CN101693894B

CN101693894B - 禽流感病毒h5n1假病毒及其制备方法与专用dna片段

Info

Publication number: CN101693894B
Application number: CN2009102360053A
Authority: CN
Inventors: 邓宏魁; 袁克湖; 王宜; 汪芳迅; 尹晓磊; 时艳
Original assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Current assignee: Peking University Shenzhen Graduate School
Priority date: 2009-10-15
Filing date: 2009-10-15
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2029-10-15
Also published as: CN101693894A

Abstract

本发明公开了一种假病毒及其制备方法与专用DNA片段。本发明提供的DNA片段的核苷酸序列如序列表序列2所示。本发明提供的假病毒是如下方法1)或方法2)：1)权利要求1所述的DNA片段和逆转录慢病毒载体导入受体细胞，得到假病毒；2)权利要求1所述的DNA片段、禽流感病毒H5N1株囊膜蛋白NA基因和逆转录慢病毒载体导入受体细胞，得到假病毒。本发明的假病毒可以感染MDCK细胞。

Description

禽流感病毒H5N1假病毒及其制备方法与专用DNA片段

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及假病毒及其制备方法与专用DNA片段。

背景技术

禽流感病毒H5N1株导致最近亚洲家禽的流行性死亡，同时该病毒可以感染人，并有很高的致死率。为了研制能够抑制该病毒进入细胞的药物，我们将利用禽流感病毒H5N1株囊膜蛋白基因，建立假病毒筛选平台，这个平台可以用于筛选抑制禽流感病毒进入细胞的小分子药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一个DNA片段。

本发明提供的DNA片段的核苷酸序列如序列表序列2所示。

含有上述DNA片段的重组载体也属于本发明的保护范围之内。

上述重组载体是将上述的DNA片段插入pcDNA3.1的多克隆位点之间，得到的重组载体。

本发明的另一目的在于提供一种假病毒的制备方法。

本发明提供的假病毒的制备方法是如下方法1)或方法2)：

1)上述的DNA片段和逆转录慢病毒载体导入受体细胞，得到假病毒；

2)上述的DNA片段、禽流感病毒H5N1株囊膜蛋白NA基因和逆转录慢病毒载体导入受体细胞，得到假病毒。

上述逆转录慢病毒载体中可插入有报告基因；所述报告基因是分泌型胎盘磷酸酯酶基因、β-半乳糖苷酶基因、β-葡萄糖苷酸酶基因、萤火虫荧光素酶基因、海肾荧光素酶基因或绿色荧光蛋白基因；所述报告基因优选是萤火虫荧光素酶基因；所述逆转录病毒载体是pNL4-3.1uc.E-R-。

上述方法1)中，上述的DNA片段是通过上述的重组载体导入受体细胞的。

上述方法2)中，上述的DNA片段是通过上述的重组载体导入受体细胞的；禽流感病毒H5N1株囊膜蛋白NA基因是通过将禽流感病毒H5N1株囊膜蛋白NA基因插入pcDNA3.1的多克隆位点之间构成的重组载体导入受体细胞的。

上述受体细胞是真核生物的传代细胞；所述真核生物的细胞可以为HEK-293T细胞。

按照上述方法制备的假病毒也属于本发明的保护范围之内。

本发明的又一目的在于提供一种假病毒细胞模型，是将上述的假病毒感染哺乳动物细胞得到的重组细胞；所述哺乳动物细胞可为MDCK细胞。

本发明又一目的在于提供上述假病毒或假病毒细胞模型在禽流感药物筛选中的应用或者在禽流感病毒中和抗体研究中的应用。

上述禽流感药物为病毒膜蛋白抑制剂。

本发明又一目的在于提供上述假病毒或假病毒细胞模型在进行禽流感病毒中和抗体研究中的应用。

本发明对禽流感病毒H5N1株全长HA基因按照真核细胞高丰度密码子进行优化和全人工合成，并和NA基因的表达质粒以及带有报告基因表达质粒的HIV骨架质粒共感染293T细胞，包装出假病毒，包装出的假病毒可以感染MDCK细胞。假病毒感染模型的建立为寻找新的H5N1禽流感病毒的受体，研究该病毒的侵染机理，寻找抗病毒的药物，研究抗病毒的中和抗体和疫苗效果评价提供了新的简便的实验方法。

