CN105939599A - 使用柑橘衰退病毒载体进行外源基因表达 - Google Patents
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Abstract
本发明揭示了基于对柑橘衰退病毒的修改、为有益目的用于转染柑橘树的病毒载体。本发明揭示了包括含有一个或多个编码异源性多肽的基因盒的病毒载体。所述基因盒位于病毒基因组上的理想位点，使得增加表达量的同时保存病毒的功能性。本发明同时揭示了用病毒载体转染植物的方法以及被病毒转染的植物的实施例。
Description
相关申请的交叉参考
本申请根据美国法典第35篇第119条(35 USC 119)要求2011年9月21日提交的美国专利申请第61/537,154号的优先权，并通过引用将其纳入本文中。
背景技术
病毒载体的早期开发目的是廉价生产该领域可等比扩大的专门蛋白。最初使用的是一种植物病毒载体，即一种双链DNA病毒花椰菜花叶病毒(Brisson et al.,1984；Gronenborn et al.,1981)。然而，这种病毒稳定性过低，因而无法使用(Fütterer et al.,1990)。反向遗传学系统的发展使得RNA病毒也能够被利用，载体的开发有了更多选择(Ahlquist et al.,1984)。
病毒载体是基础研究的重要元素，有巨大的商业应用潜力。但外源插入物质稳定性不高是病毒载体用于应用领域蛋白表达商业化的一个主要缺点。
发明内容
本申请是基于多项探索利用CTV载体表达806到3480个核苷酸外源基因的局限性研究。在一个实施例中，基因盒被引入CTV基因组中以替换p13基因。在其他实施例中，基因被插入在不同位点(例如，p13-p20、p20-p23和p23-3’NTR(非转录区))。在另一个实施例中，检测了p23融合与蛋白酶加工的作用。在可替代的实施例中，基因被插入在IRES序列后来创建双顺反子信息。
27个表达载体被创造并在本生烟原生质体和植物中进行检测。值得注意的是，这里介绍的多数新开发出的载体结构在植物中复制、系统地播散，产生外源基因。检测到的表达量最大的载体包括p13-p20或p23-3’NTR的“添加基因”结构。类似地，插入基因取代p13基因的载体有效地表达了不同的报告基因。然而，报告基因的最优表达取决于插入基因的大小和部位。表达最优的小基因为靠近3’端处的基因，而表达最优的大基因来自多个内部位点。
在本生烟和柑橘上都实现了相同载体上两种基因的同时有效表达。本文介绍的新CTV载体的基因组有独特的弹性结构，能够通过多种方法容纳并表达外源基因。
对一种有效的载体进行基因工程处理需要平衡不同因素。载体需要精心设计，让植物中的复制和系统转移最小化，同时外源蛋白的表达最大化(Shivprasad et al.,1999)。最后一个因素是载体的稳定性。简言之，载体的有用性直接与其稳定性相关。稳定性是载体减少重组、提高竞争力的结果，所产生的重组体丢失部分或全部插入序列。
附图说明
图1.在p13位点GFP替换产生基于CTV的表达载体。(A)CTV9RΔp33图示(方框代表开放阅读框，蓝色框代表复制基因块，红色框代表线性病毒保守基因块(Karasev,2000)；黑色圈和黑色框代表沉默抑制子(Luet al.,2004)；金色框代表可能有某些柑橘病毒基因型感染的基因(Tatineni et al.,2008)；实心黑框代表删除p33控制子元件和ORF(nts10858-11660基因库登记号AY170468)(Satyanarayana et al.,1999；2000；2003))。箭头指向CTV前导蛋白酶的加工，LP1与LP2是两个串联的前导蛋白酶，MT(甲基转移酶)、Hel(Helicase)、RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶，Δp33(33kda蛋白序列删除)、p6(6kda蛋白)、Hsp70h(热休克蛋白70同源体)、p61(61kda蛋白)、CPm(次要衣壳蛋白)、CP(主要衣壳蛋白、细胞内沉默抑制子)、p18(18kda蛋白)、p13(13kda蛋白)、p20(20kda蛋白、细胞内/细胞间沉默抑制子)、p23(23kda蛋白，细胞内沉默抑制子)，分别通过BYSV的CP-CE、GLRaV-2与BYV驱动GFP的修饰产生表达载体CTV33-Δ13-BY-GFP-57(C57)、CTV33-Δ13-G-GFP-65(C65)与CTV33-Δ13-B-GFP-66(C66)。(B)转染了野生型CTV(WT)和基于CTV的表达载体转录物(T)及其传代载体(P)的本生烟原生质体诺瑟杂交(Northern blot)分析。(C)荧光立体显微镜下三种载体CTV33-Δ13-BY-GFP-57、CTV33-Δ13-G-GFP-65、CTV33-Δ13-B-GFP-66转染的本生烟原生质体典型放大图像。(D)用CTV33-Δ13-G-GFP-65与CTV33-Δ13-B-GFP-66感染的柑橘树皮韧皮部荧光立体显微镜低倍镜(左)与高倍镜(右)图像。
图2.p13的GUS替换产生基于CTV的表达载体。(A)CTV9RΔp33及其修饰产生的表达载体CTV33-Δ13-BY-GUS-61图示，后者中p13及其控制子元件在BYSV的CP-CE控制下被GUS取代。(B)感染了野生型CTV(WT)和基于CTV的表达载体CTV33-Δ13-BY-GUS-61(C61)(T)及其传代载体(P)的本生烟原生质体诺瑟杂交(Northern blot)分析。(C)CTV33-Δ13-BY-GUS-61感染的柑橘树皮(右)与树皮块固定前GUS溶液(左)中GUS活性的典型示例(A＝健康对照，B＝感染)。
图3.在p13与p20之间插入GFP产生基于CTV的表达载体。(A)CTV9RΔp33及在BYSV控制下于p13与p20之间插入GFPORF修饰产生的表达载体CTV33-13-BY-GFP-69图示。(B)感染了野生型病毒(WT)和表达载体CTV33-13-BY-GFP-69(C69)转录物(T)及其传代载体(P)的原生质体诺瑟杂交(Northern blot)分析。感染了CTV33-13-BY-GFP-69的本生烟(C)与阿蕾檬韧皮部标本(D)的荧光立体显微镜示例图片。
图4.在p20与p23之间插入GFP产生基于CTV的表达载体。(A)CTV9RΔp33及其修饰产生的表达载体CTV33-20-B-GFP-49与CTV33-20-BY-GFP-58图示。(B)感染了野生型病毒(WT)与表达载体CTV33-20-B-GFP-49(C49)和CTV33-20-BY-GFP-58(C58)转录物(T)及其传代载体(P)的原生质体诺瑟杂交(Northern blot)分析。(C)UV光下原生质体(右)与树叶(左)荧光图像提示载体有效移动不足。(D)在CTV基因组不同位点插入相同基因的Westernblots免疫印迹分析。BCN5(Folimonov et al.,2007)原始CTV载体(BYV启动子之后在CPm与CP之间有GFP)、构建的载体CTV33-23-BY-GFP-37(C37，在p20与p23之间插入BYSV驱动的GFP)、CTV33-20-BY-GFP-58(C58，在p20与p23之间插入BYSV驱动的GFP)、CTV33-13-BY-GFP-69(C69，在p13与p20之间插入BYSV驱动的GFP)、CTV33-Δ13-BY-GFP-57(在p13用BYSVCP-CE驱动的GFP取代)和CTV33-27-BY-GFP-63(C63，在CPm与CP之间插入BYSV CP-CE驱动的GFPORF)示意图。
图5.在p23与3’NTR之间插入GFP产生基于CTV的表达载体。(A)CTV9RΔp33与在BYSV、GLRaV-2和BYV CP-CE控制下于p23之后插入GFP修饰产生的表达载体CTV33-23-BY-GFP-37(C37)、CTV33-23-G-GFP-40(C40)和CTV33-23-B-GFP-42(C42)示意图。(B)野生型病毒(WT)和表达载体CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40与CTV33-23-B-GFP-42转录物(T)及其传代载体(P)转染的原生质体诺瑟杂交(Northern blot)分析。(C)感染了三种构建的载体CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40与CTV33-23-B-GFP-42的本生烟荧光立体显微镜放大图示例。(D)感染了CTV33-23-BY-GFP-37与CTV33-23-G-GFP-40的阿蕾檬韧皮部组织荧光图像示例。
图6.在p23与3’NTR之间插入GUS产生基于CTV的表达载体。(A)CTV9RΔp33与在BYSV CP-CE控制下于p23与3’NTR之间插入GUS产生的表达载体CTV33-23-BY-GUS-60(C60)示意图。(B)野生型病毒(WT)与表达载体CTV33-23-BY-GUS-60转录物(T)转染的原生质体诺瑟杂交(Northern blot)分析。(C)本生烟组织和柑橘韧皮部GUS蛋白的酶活性(蓝色表示感染的植物，无色组织和溶液代表健康对照和经相同处理的GUS溶液。
图7.IRES序列后插入GFP产生基于CTV的表达载体。(A)CTV9RΔp33与CTVΔCla333R及p23后的修饰产生的表达载体CTV33-23-ITEV-GFP-41、具有TEV5’NTR IRES和3xARC-1IRES的CTV33-23-I3XARC-GFP-43，以及CTVp333R-23-ITEV-GFP、分别具有TEV5’NTRIRES与3xARC-1IRES的CTVp333R-23-I3XARC-GFP示意图。(B)野生型病毒(WT)、CTV33-23-ITEV-GFP-41(C41)与CTV33-23-I3XARC-GFP-43(C43)转染的本生烟原生质体诺瑟杂交(Northern blot)分析；T＝转录物转染的原生质体分离到的RNA，P＝从RNA转染的原生质体中分离出的病毒体转染的原生质体，从后者分离出的RNA。2-CTVp333R-23-ITEV-GFP(A列)、CTVp333R-23-I3XARC-GFP(B列)、CTVp333R(C列)和CTVp333R-23-B-GFP(在p23之后插入BYVCP-CE驱动表达的GFP)(D列)转染的原生质体诺瑟杂交(Northern blot)分析。
图8.GFP与蛋白酶在p23融合产生基于CTV的表达载体。(A)CTV9RΔp33与融合两种TEV蛋白酶(NIa与HC-Pro)及其识别序列产生表达载体CTV33-23-HC-GFP-72、CTV33-23-NIa-GFP-73、CTV33-23-HC-GFP-74和CTV33-23-NIa-GFP-75的示意图。
图9.本生烟荧光对比图。(A)携带构建的载体CTV33-23-HC-GFP-72、CTV33-23-NIa-GFP-73、CTV33-23-HC-GFP-74与CTV33-23-NIa-GFP-75(有GFP融合)和CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40与CTV33-23-B-GFP-42(游离GFP)树叶在手持UV灯(右图)和白光(左图)下的荧光对比图。(B)携带构建的载体CTV33-23-HC-GFP-72与CTV33-23-NIa-GFP-73(有GFP融合)和CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40与CTV33-23-B-GFP-42(p23后有自身控制子元件控制的GFP(游离GFP))的本生烟整株植物在手持UV灯(右图)和白光(左图)下的荧光对比图。(C)携带构建载体CTV33-23-HC-GFP-72与CTV33-23-NIa-GFP-73的相同树叶背面(下面)和正面(上面)在手持UV灯(右图)和白光(左图)下的对比图。
图10.对浸润本生烟叶片的不同的表达载体使用GFP抗体进行Western blot免疫印迹分析。A＝CTV9RΔp33GFP(在CPm和CP之间插入受BYV CP-CE控制子元件控制的GFP(产生游离GFP)(Tatineni et al.,2008))，B＝CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51，C＝CTV33-23-G-GFP-NIa-GUS-54，D＝空白，E＝CTV33-Δ13-BY-GFP-NIa-GUS-78，F＝CTV33-23-HC-GFP-72，G＝CTV33-23-NIa-GFP-73。
