CN103146743B - 一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，本发明综合考虑了影响VIGS沉默效率的多方面因素，通过不同接种方法与接种农杆菌菌液浓度，结合沉默效率：沉默频率、沉默效力、沉默效果，评价方法得到了醋栗番茄病毒诱导基因沉默的最优体系，适宜的接种方法与浓度提高了沉默效率。用本发明方法评价VIGS沉默效率时间短、速度快、效率高，可应用于其他植物病毒诱导基因沉默优化体系的评价，为快速验证基因功能提供了有效的方法。

Description

一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法。

背景技术

病毒诱导的基因沉默与传统的研究植物基因功能的方法相比，具有简便高效、周期性短、不需要对植物进行转化和可以沉默基因家族等特点，并且可以在物种间和物种内不同遗传背景的植物间进行基因功能的比较。自1995年Kumagai等首次利用重组烟草花叶病毒(tobaccomosaic virus，TMV)在本氏烟中成功沉默了植物内源八氢番茄红素脱氢酶基因以来，多种VIGS载体相继得到开发和应用。TRV是目前应用最广的VIGS载体.它是由TRV1与TRV2两条RNA病毒链组成，TRV1用于辅助载有靶基因片段的TRV2在植物体内移动。TRV病毒载体有病毒症状较轻、沉默效率高且持久、各种组织均可产生沉默等优点，因而已被广泛应用。尽管VIGS技术具有很多优越性，但还有其内在固有的局限性：VIGS很少能够完全沉默或抑制靶基因的表达，而且沉默水平因不同的植物种类和实验方法而不同，因此，应结合植物种类使用正确的方法获得最大沉默效率。影响VIGS沉默效率有多种因子：1.VIGS载体中插入的目的片段，在VIGS载体中插入的目的片段序列和大小均影响VIGS沉默效率。一般插入目的片段大小以300～500bp为宜，否则片段太大会导致载体病毒移动受阻和外源片段丢失且插入片段与目的基因至少要有连续23bp完全相同，两者序列同源性越高，连续一致序列越长，VIGS效果越好。2.植物培育条件，植物培育条件直接影响病毒侵染和增殖以及植物生长，因此VIGS沉默效果的好坏与植物培育条件密切相关。其中以温度影响最大，同一载体在不同寄主上沉默适温不同。就TRV而言，相对低温有利于它介导的基因沉默，在番茄上需要低于21℃，而在拟南芥和本氏烟上则以22～25℃最佳。高于28℃几乎完全抑制TRV介导的VIGS；相对湿度低有利于TRV介导的VIGS，不利的环境条件可能导致促发VIGS的siRNA的产生和积累，从而阻止VIGS产生。3.寄主生育期，寄主生育期对基因沉默效率影响较大，一般在较小的苗期时进行VIGS诱导接种，基因沉默效率较高，太大和太小都不容易进行有效沉默。研究认为病毒的初始积累量对沉默效率影响较大，因此不同生育期可能对病毒的侵染和增殖有较大影响，从而影响VIGS沉默效率。4.VIGS载体的植物导入方法，VIGS载体的植物导入方法直接影响病毒的初始积累量，进而影响基因沉默的起始，因而显著影响VIGS沉默效率。不同病毒载体病毒的接种方法不同，目前常用的接种方法主要包括机械接种、金属粒子轰击和农杆菌介导的接种。农杆菌介导的方法首先是将VIGS载体导入农杆菌，再以农杆菌液对植物进行接种，是一种简便、高效、劳动量少的导入方法。就TRV病毒载体而言，在不同植物上农杆菌接种方法，农杆菌菌株以及农杆菌接种液的制备也各不相同。

基于VIGS技术的优越性，VIGS已发展成一项可以快速高通量研究植物基因功能的主要技术之一，得到广泛应用，但VIGS很少能够完全沉默或抑制靶基因的表达，即使靶基因很少的转录本也可能产生功能蛋白，从而干扰对沉默表型的观察，而且沉默效率因不同的植物种类和实验方法而不同，因此对沉默效率的评价以及提高沉默效率成为VIGS技术的关键。

发明内容

本发明的目的克服现有技术中的缺陷，提供一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，利用本发明所述的方法获得的沉默植株，获得病毒诱导醋栗番茄内源基因最佳沉默体系。

其具体技术方案为：

一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，包括以下步骤：

(1)重组病毒质粒TRV2-PDS的构建与转化农杆菌；

(2)醋栗番茄幼苗培养；

(3)接种农杆菌浸染液于醋栗番茄幼苗；

(4)病毒诱导醋栗番茄PDS基因沉默。

步骤(1)中，获得所述重组病毒质粒TRV2-PDS为pTRV2载体与408bp PDS基因片段通过Sac I和Xho I酶切位点连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌，于含有卡那霉素的LB平板上37℃静置培养12-16h，获得单克隆菌落，单克隆菌落在含卡那霉素的LB液体培养基中37℃、200rpm/min震荡培养12-16h，扩繁得到的单克隆菌液通过裂解法提取重组质粒，重组质粒经过Sac I和Xho I双酶切验证，获得TRV2-PDS重组质粒。

