CN102089433A - 植物病毒表达载体及其用于在植物基因组中产生遗传型变异的用途 - Google Patents

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Abstract

公开了在植物基因组中产生遗传型变异的方法。该方法包括将至少一种病毒表达载体引入植物中，所述的病毒表达载体编码至少一种包含DNA结合结构域、核酸酶以及定位至含DNA细胞器的定位信号的嵌合核酸酶，其中该DNA结合结构域介导该核酸酶特异性地靶向植物基因组，由此在植物基因组中产生遗传型变异。

Description

植物病毒表达载体及其用于在植物基因组中产生遗传型变异的用途
发明的领域和背景
本发明在其一些实施方案中涉及植物病毒表达载体，并且更特别但非排它地，涉及该病毒表达载体用于在植物基因组中产生遗传型变异的用途。
作物的遗传修饰和改进以及新品种的保护是现代农业的基础。在过去的若干年中，从各种大基因组测序工程中获得了巨量的数据，这使得在农业转基因技术中产生显著的进步。此类技术包括植物基因组序列的基因表达、基因修饰、位点特异性基因诱变和基因打靶，这发展了基础植物研究模式并且可直接用于农业上重要的植物物种的遗传改良和保护。
将源自土壤杆菌(Agrobacterium)的外源DNA分子(例如，T-DNA)整合至植物基因组中，整合入可通过稀有切割限制性酶产生的天然双链断裂处(DSB)。这些DSB可通过植物非同源末端接合(NHEJ)蛋白识别并修复，并且导致了外源DNA频繁地整合到这些随机位点中[Salomon等，EMBO J(1998)17：6086-6095；Tzfira等，Plant Physiol(2003)133：1011-1023，Tzfira等，Trends Genet(2004)20：375-383]。DSB还可以导致经改进的在植物细胞中基于同源重组(HR)的基因打靶[Puchta等，Proc Natl Acad Sci USA(1996)93：5055-5060]。
在锌指核酸酶(ZFN)作为用于基因组修饰的新工具的领域的最新进展给植物基因组中DSB的位点特异性诱导和用于植物物种基因打靶及植物保护的基于NHEJ的方法的发展带来了新的希望。ZFN是合成的限制性酶，可将其特异地设计为结合并切割dsDNA序列的几乎任意的长片段(参见图1)。ZFN显示适于应用非病毒载体在植物物种中位点特异性地诱导基因组DSB[Lloyd等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2005)102：2232-2237；Tovkach等，The Plant Journal(2009)57，747-757]。在人类[Moehle等，Proc Natl Acad Sci USA(2007)104：3055-3060]和昆虫基因组[Beumer等，Genetics(2006)172：2391-2403]中也显示了类似的效果。
植物病毒作为载体以在植物中引入并表达非病毒基因的用途已得到了很好的证实[例如，Donson等，Proc Natl Acad Sci U S A.(1991)88：7204-8；Chapman等，Plant J.(1992)2：549-57；Dolja等，Virology(1998)252：269-74]。用经修饰的病毒感染植物比再生稳定转化的植物(如上所述)更简单且更快，因为植物病毒通常很小(3000至10,000核苷酸之间)，容易操作，具有进入植物细胞的固有能力，导致异源基因的迅速表达并且将增殖以产生高拷贝量的目标基因。已改造了病毒载体以用于递送遗传材料并在植物中表达重组蛋白[例如，Pogue，Annu.Rev.Phytopathol.(2002)40：45-74；Gleba，等，Curr.Opin.Plant Biol.(2004)7：182-188；Dolja等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：10208-10212；RNA病毒载体的US专利号5316931和US专利号5811653]。病毒表达系统被认为是瞬时表达系统，因为病毒载体不整合至宿主基因组中，然而，取决于使用何种病毒，病毒复制和基因表达可维持很长的时间(长达数周或数月)。
至今，没有记载或建议病毒载体用于在植物基因组中引入DSB的用途。
相关技术
美国专利7,229,829号公开了携带用于递送至植物中的异源核酸序列的TRV载体(TRV-RNA1和TRV-RNA2)，其用于转化植物和植物细胞。具体地，美国专利7,229,829号教导了诱导基因沉默的病毒(VIGS)的载体，包括设计用于抑制宿主植物基因表达(例如，用于敲除基因表达而不需要遗传转化该植物的反义转录物)的载体，或设计用于表达异源核酸(例如，介导基因沉默或基因抑制的核酸)的载体。
美国公开号20050026157和20070134796公开了用于靶向切割细胞染色质和用于靶向改变(例如，插入)细胞核苷酸序列的组合物和方法。为靶向特异性基因组位点，构建了包含锌指结构域和切割结构域的融合蛋白(即，锌指蛋白(ZFP))。此外，美国公开号20070134796教导了包含ZFP的载体(例如，细菌载体，诸如质粒载体，以及病毒载体诸如腺病毒和逆转录病毒载体)。
PCT公开WO07139982号公开了用于应用锌指核酸酶(ZFN)失活人类基因(例如，CCR5基因)的方法和组合物。该ZFN包含锌指蛋白(可包括1、2、3、4、5、6或更多锌指)和切割结构域或切割半结构域(即，核酸酶结构域)。此外，PCT公开WO07139982号教导了包含ZFN和/或供体序列的载体，用于靶向整合至靶基因中。
美国专利号7,309,605和6,610,545公开了编码酶I-SceI(在其识别位点内切割DNA的双链内切核酸酶)的核苷酸序列。可将这些序列整合至克隆和表达载体(诸如质粒、噬菌体或粘粒载体)中，并且可用于转化细胞系和转基因生物(例如，哺乳动物、植物)。所公开的载体可用于基因作图、定点遗传重组以及用于体内基因定点插入。
发明概述
根据本发明某些实施方案的方面，提供了在植物基因组中产生遗传型变异的方法，该方法包括将至少一种病毒表达载体引入植物中，所述的病毒表达载体编码至少一种包含DNA结合结构域、核酸酶以及定位至含DNA细胞器的定位信号的嵌合核酸酶，其中该DNA结合结构域介导该核酸酶特异性地靶向植物基因组，由此在植物基因组中产生遗传型变异。
根据本发明某些实施方案的方面，提供了治疗病原体的植物感染的方法，该方法包括将至少一种病毒表达载体引入该植物中，所述的病毒表达载体编码至少一种包含DNA结合结构域和核酸酶的嵌合核酸酶，其中该DNA结合结构域介导该核酸酶靶向病原体基因组，由此预防或治疗病原体的植物感染。
根据本发明某些实施方案的方面，提供了标记植物基因组的方法，该方法包括将至少一种病毒表达载体引入植物中，所述的病毒表达载体编码至少一种包含DNA结合结构域、核酸酶以及定位至含DNA细胞器的定位信号的嵌合核酸酶，其中该DNA结合结构域介导该核酸酶特异性地靶向植物基因组，由此标记植物基因组。
根据本发明某些实施方案的方面，提供了在植物中产生雄性不育的方法，该方法包括在该植物中上调与雄性不育相关的线粒体或叶绿体结构或功能基因，其通过将至少一种编码至少一种包含DNA结合结构域、核酸酶以及线粒体或叶绿体定位信号的嵌合核酸酶的病毒表达载体，和包含至少一种当靶向至线粒体或叶绿体基因组时可上调线粒体或叶绿体结构或功能基因的异源核酸的核酸表达构建物引入该植物中，其中该DNA结合结构域介导该异源核酸序列靶向线粒体或叶绿体基因组中，由此在植物中产生雄性不育。
根据本发明某些实施方案的方面，提供了产生除草剂抗性植物的方法，该方法包括将至少一种病毒表达载体引入植物中，所述的病毒表达载体编码至少一种包含DNA结合结构域、核酸酶以及叶绿体定位信号的嵌合核酸酶，其中该DNA结合结构域介导该核酸酶靶向赋予对除草剂敏感性的基因，由此产生除草剂抗性植物。
根据本发明某些实施方案的方面，提供了植物病毒表达载体，其包含编码至少一种嵌合核酸酶的核酸序列，其中所述的嵌合核酸酶包含DNA结合结构域、核酸酶以及定位至含DNA细胞器的定位信号。
根据本发明某些实施方案的方面，提供了基于pTRV的表达载体，其包含编码至少两种异源多肽序列的核酸序列。
根据本发明某些实施方案的方面，提供了包含至少一种嵌合核酸酶的植物细胞，其中该嵌合核酸酶包含DNA结合结构域、核酸酶以及定位至含DNA细胞器的定位信号，并且其中该嵌合核酸酶诱导靶序列的切割。
根据本发明某些实施方案的方面，提供了包含权利要求6或7的植物病毒表达载体的转基因植物。
根据本发明某些实施方案的方面，提供了产生转基因植物的方法，该方法包括：将至少一种病毒表达载体引入一种或更多种植物细胞中，其中所述的病毒表达载体编码至少一种包含DNA结合结构域、核酸酶以及定位至含DNA细胞器的定位信号的嵌合核酸酶。
根据本发明某些实施方案的方面，提供了包含如SEQ ID NO：31、32、33、34、70、72、74、76、84、86或88所示核酸序列的分离多核苷酸。
根据本发明某些实施方案的方面，提供了包含如SEQ ID NO：35、36、37、38、71、73、75、77、85、87或89所示氨基酸序列的分离多肽。
根据本发明的某些实施方案，产生遗传型变异是瞬时的。
根据本发明的某些实施方案，该遗传型变异包括核苷酸插入、核苷酸缺失或其组合。
根据本发明的某些实施方案，所述标记包括核苷酸插入、核苷酸缺失或其组合。
根据本发明的某些实施方案，所述病毒表达载体包括烟草脆裂病毒(TRV)表达载体。
根据本发明的某些实施方案，所述TRV表达载体包括基于pTRV2的表达载体。
根据本发明的某些实施方案，至少一种病毒表达载体编码两种嵌合核酸酶。
根据本发明的某些实施方案，所述至少一种病毒表达载体包含两种病毒表达载体。
根据本发明的某些实施方案，所述两种病毒表达载体伴随地引入植物中。
根据本发明的某些实施方案，通过土壤杆菌属实现引入植物。
根据本发明的某些实施方案，土壤杆菌属通过注射实现。
根据本发明的某些实施方案，土壤杆菌属的引入通过叶片渗入实现。
根据本发明的某些实施方案，通过病毒粒子感染实现引入植物。
根据本发明的某些实施方案，所述至少一种嵌合核酸酶包含两种嵌合核酸酶。
根据本发明的某些实施方案，所述植物病毒表达载体或转基因植物还包含编码异源多肽的第二核酸序列。
根据本发明的某些实施方案，所述植物病毒表达载体或转基因植物包含pTRV骨架。
根据本发明的某些实施方案，所述pTRV是pTRV1(GeneBank登录号：AF406990)。
根据本发明的某些实施方案，所述pTRV是pTRV2(GeneBank登录号：AF406991)。
根据本发明的某些实施方案，所述核酸序列缺乏2b序列(SEQ ID NO：43)。
根据本发明的某些实施方案，所述核酸序列包含Ω增强子(SEQ ID NO：44)。
根据本发明的某些实施方案，所述核酸序列包含两个分离的亚基因组启动子(sgP)，用于调节至少两种异源多肽的转录。
根据本发明的某些实施方案，所述至少两种异源多肽序列由编码切割结构域的核酸序列分离开。
根据本发明的某些实施方案，所述切割结构域包含T2A-样蛋白序列(SEQ ID NO：40)。
根据本发明的某些实施方案，所述至少两种异源多肽序列的核酸序列如SEQ ID NOs：84、86或88所示。
根据本发明的某些实施方案，所述至少两种异源多肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NOs：85、87或89所示。
根据本发明的某些实施方案，所述至少两种异源多肽序列编码植物基因。
根据本发明的某些实施方案，所述至少两种异源多肽序列包含嵌合蛋白，其中嵌合蛋白的每一个包含DNA结合结构域、核酸酶和定位至含DNA细胞器的定位信号。
根据本发明的某些实施方案，所述定位信号包含核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚单位(RSSU)序列(SEQ ID NO：138)。
根据本发明的某些实施方案，所述定位信号包含ATP酶β亚单位(ATP-β)序列(SEQ ID NO：139)。
根据本发明的某些实施方案，所述DNA结合结构域结合9核苷酸序列。
根据本发明的某些实施方案，所述DNA结合结构域包含至少一个锌指结构域。
根据本发明的某些实施方案，所述锌指结构域包含3个锌指结构域。
根据本发明的某些实施方案，所述核酸酶包含II型限制性内切核酸酶的切割结构域。
根据本发明的某些实施方案，所述II型限制性内切核酸酶是FokI限制性内切核酸酶。
根据本发明的某些实施方案，所述植物包括矮牵牛(Petunia hybrida)。
根据本发明的某些实施方案，所述植物包括烟草(Nicotiana tabacum)。
根据本发明的某些实施方案，所述植物选自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、蒿属(Artemisia sp.)、青蒿(Artemisia annua)、甜菜(Beta vulgaris)、马铃薯(Solanum tuberosum)、Solanum pimpinellifolium、番茄(Solanum lycopersicum)、茄子(Solanum melongena)、菠菜(Spinacia oleracea)、豌豆(Pisum sativum)、甜椒(Capsicum annuum)、黄瓜(Cucumis sativus)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、陆地棉(Gossypium hirsutum)cv.Siv’on、稻(Oryza sativa)和Oryza glaberrima。
根据本发明的某些实施方案，所述细胞是分生组织细胞。
根据本发明的某些实施方案，所述含DNA细胞器选自细胞核、叶绿体和线粒体。
根据本发明的某些实施方案，所述核酸酶特异靶向至矮牵牛(Petunia hybrida)的基因组是指靶向至矮牵牛的八氢番茄红素去饱和酶(PDS)或黄烷酮3β羟化酶(FHT)。
根据本发明的某些实施方案，线粒体定位信号包含ATP酶β亚单位(ATP-β)(SEQ ID NO：139)。
根据本发明的某些实施方案，叶绿体定位信号包含核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚单位(Rssu)(SEQ ID NO：138)。
除非另外定义，本文所使用的所有的技术和/或科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所描述的类似或等价的方法和材料可用于实现或测试本发明的实施方案，以下描述了示范性的方法和/或材料。当存在矛盾时，以本专利说明书，包括定义，为准。此外，材料、方法和实施例仅仅是描述性的，并且不意图作为必要的限定。
附图简述
本文参考附图仅以示例的方式描述了本发明的一些实施方案。现详细地特别参考附图，但强调显示的具体细节仅仅是以示范的方式，并且为了说明讨论本发明实施方案的目的。在这点上，说明书与附图一起使得本领域技术人员显而易见本发明实施方案可如何实施。
在附图中：
图1是锌指核酸酶(ZFN)作为用于诱导基因组双链断裂(DSB)的工具的示意图。图1A描述了由合成的DNA识别结构域组成的ZFN嵌合基因的结构，所述结构域由与非特异性DNA限制性酶(通常是FokI内切核酸酶)融合的三个C2H2锌指组成；图1B描述了定制的ZFN基因，其中每一个指识别三-核苷酸序列并且可能设计为识别任意9核苷酸的组合(通过GGGGAAGAA靶序列，SEQ ID NO：42例证)。由于FokI作为二聚体起作用，应用两组ZFN结合靶DNA，其产生18个核苷酸的独特组合；图1C描述了ZFN与靶DNA的结合；图1D描述了通过FokI内切核酸酶结构域消化DNA并产生双链断裂(DSB)。图1E描述了通过非同源末端接合(NHEJ)蛋白修复DSB，其导致在修复位点的缺失或插入突变。
图2A显示了用于自切割肽的Thosea asigna病毒序列(Tav-T2A，SEQ ID NO：51)和根据矮牵牛(Petunia)的密码子使用修饰的序列(pTRV-T2A，SEQ ID NO：52)之间的序列比对。
图2B显示了P1-25矮牵牛RB随机DNA片段(SEQ ID NO：8)。
图3显示了P1-36矮牵牛RB随机DNA片段(SEQ ID NO：9)。
图4是根据本发明教导构建的ZFN结构示意图。该ZFN构建物包含细胞核定位信号(NLS)、锌指DNA结合结构域和来自FokI的DNA核酸酶结构域。
图5A-D显示了NLS-P1-25-ZFN1、NLS-P1-25-ZFN2、NLS-P1-36-ZFN1和NLS-P1-36-ZFN2的序列。该序列是全嵌合体：NLS、ZFN和FokI(d-结构域)。细胞核定位信号(NLS)的序列以小写字母描述；核酸酶(FokI-结构域d)第一个密码子和终止密码子用粗体显示。图5A显示了NLS-P1-25-ZFN1(SEQ ID NO：31)的序列；图5B显示了NLS-P1-25-ZFN2(SEQ ID NO：32)的序列；图5C显示了NLS-P1-36-ZFN1(SEQ ID NO：33)序列；以及图5D显示了NLS-P1-36-ZFN2(SEQ ID NO：34)的序列。
图5E是显示了原始pET28载体(SEQ ID NO：39，可从Novagen商购)和经修饰的pET28载体(SEQ ID NO：49)pET28c.SX的示意图，其中所述的pET28c.SX包含MCS的修饰。为构建pET28c-SX，通过用SalI和XhoI消化从pET28c的MSC切除了核苷酸179至158(由粗体显示)。
图6A-D是pTRV2(GenBank登录号AF406991)及其修饰体的示意图谱。图6A是完整pTRV2表达载体示意图；图6B描述了2b 5’CDS片段的移除；图6C描述了添加TMV的5’UTR(Ω)；以及图6D描述了添加来自PEBV的sgP-CP。
图6E是pTRV1一部分的示意图，其显示了RNA1(GenBank登录号AF406990)。
图7A-E是说明了用pTRV2-GUS和pTRV2-Δ2b-GUS接种的矮牵牛植物分生组织中GUS表达的图片。图7A-B描述了在用该载体接种茎7天后的来自矮牵牛植物的分生组织；以及图7C-D描述了在用该载体接种茎37天后的来自矮牵牛植物的分生组织。用pTRV2-GUS接种的植物显示于图7A和7C中。用pTRV2-Δ2b-GUS接种的植物显示于图7B和7D中。图7E显示了在用pTRV2-Δ2b-GUS接种6个月后，体外繁殖的矮牵牛植物中的GUS染色。
