克隆系统和att位点来自Invitrogen Corporation，Carlsbad CA)。通过限制性酶酶切确认pDAB4488。

ΔMas启动子v1-HA5tw68 v5--Atu ORF23 3’UTR v1表达盒通过Gateway Clonase的酶反应固定到目的双元载体pDAB3736的attRGateway重组位点(Cat# 11791-019)，Invitrogen Corporation，CarlsbadCA)。通过限制性酶切鉴定阳性克隆并通过测序反应确认。完整的双元载体含有T-DNA边界B-RB7 MARv3(拟南芥基质结合区#3型)-ΔMas启动子v1-HA5tw68 v5-Atu ORF23 3’UTR v1-At Ubi10启动子v2(拟南芥多聚遍在蛋白10启动子#2型)-PAT v3(膦丝菌素乙酰转移酶#3型)-Atu ORF1 3’UTR v3(根瘤农杆菌开放读码框1 3’非翻译区#3型)-T-DNA边界A。获得的载体标记为pDAB4495。

pDAB4496的构建

含有HA5AH v1的植物密码子优化的序列(SEQ ID NO：7；血凝素H5Animal Health #1型)的质粒DASDNA1获自DNA2.0，1430 O’Brien Drive，Suite E，Menlo Park，CA，94025。HA5AH v1 DNA编码序列通过BbsI和SacI限制性酶酶切分离自DASDNA1，并克隆到pDAB3914的相应NcoI和SacI限制位点。生成的构建体pDAB4489含有ΔMAS启动子v1(ΔMAS 4 OCS启动子#1型)-HA5AH v1编码序列-Atu ORF23 3’UTR v1(根瘤农杆菌开放读码框23 3’非翻译区#1型)，其侧翼加有Gateway attL重组位点(Gateway克隆系统和att位点来自Invitrogen Corporation，Carlsbad CA)。通过限制性酶酶切确认pDAB4489。

ΔMas启动子v1-HA5AH v1--Atu ORF23 3’UTR v1表达盒通过Gateway Clonase的酶反应固定到目的双元载体pDAB3736的attRGateway重组位点(Cat # 11791-019，Invitrogen Corporation，CarlsbadCA)。通过限制性酶酶切鉴定阳性克隆并通过测序反应确认。完整的双元载体含有T-DNA边界B-RB7 MARv3(拟南芥核基质结合区#3型)-ΔMas启动子v1-HA5AH v1-Atu ORF23 3’UTR v1-At Ubi10启动子v2(拟南芥多聚遍在蛋白10启动子#2型)-PAT v3(膦丝菌素乙酰转移酶#3型)-Atu ORF1 3’UTR v3(根瘤农杆菌开放读码框13’非翻译区#3型)-T-DNA边界A。获得的载体标记为pDAB4496。

pDAB4497的构建

含有HA5AH v2的植物密码子优化的序列(SEQ ID NO：9；血凝素H5Animal Health #2型)的质粒DASDNA2获自DNA2.0，1430 O’Brien Drive，Suite E，Menlo Park，CA，94025。HA5AH v2 DNA编码序列通过BbsI和SacI限制性酶酶切分离自DASDNA2，并克隆到pDAB3914的相应NcoI和SacI限制位点。生成的构建体pDAB4490含有ΔMAS启动子v1(ΔMAS 4 OCS启动子#1型)-HA5AH v2编码序列-Atu ORF23 3’UTR v1(根瘤农杆菌开放读码框23 3’非翻译区#1型)，其侧翼加有Gateway attL重组位点(Gateway克隆系统和att位点来自Invitrogen Corporation，Carlsbad CA)。通过限制性酶酶切确认pDAB4490。