步骤(1)中，TRV2-PDS重组质粒转化农杆菌的方法为冻融法，转化的农杆菌菌株为GV3101，在含有卡那霉素、庆大霉素、利福平抗生索的LB平板上28℃静置培养36-48h，筛选出含有TRV2-PDS质粒的阳性单克隆菌落。

步骤(2)中，所述的番茄幼苗特征为，播种后12-14d，子叶展平，真叶刚刚冒出。

步骤(3)中，农杆菌浸染液的准备过程为：步骤(1)获得的含有TRV2-PDS质粒的阳性单克隆农杆菌菌落，在含抗生素的LB液体培养基中28℃、200rpm/min震荡培养24-36h，取培养液以1∶25比例稀释于诱导培养基中，继续培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，取培养产物25ml于离心管中，以5000rpm离心，获得的菌体用MgCl₂+MES(10mM，PH5.6)等体积悬浮，再离心，重新悬浮并调节为OD₆₀₀2.0、OD₆₀₀3.0，用上述方法准备TRV1菌液，将TRV1与TRV2或TRV2-PDS菌液等体积混合液用于浸染番茄幼苗。

步骤(3)中，所述的接种方法为注射法或摩擦法。

步骤(3)中，所述的醋栗番茄幼苗为步骤(2)培养所得，且接种后在人工气候箱中培养，培养条件为21-23℃、相对湿度50％，光周期为16L-8D。

步骤(4)中，基因沉默现象在浸染后12d出现，表现为接种植株出现白化或黄化现象，TRV2-PDS病毒载体成功诱导醋栗番茄PDS基因沉默。

本发明还进一步提出了病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的评价方法，包括以下评价指标：沉默频率，沉默效力，沉默效果。

本发明还提供了上述评价指标的计算方法：

所述沉默频率为，含有TRV-PDS重组质粒的农杆菌接种的醋栗番茄植株中，出现白化或黄化症状的植株所占的比例。即

所述沉默效力为，每一株出现白化或黄化症状的植株，白化和黄化叶片数占植株总叶片数的比例。

所述沉默面积为出现白化和黄化的叶面积占所测叶面积的比率，摘取叶片，平铺于桌面，相机镜头垂直于桌面拍照，将图片导入Adobe Photoshop CS4软件，利用磁性套索工具勾勒出叶片轮廓，记下当前像素为a，再利用吸管工具吸去绿色部分，记下剩余部分的像素b，利用分辨率一定的情况下，面积比等于像素比原理，此时白化和黄化叶面积之和与总叶面积之比为b/a，获得沉默面积的百分比。即

所述基因表达降低率为正常植株PDS基因表达量(定义为100％)减去出现白化或黄化症状植株相对于正常植株PDS基因的表达量，首先提取RNA，反转录cDNA，以cDNA为模板，EF1α为内参，进行实时荧光定量PCR，计算出白化或黄化症状植株PDS基因的相对表达量，从而获得基因表达降低率。即

与现有技术相比，本发明的有益效果为：利用本发明所述的方法获得的沉默植株，获得病毒诱导醋栗番茄内源基因最佳沉默体系，该沉默体系速度快、效率高，可应用于其他植物病毒诱导基因沉默优化体系的评价，为快速验证基因功能提供了有效的方法。

附图说明

图1为VIGS诱导醋栗番茄PDS基因沉默效果图。从第二、三片真叶开始就表现白化现象，随着植株生长新生叶片继续白化，而且白化现象越来越严重，表明PDS基因有效地被沉默。

图2为PDS基因沉默面积计算图。图2(a)中选区为叶片总面积，图2(b)中选区为叶片白化和黄化总面积。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

实施例1

1.试验前准备：

(1)试验材料：醋栗番茄L03708

(2)主要试剂：限制性内切酶，T4连接酶，质粒提取试剂盒，DH5α大肠杆菌感受态细胞，GV3101农杆菌感受态细胞，主要生化试剂。。

(3)培养基的配制：

LB培养基：100ml蒸馏水，NaCl 1.0g，胰蛋白胨1.0g，酵母粉0.5g，琼脂粉1.5g。

诱导培养基：475ml蒸馏水，MES 4.88g，葡萄糖2.5g，NaH₂PO₄0.156g，25ml ABsalt。

AB salt：1L蒸馏水，NH₄Cl 20g，MgSO₄·7H₂O 6g，KCl 3g，CaCl₂0.2g，FeSO₄·7H₂O 0.05g。取25ml加入诱导培养基中。