图8A-G是说明了在用基于pTRV2的载体接种后各种植物中标记基因表达的图。图8A描述了用pTRV2-Δ2b-GUS接种的辣椒植物(甜椒(Capsicum annuum)，Endra-1750)的GUS染色(接种24天后)；图8B描述了用pTRV2-Δ2b-GFP接种的的辣椒植物(甜椒(Capsicum annuum)，Endra-1750)的GFP染色(接种41天后)；图8C描述了用pTRV2-GUS接种的拟南芥植物的GUS染色(接种后13和30天)；图8D描述了用pTRV2-Δ2b-ΩGus接种的番茄植物(Solanum pimpinellifolium La121)的GUS染色(接种14天后)；图8E描述了用pTRV2-Δ2b-GFP接种的本氏烟(Nicotiana benthamiana)植物的GFP染色(接种31天后)；图8F描述了用pTRV2-35SΩGUS接种的本氏烟植物的GUS染色(接种44天后)；图8G描述了用pTRV2-Δ2b-PAP接种的本氏烟的色素形成(接种76天后)。
图9A-B是说明了与pTRV2-Δ2b-GUS(图9B)相比较的用pTRV2-Δ2b-ΩGUS(图9A)接种矮牵牛植物51天后GUS染色的图。注意，箭头指向分生组织区域。
图10A-C是说明了在本氏烟(N.benthamiana)植物分生组织中共表达两个基因的图。图10A描述了用pTRV2-Δ2b-sgP-GFP接种的植物。在用pTRV2-Δ2b-sgP-GFP接种17天后评估GFP染色；图10B-C描述了用pTRV2-Δ2b-GUS和pTRV2-Δ2b-GFP共接种的植物。在接种17天后评估GFP染色(图10B)，然后在相同的组织样本上评估GUS染色(图10C)。
图11A-F是说明了在不同植物的细胞中由病毒介导的基因表达(DsRed)的图。用pTRV1和pTRV2-Δ2b-sgP-DsRed接种植物，并且应用共聚焦激光扫描显微镜术评估荧光。上图(图11A、C、E)显示了细胞叶绿素自发荧光，以及下图(图11B、D、F)显示了同一细胞中的DsRed荧光。在488nm激发(Ex)和超过650nm发射(Em)处评估自发荧光，在ex 545nm和585-615nm的em处评估DsRed。
图12A-H是说明了在用pTRV1和pTRV2-Δ2b-sgP-DsRed接种后，不同植物中长期基因表达(DsRed)的图。应用荧光立体显微镜获得图片。在植物的包括根(图12D、F)在内的不同部分均可看到DsRed荧光(图12A、C、D、G)。下图(图12B、E、F、H)显示了在亮视野中获得的(相同的)图。注意，用TRV病毒粒子接种本氏烟，以及通过土壤杆菌渗入接种烟草(N.tabaccum)和矮牵牛(Petunia hybrida)。
图13A-K是说明了用于在各种植物中表达外源基因的TRV2载体适用性的图。在用TRV载体接种后的属于不同科的各种植物中证实了标记基因GUS、GFP和DsRed的表达：用pTRV-Δ2b-GUS接种甜菜(图13E)(在接种20天后GUS染色样本)；用pTRV-Δ2b-sgP-Rssu-EGFP  接种茄子(Solanum melongena)(图13F-G)(接种5天后评估)；用pTRV-Δ2b-sgP-DsRed接种黄瓜(Cucumis sativus)(图13A-B)、Gossypium hirsutum cv.Siv’on(图13H-I)和甘蓝型油菜(Brassica napus)(图13J-K)(分别在接种5、7和16天后评估)。还记录了亮视野图片。用pTRV-Δ2b-GUS(图13C，接种20天后GUS染色样本)和pTRV-Δ2b-sgP-DsRed(图13D，接种12天后评估)接种菠菜(Spinacia oleracea)(图13C-D)。所有图片均用荧光立体显微镜获得。
图14A-C是说明了通过TRV病毒载体在玉米变种(Zea mays Var)Royalty胚芽鞘中表达DsRed2的图。用含有稀释的病毒粒子的汁液接种种子，其中所述的病毒粒子从用pTRV1和pTRV2-Δ2b-sgP-DsRed土壤杆菌渗入的矮牵牛中提取得到。在接种后(dpi)16天评估DsRed。可见光(图14A)、DsRed(图14B)和合并的(图14C)。
图15A-G是说明了在用pTRV2-sgP-Rssu-EGFP感染后的矮牵牛和烟草中EGFP叶绿体靶向表达的图。用pTRV2-sgP-Rssu-EGFP接种烟草(N.Tabacuum)cv Samsung和矮牵牛(Petunia hybrida)CV.RB，并且在接种后约9天分析叶绿体中的EGFP的表达。叶绿素的自发荧光(图15A、E)：在488nm激发(ex)处评估，并且在超过650nm处评估发射(em)。通过在488nm处的ex和505-530nm处的em检测EGFP(图15B、F)。合并信号(图15D和G，粉红色和绿色叠加产生黄色)。插图(图15C)显示通过荧光立体显微镜显现表达EGFP的组织。
图16A-K是说明了在用pTRV2-sgP-ATPβ-EGFP感染后的矮牵牛中EGFP线粒体靶向表达的图。用pTRV2-sgP-ATPβ-EGFP接种矮牵牛(Petunia hybrida)CV.RB，并且在接种后约5天分析线粒体中的EGFP表达。在ex 488和超过650nm的em处评估自发荧光(图16A)。通过在ex 488和505-530nm处的em评估EGFP(图16B)。从表达线粒体靶向EGFP的矮牵牛RB中制备原生质体(图16E-K)，用MitoTracker染色并在ex 545nm和585-615nm的em评估。插图(图16G)显示通过荧光立体显微镜显现表达EGFP的组织。
图17A-D是描述了在不同的细胞区室共表达标记基因的图。在烟草(N.tabacum)cv.Xanthi叶片细胞的细胞质中表达DsRed，以及在叶绿体中表达GFP。用pTRV1和pTRV2-Δ2b-sgP-DsRed以及pTRV2-Δ2b-sgP-Rssu-EGFP共感染植物。应用ex 488nm和超过650nm的em评估自发荧光(图17A)，应用ex 488nm和505-530nm的em评估GFP(图17B)，应用ex 545nm和585-615nm的em评估DsRed(图17C)，合并图(图17D)描述了所有三个滤光片的合并(合并信号)。
图18A-L是描述了应用pTRV2在不同植物中共表达DsRed和EGFP的图，其中所述的pTRV2应用两个串联的、由T2A分开的报告基因构建。用pTRV1和pTRV2-Δ2b-sgP-DsRed-T2A-NLS-EGFP接种植物(矮牵牛、烟草和本氏烟)。应用共聚焦激光扫描显微镜术评估荧光。显示了细胞的叶绿素自发荧光(图18A、E、I)、EGFP(图18B、F、J)和DsRed(图18C、G、K)和合并信号(图18D、H、L)。在ex 488nm和超过650nm的em处评估自发荧光，在ex 488nm和505-530nm的em处评估EGFP，在ex 545nm和585-615nm的em处评估DsRed2。
图19A-J是描述了应用pTRV2在不同植物中共表达DsRed和GFP的图，其中所述的pTRV2应用串联的、由分开的双亚基因组启动子驱动的两个报告基因构建。用pTRV1和pTRV2-Δ2b-sgP-GFP-sgP-DsRed接种植物(烟草和本氏烟)。应用共聚焦激光扫描显微镜术评估荧光。显示了细胞的叶绿素自发荧光(图19A、E)、GFP(图19B、F)和DsRed(图19C、G)。图19D描述了亮视野图片(对于烟草)，以及图19H描述了合并信号图(对于本氏烟)。图19I-J是通过立体显微镜获得的经接种的本氏烟组织(3dpi)的图片。在ex 488nm和超过650nm的em处评估自发荧光，在ex 488nm和505-530nm的em处评估GFP，在ex 545nm和585-615nm的em处评估DsRed2。
图20是描述了通过特异性ZFN消化携带人工靶位点P1-25-1、P1-25-2、P1-36-1和P1-36-2的PCR片段(分别是P25-TS1、P25-TS2、P36-TS1、P36-TS2)的图。使携带有回文结构样靶序列的PCR片段(ca.900bp)与25-ZFN-1、25-ZFN-2或36-ZFN-1、36-ZFN-2温育，并通过琼脂糖凝胶分离消化产物。注意，TS(靶位点)是回文结构样的。
图21是描述了用36-ZFN1和36-ZFN2消化来自pBS-PI-36的NcoI/BamHI(740bp)片段的图，其中所述的片段携带靶P1-36序列。
图22是描述了通过ZFN混合物(36-ZFN 1和2)消化携带PI-36的质粒pBS(pBS-PI-36)的图。通过箭头标出了预期大小(515bp)的片段。
图23是描述了携带有PDS1或PDS2回文位点的质粒的消化图。用特异ZFN(PDS-ZFN1和PDS-ZFN2)和AgeI切割测试回文位点，其产生约950bp的片段，如预期的那样。每一列上面列出的体积是指所使用的含有粗提取物的酶的量。注意，TS(靶位点)是回文结构样的。
图24A-B是描述了在用pTRV2-Δ2b-sgP-CP-PEBV接种的矮牵牛植物中表达DsRFP(图24B)和GFP(图24A)的图，其中所述的pTRV2-Δ2b-sgP-CP-PEBV携带有通过T2A分开的DsRFP和GFP。图片描述了用该载体接种茎10天后来自矮牵牛植物的叶组织。
图25A-B显示了突变的uidA基因序列的N端。图25A描述了含有QEQ-ZFN的靶位点(粗体)插入以及间隔子(其具有终止密码子(红色))的uidA基因序列。图25B描述了由QEQ-ZFN形成的双链断裂的错误修复是如何可能导致终止密码子消除并重建uidA基因的。
图26A-J是描述了in planta uidA的基于TRV的修复的图。用pTRV1和pTRV2-Δ2b-sgP-QEQ-ZFN体内或体外接种携带有突变uidA的转基因矮牵牛和烟草植物。在土壤杆菌渗入或用病毒粒子接种后的不同时间，在植物的各个部分评估GUS活性，包括接种后发育的组织。图26A描述了在体外土壤杆菌接种12天后评估GUS表达的突变uidA转基因矮牵牛(Petunia hybrida)系65。图26B描述了在体外土壤杆菌接种22天后评估GUS表达的突变uidA转基因烟草(Nicotiana tobaccum)系3。图26C描述了在体外土壤杆菌接种11天后评估GUS表达的突变uidA转基因矮牵牛(Petunia hybrida)系I。图26D描述了接种50天后评估GUS表达的突变uidA转基因烟草(Nicotiana tobaccum)系3。图26E描述了在体外土壤杆菌接种17天后评估GUS表达的突变uidA转基因矮牵牛(Petunia hybrida)系N。图26F描述了用病毒粒子体外接种的突变uidA转基因矮牵牛(Petunia hybrida)系I，用于在接种15天后进行GUS表达的评估。图26G描述了接种后29天评估的用0.08OD体外土壤杆菌接种的突变uidA转基因矮牵牛(Petunia hybrida)系I。图26H描述了接种后29天评估的用0.8OD体外土壤杆菌接种的突变uidA转基因矮牵牛(Petunia hybrida)系I。图26I描述了突变uidA转基因烟草(Nicotiana tobaccum)系11，没有用TRV处理，测试GUS；以及图26J描述了在体外土壤杆菌接种后评估GUS表达的突变uidA转基因矮牵牛(Petunia hybrida)系I原基再生。
图27显示了突变uidA(GUS)中20个突变序列(SEQ ID NOs：96-116)的比对，其由转基因烟草(N.tabacum)CV Samsung(N_t)以及矮牵牛(Petunia hybrida)(Pet)植物的GUS终止密码子中的DdeI位点破坏来识别。注意，结果描述了插入(1或2个核苷酸)或缺失(少于或等于49个核苷酸)。GUS活性的恢复可以归因于Pet30的突变。
图28显示了来自矮牵牛RB的八氢番茄红素去饱和酶(PDS)外显子序列(GenBank登录号AY593974.1，SEQ ID NO：131)。这一序列通过再测序得以确定(由大写字母显示)。突出显示的序列是由本发明(SEQ ID NOs：70和72)产生的PDS-ZFN(SEQ ID NOs：71和73)的靶位点(PDS-ZFN1靶位点-SEQ ID NO 140和PDS-ZFN2靶位点-SEQ ID NO：141)。SEQ ID NO：132描述了与PDS-ZFN2结合的互补链序列的短片段。MfeI的识别位点由下划线标出。
图28B显示了在用pTRV1和pTRV2-Δ2b-sgP-PDS-ZFN1-T2A-PDS-ZFN2载体接种的矮牵牛(Petunia hybrida)植物中PDS核酸序列(SEQ ID NO：119-128)的改变。将突变体与所测试的矮牵牛植物(PDS-WT、Y10和G35)中的天然PDS序列相比较。TS1(GGAGATGCA，SEQ ID NO：135)和TS2(CACTTCAAT，SEQ ID NO：136)表示PDS基因中ZFN的结合位点。MfeI位点(CAATTG，SEQ ID NO：137)作为选择工具以分离ZFN介导的PDS突变体。
图29显示了来自矮牵牛(Petunia hybrida)cv.RB的黄烷酮3β羟化酶(FHT)外显子序列(GenBank登录号AF022142.1，SEQ ID NO：133)。该序列通过再测序确定。突出显示的序列(FHT-ZFN1靶位点-SEQ ID NO 142和FHT-ZFN2靶位点-SEQ ID NO：143)用作通过本发明产生的FHT-ZFN(SEQ ID NO：74和76)的靶位点。用下划线标出了EcoNI的识别位点。SEQ ID NO：134描述了与FHT-ZFN2结合的互补链序列的短片段。
图30显示了含有2b和PEBV-CP亚基因组启动子(sgP)区域(SEQ ID NO：79)的pTRV2的序列。为了比较，将缺乏来自2b-sgP的40个核苷酸的序列(pTRV2-Δ2b-Δ2bsgP-sgP)显示于上行(SEQ ID NO：78)。核苷酸1至72-CP基因的3’、核苷酸73至237-2b的sgP、核苷酸238至282-MCS、核酸283至466-来自PEBV的CP的sgP。核苷酸206至237-从2b sgP的3’缺失。
图31A显示了NLS-PDS-ZFN1的序列(SEQ ID NO 70)。该序列是完全嵌合的：NLS、ZFN和FokI(d-结构域)。细胞核定位信号(NLS)序列用小写字母显示；核酸酶(FokI-结构域d)首密码子和终止密码子用粗体描述。
图31B显示了NLS-PDS-ZFN2的序列(SEQ ID NO 72)。该序列是完全嵌合的：NLS、ZFN和FokI(d-结构域)。细胞核定位信号(NLS)序列用小写字母显示；核酸酶(FokI-结构域d)首密码子和终止密码子用粗体描述。
图32A显示了NLS-FHT-ZFN1的序列(SEQ ID NO 74)。该序列是完全嵌合的：NLS、ZFN和FokI(d-结构域)。细胞核定位信号(NLS)序列用小写字母显示；核酸酶(FokI-结构域d)首密码子和终止密码子用粗体描述。
图32B显示了NLS-FHT-ZFN2的序列(SEQ ID NO 76)。该序列是完全嵌合的：NLS、ZFN和FokI(d-结构域)。细胞核定位信号(NLS)序列用小写字母显示；核酸酶(FokI-结构域d)首密码子和终止密码子用粗体描述。
图33显示了pTRV2-Δ2b-sgP-QEQ-ZFN(SEQ ID NO：82)的图示。
图34显示了pTRV2载体的一部分图示，其携带有与T2A序列融合的基因特异性ZFN(显示了PDS用于阐释)，在两个亚基因组(2b-sgP和PEBV-CP-sgP)启动子的下游。
发明特定实施方案描述
本发明在其一些实施方案中涉及植物病毒表达载体，更具体地，但非排它地，涉及该载体用于在植物基因组中产生遗传型变异的用途。
参考附图和所附说明能更好地理解本发明的原理和操作。
在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明并不必要将其应用限定在以下说明书所示的或由实施例例证的详述中。本发明可有其它实施方案或可以各种方式实施或完成。此外，还应当理解本文所使用的词组和术语是为了描述的目的，并且不能理解为限制。
在简化待实施的本发明的一些实施方案的同时，本发明人设计了用于在植物中产生遗传型变异的有效工具，其应用编码嵌合多肽的病毒载体，所述多肽被设计以在植物基因组中产生序列特异性双链断裂。如在背景技术部分中提到的那样，DSB的形成可用于被动地(通过植物修复系统)或主动地(即，定向插入异源核酸序列)产生遗传型变异。前述毫无疑问地证实了本发明的工具在产生基因组变异中的价值。
如在以下实施例部分描述的那样，本发明发明人构建了经修饰的烟草脆裂病毒(TRV)表达载体。已成功地将这些载体用于在不同植物(例如，矮牵牛、本氏烟和烟草，例如图8A-G，图9A-B和图11A-F)的分生组织中引入并表达与本发明的嵌合基因大小相等的外源基因(例如，GUS)。本发明人成功地在叶绿体和线粒体质体中表达异源基因(分别是图15A-G和图16A-K)。此外，本发明人成功地应用本发明一些实施方案的病毒载体in-planta共表达了两种异源基因(例如，DsRed和GFP)，并且特别地在不同的细胞区室中表达(例如，细胞质、叶绿体或细胞核)(例如参见图17A-D和18A-L)。重要地，本发明人产生了锌指核酸酶(ZFN)，其特异性地结合并切割矮牵牛的非编码靶序列(图20-22)、矮牵牛八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基因组序列(图23和28B)或矮牵牛黄烷酮3β-羟化酶(FHT)基因组序列。因此，这些嵌合核酸酶和病毒载体可作为农业转基因技术领域的有力工具。
因此，根据本发明的一个方面，提供了在植物基因组中产生遗传型变异的方法。该方法包括引入至少一种病毒表达载体至该植物，所述病毒表达载体编码至少一种包含DNA结合结构域、核酸酶和细胞核定位信号的嵌合核酸酶，其中该DNA结合结构域介导该核酸酶特异性地靶向植物基因组，由此在植物基因组中产生遗传型变异。
如本文所使用的术语“植物”是指整株植物、其部分(例如，叶、根、果实、种子)或从其中分离的细胞(同质或异质细胞群)。
如本文所使用的短语“分离的植物细胞”是指衍生自破裂的植物细胞组织或植物细胞培养物的植物细胞。
如本文所使用的短语“植物细胞培养物”是指任意类型的天然(天然存在的)植物细胞、植物细胞系以及遗传修饰的植物细胞，其没有组装形成完整的植物，因此植物的至少一种生物结构不存在。任选地，本发明这一方面的植物细胞培养物可包含特定的植物细胞类型，或复数种不同类型的植物细胞。应当注意的是，特征在于特定植物细胞类型的植物培养物任选地可最初衍生自此类植物细胞的复数个不同类型。
任何商业或科学上有价值的植物都可根据本发明的实施方案进行设想。可应用本发明的方法的合适植物可以是任何单子叶或双子叶植物，包括但不限于玉米、小麦、大麦、黑麦、燕麦、稻、大豆、花生、豌豆、小扁豆和苜蓿、棉花、油菜籽、油菜(canola)、辣椒、向日葵、马铃薯、烟草、番茄、莴苣、菊花、拟南芥、花椰菜、卷心菜、甜菜、奎藜籽、菠菜、黄瓜、南瓜、西瓜、豆、木槿、秋葵、苹果、玫瑰、草莓、红番椒、大蒜、洋葱、高粱、茄子、桉树、松树、树木、观赏植物、多年生牧草和饲料作物、松柏科植物、苔藓、藻类以及其它在World Wide Web(点)nationmaster(点)com/encyclopedia/Plantae中列出的植物。