ΔMas启动子v1-HA5AH v2--Atu ORF23 3’UTR v1表达盒通过Gateway Clonase的酶反应固定到目的双元载体pDAB3736的attRGateway重组位点(Cat# 11791-019，Invitrogen Corporation，CarlsbadCA)。通过限制性酶切鉴定阳性克隆并通过测序反应确认。完整的双元载体含有T-DNA边界B-RB7 MARv3(拟南芥基质结合区#3型)-ΔMas启动子v1-HA5AH v2-Atu ORF23 3’UTR v1-At Ubi10启动子v2(拟南芥多聚遍在蛋白10启动子#2型)-PAT v3(膦丝菌素乙酰转移酶#3型)-Atu ORF1 3’UTR v3(根瘤农杆菌开放读码框13’非翻译区#3型)-T-DNA边界A。获得的载体标记为pDAB4497。

pDAB4498的构建

含有HA5AH v3的植物密码子优化的序列(SEQ ID NO：11；血凝素H5 Animal Health#3型)的质粒DASDNA3获自DNA2.0，1430 O’BrienDrive，Suite E，Menlo Park，CA，94025。HA5AH v3 DNA编码序列通过BbsI和SacI限制性酶酶切分离自DASDNA3，并克隆到pDAB3914的相应NcoI和SacI限制位点。生成的构建体pDAB4491含有ΔMAS启动子v1(ΔMAS 4 OCS启动子#1型)-HA5AH v3编码序列-Atu ORF23 3’UTRv1(根瘤农杆菌开放读码框23 3’非翻译区#1型)，其侧翼加有Gateway attL重组位点(Gateway克隆系统和att位点来自Invitrogen Corporation，Carlsbad CA)。通过限制性酶酶切确认pDAB4491。

ΔMas启动子v1-HA5AH v3--Atu ORF23 3’UTR v1表达盒通过Gateway Clonase的酶反应固定到目的双元载体pDAB3736的attRGateway重组位点(Cat# 11791-019，Invitrogen Corporation，CarlsbadCA)。通过限制性酶切鉴定阳性克隆并通过测序反应确认。完整的双元载体含有T-DNA边界B-RB7 MARv3(拟南芥核基质结合区#3型)-ΔMas启动子v1-HA5AH v3-Atu ORF23 3’UTR v1-At Ubi10启动子v2(拟南芥多聚遍在蛋白10启动子#2型)-PAT v3(膦丝菌素乙酰转移酶#3型)-Atu ORF1 3’UTR v3(根瘤农杆菌开放读码框13’非翻译区#3型)-T-DNA边界A。获得的载体标记为pDAB4498。

农杆菌转化

将每个双元构建体电穿孔到根瘤农杆菌株系LBA4404(1.8V，25μF，100Ω)。

烟草植物瞬时表达

为了观察植物是否正确表达合成基因，将双元构建体按照Frederick等人(Frederick，R.D.，Thilmony，R.L.，Sessa，G.& Martin，G.B.Recognition specificity for the bacterial avirulence protein AvrPto isdetermined by Thr-204 in the activation loop of the tomato Pto kinase.MolCell 1998，2(2)，241-245)瞬时转化本生烟草(Nicotiana benthamiana)。接种2和3天后取叶样品。然后通过HA-特异ELISA分析检测表达。用在0.01M硼酸盐缓冲液(3.8g.l^-1硼酸钠，pH9，过滤灭菌)中稀释的山羊抗-HA包被96孔ELISA板。将该板在室温过夜孵育。在Bio 101 Fast prep仪中，通过在1ml.g^-1PBS中使新鲜植物材料均匀化而制备粗蛋白质提取物。通过在4℃于Eppendorf 5415C微离心机中在14000转/分钟离心5min而除去不溶材料。分析期间将获得的样品上清保持在冰上且随后储存在-80℃。用每孔300μl的PBST(PBS原液+0.05％ Tween-20)使用洗板机洗板3次。然后用含5％脱脂牛奶的PBST(每孔200μl)于37℃封闭板2h并用每孔300μl的PBST洗涤3次。然后向孔中加入标准和样品(每孔200μl)并在37℃孵育1小时。用每孔300μl的PBST洗板3次，每孔加入100μl的鸡抗-AIV37℃孵育1h。然后在以每孔100μl加入稀释二抗(山羊抗鸡IgG或兔抗山羊辣根过氧化酶缀合物(Sigma)之前，用PBST洗板3次。将板在37℃孵育1h，用PBST洗涤3次然后与TMB底物(Bio Rad，每孔100μl)反应。在450nm读取OD值之前允许显色20-25min。

