CN105296535B - 病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系，根据八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的编码基因序列设计特异引物，通过RT‑PCR在石竹中扩增出大约500bp的cDNA片段。将获得的PDS cDNA片段连接到TRV2上，通过优化农杆菌介导的病毒诱导基因沉默体系，根据植株出现光漂白的频率、漂白的叶面积大小、漂白的状况，将乙酰丁香酮浓度、苗龄、侵染后预培养的温度以及预培养后植株的光照条件进行配套整合，建立了一套快速、有效的病毒诱导沉默体系，可以获得病毒诱导的基因沉默性状，进而解决有效验证石竹基因功能的问题。

Description

病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系
技术领域
本发明涉及花卉生物技术领域，具体涉及一种病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系。
背景技术
石竹为石竹科石竹属植物，原产于，由于其具有耐寒、抗旱、抗盐碱、花色众多等优点，因此在花坛、地被等园林上广泛应用。研究石竹抗逆机理，获得抗逆基因，进而对同属植物进行遗传改良，可以增加北方园林用植物种类，达到节约型绿化的目的。但目前缺乏对控制这些性状基因功能进行快速、有效验证的体系。VIGS(virus-induced gene silence，VIGS)技术已应用于多种植物进行基因功能验证，但由于石竹抗逆性强，该体系目前在石竹上尚无应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系，可以获得病毒诱导的基因沉默性状，进而解决有效验证石竹基因功能的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系，包括如下步骤：
S1、采用八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的编码基因序列设计特异引物，引物分别为
4F：GATGAGGATGGGGACTGGTA
4R：ATTTAGCGCCTTTGACATGG
S2、从石竹中克隆PDS基因，通过RT-PCR在石竹中扩增出500bp大小的PDS基因片段，并将片段连接到pGEM T-easy载体上；
S3、将连接到载体pGEM T-easy上的PDS片段用酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上；
S4、将步骤S3所得的pTRV2-PDS5000转入GV3101农杆菌中，进行阳性克隆的PCR鉴定；
S5、室温下将含有重组质粒的农杆菌在渗透缓冲液(MES+MgCl2+Aceto)中活化4h后，采用浓度为100um的乙酰丁香酮对4叶期的石竹幼苗室温下进行高压侵染，待叶片出现水渍状时，表明侵染完成；
S6、将侵染后的石竹幼苗先放在15℃下预培养2d后，10℃下继续预培养5d；
S7、然后步骤S6处理后的石竹幼苗放在20℃，光照为4000LUX的培养箱中进行培养，15-20d后，出现叶片漂白现象。
其中，所述步骤S5中高压侵染的压力为0.08MPa。
本发明具有以下有益效果：
根据八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的编码基因序列设计特异引物，通过RT-PCR在石竹中扩增出大约500bp的cDNA片段。将获得的PDS cDNA片段连接到TRV2上，通过优化农杆菌介导的病毒诱导基因沉默体系，根据植株出现光漂白的频率、漂白的叶面积大小、漂白的状况，将乙酰丁香酮浓度、苗龄、侵染后预培养的温度以及预培养后植株的光照条件进行配套整合，建立了一套快速、有效的病毒诱导沉默体系，可以获得病毒诱导的基因沉默性状，进而解决有效验证石竹基因功能的问题。
附图说明
图1为本发明实施例病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系的流程框图。
图2为本发明实施例中龙葵、烟草及石竹PDS核苷酸水平同源性比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所示，本发明实施例提供了病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系，包括如下步骤：
S1、采用八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的编码基因序列设计特异引物，引物分别为
4F：GATGAGGATGGGGACTGGTA
4R：ATTTAGCGCCTTTGACATGG