因此，植物科可包括葱科、苋科、石蒜科、夹竹桃科、菊科(Asteraceae)、紫草科、十字花科(Brassicaceae)、桔梗科、石竹科、藜科、菊科(Compositae)、十字花科(Cruciferae)、葫芦科、大戟科、蝶形花科(Fabaceae)、禾本科、风信子科、唇形科、豆科-蝶形花亚科、百合科、亚麻科、锦葵科、商陆科、禾本科、松科、蔷薇科、玄参科、茄科、旱金莲科、伞形科和紫堇科。
此类植物包括、但不限于：洋葱、尾穗苋、反枝苋、金鱼草、拟南芥、落花生、蒿属、燕麦、雏菊、甜菜、油菜(Brassica campestris)、油菜亚种Napus、油菜亚种Pekinensis、芥菜、金盏菊、荠菜、辣椒、长春花、桂竹香(Cheiranthus cheiri)、藜、苋色藜、菊叶香藜(Chenopodium foetidum)、茴藜、芫荽、香瓜、黄瓜、大豆、千日红、陆地棉cv.Siv′on、霞草、向日葵、风信子、天仙子、莴苣、香豌豆、亚麻、南非半边莲(Lobelia erinus)、Lupinus mutabilis、番茄、醋栗番茄、白花草木樨(Melilotus albus)、胶苦瓜(Momordica balsamina)、勿忘草、喇叭水仙、假酸浆、本氏烟、Nicotiana clevelandii、粘毛烟草、黄花烟草、Nicotiana sylvestris、烟草(Nicotiana tabacum)、Nicotiana edwardsonii、罗勒、矮牵牛、菜豆、美洲商陆、豌豆、萝卜、蓖麻、绢毛蔷薇、一串红、欧洲千里光(Senecio vulgaris)、番茄、茄子、龙葵、马铃薯、solanum pimpinellifolium、菠菜、繁缕、青蒿、红三叶、白三叶、金莲花、郁金香、蚕豆、毛苕子和Viola arvensis。可能感染其它植物包括玉米、大麦、小麦、稻和Oryza glaberrima。
根据本发明特定的实施方案，所述植物包括矮牵牛(Petunia hybrida)。
根据本发明其它的特定实施方案，所述植物包括烟草(Nicotiana tabacum)。
本文所使用的短语“遗传型变异”是指这样的过程，其中在预定的基因组位点选择性地改变或突变核苷酸或核苷酸序列(至少2个核苷酸)，也称为诱变。该基因组位点可以是编码或非编码(例如，启动子、终止子、剪接位点、多聚A)基因组位点。这一改变可以是在该靶基因中核酸缺失、核酸随机插入、引入携带期望序列的异源核酸、或形成DNA双链断裂(DSB)后同源重组的结果。根据本发明教导的遗传型变异可以是如以下将详细介绍的瞬时的。根据本发明教导的遗传型变异一般通过形成DSB而实现，尽管本发明也预期了单链的变异。遗传型变异可以与表型变异相联系。因此本发明教导的序列特异性或位点定向性质可以用于特定地设计表型变异。
如上所述，根据本发明这一方面的方法是通过引入至少一种病毒表达载体至植物而实现的，所述的载体编码至少一种包含DNA结合结构域、核酸酶和细胞核定位信号的嵌合核酸酶。
如本文所使用的短语“嵌合核酸酶”是指合成的嵌合多肽，其形成单开放阅读框并以序列特异性的方式介导DNA切割。
如本文所使用的术语“DNA结合结构域”是指天然或合成的氨基酸序列，诸如以与特定序列或序列组(即，靶位点)的亲和力结合双链或单链DNA的蛋白质基序的氨基酸序列。
在产生嵌合核酸酶时，可以使用以足够的特异性识别期望DNA结合序列的任何DNA结合结构域。
DNA结合结构域的实例包括但不限于螺旋-转角-螺旋(pfam01381)、亮氨酸拉链(ZIP)结构域、翼状螺旋(WH)结构域、翼状螺旋转角螺旋结构域(wHTH)、螺旋-环-螺旋和锌指结构域。
因此，许多此类DNA结合结构域是本领域公知的。在本发明的示范性实施方案中，DNA结合结构域是锌指结合结构域(例如，pfam00096)
锌指结构域长30个氨基酸，并且由识别螺旋和2束β折叠组成。该结构域还含有对于锌的四个规则间隔配体(组氨酸或半胱氨酸)。Zn离子稳定了该结构域的3D结构。每一个指含有一个Zn离子并且识别特定的DNA碱基对三联体。
可以改造锌指结构域以结合预定的核苷酸序列。每一个单个的锌指(例如，Cys2/His2)以模块的方式主要地与DNA的三个连续碱基对接触[Pavletich等，Science(1991)252：809-817；Berg等，Science(1996)271：1081-1085]。通过操作锌指的数目和直接与DNA接触的关键氨基酸残基的性质，可形成和选择具有新特异性的DNA结合结构域[例如参见，Desjarlais等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：7345-7349；Rebar等，Science(1994)263：671-673；Greisman等，Science(1997)275：657-661；Segal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96：2758-2763]。因此，大量的DNA序列可用作锌指蛋白的特定识别靶。之前已经公开了基于锌指识别的具有数种不同特异性的嵌合核酸酶[例如，参见，Huang等，J.Protein Chem.(1996)15：481-489；Kim等，Biol.Chem.(1998)379：489-495]。
用于设计具有不同的DNA结合结构域的嵌合核酸酶的各种方法是本领域公知的。在一个实施方案中，DNA结合结构域包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个锌指结构域，分别与3、6、9、12、15或18核苷酸序列结合。本领域技术人员将理解，识别序列越长，将获得越高的特异性。
可应用多肽展示文库选择特定DNA结合锌指。在亲和选择步骤中将靶位点与多肽展示文库一起使用，以选择与该靶位点结合的变体锌指。一般地，恒定的锌指和待随机化的锌指从任意合适的C2H2锌指蛋白制得，诸如SP-1、SP-1C、TFIIIA、GLI、Tramtrack、YY1或ZIF268[例如参见，Jacobs，EMBO J.11：4507(1992)；Desjarlais & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：2256-2260(1993)]。根据本领域技术人员公知的方法构建多肽展示文库，其编码包含随机化锌指以及取决于选择步骤包含一个或两个恒定锌指的锌指蛋白变体，其中将选择所述随机化锌指的一个或更多个变体。任选地，该文库含有设计以易于移除恒定锌指、以及添加随机化锌指的限制性位点。例如通过简并寡核苷酸、诱变盒或易错PCR随机化锌指。例如，参见美国专利号6,326,166、6,410,248和6479626。
也可以通过设计选择锌指。设计的锌指蛋白是在自然中不存在的蛋白，其设计/组成主要产生自理想标准。用于设计的理想标准包括替换规则的应用以及在储存现有ZFP设计和结合数据信息的数据库中处理信息的计算算法。例如，参见美国专利号6,140,081、6,453,242和6,534,261；还参见WO 98/53058、WO 98/53059、WO 98/53060、WO 02/016536和WO 03/016496。
如以下实施例1所阐述的那样，根据本发明的教导设计两组嵌合核酸酶，每一组都能够在矮牵牛DNA的特定把序列中形成DSB。首先，在矮牵牛植物中鉴定适于通过嵌合核酸酶识别并切割的DNA结合序列。这些DNA结合序列是非编码、非重复序列：P25-TS1(SEQ ID NO：10)、P25-TS2(SEQ ID NO：11)、P36-TS1(SEQ ID NO：12)和P36-TS2(SEQ ID NO：13)。接下来，设计嵌合核酸酶，其每一个包含3个锌指。如在图21-22中所描述的那样，这些命名为P1-25-ZFN1、P1-25-ZFN2、P1-36-ZFN1和P1-36-ZFN2(分别是SEQ ID NO：35、36、37或38)的锌指特异性地结合并切割上述矮牵牛靶位点。
此外，如在以下实施例1中所描述的那样，根据本发明的教导，设计能在矮牵牛八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基因组序列或在矮牵牛黄烷酮3β-羟化酶(FHT)基因组序列中形成特异DSB的嵌合核酸酶。首先，在矮牵牛植物中鉴定PDS和FHT的DNA结合序列，其适于被此类嵌合核酸酶识别并切割(分别参见图28A和29)。鉴定PDS特异性锌指的DNA结合序列：PDS-ZFN1(SEQ ID NO：140)和PDS-ZFN2(SEQ ID NO：141)，并设计特异性结合并切割PDS矮牵牛靶位点的嵌合核酸酶(分别是SEQ ID NOs：71和73)。同样地，鉴定FHT特异性锌指的DNA结合序列：FHT-ZFN1(SEQ ID NO：142)和FHT-ZFN2(SEQ ID NO：143)，并设计特异性结合并切割FHT矮牵牛靶位点的嵌合核酸酶(分别是SEQ ID NOs：75和77)。
根据本发明的一个实施方案，该锌指结合结构域包含如SEQ ID NO.17、18、19、22、23、24、25、26、27、28、29或30所示的核酸序列。
优选地，本发明这一方面的嵌合核酸酶包含分离的用于DNA结合和用于DNA切割的结构域，使得DNA切割是序列特异性的。
本文所使用的短语“序列特异性的”是指引入双链断裂(切割)的独特的染色体位置。不受理论束缚，相信DSB的形成将诱发细胞修复机制，其一般将导致在该基因座的高效重组事件。
如本文所使用的术语“核酸酶”是指任意的多肽，或包含多肽的复合物，其可在基因组DNA中产生链断裂(即，包含DNA切割活性)。可根据本发明的教导使用的核酸酶的实例包括限制性酶、拓扑异构酶、重组酶、整合酶和DNA酶。
应当理解，本发明应用的核酸酶可包含任何非特异性DNA切割结构域，例如，II型限制性内切核酸酶，诸如FokI限制性酶的切割结构域(GenBank登录号J04623)。通常具有分开的DNA切割和DNA结合结构域的FokI限制性酶适于构建嵌合核酸酶。因此，根据这一方面的实施方案，该嵌合核酸酶是包含特异性锌指结合结构域和FokI限制性酶的DNA切割结构域(本文也称为FokI切割结构域)的嵌合蛋白质。
根据本发明的实施方案，该嵌合核酸酶是包含如SEQ ID NO.31、32、33、34、70、72、74、76、84、86或88所示核酸序列的分离的多核苷酸。
根据本发明的实施方案，该嵌合核酸酶是包含如SEQ ID NO.35、36、37、38、71、73、75、77、85、87或89所示氨基酸序列的分离的多肽。
由于某些核酸酶(例如，FokI)作为二聚体起作用，为了在靶基因中产生双链断裂，必须应用至少两个嵌合核酸酶。因此，根据示例性实施方案，本发明的嵌合核酸酶形成二聚体(例如，通过结合至靶序列的两条链上)。例如，嵌合核酸酶可形成两个相同嵌合核酸酶之间的同二聚体(例如，通过结合至靶序列中两个相同的DNA结合序列上)。备选地，嵌合核酸酶可形成两个不同嵌合核酸酶之间的异二聚体(例如，通过结合至靶序列中两个不同的DNA结合序列上，例如参见图1)。因此，可应用两种嵌合核酸酶在靶序列中产生双链断裂。因此，嵌合核酸酶、或两个或更多个共同作用的嵌合核酸酶的DNA结合结构域可结合DNA序列。
可根据本发明的教导使用的核酸酶的实例包括但不限于：包括FokI、SceI、I-CeuI、人造兆碱基大范围核酸酶、修饰的兆碱基大范围核酸酶、归巢核酸酶(homing nucleases)在内的限制性酶；包括DNA促旋酶、真核拓扑异构酶II、细菌拓扑异构酶IV和拓扑异构酶VI在内的拓扑异构酶；包括Cre重组酶、Hin重组酶、Rad51/RecA在内的重组酶；包括脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II和微球菌核酸酶在内的DNA酶；以及整合酶。
术语“含DNA细胞器”是指存在于所有植物细胞中的亚细胞、膜包被的结构。
含DNA细胞器包括：线粒体、细胞核、叶绿体、前质体、黄化质体、色质体和白色体，以及任何包括DNA分子的亚细胞结构。一般地，DNA是内源的，但在某些情况下可指外源DNA诸如植物病原体诸如病毒的DNA。在后面这种情况下，例如，含DNA细胞器是细胞质，在这种情况下嵌合核酸酶可不包含任何定位信号。
应当理解，在细胞核之外的其它植物细胞器产生遗传型变异是根据本发明的一些实施方案特别感兴趣的，如下文将详细描述的那样。植物细胞器(例如，叶绿体和线粒体)含有DNA，其是植物生物化学途径的重要参与者。这些细胞器具有宽泛的结构和功能差异。它们本身能够转录和翻译它们自身基因组中存在的信息，但强烈地依赖于在细胞核基因组中编码并在细胞质中翻译的输入蛋白。
例如，线粒体执行具有总体重要性的重要代谢和生物合成功能，包括光合作用、类胡萝卜素和氨基酸生物合成。类胡萝卜素是植物的组成成分，它们是类异戊二烯色素，参与许多过程，包括保护抗光氧化胁迫(通过天线色素吸收的过量光的能量损耗)；在花和果实中的着色剂，以吸引传粉昆虫，以及植物生长激素脱落酸和维生素A的前体[Cunningham和Gantt(1998)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49：557-583]。类胡萝卜素色素在植物质体中合成，其从类异戊二烯生物合成途径衍生得到(Cunningham和Gantt，同上)。在植物中存在类异戊二烯生物合成的两个生物合成途径，即在细胞质中发现的甲羟戊酸途径和仅在质体中发现的甲基赤醇4-磷酸(MEP)途径。后一生物合成途径与光合作用强相关[Seemann等(2006)FEBS Lett.580：1547-1552]。
此外，芳香族氨基酸苯丙氨酸可在叶绿体中从中间产物预苯酸(prephenate)合成：经由通过预苯酸氨基转移酶活性的arogenate，或经由通过预苯酸脱水酶活性的苯丙酮酸[Jung等(1986).Proc.Natl.Acad.Sci.83：7231-7235；Rippert等(2009)Plant Physiol.149(3)：1251-1260]。
此外，细胞的亚硝酸还原酶和乙酰乳酸合成酶活性也位于质体中。发现质体仅含有细胞中全部谷氨酰胺合成酶、天冬氨酸转氨酶和磷酸丙糖脱氢酶活性的一部分[Miflin B(1974)Plant Physiol.54(4)：550-555]。叶绿体还参与植物中的甲硫氨酸代谢，叶绿体自主从头合成甲硫氨酸，并且可从胞质溶胶中输入S-腺苷甲硫氨酸[Ravanel等，(2004).J.Biol.Chem.279(21)：22548-22557]
类似地，线粒体包含细胞代谢途径的关键作用，催化这些途径中的一个或数个步骤，例如维生素叶酸和生物素、非维生素辅酶硫辛酸、心磷脂双磷脂酰甘油的合成。尽管线粒体缺乏乙酰-CoA羧化酶，其含有将丙二酸酯转化为用于脂肪酸合成的两个主要构建单元所需的酶工具，即丙二酰-和乙酰-酰基载体蛋白(ACP)。
植物的胞质雄性不育(CMS)的特征是产生具活力花粉的抑制以及这一性状的非孟德尔遗传，其与线粒体功能不良相关。胞质雄性不育的遗传决定因素位于线粒体基因组中。CMS表型主要影响产生花粉的器官，因为这一组织对能量有很高的需求。因此，线粒体功能不良将显著地影响花粉产生，而其它植物器官则可克服线粒体功能不良的后果。
本文所使用的短语“定位结构域”是指定位信号，其帮助嵌合核酸酶转运至含DNA的细胞器中。
定位信号例如可以是细胞核定位信号(NLS)，诸如短的主要是碱性氨基酸的序列，其可由核孔上的特定受体识别。在其它示范性实施方案中，含DNA的细胞器的定位信号可以是线粒体定位信号(MLS)或叶绿体定位信号(CLS)。
基本上可使用任何的NLS，不管是合成的还是天然存在的NLS，只要该NLS是靶细胞(即植物细胞)相容的NLS。
尽管在此讨论了细胞核定位信号，但不意味着本发明的教导限于这些定位信号，因为定向至含DNA的细胞器的任何信号都设想在本发明教导之内。此类信号是本领域公知的，并且本领域技术人员能很容易地检索。
可根据本发明教导使用的细胞核定位信号包括但不限于SV40大T抗原NLS、hnRNP A1的酸性M9结构域、酵母转录抑制子Matα2的序列KIPIK以及U snRNP的复合信号、烟草NLS和稻NLS。
可根据本发明教导使用的线粒体定位信号包括但不限于βATP酶亚单位[编码来自Nicotiana plumbaginifolia的β-ATP酶线粒体前序列的cDNA(核苷酸387-666)]、线粒体伴侣素CPN-60[编码来自拟南芥CPN-60的线粒体前序列的cDNA(核苷酸74-186)]和COX4[酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)COX4的前25个密码子，其编码线粒体靶向序列]的转位信号。
根据本发明特定实施方案，定位信号可包含线粒体定位信号，诸如ATP酶β亚单位(ATP-β)的信号肽(SEQ ID NO：139)。
可根据本发明使用的叶绿体定位信号包括但不限于核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小亚单位(ats1A)相关转运肽的转位信号、LHC II的转位信号、以及拟南芥SIG2和SIG3 ORF的N端。也参见http://wwwdotspringerlinkdotcom/content/p65013h263617795/。
备选地，叶绿体定位信号(CLS)可衍生自类病毒[Evans和Pradhan(2004)US 2004/0142476A1]。该类病毒可以是Avsunviroiae类病毒，例如鳄梨白斑类病毒(ASBVd)、Peach Latent Mosaic病毒(PLMVd)、菊花退绿斑驳类病毒(CChMVd)或Eggplant Latent类病毒(ELVd)。
根据本发明特定的实施方案，定位信号可包含叶绿体定位信号，诸如转运肽核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚单位(Rssu)(SEQ ID NO：138)。
为有效的基因靶向，需要将本发明的DNA结合结构域与核酸酶偶联，以便允许在靶序列可行的邻近之内切割DNA。可行的邻近是指仍然促进序列靶向的任意距离。任选地，DNA结合结构域与靶序列重叠或可结合在靶序列之内。
通常应用重组DNA技术产生本发明的嵌合核酸酶[参见以下实施例部分的实施例1和Sambrook等编辑，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor University Press，纽约(1989)；Ausubel等编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，纽约(1998)；以及Maeder等(2008)Mol Cell 31：294-301，以及下文提供的其它参考]。
可应用本领域公知的方法验证如此产生的用于特异靶识别的嵌合核酸酶是否合格。