附图说明

图1为HA单独包装得到的假病毒的感染能力图，其中A是含优化后的HA基因的假病毒的感染能力结果；B是含未优化的HA基因的假病毒的感染能力结果

图2为HA和NA共包装得到的假病毒的感染能力图，其中A是含优化后的HA基因的假病毒的感染能力结果；B是优化后的HA和NA共包装得到的假病毒的感染能力结果。

图3为利用流感病毒药物(达菲)对假病毒体系进行检测，其中A是在包装病毒时加入20uM达菲后，同时病毒感染时加入不同量的达菲后的感染效果图；B是在包装病毒时不加入达菲，同时病毒感染时加入不同量的达菲后的感染效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1.假病毒的制备及其检测

一、假病毒的制备

1、含H5N1禽流感病毒的优化后的全长血凝素蛋白(HA)基因的重组载体的制备

1)获得优化后的HA编码基因

针对禽流感病毒H5N1株HA的氨基酸序列(如序列表序列1所示)，按照真核细胞高丰度密码子优化原则，推导出编码序列1所示氨基酸的核苷酸(其序列如序列2所示)，然后人工合成优化过的核苷酸。

人工合成一对引物，在引物上分别加上BamH I和EcoR I酶切位点，引物序列如下：

上游引物：5’-CGGATCCGCCACCAGCATGGAGAAGATCGTGCTG-3’；

下游引物：5’-CCGAATTCTTATCAGATGCAGATCCGGCACTGC-3’。

以上述合成的如序列2所示的核苷酸序列为模板，以上述的上、下游引物为引物，PCR扩增HA基因。将扩增得到的目的基因进行电泳分析，得到1700bp左右的条带，将该条带回收，连接T载体，测序发现扩增得到的条带具有序列表2所示的自5’端第1位-1707位的核苷酸序列。

2)含优化后的HA基因重组载体的制备

将扩增得到的条带通过BamH I和EcoRI双酶切，然后与经同样酶切过的pcDNA3.1载体(invitrogen)连接，得到重组载体，命名为pcDNA-HA-1。

2、含H5N1禽流感病毒的未优化的全长血凝素蛋白(HA)基因的重组载体的制备

根据Genbank号为DQ432045.1的自5’端第1-1707位所示的未优化的HA基因，人工合成一对如下的引物，在引物的两端分别加上Spe I和Sal I酶切位点：

上游引物：5’-TGTACTAGTCTCGAGGCCACCATGGAGAAAATAGTGCTTC-3’；

下游引物：5’-GAGTCGACTTAAATGCAAATTCTGC-3’。

人工合成DQ432045.1的自5’端第1-1707位所示的基因，以合成的基因为模板，用上述的一对引物进行PCR扩增，将扩增得到的目的基因进行电泳分析，得到1700bp的条带，将该条带回收，连接T载体，测序发现扩增得到的条带具有Genbank号为DQ432045.1的自5’端第1-1707位的核苷酸序列。

将扩增得到的条带通过Spe I和Sal I双酶切，然后与经同样酶切过的pcDNA3.1载体连接，得到重组载体，命名为pcDNA-HA-2。

3、含H5N1禽流感病毒的神经氨酸酶(NA)基因的重组载体的制备

根据Genbank号为J02177的自5’端第20-1381位所示的NA基因，人工合成一对如下的引物，在引物的5’端加上Nhe I和Xho I酶切位点：

上游引物：5’-TGTGCTAGCGCCACCATGAATCCAAACCAGA-3’；

下游引物：5’-GACTCGAGCTACTTGTCAATGGTG-3’。

人工合成J02177的自5’端第20-1381位所示的基因，以合成的基因为模板，以上述的一对引物为引物，进行PCR扩增，将扩增得到的目的基因进行电泳分析，得到1300bp的条带，将该条带回收，连接T载体，测序发现扩增得到的条带具有Genbank号为J02177的自5’端第20-1381位的核苷酸序列。

