CN106560517B - 石竹花色调控关键酶基因chs沉默体系的建立方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法及应用，从石竹幼苗叶片中提取mRNA，以反转录的cDNA为模板，根据香石竹CHS基因的保守序列设计引物，通过RT‑PCR采用所设计的引物进行扩增，获得407bp的扩增产物；获得的407bp大小的片段连接到pGEM T‑easy上，得CHS片段；将连接到载体pGEM T‑easy上的CHS片段用EcoRI酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上，得重组质粒pTRV2/DcCHS407；将所得的重组质粒pTRV2/CHS407转化GV3101农杆菌。本发明可以快速、有效的验证花色基因功能，侵染中国石竹花蕾后获得相应性状。

Description

石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法和应用
技术领域
本发明涉及花卉生物技术领域，具体涉及一种石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法和应用。
背景技术
石竹为石竹科石竹属植物，原产于中国，由于其花色众多，因此在花坛、地被等中广泛应用。研究石竹花色调控机理，获得相关基因，用于同属植物花色遗传改良，增加北方园林用植物种类，达到美化环境的目的。石竹从播种到开花需2-3个月，因此对控制这些花色的基因功能进行快速、有效验证，对今后石竹属植物花色遗传、育种的研究及应用具有重要意义。VIGS(virus-induced gene silence,VIGS)技术已应用于多种植物进行基因功能验证，如何利用该技术研究石竹花色基因目前尚无报道。
石竹从播种到开花需2-3个月，如何快速鉴定花色基因，获得其功能是目前花色研究中面临的问题。基于此本发明建立了一套快速、有效的花色鉴定体系，可以解决验证石竹花色基因功能的问题。
查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是花色素合成途径中的一个关键酶,它在植物中表达量的改变可能影响花的颜色。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法和应用，根据查尔酮合成酶的编码基因序列设计特异引物，通过RT-PCR在石竹中扩增出407bp的cDNA片段，将获得的CHS cDNA片段连接到TRV2上，通过优化试验材料、侵染后培养温度等条件，根据花瓣出现的性状，建立了一套快速、有效的验证花色基因功能的体系，有效解决了目前验证石竹花色基因功能时间长的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法，包括如下步骤：
S1、从石竹幼苗叶片中提取mRNA，以反转录的cDNA为模板，根据香石竹CHS基因的保守序列设计引物，通过RT-PCR采用Forward:GTCGCTTCATGCTCTACCAAC及Reverse:GCTAGGACTGAACGCATCCTC进行扩增，获得407bp的扩增产物；
S2、将获得的407bp大小的片段连接到pGEM T-easy上，得CHS片段；
S3、将连接到载体pGEM T-easy上的CHS片段用EcoRI酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上，得重组质粒pTRV2/DcCHS407；
S4、将所得的重组质粒pTRV2/DcCHS407转化GV3101农杆菌,得含有重组质粒的农杆菌。
所述步骤S4具体包括如下步骤：
将含重组质粒pTRV2/DcCHS407的离心管置于液氮中速冻1min后快速置于37℃水浴锅中放置3min，再置于冰上,加入1ml LB液体培养基，在28℃160-200rpm振荡培养3-5h,将菌液取100μl涂在含有Rif和kana的LB平板上，29℃倒置培养2d至出现单菌落，单菌落经PCR检测后，摇菌扩繁、保存，得含有重组质粒的农杆菌。
上述石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的应用具体包括如下步骤：室温下将含有重组质粒的农杆菌在渗透缓冲液中活化4h后，对处于不同发育时期的花蕾进行高压法侵染，待苞片出现水渍状时，表明侵染完成。
优选地，将侵染后的生长中期的花蕾在15℃、光照强度为50-72μmol·m-2·s-1的条件下于光照培养箱中培养4d后，花蕾开放，花色改变。
优选地，所述渗透缓冲液由10mM MES，10mM MgCl2和40μM乙酰丁香酮组成。
本发明具有以下有益效果：
根据查尔酮合成酶的编码基因序列设计特异引物，通过RT-PCR在石竹中扩增出407bp的cDNA片段，将获得的CHS cDNA片段连接到TRV2上，通过优化试验材料、侵染后培养温度等条件，根据花瓣出现的性状，建立了一套快速、有效的验证花色基因功能的体系，有效解决了目前验证石竹花色基因功能时间长的问题；可以有效、大量、快速的鉴定调控中国石竹花色的新基因的功能，如花色、花香、花期等基因的功能。