如图4所示，观察到合成的HA基因的瞬时表达(使用双元载体pDAB4492-pDAB4498)。柱表示在接种2或3天后取自7个收集样品的粗提物的两个重复的平均OD。取平均值后，从转基因样品OD中减去野生型植物叶的OD。“92”表示pDAB4492；“93”表示pDAB4493；“94”表示pDAB4494；“95”表示pDAB4405；“96”表示pDAB4496；“97”表示pDAB4497；“98”表示pDAB4498；“d2”表示第2天和“d3”表示第3天。因此，通过产生的抗禽流感抗体检测合成的HA基因并且该合成的HA基因也在植物(本生烟草)中瞬时表达。

实施例2-NT1细胞系中的表达

由于已证明可由植物表达合成基因，构建体用于稳定转化NT1细胞系。植物细胞系NT1源自降低了生物碱含量且不具备再生为植物的能力的烟草细胞。植物细胞培养物按Cardineau，Guy A.；Mason，Hugh Stanley；Van Eck，Joyce M.；Kirk，Dwayne D.；Walmsley，Amanda Maree所述进行转化。用于制备免疫保护性组合物(例如新城疫病毒HN抗原)的载体和细胞来自转基因植物。WO2004098533(其通过整体引用作为参考)和HA表达通过之前描述的HA-特异性ELISA确定。表4和图5说明多种细胞系中表达的HA的量。

实施例3-矮牵牛植物转化和HA表达

使用下述方法转化矮牵牛。在具有维生素的1/2 YMB和1/2 Murashige和Skoog氏基础培养基(MS培养基)中以1:5稀释制备含有构建体的发根农杆菌(A.rhizogenes)的48h培养物。在25℃再孵育经稀释的培养物2h。在浸入发根农杆菌培养物之前用0.4％次氯酸钠表面灭菌矮牵牛叶盘。将感染的叶盘在转移至选择板之前置于MS琼脂板48h。MS琼脂板含有MS培养基、3％(w/v)蔗糖、1mgL^-1 6-苄氨基嘌呤(BAP)，1mgL^-1吲哚-3-乙酸(IAA)和0.8％(w/v)琼脂。选择板含有MS培养基、3％(w/v)蔗糖、0.8％(w/v)琼脂和5mg/L草铵磷(glufosinate)。新形成的发根以及小部分亲本组织转移到含有500μgml^-1头孢噻肟和5mg/L草铵磷的液体选择MS培养基中。生长10-14天后，从每个健康生长的培养物中取单个根尖并放入新鲜液体选择MS培养基中。按照这一单个根尖亚培养物将根培养物分类为独立系。每2-3周将独立系转移到含有降低的抗生素浓度(250μgml^-1头孢噻肟)和5mg/L草铵磷的新鲜培养基。如图6所示，被特异抗体识别的HA可在矮牵牛中表达。

实施例4-基因PDAB4493-98的DNA疫苗构建体和小鼠疫苗接种

将包括修饰的Turkey Wisconsin 68株系的HA基因以及具有修饰的共有序列祖先基因克隆到载体用于DNA疫苗。使用含有Hind III位点的引物AI11(5’-GCTAGCGGCCGCAATGCAGATTCTGCATTGAA-3’)(SEQ ID NO：15)和含有Not I位点的引物AI 12(5’-GCATAAGCTTCCATGGAGAGGATTGTGAT-3’)(SEQ ID NO：16)PCR扩增来自pDAB4493-4498的HA基因。将PCR产物凝胶纯化(Qiagen试剂盒)、Hind III和Not I消化并连接到由Hind III和Not I消化的pcDNA3(Invitrogen)的多克隆位点。生成的构建体通过限制性酶酶切、PCR和测序确认。阳性对照pCI-PR8由Lorena Brown University ofMelbourne，Melbourne Australia提供。pCI-PR8含有来自A/PR/8/34(PR8)(保藏号AF389118)的HA基因。对十只BALBc小鼠/组(2个重复，每个重复五只)，在第0和10天用100μg DNA疫苗肌肉免疫，并在第14、28、56和84天抽血。通过标准ELISA技术检测用5μg PR-8HA/孔包被的微滴定板对PR-8 HA的抗体应答并如图7所示。