将扩增得到的条带通过Nhe I和Xho I双酶切，然后与经同样酶切过的pcDNA 3.1载体连接，得到重组载体，命名为pcDNA-NA。

4、包装出假病毒

将上述的重组载体转染进HEK-293T细胞(又称为293T细胞，购自ATCC)，实验分A、B和C三组，A组为含有优化HA基因的假病毒的包装；B为含有未优化HA基因的假病毒的包装；C组为含有HA和NA的假病毒的共包装。

其中：

A组实验的具体步骤如下：

1)转染前一天将293T细胞按4×106/10cm dish的密度传代。

2)准备两个1.5ml试管：

试管I的各成分如下：

pcDNA-HA-1 10ug

pNL4-3.1uc.E-R-(Aidsreagent CAT：3418) 10ug

50ul 2.5M CaCl2

(总体积500ul，用灭菌水补齐)。

试管II：取500ul的2×HBS，其中200ml的2×HBS的组分如下：

NaCl 3.2g

KCl 0.148g

HEPES 2g

Na2HPO4 0.054g。

3)共转染

将试管I中的500ul混合溶液逐滴加入试管II的HBS中，并于振荡器上轻轻点振荡混匀7次，室温静置，于1min内逐滴、均匀地加入准备好的293T细胞中。

4)6h-10h后换液，293T贴壁不牢，要十分小心。

5)转染48hr之后(从转染算起，不要少于40hr，不要超过72hr)，收集293T细胞的培养基，2700rpm离心10min去除细胞碎片。

6)分装上清，得到含有优化HA基因的假病毒，冻存于-80°冰箱中或直接使用。

B组实验：

B组与A组的区别在于试管I中的pcDNA-HA-1换成了pcDNA-HA-2，其余步骤完全相同，得到含有未优化HA基因的假病毒。

C组实验：

C组与A组的区别在于试管I中的成分如下所述，其余步骤完全相同，得到了含有NA和优化了的HA的假病毒：

试管I成分：

pcDNA-HA-1和pcDNA-NA各10ug

pNL4-3.1uc.E-R- 10ug

50ul 2.5M CaCl2

(总体积500ul，用灭菌水补齐)。

二、病毒感染能力检测

将上述步骤一的A、B和C三组包装的假病毒进行感染能力检测。

1、检测步骤如下：

1)欲感染病毒上清的靶细胞MDCK细胞(ATCC CCL-34)应在感染前一天低密度传至96孔板中(0.6至1)×10⁴/孔)。

2)感染时，将步骤一得到的三组病毒上清先均按下述三种情况处理：a、不稀释；b、1∶2稀释；c、1∶4稀释，稀释用的是灭菌水。

然后再分别与靶细胞培养基(DMEM+2％(体积百分比)血清)一般按1∶4(体积比)左右混合，加入Polybrene(购自sigma)，使其终浓度为8ug/ml，其中DMEM购自Invitrogen；

3)将混合好的病毒加至靶细胞中，100ul/孔。

4)感染6-8hr换液，去除假病毒。

5)48hr后取出被感染的靶细胞，倒去细胞上清。

6)每孔加入200ul PBS洗涤1-2次。

7)加入30ul/孔1×Lysis buffer，于水平摇床上剧烈摇15min。

8)吸出细胞裂解液加入测Luciferase专用板中，上机检测，底物为自动上样，每孔50ul。

2、检测结果

检测结果如图1(A为含有优化HA基因的假病毒的感染效果；B为含有未优化HA基因的假病毒的感染效果)所示，未进行密码子优化的假病毒不能包装出可以感染宿主细胞的的假病毒，优化后显示假病毒可以感染宿主细胞，但是单独转染优化过的HA基因的假病毒感染能力还是较低。