设计在基因靶向中使用的嵌合核酸酶的方法可包括测试嵌合核酸酶对细胞的毒性的过程。此类过程可包括在细胞中表达该嵌合核酸酶，或以其它方式将该嵌合核酸酶引入细胞，并且通过与对照相比较来评估细胞生长或死亡率。嵌合核酸酶在基因组中超过一个的位点上切割的倾向可通过体外切割测试、随后通过电泳(例如，可应用脉冲场电泳来分辨很大的片段)以及任选地探测或Southern印迹(参见以下实施例部分的实施例5)来评估。鉴于本发明的公开，本领域技术人员可设计其它的用于切割特异性的测试。
在一个特别的实施方案中，本发明提供了两组嵌合核酸酶：P1-25-ZFN1和P1-25-ZFN2(分别显示于SEQ ID NO：35和36)，用于分别在矮牵牛的P 1-25位点1(SEQ ID NO：10)和P 1-25位点2(SEQ ID NO：11)靶向基因；以及P1-36-ZFN1和P1-36-ZFN2(分别显示于SEQ ID NO：37和38)，用于在矮牵牛的P1-36位点1(SEQ ID NO：12)和P1-36位点2(SEQ ID NO：13)靶向基因。特别地，P1-25-ZFN1和P1-25-ZFN2可形成二聚体，以及P1-36-ZFN1和P1-36-ZFN2可形成二聚体，用于在矮牵牛靶基因中产生特异双链断裂。
在本发明另一实施方案中，提供了PDS嵌合核酸酶组：PDS-ZFN1和PDS-ZFN2(分别显示于SEQ ID NO：71和73)，用于分别在矮牵牛的PDS位点1(SEQ ID NO：140)和PDS位点2(SEQ ID NO：141)靶向基因。这些嵌合核酸酶可以形成二聚体，用于在矮牵牛PDS基因中产生特异性双链断裂。
在本发明另一实施方案中，提供了FHT嵌合核酸酶组：FHT-ZFN1和FHT-ZFN2(分别显示于SEQ ID NO：75和77)，用于分别在矮牵牛的FHT位点1(SEQ ID NO：142)和FHT位点2(SEQ ID NO：143)靶向基因。这些嵌合核酸酶可以形成二聚体，用于在矮牵牛FHT基因中产生特异性双链断裂。
如上文所述，应用病毒表达载体将该嵌合核酸酶引入植物靶，所述病毒表达载体通常用于介导瞬时转化、在植物内全身传播，诸如通过分生组织感染。
因此，根据本发明的另一方面，提供了植物病毒表达载体，其包含编码至少一种嵌合核酸酶的核酸序列，所述嵌合核酸酶包含DNA结合结构域、核酸酶和任选地定位信号。
如本文所使用的植物病毒表达载体是指编码病毒基因或部分病毒基因的核酸载体，包括DNA载体(例如，质粒)、RNA载体、病毒或其它合适的复制子(例如，病毒载体)。
显示可用于转化植物宿主的病毒包括CaMV、TMV和BV。应用植物病毒转化植物描述于美国专利号4,855,237(BGV)、EP-A 67,553(TMV)、日本公开申请号63-14693(TMV)、EPA 194,809(BV)、EPA 278,667(BV)，以及Gluzman，Y等，Communications in Molecular Biology：Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，pp.172-189(1988)。用于在许多宿主(包括植物)中表达外源DNA的假病毒粒子描述于WO 87/06261。
可用于转化植物宿主的其它病毒包括烟草脆裂病毒(TRV)及其相关病毒。TRV因其感染分生组织的能力而闻名，其包含宽泛的宿主范围和不同的分离株。例如从水仙中获得的病毒株N5在Nicotiana clevelandii中引起严重的枯斑[Harrison等(1983)Ann.appl.Biol.，102：331-338]。与TRV在血清学上相关的猫儿菊花叶病毒(HMV)[Uhde等(1998)Archives of Virology 143：1041-1053]感染菊科植物[Brunt和Stace-Smith(1978)Ann.appl.Biol.90：205-214]。最初从郁金香中获得的烟草脆裂病毒株TCM与豌豆早枯病毒的荷兰血清型在血清学上紧密相关[Robinson等，J.Gen.Virol.(1987)68：2551-2561)。此外，也有对TRV易感的单子叶植物物种，例如燕麦(Avena sativa)(禾本科)[Cadman和Harrison，Ann.appl.Biol.(1959)47：542-556]。
当病毒是DNA病毒时，可对该病毒本身进行合适的修饰。备选地，可首先将病毒克隆至细菌质粒中以便于用外源DNA构建期望的病毒载体。然后将病毒从该质粒中切下。如果病毒是DNA病毒，则可将细菌的复制起始部位与病毒DNA连接，然后通过细菌复制所述病毒DNA。这一DNA的转录和翻译将产生包被病毒DNA的外壳蛋白。如果病毒是RNA病毒，通常将该病毒克隆为cDNA并插入质粒中。然后使用该质粒制备所有构建物。然后通过复制该质粒的病毒序列并翻译该病毒基因以产生包被病毒RNA的外壳蛋白，从而产生该RNA病毒。
用于在植物中引入并表达非病毒外源核酸序列(诸如包含在本发明构建物中的那些)的植物RNA病毒构建物记录在以上参考文献以及美国专利号5,316,931，Dawson，W.O.等(1989)A tobacco mosaic virus-hybrid expresses and loses an added gene.Virology 172，285-292；French，R.等(1986)Science 231，1294-1297和Takamatsu，N.等(1990).Production of enkephalin in tobacco protoplasts using tobacco mosaic virus RNA vector.FEBS Lett 269，73-76中。
在一个实施方案中，提供这样的植物病毒核酸，即其中已从病毒核酸中缺失了天然外壳蛋白编码序列，插入了能在该植物宿主中表达、能够包装该重组植物病毒核酸并且能够保证通过该重组植物病毒核酸全身感染宿主的非天然植物病毒外壳蛋白编码序列和非天然启动子，优选该非天然外壳蛋白编码序列的亚基因组启动子。备选地，可通过在其中插入非天然核酸序列使得产生蛋白质而使外壳蛋白基因失活。该重组植物病毒核酸可含有一个或更多个附加的非天然亚基因组启动子。每一个非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中复制或表达相邻的基因或核酸序列，并且不能彼此也不能与天然的亚基因组启动子重组。可将非天然(外源、异源)核酸序列插入天然植物病毒亚基因组启动子的相邻，或者如果包括超过一个核酸序列的话，插入该天然和非天然植物病毒亚基因组启动子的相邻。非天然核酸序列在该亚基因组启动子的控制下在宿主植物中复制或表达，以产生期望的产物。
在第二个实施方案中，提供了如第一个实施例中的重组植物病毒核酸，但是将天然外壳蛋白编码序列与非天然外壳蛋白亚基因组启动子之一相邻地放置，代替非天然外壳蛋白编码序列。
在第三个实施方案中，提供了重组植物病毒核酸，其中天然外壳蛋白基因与其亚基因组启动子相邻，并且已将一个或更多个非天然亚基因组启动子插入该病毒核酸中。该插入的非天然亚基因组启动子能够在植物宿主中复制或表达相邻的基因，并且不能彼此也不能和天然亚基因组启动子重组。可将非天然核酸序列插入非天然亚基因组植物病毒启动子的相邻，使得所述序列在该亚基因组的控制之下在宿主植物中复制或表达，以产生期望的产物。
在第四个实施方案中，提供了如第三个实施方案中所提供的重组植物病毒核酸，但是由非天然外壳蛋白编码序列代替了天然外壳蛋白编码序列。
病毒载体由通过该重组植物病毒核酸编码的外壳蛋白包被，以产生重组植物病毒。将该重组植物病毒核酸或重组植物病毒用于感染适当的宿主植物。重组植物病毒核酸能够在宿主中复制，在宿主中全身传播，并且在宿主中转录或表达外源基因(分离的核酸)以产生期望的蛋白质，即嵌合核酸酶，以及任选地其它异源编码或非编码核酸序列。
将包含嵌合核酸酶编码核酸的病毒表达载体与一个或更多个转录调控序列可操作地连接，由此编码序列在转录信号的控制之下，以允许产生或合成该嵌合核酸酶。此类转录调控序列包括启动子序列、增强子和转录结合位点。
本发明中可使用已知或发现引起外源基因在植物细胞中转录的启动子。此类启动子可从植物或病毒中获得，并且包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(包括CaMV 35S启动子的变体，例如通过与操作子区连接、随机或受控诱变等方式衍生的启动子)、种子贮藏蛋白质基因诸如Zma10 Kz或Zmag12(分别是玉米玉米醇蛋白和谷蛋白基因)、光可诱导基因诸如二磷酸核酮糖羧化酶小亚单位(rbcS)、胁迫诱导基因诸如醇脱氢酶(Adh1)或在所有细胞中表达的“看家基因”(诸如玉米肌动蛋白基因Zmaact)的启动子。为了添加控制，可将嵌合核酸酶置于可诱导启动子的控制之下。
在一个实施方案中，植物病毒表达载体是烟草脆裂病毒(TRV)表达载体。
基于TRV的表达载体例如描述于美国专利申请号7,229,829。
TRV是具有二分体基因组的正链RNA，因此基因组分为两个正义单链RNA，其可分开地包被在病毒粒子中。本发明使用的两个TRV基因组RNA载体在本文称为pTRV1(GeneBank登录号：AF406990)和pTRV2(GeneBank登录号：AF406991)，其中pTRV1编码在宿主中介导复制和移动的多肽，而pTRV2编码外壳蛋白。
在某些实施方案中，pTRV2核酸序列没有2b序列(SEQ ID NO：43)。产生缺乏300bp的RNA22b基因的pTRV2载体是通过用PvuII和EcoRI消化从原始载体中移除而完成的(参见图6A-B)。所得到的质粒(pTRV2Δ2b)与原始pTRV2同一但是缺乏2b序列(参见以下实施例1)。根据本发明的教导，没有2b区的pTRV2载体在分生组织中的基因表达更有效得多(参见以下实施例2)。
在某些实施方案中，对pTRV2载体的修饰包括添加增强子。可将任意的增强子插入到该病毒表达载体中以增强基因的转录水平。例如，可将Ω增强子(SEQ ID NO：44或47)克隆到本发明的pTRV2载体中。
备选地，本发明的病毒载体可基于TRV相关病毒(例如，烟草脆裂病毒株N5、HMV，或烟草脆裂病毒株TCM)。
载体的选择可取决于靶植物，诸如单子叶植物。之前已经显示经修饰的小麦线条花叶病毒(WSMV)在单子叶植物(例如，小麦、大麦、燕麦或玉米)中表达NPT II和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)[Choi等，Plant J.(2000)23：547-555；Choi等，J Gen Virol(2002)83：443-450；Choi等，J.Gen.Virol.(2005)86：2605-2614]。Choi等的工作记录了将外源基因置于核包涵体b(NIb)和外壳蛋白(CP)之间。为了在经感染的小麦中更佳的表达和活性，将GUS插在小麦线条花叶病毒(WSMV)多蛋白ORF的P1切割位点直接下游和HC-Pro上游。在体外用WSMV接种植物后，证实了全身感染和GUS的表达。
本发明预期了包含至少两个异源多肽序列的病毒表达载体。
如本文使用的术语“异源序列”是指通常不是天然存在的TRV的RNA2之一部分的序列。在某些实施方案中，异源序列是如上文详细描述的嵌合核酸酶。在某些实施方案中，异源序列是目的序列，诸如用于在植物细胞中表达的异源多肽的植物基因。此类植物基因可包括但不限于编码报告多肽、抗病毒多肽、病毒部分、抗真菌多肽、抗细菌多肽、昆虫抗性多肽、除草剂抗性多肽、生物或非生物胁迫耐性多肽、药物多肽、生长诱导多肽以及生长抑制多肽的基因。在某些实施方案中，该病毒载体包含嵌合核酸酶和目的序列。
作为pTRV载体的一部分，异源序列可包含分离的亚基因组启动子(sgPs)，由此可包含用于复制异源基因的两个分离的sgPs(例如SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：48)。
在某些实施方案中，在病毒载体内的至少两个异源多肽序列被编码切割结构域的核酸序列分开。此类切割结构域可包含本领域公知的任何切割结构域，例如T2A-样蛋白序列(SEQ ID NO：40和52)。
应当理解，由切割结构域分开的两个异源多肽序列的核酸序列如SEQ ID NO：84、86或88所示。
应当理解，由切割结构域分开的两个异源多肽序列的氨基酸序列如SEQ ID NO：85、87或89所示。
一般地，当引入宿主植物细胞时，pTRV载体提供异源序列的表达，并且可能还提供其它TRV序列诸如病毒外壳蛋白的表达。
本发明的pTRV载体可表达报告基因，因此可鉴定经转化的细胞。可表达的示例性报告基因包括但不限于GUS和GFP。
应当理解，可将两个病毒表达载体引入相同的植物细胞中。这些病毒载体可以伴随地或在分开的时间引入植物细胞中。此类病毒表达载体可包含编码不同异源序列的同类载体，或备选地可包含两种不同类型的载体(例如，BV载体和TRV载体、线粒体病毒载体和TRV载体、TRV1和TRV2载体)。例如，可伴随地引入pTRV 1和pTRV2载体，例如以1∶1的比例，以使得病毒基因可在植物细胞中表达。类似地，一个载体可包含单数或复数的嵌合核酸酶并且另一载体可包含目的异源基因(如下文详细描述的那样)。
应当理解，为将目的异源基因(例如，外源DNA)引入不同的含DNA细胞器(例如，细胞核、叶绿体和线粒体)中，可使用不同类型的载体。
因此，递送外源DNA的载体可基于双粒病毒苘麻花叶病毒(AbMV)，其为菜豆金黄花叶病毒属的成员。已在质体中检测到了AbMV病毒DNA[
Figure BPA00001278962000301
等，(1987)PNAS USA 84：8996；
Figure BPA00001278962000302
等(1990)Mol.Gen.Gene.220：485；Horns & J eske，(1991)Virol.181：580]。
本发明的病毒载体还可基于裸露RNA病毒科、线粒体病毒属，诸如H.mompa线粒体病毒1-18(HmMV1-18)或O.novo-ulmi线粒体病毒6(OnuMV6)。已在线粒体中检测到了HmMV1-18病毒dsRNA[Osaki等(2005)Virus res.107，39-46；Cole等(2000)Virol.268，239-243]。
本发明预想的其它基于DNA病毒的载体包括例如双粒病毒科、花椰菜花叶病毒科和Badnaviridae。
例如，双粒病毒科含有环状共价闭合单链(ss)DNA(～2.8Kbp)基因组，其包被在双(因此称为双粒)粒子中。调节DNA复制和转录活性的序列位于基因间区域(IR)。恒定的TAATATT AC序列位于LIR(在玉米线条病毒属中)、IR(在甜菜曲顶病毒属(curtoviruses)中)和CR(在菜豆金黄花叶病毒属中)，并且含有滚环DNA复制的起始位点。双粒病毒复制循环可分为多个功能上不同的阶段。在感染过程早期，通过昆虫媒介注入病毒粒子，可能是未包被的，并且病毒基因组被转运到宿主细胞核中，在细胞核中发生所有以后的阶段：将环状ssDNA转化为共价闭合的环状dsDNA中间体，滚环复制(RCR)，产生用于包被的环状ssDNA基因组[Gutierrez(1999)Cell.Mol.Life Sci.56313-329]。
基于它们的基因组组织和生物学特性，将双粒病毒组划分为4个属[Fauquet等(2003)Arch Virol 148：405-421]。玉米线条病毒属(例如，玉米线条病毒、黍线条病毒、甘蔗线条病毒、甘蔗线条埃及病毒、甘蔗线条Reunion病毒、马唐线条病毒(Digitaria streak virus)等)具有单分体基因组并且通过叶蝉传播至单子叶植物。甜菜曲顶病毒属(例如甜菜曲顶病毒)具有与玉米线条病毒属不同的单分体基因组并且通过叶蝉媒介传播至双子叶植物。Topocuviruses(例如，番茄伪曲顶病毒)具有单分体基因组，其通过角蝉媒介传播至双子叶植物。菜豆金黄花叶病毒属(例如，菜豆金色花叶病毒、番茄黄曲叶病毒、苘麻花叶病毒、烟草曲叶病毒、非洲木薯花叶病毒、绿豆黄花叶病毒)具有双分体基因组(尽管也存在许多具有单分体基因组的菜豆金黄花叶病毒属)并且通过粉虱Bemisia tabaci传播至双子叶植物。
花椰菜花叶病毒组粒子含有单分子dsDNA(～8kbp)。花椰菜花叶病毒组通常全身性地感染宿主，它们在多数叶肉、薄壁组织和表皮细胞中发现，并且有时在韧皮部筛管和管胞中发现。该属的成员包括例如花椰菜花叶病毒(CaMV)、大豆退绿斑驳病毒(SoyCMV)、木薯叶脉花叶病毒(CVMV)、矮牵牛脉明病毒(PVCV)、稻东格鲁杆状病毒(RTBV)。
应当理解，最近描述[WO 2007/141790]的通用载体IL-60和辅助构建物也可用于本发明。这一载体实际上是番茄黄曲叶病毒(菜豆金黄花叶病毒属)的去攻击形式，其作为双链DNA使用[Peretz等(2007)Plant Physiology 145：1251-1263]。以IL-60作为去攻击的辅“病毒”，发生了转活，导致可诱导的表达/沉默系统。
为将含外源DNA的载体引导至特定的含DNA细胞器中，可将细胞核定位信号(NLS)、叶绿体定位信号(CLS)或线粒体定位信号(MLS)符合阅读框地引入异源序列中(如在上文中所详细描述的那样)。
为实现转化植物细胞或整株植物，可通过本领域公知的任何方法将本发明的病毒表达载体引入宿主细胞中。例如，可通过土壤杆菌介导的基因转移、通过直接DNA转移方法、通过病毒感染(即，应用经修饰的植物病毒)或通过线虫、通过渗入、通过真空、通过电穿孔或通过轰击而实现瞬时转化。
如本文公开的土壤杆菌介导的基因转移(例如，参见下文实施例1)包括使用含有所定义的DNA片段的质粒载体。例如，本发明教导了用pTRV1、pTRV2和含有如之前所述的质粒的pTRV2衍生物转化的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(AGLO和EHA-105株)的用途[例如，参见Liu等，Plant J (2002)30：415-429]。植物组织的接种方法依据植物物种和土壤杆菌递送系统而不同。广泛使用的方法是叶盘(leaf-disc)方法，其可使用任何为整株植物的分化起始提供良好来源的组织外植体来进行[Horsch，R.B.等(1988).″Leaf disc transformation.″Plant Molecular Biology Manual A5，1-9，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht]。补充的方法应用与真空渗入联合的土壤杆菌递送系统。土壤杆菌系统对于产生转基因双子叶植物植物是尤其有用的。参见：Klee，H.J.等(1987).Annu Rev Plant Physiol 38，467-486；Klee，H.J.和Rogers，S.G.(1989).Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，第6卷，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes，pp.2-25，J.Schell和L.K.Vasil，编辑，Academic Publishers，San Diego，Cal.；以及Gatenby，A.A.(1989).Regulation and Expression of Plant Genes in Microorganisms，第93-112页，Plant Biotechnology，S.Kung和C.J.Arntzen，编辑，Butterworth Publishers，Boston，Mass。本发明还教导了通过将土壤杆菌注射到植物中(例如，在移除顶分生组织后注射至暴露的苗表面)以及通过叶片渗入(例如应用无针头注射器)(例如，将注射器中土壤杆菌内容物释放在叶子擦痕表面，参见以下实施例部分的实施例1)的由土壤杆菌介导的基因转移。