图11.杂交基因(GFP/蛋白酶/GUS融合)替换p13产生表达载体。(A)CTV9RΔp33及对其进行修饰产生的表达载体CTV33-Δ13-BYGFP-HC-GUS-77与CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78的示意图，后两者各携带一个受BYSV CP-CE控制的融合基因，即分别携带TEV HC-Pro与NIa，两旁为GFP与GUS。(B)本生烟与阿蕾檬中报告基因的活性。(a.)感染CTV33-Δ13-BYGFP-HC-GUS-77或CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78的本生烟植物标本在白光和(b.)在紫外光下的图片。(c.)感染了CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78的本生烟上剥离下的韧皮部的荧光立体显微镜图。(d.)本生烟叶中GUS活性标本的对比图，对照叶(左图)和感染叶(右图)。(e.)健康的阿雷檬剥离下的韧皮部与浸泡于GUS溶液的韧皮部对比图。(f.)感染了CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78的阿雷檬剥离下的韧皮部图。
图12.本生烟中构建载体的稳定性。(A)携带二元载体CTV33-Δ13-BYGFP-HC-GUS-77(GFP/HC-Pro/GUS)土壤接种本生烟叶正面的荧光显微镜图。(B)对相同叶片进行GUS活性检测提示两个报告基因几乎完全重叠。
图13.在p23与3’NTR之间插入杂交基因(GFP/蛋白酶/GUS融合)构建表达载体。(A)CTV9RΔp33、分别插入受BYSV CP-CE控制的含HC-Pro和NIa蛋白酶杂交基因的表达载体CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51与CTV33-23-BY-GFP-NIa-GUS-52、分别插入受GLRaV-2驱动的含HC-Pro和NIa蛋白酶融合基因的表达载体CTV33-23-G-GFP-HC-GUS-53(C53)与CTV33-23-G-GFP-NIa-GUS-54(C54)、分别插入受BYV驱动的含HC-Pro和NIa蛋白酶融合基因的表达载体CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-55(C55)与CTV33-23-BY-GFP-NIa-GUS-56(C56)的示意图。(B)用野生型病毒(WT)、C53、C54、C55和C56构建载体转染的原生质体诺瑟杂交(Northernblot)分析。
图14.在p23之后插入杂交基因(GFP/蛋白酶/GUS)产生的报告基因的活性。(A)(a.)感染了CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51、CTV33-23-G-GFP-HC-GUS-53、CTV33-23-BY-GFP-NIa-GUS-52或CTV33-23-G-GFP-NIa-GUS-54的本生烟样本在白光和(b.)手持紫外光下的样本图。(c.)感染后本生烟叶与对照叶的GUS活性对比图(1、2号管分别为固定前和固定液中的健康叶组织，3、4号管分别为溶液和感染叶组织，G管为GUS分析缓冲液。(B.)阿雷檬中报告基因的活性：(a.)感染了CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51的阿雷檬剥离下的韧皮部荧光立体显微镜图。(b.)感染和健康的阿雷檬剥离下的韧皮部GUS活性(1、2号管分别为溶液和固定液中的健康叶组织，3、4号管分别为溶液和感染叶组织)。
图15.双分子荧光互补(BiFC)法验证理论。(A)CTVΔCla333R(Gowda et al.,2001,Satyanarayana et al.,2003)复制子及其修饰产生的表达复制子的示意图：(a.)在p23与3’NTR之间插入两个BiFC基因产生CTVp333R-23-BYbJunN-GbFosC，在p23之后插入一个基因的对照载体CTVp333R-23-BYbJunN(b.)或CTVp333R-23-GbFosC(c.)。(B)用CTVp333R-23-BYbJunN-GbFosC(a.道)、CTVp333R-23-BYbJunN(c.道)和CTVp333R-23-GbFosC(b.道)转染原生质体的诺瑟杂交(Northern blot)分析。(C)立体显微镜(上图)和激光扫描共聚焦显微镜(下图)下转染原生质体的荧光图提示荧光来自细胞核。
图16.在p13用BiFC基因替换产生基于CTV的表达载体。(A)CTV9RΔp33及其修饰产生的载体CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76和对照载体CTV33-23-G-bFosC-98与CTV33-23-BY-bJunN-97(在p23之后nts19020-19021插入)的示意图。(B)感染后本生烟的荧光图示例。
图17.构建基于CTV的表达载体同时表达来自两个控制子元件的两个基因。(A)CTV9RΔp33及其修饰产生的表达载体CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59与CTV33-Δ13-BYbJunN-23-GbFosC-67的示意图。(B)用野生型病毒(WT，T)、两个克隆的CTV33-Δ13-BYbJunN-23-GbFosC-67(C67，T1与T2)，用3’NTR+p23作为探针行RNA转染的原生质体诺瑟杂交(Northern blot)分析(Satyanarayana et al.,1999)。(C)本生烟组织的荧光立体显微镜图(CTV33-23-BY-bJunN-Gb-FosC-59＝a.,b.,c.和d；CTV33-Δ13-BYbJunN-23-GbFosC-67＝e.)(a.)芽(b.)花冠(c.)叶(d.)剥离下的韧皮部(e.)浸润的叶片。
图18.基于CTV的表达载体，同时表达来由两个控制子元件控制的两个基因。(A)CTV9RΔp33及其修饰产生的表达载体CTV33-Δ13-BYGUS-23-GGFP-71的示意图。(B)用野生型病毒(WT)与CTV33-Δ13-BYGUS-23-GGFP-71(C71)表达载体RNA以3’NTR+p23作为探针转染原生质体的诺瑟杂交(Northern blot)分析(Satyanarayana et al.,1999)。(C)在白光(a.)和手持UV光(b.)下观察到的本生烟与阿雷檬植物中报告基因的生物学活性。(c.)健康本生烟(1号管(分析溶液)和2号管(组织))与感染本生烟(3号管(分析溶液)和4号管(组织))中的GUS活性。(d.)剥离韧皮部的荧光显微镜图。(e.)阿雷檬中的GUS分析活性，与(c.)相似。
图19.阿雷檬中不同载体的Western blots免疫印迹分析，以评估GFP和GUS的表达。(A)测定感染了Δp33CTV9R的708号阿雷檬(Tatineni et al.,2008)、感染了BCN5的1808号阿雷檬(Folimonov et al.,2007))、感染了CTV33-23-G-GFP-40的1916号阿雷檬、感染了CTV33-23-BY-GFP-37的1874号阿雷檬、感染了CTV33-13-BY-GFP-69的1934、1935、1937号阿雷檬、感染了CTV33-Δ13-G-GFP-65的1931号阿雷檬与感染了CTV33-Δ13-B-GFP-66的1939号阿雷檬中的GFP与CP抗体，以评估GFP相对于CP的表达水平。(B)测定感染了CTV33-Δ13-BYGUS-61的2084、2085、2086、2087号阿雷檬、感染了CTV33-23-BYGUS-60的2132号阿雷檬、感染了表达载体CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78的2096号阿雷檬中的GUS与CP抗体，以评估GUS相对于CP的表达水平。其中，E＝空管，缓冲液＝–iveC。
图20.构建基于CTV的表达载体，同时表达四个控制子元件控制的四个基因。(A)CTV9R示意图。(B)对CTV9R进行修饰构建表达载体CTVΔ13-BRFP-GbFosC-BYbJunN-CTMVCP-118，该载体表达了CTV基因组内不同位点的4个基因。第1个基因为次要衣壳蛋白和主要衣壳蛋白之间的红色荧光蛋白基因(tagRFP)，受甜菜黄化病毒(BYV)衣壳蛋白控制子元件(CP-CE)的控制，第2个和第3个基因分别替换了p13基因，分别为截短的哺乳动物转录因子bFos与bJun和EYFP的C、N末端融合(Hu et al.,2002)而成，受葡萄卷叶相关病毒-2(GLRaV-2)和甜菜黄矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第4个基因为p23后的TMVCP，受CTV双重主要CP-CE的控制。
图21.构建基于CTV的表达载体，同时表达三个控制子元件控制的三个基因。(A)CTV9R示意图。(B)对CTV9R进行修饰构建表达载体CTVΔ13-GbFosC-BYbJunN-CTMVCP-129，该载体表达了CTV基因组内不同位点的3个基因。第1、2个基因分别替换了p13基因，分别为截短的哺乳动物转录因子bFos与bJun和EYFP的C、N末端融合(Hu et al.,2002)而成，受葡萄卷叶相关病毒-2(GLRaV-2)和甜菜黄矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第4个基因为p23后的TMVCP，受CTV双重主要CP-CE的控制。
图22.构建基于CTV的表达载体，同时表达三个控制子元件控制的三个基因。(A)CTV9R示意图。(B)对CTV9R进行修饰构建表达载体CTV-BRFP-BYGFP-CTMVCP-117，该载体表达了CTV基因组内不同位点的3个基因。第1个基因为在次要和主要衣壳蛋白之间的红色荧光蛋白基因，受甜菜黄化病毒(BYV)衣壳蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2个基因为p13-p20基因之间插入的绿色荧光蛋白(GFPC3)，受到甜菜黄矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第3个基因为p23之后的TMVCP，受CTV双重主要CP-CE控制。
图23.构建基于CTV的表达载体，同时表达三个控制子元件控制的三个基因。(A)CTV9R示意图。(B)对CTV9R进行修饰构建表达载体CTV-BASL-BYPTA-CP7-119，该载体表达了CTV基因组内不同位点的3个基因。第1个基因是从大蒜(ASL)中提取的凝集素，位点在次要和主要衣壳蛋白之间，受甜菜黄化病毒(BYV)衣壳蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2个基因是从半夏(PTA)中提取的凝集素，位点在p13-p20基因之间，受甜菜黄矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第3个基因为中国鲎(P7)中提取的抗微生物肽，位点在p23之后，受CTV双重主要CP-CE控制。
图24.构建基于CTV的表达载体，同时表达三个控制子元件控制的三个基因。(A)CTV9R示意图。(B)对CTV9R进行修饰构建表达载体CTV-BASL-BYPTA-CP7-119，该载体表达了CTV基因组内不同位点的3个基因。第1个基因是从大蒜(ASL)中提取的凝集素，位点在次要和主要衣壳蛋白之间，受甜菜黄化病毒(BYV)衣壳蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2个基因是从半夏(PTA)中提取的凝集素，位点在p13-p20基因之间，受甜菜黄矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第3个基因为中国鲎(P7)中提取的抗微生物肽，位点在p23之后，受CTV双重主要CP-CE控制。
图25.构建基于CTV的表达载体，同时表达三个控制子元件控制的三个基因。(A)CTV9R示意图。(B)对CTV9R进行修饰构建表达载体CTV-BASL-BYP10-CP7-131，该载体表达了CTV基因组内不同位点的3个基因。第1个基因是从大蒜(ASL)中提取的凝集素，位点在次要和主要衣壳蛋白之间，受甜菜黄化病毒(BYV)衣壳蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2个基因是从野猪(P10)中提取的微生物肽，位点在p13-p20基因之间，受甜菜黄矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第3个基因为中国鲎(P7)中提取的抗微生物肽，位点在p23之后，受CTV双重主要CP-CE控制。