图2(A为含有优化HA基因的假病毒的感染效果，B为HA和NA共包装得到的假病毒的感染效果)显示：HA和NA共包装能极大地提高假病毒的感染能力，而单独用HA表达质粒包装假病毒的感染能力较低。导致病毒感染宿主细胞能力很低的原因可能在于病毒不能从包装细胞上脱落，而NA的表达可以帮助假病毒从包装细胞上脱落，从而提高病毒产生效率。

实施例2.本发明的假病毒在代替真病毒进行病毒膜蛋自抑制剂的筛选上的应用

达菲(购自Roche公司)是NA的抑制剂，为了证明实施例1中C组得到的共包装过的假病毒是否能代替真病毒在病毒膜蛋白抑制剂的筛选上进行应用，本实施例分别在病毒的包装时加入达菲或不加入达菲，在感染时加入或不加入达菲。

在包装和感染都加入达菲的实验步骤如下：在实施例1的步骤一的C组假病毒包装实验中，待C组中的试管I中的溶液缓慢加入到试管II后，再往试管II加入不同量的达菲，使其在试管II中的终浓度为20μM，其余病毒包装的步骤与C组包装步骤相同；在实施例1的步骤二的C组假病毒感染实验中，在病毒上清(不稀释)与靶细胞培养基1∶4混合后，加入不同量的达菲，使其在靶细胞培养基中的终浓度为20μM、2μM、200nM、20nM、2nM和0nM(0nM即不加入达菲)，其余病毒感染步骤与C组感染步骤相同。

只在感染时加入达菲的实验步骤如下：在实施例1的步骤二的C组假病毒感染实验中，在病毒上清(不稀释)与靶细胞培养基1∶4混合后，加入不同量的达菲，使其在靶细胞培养基中的终浓度为20μM、2μM、200nM、20nM、2nM和0nM(0nM即不加入达菲)，其余病毒感染步骤与C组感染步骤相同。

结果如图3(A为包装和感染时都加入达菲；B为只在感染时加入达菲)所示，在包装时加入达菲时，病毒抑制能达到80％(B组的平均相对荧光值是612，A组平均相对荧光值是105)，其中抑制率＝(B组相对荧光值-A组相对荧光值)/B组相对荧光值。在感染时加入不同浓度的达菲，对假病毒感染能力没有影响。这结果说明NA可能只在包装时有作用，对病毒感染作用不大。同时也说明，该假病毒模型可以代替真病毒用于药物筛选。

序列表

<110>北京大学深圳研究生院

<120>假病毒及其制备方法与专用DNA片段

<130>CGGNARL92591

<160>2

<210>1

<211>568

<212>PRT

<213>禽流感病毒(Influenza A virus)