直接的DNA转移方法例如包括电穿孔、微注射和微粒子轰击。例如参见：Paszkowski，J.等(1989).Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，第6卷，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes，第52-68页，J.Schell和L.K.Vasil，编辑，Academic Publishers，San Diego，Cal.；以及Toriyama，K.等(1988).Bio/Technol 6，1072-1074(用于直接摄入DNA至原生质体的方法)。这些方法还可用于将含有外源DNA的载体(如上文详细描述)引入特定的含DNA细胞器中。例如，用编码核酸酶的DNA和供体DNA两者电穿孔共转化烟草原生质体[Wright等(2005)Plant J 44：693-705]。
还可通过使用线虫完成病毒载体(例如，pTRV)对植物的感染，包括但不限于本氏烟(N.benthamiana)或N.clevelandii(TRV的天然宿主)。因此，在作用于植物之前，用pTRV1、pTRV2或它们的衍生物接种本氏烟或N,clevelandii。
还可通过病毒粒子感染(如以下实施例1所详细描述的那样)实现病毒载体对植物的感染。例如可通过首先用病毒载体(pTRV1、pTRV2、或其衍生物)接种该病毒的惯常宿主(例如，TRV感染矮牵牛)来完成病毒粒子的感染。在感染后(dpi)约5至21天，收集植物叶子并通过研钵和杵在20mM磷酸盐缓冲液pH＝6.8和表面活性剂(例如0-0.03％Silwet L-77)中提取汁液。然后将含有TRV的汁液滴在纱布(cheesecloth)上或离心以移除细胞碎片，并在添加金刚砂细粉(以提高感染)后，轻轻地划破幼植物的茎和叶(约1个月大)。还可如下进行体外生长的植物的汁液感染：首先使汁液通过0.22μm滤片，然后损伤组织培养繁殖的植物的茎，并且应用注射器和针头或通过真空感染。对于种子感染(例如单子叶植物)，可在膨胀和萌芽期间用该汁液温育种子(约1至2周)。
可通过针对病毒表达载体上存在的标记基因编码的性状选择或筛选工程植物材料，从而鉴定和分离转基因整株植物、愈伤组织、组织或植物细胞。例如，可通过在含有抑制量抗生素或除草剂的培养基中培养工程植物材料来进行选择，其中转化基因构建物赋予了针对该抗生素或除草剂的抗性。此外，还可通过针对可能存在于病毒表达载体上的任何可见标记基因(例如，GFP或GUS)的活性进行筛选来鉴定转基因植物和植物细胞。此类选择和筛选方法是本领域公知的。
还可应用物理和生物化学方法鉴定含有插入基因构建物的转基因植物或植物细胞。这些方法包括但不限于：Southern分析或PCR扩增、Northern印迹、酶测试法、蛋白质凝胶电泳、蛋白质印迹技术、免疫沉淀技术或酶联免疫测定。还可使用其它技术诸如原位杂交、酶染色和免疫染色来检测异源基因在特定植物器官和组织中的存在和表达。进行所有这些测试法的方法是本领域技术人员公知的。
可用于实现本发明教导的其它参考在以下提供：Agrobacterium delivery of a Ti plasmid harboring both the ZFNs and a donor DNA construct[Cai等(2009)Plant Mol Biol.2008年12月14日接收]。
以上提到的方法、嵌合核酸酶和载体可用于在植物中产生遗传型变异。
以下部分提供了产生此类变异的非限制性应用。
因此，本发明的嵌合核酸酶可用于产生以序列特异性的方式随机插入核酸的识别标志，在本文中也称为标记(tagging)。这一识别标志可用作“遗传标志(genetic mark)”。本文使用这一术语与通常的术语“遗传标记(genetic marker)”区别。后一术语是指在群体中的个体之间天然存在的遗传变异，本文使用的术语遗传标志特别地指可遗传的、人工的(人产生的)、可检测的遗传变异性。
通常将DSB定向至非编码区(非开放阅读框序列)，以便不影响植物表型(例如，对于标记)。然而，也可将标记定向至编码区。如下选择高品质的遗传标志：其对植物基因组是独特的，并且能忍耐序列变异，所述变异可随着繁殖而引入。
对于某些(例如管理)目的，可能期望用公众已知的标志来标志商业上销售的植物，以便使得管理机构可容易地鉴定该标志，从而鉴定所标志的生物的生产商、销售商、所有者或使用者。对于其它目的，秘密可能是有利的。例如，对于防止企图遗传修饰受知识产权法保护的最高等事件的遗传标志而言，后者是真实的。
因此根据本发明有用的实施方案，将也受管理的受知识产权保护的生物通过(a)至少一个公众公知的独特的DNA序列，和(b)至少一个公众未知(至少不是作为遗传标志)的独特DNA序列来进行遗传标志。
为引入异源序列(例如，编码或非编码)，将如本文所描述的那样首先在植物DNA中产生DSB。本领域技术人员公知在这些DNA断裂位点高频率地发生外源DNA的整合[Salomon等，EMBO J(1998)17：6086-6095；Tzfira等，Plant Physiol(2003)133：1011-1023；Tzfira等，Trends Genet(2004)20：375-383，Cai等(2009)Plant Mol Biol.Accepted：14Dec.2008]。一旦存在于靶细胞中，例如在附随质粒中，则可应用在植物DNA中产生DSB的相同的ZFN从该质粒中切下外源DNA。从该附随质粒中释放的外源DNA然后将通过植物非同源末端接合(NHEJ)蛋白整合至细胞DNA中。DSB还可能在植物细胞中导致增强的基于同源重组(HR)的基因打靶(Puchta等Proc Natl Acad Sci USA(1996)93：5055-5060)。
如所提到的那样，本发明的教导可用于产生遗传型变异。因此，可设计本发明教导的嵌合核酸酶，以在目的座位的编码或非编码区域产生DSB，以便引入目的异源基因。在植物基因组中的此类变化因此可导致植物基因表达(上文详细描述)和植物表型特征(例如，颜色、气味等)的添加或改变。
此外，嵌合核酸酶还可用于通过敲除基因表达而产生遗传型变异。因此，可设计嵌合核酸酶以在目的座位的编码或非编码区域产生DSB，以便产生无义或错义突变。备选地，可使用一对嵌合核酸酶以切除基因组的整个序列，由此敲除基因表达。
本发明的嵌合核酸酶还可以用于通过将非特定突变引入植物基因组而产生变异性。这可通过使用非特异性DNA限制酶或非严格Fok1来实现。
作为备选的，本发明的嵌合核酸酶可用于对抗植物病原体的感染。
因此，本发明设想了治疗病原体的植物感染的方法。该方法包括将至少一种表达载体引入该植物，所述表达载体编码至少一种包含DNA结合结构域和核酸酶的嵌合核酸酶，其中该DNA结合结构域介导该核酸酶靶向至病原体的基因组，由此预防或治疗病原体的植物感染。
如本文所使用的“植物病原体”是指在受感染的植物中引起疾病的生物。引起感染疾病的生物包括真菌、卵菌、细菌、病毒、类病毒、病毒样生物、植物菌原体(phytoplasmas)、原生动物、线虫和寄生植物。
由于期望完全破坏病原体的DNA，因此设计嵌合核酸酶以切割该病原体DNA上尽可能多的序列位点。因此，可靶向重复序列。此外或备选地，靶向足以诱导该病原体DNA降解的许多不同的序列。
根据本发明的这一方面的一些实施方案，设计嵌合核酸酶以切割病原体的DNA但是不切割植物DNA。为这一目的，设计缺乏定位信号的嵌合核酸酶，使得该嵌合核酸酶在含有病原体(例如，病毒)DNA但没有植物DNA的细胞质中有活性。
备选地，可设计核酸酶以便切割对病原体特异但不存在于植物基因组中的序列。这可通过常规生物信息学分析来完成，诸如通过应用比对软件，例如Blast(http://wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/blast/Blastdotcgi)。
可应用本发明教导靶向的植物病毒病原体的非限制性列表包括但不限于：种：豌豆早枯病毒(PEBV)，属：烟草脆裂病毒；种：辣椒环斑病毒(PepRSV)，属：烟草脆裂病毒；种：西瓜花叶病毒(WMV)，属：马铃薯Y病毒(Potyvirus)，以及其它来自马铃薯Y病毒属的病毒；种：烟草花叶病病毒(TMV)，属：烟草花叶病毒(Tobamovirus)，以及其它来自烟草花叶病毒属的病毒；种：马铃薯X病毒(PVX)，属：马铃薯X病毒(Potexvirus)，以及其它来自马铃薯X病毒属的病毒。因此，本发明教导设想了靶向RNA以及DNA病毒(例如，双粒病毒或Bigeminivirus)。可靶向的双粒病毒包括但不限于：苘麻花叶bigeminivirus、藿香黄脉bigeminivirus、菜豆印色花叶bigeminivirus、菜豆金色花叶bigeminivirus、Bhendi黄脉花叶bigeminivirus、非洲木薯花叶bigeminivirus、印度木薯花叶bigeminivirus、Chino del tomatébigeminivirus、棉皱叶bigeminivirus、棉曲叶bigeminivirus、棉黄脉花叶bigeminivirus、扁豆黄色花叶bigeminivirus、大戟花叶bigeminivirus、马豆黄色花叶bigeminivirus、麻风树花叶bigeminivirus、利马豆金色花叶bigeminivirus、甜瓜曲叶bigeminivirus、绿豆黄色花叶bigeminivirus、羊角豆曲叶bigeminivirus、辣椒hausteco bigeminivirus、辣椒Texas bigeminivirus、马铃薯黄色花叶bigeminivirus、Rhynchosia花叶bigeminivirus、Serrano金色花叶bigeminivirus、南瓜曲叶bigeminivirus、烟草曲叶bigeminivirus、澳大利亚番茄曲叶bigeminivirus、番茄金色花叶bigeminivirus、印度番茄曲叶bigeminivirus、番茄皱叶bigeminivirus、番茄花斑bigeminivirus、番茄黄色曲叶bigeminivirus、番茄黄色花叶bigeminivirus、西瓜萎黄矮化bigeminivirus和西瓜卷曲花斑bigeminivirus。
本发明还设想了在植物中产生雄性不育的方法。该方法包括通过引入至少一种病毒表达载体至植物中从而在该植物中上调与雄性不育相关的线粒体或叶绿体结构或功能基因，其中所述的病毒表达载体编码至少一种嵌合核酸酶，该嵌合核酸酶包含DNA结合结构域、核酸酶和线粒体或叶绿体定位信号以及核酸表达构建物，所述核酸表达构建物包含至少一种当靶向至线粒体或叶绿体基因组时能上调线粒体或叶绿体结构或功能基因的异源核酸序列，其中该DNA结合结构域介导该异源核酸序列靶向至线粒体或叶绿体的基因组，由此在植物中产生雄性不育。
因此，例如，该核酸构建物包含编码(例如，CMS相关基因)或非编码(例如，用于增强CMS相关基因表达的强启动子)异源核酸序列以及用于嵌合核酸酶的结合位点(与在线粒体或叶绿体基因组上的位点同一)。在被嵌合核酸酶切割后，该异源核酸序列插入到叶绿体或线粒体基因组中的预定位点。
如上所述，细胞质雄性不育(CMS)与线粒体功能不良相关。因此，设计嵌合核酸酶以包含线粒体定位信号(如上文详述)以及对线粒体基因组特异的切割位点。可上调的特定基因包括但不限于：矮牵牛pcf嵌合体，其与nad3和rps12非常接近；稻(Oryza sativa)B-atp6基因的下游序列(即orf79)；玉米T-urf13和orf221；向日葵属atpA下游的orf239；芸苔属的位于atp6上游的orfs(例如，orf139 orf224或orf138和orf158)。应当理解，为诱导CMS，一般在植物中转录这些基因组序列，因此本发明的教导设想应用上述方法靶向这些序列(例如，通过添加编码序列)或过表达它们，从而实现CMS。
应当理解，由细胞核和线粒体基因组之间的不相容产生的CMS表型已用作重要的农学性状，其防止近交并有利于杂种生产。
如上所述，还可通过过表达诸如β-酮硫解酶的叶绿体基因来实现CMS的诱导。之前已显示通过叶绿体基因组过表达β-酮硫解酶诱导了CMS[Ruiz等(2005)Plant Physiol.138 1232-1246]。因此，本发明教导还设想了应用上述方法靶向叶绿体基因或过表达它们(例如，β-酮硫解酶)，以实现CMS。
本发明还设想了产生除草剂抗性植物的方法。该方法包括将至少一种病毒表达载体引入植物，所述病毒表达载体编码至少一种嵌合核酸酶，所述嵌合核酸酶包含DNA结合结构域、核酸酶和叶绿体定位信号，其中该DNA结合结构域介导该核酸酶靶向赋予对除草剂的敏感性的基因，由此产生除草剂抗性植物。
应当理解，在遗传修饰植物领域，非常期望改造对除草剂具抗性的植物。此外，多数除草剂靶通路位于质体中(例如，位于叶绿体中)。因此，为了除草剂抗性植物，设计嵌合核酸酶以包含叶绿体定位信号(如上面详述)以及对叶绿体基因组特异的切割位点。在叶绿体基因组中可靶向的特定基因包括但不限于：叶绿体基因psbA(其编码光合作用醌结合膜蛋白QB，为除草剂阿特拉津的靶)和EPSP合酶的基因(细胞核基因，然而，其在叶绿体中过表达或积累使得对除草剂草甘膦具有抗性，因为其增加了EPSP的转录速率以及减少了该酶的周转)。
如果期望的话，本发明的嵌合核酸酶和表达构建物可以在包装或分配装置或试剂盒中存在。包装例如可包括金色或塑料箔材，诸如泡罩包装。包装或分配装置可附有使用说明书。
预期在从本申请成熟的专利寿命期间，将开发许多相关的病毒载体和嵌合核酸酶，并且这些术语的范围意图很显然地包括所有此类新的技术。
如本文所述的术语“约”是指±10％。
术语“包含”、“包括”、“含有”“具有”以及它们的同根词的意思是“包括但不限于”。这一术语包括术语“由……组成”和“基本上由……组成”。
短语“基本上由……组成”的意思是该组合物和方法可包括其它的成分和/或步骤，只要该其它的成分和/或步骤不会实质上地改变所要求的组合物或方法的基础和新颖特征。
如本文所使用的单数形式“一”和“该”包括复数个指代物，除非上下文清楚地以其它方式表明。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括复数种化合物，包括其混合物。
在本申请中，将以范围格式显现本发明的各个实施方案。应当理解，以范围格式描述仅仅是为了方便和简洁，并且不能认为是对本发明范围的不可变的限制。因此，应当认为范围的描述已具体地公开了所有可能的亚范围以及在该范围内的单个数值。例如，范围的描述诸如1至6应当理解为已具体地公开了诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的亚范围，以及在该范围内的单个数值，例如，1、2、3、4、5和6。不管范围的幅度，这一规定都适用。
本文无论何时表明数值范围，其意味着包括在该所示范围内的任何引证的数值(分数或整数)。短语“在(第一指示数字)和(第二指示数字)范围内”和“在(第一指示数字)“至”(第二指示数字)范围内”在本文中可互换使用，并且表示包括该第一和第二指示数字，以及所有在其中的分数和整数。
如本文所使用的术语“方法”是指完成给定任务的方法、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药学、生物、生物化学和医学领域从业者公知的或他们可很容易地从已知的方法、手段、技术和程序中开发的那些方法、手段、技术和程序。
本文使用的术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓、或逆转疾病的进展，基本上改良状况的临床或美学症状，或基本上预防了状况的临床或美学症状的出现。
应当理解，为了清楚地目的而在分开的实施方案上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中联合提供。相反，为了简要而在单个实施方案上下文中描述的本发明的各个特征也可以独立地或以任意合适的亚组合或适合地在本发明所描述的任何其它实施方案中提供。在各个实施方案上下文中描述的某些特征不能认为是这些实施方案的必要技术特征，除非该实施方案没有这些元素则不能操作。
上文描述的以及在以下权利要求部分要求的本发明的各个实施方案和方面能在以下实施例中找到实验支持。
实施例
参考以下实施例，其与上文的描述一起，以非限制性的方式阐述本发明。