图26.构建基于CTV的表达载体，同时表达三个控制子元件控制的三个基因。(A)CTV9RΔp33示意图。(B)对CTV9RΔp33进行修饰构建表达载体CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79，该载体表达了CTV基因组内不同位点的3个基因。第1个基因为在次要和主要衣壳蛋白之间的绿色荧光蛋白基因，受甜菜黄化病毒(BYV)衣壳蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2个基因为p13-p20基因之间插入的来自大肠杆菌的-葡糖醛酸酶(GUS)基因，受甜菜黄矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第3个基因为p23之后的TMVCP，受葡萄卷叶相关病毒-2(GLRaV-2)CP-CE的控制。
图27.构建基于CTV的表达载体，同时表达四个控制子元件控制的四个基因。(A)CTV9RΔp33示意图。(B)对CTV9RΔp33进行修饰构建表达载体CTV33-BGFP-GbFosC-BYbJunN-81，该载体表达了CTV基因组内不同位点的3个基因。第1个基因为在次要和主要衣壳蛋白之间的绿色荧光蛋白基因，受甜菜黄化病毒(BYV)衣壳蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2、3个基因分别为截短的哺乳动物转录因子bFos与bJun和EYFP的C、N末端融合(Hu etal.,2002)而成，受葡萄卷叶相关病毒-2(GLRaV-2)和甜菜黄矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。在p23基因之后插入bFosC基因。
图28.构建基于CTV的表达载体，同时表达四个控制子元件控制的四个基因。(A)CTV9RΔp33示意图。(B)对CTV9RΔp33进行修饰构建表达载体CTV33-Δ13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82，该载体表达了CTV基因组内不同位点的3个基因。第1个基因为在次要和主要衣壳蛋白之间的绿色荧光蛋白基因(GFPC3)，受甜菜黄化病毒(BYV)衣壳蛋白控制子元件(CP-CE)的控制。第2个基因替换了CTV p13基因，为截短的哺乳动物转录因子bFos与EYFP的N末端融合(bJunN)(Hu et al.,2002)而成，受甜菜黄矮病毒(BYSV)CP-CE的控制。第3个基因在p23之后，为截短的哺乳动物转录因子bFos与EYFP的C末端融合(bJunC)而成，受葡萄卷叶相关病毒-2(GLRaV-2)CP-CE的控制。
图29.浸润本生烟叶尖的无染色电镜照片。(A)携带CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79载体的浸润本生烟叶尖形成CTV载体病毒体和TMV假病毒体，提示TMV衣壳蛋白基因的表达。(B)携带CTV33-Δ13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82载体的浸润本生烟叶尖形成病毒体。
发明详述
病毒载体的早期开发目的是廉价生产该领域可等比扩大的专门蛋白。最初使用的是一种植物病毒载体，即一种双链DNA病毒花椰菜花叶病毒(Brisson et al.,1984；Gronenborn et al.,1981)。然而，这种病毒稳定性过低，因而无法使用(Fütterer et al.,1990)。反向遗传学系统的发展使得RNA病毒也能够被利用，载体的开发有了更多选择(Ahlquist et al.,1984)。关于以RNA病毒作为载体，目前存在很大争议(Siegel,1983,1985；Van Vluten-Dotting,1983Van Vluten-Dotting et al.,1985)。有人认为缺乏RENA病毒复制酶缺乏校正机制，将导致过快的序列飘逸，在复制期间难以维持外源序列。然而，RNA病毒载体的后续开发与应用证明了该担忧并无必要。
人们一直在致力于建立基于柑橘衰退病毒(CTV)的柑橘树病毒载体。CTV是已知的植物病毒中RNA最大的病毒，约为20kb(Karasev et al.,1995；Pappu et al.,1994)。CTV有两个保守基因块，与复制和病毒体的形成有关(Karasev,2000)。复制基因块位于基因组的5’端，通过多蛋白策略从基因组RNA表达而来，有a+1核糖体读框移位，偶有RNA依赖性RNA聚合酶的表达(Karasev et al.,1995)。CTV的丝状病毒体由两种衣壳蛋白包被，主要衣壳蛋白(CP)包被大约97％的病毒体，次要衣壳蛋白(CPm)包被了5’约700nts病毒体(Satyanarayana et al.,2004)。病毒体的形成是一个复杂的过程，除衣壳蛋白之外，还需两种蛋白参与(Hsp70h与p61)(Satyanarayana et al.,2000,2004；Tatineni et al.,2010)。这4个基因及6个残留基因分别通过3’-共末端亚基因组(sg)RNA的集合套表达(Hilfet al.,1995)。在每个ORF上游有一个控制子元件(CE)，决定了转录水平(Gowda et al.,2001))。转录水平也与+1转录起始位点(Ayllón et al.,2003)、ORF上游是否有非转录区(Gowda et al.,2001)和ORF对3’端的封闭性(Satyanarayana et al.,1999)相关。
第一代CTV载体的研究过程考虑了CP基因融合、插入其他基因、替换p13ORF这三种方法(Folimonov et al.,2007)。p13ORF的替换和衣壳蛋白ORF的融合并不能构建有效的载体，但插入其他基因可产生多种载体，能够表达相对较多的外源基因，在柑橘树中可稳定数年。然而，最初设计基于CTV的载体时在这一大体积病毒中仅研究了少数外源基因的表达。在此过程中，发明人尝试探究了CTV成为载体的局限性，即该病毒基因组的不同位点是否可以插入其他基因，对于不同大小的插入基因，应如何得到最大化的表达量等。发明人也探究了与不同病毒基因进行融合的各种方法是否可行，是否可以同时表达多个外源基因。令人惊喜的是，本文介绍的CTV载体可在基因组内不同位点接受处理，产生切实可行的多种不同的载体构建方法。
一旦柑橘感染了含外源基因的CTV载体，可通过移植方便地将载体转移到其他柑橘树。但CTV载体系统的缺点在于很难让最初的柑橘树感染上新构建的载体。通过土壤接种、基因枪轰击或用RNA转录体的机械培育从cDNA直接培养柑橘及其困难，而且结果不可预测(Gowda et al.,2005；Satyanarayana et al.,2001)。另一个方法是用从本生烟原生质体纯化得到的病毒体培育(Folimonov et al.,2007；Robertson et al.,2005；Satyanarayana et al.,2001；Tatineni et al.,2008)。然而，只有约0.01-0.1％的原生质体能够感染上体外转录的RNA(Satyanarayana et al.,2001)。但因为病毒体对原生质体的传染性大于RNA(Navas-Castillo et al.,1997)，发明人可通过原生质体传代扩大感染率(Folimonov et al.,2007；Robertson et al.,2005；Satyanarayana et al.,2001；Tatineni et al.,2008)。虽然可行，但该系统极难操作。发明人现在能够土壤接种本生烟，引起系统性感染。结果可在这些植物中更快地进行载体分析，为柑橘树的培育提供大量重组病毒。因此，发明人对本生烟和柑橘中不同载体的活性进行了研究。
根据一个实施例，本发明涉及了CTV病毒载体与基因盒的联合构建，该基因盒中含编码异源性多肽的多核苷酸。该基因盒位于CTV基因组的靶位点。在一个更具体的实施例中，CTV病毒载体被构建成使得在CTV基因组p13-p20、p20-p23或p23-3’NTR插入基因盒。在其他实施例中，CTV病毒载体被构建成在一个或多个位点插入多个基因。本文显示CTV病毒载体能够成功地容纳至少3个或4个基因进行表达，同时维持载体的功能和传染性不变。
在一些相关实施例中，本发明涉及一种植物，该种植物包括至少一个CTV病毒载体转染的细胞，CTV病毒载体被构建成包含一个基因盒，该基因盒包含异源性多肽编码多核苷酸，CTV病毒载体被构建成在CTV基因组p13-p20、p20-p23或p23-3’NTR插入一个或多个基因盒。其他相关实施例涉及用具体载体感染植物后，让植物表达至少一种异源性多肽的方法。
在一个进一步的实施例中，本发明涉及将CTV病毒载体构建成包括至少一个含异源性多肽编码多核苷酸的基因盒，其中CTV病毒载体被处理成使在CTV p13基因位点能够插入该基因盒。在相关实施例中，本发明涉及了一种包含至少一个CTV病毒载体转染细胞的植物，或者通过具体载体感染植物来在植物中表达异源性多肽的方法。
在另一个实施例中，本发明涉及CTV病毒载体被构建成包括至少一个含异源性多肽编码核苷酸与共轭IRES序列的基因盒。在相关实施例中，本发明涉及了一种包含至少一个CTV病毒载体转染细胞的植物，或者通过具体载体感染植物来在植物中表达异源性多肽的方法。
在进一步的实施例中，本发明涉及CTV病毒载体被构建成包含一个含从p23ORF开始的连续氨基酸编码子多核苷酸序列的基因盒，编码两侧均有剪切位点的第一异源性多肽(蛋白酶)和第二异源性多肽。在相关实施例中，本发明涉及了一种包含至少一个CTV病毒载体转染细胞的植物，或者通过具体载体感染植物来在植物中表达异源性多肽的方法。
在进一步的实施例中，多核苷酸中进一步包括上文所述第一异源性多肽上游的编码第一控制子元件的序列、编码两侧有剪切位点的蛋白酶的第二序列、和编码第二异源性多肽的序列。
根据另一个实施例，本发明涉及将CTV病毒载体构建成包括一个第一基因盒，该基因盒包括一个编码第一异源性多肽的多核苷酸序列和所述编码第一异源性多肽序列上游的一个第一控制子元件；和一个第二基因盒，该基因盒包括一个编码第二异源性多肽的多核苷酸序列和所述编码第二异源性多肽序列上游的一个第二控制子元件。可选择的，CTV病毒载体进一步包括一个第三基因盒，该基因盒包括一个编码第三异源性多肽的多核苷酸序列和所述编码第三异源性多肽序列上游的一个第三控制子元件；和一个第四基因盒，该基因盒包括一个编码第四异源性多肽的多核苷酸序列和所述编码第四异源性多肽序列上游的一个第四控制子元件。本领域技术人员将会懂得只要保证维持载体的功能和传染性，就能继续在载体中增加基因盒。在相关实施例中，本发明涉及一种包含至少一个CTV病毒载体转染细胞的植物，或者通过具体载体感染植物来在植物中表达异源性多肽的方法。
根据本发明所教授的内容使用的控制子元件(CE)包括，但不局限于，CTV同源性控制子元件或异源性控制子元件。异源性控制子元件包括，但不局限于，三种线形病毒甜菜黄化病毒(BYV)(第13547到13640的94nts，基因库登记号AF190581)(Peremyslov et al.,1999)、甜菜黄矮病毒(BYSV)衣壳蛋白控制子元件(CP-CE)(第8516到8616的101nts，基因库登记号U51931)和葡萄卷叶相关病毒-2(GLRaV-2)(第9454-9651的198nts，基因库登记号DQ286725)。根据本发明，其他控制子元件，特别是有强启动子样活性的控制子元件，亦可以被应用，这对本领域的技术人员是显而易见的。
上述及其他实施例在以下被进一步进行描述，并被包括在所附权利要求中。
以下实施例1-7的材料和方法
质粒的构建
使用pCTV9RΔp33与pCTVΔCla333R(Gowda et al.,2001；Satyanarayana etal.,1999,2000,2003；Tatineni et al.,2008)作为基础质粒构建原生质体反向遗传系统所用的所有表达载体。核苷酸计数(nts)是基于T36克隆全长(基因库登记号AY170468)(Satyanarayana et al.,1999,2003)。融合烟草烛纹病毒(TEV)的5’非转录区(NTR)(核苷酸(nts)2-144基因库登记号DQ986288)(Carrasco et al.,2007)和p23终止密码子之后的3xARC-1(活性核糖体互补序列)(T36克隆全长中的核苷酸19020-19021)(Akergenov etal.,2004)使用重叠延伸聚合酶链式反应(PCR)(Horton et al.,1989)构建CTVp333R-23-ITEV-GFP和CTVp333R-23-I3XARC-GFP(图7A)。通过在不同位点插入基因和(或)替换基因构建表达载体，从三种线性病毒的衣壳蛋白控制子元件(CP-CE)选择异源性控制子元件(CE)：甜菜黄化病毒(BYV)(第13547-13640的94nts，基因库登记号AF190581)(Peremyslov etal.,1999)、甜菜黄矮病毒(BYSV)(第8516-9616的101nts)(Karasev et al.,1996)和葡萄卷叶相关病毒-2(GLRaV-2)(第9454-9651的198nts，基因库登记号DQ286725)，以驱动周期3GFP(GFP)(Chalife et al.,1994；Crameri et al.,1996)的ORF、大肠杆菌β-葡糖醛酸酶(GUS)ORF、bFosYC155-238(bFosC)、bJunYN1-154(bJunN)。通过从质粒pBiFC-bFosYC155与pBiFC-bJunYN155(Hu et al.,2002)及CTV9R(Satyanarayana et al.,1999；2003)的重叠延伸PCR创建载体CTVp333R-23-BYbJunN-GbFosC、CTVp333R-23-BYbJunN、CTVp333R-23-GbFosC(图15A)。因双分子荧光基因(BiFC)中存在两个NotI位点，重叠延伸PCR产物被NotI限制性内切酶部分消化。在StuI和NotI消化后的pCTVΔCla333R引入PCR产物(图7A和图3-15A)。