实施例5-动物细胞的DNA转染

使用聚乙烯亚胺(PEI)方法对人293T细胞进行转染。简言之，将细胞加种到含有包括10％胎牛血清(TC培养基)的DMEM的6-孔板中并于37℃，5％ CO₂条件中过夜生长。第二天，当细胞融合70-80％时，除去培养基并加入1ml新的TC培养基在37℃，5％ CO₂孵育1h。这一孵育期间，制备每个孔的反应混合物如下：总体积200μl的普通DMEM中2μgDNA，9ul PEI。将反应混合物混和并在室温孵育10-20min。向每孔加入200μl并将板在37℃，5％ CO₂中孵育48h。孵育24h后用PBS洗涤孔并加入2ml新的TC培养基。通过除去培养基、用PBS洗涤并在含有5mM EDTA的500μl PBS(PBSE)中重悬浮细胞而收集转染。然后将细胞转移到1.5ml管中，离心沉淀并在200μl的PBSE中重悬浮。将细胞进行3次冻融循环并加入Nonidet P40(NP-40，非离子表面活性剂)至终浓度1％。

为了确定表达的蛋白质吸附鸡红细胞的能力，转染哺乳动物细胞(293T和Vero)，随后在无血清培养基中孵育1-4h。除去培养基随后加入500μl 0.5-1％鸡红细胞。室温孵育45min，充分洗涤细胞并显微镜检查。转基因HA蛋白质与红细胞交联的能力表明转基因蛋白质保留了其构象以及结合在红细胞表面的糖基团的能力。

构建体                        分数(293T)-48hr         分数(Vero)-24hr

pCI-PR8对照构建体              ++++                    ++++

单独pcDNA构建体                -                       -

模拟(mock)                     -                       -

pcDNA-4493 tw68 植物密码子     +++                     +++

pcDNA-4494 tw68 239 S为N       ++                      ++

pcDNA-4495 tw68+切割           -                       ++

pcDNA-4496 祖先 170 NST        -                       +

pcDNA-4497 祖先 239 S为N       +                       +

pcDNA-4498 祖先 170 NST 239 N  +                       -

注释

++++，有许多红细胞附着的血细胞吸附(hemabsorbing)细胞的高发生率

+++，有大于5个红细胞附着的血细胞吸附细胞的中度高发生率

++，有大于5个红细胞附着的血细胞吸附细胞的中度发生率

+，有大于5个红细胞附着的血细胞吸附细胞的一定的发生率

-，未检测到血细胞吸附细胞的发生

序列表

<110>美国陶氏益农公司

     M·亨利

     I·M·拉里努亚

     S·M·拉塞尔

<120>禽流感血凝素的新型DNA序列、载体和蛋白质

<130>DAS-133XC1

<150>US 60/814,241

<151>2006-06-16

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1749

<212>DNA

<213>禽流感

<400>1

<210>2

<211>564

<212>PRT

<213>禽流感

<400>2

<210>3

<211>1749

<212>DNA

<213>禽流感

<400>3

<210>4

<211>564

<212>PRT

<213>禽流感

<400>4

<210>5

<211>1761

<212>DNA

<213>禽流感

<400>5

<210>6

<211>568

<212>PRT

<213>禽流感

<400>6

<210>7

<211>1749

<212>DNA

<213>禽流感

<400>7

<210>8

<211>564

<212>PRT

<213>禽流感

<400>8

<210>9

<211>1749

<212>DNA

<213>禽流感

<400>9

<210>10

<211>564

<212>PRT

<213>禽流感

<400>10

<210>11

<211>1749

<212>DNA

<213>禽流感

<400>11

<210>12

<211>553

<212>PRT

<213>禽流感

<400>12

<210>13

<211>1692

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>禽流感血凝素序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1692)