一般地，本文使用的命名法和在本发明中使用的实验方法包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。此类技术在文献中得到了完整地解释。例如，参见″Molecular Cloning：A laboratory Manual″Sambrook等(1989)；″Current Protocols in Molecular Biology″卷I-IIIAusubel，R.M.，编辑(1994)；Ausubel等，″Current Protocols in Molecular Biology″，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，″A Practical Guide to Molecular Cloning″，John Wiley & Sons，New York (1988)；Watson等，″Recombinant DNA″，Scientific American Books，New York；Birren等(编辑)″Genome Analysis：A Laboratory Manual Series″，卷1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；如在美国专利申请号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057中所示的方法；″Cell Biology：A Laboratory Handbook″，卷I-III Cellis，J.E.，编辑(1994)；″Current Protocols in Immunology″卷I-III Coligan J.E.，编辑(1994)；Stites等(编辑)，″Basic and Clinical Immunology″(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell 和Shiigi(编辑)，″Selected Methods in Cellular Immunology″，W.H.Freeman及同事，New York(1980)；在专利和科学文献中深入地描述了可利用的免疫测试，参见例如美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521；″Oligonucleotide Synthesis″Gait，M.J.，ed.(1984)；“Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编辑(1985)；″Transcription and Translation″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编辑(1984)；″Animal Cell Culture″Freshney，R.I.，编辑(1986)；″Immobilized Cells and Enzymes″IRL Press，(1986)；″A Practical Guide to Molecular Cloning″Perbal，B.，(1984)和″Methods in Enzymology″卷1-317，Academic Press；″PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications″，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，″Strategies for Protein Purification and Characterization -A Laboratory Course Manual″CSHL Press(1996)；所有这些都通过引用并入本文，就如同其在本文中全部示出一样。贯穿本文提供了其它普通参考文献。相信其中的方法都是本领域技术人员公知的，并且为了读者的方便而提供。其中所含有的所有信息都通过引用并入本文。
实施例1
产生病毒载体和锌指核酸酶
植物材料
矮牵牛系B1、P720、Burgundy和Royal Blue(Danziger-″Dan″Flower Farm，Mishmar Hashiva，Israel)的生根幼苗常规地用于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感染，用于瞬时表达外源基因。
其它用于接种实验的植物包括Solanum pimpinellifolium La121(Davis University Gene bank)、甜椒(Capsicum annuum)indra1750(S&GSyngeta global LTD.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)[Greenboim-Wainberg等(2005)Plant Cell，17：92-102]、蒿属(Artemisia sp.)(Danziger-″Dan″Flower Farm，Mishmar Hashiva，Israel)，本氏烟(Nicotiana benthamiana)[Radian-Sade等，Phytoparasitica(2000)28：79-86]、菠菜(Spinacia oleracea)和甜菜(Beta vulgaris)(Eden Seeds，Reut，以色列)、烟草(Nicotiana tabacum)CV SAMSUNG[Levy等(2004)Plant Physiol 135：1-6]、烟草CV XANTHI[Ovadis等(1999)在“Plant Biotechnology and In Vitro Biology”中，Kluwer Academic Press，the Netherlands，pp.189-192]、黄瓜(Cucumis sativus)(Eden Seeds，Reut，以色列)，茄子(Solanum melongena)(M.Ben-Sachar LTD，Tel-Aviv，以色列)，陆地棉(Gossypium hirsutum)cv.Siv′on[Saranga等(2004)Plant，Cell and Environment 27，263-277)、甘蓝型油菜(Brassica napus)[Nesi等，C.R.Biologies 331(2008)763-771]、玉米(Zea mays)变种Royalty F1(M.Ben-Sachar LTD，Tel-Aviv，以色列)。所有植物在温室中在25℃/20℃白天/黑夜温度和自然光周期下生长。
质粒构建
使用了携带相应于TRV Ppk20株RNA1(GenBank登录号AF406990)cDNA全序列的pYL44双T-DNA载体pTRV1，以及pTRV2(GenBank登录号AF406991)载体[Liu等.Plant J(2002)30：415-429]。通过将GUS从pBI101(Clontech Laboratories)克隆至pTRV2的MCS(XbaI-SacI位点)产生含有GUS的pTRV2(pTRV2-Gus)。通过从pCHFS-PAP1[Borevitz等，The Plant Cell(2000)12：2383-2393]克隆PAP1至pTRV2-Δ2b的MSC(EcoRI-BamHI位点)产生含有PAP1的pTRV2(pTRV2-Δ2b-Pap)。
通过从原始载体中移除300bp的RNA22b基因产生用于瞬时表达靶基因的pTRV2。为这一目的，用PvuII和EcoRI消化pTRV2DNA，并且用PCR片段替换切除的含有2b部分的片段。这一片段应用pTRV2DNA作为模板和引物A和B(参见下表1)通过PCR产生。在重克隆前，用PvuII和EcoRI对其进行消化。所得到的质粒(pTRV2Δ2b)与原始pTRV2同一，但是缺乏2b序列。以相同的方式产生没有2b但有GUS的质粒pTRV2(pTRV2Δ2b-Gus)，除了用pTRV2-Gus代替pTRV2用作受体质粒。
为产生含有全长TRV 2b的pTRV2(pTRV2-2b)，应用引物A和C(参见下表1)以pK202b-GFP[Vellios等，Virology(2002)300：118-124]作为模板产生1.5Kbp的PCR片段。扩增的片段包括2b基因(来自Ppk20株，GenBank登录号Z36974)，其具有5’和3’UTR以及来自豌豆早枯病毒(PEBV)的外壳蛋白(CP)的亚基因组启动子(sg-P)(GenBank登录号X78455)。该sg-P位于2b下游。为产生在sg-P下游含GFP(GenBank登录号U62637)的pTRV2-2b(pTRV2-2b-Gfp)，将来自pK202b-GFP的PvuII-EcoRI片段转移至用相同的酶消化的pTRV2中。
为产生含有具下游GFP的sg-P的pTRV2Δ2b(pTRV2Δ2b-Gfp)，应用引物F和G*(参见下表1)和pK202b-GFP作为模板产生PCR片段。然后用SacI和SmaI消化这一片段，并克隆至经相同的酶消化的pTRV2Δ2b中。*注意，引物G给Gfp添加了沉默突变，以消除在终止密码子上游的SacI位点。
将具有或没有Ω的Gus基因[Broido等，Physiologia Plantarum(1993)88：259-266]克隆至pTRV2Δ2b-Gfp的MCS中，在PEBV的sg-P的上游，以分别产生pTRV2Δ2b-ΩGus-Gfp和pTRV2Δ2b-Gus-Gfp。通过EcoRI和SacI消化pTRV2-Gus后产生GUS片段。通过将GUS克隆至pDrive(Qiagen)中，至TMV的Ω序列下游(Broido等，同上)SalI-BamHI位点，并且然后用XbaI-KpnI消化得到的质粒以释放ΩGus，从而产生ΩGus片段，并将其重构至pTRV2Δ2b-Gfp中。
如下产生含有ΩGus的pTRV2Δ2b(pTRV2Δ2b-ΩGus)：通过将GUS克隆至pBluescript SK+(Stratagen)，至TMV的Ω序列下游(Broido等，同上)的SalI-BamHI位点上，并且然后用KpnI-SacI消化得到的质粒，以释放ΩGus，并将其重构至pTRV2Δ2b中。
通过将来自pCB301-p19[Voinnet等，Plant J.(2003)33：949-956]的编码p19的519-bp PCR片段(应用引物D和E，参见下表1)转移至pTRV2Δ2b(Obermeier等，Phytopathology(2001)91：797-806]中，从而构建携带有番茄丛矮病毒沉默抑制子p19的pTRV2Δ2b(pTRV2Δ2b-p19)。
首先将全部新形成的pTRV2构建物转化至大肠杆菌中，并且转化至根癌土壤杆菌AGLO[Zuker等Mol.Breeding(1999)5：367-375]中。如之前描述的那样[Zuker等，同上]，用X-gluc溶液定性地评估土壤杆菌中的Gus活性。应用荧光立体显微镜(Leica Microsystems，Wetzlar，德国)定性地分析土壤杆菌中的GFP表达。
通过应用模板pSAT6-DsRed2-N1和引物H及I(参见下表1)制备PCR片段，从而产生含有具下游DsRed2(DsRed，DsRed的GenBank登录号AY818373核苷酸1395-2074，SEQ ID NO：129，pTRV-Δ2b-sgP-DsRed)的sg-P的pTRV2Δ2b。然后用HpaI和SacI消化PCR产物，用T4 DNA聚合酶钝化末端，并克隆(替换GFP)至用HpaI和SmaI消化的pTRV-2Δ2b-GFP中。
构建了pTRV2中两种荧光基因的两种不同组合：
应用2A-样54核苷酸序列(GenBank登录号AF062037核苷酸502-555，SEQ ID NO：81)、Thosea asigna病毒(TaV-T2A)[Donnelly等(2001)J.Gen.Virol，82，1027-1041；Osborn等(2005)Mol.Therapy，12，569-574]以产生编码由DsRed2基因和NLS-EGFP基因组成的单个、长ORF的双顺反子质粒载体。当插入含有两个ORF的单RNA分子时，该序列(编码18个氨基酸的肽)允许两个ORF的独立翻译[Donnelly等(2001)同上；Osborn等(2005)，同上]。
基于矮牵牛的密码子使用(http//worldwidewebdotkazusadotordotjp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝4102)在核苷酸水平修饰T2A序列，并且该经修饰的序列称为pTRV-T2A(参见图2A)。
如下产生含有插入在DsRed2和NLS-EGFP之间的pTRV-T2A序列的质粒：首先，应用pSAT6-NLS-P1-36-ZFN1作为模板，随后用针对FoKI的两个正向引物J&K(下表1)和反向引物S(下表1)进行三联PCR反应产生PCR片段。将得到的产物克隆至缺乏XhoI位点的pBluescript SK(pBS)的BamHI和SacI位点中，以产生pBS-T2A-P36-ZFN2。应用引物N&O(下表1)PCR扩增EGFP(GenBank登录号AY818363，SEQ ID NO：130)，并且克隆至用XhoI和SacI消化的pBS-T2A-P36-ZFN1中NLS的下游，代替ZFN。所得到的质粒称为pBS-T2A-NLS-EGFP。应用引物H&M(下表1)扩增DsRed2。将所得到的缺乏终止密码子的DsRed2连接SalI-BamHI片段至pBS T2A-NLS-EGFP，位于T2A上游，产生具有双顺反子ORF的pBS-DsRed-T2A-NLS-EGFP。然后将来自该质粒的DsRed-T2A-NLS-EGFP片段连接至pTRV2-Δ2b-sgP的HpaI-SacI位点，以产生pTRV2-Δ2b-sgP-DsRed-T2A-NLS-EGFP。
产生含有在分开的亚基因组启动子下的两个荧光标记的pTRV2-Δ2b-sgP，其中首先用SmaI消化pTRV2-Δ2b-sgP-GFP。将应用pTRV2-Δ2b-sgP-DsRed作为模板以及引物P&Q(见下表1)产生的PCR片段克隆至这一SmaI中，产生pTRV2-Δ2b-sgP-GFP-sgP-DsRed。
表1：引物
 引物   序列
 A   TGGAGTTGAAGAGTTATTACCGAACG(SEQ ID NO：1)
 B   AAGAATTCGAAACTCAAATGCTACCAA(SEQ ID NO：2)
 C(PEBV-sgP R)   TAGAATTCTCGTTAACTCGGGTAAGTGA(SEQ ID NO：3)
 D(P19-F)   AAACTCGAGATGGAACGAGCTATACAAGGAA(SEQ ID NO：4)
克隆允许将基因产物靶向至质体的pTRV2病毒载体
为产生靶向至叶绿体的EGFP，发明人应用引物V&O(参见上表1)及应用之前由Bezawork描述的[Bezawork(2007)M.Sc Thesis，提交给Agricultural Research Organization，Volcani center and the Faculty of Agriculture]质粒pTEX-Rssu-GFP作为模板，扩增了含有与EGFP融合的豌豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚单位(Rssu)转运肽(GenBank登录号X00806，核苷酸1086-1259，SEQ ID NO：138)的PCR片段。在用HpaI钝化后，将该PCR产物克隆至pTRV2-Δ2b-sgP的sgP下游，以产生pTRV2-Δ2b-sgP-Rssu-EGFP。
为产生靶向至线粒体的EGFP，发明人应用引物W&O(参见上表1)及应用之前由Bezawork描述的[Bezawork(2007)，同上]质粒pTEX-ATPβ-GFP作为模板，扩增含有与EGFP融合的Nicotiana sylvestris ATP酶β亚单位(ATP-β)信号肽(GenBank登录号U96496，nsatp2.1.1，核苷酸12至167，SEQ ID NO：139)的PCR片段。在用HpaI钝化后，将该PCR产物克隆至pTRV2-Δ2b-sgP的sgP下游，以产生pTRV2-Δ2b-sgP-ATP β-EGFP。
用TRV病毒接种植物
如之前描述的那样[Liu等，Plant J(2002)30：415-429]制备用pTRV1、pTRV2和pTRV2衍生物转化的根癌土壤杆菌(AGLO株)。在28℃，在补充有50mg/L卡那霉素和200μM乙酰丁香酮(A.S.)的LB培养基中培养土壤杆菌培养物过夜。收集细胞并在含有10mM MES、200μM A.S.和10mM MgCl2的接种缓冲液中重悬至OD600为10。在28℃再温育3小时后，以1∶1的比例混合具有pTRV1的细菌和含有pTRV2衍生物的细菌。当涉及超过一种pTRV2的共感染时，具有pTRV1的土壤杆菌在混合物中总是50％。应用200-400μl土壤杆菌混合物注射至茎中。还将土壤杆菌注射至移除顶生分生组织后暴露的苗表面。
感染的另一选择是应用无针头注射器的叶渗入：将注射器的土壤杆菌内容物释放至划破的叶子表面。对于不使用土壤杆菌的用TRV对植物的感染，首先用pTRV1和pTRV2或其衍生物接种本氏烟(N.benthamiana)或N.clevelandii(TRV的通常宿主)。感染后(dpi)约15至21天，收集植物叶子(作为新鲜制备的汁液感染来源)并且通过研钵和杵在20mM磷酸盐缓冲液(pH-6.8)中提取汁液。
对于植物的病毒粒子感染(不使用土壤杆菌的TRV感染)，发明人首先用pTRV1和pTRV2(或其衍生物)接种矮牵牛、烟草cv Samsung或本氏烟(TRV的通常宿主)。感染后(dpi)约5至21天，发明人收集植物叶子，并通过研钵和杵在20mM磷酸盐缓冲液pH＝6.8和表面活性剂(例如，0-0.03％Silwet L-77)中提取汁液。将含有TRV的汁液滴在纱布(cheesecloth)上或离心，并在添加金刚砂细粉(以提高感染)后，轻轻地划破幼植物(约1个月大)的茎和叶。
体外生长的植物的汁液感染：首先使汁液通过0.22μm滤片，然后损伤组织培养繁殖的植物的茎，并且应用注射器和针头感染。
对于玉米(单子叶植物)感染，在膨胀和萌芽期间用该汁液温育种子(约1至2周)。
除了土壤杆菌AGLO株之外，发明人还成功地应用EHA-105[Tovkach等，Plant J.(2009)57，747-757]株用于递送各种pTRV构建物。
为了应用根癌土壤杆菌AGLO或EHA-105细菌接种体外生长的植物，应用了无葡萄糖但具有10mM MgSO4和50μg/ml乙酰丁香酮(A.S.)的MS溶液[Murashige和Skoog，Physiol Plant(1962)15：473-497]，并将细菌的浓度降低至每一TRV为0.08-0.8OD 600nm。应用汁液或通过真空渗入基本上如上所述进行感染。
表达分析
每一表达实验重复三次，并且每一实验包括每次处理的至少四株植物。在实验期间收集测试植物分生组织(每株植物至少2个)若干次。应用UV照射完成GFP成像，并且应用装备有数码相机和用于455-490nm激发和超过515发射的滤光片组的荧光立体显微镜(Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)获得照片。应用在合适缓冲液中的底物1mM 5-溴-4氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸(X-gluc.，Duchefa Biochemie B.V.Haarlem，Netherlands)评估Gus活性(Zuker等，同上)。在37℃用底物混合物温育过夜之前，用底物真空渗入植物组织30分钟。然后将底物溶液更换为75-95％乙醇，历时数天，用于叶绿素漂白，并应用立体显微镜观察该组织。
应用UV照射完成DsRed2成像，并且应用装备有数码相机和用于530-560nm激发和在590-650发射的滤光片组的荧光立体显微镜(Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)获得照片。
还应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM510，Zeiss Jena Germany)产生EGFP和DsRed2成像。对于EGFP，将激发设置在488nm以及在505-530nm发射，对于DsRED2，将激发设置在545nm以及在585-615nm发射。对于叶绿素自发荧光，将激发设置在488nm以及在超过650nm发射。
原生质体的制备