通过用PstI(nts17208-17213)和NotI或StuI消化质粒，将pCTV9RΔp33中构建的表达质粒插入CTV基因组(在第19,293最末CTV核苷酸后插入)。使用重叠延伸PCR(Hortonet al.,1989)在不同的位点插入适当的基因。通过删除p13ORF的nts17293-17581和重叠延伸PCR替换p13基因(图3-1A、图3-2A、图3-11A、图3-16A、图3-17A和图3-18A)。类似地，通过重叠延伸PCR在p13与p20之间(nts#17685-17686)(图3A)、p20-p23之间(nts#18312-18313)(图4A)、p23-3’NTR之间(nts#19020-19021)(图3-5A、图3-6A、图3-13A、图3-16A、图3-17A和图3-18A)插入基因。通过融合相隔HC-Pro蛋白酶基序(nts1966-2411，基因库登记号M11458)GFP ORF(Chalife et al.,1994；Cramerietal.,1996)和GUS ORF创建杂交基因，其识别序列与GUS的N末端(ATGAAAACTTACAATGTTGGAGGGATG(nts2412-2438基因库登记号M11458))(Allison et al.,1985；Carrington et al.,1989)(氨基酸序列(A.A)MKTYNVG↓GM)(箭头指示加工位点)和GFP的C末端(ATGAAGACCTATAACGTAGGTGGCATG)融合，插入在p23之后(图13A)或替换p13(图3-11A)，受不同的控制子元件控制。使用TEV的NIa蛋白酶基序(nts6270-6980基因库登记号M11458)(Allison et al.,1985)及其识别序列(位于GFPC末端的GAGAATCTTTATTTTCAGAGT(nts8499-8519基因库登记号M11458)(A.A.ENLYFQ↓S)(箭头指示加工位点)(Carrington and Dougherty,1988)和位于GUSN末端的GAAAACCTATACTTCCAATCG)构建类似的杂交基因。利用氨基酸遗传密码子的冗余消除识别基序核苷酸序列的完全重复。使用相似方法在CTV33-23-HC-GFP-72和CTV33-23-NIa-GFP-73的p23ORF与GFP ORF之间插入构建杂交基因(图8)。交换蛋白酶识别基序产生控制载体CTV33-23-HC-GFP-74与CTV33-23-NIa-GFP-75(图8)。
对二元质粒pCAMBIACTV9R(Gowda et al.,2005)进行修饰，删除nts10858-11660消除p33基因(Satyanarayana et al.,2000；Tatineni et al.,2008)，在基于地下三叶草斑驳病毒构建的核糖体之后插入SwaI位点(Turpen et al.,1993)。对修饰后的二元质粒pCAMBIACTV9RΔp33用PstI(正向引物C-749)和SwaI(逆向引物C-1894)中插入pCTV9RΔp33骨架中表达载体的PCR扩增产物。向载体CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59(图17)、CTV33-Δ13-BYbJunN-23-GbFosC-67(图17)、CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76(图16)、CTV33-23-GbFosC-98(图16)和CTV33-23-BYbJunN-97(图16)中插入双分子荧光互补(BiFC)基因时使用了引物将PstI换为相容的NSiI(引物C-2085)以便克隆(bFosC基因序列含有一个PstI位点，而bJunN基因序列含有两个PstI位点)。对不同的表达载体进行正确插入的初步筛查，使用适当的酶进行限制性消化。通过在生物科技多学科中心(ICBR)(佛罗里达大学，佛罗里达州甘斯威尔市)测序证实了插入表达载体的外源基因结合位点。所有引物在以下表1-1中列出。
表1-1.构建表达载体所用的引物列表
聚合酶链式反应(PCR)
使用稀释的质粒(1:50)作为模板，使用VentDNA聚合酶(马萨诸塞州伊普斯维奇市新英格兰生物实验室)根据使用说明建议进行PCR。
土壤注射/浸润法
根据Gowda et al.,(2005)发明的过程加以微小改良进行本生烟的土壤接种。用含有CTV、变异体(表达载体)和沉默抑制子(番茄丛矮病毒(Gowda et al.,2005)、GLRaV-2的p24(Chiba et al.,2007)、芜菁花叶病毒的P1/HC-Pro(Kasschau et al.,2003)和番茄褪绿病毒的p22( et al.,2008))的二元质粒进行根瘤农杆菌EHA105的转染，转染过程使用热休克法(37℃，5分钟)，再在添加了抗生素(卡那霉素(50μg/ml)和利福平(50μg/ml))的Luria Burtani(LB)培养基(密苏里州圣路易市Sigma-Aldrich)平皿中28℃培育48小时。用添加了抗生素的LB培养基中过夜培养菌落(每个构建的载体2个菌落)，作为种菌培养。次日将0.5ml种菌接种于35ml添加了抗生素的LB培养基中过夜培养。以6000r/min(rpm)转速离心细菌培养液，用10毫摩尔(mM)MgCL2与10mM MES重新悬浮沉淀，用10mM MgCL2与10mM MES洗涤沉淀，再悬浮于诱导培养基中，即含有乙酰丁香酮的10mM MgCL2与10mM MES，最终浓度为150μM。在诱导培养基中培养悬浮液至少5小时，然后注射入本生烟茎或浸润本生烟叶的下表面。
植物生长条件
在生长房(21℃，24小时中光照16小时)中培养本生烟，移植后4小时用于土壤注射或浸润。
柑橘植物感染
从本生烟叶的浸润叶或全部叶中获得重组CTV病毒体以感染柑橘植物。该病毒体部分纯化，在TL100或SW41转子上利用蔗糖片上富集病毒体(Robertson et al.,2005)。对表达两种外源蛋白的载体病毒体使用梯度法浓缩2倍，再分别在TL100或SW41转子上利用蔗糖片梯度进行浓缩(Garnsey and Henderson,1982)。在1-1.5年的阿雷檬幼苗中通过树皮接种法接种柑橘植物(Robertson et al.,2005)，在25-32℃的温室内生长。
原生质体的制备、转染、RNA分离与诺瑟杂交(Northern Blot)分析
根据Nava-Castilloetal.,(1997)发明的方法制备本生烟叶原生质体。对3周本生烟叶进行表面消毒，使用无菌刀在下表面轻划一道，在暗室过夜培养(16-20小时)，培养基为0.7M MMC(0.7M甘露醇、5mM MES,10mMCaCl2)加1％纤维素(Yakult Honsh,Tokyo,Japan)和0.5％聚半乳糖醛酸酶(加利福尼亚州La Jolla市Calbiochem实验室)。
使用Sp6RNA聚合酶(威斯康星州Epicentre Technologies实验室)在NotI或StuI线性质粒DNA上得到加帽体外RNA(Satyanarayana et al.,1999)，使用PEG(聚乙二醇)转染原生质体，该方法参考Satyanarayana et al.,(1999)。转染4天后，使用原生质体制备总RNA用于诺瑟杂交(Northern blot)分析，并分离病毒体。将原生质体等量分装于2个1.5ml离心管中。第一个离心管用液氮快速冷冻，在-80℃保存，用于分离病毒体，后续培养新一批的原生质体以扩增病毒体(Satyanarayana et al.,2000)。第二个离心管用于分离RNA，用Buffard缓冲液破坏原生质体，再用苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)提取，用甲醇沉淀，该方法参考Navas-Castillo et al.,(1997)与Robertson et al.,(2005)。用20μl无DNAse/RNAase水重悬总RNA，用于诺瑟杂交(Northern blot)分析，分析方法参考Lewandowski与Dawson(1998)。简言之，在变性缓冲液(8.6％甲醛、67％甲酰胺1XMOPS溶液(5mM乙酸钠、1mMEDTA、0.02M MOPS pH＝7.0))中对分离的RNA进行热变性，用0.9％琼脂凝胶1XMOPS(含1.9％甲醛)溶液分离RNA，通过电印记法转染到尼龙膜上(Boehringer Mannheim,Germany)。在68℃的杂交箱(密苏里州圣路易市Sigma-Aldrich)中进行预杂交(至少1小时)和杂交(过夜)。使用900nts的地高辛标记RNA探针(相应于CTV基因组的3’端)(联合链特异性CTVRNA探针)(Satyanarayana et al.,1999)进行杂交，但如果外源基因位于p23之后，根据使用说明建议(德国Boehringer Mannheim)通过PCR扩增的DNA(含有CTV3’NTR和SP6噬菌体启动子(C-1982)的反向引物)制造地高辛标记的RNA探针，与p23之后插入的序列和CTV的3’NTR序列互补。
Western Blots免疫印迹分析
在盛有液氮的研钵中磨碎植物组织，加入Laemmli缓冲液(50mM Tris-ClpH6.8、2.5％2-巯基乙醇、2％SDS、0.1％溴酚蓝、10％甘油)(每100mg组织加入100μl)。样本转移到1.5ml离心管中，水浴煮沸3分钟，再最大转速离心2分钟。上清液转移到新管中，在-20℃下贮存待用。使用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶(加利福尼亚州Hercules市Bio-Rad公司生产)进行电泳，之后用半干法在2小时内将蛋白转移到硝酸纤维素膜上(加利福尼亚州Hercules市Bio-Rad公司生产)。室温下封闭膜1小时，之后用一抗(可以为CP(1:5000)、GFP(1:100)(加利福尼亚州PaloAlto市Clontech Laboratories实验室)或GUS(1:1000)(俄勒冈州尤金市Molecular probes)在室温下孵育1小时，再用辣根过氧化物酶结合的抗兔二抗(1:10,000)(英国白金汉郡Amersham公司生产)孵育1小时。最后，根据生产建议，使用在X射线膜(纽约州罗切斯特市柯达公司生产)上冲洗的蛋白质印迹法化学荧光系统(英国白金汉郡Amersham公司生产)。
植物与原生质体拍照
使用佳能相机(Canon EOS Digital Rebel XTi400D,纽约州Lake Success市)采集植物在紫外线(UV)或白光下的照片。使用荧光解剖镜(Zeiss Stemi SV11UV-荧光解剖镜，德国Jena市Carl Zeiss Jena,GmbH.公司生产)采集部分植物或原生质体的封闭荧光图。使用共聚焦扫描显微镜采集高分辨率原生质体图像(Leica TCS SL,宾夕法尼亚州埃克斯顿市Leica Microsystems,Inc.公司生产)。
酶联免疫吸收分析(ELISA)
根据Garnsey与Cambra(1991)发明的方法使用双抗体插夹式ELISA。使用兔多克隆抗体(1μg/ml)包覆ELISA板。对植物组织样本以1:20用PBS-T(磷酸盐缓冲液生理盐水-1％Tween20)提取缓冲液稀释。使用Mab ECTV172(稀释倍数1:100K)检测抗体。
GUS分析
对土壤接种柑橘树皮或本生烟的叶表面进行酒精消毒(70％乙醇)，再用10％次氯酸钠消毒，用无菌蒸馏水洗涤3次之后，进行GUS染色。样本在含1mg/ml X-gluc(单环己胺盐：密苏里州圣路易市Gold Biotechnology公司生产)的EDTA-磷酸盐缓冲液(0.1MNa2HPO4、1mM Na2EDTA)中培养。用95％乙醇：冰醋酸(3:1)固定组织。
实施例1：检测基于CTV的表达载体的系统