悬浮培养基：10mM MES，10mM MgCl₂，PH5.5。

2.试验步骤：

(1)重组病毒质粒TRV2-PDS的构建与转化农杆菌：pTRV2载体与PDS基因片段通过Sac I和Xho I酶切位点连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌，于含有卡那霉素的LB平板上37℃静置培养12-16h，获得单克隆菌落，单克隆菌落在含卡那霉素的LB液体培养基中37℃、200rpm/min震荡培养12-16h，扩繁得到的单克隆菌液通过裂解法提取重组质粒，重组质粒经过Sac I和Xho I双酶切验证，获得TRV2-PDS重组质粒。TRV2-PDS重组质粒转化农杆菌的方法为冻融法，转化的农杆菌菌株为GV3101，在含有卡那霉素、庆大霉素、利福平抗生素的LB平板上28℃静置培养36-48h，筛选出含有TRV2-PDS质粒的阳性单克隆菌落。

(2)醋栗番茄幼苗培养：挑选饱满一致的种子，浸种催芽，播种于基质中，摆放于人工气候箱中，温度为23-25℃，相对湿度为50％，光周期为16L-8D，培养至10-12d。

(3)接种农杆菌浸染液于醋栗番茄幼苗：步骤(1)获得的含有TRV2-PDS质粒的阳性单克隆农杆菌菌落，在含抗生素的LB液体培养基中28℃、200rpm/min震荡培养24-36h，取培养液以1∶25比例稀释于诱导培养基中，继续培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，取培养产物25ml于离心管中，以5000rpm离心，获得的菌体用MgCl₂+MES(10mM，PH5.6)等体积悬浮，再离心，重新悬浮并调节OD₆₀₀为2.0。用同样方法准备TRV1菌液，将TRV1与TRV2或TRV2-PDS菌液等体积混合，注射与摩擦两种方法接种于番茄幼苗，接种密度为5株/毫升，接种后的幼苗于人工气候箱中培养，培养条件为21-23℃，相对湿度50％，光周期16L-8D。

(4)病毒诱导醋栗番茄PDS基因沉默体系评价：接种后25-35d，统计沉默频率，沉默效力，计算沉默面积和基因表达降低率，对VIGS沉默效率做出整体评价。

实施例2

实验的各步骤同实施例1，农杆菌浸染液浓度OD₆₀₀为3.0，注射和摩擦两种方法接种于番茄幼苗，接种后25-35d，对VIGS沉默效率做出整体评价。

实验结果

不同的浸染液浓度与不同的接种方法均能诱导靶基因沉默，但沉默效率有差异，具体评价指标值见表1。

表1各实验评价指标值

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，本发明的技术方案可应用于其他植物病毒诱导基因沉默优化体系的评价任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种提高病毒诱导醋栗番茄内源基因沉默效率的方法，其特征在于，包括以下步骤： 

(1)重组病毒质粒TRV2-PDS的构建与转化农杆菌； 

(2)醋栗番茄幼苗培养； 

(3)接种农杆菌浸染液于醋栗番茄幼苗； 

(4)病毒诱导醋栗番茄PDS基因沉默； 

步骤(1)中，获得所述重组病毒质粒TRV2-PDS为pTRV2载体与408bp PDS基因片段通过Sac I和Xho I酶切位点连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌，于含有卡那霉素的LB平板上37℃静置培养12-16h，获得单克隆菌落，单克隆菌落在含卡那霉素的LB液体培养基中37℃、200rpm/min震荡培养12-16h，扩繁得到的单克隆菌液通过裂解法提取重组质粒，重组质粒经过Sac I和Xho I双酶切验证，获得TRV2-PDS重组质粒； 

步骤(1)中，TRV2-PDS重组质粒转化农杆菌的方法为冻融法，转化的农杆菌菌株为GV3101，在含有卡那霉素、庆大霉素、利福平抗生素的LB平板上28℃静置培养36-48h，筛选出含有TRV2-PDS质粒的阳性单克隆菌落； 

步骤(2)中，所述的番茄幼苗特征为，播种后12-14d，子叶展平，真叶刚刚冒出； 

步骤(3)中，农杆菌浸染液的准备过程为：步骤(1)获得的含有TRV2-PDS质粒的阳性单克隆农杆菌菌落，在含抗生素的LB液体培养基中28℃、200rpm/min震荡培养24-36h，取培养液以1∶25比例稀释于诱导培养基中，继续培养至OD₆₀₀为0.5-0.8，取培养产物25ml于离心管中，以5000rpm离心，获得的菌体用MgCl₂+MES10mM，pH5.6等体积悬浮，再离心，重新悬浮并调节为OD₆₀₀2.0、OD₆₀₀3.0，用上述方法准备TRV1菌液，将TRV1与TRV2或TRV2-PDS菌液等体积混合液用于浸染番茄幼苗； 

步骤(3)中，所述的接种方法为注射法或摩擦法； 

步骤(3)中，所述的醋栗番茄幼苗为步骤(2)培养所得，且接种后在人工气候箱中培养，培养条件为21-23℃、相对湿度50％，光周期为16L-8D； 

步骤(4)中，基因沉默现象在浸染后12d出现，表现为接种植株出现白化或黄化现象，TRV2-PDS病毒载体成功诱导醋栗番茄PDS基因沉默。