如之前通过Locatelli[Locatelli等，Plant Cell Reports(2003)21：865-871]描述的那样应用矮牵牛叶产生原生质体。
转基因植物
将之前由Tovkach[Tovkach等(2009)，同上]描述的双载体pRCS2[QQR-TS*::GUS]转移至根癌土壤杆菌，然后使用标准叶盘转化方法[Guterman等，Plant Mol.Biol.(2006)60：555-563]应用该根癌土壤杆菌转化矮牵牛cv Burgundy和烟草cv.Samsung。
鉴定矮牵牛非编码基因组序列
应用标准方案制备矮牵牛cv.Royal Blue的基因组DNA。首先应用EcoRI和HindIII消化基因组DNA，随后琼脂糖(1％)凝胶电泳。接下来，通过凝胶提取试剂盒(iNtRON Biotechnology，INC.LTD，韩国)从该凝胶中提取1-1.5Kbp片段。将这些片段连接至pBS-SK(IRACompany)，以形成在大肠杆菌中的半基因组文库。通过Macrogen Inc.(首尔，韩国)产生110个基因组片段的序列。用所产生的基因组矮牵牛序列针对核苷酸集和非人、非小鼠EST文库进行两个BLAST分析(核苷酸blast和tblastx)，以允许消除所有假定的转录/翻译DNA。对具有高于5的BLAST E值的所有序列进一步进行评估，以鉴定具有最短ORF(对于所有6种阅读框)且具有最小重复AAAA和TTTT区域的那些。最后选择了两个矮牵牛基因组DNA片段作为非编码、非重复序列，即P1-25(1.2Kbp，图2B)和P1-36(1.175Kbp，图3)。
在这些序列内，设计了用于锌指核酸酶(ZFN)的靶位点。锌指蛋白能够识别几乎任何18bp长的靶序列，其足以决定植物基因组中的独特位置。所使用的靶位点(人造回文样序列靶，在图2-3中以蓝色标记)是：
P1-25位点1：TCC-TCC-TGC(SEQ ID NO：10)
     位点2：GAG-GGG-GAA(SEQ ID NO：11)
P1-36位点1：ACC-ACC-ATC(SEQ ID NO：12)
     位点2：GGT-TGA-GAG(SEQ ID NO：13)
在矮牵牛中鉴定PDS和FHT序列作为ZFN靶位点
通过再测序(基于GenBank登录号AY593974.1，SEQ ID NO：131)确认来自矮牵牛RB的八氢番茄红素去饱和酶(PDS)外显子序列，并将其用作ZFN的靶位点。突出显示的序列(图28A)用作PDS-ZFN蛋白的靶位点(SEQ ID NO：71和73)。
鉴定了来自矮牵牛RB的黄烷酮3β-羟化酶(FHT)外显子序列(GenBank登录号AF022142.1，SEQ ID NO：133)，并将其用作ZFN的靶位点。该序列通过再测序得以确定。突出显示的序列(图29)用作FHT-ZFN蛋白的靶位点(SEQ ID NO：75和77)。
设计锌指核酸酶(ZFN)
基于之前由Desjarlais和Berg[Desjarlais和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：2256-2260]开发的锌指框架共有序列设计锌指蛋白编码区。例如，为表达对P 1-25矮牵牛随机DNA片段上的gagggggaa序列(位点2，SEQ ID NO：11)具有预期亲和力的锌指内切核酸酶，在PCR反应中通过PFU聚合酶(Invitrogen)从以下重叠的寡核苷酸集组装锌指262bp结构域：BBO1(5′GAAAAACCTTACAAGTGTCCTGAATGTGGAAAGTCTTTTTCT，SEQ ID NO：14)，BBO2M(5′CAGCGAACACACACAGGTGAGAAGCCATATAAATGCCCAGAATGTGGTAAATCATTCAG，SEQ ID NO：15)，BBO3M(5′CAACGGACCCACACCGGGGAGAAGCCATTTAAATGCCCTGAGTGCGGGAAGAGTTTTT，SEQ ID NO：16)，FtsH2-Z1.1-GAA(SEQ ID NO：17)，P1-25-ZFN2.2GGG(SEQ ID NO：18)和P1-25-ZFN2.3GAG(SEQ ID NO：19)，然后应用BBO1-XhoI-F(SEQ ID NO：20)和SDO3-Spel-R(SEQ ID NO：21)引物PCR扩增产生DNA结合结构域P1-25-ZFN2bd。
在每一PCR反应中，以0.005pM的浓度混合BBO和SDO，并且用PFU聚合酶(Invitrogen)扩增35个循环。应用相同的策略，仅仅使用不同的寡核苷酸(参见下表2)，组装P1-25-ZFN1bd、P1-36-ZFN1bd和P1-36-ZFN2bd DNA结合结构域。用于组装在这一工作中使用的ZF结合结构域的PCR程序概述阐述于图4中。
图2：用于产生DNA结合结构域P1-25-ZFN1bd，P1-36-ZFN1bd和P1-36-ZFN2bd的重叠寡核苷酸序列
Figure BPA00001278962000491
将扩增的DNA结合结构域作为XhoI-SpeI片段克隆至pSAT6-NLS-FokI的相同位点，产生pSAT6-NLS-P1-25-ZFN1(SEQ ID NO：31)、pSAT6-NLS-P1-25-ZFN2(SEQ ID NO：32)、pSAT6-NLS-P1-36-ZFN1(SEQ ID NO：33)和pSAT6-NLS-P1-36-ZFN2(SEQ ID NO：34)表达载体(图5A-D)。pSAT6-NLS-FokI由pSAT载体[GeneBank AY818383，Tzfira等，Plant Mol Biol(2005)57：503-516]、克隆至NcoI-XhoI位点的30bp NLS(细胞核定位信号，SEQ ID NO：46)和克隆至pSAT6的SpeI-BamHI位点中的FokI内切核酸酶584bp片段(核苷酸1164至1748；GeneBank J04623)组成。
为在大肠杆菌细胞中表达His标记的锌指内切核酸酶，将NLS-P1-25-ZFN1、NLS-P1-25-ZFN2、NLS-P1-36-ZFN1和NLS-P1-36-ZFN2片段作为NcoI-BamHI插入片段从它们相应的质粒中克隆至经修饰的pET28(pET28.SX，图5E)的相同位点中，产生pET28.SX-NLS-P1-36-ZFN1、pET28.SX-NLS-P1-36-ZFN2、pET28.SX-NLS-P1-25-ZFN1和pET28.SX-NLS-P1-25-ZFN2。在pET28.SX中，组装的ZFN克隆至pET28载体(Novagen)的T7启动子下游。完整的ZFN构建物还含有编码位于蛋白C端的6xHis-标签的序列。
在BL21 GOLD(DE3)PlyS细胞(Stratagene)中进行pET28.SX-NLS-P1-36-ZFN1、pET28.SX-NLS-P1-36-ZFN2、pET28.SX-NLS-P1-25-ZFN1和pET28.SX-NLS-P1-25-ZFN2的表达。在100ml补充有Kan(50ug/ml)和100μM ZnCl2的LB培养基中在22℃培养细胞培养物，直到0.6的OD600，然后用0.7mM IPTG诱导细胞3小时。通过离心收集细胞，重悬于35ml含有25mM Tris-HCl(pH7.5)、300mM NaCl、5％甘油和100μM ZnCl2的混合物中，通过弗氏细胞压碎器(French Press)裂解两次。将蛋白上样至0.5ml Ni-NTA琼脂糖小球(Qiagen)上，并用1ml含500mM咪唑的缓冲液洗脱。将洗脱的蛋白质在50％甘油中在-20℃储存。
用NEB4缓冲液将各种量的大肠杆菌和Ni-NTA纯化的ZFN与0.5μg靶DNA混合，并且通过琼脂糖凝胶电泳分离经消化的DNA底物。
克隆允许表达ZFN的pTRV2病毒载体
在pSAT构建物(pSAT6-P1-36-ZFN1、pSAT6-P1-36-ZFN2、pSAT6-PDS-ZFN1、pSAT6-PDS-ZFN2、pSAT6-FHT-ZFN1、pSAT6-FHT-ZFN2)中的ZFN插入片段分别以非特异性结构域NLS和FokI开始和结束。为产生适于在植物细胞中递送和表达不同ZFN的pTRV2，发明人应用正向引物R和反向引物L(对于pSAT6-P1-36-ZFN2、pSAT6-PDS-ZFN1、pSAT6-FHT-ZFN1)或T(对于pSAT6-P1-36-ZFN1、pSAT6-PDS-ZFN2、pSAT6-FHT-ZFN2)(参见上表1)扩增ZFN。用HpaI和SacI(对于引物L)或SmaI(对于引物T)消化得到的扩增产物，钝化末端(在SacI的情况下)并且插入到pTRV2-Δ2b-sgP的HpaI-SmaI位点中。这产生了pTRV2-Δ2b-sgP-PDS-ZFN1(图31A，SEQ ID NO：70)、pTRV2-Δ2b-sgP-PDS-ZFN2(图31B，SEQ ID NO：72)；pTRV2-Δ2b-sgP-FHT-ZFN1(图32A，SEQ ID NO：74)、pTRV2-Δ2b-sgP-FHT-ZFN2(图32B，SEQ ID NO：76)；pTRV2-Δ2b-sgP-P36-ZFN1(SEQ ID NO：33)和pTRV2-Δ2b-sgP-P36-ZFN2(SEQ ID NO：34)。
为产生pTRV2-Δ2b-sgP-QEQ-ZFN(SEQ ID NO：82)，发明人首先应用引物U和S(参见上表1)以及应用pSAT4.hspP.QQR[Tovkach等(2009)，同上]作为模板产生PCR产物。用XhoI和SpeI消化产物，并且插入到经XhoI和SpeI消化的、缺乏ZF的质粒pTRV2-Δ2b-sgP-P36-ZFN2(图33)中。
为产生含有两个与T2A连接的ZFN的构建物(pTRV2-Δ2b-sgP-P36-ZFN2-T2A-P36-ZFN1，SEQ ID NO：84)，将来自pTRV2-Δ2b-sgP-P36-ZFN2含有sgP-NLS-P1-36-ZFN2的BamHI片段克隆至pBS-T2A-NLS-36-ZFN1的独特BamHI位点。这产生了pBS-sgP-P36-ZFN2-T2A-P36-ZFN1。用SacI消化这一质粒，并且将所释放的含有sgP-P36-ZFN2-T2A-P36-ZFN1的片段克隆至用SacI线性化的pTRV2-Δ2b中，产生pTRV2-Δ2b-sgP-P36-ZFN2-T2A-P36-ZFN1。
为产生pTRV2-Δ2b-sgP-PDS-ZFN1-T2A-PDS-ZFN2(SEQ ID NO：86)和pTRV2-Δ2b-sgP-FHT-ZFN1-T2A-FHT-ZFN2(SEQ ID NO：88)，发明人首先用XhoI & SpeI(在ZF序列两侧)消化pBS-T2A-NLS-36-ZFN1、pSAT6-FHT-ZFN2和pSAT6-PDS-ZFN2。发明人然后将从后两个质粒中释放的片段连接至经消化的pBS-T2A-NLS-36-ZFN1中，产生pBS-T2A-NLS-PDS-ZFN2和pBS-T2A-NLS-FHT-ZFN2。用BamHI消化质粒pTRV2-Δ2b-sgP-PDS-ZFN1和pTRV2-Δ2b-sgP-FHT-ZFN1，以释放sgP-PDS-ZFN1和sgP-FHT-ZFN1，然后将它们分别连接至经BamHI消化的pBS-T2A-NLS-PDS-ZFN2和pBS-T2A-NLS-FHT-ZFN2中。用SacI消化这些质粒，并且然后将所释放的片段克隆至pTRV2-Δ2b中的MCS的独特SacI位点中，分别产生pTRV2-Δ2b-sgP-PDS-ZFN1-T2A-PDS-ZFN2和pTRV2-Δ2b-sgP-FHT-ZFN1-T2A-FHT-ZFN2。
实施例2
通过pTRV2-Δ2b载体表达外源基因
将RNA2-2b片段(300bp的SEQ ID NO：43，描述于SEQ ID NO：50)从pTRV2(GenBank登录号AF406991)中完全地移除，以产生pTRV2-Δ2b(参见上文实施例1，以及图6A-B)。发明人对在分生组织中表达报告基因感兴趣，因此在这些组织中评估报告基因表达。用pTRV2-Δ2b-GUS和pTRV2-GUS接种矮牵牛植物，并且比较了通过这些载体表达外源基因(即GUS)的效率。在感染后一周至两个月评估GUS的表达，并且给出了表达GUS的分生组织占所分析的分生组织总数的百分比(参见下表3)。如从结果清楚地看出，没有2b区域的pTRV2在分生组织中表达GUS更有效得多。此外，在用缺乏GUS的TRV接种的矮牵牛植物中没有显著的GUS染色。在接种植物的分生组织中的典型GUS表达阐述于图7A-E中。如从图7E可清楚地看出的那样，在用pTRV2-Δ2b-GUS接种后的矮牵牛植物的GUS染色甚至在组织培养物多轮繁殖(通过腋生分生组织)之后仍然是显著的。用于测试基于pTRV2的载体在表达外源基因中的可利用性的其它标记基因是GFP和PAP1。用这些载体接种矮牵牛和其它植物(甜椒、Solanum pimpinellifolium、本氏烟，拟南芥，黄花蒿(Artemisia annua)、菠菜和甜菜)导致在所有所分析的植物中的分生组织中表达这些报告基因(图8A-G)。
表3：在用pTRV2-Δ2b-GUS和pTRV2-GUS接种的矮牵牛植物中的GUS表达
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实施例3
通过Ω翻译增强子增强外源基因的表达
在TMV的5′UTR的70bp(Ω)是非编码序列，其显示为翻译增强子(SEQ ID NO：44)[Gallie等，Nucl.Acid.Res.(1987)15：8693-8710]。将Ω克隆至pTRV2病毒载体中报告基因的上游，以评估其是否能够促进外源基因的表达水平(参见图6A，C)。如图9A-B所示，用pTRV2-Δ2b-ΩGUS载体接种矮牵牛植物导致与应用pTRV2-Δ2b-GUS载体(缺乏Ω增强子)相比更高的GUS活性水平。应当注意，Ω片段没有影响表达GUS的分生组织在所分析的分生组织总数中的百分比。
实施例4
通过pTRV2载体共表达两个外源基因
开发了两种允许共表达两个编码序列的方法。首先，产生了携带有附加亚基因启动子(sgP)序列的pTRV2载体，因此允许共表达两个编码序列(参见图6A、D)。将PEBV的外壳蛋白亚基因组启动子用于这一目的。为测试载体活性，将GFP报告基因克隆至这一亚基因组启动子的下游，产生pTRV2-Δ2b-sgP-GFP。用这一载体接种本氏烟植物，导致在分生组织中表达GFP(图10A)。
在备选的用于共表达两个外源基因的方法中，用pTRV2-Δ2b-GUS和pTRV2-Δ2b-GFP共接种本氏烟植物(图10B-C)。基于在组织中分析GFP表达，并随后在相同的组织中分析GUS染色，从而揭示两种报告基因的共表达。
实施例5
通过pTRV载体在大量各种植物中表达外源基因
用pTRV1和pTRV2-Δ2b-sgP-DsRed接种不同植物(例如，本氏烟(N.benthamiana)、烟草(N.tobaccum)和矮牵牛(Petunia hybrida))导致在这些植物的细胞中高水平地表达标记基因(图11A-F)。由于全身感染，在这些植物的不同部分能很容易地检测到持续(数月)的强表达(图12A-H)。用这一载体接种各种植物(例如，黄瓜、茄子，陆地棉cv.Siv’on(棉)，甘蓝型油菜(油菜(canola))、甜菜(甜菜(beet))、菠菜)导致该报告基因在所有所分析的植物中表达(图13A-K)。
实施例6
通过TRV载体在单子叶植物中表达外源基因
为测试基于pTRV2的载体用于在单子叶植物(例如玉米)中表达外源基因的可用性，用从pTRV1和pTRV2-Δ2b-sgP-DsRed感染的矮牵牛植物中产生的汁液温育种子(如上文实施例1中所详细描述的那样)。图14A-C清楚地显示了DsRed在胚芽鞘中的表达。
实施例7
线粒体和叶绿体质体：TRV载体介导的质体靶向表达
如上文实施例1所述，发明人已构建了分别含有叶绿体转运肽和线粒体信号肽的两个载体pTRV2-Δ2b-sgP-Rssu-EGFP和pTRV2-Δ2b-sgP-ATPβ-EGFP。发明人将两个pTRV2-Δ2b-2sgP-tp-EGFP(tp在此处代表转运肽和信号肽)土壤杆菌渗入至矮牵牛cv RB和本氏烟中。首先通过荧光立体显微镜分析EGFP表达，然后通过共聚焦激光扫描显微镜分析荧光叶片区。叶绿体的大小和自发荧光(488nm激发，超过650nm发射)使得能够将EGFP(488nm激发，505-530nm发射)的表达定位至叶绿体中(图15A-G)。
对于线粒体的鉴定，制备了原生质体，并且应用了红色荧光线粒体特异性试剂(MitoTracker
Figure BPA00001278962000541
Invitogen inc.USA)。应用545nm激发和585-615nm的发射使得区分了叶绿体和MitoTracker的荧光。根据mitotracker信号的大小和位置，发明人揭示了EGFP的表达位于线粒体中(图16A-K)。
实施例8
在各种植物中共表达两种报告基因
使用了数种方法以在植物(矮牵牛、本氏烟或烟草)细胞中同时表达两个基因。在一种方法中，用两种TRV载体同时接种植物，一种携带有一个标记基因，以及另一种携带有另一标记基因。具体地，用pTRV1和两个pTRV2载体，即pTRV2-Δ2b-sgP-DsRed和pTRV2-Δ2b-sgP-Rssu-EGFP共感染植物。经体外土壤杆菌渗入的烟草cv Xanthi植物的共聚焦荧光扫描显微镜结果显示EGFP和DsRed的共表达(图17A-D)。
用于共表达两个基因的第二和第三种方法应用构建有串联的两个报告基因的pTRV2来说明。该基因由T2A分开(图18A-L)或通过分开的双亚基因组启动子驱动(图19A-J)。如图18A-L所示，在用pTRV2-Δ2b-sgP-DsRed-T2A-NLS-EGFP接种植物后，GFP和DsRed的共表达是很清楚的。类似地，如图19A-J所示，在用pTRV2-Δ2b-sgP-GFP-sgP-DsRed接种植物后，GFP和DsRed的共表达是很清楚的。
实施例9
特异性锌指核酸酶(ZFN)的产生
在测序了110个基因组片段后，鉴定了矮牵牛的非重复假定的非编码基因组序列(参见上文实施例1)。合成了两组ZFN，即25-ZFN-1、25-ZFN-2和36-ZFN-1、36-ZFN-2，以在矮牵牛特异DNA序列中形成双切口，即分别是P1-25和P1-36。为测试所产生ZFN的核酸酶活性，产生含有回文样形式的靶序列的PCR片段，并且将这些片段与特异性ZFN温育。如图20所说明的那样，PCR片段被每一ZFN消化为预期的大小。
为进一步证实ZFN活性，产生了携带P1-36的pBS载体。与纯化的ZFN，36-ZFN1和36-ZFN2，一起温育携带有靶序列的P1-36的740bp片段(通过用NcoI/BamHI*消化pBS-P1-36而产生)产生了预期大小的片段(图21，由箭头示出)。注意，BamHI以及SmaI是pBS多克隆位点(MCS)的一部分，正好位于克隆位点EcoRI上游。NcoI位点是P1-36序列的一部分，并且在P1-36位点2的下游200bp。此外，如预期的那样，单个的36-ZFN1和36-ZFN2没有产生消化产物。而且，如图22所说明的那样，36-ZFN1和36-ZFN2的联合成功地消化了由pBS-P1-36携带的靶序列P1-36。