在三个系统中检测基于CTV的表达载体，分别为本生烟叶肉原生质体、本生烟整株植物、阿雷檬整株植物。感染整株植物的载体构建使用CTV全长cDNA克隆(pCTV9R)与p33基因大部分删除的突变体(pCTV9RΔp33)，后者有一个PstI限制位点删除，更易克隆，且保留感染多数柑橘类植物的能力(Tatineni et al.,2008)。对本生烟原生质体进行较快速分析，要求在SP6转录质粒(Satyanarayana et al.,1999)上构建载体。原生质体中使用多数3’基因删除的微复制子pCTVΔCla333R(Gowda et al.,2001)较方便。总目标是得到感染了不同的CTV表达载体的柑橘树，这一目标更难、更耗时。目前已经发现土壤接种柑橘树很难。因此，为避免这一难题，对病毒体进行扩增、浓缩以通过茎秆或树叶感染柑橘树(Robertsonet al.,2005；Satyanarayana et al.,2001)。可以使用重组CTV载体的体外转录体和通过天然树液中病毒体传代扩增的病毒感染本生烟原生质体(Folimonov et al.,2007；Satyanarayana et al.,2001；Tatineni et al.,2008)。此外，在土壤接种之后可以在本生烟植物中扩增重组CTV(Gowda et al.,2005)。病毒可以感染土壤接种部分的叶肉细胞，但随着病毒能够系统性进入上部非接种树叶，病毒聚集于维管组织，通常导致叶脉清空和后期坏死。在本生烟植物系统感染期间对所有载体进行检查。因CTV病毒体离心之后并不重新悬浮，可以通过离心法加蔗糖密度梯度浓缩病毒体(Garnsey et al.,1977；Robertson etal.,2005)。接种后，去除柑橘植物顶端，在2-3个月之后监测新生长部分的病毒系统性感染。一旦柑橘树被感染，使用第一株感染植物的接种体(出芽、树叶碎片或新芽)感染新的植物待用。整个过程约持续1年时间。因此研究者选择在柑橘树中仅研究最有前景的载体。一些后期开发的载体尚未进行过柑橘研究。
实施例2：在CTV基因组内不同部位增加基因
在p13基因位点插入
曾有研究者(Folimonov et al.,2007)在有效的CTV载体中两个衣壳蛋白基因之间插入其他基因，使得外源性基因成为3’端开始的第6个基因。但表达量最高的CTV基因趋向于靠近3’端。因此在靠近3’端插入基因将导致表达量增加。P13是3’端数起的第3个基因，是表达量相对较高的基因，多数CTV宿主的感染并不需要该基因(Tatineni et al.,2008；Tatineni et al.,in preparation)。但既往用GFP ORF替换p13ORF的尝试均告失败(Folimonov et al.,2007)。失败原因有多种可能性。此前设计载体时假设翻译在第1个起始密码子处开始，但p13ORF有第二个框内AUG。转录可能从第2个AUG开始。但在第2个AUG之后融合GFP ORF也未表达报告基因(Gowda et al.，结果未发表)。第二个可能的原因是p13控制元件(CE)可能延伸进入p13ORF或核糖体募集直接从ORF内开始。于是研究者删除了p13CE和ORF，在p13位点异源性CE之后插入一个新的ORF。受BYSV(101nts，8516-8616，基因库登记号U51931)、GLRaV-2(198nts，9454-9651，基因库登记号DQ286725)或BYV控制的GFPORF被设计成pCTV9RΔp33，替代nts17293-17581(分别为CTV33-Δ13-BY-GFP-57,CTV33-Δ13-G-GFP-65,CTV33-Δ13-B-GFP-66)(图1A)。使用RNA转录体接种系列原生质体，判断哪些载体能够复制，哪些病毒体能够在原液中传代形成新一批原生质体。感染后原生质体的荧光(未列出数据)和诺瑟杂交(northern blot)分析证实了表达载体通过原生质体转移能够有效传代(图1B)。此外，GFP mRAN的水平与CP相似。载体序列CTV33-Δ13-BY-GFP-57、CTV33-Δ13-G-GFP-65和CTV33-Δ13-B-GFP-66被转移到土壤细菌二元质粒中，以土壤接种本生烟。通过对叶、出芽、花和花冠的荧光成像，发现这三种载体感染了本生烟，在本生烟维管系统中大量转移(图1C)，早期出现维管清除，ELISA也能证实这一点(未列出数据)。
扩增CTV33-Δ13-G-GFP-65与CTV33-Δ13-B-GFP-66，用于接种阿雷檬植物。最初感染的植物的维管系统表现出显著的荧光(图1D)。这些植物接种2年后仍可见荧光。
在相同位点用GUS ORF(1812nts)替换GFP ORF(720nts)研究更大外源基因的表达。选择BYSV CP-CE驱动表达载体CTV33-Δ13-BY-GUS-61中的GUS ORF(图2A)。用该载体的RNA转录体转染原生质体，经诺瑟杂交(northern blot)分析证实，病毒能够复制且能从一批原生质体有效传代给另一批(图2B)。此外，分析结果提示GUS mRNA的蓄积水平与CP mRNA相同，载体CP和CPm mRNA与野生型病毒相似。本生烟土壤接种的GUS染色结果发现载体能够感染植物并在维管系统中播散，这一结果也经ELISA(未列出数据)与维管清除表型的证实。
从携带CTV33-Δ13-BY-GUS-61的本生烟浸润叶片分离到的病毒体感染了阿雷檬，经ELISA(数据未显示)和GUS蛋白生物活性(图2C)的证实。柑橘树接种后1.5年，GUS基因仍具有生物学活性。
从技术上看，上述基因工程产物替换了一个基因(p13)而非增加一个基因，为了检查在p13和p20之间插入其他基因的载体，在nts17685-17686之间插入BYSV的CP-CE，以控制GFP ORF，产生CTV33-13-BY-GFP-69(图3A)。该载体应在p13和p20的次基因组之间产生另一个次基因组RNA。研究本生烟原生质体和植物中的载体CTV33-13-BY-GFP-69。在原生质体系统中，CTV33-13-BY-GFP-69能有效复制，可从一批原生质体顺利传代给新一批原生质体即证明了这一点，荧光成像(数据未列出)和诺瑟杂交(northern blot)杂交分析也证实了病毒体的形成(图3B)。外源性mRNA蓄积水平相对高，但CP mRNA蓄积水平下降。与p13结构替换相似，表达载体CTV33-13-BY-GFP-69经土壤接种法进入本生烟之后，新的载体能够在维管组织中播散(图3C)。
载体CTV33-13-BY-GFP-69可感染阿雷檬，在整个维管组织中可见强荧光(图3C)，ELISA也证实了这一点(数据未显示)。植物接种后2年仍有荧光。
在p20和p23之间插入
为研究靠近CTV3’NTR外源基因的表达，在p20和p23之间(nts18312-18313)插入基因。使用BYV或BYSVCP-CE驱动基于T36CTV9RΔp33的两个载体(CTV33-20-B-GFP-49和CTV33-20-BY-GFP-58)中的GFP mRNA(图3-4A)。新载体在p20和p23sgRNA之间产生其他sgRNA mRNA(图4B)。但p20sg mRNA的蓄积显著减少。两个载体均可在原生质体中复制并传代，但原生质体的传代减少，表现为GFP荧光细胞数量减少，诺瑟杂交(northern blot)分析也可以证实这一点(图4B和C)。CTV33-20-B-GFP-49或CTV33-20-BY-GFP-58载体浸润本生烟叶有一过性表达时，载体复制，荧光镜下可见大量GFP产生(数据未显示)，western blots免疫印迹分析也证实这一点(图4D)。然而，载体经土壤接种进入本生烟植物后，载体复制，但进入上部非接种叶片的运动为随机的，常有失败。因本生烟的系统性感染并不确定，未再尝试接种柑橘。
在p23和3’NTR之间插入
下一个待检测位点为在最靠近3’端插入基因，该位点的外源基因表达水平预计最高(Navas-Castillo et al.,1997；Hilf et al.,1995)。虽然已经分析过3’NTR(Satyanarayana et al.,2002a)，目前尚不明确该区域增加一个基因是否能够产生有效复制。在烟草花叶病毒(TMV)与苜蓿花叶病毒(AMV)的CP基因与3’NTR之间插入其他基因均未能产生有活性的载体(Dawson et al.,1989；Sánchez-Navarro et al.,2001)。BYSV、GLRaV-2或BYV中在GFP ORF之间的CP-CE被插入第19020和19021核苷酸之间，分别构建载体CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40和CTV33-23-B-GFP-42(图5A)。所有构建的载体被转染进原生质体后均能复制和有效传代，经诺瑟杂交(northern blot)分析(图5B)与GFP荧光分析(数据未列出)证实。GFP mRNA为蓄积率最高的mRNA，与其他mRNA相比，较野生型基因中的积累率仅轻度降低(图5B)。此外，在p23ORF3’端插入GFP得到积累率最高的外源基因mRNA。将CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40和CTV33-23-B-GFP-42经土壤接种法接种到本生烟植物中。该感染通过维管组织进行系统性播散，荧光(图5C)、表型(维管清除和坏死)与ELISA(数据未列出)均证实了这一点。本生烟维管组织中的荧光非常明亮，感染植物中的荧光可维持终生(图5C)。
构建载体CTV33-23-BY-GFP-37通过传代能够在12批原生质体中扩增，此后再接种柑橘。用浓缩的病毒体接种叶肉的阿雷檬也变得具有传染性。经GFP荧光法和ELISA(数据未列出)证实了柑橘的感染(图3-5D)。通过土壤接种本生烟扩增构建的载体CTV33-23-G-GFP-40，再对柑橘接种。感染率为1/4，经荧光(图5D)和ELISA(数据未列出)证实。与本生烟相似地，柑橘接种后12周维管组织仍可见强荧光，此后的2.5年均有荧光(图5D)。
为了检查载体在该位点表达更大基因的能力，在p23基因3’端插入BYSV CP-CE及之后的GUS ORF，构建CTV33-23-BY-GUS-60(图6A)。构建的载体在成功转染的原生质体中复制。但根据诺瑟杂交(northern blot)分析，所有CTV次基因组RNA的蓄积水平均显著低于野生型病毒(图6B)。此外，CTV33-23-BY-GUS-60载体在原生质体中的传代能力较差(数据未列出)。但对本生烟进行土壤接种之后，载体复制并系统性移动，植物表现出系统性症状(维管清除继而坏死)，ELISA(数据未列出)和GUS分析也证实了这一点。本生烟植物中的GUS活性在新老叶中持续产生，直至植物死亡(图.7C)。与CTV33-Δ13-BY-GUS-61类似，p23与3’NTR之间的位点能够良好地容纳较长基因，但上游基因的sgRNA水平有不同的效应(图5B与图6B)。
使用浓缩CTV33-23-GUS-60接种阿雷檬植物，ELISA(数据未列出)和GUS基因活性分析(图6C)证实植物已被感染。此外，GUS的活性和western blots免疫印迹分析提示柑橘接种后1.3年仍有GUS基因(图6C与图19)。
实施例3：产生外源性多肽而不产生外源性次基因组mRNA
内部核糖体进入位点法(IRES)
烟草烛纹病毒(TEV)IRES
TEV的5’NTR介导病毒mRNA的非帽依赖性转录。关于TEV5’NTR的研究证实在一个双顺反子mRNA的内部ORF启动转录(Gallie,2001；Niepel and Gallie,1999)。TEV5’NTR(nts2-144，基因库登记号DQ986288)被插入p23ORF之后的一个CTV微小复制子(在nts19020-19021之间)，其后为GFP ORF(CTVp333R-23-ITEV-GFP)(图7A)以研究双顺反子次基因组mRNA是否可应用于该病毒。虽然诺瑟杂交(northern blot)分析显示转然后的本生烟原生质体中微小复制子复制并产生大量的双顺反子mRNA(图7C)，但未观察到GFP荧光，提示双顺反子mRNA中第2个ORF无转录。研究也检测了本生烟原生质体和本生烟植物的全长CTV中5’NTR TEV IRES结构。载体CTV33-23-ITEV-GFP-41能够从原生质体向下一代原生质体有效传代(图7B)，提示病毒体有良好的复制和行程，但未观察到荧光原生质体，提示该IRES在CTV中效果不佳(数据未列出)。该载体感染本生烟植物并系统地移动，植物表现出系统性症状，即维管清空继而坏死，ELISA也证实了这一点(数据未列出)，但紫外线(UV)光下未观察到GFP荧光(数据未列出)。
活性核糖体互补序列(ARB)IRES
从宿主和病毒mRNA分析(基因工程产物3xARC-1(86nts)IRES(Akbergenov etal.,2004))得到IRES相同序列插入信息，在CTV中检测其活性。该IRES在CTV微小复制子(CTVp333R-23-I3XARC-GFP)和Δp33CTV9R(CTV33-23-I3XARC-GFP-43)的p23ORF(nts19020-19021)后融合，如上文所述(图7A)。但感染原生质体和植物之后，未观察到GFP荧光，尽管二者中病毒复制良好(图7B和C)。
多肽融合