附图说明
图1为本发明实施例中CHS基因的RT-PCR扩增结果；
图中1，2为已扩增的407bp大小的片段。
图2为本发明实施例中香石竹、Dianthus monspessulanus及石竹CHS核苷酸水平同源性比较示意图。
图3为本发明实施例中pTRV2/DcCHS407的酶切结果；
图中，M为100bp Ladder。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法，包括如下步骤：
S1、从石竹幼苗叶片中提取mRNA，以反转录的cDNA为模板，根据香石竹CHS基因的保守序列设计引物，通过RT-PCR采用Forward:GTCGCTTCATGCTCTACCAAC及Reverse:GCTAGGACTGAACGCATCCTC进行扩增，获得407bp的扩增产物(图1)。
S2、将获得的407bp大小的片段连接到pGEM T-easy上测序并在NCBI上进行序列比对(图2)。结果表明扩增的片段与Dianthusmonspessulanus、香石竹的CHS基因分别达100％和97％的同源性。
S3、将连接到载体pGEM T-easy上的CHS片段用EcoR I酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上，然后对重组质粒pTRV2/DcCHS407进行酶切验证(图3)；
将不同时期的花蕾采下后插入液体培养基(1/2×MS大量元素，1/2×MS钙盐，1×MS微量元素，1×MS铁盐，0.4mg/L维生素B1，10mg/L肌醇，3％蔗糖)中，放在光照培养箱中进行培养，在不同的温度(10℃、15℃及22℃)下观察其开花率及开花时间，结果表明不同温度下花蕾形态处于生长中期及花前期时均能开花，且开花率高，结果表1所示。
表1
表2花蕾不同发育时期以及侵染后不同培养温度对花色沉默效果的影响
Figure GDA0002228961350000042
Figure GDA0002228961350000051
结果表明在0.05Mpa的压力下，花蕾形态处于生长中期，在15℃、光照强度50-72μmol·m-2·s-1的条件下于光照培养箱中培养，于第4天花瓣颜色出现变化且趋于白色，沉默花朵多、沉默效果好。
因此，根据上述结果，得出花蕾形态处于生长中期时，在0.05Mpa的压力下侵染至苞片呈水渍状，然后在15℃、光照强度为50-72μmol·m-2·s-1的条件下于光照培养箱中培养大约4d后，花蕾开放，花色改变，侵染效率达最高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、从石竹幼苗叶片中提取mRNA，以反转录的cDNA为模板，根据香石竹CHS基因的保守序列设计引物，通过RT-PCR采用Forward:GTCGCTTCATGCTCTACCAAC及Reverse:GCTAGGACTGAACGCATCCTC进行扩增，获得407bp的扩增产物；
S2、将获得的407bp大小的片段连接到pGEM T-easy上，测序得CHS片段；
S3、将连接到载体pGEM T-easy上的CHS片段在37℃用EcoRI酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2载体上，得重组质粒pTRV2/DcCHS407；
S4、将所得的重组质粒pTRV2/DcCHS407转化GV3101农杆菌,得含有重组质粒的农杆菌；
S5、室温下将含有重组质粒的农杆菌在渗透缓冲液中活化4h后，对处于不同发育时期的花蕾进行高压法侵染，待苞片出现水渍状时，表明侵染完成；
S6、将侵染后的生长中期的花蕾在15℃、光照强度为50-72μmol·m-2·s-1的条件下于光照培养箱中培养4d后，花蕾开放，花色改变。
2.如权利要求1所述的石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法，其特征在于，所述步骤S4具体包括如下步骤：
将含重组质粒pTRV2/DcCHS407的离心管置于液氮中速冻1min后快速置于37℃水浴锅中放置3min，再置于冰上,加入1ml LB液体培养基，在28℃ 160-200rpm振荡培养3-5h,将菌液取100μl涂在含有Rif和kana的LB平板上，29℃倒置培养2d至出现单菌落，单菌落经PCR检测后，摇菌扩繁、保存，得含有重组质粒的农杆菌。
3.如权利要求1所述的石竹花色调控关键酶基因CHS沉默体系的建立方法，其特征在于，所述渗透缓冲液由10mM MES，10mM MgCl2，40μM乙酰丁香酮混合所得。
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香石竹查尔酮合酶基因的克隆与植物反义表达载体的构建;蔡鹏等;《健康必读杂志》;20111231(第6期);全文 *

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