此外，在测序基因组片段后鉴定了矮牵牛八氢番茄红素去饱和酶(PDS)基因组序列(参见图28A)。合成了ZFN组，即PDS-ZFN1和PDS-ZFN2(如上文实施例1所详述的那样)，以在矮牵牛特异PDS DNA序列中形成双切口。为测试所产生的ZFN的核酸酶活性，构建了携带半回文靶序列的质粒，并将这些质粒与特异性ZFN温育。如图23所说明的那样，进行了由特异性ZFN对携带有人造靶位点PDS1和PDS2(分别是PDS-TS1和PDS-TS2)的质粒的消化。质粒被AgeI和PDS-ZFN1或PDS-ZFN2消化为预期的大小。
总之，这些结果结论性地显示外源基因能在包括矮牵牛分生组织在内的植物分生组织中表达。此外，这些结果显示了矮牵牛DNA通过ZFN的体外特异性消化。
实施例10
产生包含ZFN的病毒表达载体
进行由pTRV表达载体对ZFN的表达，以确定在矮牵牛中共表达ZFN的最佳方式。测试了3种方法，其中的每一种都首先如上面详细描述的那样用两个荧光报告基因(GFP和DsRFP)测试。将这些荧光报告基因递送至矮牵牛植物中，并应用荧光显微镜检查它们在分生组织细胞中的共表达。基于这些结果，将产生ZFN表达载体。
在第一个方法中，将每一个基因分别地克隆至pTRV2-Δ2b-Ω中，克隆至SalI-SacI位点。然后用两个pTRV2质粒(一个携带有GFP，并且另一个携带有DsRFP)同时共感染植物。
在第二种方法中，将两个基因引入相同的pTRV2(pTRV2-Δ2b-Ω)中，每一个基因具有不同的亚基因组启动子(sg-P)。然后用该pTRV2质粒感染植物。
第三种方法基于能在C端切割其自身的“2A样”蛋白[(Donnelly等，J.Gen.Virol.(2001)82：1027-1041；Osborn等，Molecu.Therapy(2005)12：569-574]。昆虫病毒Thosea asigna的“2A样”蛋白序列EGRGSLLTCGDVEENPGP(SEQ ID NO：41，T2A)介导有效的共翻译切割事件，其导致释放每一个单个的蛋白产物。在自切割后，C端Pro是剩余在下游蛋白中的唯一的氨基酸。合成编码该“2A样”蛋白的这些18个氨基酸的寡聚体(T2A)。基于矮牵牛密码子使用设计该核苷酸序列(密码子使用数据库http://wwwdotkazusadotordotjp/codon)。为共翻译地表达GFP和DsRFP，将它们符合阅读框地克隆至pTRV2-Δ2b-Ω，由T2A 18个氨基酸分开。为通过这一方法将ZFN递送至细胞核，将以Pro开始的细胞核定位信号(NLS)序列融合至它们的5’端。因此，Pro由NLS和T2A共有，即T2A最后的3’Pro代表NLS的第一个氨基酸。这消除了引入其它外源序列至NLS 5’端的需要。最终的插入物是KpnI-Ω-NLS-ZFN2-T2A-NLS-ZFN1-SacI。例如，应用携带有由T2A分开的DsRFP和GFP的pTRV2-Δ2b-sgP-CP-PEBV(图24A-B)，产生了共表达两个报告基因的矮牵牛组织。
对第三种方法的任选修饰是将在N端具有T2A的一个ZFN(T2A-NLS-ZFN1片段)下游地且符合阅读框地与TRV1 16K基因一起克隆(图6E)。在这种情况下，用经修饰的pTRV1和pTRV2(每一个仅携带一个外源ZFN基因)进行矮牵牛植物的土壤杆菌感染。
实施例11
植物中pTRV-载体介导的GUS表达的活化
发明人利用了之前由Tovkach等[Tovkach等(2009)，同上]描述的基于锌指的转基因修复工具，以产生携带有突变uidA(GUS)基因的矮牵牛和烟草转基因植物。改造了突变的uidA基因以在QEQ-ZFN靶位点的6-bp间隔子内携带TGA(终止)密码子(参见图25A)，导致了uidA在植物细胞中翻译的提前终止。因此，在该转基因植物中不能检测到GUS表达(图26I)。在ZFN靶位点之间的间隔子中消化DNA(通过使用特异性ZFN)及其相继的修复通常导致该终止密码子的缺失和/或突变，并且导致了uidA报告基因的随后活化(图25B)。为这一目的，将对该突变uidA基因特异的QEQ-ZFN克隆至pTRV2-Δ2b-2sgP病毒载体中(如在上文实施例1详细描述的那样)，并且应用得到的pTRV2-Δ2b-sgP-QEQ-ZFN接种转基因突变uidA基因。从结果可清楚地看到(图26A-J)，在体组织和分生组织中TRV-驱动的QEQ-ZFN表达导致了GUS表达的活化。
实施例12
在用pTRV2-Δ2b-sgP-QEQ-ZFN接种后具活化的GUS表达的转基因烟草和矮牵牛植物中的分子分析
在用pTRV1和pTRV2-Δ2b-sgP-QEQ-ZFN接种之前或7-30天后，用苯酚-氯仿法从GUS转基因矮牵牛和烟草植物(携带有突变的uidA(GUS)基因)的叶中提取总植物DNA。用DdeI消化总DNA 3小时，并且应用引物5′-CTATCCTTCGCAAGACCCTTCC-3′(35S-F，SEQ ID NO：90)和5′-GTCTGCCAGTTCAGTTCGTTGTTC-3′(GUS-R-401，SEQ ID NO：91)PCR扩增ZFN靶位点周围的区域。用DdeI再次消化得到的PCR片段，并且再次扩增其未被消化的级份，并TA克隆至pGEM-T-easy(Promega inc.，WI，USA)。然后选择随机选择的集落，并测序DNA片段。
图27显示了在转基因烟草或矮牵牛植物中，由QEQ-ZFN活化后的GUS序列与原始GUS序列相比较的变化。
实施例13
用特异性ZFN接种后的矮牵牛植物中经修饰的PDS的分子分析
如在上文实施例1中详细描述的那样，本发明的发明人产生了特异性地切割矮牵牛植物PDS基因的ZFN。为分析用pTRV2-Δ2b-sgP-PDS-ZFN1-T2A-PDS-ZFN2接种后，对PDS基因进行的分子修饰，应用苯酚-氯仿法从野生型(WT)或经pTRV1和pTRV2-Δ2b-sgP-PDS-ZFN1-T2A-PDS-ZFN2处理的矮牵牛植物的叶中提取总植物DNA。应用引物5′-TATTGAGTCAAAAGGTGGCCAAGTC-3′(phPDS-F208，SEQ ID NO：117)和5′-GCAGATGATCATATGTGTTCTTCAG-3′(phPDS-R-487，SEQ ID NO：118)，PCR扩增ZFN靶位点(TS)周围的区域。用MfeI消化PCR产物过夜，再次扩增得到的未被消化的级份，并TA克隆至pGEM-T-easy(Promega inc.，WI，USA)中。然后测序来自随机选择的集落的插入物。图28B描述了由特异性PDS-ZFN修饰后，PDS序列与矮牵牛植物中原始PDS序列相比较的改变。
尽管本发明已结合其特定的实施方案进行了描述，但不言自明地，许多改变、修改和变形对本领域技术人员而言都是显而易见的。因此，其意图包含落入所附权利要求的精神和宽范围内的所有此类改变、修改和变形。
在这一说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均在此通过引用全文地并入该说明书，如同特别地且单个地表明每一单个的出版物、专利或专利申请均通过引用并入本文一样的程度。此外，在这一申请中的任何参考文献的引用或识别均不能理解为承认此类参考文献可作为本发明的现有技术加以利用。在使用节标题的程度，不能将它们理解为必要的限制。
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Claims (53)

1.在植物基因组中产生遗传型变异的方法，所述方法包括将至少一种病毒表达载体引入植物中，所述的病毒表达载体编码至少一种包含DNA结合结构域、核酸酶以及定位至含DNA细胞器的定位信号的嵌合核酸酶，其中所述的DNA结合结构域介导所述核酸酶特异性地靶向植物基因组，由此在植物基因组中产生遗传型变异。
2.治疗病原体的植物感染的方法，所述方法包括将至少一种病毒表达载体引入所述植物中，所述的病毒表达载体编码至少一种包含DNA结合结构域和核酸酶的嵌合核酸酶，其中所述的DNA结合结构域介导所述核酸酶靶向病原体基因组，由此预防或治疗病原体的植物感染。
3.标记植物基因组的方法，所述方法包括将至少一种病毒表达载体引入植物中，所述的病毒表达载体编码至少一种包含DNA结合结构域、核酸酶以及定位至含DNA细胞器的定位信号的嵌合核酸酶，其中所述的DNA结合结构域介导所述核酸酶特异性地靶向植物基因组，由此标记植物基因组。
4.在植物中产生雄性不育的方法，所述方法包括在所述植物中上调与雄性不育相关的线粒体或叶绿体结构或功能基因，其通过将至少一种编码至少一种包含DNA结合结构域、核酸酶以及线粒体或叶绿体定位信号的嵌合核酸酶的病毒表达载体和包含至少一种当靶向至所述线粒体或叶绿体基因组时能上调线粒体或叶绿体所述结构或功能基因的异源核酸序列的核酸表达构建物引入该植物中，其中所述DNA结合结构域介导所述异源核酸序列靶向线粒体或叶绿体基因组中，由此在植物中产生雄性不育。
5.产生除草剂抗性植物的方法，所述方法包括将至少一种病毒表达载体引入植物中，所述的病毒表达载体编码至少一种包含DNA结合结构域、核酸酶以及叶绿体定位信号的嵌合核酸酶，其中所述的DNA结合结构域介导所述核酸酶靶向赋予对除草剂敏感性的基因，由此产生除草剂抗性植物。
6.植物病毒表达载体，其包含编码至少一种嵌合核酸酶的核酸序列，其中所述的嵌合核酸酶包含DNA结合结构域、核酸酶以及定位至含DNA细胞器的定位信号。
7.基于pTRV的表达载体，其包含编码至少两种异源多肽序列的核酸序列。
8.包含至少一种嵌合核酸酶的植物细胞，其中所述的嵌合核酸酶包含DNA结合结构域、核酸酶以及定位至含DNA细胞器的定位信号，并且其中所述的嵌合核酸酶诱导靶序列的切割。
9.包含权利要求6或7的植物病毒表达载体的转基因植物。
10.产生转基因植物的方法，所述方法包括：将至少一种病毒表达载体引入一种或更多种植物细胞中，其中所述的病毒表达载体编码至少一种包含DNA结合结构域、核酸酶以及定位至含DNA细胞器的定位信号的嵌合核酸酶。
11.权利要求1的方法，其中所述的产生遗传型变异是瞬时的。
12.权利要求1的方法，其中所述的遗传型变异包括核苷酸插入、核苷酸缺失或其组合。
13.权利要求3的方法，其中所述标记包括核苷酸插入、核苷酸缺失或其组合。
14.权利要求1、2、3、4、5或10的方法，其中所述的病毒表达载体包括烟草脆裂病毒(TRV)表达载体。
15.权利要求14的方法，其中所述的TRV表达载体包括基于pTRV2的表达载体。
16.权利要求1、2、3、4、5或10的方法，其中所述的至少一种病毒表达载体编码两种嵌合核酸酶。
17.权利要求1、2、3、4、5或10的方法，其中所述的至少一种病毒表达载体包含两种病毒表达载体。
18.权利要求17的方法，其中所述的两种病毒表达载体伴随地引入植物中。
19.权利要求1、2、3、4、5或10的方法，其中通过土壤杆菌属实现所述的引入植物。
20.权利要求19的方法，其中所述引入所述土壤杆菌属通过注射实现。
21.权利要求19的方法，其中所述引入所述土壤杆菌属通过叶片渗入实现。
22.权利要求1、2、3、4、5或10的方法，其中通过病毒粒子感染实现所述的引入植物。
23.权利要求1、2、3、4、5、6、8、9或10的方法、植物病毒表达载体、植物细胞或转基因植物，其中所述的至少一种嵌合核酸酶包含两种嵌合核酸酶。
24.权利要求6或9的植物病毒表达载体或转基因植物，其还包含编码异源多肽的第二核酸序列。
25.权利要求6或9的植物病毒表达载体或转基因植物，其包含pTRV骨架。
26.权利要求7或25的植物病毒表达载体、基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的pTRV是pTRV1(GeneBank登录号：AF406990)。
27.权利要求7或25的植物病毒表达载体、基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的pTRV是pTRV2(GeneBank登录号：AF406991)。
28.权利要求7或25的植物病毒表达载体、基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的核酸序列缺乏2b序列(SEQ ID NO：43)。
29.权利要求7或25的植物病毒表达载体、基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的核酸序列包含Ω增强子(SEQ ID NO：44)。
30.权利要求7或9的植物病毒表达载体、基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的核酸序列包含两个分离的亚基因组启动子(sgP)，用于调节所述的至少两种异源多肽的转录。
31.权利要求7或9的基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的至少两种异源多肽序列由编码切割结构域的核酸序列分离开。
32.权利要求31的基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的切割结构域包含T2A-样蛋白序列(SEQ ID NO：40)。
33.权利要求32的基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述至少两种异源多肽序列的所述核酸序列如SEQ ID NOs：84、86或88所示。
34.权利要求32的基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述至少两种异源多肽序列的所述氨基酸序列如SEQ ID NOs：85、87或89所示。
35.权利要求7或9的基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的至少两种异源多肽序列编码植物基因。
36.权利要求7或9的基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的至少两种异源多肽序列包含嵌合蛋白，其中所述嵌合蛋白的每一个包含DNA结合结构域、核酸酶和定位至含DNA细胞器的定位信号。
37.权利要求36的基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的定位信号包含核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚单位(RSSU)序列(SEQ ID NO：138)。
38.权利要求36的基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的定位信号包含ATP酶β亚单位(ATP-β)序列(SEQ ID NO：139)。
39.权利要求1、2、3、4、5、6、8、10或36的方法、植物病毒表达载体、植物细胞、基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的DNA结合结构域结合9核苷酸序列。
40.权利要求1、2、3、4、5、6、8、10或36的方法、植物病毒表达载体、植物细胞、基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的DNA结合结构域包含至少一个锌指结构域。
41.权利要求40的方法、植物病毒表达载体、植物细胞、基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的锌指结构域包含3个锌指结构域。
42.权利要求1、2、3、4、5、6、8、10或36的方法、植物病毒表达载体、植物细胞、基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的核酸酶包含II型限制性内切核酸酶的切割结构域。
43.权利要求42的方法、植物病毒表达载体、植物细胞、基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的II型限制性内切核酸酶是FokI限制性内切核酸酶。
44.权利要求1、2、3、4、5、8、9或10的方法、植物细胞或转基因植物，其中所述的植物包括矮牵牛(Petunia hybrida)
45.权利要求1、2、3、4、5、8、9或10的方法、植物细胞或转基因植物，其中所述的植物包括烟草(Nicotiana tabacum)。
46.权利要求1、2、3、4、5、8、9或10的方法、植物细胞或转基因植物，其中所述的植物选自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、蒿属(Artemisia sp.)、青蒿(Artemisia annua)、甜菜(Beta vulgaris)、马铃薯(Solanum tuberosum)、Solanum pimpinellifolium、番茄(Solanum lycopersicum)、茄子(Solanum melongena)、菠菜(Spinacia oleracea)、豌豆(Pisum sativum)、甜椒(Capsicum annuum)、黄瓜(Cucumis sativus)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、陆地棉(Gossypium hirsutum)cv.Siv’on、稻(Oryza sativa)和Oryza glaberrima。
47.权利要求8或10的植物细胞或方法，其中所述的细胞是分生组织细胞。
48.权利要求1、3、6、8、10或36的方法、植物病毒表达载体、植物细胞、基于pTRV的表达载体或转基因植物，其中所述的含DNA细胞器选自细胞核、叶绿体和线粒体。
49.权利要求44的方法、植物细胞或转基因植物，其中所述的核酸酶所述特异靶向至所述矮牵牛的基因组是指靶向至所述矮牵牛的八氢番茄红素去饱和酶(PDS)或黄烷酮3β-羟化酶(FHT)。
50.权利要求4的方法，其中所述的线粒体定位信号包含ATP酶β亚单位(ATP-β)(SEQ ID NO：139)。
51.权利要求5的方法，其中所述的叶绿体定位信号包含核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚单位(Rssu)(SEQ ID NO：138)。
52.包含如SEQ ID NO：31、32、33、34、70、72、74、76、84、86或88所示核酸序列的分离的多核苷酸。
53.包含如SEQ ID NO：35、36、37、38、71、73、75、77、85、87或89所示氨基酸序列的分离的多肽。
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