p23是CTV中表达水平最高的基因，其多功能性蛋白对柑橘的感染至关重要。P23是一个沉默抑制子，通过由带正电荷氨基酸残基和氨基酸50-86之间的锌指域组成的一个RNA结合域控制感染细胞中正反RNA比值(Lopez et al.,2000；Satyanarayana et al.,2002b；Lu et al.,2004)。为构建基因融合，选择TEV的HC-Pro或NIa蛋白酶基序与p23的C末端(nts19017-19018之间)融合(图8)。HC-Pro的蛋白酶识别序列与NIa在p23于蛋白酶之间和蛋白酶与GFP之间重复，分别构建出载体CTV33-23-HC-GFP-72与CTV33-23-NIa-GFP-73(图8)。若为HC-Pro，p23的蛋白酶基序的加工应使得p23的C末端多出7个氨基酸；若为NIa，应多出6个氨基酸。GFP蛋白从HC-Pro和NIa上剪切下来之后应分别多出2个或1个氨基酸。转换HC-Pro与NIa之间的识别序列构建载体CTV33-23-HC-GFP-74与CTV33-23-NIa-GFP-75，作为不能剪切的对照(图8)。在CTV二元载体中构建所有多肽融合载体以感染植物，因原生质体中p23融合不影响复制和传代的活性(Tatineni与Dawson，结果未发表)。在本生烟浸润烟叶中，所有载体的荧光程度彼此相等，与p23之后的空GFP载体也类似(图9A)。此外，浸润烟叶的western blots免疫印迹分析提示多肽融合产生了几乎完美的报告基因加工(图10)。GFP蛋白并未局限在核上(如与p23融合时)，非由蛋白酶加工释放报告基因。对植物进行土壤接种之后，只有携带蛋白酶及其同源加工位点的载体能够系统性地移动到上部非接种烟叶。上部非接种烟叶的荧光较弱，弱于携带GFP、受各自控制子控制的表达载体CTV33-23-BY-GFP-37、CTV33-23-G-GFP-40与CTV33-23-B-GFP-42(图9B)。此外，观察下表面的荧光比观察叶片下表面容易(图9C)。柑橘接种CTV33-23-HC-GFP-72之后，一株植物为阳性，但其ELISA结果相对地低于其他植物(数据未列出)。未检测报告基因的活性。
实施例4：在CTV载体中产生超过一个其他外源基因
使用单一控制子元件表达多个蛋白
为利用多肽法在CTV载体相同控制子元件的驱动下表达多基因，构建含有GFP/蛋白酶(Pro)/GUS的融合多肽。在不同的载体中使用两种不同的蛋白酶基序，HC-Pro与NIa，其各自的蛋白水解基序和识别序列将GFP ORF与GUS ORF分隔开(图14A与3-16)(Carrington与Dougherty,1988；Carrington et al.,1989)。理论上，如果使用NIa作为融合时的蛋白酶基序，6个额外氨基酸与N末端蛋白(GFP)在C-末端耦合，而只有一个额外氨基酸添加到GUS的N-末端。类似地，虽然HC-Pro是融合多肽中的蛋白酶，在GFP的C末端增加7个额外的氨基酸，在GUS的N末端增加2个额外的氨基酸。融合基因的大小在3127与3480nts之间。
替换p13基因
如上文所述两个融合GFP/Pro/GUS替换土壤接种二元载体CTV的p13位点，受BYSVCP-CE的控制(如为HC-Pro蛋白酶基序，受CTV33-Δ13-BYGFP-HC-GUS-77的控制，如为NIa蛋白酶基序，受CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78的控制)(图11A)。构建的载体经土壤接种法进入本生烟，以监测系统性感染植物及产生GUS和GFP的能力。根据各自的分析观察到两种基因均有产生(图11B)。Western blots免疫印迹分析提示多肽融合后GFP蛋白的有效加工(图10)。本生烟中病毒扩增并传播形成高滴度，表现为上叶面症状(图11B)，ELISA也证实了这一点。然而，GFP荧光水平低于只表达GFP的载体CTV33-Δ13-BY-GFP-57、CTV33-Δ13-G-GFP-65、CTV33-Δ13-B-GFP-66，进入非接种叶片的播散速率也慢于这些载体(数据未列出)。在本生烟植物中，重叠荧光和GUS酶活性分析显示注射后7个月载体仍保持稳定(图12)。
在p23与3’NTR之间插入
为尝试提高GFP与GUS的表达水平，将融合多肽移动到更靠近3’NTR的位点。含HC-Pro蛋白酶的BYSV、GLRaV-2或BYVCP-CE构建的融合基因被插入p23与3’NTR之间，形成CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51、CTV33-23-G-GFP-HC-GUS-53与CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-55，如果结构中蛋白酶为NIa，则分别称为CTV33-23-BY-GFP-NIa-GUS-52、CTV33-23-G-GFP-NIa-GUS-54和CTV33-23-BY-GFP-NIa-GUS-56(图13)。本生烟植物经土壤接种后，所有构建体扩增，GFP荧光(图14A)与GUS活性(图14A)证实构建体播散进入上部非接种叶片。与CTV33-Δ13-BYGFP-HC-GUS-77和CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78构建体相似的时，荧光重叠加GUS酶活性分析提示注射后7个月融合仍具有稳定性。然而，注射了构建体CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51的阿雷檬植物仅有弱荧光，几乎无GUS活性(图14B)和高ELISA值。
实施例5：使用多启动子同时表达外源基因
CTV中的双分子荧光互补(BiFC)。为了研究插入两个CP-CE控制的不同ORF，使用了BiFC系统，该系统仅当两个蛋白在同一细胞中蓄积才能够产生可见的荧光。该系统的开发是使用bJun与EYFP的N末端融合(A.A.1-154)(称为bJunN)和bFos ORF与EYFP的C末端融合(A.A.155-238)(称为bFosC)(Hu et al.,2002)。
两种蛋白均被转运至核，直接相互作用使得EYFP蛋白获得野生型的这点特性，一经蓝光照射活化后释放荧光(刺激波长为525nm，释放波长为575nm)(Hu et al.,2002)。向CTV p23ORF的3’微小复制子中引入BiFC的一个或两个成分(在nts#19020-19021之间，基因库登记号AY170468)，称为CTVp333R-23-BYbJunN、CTVp333R-23-GbFosC与CTVp333R-23-BYbJunN-GbFosC(图15A)。诺瑟杂交(Northern blot)分析显示所有三种构建体均能成功地转染本生烟原生质体(图15B)。两种转录因子在植物细胞中相互作用，核荧光观察到只有在感染了CTVp333R-23-BYbJunN-GBFosC的原生质体中才会出现荧光(图15C)。应注意到两个插入基因的大小约等同于GUS ORF。
研究者也将基因分别引入p23之后的Δp33CTV9R，构建载体CTV33-23-BYbJunN-97与CTV33-23-GbFosC-98作为BiFC实验的对照，仅产生一种成分(图16B)。两种构建体核均无荧光。
多个外源基因在同一部位同时表达
替换P13。向Δp33CTV9R中引入两种基因(Satyanarayana et al.,1999,2000,2003；Tatineni et al.,2008)替换p13基因(替换17292-17581之间删除的核苷酸)，构建CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76(图16A)。用CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76的RNA转录体转染原生质体后观察到核荧光(数据未列出)。类似地，本生烟植物浸润过全长CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76的叶片释放核荧光(图16B)。相反，浸润了构建体CTV33-23-BYbJunN-97和CTV33-23-GbFosC-98的叶片无仍和核荧光(数据未列出)。监测浸润了CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76的本生烟茎韧皮部和叶脉络，观察到在浸润后7轴维管组织仍有荧光，提示该构建体能够系统性感染本生烟上部叶片(图16B)。
在p23与3’NTR之间插入。下一步是评估两个基因放置于更靠近3’末端时的表达情况。将BiFC系统的两个基因插入p23之后的CTVΔp33(在nts#19020-19021之间)，构建CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59(图3-17A)。构建体CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59完成RNA转染后，感染的原生质体荧光显微镜图片显示核荧光。但很难将新的构建体从一批原生质体传递给下一批，这种情况与在同一位点插入GUS和GFP/Pro/GUS融合基因的情况相似。本生烟土壤接种全长CTV中的CTV33-23-BYbJun-GbFosC-59之后，浸润部位观察到荧光。系统性症状与本生烟感染CTV后的症状相符，但显著延迟发生。但监测上部非浸润叶片和茎韧皮部组织观察到叶片土壤浸润后7周，维管组织仍有核荧光，证实了载体的系统性感染(图17C)。这些结果径ELISA核实，表明在p23和3’NTR之间能够插入两个外源基因而不影响CTV系统性侵袭植物的能力。与两种基因替换p13构建的CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76相似的是，构建体CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59在上部维管组织中扩增的时间框也有延迟。系统性茎韧皮部组织的核荧光显示CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76感染细胞多于CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59感染细胞(图16B与图17C)。感染细胞数量上的查体提示CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76转移进入本生烟的能力强于CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59。
实施例6：多个外源基因在不同部位同时表达
为了在两个不同部位表达多个外源基因，研究者选择替换p13基因并在其后插入第2个基因。通过用BYSV CP-CE驱动的bJunN ORF替换p13基因并在p23ORF与3’NTR之间插入GLRaV-2CP-CE控制的bFosC ORF构建CTV33-Δ13-BYbJunN-23-GbFosC-67(图17A)。CTV33-Δ13-BYbJunN-23-GbFosC-67转染进入原生质体，诺瑟杂交(Northern blot)分析证实了病毒的复制(图17B)。然而p23mRNA的蓄积显著减少。将CTV33-Δ13-BYbJunN-23-GbFosC-67经过土壤接种法接种进入本生烟。叶片浸润后感染的细胞显示出核荧光(图17C)，但感染细胞的数量显著低于构建体CTV33-Δ13-BYbJunN-GbFosC-76与CTV33-23-BYbJunN-GbFosC-59。感染后的原生质体显示成功形成具有生物学活性的蛋白体。然而，本生烟中未实现系统性感染，茎和上部非接种叶片无核荧光，ELISA进一步证实了这一点。
为了进一步研究同时表达不同位点的多个基因，构建CTV33-Δ13-BYGUS-23-GGFP-71使得GUS ORF受BYSV CP-CE的控制并替换p13基因(nts17292-17582)，GFP ORF受GLRaV-2CP-CE的控制，被插入p23与3’NTR之间(nts19020-19021)(图18A)。CTV33-Δp13-BYGUS-23-GGFP-71的RNA转录体转染本生烟原生质体，诺瑟杂交(Northern blot)分析提示构建体在原生质体中有效复制(图18B)。本生烟植物的叶片浸润构建体CTV33-Δp13-BYGUS-23-GGFP-71之后，紫外线(UV)光下课件荧光和GUS活性测定均显示病毒复制(数据未列出)。土壤接种的植物开始表现出GUS活性，浸润后6周上部非接种叶片仍有荧光(图3-18C)。上部叶片的系统性感染略慢于仅含有GFP的构建体。此外，本生烟维管系统感染CTV之后出现维管清空继而坏死，发生时间晚于单基因载体。紫外线(UV)光下观察到的荧光水平似乎略低于单基因构建体。但感染了受自身CT控制的CTV33-Δp13BYGUS-23GGFP-71构建体的GFP荧光比融合构建体(CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51、CTV33-23-BY-GFP-NIa-GUS-52、CTV33-23-G-GFP-HC-GUS-53、CTV33-23-G-GFP-NIa-GUS-54、CTV33-Δ13-BYGFP-HC-GUS-77和CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78)显著。两种基因的活性持续到本生烟植物死亡。类似地，在柑橘中，两种基因的表达也超过构建体CTV33-Δ13-BYGFP-NIa-GUS-78和CTV33-23-BY-GFP-HC-GUS-51中的相同基因。