S2、从石竹中克隆PDS基因，通过RT-PCR在石竹中扩增出500bp大小的PDS基因片段，并将片段连接到pGEM T-easy载体上；
S3、将连接到载体pGEM T-easy上的PDS片段用酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上；
S4、将步骤s3所得的pTRV2-PDS5000转入GV3101农杆菌中，进行阳性克隆的PCR鉴定；
S5、室温下将含有重组质粒的农杆菌在渗透缓冲液(MES+MgCl2+Aceto)中活化4h后，采用浓度为100um的乙酰丁香酮对4叶期的石竹幼苗室温下进行高压侵染，压力为0.08MPa，待叶片出现水渍状时，表明侵染完成；
S6、将侵染后的石竹幼苗先放在15℃下预培养2d后，10℃下继续预培养5d；
S7、然后步骤S6处理后的石竹幼苗放在20℃，光照为4000LUX的培养箱中进行培养，15-20d后，出现叶片漂白现象。
实施例
步骤一、设计引物扩增了不同大小的PDS片段，引物分别为
4F：GATGAGGATGGGGACTGGTA
4R：ATTTAGCGCCTTTGACATGG
6F：AAGGTTGCTGCTTGGAAAGA
6R：GGCCAAGTCAGCATTTCATT；
步骤二、通过RT-PCR扩增，以4F和4R为引物扩增的500bp大小的片段；以6F和6R为引物扩增的260bp大小的片段；
步骤三、获得的片段连接到pGEM T-easy上测序，比对结果如下(图2)。表明扩增的片段与PDS基因有高度同源性。
步骤四、将连接到载体pGEM T-easy上的PDS片段用酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上，然后进行酶切验证。pTRV2-PDS500和pTRV2-PDS260经EcoR I剪切后，分别获得的10.0kb和500bp，以及10.0kb和260bp的酶切片段。
步骤五、将连接了不同PDS片段大小的TRV2转入农杆菌GV3101中，阳性克隆进行PCR检测，然后侵染石竹幼苗。经农杆菌侵染石竹幼苗后，连接了260bpPDS大小的载体侵染效果不好，未出现叶片漂白现象，而连接了500bpPDS大小的载体侵染效果好，出现叶片漂白现象。
步骤六、建立侵染体系
分别采用不同浓度的乙酰丁香酮配制侵染液，对不同苗龄的石竹幼苗进行浸染处理，而后在10℃、15℃低温条件下处理一周，在正常温度、不同光强的外界条件下培养石竹幼苗两周以上，观察记录侵染结果。
表1 不同浓度的乙酰丁香酮的侵染效果比较
乙酰丁香酮浓度μm 叶片表型特征
50 叶片未出现漂白现象
100 叶片出现漂白现象
250 叶片未出现漂白现象
表2 不同苗龄的石竹幼苗的侵染效果比较
叶龄 叶片表型特征
1对真叶，即2片真叶 叶片未出现漂白现象
2对真叶，即4片真叶 叶片出现漂白现象
3对真叶，即6片真叶 叶片未出现漂白现象
4对真叶，即8叶真叶 叶片未出现漂白现象
表3 侵染后不同温度预处理与20℃培养下不同光照强度协同作用对PDS漂白效果的影响
如表1-3可知，侵染体系为：浓度为100um的乙酰丁香酮的侵染四片真叶的石竹幼苗，侵染后在15℃下预培养2d后，10℃下继续预培养5d，然后放在20℃、光照为4000LUX下进行培养，侵染效率最高，植株侵染率20％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、采用八氢番茄红素脱氢酶PDS的编码基因序列设计特异引物；
S2、从石竹中克隆PDS基因，通过RT-PCR在石竹中扩增出如SEQ ID NO：1所示的PDS基因片段，并将片段连接到pGEM T-easy载体上；
S3、将连接到载体pGEM T-easy上的PDS片段用酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上；
S4、将步骤S3所得的含上述PDS基因片段的pTRV2重组载体转入GV3101农杆菌中，进行阳性克隆的PCR鉴定；
S5、室温下将含有重组质粒的农杆菌在渗透缓冲液MES+MgCl2+Aceto中活化4h后，采用浓度为1OOμmol L-1的乙酰丁香酮对4叶期的石竹幼苗室温下进行高压侵染，待叶片出现水渍状时，表明侵染完成；
S6、将侵染后的石竹幼苗先放在15℃下预培养2d后，10℃下继续预培养5d；
S7、然后步骤S6处理后的石竹幼苗放在20℃，光照为4000LUX的培养箱中进行培养，15-20d后，出现叶片漂白现象。
2.根据权利要求1所述的病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默方法，其特征在于，所述步骤S5中高压侵染的压力为0.08MPa。
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