<400>13

<210>14

<211>564

<212>PRT

<213>人造序列

<220>

<223>禽流感血凝素序列

<400>14

<210>15

<211>32

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>用于扩增HA基因的引物AI 11

<400>15

<210>16

<211>29

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>用于扩增HA基因的引物AI 12

<400>16

Claims (25)

1、包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的分离的、纯化的和/或重组的多肽。

2、包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的片段的分离的、纯化的和/或重组的多肽，所述片段包括：

a)SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽的片段；

b)“从Y到Z”的SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的片段，其中Y是所述序列的N端氨基酸而Z是所述序列的C端氨基酸，该片段长度为至少5个氨基酸，且Y和Z是表1-4中针对特定SEQ ID NO：给出的任何整数；或

c)多肽片段或如图1、2或3所示多肽片段，其中所述多肽片段或所述变体多肽的片段具有至少一种与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽的相应生物学活性基本上相同的生物学活性。

3、分离的或纯化的变体多肽，其与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽具有至少60％-99.99％的同一性，且其具有至少一种与SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12或14的多肽相关的生物学活性。

4、分离的、纯化的和/或重组的多肽，包括：

a)选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12和14的多肽的表位；或；

b)多表位构建体，其包括选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12和14的多肽的至少一个表位。

5、分离的或纯化的多肽，其包括异源多肽序列和根据权利要求1、2或3中任一项的多肽。

6、包括载体和权利要求1、2、3或4中任一项的多肽的组合物。

7、分离的多肽，包括：SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14；或SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的至少五个连续氨基酸的片段；或包含如图1、2或3所示的一段氨基酸的片段，其中所述多肽或片段诱导对感染性禽流感病毒的免疫保护性应答，并且其中所述至少5个氨基酸的片段：跨越SEQ ID NO：2的氨基酸99；跨越SEQ ID NO：4的氨基酸239；跨越SEQ ID NO：6的氨基酸326；氨基酸327；氨基酸328；氨基酸329；氨基酸326和327；氨基酸327和328；氨基酸328和329；氨基酸326、327和328；氨基酸327、328和329；或氨基酸326、327、328和329；跨越SEQ ID NO：8的氨基酸99；氨基酸102；氨基酸170；氨基酸99和102；氨基酸102和170；或氨基酸99、102和170；跨越SEQ ID NO：10的氨基酸99；氨基酸102；氨基酸239；氨基酸99和102；氨基酸102和239；或氨基酸99、102和239；或跨越SEQ ID NO：12的氨基酸99；氨基酸102；氨基酸170；氨基酸239；氨基酸99和102；氨基酸102和170；氨基酸170和239；氨基酸99、102和170；氨基酸102、170和239；或氨基酸99、102、170和239。

8、根据权利要求7的分离的多肽，其中所述多肽在植物细胞中产生，包括：

a)用包括编码所述多肽或其片段的多核苷酸的重组载体转化植物细胞以形成转化的植物细胞；

b)在适于表达所述多肽的条件下培养所述转化的植物细胞；和

c)从所述转化的植物细胞中回收所述多肽。

9、根据权利要求7或8的分离的多肽，其中所述多肽或多肽片段与异源多肽序列融合。

10、免疫个体抗禽流感病毒的方法，包括给予足以在所述个体中诱导免疫应答的量的组合物，所述组合物包括载体和多肽，该多肽包括SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12或14；或SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的至少5个连续氨基酸的片段；或包含如图1、2或3所示的一段氨基酸的片段，其中所述多肽或片段诱导对感染性禽流感病毒的免疫保护性应答且其中所述至少5个连续氨基酸的片段：跨越SEQ ID NO：2的氨基酸99；跨越SEQ ID NO：4的氨基酸239；跨越SEQ ID NO：6的氨基酸326；氨基酸327；氨基酸328；氨基酸329；氨基酸326和327；氨基酸327和328；氨基酸328和329；氨基酸326、327和328；氨基酸327、328和329；或氨基酸326、327、328和329；跨越SEQ ID NO：8的氨基酸99；氨基酸102；氨基酸170；氨基酸99和102；氨基酸102和170；或氨基酸99、102和170；跨越SEQ ID NO：10的氨基酸99；氨基酸102；氨基酸239；氨基酸99和102；氨基酸102和239；或氨基酸99、102和239；或跨越SEQ ID NO：12的氨基酸99；氨基酸102；氨基酸170；氨基酸239；氨基酸99和102；氨基酸102和170；氨基酸170和239；氨基酸99、102和170；氨基酸102、170和239；或氨基酸99、102、170和239。