实施例7：在柑橘中不同构建体的外源基因表达水平
很难直接比较柑橘中不同载体的外源基因表达水平，因存在感染时间、组织年龄、插入外源基因盒对病毒复制的影响等混杂因素。但柑橘中存在的蛋白是最好的表达水平测量方法。因此使用western blots免疫印迹分析比较柑橘中不同的GFP与GUS构建体相对于看家基因CP蛋白的表达水平，以测定复制水平。使用GFP抗体和CP抗体的western blots免疫印迹分析提示基因组越靠近3’端表达水平越高的趋势，插入的基因远离3’端时表达水平下降，但在p13和p20之间插入基因为例外情况(图19A)。相反，柑橘中的GUS表达提示替换p13后表达水平高于在p23之后插入(图19B)。
实施例8：多个基因载体
质粒的构建：
通过向CTV基因组的不同位点引入不同的基因盒组合构建三个和四个基因的载体。在pCAMBIA1380背景下在CTV9RΔp33构建三个载体(CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79、CTV33-BGFP-GbFosC-BYbJunN-81与CTV33-Δ13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82)。在pCAMBIA1380背景下通过修饰CTV9R、用番茄褪绿病毒p22ORF替换潮霉素ORF构建其余三个三基因载体(CTV-BASL-BYPTA-CP7-119、CTV-BASL-BYP10-CP7-131、CTV-BASL-BYPTA-CP10-120和CTV-BRFP-BYGFP-CTMVCP-117)和一个四基因载体(CTVΔ13-BRFP-GbFosC-BYbJunN-CTMVCP-118)。为了便于扩增全长CTV9R中p33ORF的PstI限制位点，需消化全长CTV9R，使用重叠延伸PCR(引物1749与1750联合引物C-1436与C-253)引入沉默突变，再用XmaI和PmeI消化重叠PCR产物与CTV9R。多数基因盒通过重叠延伸PCR使用表1中所列引物成功地进入需插入位点。但CPm和CP记忆之间的绿色荧光蛋白周期3未能插入。通过用PmeI、PstI对9-47RGFP质粒和pCAMBIA1380中点突变的CTV9R进行限制性消化和将GFPC3基因盒插入位点。
同时表达三个和四个外源性基因
成功地在本生烟和柑橘中表达受1个和2个不同控制子元件控制的2个基因之后，我们开始构建载体表达3个和4个不同控制子元件分别控制的3个和4个外源基因。不同组合中所用的报告基因为绿色荧光蛋白(周期3GFP，GFPC3)、红色荧光蛋白(标签红色荧光蛋白，RFP)、使用bFos和bJun哺乳动物转录因子的双分子荧光互补(Huetal.,2002)、来自大肠杆菌的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因和番茄花叶病毒(TMV)衣壳蛋白基因(CP)。类似地，在不同组合中构建三基因载体表达来自中国鲎和野猪的两个抗微生物肽(AMP)，即大蒜凝集素(ASL)与半夏凝集素(PTA)。在CTV基因组的2个或3个位点表达三基因载体。
同时表达三个不同位点的三个外源基因：
构建6个载体表达来自3个不同位点的3个外源基因。构建载体表达来自CTV9RΔp33或全长CTV9R的基因。
构建载体表达来自CTV9RΔp33中三个不同位点的三个基因
通过向CTV9RΔp33中插入三个外源基因盒构建两个表达载体CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79(图26)和CTV33-Δ13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82(图28)。CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79表达GFP(在CPm与CP之间插入)、GUS(在p13与p20之间插入)和TMV衣壳蛋白(在p23与3’UTR之间插入)、分别受BYV、BYSV和GLRaV-2的CP-CE控制的三个ORF。CTV33-Δ13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82表达GFPORF(在CPm与CP之间插入)、bJunN ORF(替换p13)和bFOsC(在p23与3’UTR之间插入)，分别受BYV、BYSV和GLRaV-2的CP-CE控制。这两个载体联合沉默抑制子浸润本生烟叶，并使用Gowda et al.,2005创造的方法接种柑橘。本生烟叶浸润后5天切割叶片、研磨后用超过70％蔗糖片梯度分离病毒体，似乎这些植物不太可能有系统性感染，故丢弃。手持UV下浸润叶片的荧光显示在CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79与CTV33-Δ13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82中均有GFP蛋白表达，提示构建的载体能够在本生烟叶中复制。从浸润CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79与CTV33-Δ13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82的本生烟叶的叶尖制备电镜标本，结果显示形成病毒体，即成功接种柑橘幼苗的首要条件。进一步地，仅对于CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79，发现形成杆状结构，成为TMV假病毒体，是TMV一颗蛋白表达的特征。
构建载体表达CTV9R中三个不同部位的三个基因
构建四个载体表达来自CTV基因组三个不同部位的三个外源基因。选择的三个部位分别是在CPm与CP之间插入、在p13与p20之间插入和在p23与3’UTR之间插入。为便于扩增进入全长CTV，通过引入沉默点突变和重叠延伸PCR消除p33ORF中的PstI位点。使用两个AMP、ASL和PTA的不同组合构建四个载体中的三个，即CTV-BASL-BYPTA-CP7-119、CTV-BASL-BYP10-CP7-131和CTV-BASL-BYPTA-CP10-120。第四个表达载体CTV-BRFP-BYGFP-CTMVCP-117的构建是插入受BYV、BYSV和CTV重复CP-CE控制的GFP、RFP和TMV CP。所有这些载体均浸润本生烟以监测系统性感染的发生。CTV-BASL-BYPTA-CP7-119能够有效地浸润本生烟植物。浸润载体CTV-BRFP-BYGFP-CTMVCP-117的植物全部叶片在手持UV下课件荧光。发现有突出的系统性感染之后，使用蔗糖梯度片浓缩CTV-BRFP-BYGFP-CTMVCP-117病毒体，以便接种柑橘，与载体CTV-BASL-BYPTA-CP7-119操作过程相似。
同时表达来自两个不同部位的三个外源基因：
构建两个载体表达来自CTV基因组中两个不同部位的三个外源基因：在CTV9RΔp33中构建一个表达载体CTV33-BGFP-GbFosC-BYbJunN-81，在全长CTV9R中构建另一个载体CTVΔ13-GbFosC-BYbJunN-CTMVCP-129。
构建载体表达来自CTV9RΔp33中两个不同位点的三个基因：
修饰CTV9RΔp33，在CPm与CP之间插入单一基因盒(GFP ORF，受BYV CP-CE的控制)、在p23与3’UTR之间插入一个双基因盒(bFosC ORF和其后的bJunN ORF，分别受GLRaV-2与BYSV CP-CE的控制)构建CTV33-BGFP-GbFosC-BYbJunN-81(图27)。将4中不同的沉默抑制子与CTV33-BGFP-GbFosC-BYbJunN-81的1:1混合液浸润本生烟叶。叶尖电镜照片显示形成病毒体，与CTV33-BGFP-BYGUS-GTMVCP-79、CTV33-Δ13-BGFP-BYbJunN-GbFosC-82相似。此外，浸润的叶片在手持UV光下发现强荧光。使用浸润叶片在70％蔗糖片上浓缩病毒体，以便感染柑橘幼苗。
构建载体表达CTV9R中两个不同位点的三个基因：
向CTV9R中插入一个双基因盒(bFos ORF与其后的bJunN ORF，分别受GLRaV-2与BYSV CP-CE的控制)替换p13，在p23于3’UTR之间插入一个基因盒(TMV CP ORF，受双重CP-CE的控制)，构建表达载体CTVΔ13-GbFosC-BYbJunN-CTMVCP-129(图21)。该载体浸润本生烟叶。在系统地感染本生烟叶之后，将浓缩病毒体使之能够接种柑橘类植物。
同时表达三个不同位点的四个外源基因：
为构建四基因载体，我们使用了CTV基因组中三个不同位点的四基因盒。在CPm与CP之间插入RFP ORF(受BYV CP-CE的控制)，用两个BiFC成分bFosC和bJunN替换p13基因，(分别受GLRaV-2和BYSV的控制)，在p23之后插入TMV ORF(受CTV双重CP-CE的控制)。用该四基因载体CTVΔ13-BRFP-GbFosC-BYbJunN-CTMVCP-118浸润本生烟叶以系统地感染植物。在系统地感染本生烟叶之后，将使用蔗糖梯度和蔗糖片浓缩病毒体使之能够接种柑橘类植物。
与实施例1-8相关的讨论
本研究发现CTV构建体极易在基因组3’部分的不同位点插入外源序列。我们构建并分析了大量可能的载体构建体，通过添加次基因组RNA、双顺反子mRNA或对融合蛋白的蛋白酶进行加工来表达外源基因。其中多数构建体可作为载体。此外，本文介绍的CTV构建体能够同时表达大量的多个外源蛋白或肽段。
总目的是开发天然CTV宿主柑橘中的高表达、稳定的载体。因此对12种能够中度至显著传播并表达外源蛋白的不同构建体感染的本生烟中病毒体进行浓缩，以接种柑橘。接种后6-60周阿雷檬能否感染阳性取决于病毒中插入体的长度和从本生烟叶中浓缩用于接种的病毒体数量。多数构建体感染柑橘后产生中等水平的报告基因。
使用多种方法表达来自CTV的外源基因。第一种方法是“添加基因”，包括添加或复制控制子元件，和增加ORF，产生次基因组RNA。“添加基因”方法最初应用于在TMV中通过复制CP次基因组启动子控制外源基因(Dawson et al.,1989；Donson et al.,1991；Shivprasad et al.,1999)。该方法的一个优点在于能够准确表达蛋白，在N末端和(或)C末端不增加可能影响生物学活性的氨基酸，表达水平相对较高。但该方法也存在一些必须注意的局限性。控制子元件复制产生同源性重组，引起目标基因的丢失(Chapman et al.,1992；Dawson et al.,1989)。尽管这使得TMV插入体不稳定，似乎基本不影响CTV的稳定性(Folimonov et al.,2007)。使用相关病毒的异源性控制子元件有助于稳定TMV的插入。然而，病毒复制酶复合体对异源性控制子元件的识别通常具有差异性(Folimonov et al.,2007；Shivprasad et al.,1999)。这一点可用于调控目标基因的表达水平(Shivprasad etal.,1999)。一个重要的考虑因素是病毒不同次基因组RNA之间存在竞争。对于TMV，外源基因与衣壳蛋白基因和移动基因竞争。似乎这三种RNA汇总的次基因组RNA产量具有一个最大水平。导致一种表达量增高的操作将引起其他RNA表达量下降。一个解决办法是减少衣壳蛋白的表达，以优化外源基因和移动基因的表达(Shivprasad et al.,1999；Girdishivelliet al.,2000)。然而，CTV次基因组mRNA似乎竞争力较弱(Folimonov et al.,2007；Ayllónet al.,2003)。
现有技术建立了一种在柑橘树中有效、稳定的CTV载体，能够表达CP与CPm之间的外源基因。该外源基因位于3’端的第6位点(Folimonov et al.,2007)。外源基因位点的选择是随机的。研究者继续进行载体设计，以尝试定义对CTV基因组操作的范围以产生外源蛋白或肽段。该病毒通过sg mRNA表达3’端的10个基因(Hilf et al.,1995)。CTV基因表达的一个原则是靠近3’端的基因转录量大于内部基因。例如，天然位点在3’端第10位点的p33基因转录量相对偏低，但移至靠近3’端之后转录量极高(Satyanarayana et al.,1999)。因此，越靠近3’端位点，外源基因的表达量越高于第1个载体中随机选择的位点6(Folimonovet al.,2007)。然而，根据其他病毒的分析结果，病毒基因组内只有某些位点能够耐受外源基因的插入。例如，对于TMV或苜蓿花叶病毒，CP与3’NTR之间的位点不能耐受基因插入(Dawson et al.,1989；Lehto and Dawson,1990；Sanchez-Navarro et al.,2001)。CTV中替换p13、在p13与p20之间插入和p23与3’NTR之间插入的几乎所有构建体均有活性。相反，发现该病毒不能耐受的插入点是在p20与p23之间。可能的原因是这种插入干扰了其他相邻基因的转录。