<400>1

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser

130 135 140

Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe

145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

225 230 235 240

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

340 345 350

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr

355 360 365

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys

370 375 380

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser

385 390 395 400

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe

405 410 415

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp

420 425 430

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met

435 440 445

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu

450 455 460

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly

465 470 475 480

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu

485 490 495

Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala

500 505 510

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly

515 520 525

Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala

530 535 540

Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly

545 550 555 560

Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

<210>2

<211>1707

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>2

atggagaaga tcgtgctgct gttcgccatc gtgagcctgg tgaagagcga ccagatctgc 60

atcggctacc acgccaacaa cagcaccgag caggtggaca ccatcatgga gaagaacgtg 120

accgtgaccc acgcccagga catcctggag aagacccaca acggcaagct gtgcgacctg 180

gacggcgtga agcccctgat cctgcgggac tgcagcgtgg ccggctggct gctgggcaac 240

cccatgtgcg acgagttcat caacgtgccc gagtggagct acatcgtgga gaaggccaac 300

cccgtgaacg acctgtgcta ccccggcgac ttcaacgact acgaggagct gaagcacctg 360

ctgagccgga tcaaccactt cgagaagatc cagatcatcc ccaagagcag ctggagcagc 420

cacgaggcca gcctgggcgt gagctccgcc tgcccctacc agggcaagag cagcttcttc 480

cggaacgtgg tgtggctgat caagaagaac agcacctacc ccaccatcaa gcggagctac 540

aacaacacca accaggagga cctgctggtg ctgtggggca tccaccaccc caacgacgcc 600

gccgagcaga ccaagctgta ccagaacccc accacctaca tcagcgtggg caccagcacc 660

ctgaaccagc ggctggtgcc ccggatcgcc acccggagca aggtgaacgg ccagagcggc 720

cggatggagt tcttctggac catcctgaag cccaacgacg ccatcaactt cgagagcaac 780

ggcaacttca tcgcccccga gtacgcctac aagatcgtga agaagggcga cagcaccatc 840

atgaagagcg agctggagta cggcaactgc aacaccaagt gccagacccc catgggcgcc 900

atcaacagca gcatgccctt ccacaacatc caccccctga ccatcggcga gtgccccaag 960

tacgtgaaga gcaaccggct ggtgctggcc accggcctgc ggaacagccc ccagcgggag 1020

cggcggcgga agaagcgggg cctgttcggc gccatcgccg gcttcatcga gggcggctgg 1080

cagggcatgg tggacggctg gtacggctac caccacagca acgagcaggg cagcggctac 1140

gccgccgaca aggagagcac ccagaaggcc atcgacggcg tgaccaacaa ggtgaacagc 1200

atcatcgaca agatgaacac ccagttcgag gccgtgggcc gggagttcaa caacctcgag 1260

cggcggatcg agaacctgaa caagaagatg gaggacggct tcctggacgt gtggacctac 1320

aacgccgagc tgctggtgct gatggagaac gagcggaccc tggacttcca cgacagcaac 1380

gtgaagaacc tgtacgacaa ggtgcggctg cagctgcggg acaacgccaa ggagctgggc 1440

aacggctgct tcgagttcta ccacaagtgc gacaacgagt gcatggagag cgtgcggaac 1500

ggcacctacg actaccccca gtacagcgag gaggcccggc tgaagcggga ggagatcagc 1560

ggcgtgaagc tggagagcat cggcatctac cagatcctga gcatctacag caccgtggcc 1620

agcagcctgg ccctggccat catggtggcc ggcctgagcc tgtggatgtg cagcaacggc 1680

agcctgcagt gccggatctg catctga 1707

Claims

1.一个DNA片段，其核苷酸序列如序列表序列2所示。

2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将权利要求1所述的DNA片段插入pcDNA3.1的多克隆位点之间，得到的重组载体。

4.一种假病毒的制备方法，是如下方法1)或方法2)：

1)权利要求1所述的DNA片段和逆转录慢病毒载体导入受体细胞，得到假病毒；

2)权利要求1所述的DNA片段、禽流感病毒H5N1株囊膜蛋白NA基因和逆转录慢病毒载体导入受体细胞，得到假病毒。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述逆转录慢病毒载体中插入有报告基因；所述报告基因是分泌型胎盘磷酸酯酶基因、β-半乳糖苷酶基因、β-葡萄糖苷酸酶基因、萤火虫荧光素酶基因、海肾荧光素酶基因或绿色荧光蛋白基因；所述逆转录病毒载体是pNL4-3.luc.E-R-。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述方法1)中，权利要求1所述的DNA片段是通过权利要求2或3所述的重组载体导入受体细胞的；所述方法2)中，权利要求1所述的DNA片段是通过权利要求2或3所述的重组载体导入受体细胞的，禽流感病毒H5N1株囊膜蛋白NA基因是通过将禽流感病毒H5N1株囊膜蛋白NA基因插入pcDNA3.1的多克隆位点之间构成的重组载体导入受体细胞的。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述受体细胞是真核生物的细胞；所述真核生物的细胞为HEK-293T细胞。

8.权利要求4-7任一所述的方法制备的假病毒。

9.一种假病毒细胞模型，是将权利要求8所述的假病毒感染哺乳动物细胞得到的重组细胞；所述哺乳动物细胞为MDCK细胞。

10.权利要求8所述的假病毒或权利要求9所述的假病毒细胞模型在进行禽流感病毒中和抗体研究中的应用或者在禽流感药物筛选中的应用；所述禽流感药物为病毒膜蛋白抑制剂。