11、根据权利要求10的方法，其中所述多肽或所述多肽片段与异源多肽序列融合。

12、根据权利要求11的方法，其中所述多肽或其片段是植物产生的多肽或植物产生的片段。

13、诱导对禽流感(AI)病毒株系的免疫应答的方法，包括向个体给予足以在所述动物中诱导免疫应答的量的核酸序列或2)病毒载体，其中所述核酸序列编码：包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14，或所述多肽的免疫原性片段；或包括如图1、2或3所示的氨基酸序列的肽片段的多肽；或其中所述病毒载体包括编码包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽或所述多肽的免疫原性片段；或包括如图1、2或3所示的氨基酸序列的肽片段的核酸序列。

14、根据权利要求13的方法，其中所述方法还包括通过给予组合物而加强所述动物的免疫应答，该组合物包括包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽，或所述多肽的免疫原性片段或包含如图1、2或3所示的氨基酸序列的肽片段。

15、根据权利要求13或14的方法，其中所述多肽或所述多肽的免疫原性片段与异源多肽序列融合。

16、根据权利要求13、14或15的方法，其中所述多肽或所述多肽的免疫原性片段源自植物。

17、根据权利要求7、10、11、13、14或15的方法，其中所述多肽在原核生物或真核生物细胞中制备。

18、分离的多核苷酸序列或与其互补的多核苷酸，所述多核苷酸序列编码包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽或者图1、2或3的一或多个多肽片段或者SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的片段。

19、分离的多核苷酸序列或与其互补的多核苷酸，所述多核苷酸序列包括编码与包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽或者SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12或14的或者图1、2或3的一或多个多肽片段具有20％-99.99％序列同源性或同一性的多肽的多核苷酸序列，其中所述多肽具有与包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽或者SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12或14的或者图1、2或3的一或多个多肽片段相关的至少一种生物学活性。

20、与包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13的多核苷酸序列具有至少约20％-99.99％同一性的分离的或纯化的多核苷酸序列，或与其互补的多核苷酸。

21、分离的或纯化的包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13或SEQID NO：1、3、5、7、9、11或13的至少连续8个核苷酸的片段的多核苷酸序列或与其互补的多核苷酸，任选地所述片段是标记的。

22、包括多核苷酸序列的遗传构建体，包括：

a)编码包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽或者图1、2或3的一或多个多肽片段或者SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的片段的多核苷酸或者与其互补的多核苷酸；

b)多核苷酸序列，或者与其互补的多核苷酸，所述多核苷酸序列编码与包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽或者SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的或者图1、2或3的一或多个多肽片段具有20％-99.99％序列同源性或同一性的多肽，其中所述多肽具有与包括SEQID NO：2、4、6、8、10、12或14的多肽或者SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的或者图1、2或3的一或多个多肽片段相关的至少一种生物学活性；

c)与包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13的多核苷酸序列具有至少约20％-99.99％同一性的多核苷酸序列，或与其互补的多核苷酸；或

d)包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13或SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11或13的至少连续8个核苷酸的片段的多核苷酸序列，或与其互补的多核苷酸。

23、根据权利要求22的遗传构建体，其中所述构建体是载体。

24、包括根据权利要求22的遗传构建体或根据权利要求18、19、20或21中任一项的多核苷酸的宿主细胞。

25、包括根据权利要求22的遗传构建体或根据权利要求18、19、20或21中任一项的多核苷酸的转基因植物。

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