另一种在病毒载体中表达外源基因的方法包括框内融合目标基因的ORF与病毒基因ORF的N末端或C末端。可通过加工蛋白酶和两个蛋白之间的位点释放两种蛋白(Dolja etal.,1997；Gopinath et al.,2000)。该方法最初应用于Potyvirus属烟草蚀刻病毒(Doljaet al.,1992)。多蛋白融合方法的主要优点在于外源蛋白与病毒蛋白的表达比为1：1。主要局限性在于两种蛋白的N和(或)C末端会添加多余的氨基酸，可能影响蛋白的生物学活性。
构建了一系列载体，利用Potyvirus属HC-Pro或NIa蛋白酶能够对多蛋白进行转录后加工释放游离的GFP、蛋白酶和p23蛋白。这些载体能够系统地感染本生烟。这些构建体的系统运动慢于仅含有一个外源基因GFP ORF的表达载体。系统性运动缓慢和GFP的系统表达水平较低的部分原因可能是p23C末端多于的氨基酸降低了RNA沉默抑制活性，或扩增病毒RNA的能力，或蛋白酶的加工延缓了其活性。虽然这些构建体未产生最大量的外源性蛋白，但这些活性载体仍表达了大量GFP。
识别CTV基因组中能容纳外源性基因插入的位点之后，发明人设计新的方法构建病毒载体以表达多个基因。第一个方法需使用单一的控制子元件驱动多肽基因的转录。融合基因中包括GFP/Pro/GUS，大小为3127nts-3480nts。其他方法利用两个外源性CE同时产生两个外源性sg RNA。该方法能够在一个位点或两个不同位点灵活地插入两个串联基因。两种方法均有效。
整株植物中异源性蛋白的表达通常伴随着转基因植物的发展，需将外源性DNA插入质粒或核基因组中。质粒转基因仅在少数一年生作物中成功实现。核转基因所需时间和成功率因不同作物而异。某些植物不易转基因和后续的再生处理。该方法存在一些缺点，特别是对于多年生作物而言。例如柑橘幼苗期时间较长，再生后需评估种植特征的时间和有商业应用的时间均需延长。另一个主要的缺点是转基因局限于下一代植物。
发明人现在开发了多种不同的CTV载体，各有不同特点可在具体环境下提高效率。例如研究者使用“添加基因”载体能够促进CTV中小基因在p23基因3’端的表达，尽可能实现最大化表达。中等大小的基因在p13区域的表达效率更高。较大的基因很可能最好在CP于CPm之间插入，较少地干扰病毒次基因组RNA，从而更好地侵袭植物。为了表达小蛋白、肽段或RNA以致目标RNA沉默，病毒可以容纳3个或3个不同的基因。可选择不同的外源性sgRNA和蛋白酶加工组合。尽管可从其他病毒产生两种外源性蛋白，CTV因其稳定性仍有大量应用。原代载体持续产生GFP可达8年。
使用基于CTV的表达载体从开发至今已经经过很多演化。该载体最初是作为改善柑橘生长的实验室工具。该载体被设计用于表达可能转化柑橘的基因。异源性基因在柑橘中的效果，特别是对成熟组织或果实的效果可在直接转化结果出现之前通过病毒年获得，但柑橘产业的条件和需求已经被新出现的细菌性疾病黄龙病(HLB)所影响。这种疾病快速传播，具有显著的破坏力，威胁着柑橘产业的存货。最初CTV载体被用于识别有抗HLB细菌活性的抗微生物肽，以便转入柑橘体内。但该疾病播散速度过快，转基因植物不能够及时拯救柑橘产业。因CTV载体具有显著的稳定性，该载体目前被用于保护柑橘树和治疗病株，直至出现抗感染的转基因植物。CTV载体在对抗柑橘侵袭性疾病领域是一个有效的工具，这仅是病毒载体可应用于农业的一个案例。CTV载体等极稳定载体对多年生植物，特别是树木的应用具有良好的前景。很多树木能够存活100年甚至更久。在树木的生命周期中，科技在不断进步，疾病和虫害压力也在不断变化。为通过传统转基因方法改善树木，需要将目前田地中所有树木清除、重新终止。而使用病毒载体可向现有树木中添加新的基因。
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虽然以上描述了不同的实施例，但应当理解的是，以上实施例只是作为示范，而不具有限制性。根据本文和在不偏离本文的精神和范围的基础上可以对本发明揭示的主题进行多种改变。另外，正如任何一个申请所被期望和具有优势的一样，当一个特征只针对多种实施方式之一被揭示时，这一特征可以与其他实施方式的一个或多个其他特征相结合。
由此，本发明所提供的主题的宽度和范围不应当被任何以上清晰描述的实施例所局限。同时，本发明的范围应当根据权利要求书的范围进行限定。
本文中使用的词汇只是为了描述特别的实施例这一目的，而不是用于限定的目的。除非在文中清楚指出，在本文中使用的单数词“一”、“一个”和“这个”也被用来包括复数形式。另外，“包括”、“包含”、“有”、“具有”、“和”，或其变形词在具体实施方式和/或权利要求书中使用时，这些词汇都具有与“包括”一词类似的包含的含义。
除非另行限定，所有本文中使用的词汇(包括技术和科学名词)具有其被实施例所属领域技术人员所通常理解的相同的含义。应当进一步理解的是，那些被通常使用的字典所限定的词汇，其被解释的含义应当与其在相关技术背景中的含义相一致，并且除非在本文中明确限定，这些词汇不应当以理想化或过于正式的方式进行解释。
任何专利、专利申请、技术或科学文章、或其它参考文献所教授的内容在不与本发明不一致的前提下被全部包含在本发明之内。
Claims (52)
1.一个CTV病毒载体被构建成含有至少一个包含编码异源性多肽的多核苷酸基因盒，构建的CTV病毒载体中基因盒应位于CTV基因组区域p13-p20、p20-p23或p23-3’NTR。
2.如权利要求1中所述的CTV病毒载体，其中所述至少一个基因盒位于CTV基因组p13-p20。
3.如权利要求1中所述的CTV病毒载体，其中所述至少一个基因盒位于CTV基因组p20-p23。
4.如权利要求1中所述的CTV病毒载体，其中所述至少一个基因盒位于CTV基因组p23-3’NTR。
5.如权利要求1中所述的CTV病毒载体，其中所述至少一个基因盒进一步包括在所述编码异源性多肽的多核苷酸上游至少包含一个次基因组mRNA控制子元件。
6.一种植物包含至少一个转染有权利要求1中CTV病毒载体的细胞。
7.如权利要求6所述的植物，其中所述植物为树木。
8.如权利要求6所述的植物，其中所述植物为柑橘树。
9.一种感染树木来表达异源性多肽的方法，所述方法包括用CTV病毒载体转染树木的至少一个细胞，所述CTV病毒载体被构建成包含至少一个基因盒，所述基因盒包含编码异源性多肽的多核苷酸，所述CTV病毒载体被构建成所述基因盒位于CTV基因组的p13-p20、p20-p23或p23-3’NTR区域。
10.如权利要求9中所述的方法，其中所述树木为柑橘树。
11.一个CTV病毒载体被构建成含有一个包含编码异源性多肽的多核苷酸基因盒，所述CTV病毒载体被构建成所述基因盒被插入CTV p13基因位点。
12.如权利要求11中所述的CTV病毒载体，其中所述基因盒进一步包括一个次基因组mRNA控制子元件，位于编码异源性多肽的多核苷酸上游。
13.一种植物包含至少一个转染有权利要求11中CTV病毒载体的细胞。
14.如权利要求13所述的植物，其中所述植物为树木。
15.如权利要求13所述的植物，其中所述植物为柑橘树。
16.一种感染树木来表达异源性多肽的方法，所述方法包括用CTV病毒载体转染树木的至少一个细胞，所述CTV病毒载体被构建成包含至少一个基因盒，所述基因盒包含编码异源性多肽的多核苷酸，所述CTV病毒载体被构建成所述基因盒被插入CTV p13基因位点。
17.一个CTV病毒载体被构建成包含一个基因盒，所述基因盒包含编码异源性多肽的多核苷酸和与之相连的IRES序列。
18.如权利要求17所述的CTV病毒载体，其中所述基因盒与p13、p20或p23基因融合。
19.一种植物包含至少一个被权利要求17所述CTV病毒载体转染的细胞。
20.一种感染树木来表达异源性多肽的方法，所述方法包括用CTV病毒载体转染树木的至少一个细胞，所述CTV病毒载体被构建成包含至少一个基因盒，所述基因盒包含编码异源性多肽的多核苷酸和与之相连的IRES序列。
21.一个CTV病毒载体被构建成包含一个基因盒，所述基因盒包含编码第一异源性多肽的多核苷酸序列、剪切位点两端加工过的蛋白酶、和第二异源性多肽的多核苷酸序列。
22.如权利要求21所述的CTV病毒载体，其中所述蛋白酶位于所述第一异源性多肽和第二异源性多肽之间。
23.如权利要求21所述的CTV病毒载体，其中所述基因盒进一步包括一个次基因组mRNA控制子元件，位于编码第一异源性多肽的多核苷酸上游。
24.如权利要求21所述的CTV病毒载体，其中所述多核苷酸包括编码异源性多肽的序列。
25.如权利要求21所述的CTV病毒载体，其中所述多核苷酸进一步编码外源性蛋白序列和蛋白酶，并且蛋白酶识别位点在第一和第二异源性多肽序列之间。
26.如权利要求21所述的CTV病毒载体，其中所述基因盒被插入来替换一个内源性基因。
27.如权利要求25所述的CTV病毒载体，其中所述内源性基因为p13。
28.如权利要求21所述的CTV病毒载体，其中所述基因盒位于CTV基因组的p13-p20、p20-p23或p23-3’NTR区域。
29.一种植物包含至少一个被权利要求21所述CTV病毒载体转染的细胞。
30.一个CTV病毒载体被构建成包含一个基因盒，所述基因盒包含编码一个异源性多肽的多核苷酸序列和一个剪切位点两端与病毒蛋白相同阅读框融合的蛋白酶。
31.如权利要求29所述的CTV病毒载体，其中所述蛋白酶位于所述病毒蛋白和所述异源性多肽之间。
32.如权利要求29所述的CTV病毒载体，其中所述基因盒与一个内源性CTV基因融合使内源性基因的转录和所述多核苷酸序列的转录同时发生。
33.如权利要求31所述的CTV病毒载体，其中所述内源性基因为p13、p20或p23。
34.一种感染树木来表达异源性多肽的方法，所述方法包括用CTV病毒载体转染树木的至少一个细胞，所述CTV病毒载体被构建成包含至少一个基因盒，所述基因盒包含编码一个第一异源性多肽和一个第二异源性多肽的多核苷酸序列。
35.一个CTV病毒载体被构建成包含第一基因盒和第二基因盒，其中第一基因盒包含编码第一异源性多肽的多核苷酸序列和所述第一异源性序列上游的第一控制子元件；第二基因盒包含编码第二异源性多肽的多核苷酸序列和所述第二异源性序列上游的第二控制子元件。
36.如权利要求34所述的CTV病毒载体，其中所述第一和第二基因盒依序位于所述CTV病毒载体的相同部位。
37.如权利要求34所述的CTV病毒载体，其中所述第一和第二基因盒位于所述CTV病毒载体的两个分离的位点。
38.如权利要求35所述的CTV病毒载体，其中所述基因盒位于CTV病毒基因组的p13-p20、p20-p23或p23-3’NTR区域。
39.如权利要求36所述的CTV病毒载体，其中所述基因盒位于CTV病毒基因组的p13-p20、p20-p23或p23-3’NTR区域。
40.如权利要求36所述的CTV病毒载体，其中所述一个或两个基因盒被插入来替换一个内源性基因，并且所述第二基因盒的位点与第一基因盒的位点分离。
41.如权利要求39所述的CTV病毒载体，其中所述内源性基因为p13。
42.一种植物包含至少一个被权利要求34所述CTV病毒载体转染的细胞。
43.一种感染树木来表达异源性多肽的方法，所述方法包括用CTV病毒载体转染树木的至少一个细胞，所述CTV病毒载体被构建成包含第一基因盒和第二基因盒，其中第一基因盒包含编码第一异源性多肽的多核苷酸序列和所述第一异源性序列上游的第一控制子元件；第二基因盒包含编码第二异源性多肽的多核苷酸序列和所述第二异源性序列上游的第二控制子元件。
44.如权利要求1所述的载体，其中所述CTV病毒载体被构建成包含位于一个或多个位点的多个基因盒。
45.如权利要求43所述的载体，其中所述CTV病毒载体包含至少两个基因盒位于一个位点和至少一个基因盒位于一个不同位点。
46.如权利要求9所述的方法，其中所述CTV病毒载体被构建成包含位于一个或多个位点的多个基因盒。
47.如权利要求43所述的方法，其中所述CTV病毒载体包含至少两个基因盒位于一个位点和至少一个基因盒位于一个不同位点。
48.如权利要求34所述的载体，其进一步包括一个第三基因盒，所述第三基因盒包含编码第三异源性多肽的多核苷酸序列和所述第三异源性序列上游的第三控制子元件。
49.如权利要求47所述的载体，其进一步包括一个第四基因盒，所述第四基因盒包含编码第四异源性多肽的多核苷酸序列和所述第四异源性序列上游的第四控制子元件。
50.如权利要求47所述的载体，其中所述第三基因盒在所述CTV载体上的位点与第一和第二基因盒相同或不同。
51.如权利要求48所述的载体，其中所述第三和第四基因盒在所述CTV病毒载体上同一位点按序排列。
52.如权利要求48所述的CTV病毒载体，其中所述第三和第四基因盒位于所述CTV病毒载体上两个分离的位点。
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